CN117730154A - Aav制造方法 - Google Patents

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Abstract

产生重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法包括：扩增阶段，所述扩增阶段包括增加至少一个含有培养基的培养容器中的细胞数量；将包括侧接AAV反向末端重复序列的转基因的第一多核苷酸序列和任选的包括AAV rep和cap基因的第二多核苷酸序列和/或包括一个或多个辅助基因的第三多核苷酸序列引入所述细胞中；产生阶段，所述产生阶段包括培养引入了一种或多种多核苷酸序列的细胞并向产生阶段培养基中添加钙(Ca)离子(即Ca2+的盐)；和分离所述rAAV颗粒。

Description

AAV制造方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年6月17日提交的美国临时专利申请第63/211,877号的优先权权益，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本公开提供了通过向重组腺相关病毒(AAV)产生培养基中添加某些盐，特别是钙盐，例如氯化钙来制备AAV载体的方法。
技术背景
腺相关病毒(AAV)是一种复制缺陷型细小病毒。AAV颗粒包含具有三种衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)的衣壳，包封长度约为4.8kb的单链DNA基因组，所述基因组可以是正链或负链。含有任一链的颗粒都具有感染性，并且通过将亲本感染单链转化为双链体形式并随后扩增来发生复制，后代单链由此被置换并包装成衣壳。
AAV依赖于与其它病毒(主要是腺病毒)的共同感染来进行复制。其单链基因组含有三个基因，rep(复制)、cap(衣壳)和aap(组装)，所述基因通过使用三个启动子、替代翻译起始位点和差异剪接产生至少九种基因产物。这些编码序列的两侧是基因组复制和包装所需的反向末端重复序列(ITR)。rep基因编码四种蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)，它们参与病毒基因组复制和包装，而cap表达产生病毒衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)，它们形成保护病毒基因组的衣壳外壳，并积极参与细胞结合和内化。aap基因在与cap基因重叠的替代阅读框中编码组装激活蛋白(AAP)。认为这种AAP蛋白为衣壳组装提供了支架功能。
AAV颗粒具有使其作为包括基因疗法和遗传疫苗等治疗应用的载体有吸引力的特征。AAV感染多种细胞类型，包括许多哺乳动物细胞，因此有可能靶向体内许多不同的组织。AAV感染缓慢分裂和非分裂细胞。对于治疗应用，使用重组AAV(rAAV)，其中基因组包含异源转基因，并且典型地保留ITR，但缺乏病毒rep、cap和aap基因。在不存在Rep蛋白的情况下，侧接ITR的转基因可形成转录活性核染色体外元件或附加体，其基本上可在转导细胞的一生中持续存在。
用于产生rAAV载体的细胞培养系统包括人类细胞系的瞬时转染和哺乳动物或昆虫细胞系的感染。rAAV载体生成方法通常包括为载体生成提供生物合成机制的产生细胞类型，与辅助载体(例如辅助质粒、辅助病毒)组合作为rAAV复制和包装所需的额外基因产物的来源。
rAAV载体产生方法的重要目标是实现一致、高的载体产生率，同时最大限度地减少与产品相关的杂质的产生，所述杂质包括AAV衣壳化残余DNA杂质和空衣壳。以每个细胞产生的载体基因组(VG)来测量，rAAV载体产生力可能变化很大，从每个细胞少于103至2×105VG不等。除了更高的成本效益之外，高生产率的一个重要优势是，当起始材料中rAAV载体产物与总收获生物量的比率较高时，纯化可更有效。
产物相关杂质类似于rAAV载体本身，并且在纯化过程中不易与rAAV载体分离。在当前的rAAV载体产生系统中，AAV空衣壳以高水平产生。对于AAV2，细胞培养物中产生的总AAV颗粒的50％至95％是空衣壳。然而，为了限制对AAV衣壳的潜在有害免疫反应，谨慎的做法是尽量减少细胞培养物中空衣壳的产生和/或在载体纯化过程中将其基本上去除。因此，需要增加rAAV产生力和/或减少产物相关杂质，例如空衣壳的方法。
发明内容
本发明提供了通过向AAV产生培养基中添加某些盐，特别是钙盐，例如氯化钙来产生重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法。本文描述了一种用于产生重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，其中所述方法包括：
(i)扩增阶段，其包括增加至少一个含有培养基的培养容器中的细胞数量；
(ii)将包含侧接AAV反向末端重复序列(ITR)的转基因的第一多核苷酸序列和任选的包含AAV rep和cap基因的第二多核苷酸序列和/或包含一个或多个辅助基因的第三多核苷酸序列引入细胞中；
(iii)产生阶段(其中产生rAAV颗粒)，其包括培养来自步骤(ii)的细胞并在引入第一多核苷酸序列之后约0至约24小时向培养基中添加钙(Ca)离子(即Ca2+的盐)，使得培养基中Ca离子的总浓度大于0.3mM且小于10mM；和
(iv)分离rAAV颗粒。
在所述方法的实施方案中，向培养基添加Ca离子包括添加Ca盐，例如CaCl2。可添加钙离子至培养基中的Ca离子浓度为约0.5mM至约9mM、约1mM至约9mM、约1mM至约8mM、约1mM至约7mM、约2mM至约9mM、约2mM至约8mM、约2mM至约7mM、约2mM至约6mM、约2mM至约5mM、或约2mM至约4mM。在实施方案中，添加钙离子至浓度为约1mM、约1.5mM、约2mM、约2.5mM、约3mM、约3.5mM、约4mM、约4.5mM、约5mM、约5.5mM、约6mM、约6.5mM、约7mM、约7.5mM、约8mM、约8.5mM、约9或约9.5mM。在实施方案中，向产生培养基中添加钙离子至约0.5mM至约6mM；约2mM至约6mM、约2mM至约4mM、或约1mM至约3mM的浓度。
在一些实施方案中，Ca离子(Ca盐，例如CaCl2)在引入第一、第二和第三多核苷酸序列中的至少一者之后或在产生阶段开始时(即，在引入后约0小时时)添加。在实施方案中，在引入第一多核苷酸序列之后或在产生阶段开始之后约0小时至约24小时(例如0、约1、约2、约5、约8、约12、约18、约23、约24、约24.5小时)的任何时间添加Ca离子。在实施方案中，在引入第一多核苷酸序列之后或在产生阶段开始之后约0小时至约18小时的任何时间添加Ca离子。在实施方案中，在引入第一多核苷酸序列或产生阶段开始之后约6小时至约20小时、约6小时至约18小时、或约6至约12小时的任何时间添加Ca离子。在一些实施方案中，在引入第一、第二和第三多核苷酸序列中的至少一者(或产生阶段开始)之后约12小时添加Ca离子，使得培养基中Ca的总浓度为约2mM。
在所述方法的实施方案中，扩增阶段培养基和/或产生阶段培养基是无血清的。在实施方案中，扩增和/或产生阶段包括将谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽中的一者或多者添加至扩增阶段培养基和/或产生阶段培养基中。谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽中的一者或多者可以是例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酰-L-谷氨酰胺、谷氨酰胺蛋白质水解物、L-谷氨酸和谷氨酰胺二肽中的一者或多者。可例如在引入第一、第二和第三多核苷酸序列中的至少一者之后约6小时、约12小时、约24小时、约48小时和/或约72小时中的一者或多者时在产生阶段开始之后约6小时、约12小时、约24小时、约48小时和/或约72小时中的一者或多者时将包含谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽中的至少一者的溶液添加至产生阶段培养基中。
在所述方法的实施方案中，扩增阶段和/或产生阶段包括向扩增阶段培养基和/或产生阶段培养基添加抗结块补充剂。在实施方案中，抗结块补充剂包含硫酸葡聚糖、肝素和/或抑制细胞聚集的其它硫酸化糖胺聚糖。在实施方案中，抗结块补充剂包含肝素钠，其可以约25μg/ml至约250μg/ml，例如约25μg/ml、约50μg/ml、约100μg/ml、约150μg/ml和/或约200μg/ml的浓度添加至培养基中。在实施方案中，不将抗结块补充剂添加至产生阶段，或仅在产生阶段结束时在分离步骤之前不久添加，例如在分离产生的rAAV颗粒的步骤之后约10小时内、约5小时内、约4小时内、约3小时内、约2小时内或约1小时内添加。
在实施方案中，产生阶段包括将山梨醇添加至产生阶段培养基中。在实施方案中，在产生阶段期间的一个或多个时间点，例如在引入第一、第二和第三多核苷酸序列中的至少一者之后约6小时、约12小时、约20小时、约24小时、约48小时(即，产生阶段开始之后约6小时、约12小时、约20小时、约24小时、约48小时)，将山梨醇添加至产生阶段培养基中。在实施方案中，向产生培养基中添加山梨醇至约50mM至约200mM、或约80mM至约120mM的浓度。在实施方案中，向产生培养基中添加山梨醇至约100mM的浓度。
在实施方案中，产生阶段为至少约48小时(例如47.5、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、96.5或97小时)。在优选的实施方案中，产生阶段为约72至约100小时、约90小时至约100小时、约92小时至约98小时、或约94至约98小时。在一个实施方案中，产生阶段为约96小时。
在所述方法的实施方案中，通过包括第一、第二和第三多核苷酸序列的一种或多种载体的转染，通过用包括第一、第二和第三多核苷酸序列中的一者或多者的一种或多种病毒载体感染，通过一种或多种载体的转染和一种或多种病毒的感染的组合，或通过用第一、第二和第三多核苷酸序列进行电穿孔，将第一、第二和第三多核苷酸序列中的至少一者引入细胞中。在实施方案中，通过转染将第一、第二和第三多核苷酸序列中的至少一者引入细胞中。
在所述方法的实施方案中，转基因编码治疗蛋白或报告蛋白。转基因实例的非详尽列表包括RPGR、RPE65、GAD65、GAD67和CNGB3。在一些实施方案中，两个AAV ITR是AAV2ITR。在所述方法中，AAV cap基因可来自AAV血清型或AAV变体，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10、AAV-PHP.5、AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB、AAV2-retro、AAV9-retro和其混合体。在实施方案中，一种或多种辅助基因可包括一种或多种腺病毒基因、单纯疱疹病毒1型基因或杆状病毒基因的全部或部分。
在所述方法的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如HEK293细胞。细胞(例如HEK293细胞)可适于悬浮培养。至少一个培养容器可以是例如摇瓶、旋转瓶、细胞袋或生物反应器中的一者或多者。在实施方案中，用于扩增阶段的培养基可具有约7.1至约7.5(例如约7.2至约7.4)的pH，并且培养细胞可包括CO2鼓泡。在一些实施方案中，在引入第一、第二和第三多核苷酸序列中的至少一者的步骤之前，允许培养基的pH在约6.9与约7.3之间漂移。在实施方案中，在将一种或多种多核苷酸构建体引入细胞之前，将培养基的pH改变至约6.9并停止CO2鼓泡。
在实施方案中，分离rAAV颗粒包括在产生阶段之后溶解细胞的步骤。在实施方案中，可在引入第一、第二和/或第三多核苷酸序列(上述步骤(ii))之后约48小时或更长时间(例如47.5、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、96.5、97小时)分离rAAV颗粒。例如，可在引入第一、第二和第三多核苷酸序列之后约90至约100小时、约92小时至约98小时、或约94至约98小时分离rAAV颗粒。在实施方案中，在引入第一、第二和/或第三多核苷酸序列之后约96小时(例如上述步骤(ii)之后约96小时)分离rAAV颗粒(例如溶解细胞)。在实施方案中，分离的rAAV颗粒存在于溶解产物中并且使用至少一个过滤器澄清所述溶解产物，从而产生澄清的溶解产物。在此类实施方案中，所述方法还可包括使澄清的溶解产物经历一个或多个纯化步骤。可使用任何合适的纯化步骤，例如超速离心、亲和色谱和/或离子交换色谱中的一者或多者。在实施方案中，所述方法提供每个细胞至少约40,000至约200,000个rAAV颗粒，和/或：来自1升转染的培养基的大于约8×1012至约1×1014个纯化的rAAV颗粒的平均产量。在实施方案中，所述方法提供至少约30％，例如约30％-40％、至少65％、约65％-90％等的rAAV颗粒与空AAV颗粒比率。在实施方案中，所述方法还包括从溶解产物或澄清的溶解产物的一部分确定以下中的至少一者：衣壳浓度、病毒基因组滴度和rAAV颗粒与空AAV颗粒比率。在所述方法的实施方案中，分离的rAAV颗粒与空AAV颗粒分离。
本发明还提供了通过所述方法产生的rAAV颗粒群体，以及包含rAAV颗粒群体的药物组合物。
附图说明
图1A是显示在用于产生含有RPGR转基因的rAAV5载体的烧瓶模型中补充Ca2+的结果的图。用RPGR转基因质粒、辅助质粒和Rep/Cap质粒转染HEK293细胞，并在转染后6小时或20小时添加0.5mM或2mM CaCl2。在转染后72小时或96小时溶解细胞。提供了转染后72小时和96小时溶解产物中AAV5-RPGR的载体基因组(VG)和衣壳满:空(F:E)比率。
图1B是显示在用于产生含有GAD67转基因的rAAV2载体的烧瓶模型中补充Ca2+的结果的图。用GAD67转基因质粒、辅助质粒和Rep/Cap质粒转染HEK293细胞。转染后20或24小时，将100mM山梨醇、50mMNaCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2或2mM CaCl2/MgCl2添加至培养基中。在转染后72小时或96小时溶解细胞。提供了转染后72小时和96小时溶解产物中AAV2-GAD67的载体基因组(VG)。
图2A和2B是显示在250mL生物反应器中的产生阶段期间补充Ca2+、添加抗结块剂(ACA)和/或添加浓缩必需营养素进料之后的rAAV2产生的图。图2A将96小时收获(转染后)的溶解产物中的VG滴度显示为VG/mL。图2B显示96小时收获(转染后)的溶解产物中的满与空(F:E)比率(百分比)。
图3A和3B是显示转染后12小时添加不同盐对rAAV2产生的影响的图。图3A将VG滴度显示为VG/mL，且图3B显示F:E比率(百分比)。
图4A和4B是显示转染后-1至24小时添加CaCl2(添加至2mM)对rAAV2产生的影响的图。对照是AAV2-无盐。图4A将VG滴度显示为VG/mL，且图4B显示F:E比率(百分比)。
图5A和5B是显示转染后12小时添加CaCl2至0mM(对照)至10mM的浓度对rAAV2产生的影响的图。图5A将VG滴度显示为VG/mL，且图5B显示F:E比率(百分比)。
图6A和6B是显示转染后12小时添加CaCl2至2mM对rAAV2、rAAV5或rAAV8产生的影响的图。图6A将VG滴度显示为VG/mL，且图6B显示F:E比率(百分比)。
具体实施方式
本公开提供了用于产生重组腺相关病毒(rAAV)的方法。产生rAAV颗粒的方法包括以下步骤：
(i)扩增阶段，其包括增加至少一个含有培养基的培养容器中的细胞数量；
(ii)将包含侧接AAV反向末端重复序列(ITR)的转基因的第一多核苷酸序列和任选的包含AAV rep和cap基因的第二多核苷酸序列和/或包含一个或多个辅助基因的第三多核苷酸序列引入细胞中；
(iii)产生阶段(其中产生rAAV颗粒)，其包括培养来自步骤(ii)的细胞并在引入第一多核苷酸序列之后约0至约24小时向培养基中添加钙(Ca)离子，使得培养基中Ca离子的总浓度大于0.3mM且小于10mM；和
(iv)分离rAAV颗粒。
本发明还提供了通过所述方法产生的rAAV颗粒群体，以及包含rAAV颗粒群体的药物组合物。
在实施方案中，所述方法提供增加的产生滴度和/或更高的全衣壳与空衣壳比率(F:E)。更具体地，本公开提供了例如通过向产生培养基中添加Ca离子(例如钙盐如CaCl2)来增加转染细胞的rAAV的产生滴度和/或F:E比率的方法。在实施方案中，与不向产生培养基中添加Ca离子时的产生滴度相比，产生滴度增加约1.5倍、约1.8倍、约2倍、约3倍、约5倍、约10倍或更多倍。在实施方案中与不向产生培养基中添加Ca离子时的F:E比率相比，F:E比率增加约1.3倍、约1.5倍、约2倍、约5倍、约8倍、约10倍、约12倍或更多倍。
所述方法可扩展至制造规模，例如约5至约10、约10至约20、约20至约50、约50至约100、约100至约200或更多升的培养物，并且适用于包含多种AAV血清型/衣壳变体的rAAV。
通过本文公开的方法产生的rAAV载体可用于在靶细胞中表达转基因。这些rAAV载体可用于基因疗法，因为其可将包含可在靶细胞中维持和表达的转基因的多核苷酸引入靶细胞中。rAAV载体能够将异源多核苷酸序列(例如编码治疗蛋白或报告蛋白的多核苷酸序列和用于表达所述蛋白的调节元件)递送至人类患者的靶细胞。转基因实例的非详尽列表包括RPGR、RPE65、GAD65、GAD67和CNGB3。在一些实施方案中，两个AAV ITR是AAV2 ITR。在所述方法中，AAV cap基因可来自AAV血清型或AAV变体，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV12、AAV13、AAVrh10、AAV-PHP.5、AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB、AAV2-retro、AAV9-retro和其混合体。在实施方案中，一种或多种辅助基因可包括一种或多种腺病毒基因、单纯疱疹病毒1型基因或杆状病毒基因的全部或部分。
术语“载体”是指用于将多核苷酸引入靶细胞中的媒剂。载体可以是病毒载体(例如rAAV载体、HSV载体)或例如质粒的非病毒载体，或与例如脂质体、明胶或多胺的化合物相关的DNA。表达载体是含有编码基因产物(例如蛋白质或RNA)的多核苷酸序列的载体，其具有用于在宿主或靶细胞中表达的调节元件。
“rAAV”、“rAAV载体”、“rAAV颗粒”或“rAAV病毒体”是指包装在衣壳蛋白中(即，被衣壳蛋白包裹)，用于随后离体、体外或体内感染靶细胞的重组AAV载体基因组。这些短语排除空AAV衣壳和缺乏含有要在靶细胞中表达的转基因的完整重组AAV基因组的AAV衣壳。因此，除了衣壳之外，rAAV载体还包含rAAV基因组。“rAAV基因组”或“rAAV载体基因组”是指含有最终被包装或衣壳化以形成rAAV颗粒的感兴趣的转基因的多核苷酸序列。典型地，对于rAAV，大部分AAV基因组(包括例如rep、cap和aap基因)已被删除，一个或两个ITR序列与转基因一起保留为rAAV基因组的一部分。如本文所用，“转基因”是指编码基因产物(例如治疗蛋白或报告蛋白)和用于在靶细胞中表达基因产物的调节元件的多核苷酸序列。
“空衣壳”和“空颗粒”是指具有AAV衣壳但完全或部分缺乏包含转基因序列和一个或两个ITR的重组AAV基因组的AAV颗粒。此类空衣壳不起将转基因转移至一个或多个靶细胞中的作用。在实施方案中，分离的rAAV颗粒与空AAV颗粒分离。
rAAV基因组(包括例如ITR)可基于相同毒株或血清型(或亚组或变体)，或者其可彼此不同。作为非限制性实例，基于一种血清型基因组的rAAV质粒或载体基因组或颗粒(衣壳)可与包装载体基因组的一种或多种衣壳蛋白相同。另外，rAAV基因组可源自AAV基因组(例如包含源自AAV2基因组的一种或多种ITR)，其不同于包装rAAV载体基因组的一种或多种衣壳蛋白。
可通过本文公开的方法产生的rAAV载体包括包含源自任何AAV毒株或血清型的衣壳和基因组的任何rAAV载体。作为非限制性实例，rAAV载体衣壳和/或基因组可基于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-PHP-5、AAV-PHP-B、AAV-PHP-eB、AAV2-retro、AAV9-retro、AAVrh74、AAVrh、AAVrh.10(即含有AAVrh.10ITR和AAVrh.10衣壳蛋白的AAV)等。在实施方案中，rAAV载体包含源自相同AAV毒株或血清型的基因组和衣壳蛋白。例如，rAAV载体可以是rAAV2载体(即，含有AAV2ITR和AAV2衣壳蛋白的rAAV)。
在实施方案中，AAV载体是假型rAAV载体，其含有来自一种AAV血清型的ITR和来自不同AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，假型rAAV是rAAV2/5(即，含有AAV2ITR和AAV5衣壳蛋白的rAAV)；rAAV2/8(即，含有AAV2 ITR和AAV8衣壳蛋白的rAAV)；rAAV2/9(即，含有AAV2 ITR和AAV9衣壳蛋白的AAV)rAAV2/10(即，含有AAV2 ITR和AAV10衣壳蛋白的rAAV)。在实施方案中，rAAV载体包含衣壳蛋白，其为变体AAV衣壳，例如AAV2变体rAAV2-retro(来自以引用方式并入本文中的WO 2017/218842的SEQ ID NO:44)。
细胞系
本文所述的rAAV载体产生方法通常需要某些元件，包括例如：(i)rAAV产生的许可宿主细胞(产生细胞)；(ii)可例如通过含有提供腺病毒辅助功能的基因的合适构建体来提供的辅助病毒功能；(iii)转运包装rep/cap结构；以及(iv)合适的产生培养基。
产生细胞是一旦存在rAAV基因组构建体、辅助功能构建体和提供AAV功能(例如表达rep和cap)的构建体时作为rAAV产生的许可宿主细胞的任何细胞。所述术语还可包括已转染的原始细胞的后代。因此，产生细胞也是已用外源DNA序列转染的宿主细胞，或其中所述DNA序列已整合至宿主细胞基因组中的宿主细胞的后代。应理解，由于天然、偶然或有意突变，单一亲本细胞的后代可不必在形态或在基因组或总DNA互补序列上与原始亲本完全相同。
在实施方案中，用于产生rAAV颗粒的细胞是哺乳动物细胞，包括HEK293细胞、BHK细胞和HeLa细胞。示例性产生细胞/宿主细胞包括人胚肾(HEK)细胞，例如HEK293。在优选实施方案中，产生细胞适合在悬浮液中生长，包括适应悬浮液的HEK293细胞。在另外的优选实施方案中，产生细胞适合在无血清培养基中生长。在实施方案中，产生细胞在至少一个培养容器中增加，所述培养容器可以是例如摇瓶、旋转瓶、细胞袋或生物反应器中的一者或多者。
可用于本文公开的rAAV产生方法的产生细胞系包括哺乳动物或昆虫细胞系。术语“细胞系”是指在适当的培养条件下能够在体外连续或长时间生长和分裂的细胞群。细胞系可以但不一定是源自单个祖细胞的克隆群。在细胞系中，在此类克隆群的储存或转移期间以及在组织培养物中长时间传代期间，核型可能会发生自发或诱导的变化。因此，源自细胞系的后代细胞可能与祖先细胞或培养物不完全相同。
为了发生rAAV产生，产生细胞系可能需要rAAV基因组产生构建体、辅助功能构建体和/或AAV rep/cap构建体中的一者或多者存在于产生细胞内。这些可作为三个构建体(例如三个质粒)引入，或者产生细胞可能已经具有一种或多种稳定整合至产生细胞基因组中的构建体，所述构建体提供这些功能中的一些或全部。如本文所用，关于细胞的术语“稳定的”或“稳定整合的”意指核酸序列，例如选择标记和/或异源核酸序列，或质粒或载体(或其部分)已插入染色体(例如，通过同源重组、非同源末端连接、转染等)或在染色体外维持在受体细胞或宿主生物体中，并且已保留在染色体中或在染色体外维持一段时间。
扩增产生细胞系
在本文所述的方法的实施方案中，在引入rAAV基因组产生构建体(含有rAAV基因组)和/或提供辅助病毒功能和AAV功能的其它构建体的步骤之前，使用扩增阶段或扩增步骤来增加产生细胞的数量。扩增阶段或扩增步骤可在一个或多个细胞培养容器中进行。例如，扩增阶段或扩增步骤可在一系列体积增加的细胞培养容器中进行。用于扩增产生细胞系的细胞培养基可以是适合于产生细胞生长(即数量增加)的任何培养基。在优选的实施方案中，扩增阶段培养基不含动物组分，并且不包括例如源自动物的血清或其它组分。化学成分明确、不含动物组分的培养基可商购获得。
在实施方案中，将抗结块补充剂(有时在本文中称为抗结块剂(ACA))添加至扩增培养基中以减少细胞聚集。ACA可从例如Irvine Scientific商购获得。抗结块补充剂可在一个或多个时间点添加至扩增阶段培养基中。在实施方案中，抗结块补充剂包含硫酸葡聚糖、肝素和/或抑制产生细胞聚集的其它硫酸化糖胺聚糖。在实施方案中，抗结块补充剂包含肝素钠，其可以约25μg/ml至约250μg/ml，例如约25μg/ml、约50μg/ml、约100μg/ml、约150μg/ml和/或约200μg/ml的浓度添加至培养基中。
在实施方案中，扩增阶段培养基包含和/或被补充以包含浓度为约2mM至约6mM(例如约2mM、约3mM、约4mM、约5mM或约6mM)的谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽中的一者或多者。谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽中的一者或多者可以是例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酰-L-谷氨酰胺、谷氨酰胺蛋白质水解物、L-谷氨酸和谷氨酰胺二肽中的一者或多者。作为二肽L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺提供的谷氨酰胺补充剂的市售实例是GlutaMAX(ThermoFisher)。
在实施方案中，扩增阶段培养基包含和/或被补充以包含非离子多元醇表面活性剂，例如泊洛沙姆188(聚乙烯和聚丙烯醚二醇的共聚物)。在实施方案中，非离子多元醇表面活性剂以约0.05％至约0.2％(w:v)(例如约0.05％、约0.1％、约0.1％或约0.2％)存在于扩增阶段培养基中。在实施方案中，扩增阶段培养基包含约4mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺二肽和0.1％(w:v)泊洛沙姆188。
在实施方案中，扩增阶段培养基的pH维持在约7.1至约7.5(例如约7.1、约7.2、约7.3、约7.4或约7.5)的pH。在实施方案中，通过CO2鼓泡将pH维持在约7.2至约7.4。在实施方案中，在将一种或多种多核苷酸构建体引入细胞之前，将培养基的pH改变至约6.9并停止CO2鼓泡。
引入一种或多种多核苷酸构建体
rAAV载体生成典型地需要提供基本生物合成机制的产生细胞系，以及(i)提供rAAV基因组的构建体(感兴趣的转基因和侧接AAV ITR的相关调节元件)和(ii)一种或多种具有额外基因的构建体，所述额外基因提供指导rAAV载体产生所需的基因产物。这些额外的基因包括支持载体基因组复制和包装所需的AAV衍生基因(例如AAV rep和cap)和辅助病毒衍生基因(例如腺病毒E1a、E1b、E2a、E4和VA)。
在实施方案中，通过包括第一、第二和第三多核苷酸序列的一种或多种载体的转染，通过用包括第一、第二和第三多核苷酸序列中的一者或多者的一种或多种病毒感染，通过一种或多种载体的转染和一种或多种病毒的感染的组合，或通过用第一、第二和第三多核苷酸序列进行电穿孔，将第一、第二和第三多核苷酸序列中的至少一者引入细胞中。
“辅助病毒基因”或“辅助病毒衍生基因”是指非AAV衍生的病毒基因，复制依赖于所述基因的基因产物AAV。所述术语包括AAV复制所需的蛋白质和/或RNA，包括参与AAV基因转录激活、阶段特异性AAV mRNA剪接和AAV DNA复制的蛋白质和/或RNA。辅助病毒基因可源自任何已知的AAV辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒和牛痘病毒。因此，“辅助病毒功能”是指由AAV产生所需的辅助病毒基因(例如腺病毒E1a、E1b、E2a、E4和VA)提供的那些功能。这些辅助病毒功能可在引入产生细胞中的一种或多种载体上提供，由产生细胞稳定表达，或两者的组合。
如本文所用，“AAV功能”或“AAV辅助功能”是指AAV衍生的编码序列，其可在产生细胞中表达以提供以反式起作用以用于生产性AAV复制和包装的AAV基因产物。因此，AAV功能包括AAV开放阅读框(ORF)，包括rep和cap以及其它功能，例如某些AAV血清型的aap。此类AAV功能由一种或多种多核苷酸构建体提供，所述构建体可以是质粒载体、非质粒载体或已整合至产生细胞染色体中的提供AAV辅助功能的多核苷酸构建体。提供可用于本文公开的方法中的AAV功能的质粒是可商购的。
在所述方法的实施方案中，一种或多种辅助病毒基因由产生细胞(例如HEK293细胞)组成型表达，而其它辅助病毒基因例如通过转染一种或多种编码AAV产生所需的剩余辅助病毒基因的多核苷酸构建体而引入产生细胞中。AAV衍生基因(例如rep和cap)可包含于含有一种或多种辅助病毒基因的相同多核苷酸构建体中，或者可包含于单独的多核苷酸构建体上。在将包含rAAV基因组的多核苷酸构建体(例如rAAV基因组产生载体)引入产生细胞系后，产生rAAV颗粒。在实施方案中，在用(i)rAAV基因组产生载体和(ii)提供辅助病毒基因(例如E4、E2a和VA)和AAV基因(例如rep和cap)的一种或多种载体瞬时转染产生细胞后产生rAAV颗粒。在实施方案中，这些载体是质粒。
在本文公开的方法的实施方案中，在扩增阶段之后，将包含侧接ITR的转基因的第一多核苷酸构建体和包含辅助病毒基因以及AAV rep和cap基因的第二多核苷酸构建体引入扩增的产生细胞中。当第一和第二多核苷酸构建体是质粒时，此系统可称为双质粒系统。
在本文公开的方法的实施方案中，在扩增阶段之后，将包含侧接ITR的转基因的第一多核苷酸构建体、包含辅助病毒基因的第二多核苷酸构建体以及包含AAV rep和cap基因的第三核苷酸构建体引入扩增的产生细胞中。当第一、第二和第三多核苷酸构建体是质粒时，此系统可称为三质粒系统。
在使用一种或多种重组质粒来制造rAAV载体的情况下，“rAAV基因组产生质粒”是指包含包含以下的质粒：转基因(可操作地连接至调节序列)和旨在包装至rAAV中的一种或多种ITR，以及对质粒的克隆和扩增很重要，但不包装或衣壳化至rAAV载体中的非rAAV基因组组分(质粒主链)。
术语“转导”和“转染”是指将多核苷酸引入宿主细胞或靶细胞中。在实施方案中，宿主细胞是产生细胞，例如HEK293细胞。在实施方案中，通过瞬时转染方法将rAAV基因组产生质粒与提供辅助病毒功能和AAV功能的一种或多种质粒一起引入产生细胞中。瞬时转染产生细胞以引入包含转基因和ITR的第一多核苷酸构建体(例如rAAV基因组产生载体)；和任选地提供AAV功能(rep和cap基因)和辅助病毒功能的第二和/或第三多核苷酸构建体可通过标准转染方法来完成，所述标准转染方法包括例如磷酸钙共沉淀、基于阳离子脂质的转染和基于阳离子聚合物的转染。基于阳离子脂质的转染包括例如Lipofectamine(DOSPA(2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰氨基)乙基]-N,N-二甲基-1-三氟乙酸丙亚胺)和DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺)的3:1混合物)。基于阳离子聚合物的转染包括例如使用直链和/或支链聚乙烯亚胺(PEI)、聚-L-赖氨酸、聚-L-精氨酸、聚酰胺胺树枝状聚合物等。在实施方案中，使用基于PEI的转染试剂进行产生细胞的瞬时转染。PEI可以是直链或支链聚合物。在实施方案中，PEI是20-25kD直链PEI。例如，在实施方案中，PEI是jetPEI或PEIpro(可从Polyplus获得)。另外，可使用包含阳离子脂质和阳离子聚合物两者的转染试剂来进行产生细胞的瞬时转染。
或者，rAAV可使用杆状病毒载体在昆虫细胞(例如sf9细胞)中或在HSV感染的幼仓鼠肾(BHK)细胞(例如BHK21)中产生。在这两种方法中，当与两种或更多种携带rAAV基因组和再一种AAV rep和cap以及rAAV复制和包装所需的辅助病毒功能的重组病毒共感染时，分别在宿主细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞中触发rAAV产生。
产生rAAV颗粒
本文公开的方法包括在将rAAV基因组载体和/或提供辅助病毒功能和/或AAV功能的载体引入产生细胞的步骤之后的产生阶段(也称为产生步骤)。在本文所述的方法中，通过在引入rAAV基因组载体之后培养细胞至少约48小时(例如47.5、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、96.5或97小时)来产生rAAV颗粒。在实施方案中，将转染的产生细胞培养(即维持产生阶段)约72至约100小时、约90小时至约100小时、约92小时至约98小时、或约94至约98小时。在实施方案中，产生阶段维持约96小时。
产生阶段培养基可以是适合在产生细胞中产生rAAV的任何细胞培养基。在实施方案中，产生培养基不含动物产品，例如血清。在本文中，“不含”意味着培养基中具有不可检测水平的动物产品，例如血清。在实施方案中，产生培养基的pH与扩增阶段培养基的pH相比降低。在实施方案中，产生培养基的pH维持在约6.8至约7.4(例如约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3或约7.14)。在实施方案中，pH维持在约6.9至约7.3。
在所述方法的实施方案中，产生阶段包括将钙离子添加至产生阶段细胞培养基中。按照本领域的惯例，在悬浮细胞培养过程中使用的培养基配制物中钙离子的水平典型地维持在低水平(通常约0.1mM)以减少或防止细胞聚集。参与细胞间粘附的蛋白质，例如E-钙粘蛋白是钙依赖性的。E-钙粘蛋白的胞外域形成钙依赖性同亲反式二聚体，提供与相邻细胞的特异性相互作用，而胞质域与肌动蛋白细胞骨架相连。因此，在本领域中，通常认为需要维持低水平的钙。
将钙离子添加至产生培养基中，在本文中也称为钙补充，包括添加钙盐形式的钙离子(Ca2+)，例如CaCl2。可在引入rAAV基因组载体后(例如转染后)的产生阶段期间一次或多次添加钙离子。例如，可在产生阶段开始后(即转染后)约0小时至约48小时之间，例如约1小时、约6小时、约10小时、约12小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、和/或约48小时一次或多次添加钙离子。在实施方案中，在产生阶段开始后(即转染后)约0小时至约24小时、约0小时至约20小时、约0小时至约18小时、或约6小时至约12小时之间一次或多次将钙离子添加至产生培养基中在实施方案中，在转染后约6小时将钙离子添加至产生阶段培养基中。
可将钙离子添加至产生培养基中以实现培养基中的钙离子总浓度大于0.3mM且小于10mM。在实施方案中，添加钙离子至总浓度为约1mM至约9mM、约1mM至约8mM、约1mM至约7mM、约2mM至约9mM、约2mM至约8mM、约2mM至约7mM、约2mM至约6mM、约2mM至约5mM、或约2mM至约4mM。在实施方案中，添加钙离子(例如CaCl2)至浓度为约1mM、约1.5mM、约2mM、约2.5mM、约3mM、约3.5mM、约4mM、约4.5mM、约5mM、约5.5mM、约6mM、约6.5mM、约7mM、约7.5mM、约8mM、约8.5mM、约9或约9.5。
在实施方案中，产生阶段包括将谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽中的一者或多者添加至产生阶段培养基中。谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽中的一者或多者可以是例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酰-L-谷氨酰胺、谷氨酰胺蛋白质水解物、L-谷氨酸和谷氨酰胺二肽中的一者或多者。包含谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽中的至少一者的溶液可在例如转染后约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时中的一个或多个时间添加至产生阶段培养基中。
在实施方案中，产生阶段包括将山梨醇添加至产生阶段培养基中。山梨醇可在产生阶段期间的一个或多个时间点，例如在转染后约6小时、约12小时、约20小时、约24小时和/或约48小时添加至产生阶段培养基中。在实施方案中，向产生培养基中添加山梨醇至约50mM至约200mM、或约80mM至约120mM的浓度。在实施方案中，向产生培养基中添加山梨醇至约100mM的浓度。
在实施方案中，产生阶段包括向产生阶段培养基中添加抗结块补充剂。抗结块补充剂可在一个或多个时间点添加至产生阶段培养基中(例如在转染后约6、约10、约12、约20、约24、约48或约72小时中的一者或多者)。在实施方案中，抗结块补充剂包含硫酸葡聚糖、肝素和/或抑制产生细胞聚集的其它硫酸化糖胺聚糖。在实施方案中，抗结块补充剂包含肝素钠，其可以约25μg/ml至约250μg/ml，例如约25μg/ml、约50μg/ml、约100μg/ml、约150μg/ml和/或约200μg/ml的浓度添加至培养基中。
在实施方案中，抗结块补充剂不添加至产生阶段培养基，或仅在产生阶段结束前不久添加至产生阶段培养基，例如在产生阶段结束的约24小时内、约12小时内、约6小时内，约3小时内、约2小时内或约1小时内。
分离rAAV
本文所述的方法的实施方案包括在产生阶段结束时分离rAAV颗粒。在实施方案中，可在引入第一、第二和/或第三多核苷酸序列之后(在上述步骤(ii)之后，换句话说，在产生阶段开始之后)约48小时或更长时间(例如47.5、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、96.5、97小时)分离rAAV颗粒。例如，可在引入第一、第二和第三多核苷酸序列之后约90至约100小时、约92小时至约98小时、或约94至约98小时分离rAAV颗粒。在实施方案中，在引入第一、第二和/或第三多核苷酸序列之后约96小时(例如上述步骤(ii)之后约96小时)分离rAAV颗粒(例如溶解细胞)。分离rAAV可包括多个步骤，包括例如溶解产生细胞、澄清溶解产物以及随后的纯化步骤。
rAAV颗粒可在产生后保留在产生细胞内，并且释放细胞内rAAV载体的方法包括物理和化学破坏，例如使用洗涤剂、微流化和/或均质化。在细胞溶解期间和/或随后在细胞溶解之后，可添加核酸酶，例如全能核酸酶(benzonase)以降解污染DNA。
典型地，将所得溶解产物澄清以去除细胞碎片并提供澄清的细胞溶解产物。过滤技术可用于将rAAV载体与例如细胞碎片等较大颗粒分离(微滤)以及与例如可溶性蛋白质杂质等较小分子分离(超滤)。例如，已破坏的含有rAAV载体的细胞可通过一个或多个微米直径孔径过滤器(例如0.1-10.0μm孔径过滤器，例如0.45μm和/或孔径0.2μm过滤器)。两级0.45/0.2μm滤筒过滤器可用于将过滤器渗透物中回收的rAAV载体与过滤器保留的细胞碎片分离。在实施方案中，所述方法还包括从溶解产物或澄清的溶解产物的一部分确定以下中的至少一者：衣壳浓度、病毒基因组滴度和rAAV颗粒与空AAV颗粒比率。
澄清的溶解产物中的rAAV载体可通过使用一种或多种另外的纯化方法，包括超速离心、亲和色谱、离子交换色谱和切向流过滤(TFF)来进一步分离(纯化)。
在实施方案中，分离的rAAV颗粒与空AAV颗粒分离，并且所述方法提供至少约30％，例如约30％-40％、至少65％、约65％-90％等的rAAV颗粒与空AAV颗粒比率。可使用针对辅助质粒中相关序列或高拷贝数基因组序列设计的引物和探针，通过qPCR来评估核酸酶抗性、AAV衣壳化DNA杂质的水平。在qPCR之前进行的核酸酶处理的敏感性可区分核酸酶敏感的‘裸’残留DNA杂质和核酸酶不敏感的衣壳化残留DNA杂质。可使用衣壳特异性ELISA测定来测量总AAV衣壳，并通过比较衣壳颗粒滴度和VG滴度来确定空衣壳的量。分光光度法可用于已基本上去除非AAV衣壳杂质的样品。
实施例
实施例1.评估添加氯化钙对摇瓶模型中的AAV产生的影响
在E125摇瓶中培养的悬浮适应HEK293细胞中评估了不同产生时间点和浓度以及产生长度下的氯化钙添加情况。在烧瓶过程结束时，收获培养物并进行化学溶解。根据物理衣壳和病毒基因组滴度评估条件之间的性能。
种子培养和扩增：
将HEK293细胞在锥形烧瓶(E1000)中扩增至足够用于研究的数量，并在CO2振荡培养箱(New Brunswick S41i)中培养。种子培养瓶以每毫升2×105个活细胞(VC)的接种密度接种，种子体积为200ml。种子培养基是补充有4mM GlutaMAX和0.1％w:v泊洛沙姆188的化学成分确定的培养基。接种后48小时，添加180mL化学成分确定的进料培养基(进料:种子培养基体积比为9:10)。
在第一次传代期间以及此后定期以1mL/L添加抗结块剂(ACA,Fujifilm IrvineScientific)，以控制细胞聚集。
HEK293细胞在37℃与8％CO2和以150rpm与1英寸轨道旋转搅拌下培养。细胞在补充有4mM GlutaMAX和0.1％w:v泊洛沙姆188的化学成分确定的培养基中培养。
AAV5-RPGR的转染条件：
接种后96小时，以约1.8-2.4×106VC/mL的细胞密度用以下质粒转染E1000无挡板烧瓶(Corning)中的HEK293细胞：辅助(pFD6k，15.4kb)；Rep/Cap(pRC2-5k，8.1kb)；转基因(pRPGR-k，7.7kb)，质粒拷贝数比率为1:1:2，转染时每106个活细胞的总DNA量为0.95μg总DNA。
以1.3:1(v:w)的PEI:DNA比率制备转染混合物，DNA浓度为30mg/L。转染混合物的培养基是化学成分确定的培养基(未补充)。将辅助、Rep/Cap和转基因构建体添加至培养基中。将PEI添加至培养基中，混合，且接着将混合物添加至DNA混合物中，然后旋转并培育15分钟。培育15分钟后，将转染混合物添加至烧瓶中，将烧瓶放回摇床培养箱。
rAAV2-GAD67的转染条件：
接种后96小时，以约1.8-2.4×106VC/mL的细胞密度用以下质粒转染E1000无挡板烧瓶(Corning)中的HEK293细胞：辅助(pFD6k，15.4kb)；Rep/Cap(pNLRep2-2-K，10.3kb)；转基因(pGAD67k,7.1kb)，质粒拷贝数比率为2:1.5:1，转染时每106个活细胞的总DNA量为1.0μg总DNA。
以1.5:1(v:w)的FectoVIR:DNA比率制备转染混合物，DNA浓度为80mg/L。转染混合物的培养基是化学成分确定的培养基(未补充)。将辅助、Rep/Cap和转基因构建体添加至培养基中。将FectoVIR添加至培养基中，混合，且接着添加至DNA混合物中，然后旋转并培育15分钟。培育15分钟后，将转染混合物添加至烧瓶中，将烧瓶放回摇床培养箱。
rAAV产生条件：
对于用AAV5-RPGR质粒转染的HEK293细胞，转染后一小时将细胞吐入E125无挡板烧瓶(Corning)中，并在37℃、8％CO2、150RPM、1”轨道旋转下继续培育。转染的HEK293细胞在37℃、8％CO2、180RPM、1”轨道旋转下培育，并在转染后6小时或24小时添加1M CaCl2储备溶液至0.5mM或2.0mM的浓度。对于对照烧瓶，不添加储备溶液。
对于用AAV2-GAD67质粒转染的HEK293细胞，转染后一小时将细胞吐入E125无挡板烧瓶(Corning)中，并在37℃、8％CO2、150RPM与1”轨道旋转下继续培育。转染的HEK293细胞在37℃、8％CO2、150RPM与1”轨道旋转下培育，并添加以下之一：转染后20小时，添加4M D-山梨醇至浓度为100mM山梨醇；转染后20小时，添加4M NaCl储备液至浓度为50mM NaCl；转染后24小时，添加1M CaCl2储备液至浓度为2mM CaCl2；转染后24小时，添加1M MgCl2储备溶液至浓度2mM MgCl2；或转染后24小时，添加1M CaCl2和1M MgCl2储备溶液至浓度为2mMCaCl2和2mM MgCl2。对于对照烧瓶，不添加储备溶液。
溶解条件：
转染后96小时收获细胞。50X溶解缓冲液(配制为达到以下最终浓度：0.1％TritonX-100、2mM MgCl2、1mM Tris、125U/107个全能核酸酶细胞)以2％v/v添加至细胞培养物中并在37℃和150RPM下培育2小时。
病毒衣壳和病毒基因组滴度的确定：
使用来自ProgenTM的AAV滴定ELISA试剂盒或来自Gyros Protein Technologies的AAVX滴度试剂盒，通过遵循制造商的指南，通过ELISA来确定病毒衣壳(VC)滴度。
通过qPCR测定病毒基因组(VG)浓度和滴度。对样品进行DNA酶I处理，然后进行蛋白酶K处理。通过将足量的样品与含有核苷酸、正向引物、反向引物和针对每个转基因特定区域的Taqman探针的qPCR主混合物混合来测定四种连续稀释液。使用质粒DNA或含有目标区域的DNA寡核苷酸建立七点标准曲线，并用于评估每个样品的病毒基因组数量。
结果：
与未补充的对照培养物相比，在转染后6或20小时添加0.5mM或2mM CaCl2之后，rAAV5的病毒基因组(VG)滴度增加了3.5倍。参见图1A。与未补充的对照培养物相比，补充Ca2+可使rAAV2的病毒基因组(VG)滴度增加约4至5倍。参见图1B。另外，全衣壳与空衣壳(F:E)比率从对照培养物中的10-15％增加至rAAV5的30-40％。参见图1A。当补充Ca2+与将产生时间延长至转染后96小时组合时，病毒基因组滴度和F:E比率均显著增强。参见图1A和1B。与对照相比，补充NaCl或MgCl2并未增加VG滴度，而补充山梨醇似乎在转染后96小时收获时对rAAV2的VG滴度有一些改善。参见图1B。
实施例2：评估添加氯化钙对250ml规模生物反应器中的AAV产生的影响
本研究使用250mL规模的搅拌罐生物反应器来评估在AAV产生阶段期间添加CaCl2、添加CaCl2的时间、添加ACA、添加GlutaMAX以及添加某些进料。
种子培养：将悬浮适应的HEK293细胞在锥形烧瓶(E125、E250、E500和E1000)中扩增至足够用于研究的数量，并在CO2振荡培养箱(New Brunswick S41i)中培养。种子培养烧瓶以1.5或3.0×105VC/mL的接种密度接种，并分别扩增96小时和72小时培养时间。
在第一次传代期间以及此后定期以1mL/L添加抗结块剂(ACA,IrvineScientific)，以控制细胞聚集。
HEK293细胞在37℃与8％CO2和以150rpm与1英寸轨道旋转搅拌下培养。细胞在补充有4mM GlutaMAX和0.1％w:v泊洛沙姆188的化学成分确定的培养基中培养。
生物反应器细胞扩增
用于在250mL搅拌罐生物反应器中扩增的种子培养基是补充有4mM GlutaMAX和0.1％w:v泊洛沙姆188的化学成分确定的培养基。HEK293细胞以2.0×105VC/mL的目标接种密度接种在总工作体积(113mL)的45％的体积中。
接种后48小时，向细胞喂以化学成分确定的培养基(未补充)，喂料体积为总工作体积(100mL)的40％。
温度设定点为37℃，pH设定点为7.30±0.05，且DO设定点为50％。通过在生物反应器中鼓入空气和纯氧来控制DO水平，并通过添加CO2(酸)和氢氧化钠(碱)来控制pH。搅拌在45％总工作体积时的7.5W/m3与85％总工作体积时的17.5W/m3之间变化。
转染
接种后96小时，以约1.6-2.2×106VC/mL的细胞密度用以下质粒转染HEK293细胞：辅助(pFD6k，15.4kb)；Rep/Cap(pNLRep2-2-K，10.3kb)；转基因(pGAD67k,7.1kb)，质粒拷贝数比率为2:1.5:1，转染时每106个活细胞的总DNA量为1.0μg总DNA。
以1.5:1(v:w)的FectoVIR:DNA比率和转染混合物中80mg/L的DNA浓度制备转染混合物。转染混合物的培养基是化学成分确定的培养基(未补充)。将辅助、Rep/Cap和转基因构建体添加至培养基中。将FectoVIR添加至培养基中，混合，且接着添加至DNA混合物中，然后旋转并培育15分钟。培育15分钟后，将转染混合物添加至生物反应器中。
rAAV产生
rAAV产生参数：温度设定为37℃；DO设定点50％；pH设定点6.9，不添加CO2；以及搅拌设定点17.5W/m3和85％总工作体积。测试的产生条件提供于表1中。
对于添加进料的条件，在产生阶段期间添加BalanCD HEK293进料4次(第一次钙添加、转染后24小时、48小时和72小时)，每次添加3％v/v(每次添加6.4mL)。在添加CaCl2的运行中，在转染后6、12或20小时添加1M CaCl2储备溶液至2mM CaCl2的浓度。在添加ACA的运行中，转染后20小时添加2mL/L ACA。在产生阶段期间添加GlutaMAX的运行中，添加GlutaMAX4次(转染后6、24、48和72小时)，以在生物反应器中达到每次添加1mM GlutaMAX的浓度(每次添加1.1mL)。当在同一时间点添加CaCl2、ACA、BalanCD HEK293 Feed或GlutaMAX时，将单独的溶液合并。
表1.测试的生物反应器rAAV产生条件。
细胞溶解
转染后96小时收获细胞。50X溶解缓冲液(配制为达到最终浓度：0.1％Triton X-100、2mM MgCl2和1mM Tris)以2％v/v与全能核酸酶125U/107个总细胞一起添至生物反应器中，并在37℃和17.5W/m3下以85％总工作体积培育2小时。
病毒衣壳和病毒基因组滴度的确定：
如上所述地进行病毒衣壳和病毒基因组滴度的确定。
结果：
在生物反应器缩小模型中，在rAAV产生阶段期间进行钙补充可使rAAV2的VG滴度相比于对照增加7至8倍，并且使F:E比率从5-10％增加至65-90％。参见图2A和2B。与不添加ACA或基于葡萄糖的进料的Ca2+补充相比，除了补充Ca2+之外，在产生阶段期间还添加ACA和基于葡萄糖的进料降低了F:E比率。然而，F:E比率仍然比对照高约四倍。参见图2B。与在产生阶段期间添加相同补充剂(包括CaCl2)但不含谷氨酰胺的运行相比，添加谷氨酰胺似乎可提高VG滴度。参见图2A。
实施例3：评估盐添加时间和浓度对rAAV产生的影响
通过在不同时间点或以不同浓度添加CaCl2之后检查VG滴度和F:E衣壳比率，以及评估添加其它盐的效果来评估rAAV2和rAAV5血清型的产生。通过在转染前1小时(-1小时)、转染时(0小时)、或转染后6小时、12小时、18小时和24小时添加CaCl2来评估CaCl2的添加时机(至最终浓度为2mM)。在转染后12小时，通过添加CaCl2至最终浓度为0.3mM、2mM、4mM、6mM或10mM，测试了一系列CaCl2浓度。此外，将添加CaCl2至最终浓度为2mM与添加MgCl2至最终浓度为2mM或添加NaCl至最终浓度为4mM(各自在转染后12小时添加)进行比较。
种子培养和扩增、转染、产生和溶解的方法与上述rAAV2-GAD67和rAAV5-RPGR的方法基本上相同，除了在任何条件下在转染后不添加ACA。产生阶段结束并在转染后96小时溶解细胞。
结果：向产生阶段培养基中添加NaCl或MgCl2不会导致VG滴度或F:E衣壳比率增加(图3A和3B)。与对照(未补充钙)相比，转染前1小时通过添加CaCl2至2mM进行钙补充使VG滴度和F:E衣壳比率显著降低。参见图4A和4B。与对照相比，转染后0至18小时通过添加CaCl2至2mM进行钙补充使VG滴度增加至多1.5倍。参见图4A。当转染后0小时添加CaCl2时，观察到F:E衣壳比率增加。参见图4B。当添加CaCl2至最终浓度为2至6mM时，观察到VG滴度改善(图5A)，并且当添加CaCl2至浓度为2mM或4mM时，F:E比率最高(图5B)。
实施例4：在250ml生物反应器中产生AAV2、AAV5和AAV8
在250mL规模的搅拌罐生物反应器中进行rAAV2-GAD67、rAAV5-RPE65和rAAV8-CNGB3的产生，以评估添加CaCl2对VG滴度和F:E比率的影响。如以上实施例3中所述地进行种子培养、扩增、转染、产生和溶解的方法。具体地，在转染后12小时向产生培养物中添加CaCl2至2mM。在任何条件下均未在转染后添加ACA。产生阶段结束并在转染后96小时溶解细胞。
结果：
通过在转染后12小时添加CaCl2至2mM进行钙补充使rAAV2、rAAV5和rAAV8的VG滴度分别提高1.5倍、1.4倍和1.5倍(图6A)。另外，钙补充使rAAV5的F:E比率增加3倍(图6B)。

Claims (32)

1.一种产生重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，所述方法包括：
(i)扩增阶段，所述扩增阶段包括增加至少一个含有培养基的培养容器中的细胞数量；
(ii)将包含侧接AAV反向末端重复序列(ITR)的转基因的第一多核苷酸序列和任选的包含AAVrep和cap基因的第二多核苷酸序列和/或包含一个或多个辅助基因的第三多核苷酸序列引入所述细胞中；
(iii)产生阶段，其中产生rAAV颗粒，所述产生阶段包括培养来自步骤(ii)的所述细胞并在步骤(ii)之后约0至约24小时向所述培养基中添加钙(Ca)离子，使得所述培养基中的Ca离子浓度大于0.3mM并且小于10mM；和
(iv)分离所述rAAV颗粒。
2.如权利要求1所述的方法，其中向所述产生阶段培养基中添加Ca离子包括添加钙盐。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述钙盐包括CaCl2。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中添加所述Ca离子至约0.5mM至约6mM的浓度。
5.如权利要求4所述的方法，其中添加所述Ca离子至约2mM至约6mM的浓度。
6.如权利要求4所述的方法，其中添加所述Ca离子至约2mM至约4mM的浓度。
7.如权利要求4所述的方法，其中添加所述Ca离子至约1mM至约3mM的浓度。
8.如权利要求4所述的方法，其中添加所述Ca离子至约2mM的浓度。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)之后约0小时至约24小时将所述Ca离子添加至所述产生阶段培养基中。
10.如权利要求4所述的方法，其中在步骤(ii)之后约6小时至约18小时将所述Ca离子添加至所述产生阶段培养基中。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)之后约12小时添加Ca离子至所述培养基中的Ca离子浓度为约2mM。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述产生阶段(步骤iii)为至少约48小时、约72小时至约100小时、约90小时至约100小时、约92小时至约98小时、约94至约98小时、或约96小时。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述产生阶段包括向所述产生阶段培养基中添加以下中的一者或多者：(a)谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽；和/或(b)山梨醇。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽中的一者或多者选自L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酰-L-谷氨酰胺、谷氨酰胺蛋白质水解物、L-谷氨酸和谷氨酰胺二肽中的一者或多者。
15.如权利要求13所述的方法，其中在步骤(ii)之后约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时中的一个或多个时间将谷氨酰胺、谷氨酰胺前体或包含谷氨酰胺的氨基酸二肽中的至少一者添加至所述培养基中。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中将抗结块补充剂添加至所述培养基中。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中通过包括所述第一、第二和第三多核苷酸序列的一种或多种载体的转染，通过用包括所述第一、第二和第三多核苷酸序列中的一者或多者的一种或多种病毒感染，通过所述一种或多种载体的转染和所述一种或多种病毒的感染的组合，或通过用所述第一、第二和第三多核苷酸序列进行电穿孔，将所述第一、第二和第三多核苷酸序列中的至少一者引入所述细胞中。
18.如权利要求17所述的方法，其中通过转染将所述第一、第二和第三多核苷酸序列中的至少一者引入所述细胞中。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述转基因编码治疗蛋白或报告蛋白。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述转基因选自由以下组成的组：RPE65、RPGR、GAD65、GAD67和CNGB3。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述AAV ITR是AAV2 ITR。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述AAV cap基因来自选自由以下组成的组的AAV血清型或AAV变体：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10、AAV-PHP.5、AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB、AAV2-retro、AAV9-retro和其混合体。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是HEK293细胞。
25.如权利要求23或24所述的方法，其中所述细胞在悬浮液中培养。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述至少一个培养容器是摇瓶、旋转瓶、细胞袋或生物反应器。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，所述培养基具有约7.2至约7.4的pH并且培养所述细胞包括CO2鼓泡。
28.如权利要求27所述的方法，其中在步骤(ii)之前，将所述培养基的pH改变至约6.9并且停止CO2鼓泡。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离所述rAAV颗粒的步骤包括溶解所述细胞并任选地澄清所得溶解产物并对所述澄清的溶解产物进行纯化步骤。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述纯化步骤选自由以下组成的组：超速离心、亲和色谱和离子交换色谱。
31.一种rAAV颗粒群体，所述rAAV颗粒群体由根据权利要求1至30中任一项所述的方法产生。
32.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求31所述的rAAV颗粒群体。
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