ES2962460T3 - Inhibidores de mdm2 y combinaciones de estos - Google Patents

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Giordano Caponigro
Thomas Horn-Spirohn
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Abstract

La presente divulgación se refiere a una combinación farmacéutica que comprende (a) un inhibidor de Mdm2 y (b)(i) un inhibidor de MEK y/o (b)(ii) inhibidor de Bcl2, particularmente para su uso en el tratamiento de un cáncer. Esta divulgación también se refiere a usos de dicha combinación para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer; métodos para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar a dicho sujeto una cantidad conjunta terapéuticamente eficaz de dicha combinación; composiciones farmacéuticas que comprenden dicha combinación y envases comerciales de las mismas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Inhibidores de mdm2 y combinaciones de estos
Campo de la divulgación
La presente invención se refiere a una combinación farmacéutica que comprende el inhibidor de MDM2 (6S)-5-(5-cloro-1 -metil-2-oxo-1,2-dihidropi ridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipi rimidin-5-il)-1-(propan-2-il)-5,6-dihidropirrolo[3,4-d]imidazol-4(1H)-ona, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y el inhibidor de Bcl2 ABT-199, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en particular para su uso en el tratamiento de un cáncer. La invención se define en las reivindicaciones.
ANTECEDENTES DE LA DIVULGACIÓN
La aparición de terapias dirigidas para el cáncer ha aumentado la esperanza de vida de los pacientes para diversas neoplasias malignas y ha ayudado a apreciar la complejidad de los tumores a través del estudio de los mecanismos de resistencia a los fármacos. El hecho de que las respuestas clínicas frente a los agentes dirigidos sean generalmente incompletas y/o transitorias es el resultado de una multitud de factores que se pueden agrupar a grandes rasgos en dos clases: toxicidades que impiden la dosificación óptima de los fármacos y, en consecuencia, limitan el acoplamiento a la diana (Brana y Siu 2012, Chapman, Solitet al.2014) y la capacidad de los cánceres para adaptarse y mantener su potencial proliferativo frente a perturbaciones (Druker 2008, Chandarlapaty 2012, Doebele, Pillinget al.2012, Duncan, Whittleet al.2012, Katayama, Shawet al.2012, Lito, Rosenet al.2013, Sullivan y Flaherty 2013, Solit y Rosen 2014). Las combinaciones de fármacos pueden resolver estos dos factores ya que mejoran las eficacias globales y, al mismo tiempo, actúan sobre la robustez y complejidad de los tumores para contrarrestar su resistencia (Robert, Karaszewskaet al.2015, Turner, Roet al.2015). Todavía no se ha clarificado cuántos fármacos son necesarios ni sobre qué procesos se debe actuar de forma combinada para superar el cáncer. Pero es casi seguro que deben inhibirse diferentes vías o iniciadores oncogénicos, con lo que lo más probable es que se requieran dos o más fármacos (Bozic, Reiteret al.2013). Esto está respaldado por los éxitos de combinar agentes quimioterapéuticos convencionales para tratar cánceres (DeVita 1975) y terapias combinadas para enfermedades infecciosas tales como el VIH (Porter, Babikeret al.2003), así como por estrategias teóricas que muestran cómo la robustez biológica puede ser desafiada aumentando el orden de perturbaciones (Lehar, Kruegeret al.2008).
K Kojimaet al.«Cell cycle, Landes Bioscience, US», vol. 5, n.° 23, 1 de diciembre de 2006, páginas 2778-2786, XP002740450, hace referencia a que la inhibición concomitante de MDM2 y la función de la proteína Bcl-2 induce de forma sinérgica la apoptosis mitocondrial en la LMA.
A pesar de las numerosas opciones de tratamiento para pacientes con tipos específicos de cáncer, siguen siendo necesarias terapias combinadas seguras y eficaces que se puedan administrar para el tratamiento eficaz del cáncer a largo plazo.
COMPENDIO DE LA DIVULGACIÓN
Un objeto de la presente divulgación consiste en proporcionar un medicamento para mejorar el tratamiento de un cáncer, en particular para mejorar el tratamiento del cáncer a través de la inhibición del crecimiento celular (proliferación) y la inducción de la apoptosis. Un objeto de la presente divulgación consiste en encontrar terapias combinadas novedosas, que presenten sinergia selectivamente en la inhibición de la proliferación y/o en la inducción de la apoptosis.
Inhibidores tales como los inhibidores de MDM2, inhibidores de MEK e inhibidores de BCL2, como monoterapia, presentan actividades antiproliferativas (citostáticas) y proapoptóticas (citotóxicas) en ensayos preclínicosin vivoein vitro.Sorprendentemente, se ha descubierto que una combinación farmacéutica comprende
el inhibidor de MDM2 (6S)-5-(5-cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-(propan-2-il)-5,6-dihidropirrolo[3,4-d]imidazol-4(1 H)-ona, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y el inhibidor de Bcl2 ABT-199, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, tiene una interacción sinérgica beneficiosa, una actividad contra el cáncer mejorada, un efecto antiproliferativo mejorado y un efecto proapoptótico mejorado. Estas combinaciones presentaron un efecto sinérgico en la inhibición del crecimiento celular y la inducción de la muerte celular por apoptosis.
Además, se ha descubierto que esta combinación puede comprender de forma ventajosa otros inhibidores seleccionados entre inhibidores de EGFR, inhibidores de PI3K e inhibidores de BRAF. Además, se puede añadir a la combinación un inhibidor de CDK4/6 o un tratamiento asistencial habitual tal como paclitaxel, lo que puede conducir a un efecto sinérgico adicional o una fuerte inducción de la apoptosis. Una combinación del inhibidor de MDM2 de la invención con un inhibidor de Bcl2 de la invención puede complementarse con un inhibidor de BRAF (p. ej., dabrafenib) y un inhibidor de CMET (p. ej., PF-04217903) para formar una combinación cuádruple. Se puso de manifiesto que esta última combinación era débilmente sinérgica, pero con una fuerte inducción de apoptosis.
En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende la combinación farmacéutica de la divulgación y al menos un portador farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a la combinación farmacéutica o la composición farmacéutica de la divulgación para su uso como medicamento.
En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a la combinación farmacéutica o la composición farmacéutica de la divulgación para su uso en el tratamiento del cáncer.
Específicamente, la presente divulgación proporciona los siguientes aspectos, características ventajosas y realizaciones específicas, respectivamente, solos o combinados, como se enumeran en las reivindicaciones más adelante.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
FIG. 1Curvas de respuesta-dosis para 8 líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural para el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxo-piperazin-1-il)-transciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (Co Mp Ue St O A) (círculo) y el inhibidor de MEK trametinib (triángulo) y su combinación (rombo). El eje de las x indica el log10 de la dilución del tratamiento; el eje de las y indica el recuento celular después del tratamiento respecto al DMSO. Las combinaciones son el resultado de la combinación con una relación fija (1: 1) de los agentes individuales. La línea discontinua fuerte indica el número de células antes del inicio del tratamiento («línea de base»).
FIG. 2Curvas de respuesta-dosis para 8 líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural para el inhibidor de MDM2 (6S)-5-(5-cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-(propan-2-il)-5,6-dihidropirrolo[3,4-d]imidazol-4(1H)-ona (COMPUESTO B) (círculo) y el inhibidor de MEK trametinib (triángulo) y su combinación (rombo). El eje de las x indica el log10 de la dilución del tratamiento; el eje de las y indica el recuento celular después del tratamiento respecto al DMSO. Las combinaciones son el resultado de la combinación con una relación fija (1: 1) de los agentes individuales. La línea discontinua fuerte indica el número de células antes del inicio del tratamiento («línea de base»).
FIG. 3Análisis de isobolograma a un nivel de inhibición de un 75 % para combinaciones del inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-transciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO A) o el inhibidor de MDM2 (6S)-5-(5-cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-(propan-2-il)-5,6-dihidropirrolo[3,4-d]imidazol-4(1H)-ona (COMPUESTO B) (eje de las y) con el inhibidor de MEK trametinib (eje de las x) en 8 líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural. Los puntos en la curva diagonal indican un efecto aditivo, los puntos a su derecha indican un antagonismo y los puntos a su izquierda indican sinergia. El círculo vacío muestra la combinación con el índice de combinaciones más bajo (sinergia más fuerte) (véase la Tabla 2 para consultar el valor).
FIG.4Inducción máxima de la Caspasa 3/7 para el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopi perazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO A), el inhibidor de MEK trametinib y su combinación en 5 líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural y después de 24 h, 48 h y 72 h (diferentes tonalidades de gris). El eje de las x indica el tratamiento; el eje de las y indica la inducción máxima de la Caspasa 3/7 (% de células) observada para cada tratamiento.
FIG. 5Ensayos de formación de colonias a largo plazo para los agentes individuales y la combinación del inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-transciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO A) y el inhibidor de MEK trametinib. «COMPUESTO A (L)»: 0,33|jM; «COMPUESTO A (H)»: 1|jM; «trametinib (L)» para todos los casos excepto LIM2405 y SW48: 4 nM; «trametinib (H)» para todos los casos excepto LIM2405 y S<w>48: 12 nM; «trametinib (L)» para LIM2405 y SW48: 1 nM, «trametinib (H)» para LIM2405 y SW48: 3 nM. (A) Imágenes representativas de las células después de una tinción con violeta cristal. (B) Cuantificación de la señal de violeta cristal de (A). Las barras muestran el promedio ± la desviación estándar para n = 3 réplicas. Para la prueba de significancia, véase la Tabla 3. UFR = Unidad de fluorescencia relativa.
FIG. 6Análisis de FACS para el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO A) y el inhibidor de MEK trametinib y su combinación después de 24 h de tratamiento. «COMPUESTO A (L)»: 0,33<j>M; «COMPUESTO A (H)»: 1<j>M; «trametinib (L)» para todos los casos excepto LIM2405 y S<w>48: 4 nM; «trametinib (H)» para todos los casos excepto LIM2405 y SW48: 12 nM; «trametinib (L)» para LIM2405 y SW48: 1 nM, «trametinib (H)» para LIM2405 y SW48: 3 nM. Las barras apiladas indican el porcentaje de la población celular en cada una de las fases del ciclo celular: subG1, G1, S y G2.
FIG. 7Análisis de inmunotransferencia de Western para el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO A) y el inhibidor de MEK trametinib y su combinación después de 24 h de tratamiento. «COMPUESTO A (L)»: 0,33|jM; «COMPUESTO A (H)»: 1|jM; «trametinib (L)» para todos los casos excepto LIM2405 y SW48: 4 nM; «trametinib (H)» para todos los casos excepto LIM2405 y S<w>48: 12 nM; «trametinib (L)» para LIM2405 y SW48: 1 nM, «trametinib (H)» para LIM2405 y SW48: 3 nM.
FIG. 8Análisis de qRT-PCR de 5 genes diana para el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO A) y el inhibidor de MEK trametinib y su combinación después de 10 h de tratamiento. «COMPUESTO A (L)»: 0,33 j M; «COMPUESTO A (H)»: 1 j M; «trametinib (L)» para todos los casos excepto LIM2405 y SW48: 4 nM; «trametinib (H)» para todos los casos excepto LIM2405 y Sw 48: 12 nM; «trametinib (L)» para LIM2405 y SW48: 1 nM, «trametinib (H)» para LIM2405 y sW48: 3 nM. Las barras muestran la expresión diferencial en la escala log2 en comparación con el tratamiento de DMSO, las barras de error muestran la desviación estándar para n = 2 réplicas.
FIG. 9Curvas de respuesta-dosis para el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO A) (círculos), el inhibidor de MEK trametinib (<c>O<m p>U<e>STO B, triángulos), el inhibidor de BCL-2/-XL inavitoclax (ABT-263) (COMPUESTO C, rombos) y sus combinaciones A+B (círculos, línea de puntos), A+C (triángulos), B+C (rombos) y A+B+C (círculos, línea continua) en 5 líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural. El eje de las x indica el log10 de la dilución del tratamiento; el eje de las y indica el recuento celular después del tratamiento respecto al DMSO. La línea discontinua fuerte indica el número de células antes del inicio del tratamiento («línea de base»).
FIG. 10Inducción máxima de la Caspasa 3/7 para el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO A), el inhibidor de MEK trametinib (B) y el inhibidor de BCL-2/-XL navitoclax (AbT-263) (C), y sus combinaciones A+B, A+C, B+C y A+B+C en 5 líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural y después de 24 h, 48 h y 72 h (diferentes tonalidades de gris). El eje de las x indica el tratamiento; el eje de las y indica la inducción máxima de la Caspasa 3/7 (% de células) observada para cada tratamiento.
FIG. 11Curvas de respuesta-dosis para el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMpUESTO A) (círculos), el inhibidor de MEK trametinib (COMPUESTO B, triángulos), el inhibidor de EGFR erlotinib (COMPUESTO C, rombos) y sus combinaciones A+B (círculos, línea de puntos), A+C (triángulos), B+C (rombos) y A+B+C (círculos, línea continua) en 5 líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural. El eje de las x indica el log10 de la dilución del tratamiento; el eje de las y indica el recuento celular después del tratamiento respecto al DMSO. La línea discontinua fuerte indica el número de células antes del inicio del tratamiento («línea de base»).
FIG. 12Inducción máxima de la Caspasa 3/7 para el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO A), el inhibidor de MEK trametinib (COMPUESTO B) y el inhibidor de EGFR erlotinib (COMPUESTO C), y sus combinaciones A+B, A+C, B+C y A+B+C en 5 líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural y después de 24 h, 48 h y 72 h (diferentes tonalidades de gris). El eje de las x indica el tratamiento; el eje de las y indica la inducción máxima de la Caspasa 3/7 (% de células) observada para cada tratamiento.
FIG. 13Curvas de respuesta-dosis para el inhibidor de PIK3CA 2-amida y 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetiletil)piridin-4-il]tiazol-2-il}amida) del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico (COMPUESTO A) (círculos), el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-transciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO B) (triángulos), el inhibidor de BCL-2/-XL navitoclax (ABT-263) (COMPUESTO<c>) (rombos), y sus combinaciones A+B (círculos, línea de puntos), A+C (triángulos), B+C (rombos) y A+B+C (círculos, línea continua) en 5 líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural. El eje de las x indica el log10 de la dilución del tratamiento; el eje de las y indica el recuento celular después del tratamiento respecto al DMSO. La línea discontinua fuerte indica el número de células antes del inicio del tratamiento («línea de base»).
FIG. 14Inducción máxima de la Caspasa 3/7 para el inhibidor de PIK3CA 2-amida y 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1, 1 -dimetiletil)piridin-4-il]tiazol-2-il}amida) del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico (Co MPUEs To A), el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-transciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (C<o>M<p>U<e>S<t>O B), el inhibidor de BCL-2/-XL navitoclax (ABT-263) (COMPUESTO C), A+B, A+C, B+C y A+B+C en 5 líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural y después de 24 h, 48 h y 72 h (diferentes tonalidades de gris). El eje de las x indica el tratamiento; el eje de las y indica la inducción máxima de la Caspasa 3/7 (% de células) observada para cada tratamiento.
FIG. 15Curvas de respuesta-dosis para el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO A) (círculo) y el inhibidor de BCL-2/-XL navitoclax (ABT-263) (triángulo) y la combinación del COMPUESTO A y ABT-263 (rombo) en 5 líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural. El eje de las x indica el log10 de la dilución del tratamiento; el eje de las y indica el recuento celular después del tratamiento respecto al DMSO. La línea discontinua fuerte indica el número de células antes del inicio del tratamiento («línea de base»).
FIG. 16Inducción máxima de la Caspasa 3/7 para el COMPUESTO A y ABT-263 y la combinación del inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-transciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO A) y el inhibidor de BCL-2/-XL navitoclax (ABT-263) en 5 líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural y después de 24 h, 48 h y 72 h (diferentes tonalidades de gris). El eje de las x indica el tratamiento; el eje de las y indica la inducción máxima de la Caspasa 3/7 (% de células) observada para cada tratamiento.
FIG. 17Se trataron xenoinjertos de HCT-116 con KRAS mutado con el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO A), el inhibidor de MEK trametinib (COMPUESTO B) y el inhibidor de BCL-2/-XL ABT-263 (COMPUESTO C), o combinaciones de estos. Concretamente, los xenoinjertos se trataron con vehículo (G1), ABT-263 (G2, 100 mg/kg a diario), COMPUESTO A (G3, 100 mg/kg tres veces a la semana), trametinib (G4, 0,3 mg/kg a diario), la combinación del COMPUESTO A y trametinib (G5) o la combinación de los tres agentes (G6). En el día 9, se añadió ABT-263 a G3-G5. Se muestra el cambio porcentual medio en el volumen tumoral con respecto al volumen tumoral inicial. Las barras de error representan el EEM.
FIG. 18Gráficos en cascada que muestran el cambio porcentual en el volumen tumoral (respecto al volumen inicial) para tumores individuales en las cohortes G3-G6 (tal como se describe en el Ejemplo 10 y la Figura 17) después de 9 días de tratamiento (A) y 19 días de tratamiento (10 días después de la adición secuencial de ABT-263) (B).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA DIVULGACIÓN
En una realización, la presente invención se refiere a una combinación farmacéutica que comprende el inhibidor de MDM2 (6S)-5-(5-cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-(propan-2-il)-5,6-dihidropirrolo[3,4-d]imidazol-4(1H)-ona, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y el inhibidor de Bcl2 ABT-199, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. Se ha determinado que la combinación se podría utilizar para tratar el cáncer de forma eficaz. En particular, se ha determinado que la combinación se podría utilizar para tratar el cáncer de forma eficaz debido a un efecto sinérgico en la inhibición de la proliferación celular y/o la inducción de la apoptosis. En consecuencia, las combinaciones de la presente divulgación, en particular una combinación triple y de orden superior, pueden cambiar una respuesta «citoestática» a una respuesta «citotóxica», con lo que consiguen así una regresión del cáncer.
Se debe interpretar que los términos «un/a» y «el/la» y referencias similares en el contexto de la descripción de la divulgación (especialmente en el contexto de las reivindicaciones más adelante) cubren tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o claramente se contradigan por el contexto. En los casos en los que se utiliza la forma en plural para compuestos, pacientes, cánceres y similares, se entiende que también significa un único compuesto, paciente o similar.
La expresión «efecto sinérgico», tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la acción de dos o tres agentes terapéuticos tales como, por ejemplo, un compuesto de fórmula (i), p. ej., el Compuesto A, y al menos un compuesto inhibidor de MEK de la presente divulgación, p. ej., el Compuesto A y al menos un compuesto inhibidor de BCL2 de la presente divulgación, que produce un efecto, por ejemplo, la ralentización de la progresión de una enfermedad proliferativa, en particular el cáncer, o sus síntomas, que es mayor que la simple adición de los efectos de cada fármaco administrado por sí mismo. Se puede calcular un efecto sinérgico, por ejemplo, utilizando métodos adecuados tales como la ecuación sigmoide de Emáx (Holford, N. H. G. y Scheiner, L. B.,Clin. Pharmacokinet.6: 429-453 (1981)), la ecuación de la aditividad de Loewe (Loewe, S. y Muischnek, H.,Arch. Exp. Pathol Pharmacol.114: 313-326 (1926)) y la ecuación del efecto mediano (Chou, T. C. y Talalay, P.,Adv. Enzyme Regul.22: 27-55 (1984)). Cada ecuación mencionada anteriormente se puede aplicar a los datos experimentales para generar una gráfica correspondiente con el fin de ayudar a evaluar los efectos de una combinación farmacológica. Las gráficas correspondientes asociadas con las ecuaciones mencionadas anteriormente son la curva de efecto-concentración, la curva de isobolograma y la curva del índice de combinación, respectivamente.
En particular, se ha demostrado que la inhibición combinada de MDM2 y MEK en el cáncer colorrectal con TP53 de origen natural proporciona una respuesta mejorada (Ejemplo 1, Figuras 1 y 2, Tabla 2) y más duradera (Ejemplo 1, Figura 5, Tabla 3) en comparación con cada agente individual. Además, la inhibición combinada de MDM2 y Bcl2 en el cáncer colorrectal con TP53 de origen natural mostró una inducción más fuerte de la apoptosis en comparación con los agentes individuales (Ejemplo 5, Figura 16). Además, una combinación triple de un inhibidor de MDM2, un inhibidor de MEK y un inhibidor de Bcl2 provocó una inhibición sinérgica en comparación con los pares de fármacos en 2/5 modelos de células de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural evaluados (Ejemplo 2, Tabla 5), y en cuatro de estas líneas celulares, la combinación triple mostró una apoptosis más fuerte en comparación con las combinaciones por pares (Ejemplo 2, Figura 10). Por lo tanto, las combinaciones de la presente divulgación proporcionan una opción terapéutica eficaz capaz de mejorar las respuestas en comparación con cada uno de los agentes individuales y pueden conducir a unas respuestas más duraderas en el centro de salud.
Las expresiones «inhibidor de MDM2» o «inhibidor de HDM2» o «inhibidor de Mdm2», tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a cualquier compuesto que inhiba la asociación de la interacción HDM2/p53 (Mdm2/p53). HDM2 (siglas en inglés de homólogo humano del doble minuto murino 2) es un regulador negativo de p53. Los inhibidores de Mdm2 son útiles en composiciones farmacéuticas para uso humano o veterinario donde se indica la inhibición de la asociación Mdm2/p53, p. ej., en el tratamiento de tumores y/o crecimiento de células cancerosas. En particular, los inhibidores de Mdm2 son útiles en el tratamiento del cáncer humano, ya que la evolución de estos tipos de cáncer puede ser dependiente al menos parcialmente de la anulación de la función de «guardián» de p53, por ejemplo, la sobreexpresión de Mdm2.
De acuerdo con la presente invención, el inhibidor de Mdm2 es (6S)-5-(5-cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-(propan-2-il)-5,6-dihidropirrolo[3,4-d]imidazol-4(1H)-ona o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. El inhibidor de Mdm2 (6S)-5-(5-cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-(propan-2-il)-5,6-dihidropirrolo[3,4-d]imidazol-4(1H)-ona pertenece a una clase novedosa de compuestos de tipo imidazopirrolidinona y muestra una potente inhibición de la interacción MDM2/p53 (incluyendo este término en particular la interacción Hdm2/p53). En particular, este compuesto actúa como inhibidor de la interacción de MDM2 con p53 uniéndose a MDM2. El inhibidor de M<d>M2 (6S)-5-(5-cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-(propan-2-il)-5,6-dihidropirrolo[3,4-d]imidazol-4(1H)-ona, que es el inhibidor de Mdm2i de la invención, es un compuesto de fórmula I y se describe en el Ejemplo 102 del documento WO2013/111105:
Las formas cristalinas de (6S)-5-(5-cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-(propan-2-il)-5,6-dihidropirrolo[3,4-d]imidazol-4(1H)-ona se describen como EX6, EX7 y EX8 en el documento WO2013/111105. La divulgación engloba el cocristal con ácido succínico del compuesto (6S)-5-(5-cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-(propan-2-il)-5,6-dihidropirrolo[3,4-d]imidazol-4(1H)-ona. El compuesto también puede estar en forma de un solvato de etanol.
La expresión «un inhibidor de MEK» se define en el presente documento de modo que se refiera a un compuesto que tiene como diana, reduce o inhibe la actividad cinasa de MAP-cinasa, MEK. Una diana de un inhibidor de MEK incluye, sin carácter limitante, ERK. Una diana indirecta de un inhibidor de MEK incluye, sin carácter limitante, ciclina D1.
Las combinaciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden incluir al menos un compuesto inhibidor de MEK seleccionado del grupo que consiste en trametinib, (2-hidroxietoxi)-amida del ácido 6-(4-bromo-2-fluorofenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico, (S)-5-fluoro-2-(2-fluoro-4-(metiltio)fenilamino)-N-(2-hidroxipropoxi)-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropiridin-3-carboxamida, PD0325901, PD-184352, RDEA119, XL518, AS-701255, AS-701173, AS703026, RDEA436, E6201, RO4987655, RG7167 y RG7420, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
Preferentemente, el inhibidor de MEK es trametenib (N-(3-{3-ciclopropil-5-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]-6,8-dimetil-2,4,7-trioxo-3,4,6,7-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidin-1(2H)-il }fenil)acetamida, que también se denomina JPT-74057 o GSK1120212). El trametinib (GSK1120212) se describe en la Publicación de PCT N.° WO05/121142. El compuesto ha sido aprobado como Mekinist®.
De acuerdo con la presente divulgación, otro inhibidor de MEK adecuado para la combinación de la presente divulgación es el compuesto (2-hidroxietoxi)amida del ácido 6-(4-bromo-2-fluorofenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico de fórmula (III)
El compuesto inhibidor de MEK (2-hidroxietoxi)amida del ácido 6-(4-bromo-2-fluorofenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico se describe en la Solicitud de PCT N.° WO 03/077914 y los métodos para su preparación se han descrito, por ejemplo, en el Ejemplo 18 de esta.
Otro inhibidor de MEK adecuado para la combinación de la presente divulgación es el compuesto (S)-5-fluoro-2-(2-fluoro-4-(metiltio)fenilamino)-N-(2-hidroxipropoxi)-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropiridin-3-carboxamida, que es un compuesto de fórmula (IV)
El compuesto inhibidor de MEK (S)-5-fluoro-2-(2-fluoro-4-(metiltio)fenilamino)-N-(2-hidroxipropoxi)-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropiridin-3-carboxamida se describe en el Ejemplo 25-BB de la Solicitud de PCT N^ WO2007/044084, y los métodos para su preparación se han descrito en esta.
Una sal especialmente preferida de la (2-hidroxietoxi)amida del ácido 6-(4-bromo-2-fluorofenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico es una sal de tipo clorhidrato o sulfato. Otras sales farmacéuticamente aceptables de la (2-hidroxietoxi)amida del ácido 6-(4-bromo-2-fluorofenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico y (S)-5-fluoro-2-(2-fluoro-4-(metiltio)fenilamino)-N-(2-hidroxipropoxi)-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropiridin-3-carboxamida adecuadas para la presente divulgación incluyen las sales que se divulgan en la Solicitud de PCT N^ WO 03/077914 y la Solicitud de PCT N^ WO2007/044084.
Otros inhibidores de MEK que se pueden utilizar combinados con la presente divulgación incluyen, sin carácter limitante, PD0325901 (Pfizer) (véase la Publicación de PCT N° WO02/06213), PD-184352 (Pfizer), RDEA119 (Ardea Biosciences), XI,518 (Exelexis), A<s>-701255 (Merck Serono), AS-701173 (Merck Serono), AS703026 (Merck Serono), RDEA436 (Ardea Biosciences), E6201 (Eisai) (véase Gotoet al., Journal o f Pharmacology and Experimental Therapeutics,3331(2): 485 495 (2009)), RO4987655 (Hoffmann-La Roche), RG7167 y/o RG7420.
La expresión «un inhibidor de Bcl2» o «un inhibidor de BCL2» o «inhibidor de BCL-2» o «inhibidor de Bcl-2» se define en el presente documento de modo que se refiera a un compuesto que tiene como diana, reduce o inhibe la familia de proteínas antiapoptóticas linfoma de linfocitos B 2 (Bcl-2) (Bcl-2, BcI-X<l>, Bcl-w, Mcl-1, Bfll/A-1 y/o Bcl-B).
De acuerdo con la presente divulgación, la combinación farmacéutica que comprende el inhibidor de MDM2 de la invención y el inhibidor de Bcl2 de la invención puede comprender ventajosamente además un inhibidor adicional, que mejora aún más la actividad antitumoral de la combinación. De este modo, una combinación triple de un inhibidor de m Dm 2, un inhibidor de MEK y un inhibidor de Bcl2 provocó una inhibición sinérgica en comparación con los pares de fármacos en 2/5 modelos de células de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural evaluados (Ejemplo 2, Tabla 5), y en cuatro de estas líneas celulares, la combinación triple mostró una apoptosis más fuerte en comparación con las combinaciones por pares (Ejemplo 2, Figura 10).
De manera similar, las combinaciones farmacéuticas de la presente divulgación que comprenden el inhibidor de MDM2 de la invención y el inhibidor de Bcl2 de la invención pueden comprender ventajosamente además un inhibidor de EGFR. La expresión «inhibidor de EGFR» se define en el presente documento de modo que se refiera a un compuesto que tiene como diana, reduce o inhibe la actividad de la familia de factores de crecimiento epidérmico de las tirosina-cinasas receptoras (EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4 como homo- o heterodímeros) o se une a EGF o ligandos relacionados con EGF.
El compuesto inhibidor de EGFR utilizado en la combinación de la presente divulgación se selecciona del grupo que consiste en erlotinib, gefitinib, lapatinib, canertinib, pelitinib, neratinib, (R,E)-N-(7-cloro-1-(1-(4-(dimetilamino)but-2-enoil)azepan-3-il)-1H-benzo[d]imidazol-2-il)-2-metilisonicotinamida, panitumumab, matuzumab, pertuzumab, nimotuzumab, zalutumumab, icotinib, afatinib y cetuximab, y una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
Preferentemente, el inhibidor de EGFR es erlotinib o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
En una realización, la combinación farmacéutica de la invención puede comprender ventajosamente además el inhibidor del EGFR. Se ha descubierto sorprendentemente que esta combinación triple ha mostrado una apoptosis más fuerte en comparación con las combinaciones por pares (Ejemplo 3, Figura 12).
En una realización preferida, la combinación farmacéutica comprende el inhibidor de MDM2 de la invención, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, el inhibidor de Bcl2 de la invención, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, el inhibidor de MEK trametinib, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y el inhibidor de EGFR erlotinib, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. De acuerdo con la presente divulgación, las combinaciones farmacéuticas de la invención pueden comprender ventajosamente además un inhibidor de PI3K.
La expresión «un inhibidor de fosfatidilinositol 3-cinasa» o «inhibidor de PI3K» se define en el presente documento de modo que se refiera a un compuesto que tiene como diana, reduce o inhibe la PI3-cinasa. Se ha demostrado que la actividad de la PI3-cinasa aumenta como respuesta a una serie de estímulos hormonales y de factores de crecimiento, que incluyen la insulina, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento epidérmico, factor estimulador de colonias y factor de crecimiento de hepatocitos, y se ha implicado en procesos relacionados con el crecimiento y la transformación celular.
Los inhibidores de fosfatidilinositol-3-cinasa (PI3K) adecuados para la presente divulgación se seleccionan del grupo que consiste en 2-metil-2-[4-(3-metil-2-oxo-8-quinolin-3-il-2,3-dihidroimidazo[4,5-c]quinolin-1-il)fenil]propionitrilo, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, 5-(2,6-dimorfolin-4-ilpirimidin-4-il)-4-trifluorometilpiridin-2-ilamina, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y 2-amida y 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetiletil)piridin-4-il]tiazol-2-il}amida) del ácido (S)-pirrolidin-l ,2-dicarboxílico, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
El documento WO2006/122806 describe derivados de imidazoquinolina, que se ha descrito que inhiben la actividad de PI3K. El compuesto 2-metil-2-[4-(3-metil-2-oxo-8-quinolin-3-il-2,3-dihidroimidazo[4,5-c]quinolin-1-il)fenil]propionitrilo tiene la estructura química de fórmula (V)
El compuesto, su utilidad como inhibidor de PI3K y la síntesis de 2-metil-2-[4-(3-metil-2-oxo-8-quinolin-3-il-2,3-dihidroimidazo[4,5-c]quinolin-1-il)fenil]propionitrilo y su sal de tipo monotosilato se describen en el documento WO2006/122806, por ejemplo, en el Ejemplo 7 y el Ejemplo 152-3, respectivamente. El compuesto 2-metil-2-[4-(3-metil-2-oxo-8-quinolin-3-il-2,3-dihidroimidazo[4,5-c]quinolin-1-il)fenil]propionitrilo puede estar presente en forma de base libre o cualquier sal farmacéuticamente aceptable de esta. Preferentemente, el 2-metil-2-[4-(3-metil-2-oxo-8-quinolin-3-il-2,3-dihidroimidazo[4,5-c]quinolin-1-il)fenil]propionitrilo está en forma de su sal de tipo monotosilato.
El documento WO07/084786 describe derivados específicos de pirimidina que se ha establecido que inhiben la actividad de PI3K. El compuesto 5-(2,6-dimorfolin-4-ilpirimidin-4-il)-4-trifluorometilpiridin-2-ilamina tiene la estructura química de fórmula (VI)
El compuesto, sus sales, su utilidad como inhibidor de PI3K y la síntesis del compuesto 5-(2,6-dimorfolin-4-ilpirimidin-4-il)-4-trifluorometilpiridin-2-ilamina se describen en el documento WO 2007/084786, por ejemplo, en el Ejemplo 10. El compuesto 5-(2,6-dimorfolin-4-ilpirimidin-4-il)-4-trifluorometilpiridin-2-ilamina puede estar presente en forma de base libre o cualquier sal farmacéuticamente aceptable de esta. Preferentemente, la 5-(2,6-dimorfolin-4-ilpirimidin-4-il)-4-trifluorometilpiridin-2-ilamina está en forma de su sal de tipo clorhidrato.
El documento WO2010/029082 describe derivados específicos de 2-carboxamidocicloaminourea que se determinado que son altamente selectivos para la isoforma alfa de PI3K y se pueden añadir a las combinaciones de la presente divulgación. El compuesto 2-amida y 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetiletil)piridin-4-il]tiazol-2-il}amida) del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico tiene la estructura química de fórmula (VII)
El compuesto, sus sales, su utilidad como inhibidor de PI3K selectivo para la isoforma alfa y la síntesis del compuesto 2-amida y 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetiletil)piridin-4-il]tiazol-2-il}amida) del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico se describen en el documento WO2010/029082, por ejemplo, en el Ejemplo 15. El compuesto 2-amida y 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetiletil)piridin-4-il]tiazol-2-il}amida) del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico puede estar presente en forma de base libre o cualquier sal farmacéuticamente aceptable de esta. Preferentemente, la 2-amida y 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetiletil)piridin-4-il]tiazol-2-il}amida) del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico está en forma de su base libre.
Preferentemente, el compuesto inhibidor de PI3K utilizado en la combinación de la presente divulgación es la 2-amida y 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetiletil)piridin-4-il]tiazol-2-il}amida) del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico o cualquiera de sus sales farmacéuticamente aceptables.
En una realización, la combinación farmacéutica que comprende el inhibidor de MDM2 y el inhibidor de Bcl2 puede comprender ventajosamente además el inhibidor de PI3K. Se ha descubierto sorprendentemente que esta combinación triple mostró una inhibición sinérgica (en comparación con los pares de fármacos en 2/5 modelos de células evaluados (Ejemplo 4, Tabla 9) y mostró una apoptosis más fuerte en comparación con las combinaciones por pares (Ejemplo 4, Figura 14).
Además, de acuerdo con la presente divulgación, las combinaciones farmacéuticas de la invención pueden comprender ventajosamente además un inhibidor de BRAF.
Además, la combinación farmacéutica de la presente invención puede comprender ventajosamente (a) el inhibidor de MDM2 de la invención, (b) un inhibidor de MEK, (c) el inhibidor de Bcl2 de la invención y (d) un inhibidor de BRAF.
La expresión «un inhibidor de BRAF» se define en el presente documento de modo que se refiera a un compuesto que tiene como diana, reduce o inhibe la actividad de la serina/treonina-proteína-cinasa B-Raf.
La combinación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el inhibidor de BRAF se selecciona del grupo que consiste en RAF265, dabrafenib (S)-1-(4-(3-(5-cloro-2-fluoro-3-(metilsulfonamido)fenil)-1-isopropil-1H-pirazol-4-il)pirimidin-2-ilamino)propan-2-ilcarbamato de metilo, N-[(2S)-1-({4-[3-(5-cloro-2-fluoro-3-metanosulfonamidofenil)-1-(propan-2-il)-1 H-pirazol-4-il]pirimidin-2-il}amino)propan-2-il]carbamato de metilo y vemurafenib, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
De acuerdo con la presente divulgación, el inhibidor de BRAF es preferentemente dabrafenib o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. En una realización, el inhibidor de BRAF añadido a la combinación es RAF265.
La combinación de la presente divulgación puede comprender además un inhibidor de CDK4/6. Un «inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina 4/6 (CDK4/6)», tal como se define en el presente documento, se refiere a una molécula de peso molecular bajo que interacciona con un complejo de ciclina-CDK para bloquear la actividad de la cinasa. Las cinasas dependientes de ciclina (CDK) constituyen una gran familia de proteínas cinasas que regulan el inicio, la progresión y la finalización del ciclo celular de los mamíferos. Preferentemente, el inhibidor de CDK4/6 es 7-ciclopentil-N,N-dimetil-2-((5-(piperazin-1-il)piridin-2-il)amino)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
La expresión «sales farmacéuticamente aceptables» se refiere a sales que conservan la eficacia biológica y las propiedades del compuesto y que normalmente no son indeseables desde un punto de vista biológico o de otro tipo. El compuesto puede ser capaz de formar sales de adición de ácido debido a la presencia de un grupo amino.
A menos que se especifique de otro modo o que lo indique claramente el texto, la referencia a los agentes terapéuticos útiles en la combinación farmacéutica de la presente divulgación incluye tanto la base libre de los compuestos como todas las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos.
El término «combinación» o «combinación farmacéutica» se define en el presente documento de modo que se refiera a una combinación fija en una forma farmacéutica unitaria, una combinación no fija o un kit de partes para la administración combinada donde los agentes terapéuticos se pueden administrar juntos, independientemente al mismo tiempo o por separado dentro de intervalos de tiempo, de modo que se permita preferentemente que los componentes de la combinación muestren un efecto cooperativo, p. ej., sinérgico. Por lo tanto, los compuestos individuales de la combinación farmacéutica de la presente divulgación podrían administrarse de forma simultánea o secuencial.
Además, la combinación farmacéutica de la presente divulgación puede estar en forma de una combinación fija o en forma de una combinación no fija.
La expresión «combinación fija» significa que los agentes terapéuticos, p. ej., los compuestos individuales de la combinación, están en forma de una sola entidad o forma farmacéutica.
La expresión «combinación no fija» significa que los agentes terapéuticos, p. ej., los compuestos individuales de la combinación, se administran a un paciente como entidades o formas farmacéuticas separadas, ya sea de forma simultánea o secuencial sin límites de tiempo específicos, en donde preferentemente tal administración proporciona unos niveles terapéuticamente eficaces de los dos agentes terapéuticos en el cuerpo del sujeto, p. ej., un mamífero o ser humano, que lo necesite.
Las combinaciones farmacéuticas pueden comprender además al menos un portador farmacéuticamente aceptable. De este modo, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende la combinación farmacéutica de la presente divulgación y al menos un portador farmacéuticamente aceptable.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión «portador» o «portador farmacéuticamente aceptable» incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, surfactantes, antioxidantes, conservantes (p. ej., agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardantes de la absorción, sales, conservantes, estabilizantes farmacológicos, aglutinantes, excipientes, agentes desintegrantes, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, tintes y similares y sus combinaciones, tal como serían conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo,Remington's Pharmaceutical Sciences,18.a ed. Mack Printing Company, 1990, págs.
1289-1329). Excepto en la medida en que cualquier portador convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.
La expresión «farmacéuticamente aceptable» se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, según el juicio médico razonable, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin que provoquen una toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación en exceso, acorde con una relación de beneficio/riesgo razonable.
Generalmente, la expresión «composición farmacéutica» se define en el presente documento como referente a una mezcla o solución que contiene al menos un agente terapéutico que se ha de administrar a un sujeto, p. ej., un mamífero o ser humano. Las combinaciones farmacéuticas del presente documento se pueden formular en una composición farmacéutica adecuada para administración enteral o parenteral y son, por ejemplo, aquellas en formas farmacéuticas unitarias, tales como comprimidos recubiertos de azúcar, comprimidos, cápsulas o supositorios, o ampollas. Si no se indica lo contrario, estas se preparan de una manera conocidaper se,por ejemplo, por medio de diversos procesos convencionales de mezcla, trituración, compresión directa, granulación, recubrimiento con azúcar, disolución, liofilización o técnicas de fabricación muy evidentes para los expertos en la técnica. Se apreciará que el contenido unitario de un componente de la combinación contenido en una dosis individual de cada forma farmacéutica no necesita constituir en sí mismo una cantidad eficaz ya que la cantidad eficaz necesaria puede alcanzarse mediante la administración de una pluralidad de unidades de dosificación. La composición farmacéutica puede contener de un 0,1 % a un 99,9 %, preferentemente de un 1 % a un 60 %, del(de los) agente(s) terapéutico(s). Un experto en la técnica puede seleccionar uno o más de los portadores mencionados anteriormente con respecto a las propiedades particulares deseadas de la forma farmacéutica mediante experimentación rutinaria y sin ninguna dificultad excesiva. La cantidad de cada uno de los portadores utilizados puede variar dentro de los intervalos convencionales en la técnica. Las siguientes referencias divulgan técnicas y excipientes utilizados para formular formas farmacéuticas orales. VéaseThe Handbook of Pharmaceutical Excipients,4.a edición, Roweet al.,Eds., American Pharmaceuticals Association (2003); yRemington: the Science and Practice of Pharmacy,20.a edición, Gennaro, Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2003). Estos portadores convencionales adicionales opcionales pueden incorporarse en la forma farmacéutica oral incorporando dicho uno o más portadores convencionales en la mezcla inicial antes o durante la granulación o combinando dicho uno o más portadores convencionales con gránulos que comprenden la combinación de agentes o los agentes individuales de la combinación de agentes en la forma farmacéutica oral. En la última realización, la mezcla combinada puede mezclarse adicionalmente, p. ej., en un mezclador en forma de V, y posteriormente prensarse o moldearse para obtener un comprimido, por ejemplo, un comprimido monolítico, encapsulado en una cápsula o introducido en un sobre. Obviamente, las combinaciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden utilizar para fabricar un medicamento.
La presente divulgación se refiere a tales combinaciones farmacéuticas o composiciones farmacéuticas que son particularmente útiles como medicamento.
Concretamente, las combinaciones o composiciones de la presente divulgación se pueden aplicar en el tratamiento del cáncer.
El término «tratamiento», tal como se utiliza en el presente documento, comprende un tratamiento que mitiga, reduce o alivia al menos un síntoma en un sujeto, aumenta la supervivencia libre de progresión, la supervivencia global, extiende la duración de la respuesta o retrasa la progresión de una enfermedad. Por ejemplo, el tratamiento puede ser la disminución de uno o varios síntomas de un trastorno o la erradicación completa de un trastorno, tal como el cáncer. En el sentido de la presente divulgación, el término «tratamiento» también designa detener, retrasar el inicio (es decir, el período anterior a la manifestación clínica de una enfermedad) y/o reducir el riesgo de desarrollar o empeorar una enfermedad en un paciente, p. ej., un mamífero, particularmente el paciente es un ser humano. El término «tratamiento», tal como se utiliza en el presente documento, comprende una inhibición del crecimiento de un tumor que incorpora una inhibición directa del crecimiento de un tumor primario y/o la inhibición sistémica de las células cancerosas metastásicas.
Un «sujeto», «individuo» o «paciente» se utiliza indistintamente en el presente documento y se refiere a un vertebrado, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, sin carácter limitante, ratones, simios, seres humanos, animales de granja, animales que participan en deportes y animales de compañía.
La expresión «una cantidad terapéuticamente eficaz» de un compuesto (p. ej., entidad química o agente biológico) de la presente divulgación se refiere a una cantidad del compuesto de la presente divulgación que provocará la respuesta biológica o médica de un sujeto, por ejemplo, la reducción o inhibición de una enzima o una actividad proteica, o mejorará los síntomas, aliviará las afecciones, ralentizará o retrasará la progresión de la enfermedad, o prevendrá una enfermedad, etc. En una realización, una cantidad terapéuticamente eficazin vivopuede estar comprendida, dependiendo de la vía de administración, en el intervalo de 0,1-500 mg/kg o de 1-100 mg/kg.
La dosis óptima de cada componente de la combinación para el tratamiento de un cáncer se puede determinar empíricamente para cada individuo utilizando métodos conocidos y dependerá de una variedad de factores, que incluyen, sin carácter limitante, el grado de avance de la enfermedad; la edad, el peso corporal, la salud general, el género y la dieta del individuo; el tiempo y la vía de administración; y otros medicamentos que el individuo esté tomando. Las dosificaciones óptimas se pueden establecer utilizando pruebas y procedimientos rutinarios que son muy conocidos en la técnica. La cantidad de cada componente de la combinación que puede combinarse con los materiales portadores para producir una única forma farmacéutica variará dependiendo del individuo tratado y el modo particular de administración. En algunas realizaciones, las formas farmacéuticas unitarias que contienen la combinación de agentes tal como se describe en el presente documento contendrán las cantidades de cada agente de la combinación que se administran habitualmente cuando los agentes se administran solos.
La frecuencia de dosificación puede variar dependiendo del compuesto utilizado y la afección particular que se ha de tratar o prevenir. En general, se prefiere el uso de la dosificación mínima que sea suficiente para proporcionar una terapia eficaz. En general, se puede monitorizar a los pacientes para determinar la efectividad terapéutica utilizando ensayos adecuados para la afección que se esté tratando o previniendo, con lo que estarán familiarizados los expertos en la técnica.
Una cantidad terapéutica o una dosis de (6S)-5-(5-cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-(propan-2-il)-5,6-dihidropirrolo[3,4-d]imidazol-4(1H)-ona puede estar comprendida entre 100 y 1500 mg cada tres semanas, concretamente entre 100 y 800 mg cada tres semanas, o entre 50 y 600 mg a diario, cuando se administra por vía oral. Una cantidad terapéutica o una dosis de (6S)-5-(5-cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6(4-dorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-(propan-2-il)-5,6-dihidropirrolo[3,4-d]imidazol-4(1H)-ona puede ser de 400 mg, más preferentemente es de 300 mg para una administración a diario durante los primeros 21 días de cada ciclo de 28 días. Como alternativa, una cantidad terapéutica o una dosis de (6S)-5-(5-cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-dorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-(propan-2-il)-5,6-dihidropirrolo[3,4-d]imidazol-4(1H)-ona es de 560 mg por ciclo (40 mg cd 2 semanas sí / 2 semanas no, o de 80 mg cd 1 semana sí / 3 semanas no). Las dosis intravenosas deben reducirse según corresponda.
La dosis recomendada del inhibidor de MEK trametinib es de 2 mg al día. La gestión de las reacciones adversas puede requerir una reducción de la dosis de hasta 1 mg al día.
El compuesto inhibidor de MEK (2-hidroxietoxi)amida del ácido 6-(4-bromo-2-fluorofenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico se puede administrar a un sujeto adecuado a diario en dosis individuales o divididas con una dosificación eficaz comprendida en el intervalo de 0,001 a 100 mg por kg de peso corporal al día, preferentemente de 1 a 35 mg/kg/día, en dosis individuales o divididas. Para un ser humano de 70 kg, esto correspondería a un intervalo de dosificación preferible de 0,05 a 7 g/día, preferentemente de 0,05 a 2,5 g/día.
El compuesto inhibidor de MEK (S)-5-fluoro-2-(2-fluoro-4-(metiltio)fenilamino)-N-(2-hidroxipropoxi)-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropiridin-3-carboxamida se puede administrar a un sujeto adecuado en dosis individuales o divididas con una dosificación eficaz comprendida en el intervalo de 0,001 a 100 mg por kg de peso corporal al día, preferentemente de 1 mg/kg/día a 35 mg/kg/día, en dosis individuales o divididas. Para un ser humano de 70 kg, esto correspondería a un intervalo de dosificación preferible de 0,07 a 2,45 g/día, preferentemente de 0,05 a 1,0 g/día.
Una dosis eficaz del inhibidor de Bcl-2 navitoclax puede estar comprendida en el intervalo de 100 mg a 500 mg a diario. La dosis se puede reducir o se puede emplear una dosis inicial de 150 mg durante 7 días. Después de la dosis inicial, se puede administrar una dosis de 325 mg o hasta 425 mg a diario.
La dosis recomendada del inhibidor de EGFR erlotinib es de 100 mg o 150 mg a diario.
El compuesto inhibidor de PI3K 2-amida y 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetiletil)piridin-4-il]tiazol-2-il}amida) del ácido (S)-pi rrolidin-1,2-dicarboxílico se administra generalmente por vía oral con una dosis comprendida en el intervalo de 30 mg a 450 mg al día, por ejemplo, de 100 a 400 mg al día en un adulto humano. La dosis diaria se puede administrar siguiendo una pauta de una vez al día o dos veces al día. La 2-amida y 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetiletil)piridin-4-il]tiazol-2-il}amida) del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico se puede administrar a un sujeto adecuado a diario en dosis individuales o divididas con una dosificación eficaz comprendida en el intervalo de 0,05 a 50 mg por kg de peso corporal al día, preferentemente de 0,1-25 mg/kg/día, más preferentemente de 0,5-10 mg/kg/día, en dosis individuales o divididas. Para un ser humano de 70 kg, esto correspondería a un intervalo de dosificación preferible de 35-700 mg al día. Más preferentemente, el intervalo de dosificación es de 35 - 400 mg al día.
El compuesto inhibidor de PI3K 2-metil-2-[4-(3-metil-2-oxo-8-quinolin-3-il-2,3-dihidroimidazo[4,5-c]quinolin-1-il)fenil]propionitrilo se administra generalmente por vía oral con una dosis comprendida en el intervalo de 100 mg a 1200 mg, o de 200 mg a 1000 mg, o de 300 mg a 800 mg, o de 400 mg a 600 mg al día en un adulto humano. La dosis diaria se puede administrar siguiendo una pauta de una vez al día o dos veces al día.
El compuesto inhibidor de PI3K 5-(2,6-dimorfolin-4-ilpirimidin-4-il)-4-trifluorometilpiridin-2-ilamina se administra generalmente por vía oral con una dosis comprendida en el intervalo de 30 mg a 300 mg, o de 60 mg a 120 mg, o de 100 mg al día en un humano adulto. La dosis diaria se puede administrar siguiendo una pauta de una vez al día o dos veces al día.
La dosis recomendada del inhibidor de BRAF dabrafenib es de 150 mg por vía oral dos veces al día como un solo agente o en combinación con 2 mg de trametinib por vía oral una vez al día.
Se entiende que cada agente terapéutico puede administrarse convenientemente, por ejemplo, en una unidad de dosificación individual o dividirse en múltiples unidades de dosificación. Se entiende además que cada agente terapéutico puede administrarse convenientemente en dosis una vez al día o dosis hasta cuatro veces al día.
El término «cáncer» se utiliza en el presente documento para referirse a un espectro amplio de tumores, en particular tumores sólidos. Algunos ejemplos de tales tumores incluyen, sin carácter limitante, un tumor benigno o maligno del pulmón (que incluye cáncer de pulmón microcítico y cáncer de pulmón no microcítico), bronquios, próstata, mama (que incluye cánceres de mama esporádicos y pacientes que padecen la enfermedad de Cowden), páncreas, tracto gastrointestinal, colon, recto, carcinoma de colon, cáncer colorrectal, de tiroides, hígado, vías biliares, conducto biliar intrahepático, hepatocelular, de glándula suprarrenal, estómago, gástrico, glioma, glioblastoma, endometrial, de riñón, pelvis renal, vejiga, útero, cuello uterino, vagina, ovario, mieloma múltiple, esófago, cuello o cabeza, cerebro, cavidad oral y faringe, laringe, intestino delgado, un melanoma, adenoma de colon velloso, un sarcoma, una neoplasia, una neoplasia de carácter epitelial, un carcinoma mamario, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, queratosis actínica, policitemia vera, trombocitemia esencial, una leucemia (que incluye leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica y leucemia mieloide), un linfoma (que incluye linfoma no hodgkiniano y linfoma de Hodgkin), mielofibrosis con metaplasia mieloide, enfermedad de Waldenstroem y adenocarcinoma de Barret.
Preferentemente, el cáncer es cáncer colorrectal, melanoma, liposarcoma, glioblastoma, neuroblastoma, linfoma o leucemia. En una realización preferida, el cáncer es cáncer colorrectal. La expresión «cáncer colorrectal», tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un cáncer en el colon o recto, también conocido como cáncer de colon, cáncer rectal o cáncer de intestino. En una realización, la presente divulgación se refiere a un cáncer colorrectal metastásico.
Cabe esperar que la combinación consiga efectos superiores en los cánceres con p53 de origen natural o p53 funcional. El gen TP53 es uno de los genes mutados con mayor frecuencia en los cánceres humanos. Por lo tanto, el supresor tumoral p53 se ve funcionalmente afectado por mutación o deleción en casi el 50 % de los cánceres humanos. En los cánceres humanos restantes, p53 conserva su estado natural, pero su función se ve inhibida por su inhibidor celular primario, el doble minuto murino 2 (Mdm2, MDM2; HDM2 (homólogo humano del doble minuto murino 2)). MDM2 es un regulador negativo del supresor tumoral p53. La proteína Mdm2 funciona tanto como una ligasa de ubicuitina E3, que conduce a la degradación proteosómica de p53, como un inhibidor de la activación transcripcional de p53. Se suele observar Mdm2 amplificado en los tumores con p53 de origen natural. Debido a que la interacción entre Mdm2 y p53 es un mecanismo primario para la inhibición de la función p53 en los cánceres, que conservan p53 de origen natural, la combinación de la presente divulgación que comprende el inhibidor de MDM2 es particularmente útil para el tratamiento de los cánceres con p53 de origen natural o con p53 funcional.
Además, cabe esperar que la eficacia de la combinación sea mayor en un cáncer que se caracterice por una o más de entre una mutación de KRAS y/o mutación de BRAF y/o mutación de MEK1 y/o mutación de PIK3CA y/o sobreexpresión de PIK3CA.
Los pacientes con cáncer colorrectal que son portadores de mutaciones de KRAS o BRAF, que constituyen conjuntamente hasta un 50 %-60 % de los casos de cáncer colorrectal registrados (Fearon 2011), se asocian generalmente con un mal pronóstico (Arrington, Heinrichet al.2012, Safaee Ardekani, Jafarnejadet al.2012). Las combinaciones de esta divulgación son particularmente útiles para el tratamiento de un cáncer que comprende una o más mutaciones de KRAS o una o más mutaciones de BRAF.
Los ejemplos de mutaciones de BRAF incluyen, sin carácter limitante, V600E, R461I, I462S, G463E, G463V, G465A, G465E, G465V, G468A, G468E, N580S, E585K, D593V, F594L, G595R, L596V, T598I, V599D, V599E, V599K, V599R, V600K, A727V. La mayoría de estas mutaciones se agrupan en dos regiones: el bucle P rico en glicina del lóbulo N y el segmento de activación y las regiones flanqueantes. Se ha detectado una mutación V600E en una variedad de cánceres y se debe a una sustitución de timina por adenina en el nucleótido 1799. Esto lleva a que la valina (V) se sustituya por glutamato (E) en el codón 600 (a lo que se hace referencia como V600E).
Una mutación de MEK1 puede ser, por ejemplo, la mutación de MEK1 S72G.
Los ejemplos de una mutación de PIK3CA y/o sobreexpresión de PIK3CA incluyen, sin carácter limitante, la amplificación de la isoforma alfa de PI3K, una mutación somática de PIK3CA, mutaciones de la línea germinal o mutaciones somáticas de PTEN, mutaciones y translocación de p85a que sirven para regular positivamente el complejo p85-p110, o la amplificación o sobreexpresión de la isoforma beta de PI3K.
La combinación farmacéutica de la presente divulgación es particularmente útil para el tratamiento de un cáncer, en particular cáncer colorrectal, en donde el cáncer es resistente a un tratamiento con un inhibidor de EGFR, o está desarrollando resistencia a un tratamiento con un inhibidor de EGFR, o corre un riesgo elevado de desarrollar resistencia a un tratamiento con un inhibidor de EGFR, en particular en donde el inhibidor de EGFR se selecciona del grupo que consiste en erlotinib, gefitinib y afatinib.
La combinación farmacéutica de la presente divulgación también es adecuada para el tratamiento de pacientes con mal pronóstico, teniendo especialmente tales pacientes con mal pronóstico un cáncer, en particular cáncer colorrectal, que se vuelve resistente al tratamiento que emplea un inhibidor de EGFR, p. ej., un cáncer de pacientes tales que inicialmente habían respondido al tratamiento con un inhibidor de EGFR y posteriormente sufrieron una recidiva. En un ejemplo adicional, dicho paciente no ha recibido tratamiento con un inhibidor de FGFR. Este cáncer puede haber adquirido resistencia durante un tratamiento previo con uno o más inhibidores de EGFR. Por ejemplo, la terapia dirigida a EGFR puede comprender un tratamiento con gefitinib, erlotinib, lapatinib, XL-647, HKI-272 (Neratinib), BIBW2992 (Afatinib), EKB-569 (Pelitinib), AV-412, canertinib, PF00299804, BMS 690514, HM781-36b, WZ4002, AP-26113, cetuximab, panitumumab, matuzumab, trastuzumab, pertuzumab o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. En particular, la terapia dirigida a EGFR puede comprender un tratamiento con gefitinib, erlotinib y afatinib. Los mecanismos de resistencia adquirida incluyen, sin carácter limitante, el desarrollo de una segunda mutación en el gen EGFR en sí, p. ej., T790M, la amplificación de EGFR; y/o la desregulación de FGFR, una mutación de FGFR, una mutación del ligando de FGFR, la amplificación de FGFR o la amplificación del ligando de FGFR.
Los siguientes Ejemplos ilustran la divulgación descrita anteriormente, pero no se pretende, sin embargo, que limiten el alcance de la divulgación de modo alguno. Otros modelos de prueba conocidos como tales por el experto en la técnica pertinente también pueden determinar los efectos beneficiosos de la divulgación reivindicada.
Ejemplos
La expresión «COMPUESTO A», «COMPUESTO B» o similares denotan en el presente documento compuestos específicos. La denotación de un compuesto respectivo puede no ser la misma para todos los ejemplos o combinaciones. Más bien, los compuestos se denotan en cada ejemplo de nuevo.
Ejemplo de referencia 1: Efecto in vitro sobre la proliferación de combinar un inhibidor de MDM2 y un inhibidor de MEK.
Este estudio fue diseñado para explorar el efectoin vitrosobre la proliferación de combinar el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO A) o el inhibidor de M<d>M2 (6S)-5-(5-cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1 -(propan-2-il)-5,6-dihidropirrolo[3,4-d]imidazol-4(1 H)-ona (COMPUESTO B) con el inhibidor de MEK trametinib (COMPUESTO C) en líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural.
MÉTODOS
Los COMPUESTOS A, B y C se disolvieron en DMSO al 100 % (Sigma, número de catálogo D2650) con concentraciones de 20 mM y se almacenaron a -20 °C hasta su uso.
Las líneas celulares de cáncer colorrectal utilizadas para este estudio se obtuvieron, cultivaron y procesaron a partir de los proveedores comerciales ATCC, ECACC, DSMZ y CellBank Australia (Tabla 1). Todos los medios de la línea celular se complementaron con FBS al 10 % (HyClone, número de catálogo SH30071.03). El medio para LIM2405 se complementó adicionalmente con 0,6 |jg/mL de insulina (SIGMA, número de catálogo 19278), 1 |jg/mL de hidrocortisona (SIGMA, número de catálogo H0135) y 1-tioglicerol 10 jM (SIGMA, número de catálogo M6145).
<Línea celular 1Mutaciones oncoriciadoras Fuente>■ I<Núm. de caL de la fuente Medio Proveedor del medio>I I<Núm. de cat. del metió Tratamiento (h]>
HCT-116 KRAS, PIK3CA ATCC CCL-247 McCo/s 5A ATCC 30-2007 500 72
LS-180 KRAS. PIK3CA ATCC CCL-187 EMEM ATCC 30-2003 800 72
GP2d KRAS. PIK3CA ECACC 95090714 DMEM ATCC 30-2002 900 72
COLO-678 KRAS DSMZ ACC-194 RPMI ATCC 30-2001 1250 96
LoVo KRAS ATCC CCL-229 F-12K ATCC 30-2004 1250 96
RKO BRAF.PIK3CA ATCC CRL-2577 EMEM ATCC 30-2003 500 72
LIM24Q5 BRAF CellBank Australia CBA-0165 RPMI ATCC 30-2001 750 72
SW48 MEK1 ATCC CCL-231 RPMI ThemnoFisher 22400-071 1250 96
Tabla 1. Información sobre las líneas celulares
Las líneas celulares se cultivaron en una incubadora a 37 °C y con un 5 % de CO2 y se expandieron en frascos T-75. En todos los casos, las células se descongelaron a partir de patrones congelados, se expandieron a través de > 1 pasaje utilizando diluciones 1:3, se contaron y se evaluaron para determinar la viabilidad utilizando un contador ViCell (Beckman-Coulter) antes de la colocación en placas. Para dividir y expandir las líneas celulares, las células se desprendieron de los frascos utilizando tripsina-EDTA al 0,25 % (GIBCO, número de catálogo 25200). Se determinó que todas las líneas celulares estaban exentas de contaminación por micoplasma según se determinó mediante una metodología de detección por PCR realizada en Idexx Radii (Columbia, MO, EE. UU.) y se identificaron correctamente mediante la detección de un panel de SNP.
Para evaluar el efecto de la combinación del COMPUESTO A o el COMPUESTO B con el COMPUESTO C sobre la proliferación celular, las células se sembraron en microplacas negras de 384 pocillos con fondo transparente (Matrix/Thermo Scientific, número de catálogo 4332) en 50 jL de medio por pocillo con densidades celulares comprendidas entre 500 y 1250 células/pocillo (Tabla 1) y se dejaron incubar a 37 grados, con un 5 % de CO2 durante 24 h. Después de 24 h, se preparó una placa de 384 pocillos por línea celular para el recuento celular mediante microscopía (véase más adelante) sin recibir tratamiento (= «línea de base»). Las otras placas celulares se trataron utilizando un dispensador digital HP D300 (Tecan) que genera curvas de respuesta-dosis de 6 puntos con pasos de dilución de 2.5X.
El COMPUESTO A se utilizó en un intervalo de concentración final de 51nM - 5 jM , el COMPUESTO B en un intervalo de concentración final de 10 nM - 1 jM y el COMPUESTO C en un intervalo de concentración final de 1 nM - 100 nM.
Para las combinaciones del COMPUESTO A o COMPUESTO B con el COMPUESTO C, los agentes individuales se combinaron en 6 dosis de agente individual, para generar una matriz de dosis de 6x6 = 36 tratamientos de combinación. Además, se transfirieron controles negativos (DMSO = «vehículo») y controles positivos (estaurosporina = destrucción de células, serie de diluciones 1:2 de 7 puntos para un intervalo de dosis de 16 nm - 1 |jM) como controles de tratamiento. Las células se trataron durante de 72 h a 96 h dependiendo de su tiempo de duplicación (Tabla 1). Al final del tratamiento, las células se prepararon para el recuento celular por microscopía. Las células se fijaron y se permeabilizaron durante 45 minutos en PFA al 4 % (Electron Microscopy Sciences, número de catálogo 15714), t X-100 al 0,12 % (Electron Microscopy Sciences, número de catálogo 22140) en PBS (Boston Bioproducts, número de catálogo BM-220). Después de lavar las células tres veces con PBS, su ADN se tiñó durante 30 minutos con Hoechst 33342 (ThermoFisher, número de catálogo H3570) con una concentración final de 4 jg/mL. Las células se lavaron tres veces con PBS y a continuación las placas se sellaron con calentamiento utilizando un PlateLoc (Agilent Technologies) con sellos de aluminio (Agilent Technologies, número de catálogo 06644-001) y se almacenaron a 4 ° C hasta la obtención de imágenes. Todas las células por pocillo/tratamiento fueron capturadas en una sola imagen por microscopía de fluorescencia utilizando un analizador InCell 2000 (GE Healthcare) dotado de un objetivo X4 y filtros de excitación/emisión de DAPI.
Para evaluar los efectos de las combinaciones sobre la inducción de la apoptosis, se llevó a cabo un ensayo de Caspasa 3/7 utilizando un montaje experimental similar al del ensayo de proliferación descrito anteriormente y evaluando tan solo la combinación del COMPUESTO A con el COMPUESTO C. Los compuestos se distribuyeron en placas maestras de fármaco (Greiner, número de catálogo 788876) y se diluyeron en serie 3 veces (7 pasos) con una concentración de 2000X. Las células se trataron transfiriendo 25 nL del compuesto 2000X desde las placas maestras de fármaco utilizando un dispensador de líquidos acústico ATS (ECD Biosystems) a 50 jL de células, lo que dio como resultado una concentración final de 1X.
El COMPUESTO A se utilizó en un intervalo de concentración final de 13 nM - 10 jM y el COMPUESTO C en un intervalo de concentración final de 0,4 nM - 0,3 jM . Además, se transfirieron controles negativos (DMSO = «vehículo») y controles positivos (estaurosporina = destrucción de células, serie de diluciones 1:2 de 7 puntos para un intervalo de dosis de 16 nm - 1 jM ) como controles de tratamiento.
Después de la adición del compuesto, se añadieron 50 nL de reactivo de detección verde para Caspasa-3/7 CellEvent 2 mM (ThermoFisher, número de catálogo C10423) a una de las tres réplicas utilizando el dispensador digital HP D300 (Tecan). La inducción de la Caspasa 3/7 se midió como un indicador de la apoptosis inducida por los tratamientos. Las células se trataron durante de 72 h a 96 h dependiendo de su tiempo de duplicación (Tabla 1), y la activación de la Caspasa 3/7 se midió cada 24 h por microscopía utilizando un analizador InCell 2000 (GE Healthcare) dotado de un objetivo 4X y filtros de excitación/emisión de FITC. Al final del tratamiento, se prepararon las células para el recuento celular por microscopía e imágenes tal como se ha descrito anteriormente para el ensayo de proliferación celular.
Las imágenes se analizaron después de adaptar los métodos descritos anteriormente (Horn, Sandmannet al.2011) y utilizando el paquete Bioconductor EBImage en R (Pau, Fuchset al.2010). Los objetos en ambos canales, DAPI (para Hoechst/ADN) y FITC (para Caspasa 3/7), se segmentaron por separado mediante un umbral adaptativo y se contaron. Se definió manualmente un umbral para los objetos positivos de Caspasa 3/7 por línea celular después de comparar controles negativos (DMSO) y controles positivos (estaurosporina). Al analizar 17 características adicionales de objeto/núcleo en el canal de ADN (características de forma e intensidad) se identificaron residuos/núcleos fragmentados. Con este fin por línea celular, las distribuciones de las características adicionales entre controles positivos (estaurosporina) y controles negativos (DMSO) se compararon manualmente. Las características que podían distinguir entre las condiciones (p. ej., un cambio en la distribución de una medición de características que compara DMSO con estaurosporina) se utilizaron para definir la población de «residuos» frente a la población de núcleos «viables». Los recuentos de residuos se restaron de los recuentos de núcleos en bruto. El número de núcleos resultante se utilizó como medida de la proliferación celular («recuento celular»).
El efecto del compuesto sobre la proliferación celular se calculó a partir de los recuentos celulares de los tratamientos en relación con los recuentos celulares del control negativo (DMSO), en las Figuras 1 y 2 denominado «Recuento celular normalizado» en el eje de las y. La sinergia de las combinaciones se evaluó mediante un análisis de isobolograma (Greco, Bravoet al.1995) (Figura 3) y mediante el cálculo de los índices de combinación (Chou, Talalay 1984) (Tabla 2), que evalúa la sinergia según el modelo de Loewe (Loewe 1928). El análisis del IC se realizó para un nivel de isoefecto de un 75 % (inhibición de un 75 % para tratamientos con un agente individual en comparación con el tratamiento con la combinación). El «mejor IC» (puntos rojos en la Figura 3 y la Tabla 2) es el índice de combinación más bajo observado para esa combinación en una línea celular particular.
El índice de las combinaciones (IC) es un indicador del efecto de la combinación en donde
IC < 1: sinergia
IC = 1: efecto aditivo
IC > 1: antagonismo,
p. ej., un índice de combinación de 0,5 indica que, en la combinación, solo se requiere la mitad de cada agente individual cuando se compara con las dosis solas de agente individual requeridas para alcanzar el mismo efecto (en este caso, una inhibición de un 75 %).
La CI75 es la concentración de compuesto que da como resultado un 75 % de los recuentos celulares respecto al DMSO. Se realizaron cálculos de CI75 (véase la Tabla 2) llevando a cabo una regresión logística de 3 parámetros en los datos.
Cé!ula| CI75 para el COMPUESTO A. CI75 parael COMPUESTO 3 £ CI75 para trametinib (C )|| Mejor IC parala COMBINACIÓN A*C 11 Mejor IC para la COMBINACIÓN B+C
colo678 3,13<>1>>0.1 0,18 0,19
rko 1.75 0,54 >0.1 0,26 0,21
9P?d 1,11 0,23 >0.1 0,30 0,24
lovo 1,32 0,34 0,018 0,35 0,31
Iim2405 0,81 0,20 0,008 0,47 0,34
Is180 0.38 0,20 0,014 0,60 0,55
hct116 0,59 0,12 0.029 0,61 0,48
sw48 1,01 0,26 0,003 0,65 0,63
Tabla 2. Valores de CI75 de los agentes Individuales para cada compuesto y mejores índices de la
combinación (mejor IC) para las combinaciones del COMPUESTO A y trametinib y el COMPUESTO
B y trametinib.
El efecto del compuesto sobre la apoptosis se determinó calculando el porcentaje de células con Caspasa 3/7 activada por tratamiento y punto de evaluación respecto a los recuentos celulares en bruto (antes de la sustracción de los residuos) (eje de las y en la Figura 4). Los recuentos celulares en puntos de evaluación que no se midieron experimentalmente se obtuvieron mediante análisis de regresión ajustando un modelo lineal para recuentos celulares transformados logarítmicamente en el día 0 y al final del tratamiento (suponiendo un crecimiento celular exponencial).
Para los ensayos de formación de colonias (Figura 5), las células se sembraron en 1 mL de medio en placas tratadas con cultivo tisular de 12 pocillos (Costar, número de catálogo 3513): para COLO-678 6000 células/pocillo, SW48 5000 células/pocillo, GP2d 2000 células/pocillo, LoVo 2500 células/pocillo, LS-180 2500 células/pocillo, LIM2405 2500 células/pocillo, RKO 1000 células/pocillo y para HCT-1161000 células/pocillo. Las células se cultivaron durante 72 h antes de la adición de los compuestos, y los tratamientos se refrescaron cada 48 h (en medio fresco) durante un máximo de 14 días utilizando un dispensador digital HP D300 (Tecan). Al final del tratamiento, las células se lavaron en PBS una vez, se fijaron y se tiñeron durante 30 minutos a temperatura ambiente utilizando una solución que contenía un 4 % de PFA (Electron Microscopy Sciences, número de catálogo 15714) y 2 mg/mL de violeta cristal (EMD, número de catálogo 192 12), y se lavaron 3 veces con agua. Las placas se secaron durante la noche y se escanearon con un tomógrafo Odyssee (Licor). Se utilizó el software ImageStudio (Licor) para cuantificar la señal de violeta cristal para la Figura 5. Para la prueba de significancia, véase la Tabla 3.
Tabla 3. Significancia de la diferencia de los resultados de los ensayos de formación de colonias
(Figura 4) de la combinación del COMPUESTO A y trametinib en comparación con las dosis
correspondientes del COMPUESTO A o trametinib por sí solos (prueba t de una cola). *p < 0,05,
**p < 0,01, ***p < 0,001.
Para el análisis del ciclo celular (Figura 6), las células se sembraron en 10 mL de medio en placas tratadas con cultivo tisular de 10 cm (Corning, número de catálogo 430167): para COLO-678 3,5 millones de células, SW482,75 millones de células, GP2d 2,5 millones de células, LoVo 2,5 millones de células, LS-1802,5 millones de células, LIM2405 1,5 millones de células, RKO 1,5 millones de células y para HCT-1162 millones de células. Los tratamientos farmacológicos se llevaron a cabo manualmente después de 24 h. Las muestras se recolectaron 24 h después del tratamiento recogiendo el sobrenadante y recolectando las células por tripsinización utilizando tripsina-EDTA al 0,25 % (GIBCO, número de catálogo 25200). Las células se sedimentaron, se lavaron una vez con PBS y se sedimentaron de nuevo antes de fijarlas en 1 mL de etanol al 70 % enfriado con hielo (que se añadió gota a gota al sedimento a la vez que se agitaba con vórtex) durante 30 minutos a 4°C. A continuación, las células se sedimentaron a una velocidad más elevada (850xg) durante 5 min y el sedimento se lavó dos veces en tampón de fosfato-citrato (Na2HPO40,2M, ácido cítrico 0,1 M, ajustado a un pH de 7.8) y se centrifugó a la misma velocidad (durante 5 minutos). Finalmente, el sedimento se disolvió en 0,5 mL de tampón de tinción de PI/RNasa (BD Pharmingen, número de catálogo 550825). Después de 15 minutos de incubación a TA, se analizó el ciclo celular en un sistema BD FACSCanto II (analizando 10000 eventos por condición). Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo.
Para las transferencias de Western (Figura 7), las células se sembraron en 10 mL de medio en placas tratadas con un cultivo tisular de 10 cm (Corning, número de catálogo 430167): para COLO-678 8 millones de células, SW484 millones de células, GP2d 3 millones de células, LoVo 4 millones de células, LS-1804,5 millones de células, LIM24052 millones de células, RKO 3,5 millones de células y para HCT-116 3,5 millones de células. Las células se cultivaron durante 24 h antes de la adición de los compuestos. Después de 24 h de tratamiento, las células se recolectaron en PBS enfriado con hielo por raspado, se sometieron a lisis en tampón de lisis (Cell Signaling, número de catálogo 9803) que contenía inhibidores de fosfatasas (Roche, número de catálogo 04906837001) e inhibidores de proteasas (Roche, número de catálogo 04693116001) durante 30 minutos. Se cuantificaron los lisados utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (ThermoFisher, número de catálogo 23225), se normalizó la concentración, se añadió tampón de carga (ThermoFisher, NP0007), se añadieron 25-50 |jg de proteína en geles prefabricados de gradiente de poliacrilamida al 4-15 % (Biorad, número de catálogo 5671084) y se ejecutaron en un sistema de electroforesis (Biorad) durante 30-35 min a 300 V. La proteína se transfirió a membranas de nitrocelulosa utilizando el sistema de transferencia iBlot (Invitrogen) y el kit de transferencia iBlotGel (ThermoFisher, número de catálogo IB301001). Las proteínas que se muestran en la Figura 5 se detectaron utilizando los siguientes anticuerpos primarios: p53 (Santa Cruz Biotechnology, sc-126, 1:500), MDM2 (CalBiochem, #OP46, 1:500), ERK (Cell Signaling Technology, #4695, 1:1000), pERK (Cell Signaling Technology #4370, 1:1000), p21 (Cell Signaling Technology, #2947, 1:1000), p27 (Santa Cruz Biotechnology, sc-528, 1:500), Ciclina D1 (Santa Cruz Biotechnology, sc-718, 1:500), BIM (Cell Signaling Technology, #2819, 1:500), cPARP (Cell Signaling Technology, #9541, 1:500), PUMA (Cell Signaling Technology, #4976, 1:500) y beta-actina (Ambion, AM4302, 1:10000). Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios: anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo conjugado con HRP (Biorad, 170-5046, 1:10000), anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con HRP (Biorad, 170-5047, 1:10000) y anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con IRDye® 800CW (Licor, 925-32210, 1:10000). Las membranas se desarrollaron en una película (Carestream, número de catálogo 178 8207) en un revelador (Kodak X-OMAT 2000A) o (para la betaactina) se generaron imágenes en un tomógrafo Odyssee (Licor).
Para el análisis de qRT-PCR (Figura 8), las células se sembraron en placas tratadas con cultivo tisular de 6 pocillos (Corning, número de catálogo 3516): para COLO-678 0,75 millones de células, SW48 0,5 millones de células, GP2d 0,4 millones de células, LoVo 0,4 millones de células, LS-1800,4 millones de células, LIM24050,25 millones de células, RKO 0,25 millones de células y para HCT-116 0,3 millones de células. Los tratamientos farmacológicos se llevaron a cabo manualmente después de 24 h. Las muestras se recolectaron 10 h después del tratamiento. Se retiró el sobrenadante, se lavaron las células una vez con PBS y a continuación se utilizó el kit RNeasy Mini (Qiagen, número de catálogo 74104) para la extracción de ARN El ARN se cuantificó utilizando un NanoDrop 1000 y se utilizó 1 jg de ARN total para la síntesis de ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (Biorad, número de catálogo 170-8891). Se realizó una qRT-PCR Taqman en placas de 384 pocillos en un ABI ViiA 7 (Applied Biosystems). En cada reacción, se utilizaron 6 jL de una mezcla maestra para PCR 2x (ThermoFisher, número de catálogo 435 2042), 0,6 jL del conjunto de cebador de betaactina/sonda (20X), 0,6 jL del conjunto de cebador de la diana/sonda (20X) y 4,8 jL de ADNc (dilución 1:4 del producto a partir de la síntesis de ADNc). Se ejecutó el siguiente programa: 2 minutos a 50 °C, 10 min a 95 °C y los 40 ciclos con 10 segundos a 95 °C y 1 minuto a 60 °C. Se utilizaron los siguientes conjuntos de sondas/cebadores (ensayos de expresión génica ThermoFisher TaqMan): CDKN1A/p21 (Hs00355782_M1), BAX (Hs00180269_M1), BBC3/PUMA (Hs00248075_M1), BMF (Hs00372937_M1), NOXA1 (Hs00736699_M1).
RESULTADOS
En este informe, se evaluaron las eficacias de dos inhibidores de MDM2 (COMPUESTO A y COMPUESTO B) y el inhibidor de MEK trametinib (COMPUESTO C) de forma individual y combinada en un total de 8 líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural. Cinco de las líneas tenían KRAS mutado (GP2d, LS-180, HCT-116, LoVo, COLO-678), dos líneas tenían BRAF mutado (RKO, LIM2405) y una línea tenía MEk 1 mutado (SW48). Cuatro de las líneas también tenían PIK3CA mutado (GP2d, RKO, LS-180, HCT-116) (Tabla 1). El COMPUESTO A como agente individual inhibió el crecimiento de todas las líneas celulares con valores de CI75 del orden submicromolar a micromolar, el COMPUESTO B con valores de CI75 del orden submicromolar (excepto para COLO-678) y el COMPUESTO C con valores de CI75 del orden nanomolar (excepto para COLO-678, RKO y GP2d) (Figuras 1 y 2, Tabla 2). El tratamiento combinado provocó una inhibición sinérgica (de acuerdo con el modelo de Loewe) en todos los modelos celulares evaluados tal como indican los índices de combinación (IC) (Figura 3 y Tabla 2). Otros estudios mecanísticos se centraron en la combinación del COMPUESTO A con trametinib. La combinación mostró una inducción débil de la apoptosis (evaluada midiendo la inducción de la Caspasa 3/7) (Figura 4). La combinación evitó el crecimiento de clones en ensayos de formación de colonias significativamente mejor que cada uno de los agentes individuales, lo que muestra también la eficacia a largo plazo de la combinación (Figura 5 y Tabla 3). Se realizó un análisis de FACS después de 24 h de tratamiento y mostró que la inhibición de MDM2 provocó la depleción de las células en la fase S y las detuvo en las fases G1 y/o G2 del ciclo celular (Figura 6). Las respuestas a la inhibición de MEK fueron más dependientes de la línea celular, pero en la mayoría de los modelos dieron como resultado un aumento de las poblaciones de G1. La combinación mostró principalmente una depleción de la fase S y en 5/8 modelos también aumentó las poblaciones de sub-G1, lo que sugiere la muerte celular.
Para identificar los factores que participaron en la detención del ciclo celular y la muerte celular después del tratamiento con la combinación, se realizaron análisis de Western (después de 24 h de tratamiento) y qPCR (después de 10 h tratamiento) de reguladores del ciclo celular y la apoptosis (Figuras 7 y 8). Los resultados de Western y qPCR sugirieron que la detención de G1 tras la inhibición de MDM2 fue debida a la inducción de p21 (CDKN1A). La proteína p27 (CDKN1B) fue inducida por la inhibición de MEK en algunos de los modelos evaluados (véanse los análisis de Western en la Figura 7), lo que podría potencialmente fortalecer la detención del ciclo celular en la combinación. La inhibición de MDM2 indujo transcripcionalmente la expresión de los factores proapoptóticos PUMA y BAX (Figura 7), y la inducción de PUMA también se confirmó en los análisis de Western (Figura 8). La inhibición de MEK mostró unos niveles elevados de la proteína proapoptótica BIM (Figura 7), y la expresión inducida transcripcionalmente de los factores proapoptóticos BMF y NOXA1 (Figura 8). En conjunto, la inducción de estos genes y proteínas en la combinación farmacológica podría explicar el aumento de la escisión de PARP (cPARP) observado en la combinación en todos los modelos excepto en COLO-678 (Figura 7). cPARP es un indicador para la inducción de la apoptosis.
CONCLUSIONES
En conclusión, los datos sugieren que la inhibición combinada de MDM2 y MEK podría regular conjuntos complementarios de proteínas de detención del ciclo celular (inducción p21 y p27) para inducir la detención del ciclo celular en G1 y/o G2, y proteínas proapoptóticas (p. ej., inducción de BAX, BIM y PUMA) para inducir la muerte celular por apoptosis. La inhibición combinada de MDM2 y MEK en cáncer colorrectal con TP53 de origen natural puede proporcionar una modalidad terapéutica eficaz capaz de mejorar las respuestas en comparación con cada uno de los agentes individuales y conducir a respuestas más duraderas en el centro de salud.
Ejemplo de referencia 2: Efecto in vitro sobre la proliferación de combinar un inhibidor de MDM2 y un inhibidor de MEK con un inhibidor de Bcl2.
Este estudio fue diseñado para explorar el efectoin vitrosobre la proliferación de combinar el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO A) y el inhibidor de MEK trametinib (COMPUESTO B) con el inhibidor de BCL-2/-XL navitoclax (ABT-263) (COMPUESTO C) en líneas celulares de cáncer colorrectal con Tp 53 de origen natural.
MÉTODOS
Los COMPUESTOS A, B y C se disolvieron en DMSO al 100 % (Sigma, número de catálogo D2650) con concentraciones de 20 mM y se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Los compuestos se distribuyeron en placas maestras de fármacos (Greiner, número de catálogo 788876) y se diluyeron en serie con un factor de 3 (7 pasos) con una concentración de 2000X.
Las líneas celulares de cáncer colorrectal utilizadas para este estudio se obtuvieron, cultivaron y procesaron a partir de los proveedores comerciales ATCC y ECACC (Tabla 4). Todos los medios de la línea celular se complementaron con FBS al 10 % (HyClone, número de catálogo SH30071.03).
<Línea celular Mutaciones orcon dadoras> <Núm. de cat de la fuente>1<1 Medio ■ Proveedor del medio>Núm. de cat. del medio ûías Tratamiento [h]
HCT-116 KRAS. PIK3CA ATCC CCL-247 McCo/s 5A ATCC 30*2007 500 72
LS-100 KRAS. PIK3CA ATCC CCL-187 EMEM ATCC 30-2003 SCO 72
GP2d KRAS. PIK3CA ECACC 95090714 DMEM ATCC 30-2002 900 72
L<0>V<0>KRAS ATCC CCL-229 F-12K ATCC 30-2004 1250 96
RKO BRAF.PIK3CA ATCC CRL-2577 EMEM ATCC 30-2003 500 72
Tabla 4. Información sobre las líneas celulares
Las líneas celulares se cultivaron en una incubadora a 37 °C y con un 5 % de CO2 y se expandieron en frascos T-75. En todos los casos, las células se descongelaron a partir de patrones congelados, se expandieron a través de > 1 pasaje utilizando diluciones 1:3, se contaron y se evaluaron para determinar la viabilidad utilizando un contador ViCell (Beckman-Coulter) antes de la colocación en placas. Para dividir y expandir las líneas celulares, las células se desprendieron de los frascos utilizando tripsina-EDTA al 0,25 % (GIBCO, número de catálogo 25200). Se determinó que todas las líneas celulares estaban exentas de contaminación por micoplasma según se determinó mediante una metodología de detección por PCR realizada en Idexx Radii (Columbia, MO, EE. UU.) y se identificaron correctamente mediante la detección de un panel de SNP.
Para evaluar el efecto de la combinación del COMPUESTO A, COMPUESTO B con el COMPUESTO C sobre la proliferación celular, las células se sembraron en microplacas negras de 384 pocillos con fondo transparente (Matrix/Thermo Scientific, número de catálogo 4332) en 50 |<j>L de medio por pocillo con densidades celulares comprendidas entre 500 y 1250 células/pocillo (Tabla 4) y se dejaron incubar a 37 grados, con un 5 % de CO2 durante 24 h. Después de 24 h, se preparó una placa de 384 pocillos por línea celular para el recuento celular mediante microscopía (véase más adelante) sin recibir tratamiento (= «línea de base»). Las otras placas celulares se trataron transfiriendo 25 nL del compuesto 2000X desde las placas maestras del fármaco utilizando un dispensador de líquidos acústico ATS (ECD Biosystems) y dando como resultado una concentración final de 1X. El COMPUESTO A se utilizó en un intervalo de concentración final de 13 nM - 10|jM, el COMPUESTO B se utilizó en un intervalo de concentración final de 13 nM - 10 |jM y el COMPUESTO C se utilizó en un intervalo de concentración final de 0,4 nM - 0,3<j>M (7 pasos de dilución 1:3). Con el fin de evaluar el efecto de la combinación triple, todos los COMPUESTOS individuales (A, B, C), las tres combinaciones por pares (A+B, A+C, B+C) y la combinación triple (A+B+C) se evaluaron en el mismo experimento. Las combinaciones por pares y la combinación triple se evaluaron con una relación fija de 1:1 (para pares de fármacos) y 1: 1: 1 (para el triple fármaco) en cada dilución, lo que dio como resultado 7 condiciones de combinación por tratamiento. Además, los controles negativos (DMSO = «vehículo») y los controles positivos (estaurosporina = destrucción de células, series de dilución 1:2 de 7 puntos para un intervalo de dosis de 16 nM - 1<j>M) se transfirieron como controles de tratamiento, y los compuestos sin eficacia en las líneas celulares evaluadas se utilizaron en combinaciones con el COMPUESTO A y el COMPUESTO B como controles de combinación (combinaciones que no exceden la eficacia del agente individual más eficaz = combinaciones «que no interactúan»). Después de la adición del compuesto, se añadieron 50 nL de reactivo de detección verde para Caspasa-3/7 CellEvent 2 mM (ThermoFisher, número de catálogo C10423) a una de las tres réplicas utilizando el dispensador digital HP D300 (Tecan). La inducción de la Caspasa 3/7 se midió como un indicador de la apoptosis inducida por los tratamientos. Las células se trataron durante de 72 h a 96 h dependiendo de su tiempo de duplicación (Tabla 4), y la activación de la Caspasa 3/7 se midió cada 24 h por microscopía utilizando un analizador InCell 2000 (GE Healthcare) dotado de un objetivo 4X y filtros de excitación/emisión de FITC. Al final del tratamiento, las células se prepararon para el recuento celular por microscopía. Las células se fijaron y se permeabilizaron durante 45 minutos en PFA al 4 % (Electron Microscopy Sciences, número de catálogo 15714), TX-100 al 0,12 % (Electron Microscopy Sciences, número de catálogo 22140) en PBS (Boston Bioproducts, número de catálogo BM-220). Después de lavar las células tres veces con PBS, su ADN se tiñó durante 30 minutos con Hoechst 33342 (ThermoFisher, número de catálogo H3570) con una concentración final de 4 jg/mL. Las células se lavaron tres veces con PBS y a continuación las placas se sellaron con calentamiento utilizando un PlateLoc (Agilent Technologies) con sellos de aluminio (Agilent Technologies, número de catálogo 06644-001) y se almacenaron a 4 °C hasta la obtención de imágenes. Todas las células por pocillo/tratamiento fueron capturadas en una sola imagen por microscopía de fluorescencia utilizando un analizador InCell 2000 (GE Healthcare) dotado de un objetivo 4X y filtros de excitación/emisión de DAPI.
Las imágenes se analizaron después de adaptar los métodos descritos anteriormente (Horn, Sandmannet al.2011) y utilizando el paquete Bioconductor EBImage en R (Pau, Fuchset al.2010). Los objetos en ambos canales, DAPI (para Hoechst/ADN) y FITC (para Caspasa 3/7), se segmentaron por separado mediante un umbral adaptativo y se contaron. Se definió manualmente un umbral para los objetos positivos de Caspasa 3/7 por línea celular después de comparar controles negativos (DMSO) y controles positivos (estaurosporina). Al analizar 17 características adicionales de objeto/núcleo en el canal de ADN (características de forma e intensidad) se identificaron residuos/núcleos fragmentados. Con este fin por línea celular, las distribuciones de las características adicionales entre controles positivos (estaurosporina) y controles negativos (DMSO) se compararon manualmente. Las características que podían distinguir entre las condiciones (p. ej., un cambio en la distribución de una medición de características que compara DMSO con estaurosporina) se utilizaron para definir la población de «residuos» frente a la población de núcleos «viables». Los recuentos de residuos se restaron de los recuentos de núcleos en bruto. El número de núcleos resultante se utilizó como medida de la proliferación celular («recuento celular»).
El efecto del compuesto sobre la proliferación celular se calculó a partir de los recuentos celulares de los tratamientos en relación con los recuentos celulares del control negativo (DMSO), en la Figura 9 denominado «Recuento celular normalizado» (= «xnorm») en el eje de las y. Las combinaciones sinérgicas se identificaron utilizando el modelo de agente individual más alto (HSA) como hipótesis nula (Berenbaum 1989). El exceso respecto al modelo HSA predice una conexión funcional entre las dianas inhibidas (Lehar, Zimmermannet al.2007, Lehar, Kruegeret al.2009). Los datos de entrada del modelo fueron valores de inhibición por dosis de fármaco:
1 = 1 - xnorm
I: inhibición
xnorm: recuento celular normalizado (mediana de tres repeticiones)
En cada punto de dosis del tratamiento combinado, se calculó la diferencia entre la inhibición de la combinación y la inhibición del más potente de los dos agentes individuales (= residuales del modelo). De manera similar, para evaluar la sinergia de las combinaciones triples en cada punto de dosis, se calculó la diferencia entre la inhibición del triple fármaco y la inhibición del par de fármacos más potente. Para favorecer los efectos de la combinación en una inhibición alta, los residuales se ponderaron con la inhibición observada en el mismo punto de dosis. La puntuación general de la combinación C para una combinación farmacológica es la suma de los residuales ponderados para todas las concentraciones:
C = üConc ( Idato * (Idato- Imodelo))
Idato: inhibición medida
Imodelo: inhibición de acuerdo con la hipótesis nula de HSA
Se calcularon puntuaciones robustas z de la combinación (zC) como la relación de las puntuaciones de la combinación de los tratamientos C y la desviación absoluta mediana (dam) de combinaciones que no interactúan:
zC = C / dam(Ccero)
Ccero: puntuaciones de la combinación para combinaciones que no interactúan
zC es un indicador de la potencia de la combinación en donde:
zC > 3: sinergia
3 > zC > 2: sinergia débil
zC < 2: sin sinergia
La CI50 es la concentración del compuesto que da como resultado un 50 % de los recuentos celulares respecto al DMSO. Los cálculos de CI50 (véase la Tabla 5) se realizaron utilizando el paquete DRC en R (Ritz y Streibig 2005) y ajustando una función log-logística de cuatro parámetros a los datos.
El efecto del compuesto sobre la apoptosis se determinó calculando el porcentaje de células con Caspasa 3/7 activada por tratamiento y punto de evaluación respecto a los recuentos celulares en bruto (antes de la sustracción de los residuos) (eje de las y en la Figura 10). Los recuentos celulares en puntos de evaluación que no se midieron experimentalmente se obtuvieron mediante análisis de regresión ajustando un modelo lineal para recuentos celulares transformados logarítmicamente en el día 0 y al final del tratamiento (suponiendo un crecimiento celular exponencial).
<GP2d>0,8<>0,3>>10<6,4>
<HCT-116>0,1<0,038>>10<3>
<LS-180>0,7<0,018>>101,4
<RKO>1,2 0,021 >10<1,4>
<LoVo>0,6<0,007>>10 0,8
Tabla 5. Valores de CI50 de los agentes individuales para cada compuesto y mediciones de las puntuaciones
z de la sinergia para la combinación del COMPUESTO A, COMPUESTO B y COMPUESTO C.
RESULTADOS
En este informe, se evaluaron las eficacias de un inhibidor de MDM2 (COMPUESTO A), un inhibidor de MEK (trametinib, COMPUESTO B) y un inhibidor de BCL-2/-XL (ABT-263, COMPUESTO C) de forma individual y combinada en un total de 5 líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural. Cuatro de las líneas tenían KRAS mutado (GP2d, LS-180, HCT-116, LoVo), una línea tenía BRAF mutado (RKO) (Tabla 4). El COMPUESTO A como agente individual inhibió el crecimiento de las líneas celulares con valores de CI50 del orden submicromolar a micromolar. El COMPUESTO B como agente individual inhibió el crecimiento de todas las líneas celulares excepto una (GP2d) con valores de CI50 del orden nanomolar, mientras que el COMPUESTO C no mostró ninguna eficacia como agente individual (Figura 9 y Tabla 5). La combinación triple (A+B+C) provocó una inhibición sinérgica (de acuerdo con el modelo HSA) en comparación con los pares de fármacos en 2/5 modelos celulares evaluados (Tabla 5). En cuatro de las líneas (GP2d, HCT-116, RKO, LoVo), la combinación triple mostró una apoptosis más potente (evaluada midiendo la inducción de la Caspasa 3/7) en comparación con las combinaciones por pares (Figura l0).
CONCLUSIONES
De forma colectiva, la inhibición combinada de MDM2, MEK y BCL-2/-XL en CCR con TP53 de origen natural puede proporcionar una modalidad terapéutica eficaz capaz de mejorar las respuestas en comparación con cada uno de los agentes individuales y conducir a respuestas más duraderas en el centro de salud.
Además, se añadió el inhibidor de PI3K 2-amida y 1 -({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1, 1 -dimetiletil)piridin-4-il]tiazol-2-il}amida del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico a la combinación de (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4metil-3-oxopiperazin-l-il)-trans-cidohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO A) y el inhibidor de MEK trametinib (COMPUESTO B) con el inhibidor de BCL-2/-XL navitoclax (ABT-263) (COMPUESTO C) para formar una combinación cuádruple y se evaluó conjuntamente en 1 línea celular con KRAS mutado y se observó que era débilmente sinérgica (LS-180, puntuación z de la combinación de 2,63) y que inducía apoptosis de forma potente (máximo de un 61 %).
Ejemplo de referencia 3: Efecto in vitro sobre la proliferación de combinar un inhibidor de MDM2 y un inhibidor de MEK con un inhibidor de EGFR.
Este estudio fue diseñado para explorar el efectoin vitrosobre la proliferación de combinar el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO A) y el inhibidor de MEK trametinib (COMPUESTO B) con el inhibidor de EGFR erlotinib (COMPUESTO C) en líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural.
MÉTODOS
Los COMPUESTOS A, B y C se disolvieron en DMSO al 100% (Sigma, número de catálogo D2650) con concentraciones de 20 mM y se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Los compuestos se distribuyeron en placas maestras de fármacos (Greiner, número de catálogo 788876) y se diluyeron en serie con un factor de 3 (7 pasos) con una concentración de 2000X.
Las líneas celulares de cáncer colorrectal utilizadas para este estudio se obtuvieron, cultivaron y procesaron a partir de los proveedores comerciales ATCC y ECACC (Tabla 6). Todos los medios de la línea celular se complementaron con FBS al 10 % (HyClone, número de catálogo SH30071.03).
Línea celular Mutaciones oncoinidadoías Núm. de cat.de la fuenteI I Medio H l Proveedor del medio Núm de cat. del medio i***?* Tratamiento [h]
HCT-116 KRAS. PIK3CA CCL-247 McCo/s 5A ATCC 30-2007 500 72
LS-180 KRAS. PIK3CA CCL-187 EMEM ATCC 30-2003 800 72
GP2d KRAS. PIK3CA 95090714 DMEM ATCC 30-2002 900 72
L<0>V<0>KRAS CCL-229 F-12K ATCC 30-2004 1250 96
RKO BRAF.PIK3CA CRL-2577 EMEM ATCC 30-2003 500 72
Tabla 6. Información sobre las líneas celulares
Las líneas celulares se cultivaron en una incubadora a 37 °C y con un 5% de CO2 y se expandieron en frascos T-75. En todos los casos, las células se descongelaron a partir de patrones congelados, se expandieron a través de > 1 pasaje utilizando diluciones 1:3, se contaron y se evaluaron para determinar la viabilidad utilizando un contador ViCell (Beckman-Coulter) antes de la colocación en placas. Para dividir y expandir las líneas celulares, las células se desprendieron de los frascos utilizando tripsina-EDTA al 0,25 % (GIBCO, número de catálogo 25200). Se determinó que todas las líneas celulares estaban exentas de contaminación por micoplasma según se determinó mediante una metodología de detección por PCR realizada en Idexx Radii (Columbia, MO, EE. UU.) y se identificaron correctamente mediante la detección de un panel de SNP.
Para evaluar el efecto de la combinación del COMPUESTO A, COMPUESTO B con el COMPUESTO C sobre la proliferación celular, las células se sembraron en microplacas negras de 384 pocillos con fondo transparente (Matrix/Thermo Scientific, número de catálogo 4332) en 50 |jL de medio por pocillo con densidades celulares comprendidas entre 500 y 1250 células/pocillo (Tabla 6) y se dejaron incubar a 37 grados, con un 5 % de CO2 durante 24 h. Después de 24 h, se preparó una placa de 384 pocillos por línea celular para el recuento celular mediante microscopía (véase más adelante) sin recibir tratamiento (= «línea de base»). Las otras placas celulares se trataron transfiriendo 25 nL del compuesto 2000X desde las placas maestras del fármaco utilizando un dispensador de líquidos acústico ATS (ECD Biosystems) y dando como resultado una concentración final de 1X. El COMPUESTO A se utilizó en un intervalo de concentración final de 13 nM - 10 j M, el COMPUESTO B se utilizó en un intervalo de concentración final de 13 nM - 10<j>M y el COMPUESTO C se utilizó en un intervalo de concentración final de 13 nM - 10<j>M (7 pasos de dilución 1:3). Con el fin de evaluar el efecto de la combinación triple, todos los COMPUESTOS individuales (A, B, C), las tres combinaciones por pares (A+B, A+C, B+C) y la combinación triple (A+B+C) se evaluaron en el mismo experimento. Las combinaciones por pares y la combinación triple se evaluaron con una relación fija de 1:1 (para pares de fármacos) y 1: 1: 1 (para el triple fármaco) en cada dilución, lo que dio como resultado 7 condiciones de combinación por tratamiento. Además, los controles negativos (DMSO = «vehículo») y los controles positivos (estaurosporina = destrucción de células, series de dilución 1:2 de 7 puntos para un intervalo de dosis de 16 nM - 1<j>M) se transfirieron como controles de tratamiento, y los compuestos sin eficacia en las líneas celulares evaluadas se utilizaron en combinaciones con el COMPUESTO A y el COMPUESTO B como controles de combinación (combinaciones que no exceden la eficacia del agente individual más eficaz = combinaciones «que no interactúan»). Después de la adición del compuesto, se añadieron 50 nL de reactivo de detección verde para Caspasa-3/7 CellEvent 2 mM (ThermoFisher, número de catálogo C10423) a una de las tres réplicas utilizando el dispensador digital HP D300 (Tecan). La inducción de la Caspasa 3/7 se midió como un indicador de la apoptosis inducida por los tratamientos. Las células se trataron durante de 72 h a 96 h dependiendo de su tiempo de duplicación (Tabla 6), y la activación de la Caspasa 3/7 se midió cada 24 h por microscopía utilizando un analizador InCell 2000 (GE Healthcare) dotado de un objetivo 4X y filtros de excitación/emisión de FITC. Al final del tratamiento, las células se prepararon para el recuento celular por microscopía. Las células se fijaron y se permeabilizaron durante 45 minutos en PFA al 4 % (Electron Microscopy Sciences, número de catálogo 15714), TX-100 al 0,12 % (Electron Microscopy Sciences, número de catálogo 22140) en PBS (Boston Bioproducts, número de catálogo BM-220). Después de lavar las células tres veces con PBS, su ADN se tiñó durante 30 minutos con Hoechst 33342 (ThermoFisher, número de catálogo H3570) con una concentración final de 4 |jg/mL. Las células se lavaron tres veces con PBS y a continuación las placas se sellaron con calentamiento utilizando un PlateLoc (Agilent Technologies) con sellos de aluminio (Agilent Technologies, número de catálogo 06644-001) y se almacenaron a 4 °C hasta la obtención de imágenes. Todas las células por pocillo/tratamiento fueron capturadas en una sola imagen por microscopía de fluorescencia utilizando un analizador InCell 2000 (GE Healthcare) dotado de un objetivo 4X y filtros de excitación/emisión de DAPI.
Las imágenes se analizaron después de adaptar los métodos descritos anteriormente (Horn, Sandmannet al.2011) y utilizando el paquete Bioconductor EBImage en R (Pau, Fuchset al.2010). Los objetos en ambos canales, DAPI (para Hoechst/ADN) y FITC (para Caspasa 3/7), se segmentaron por separado mediante un umbral adaptativo y se contaron. Se definió manualmente un umbral para los objetos positivos de Caspasa 3/7 por línea celular después de comparar controles negativos (DMSO) y controles positivos (estaurosporina). Al analizar 17 características adicionales de objeto/núcleo en el canal de ADN (características de forma e intensidad) se identificaron residuos/núcleos fragmentados. Con este fin por línea celular, las distribuciones de las características adicionales entre controles positivos (estaurosporina) y controles negativos (DMSO) se compararon manualmente. Las características que podían distinguir entre las condiciones (p. ej., un cambio en la distribución de una medición de características que compara DMSO con estaurosporina) se utilizaron para definir la población de «residuos» frente a la población de núcleos «viables». Los recuentos de residuos se restaron de los recuentos de núcleos en bruto. El número de núcleos resultante se utilizó como medida de la proliferación celular («recuento celular»).
El efecto del compuesto sobre la proliferación celular se calculó a partir de los recuentos celulares de los tratamientos en relación con los recuentos celulares del control negativo (DMSO), en la Figura 11 denominado «Recuento celular normalizado» (= «xnorm») en el eje de las y. Las combinaciones sinérgicas se identificaron utilizando el modelo de agente individual más alto (HSA) como hipótesis nula (Berenbaum 1989). El exceso respecto al modelo HSA predice una conexión funcional entre las dianas inhibidas (Lehar, Zimmermannet al.2007, Lehar, Kruegeret al.2009). Los datos de entrada del modelo fueron valores de inhibición por dosis de fármaco:
1 = 1 - xnorm
I: inhibición
xnorm: recuento celular normalizado (mediana de tres repeticiones)
En cada punto de dosis del tratamiento combinado, se calculó la diferencia entre la inhibición de la combinación y la inhibición del más potente de los dos agentes individuales (= residuales del modelo). De manera similar, para evaluar la sinergia de las combinaciones triples en cada punto de dosis, se calculó la diferencia entre la inhibición del triple fármaco y la inhibición del par de fármacos más potente. Para favorecer los efectos de la combinación en una inhibición alta, los residuales se ponderaron con la inhibición observada en el mismo punto de dosis. La puntuación general de la combinación C para una combinación farmacológica es la suma de los residuales ponderados para todas las concentraciones:
C =“ C«IH( ldat0* (Lo- môdelo ))
Idato: inhibición medida
Imodelo: inhibición de acuerdo con la hipótesis nula de HSA
Se calcularon puntuaciones robustas z de la combinación (zC) como la relación de las puntuaciones de la combinación de los tratamientos C y la desviación absoluta mediana (dam) de combinaciones que no interactúan:
Ccero: puntuaciones de la combinación para combinaciones que no interactúan
Zc es un indicador de la potencia de la combinación en donde:
zc > 3: sinergia
3 > zc > 2: sinergia débil
zc < 2: sin sinergia
La CI50 es la concentración del compuesto que da como resultado un 50 % de los recuentos celulares respecto al DMSO. Los cálculos de CI50 (véase la Tabla 7) se realizaron utilizando el paquete DRC en R (Ritz y Streibig 2005) y ajustando una función log-logística de cuatro parámetros a los datos.
El efecto del compuesto sobre la apoptosis se determinó calculando el porcentaje de células con Caspasa 3/7 activada por tratamiento y punto de evaluación respecto a los recuentos celulares en bruto (antes de la sustracción de los residuos) (eje de las y en la Figura 12). Los recuentos celulares en puntos de evaluación que no se midieron experimentalmente se obtuvieron mediante análisis de regresión ajustando un modelo lineal para recuentos celulares transformados logarítmicamente en el día 0 y al final del tratamiento (suponiendo un crecimiento celular exponencial).
Célula CI50 para el COMPUESTO A CI50 para el COMPUESTO B CI50 para el COMPUESTO C Puntuación z de la sinergia (zc)
LoVo 0,6 0,007 0,7 2,9
LS-180 0,7 0,018 >10 1,8
GP2d 0,8 >0,3 8,9 0,8
RKO 1,2 0,021 >10 *1,3
HCT-116 0,1 0,038 >10 -1,8
Tabla 7. Valores de CI50 de los agentes individuales para cada compuesto y mediciones de las puntuaciones
z de la sinergia para la combinación del COMPUESTO A, COMPUESTO B y COMPUESTO C.
RESULTADOS
En este informe, se evaluaron las eficacias de un inhibidor de MDM2 (COMPUESTO A), un inhibidor de MEK (trametinib, COMPUESTO B) y un inhibidor de EGFR (erlotinib, COMPUESTO C) de forma individual y combinada en un total de 5 líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural. Cuatro de las líneas tenían KRAS mutado (GP2d, LS-180, HCT-116, LoVo), una línea tenía BRAF mutado (RKO) (Tabla 6). El COMPUESTO A como agente individual inhibió el crecimiento de las líneas celulares con valores de CI50 del orden submicromolar a micromolar. El COMPUESTO B como agente individual inhibió el crecimiento de todas las líneas celulares excepto una (GP2d) con valores de CI50 del orden nanomolar, mientras que el COMPUESTO C no mostró ninguna eficacia como agente individual en 4/5 líneas y presentó un valor de CI50 del orden micromolar en LoVo con KRAS mutado (Figura 11 y Tabla 7). La combinación triple (A+B+C) provocó una inhibición sinérgica débil (de acuerdo con el modelo HSA) en comparación con los pares de fármacos en el modelo LoVo con KRAS mutado (Tabla 7). En esta línea celular, la combinación triple mostró una apoptosis más potente (evaluada midiendo la inducción de la Caspasa 3/7) en comparación con las combinaciones por pares (Figura 12).
CONCLUSIONES
La inhibición combinada de MDM2, MEK y EGFR en CCR con TP53 de origen natural puede proporcionar una modalidad terapéutica eficaz capaz de mejorar las respuestas en comparación con cada uno de los agentes individuales y conducir a respuestas más duraderas en el centro de salud.
Ejemplo de referencia 4: Efecto in vitro sobre la proliferación de combinar un inhibidor de PI3K y un inhibidor de MDM2 con un inhibidor de Bcl2.
Este estudio fue diseñado para explorar el efectoin vitrosobre la proliferación de combinar el inhibidor de PIK3CA 2-amida y 1 -({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1, 1 -dimetiletil)piridin-4-il]tiazol-2-il}amida del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico (COMPUESTO A) y el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO B) con el inhibidor de BCL-2/-XL navitoclax (ABT-263) (COMPUESTO C) en líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural.
MÉTODOS
Los COMPUESTOS A, B y C se disolvieron en DMSO al 100% (Sigma, número de catálogo D2650) con concentraciones de 20 mM y se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Los compuestos se distribuyeron en placas maestras de fármacos (Greiner, número de catálogo 788876) y se diluyeron en serie con un factor de 3 (7 pasos) con una concentración de 2000X.
Las líneas celulares de cáncer colorrectal utilizadas para este estudio se obtuvieron, cultivaron y procesaron a partir de los proveedores comerciales ATCC y ECACC (Tabla 8). Todos los medios de la línea celular se complementaron con FBS al 10 % (HyClone, número de catálogo SH30071.03).
Línea celular Mutaciones oncoinícisdoras Núm. de cat de la fuente | | Medio | | Proveedor del medio Núm. de cat. del medio Tratamiento (h]
HCT-116 KRAS. PIK3CA ATCC CCL-247 McCo/s 5A ATCC 30-2007 500 72
LS-18Q KRAS. PIK3CA ATCC CCL-187 EMEM ATCC 30-2003 800 72
GP2d KRAS, PIK3CA ECACC 95090714 DMEM ATCC 30-2002 900 72
L<0>V<0>KRAS ATCC CCL-229 F-12K ATCC 30-2004 1250 96
RKO BRAF.PIK3CA ATCC CRL-2577 EMEM ATCC 30-2003 500 72
Tabla 8. Información sobre las líneas celulares
Las líneas celulares se cultivaron en una incubadora a 37 °C y con un 5% de CO2 y se expandieron en frascos T-75. En todos los casos, las células se descongelaron a partir de patrones congelados, se expandieron a través de > 1 pasaje utilizando diluciones 1:3, se contaron y se evaluaron para determinar la viabilidad utilizando un contador ViCell (Beckman-Coulter) antes de la colocación en placas. Para dividir y expandir las líneas celulares, las células se desprendieron de los frascos utilizando tripsina-EDTA al 0,25 % (GIBCO, número de catálogo 25200). Se determinó que todas las líneas celulares estaban exentas de contaminación por micoplasma según se determinó mediante una metodología de detección por PCR realizada en Idexx Radii (Columbia, MO, EE. UU.) y se identificaron correctamente mediante la detección de un panel de SNP.
Para evaluar el efecto de la combinación del COMPUESTO A, COMPUESTO B con el COMPUESTO C sobre la proliferación celular, las células se sembraron en microplacas negras de 384 pocillos con fondo transparente (Matrix/Thermo Scientific, número de catálogo 4332) en 50 |<j>L de medio por pocillo con densidades celulares comprendidas entre 500 y 1250 células/pocillo (Tabla 8) y se dejaron incubar a 37 grados, con un 5 % de CO2 durante 24 h. Después de 24 h, se preparó una placa de 384 pocillos por línea celular para el recuento celular mediante microscopía (véase más adelante) sin recibir tratamiento (= «línea de base»). Las otras placas celulares se trataron transfiriendo 25 nL del compuesto 2000X desde las placas maestras del fármaco utilizando un dispensador de líquidos acústico ATS (ECD Biosystems) y dando como resultado una concentración final de 1X. El COMPUESTO A se utilizó en un intervalo de concentración final de 13 nM - 10 j M, el COMPUESTO B se utilizó en un intervalo de concentración final de 13 nM - 10<j>M y el COMPUESTO C se utilizó en un intervalo de concentración final de 13 nM - 10<j>M (7 pasos de dilución 1:3). Con el fin de evaluar el efecto de la combinación triple, todos los COMPUESTOS individuales (A, B, C), las tres combinaciones por pares (A+B, A+C, B+C) y la combinación triple (A+B+C) se evaluaron en el mismo experimento. Las combinaciones por pares y la combinación triple se evaluaron con una relación fija de 1:1 (para pares de fármacos) y 1: 1: 1 (para el triple fármaco) en cada dilución, lo que dio como resultado 7 condiciones de combinación por tratamiento. Además, los controles negativos (DMSO = «vehículo») y los controles positivos (estaurosporina = destrucción de células, series de dilución 1:2 de 7 puntos para un intervalo de dosis de 16 nM - 1<j>M) se transfirieron como controles de tratamiento, y los compuestos sin eficacia en las líneas celulares evaluadas se utilizaron en combinaciones con el COMPUESTO A y el COMPUESTO B como controles de combinación (combinaciones que no exceden la eficacia del agente individual más eficaz = combinaciones «que no interactúan»). Después de la adición del compuesto, se añadieron 50 nL de reactivo de detección verde para Caspasa-3/7 CellEvent 2 mM (ThermoFisher, número de catálogo C10423) a una de las tres réplicas utilizando el dispensador digital HP D300 (Tecan). La inducción de la Caspasa 3/7 se midió como un indicador de la apoptosis inducida por los tratamientos. Las células se trataron durante de 72 h a 96 h dependiendo de su tiempo de duplicación (Tabla 8), y la activación de la Caspasa 3/7 se midió cada 24 h por microscopía utilizando un analizador InCell 2000 (GE Healthcare) dotado de un objetivo 4X y filtros de excitación/emisión de FITC. Al final del tratamiento, las células se prepararon para el recuento celular por microscopía. Las células se fijaron y se permeabilizaron durante 45 minutos en PFA al 4 % (Electron Microscopy Sciences, número de catálogo 15714), TX-100 al 0,12 % (Electron Microscopy Sciences, número de catálogo 22140) en PBS (Boston Bioproducts, número de catálogo BM-220). Después de lavar las células tres veces con PBS, su ADN se tiñó durante 30 minutos con Hoechst 33342 (ThermoFisher, número de catálogo H3570) con una concentración final de 4 jg/mL. Las células se lavaron tres veces con PBS y a continuación las placas se sellaron con calentamiento utilizando un PlateLoc (Agilent Technologies) con sellos de aluminio (Agilent Technologies, número de catálogo 06644-001) y se almacenaron a 4 °C hasta la obtención de imágenes. Todas las células por pocillo/tratamiento fueron capturadas en una sola imagen por microscopía de fluorescencia utilizando un analizador InCell 2000 (GE Healthcare) dotado de un objetivo 4X y filtros de excitación/emisión de DAPI.
Las imágenes se analizaron después de adaptar los métodos descritos anteriormente (Horn, Sandmannet al.2011) y utilizando el paquete Bioconductor EBImage en R (Pau, Fuchset al.2010). Los objetos en ambos canales, DAPI (para Hoechst/ADN) y FITC (para Caspasa 3/7), se segmentaron por separado mediante un umbral adaptativo y se contaron. Se definió manualmente un umbral para los objetos positivos de Caspasa 3/7 por línea celular después de comparar controles negativos (DMSO) y controles positivos (estaurosporina). Al analizar 17 características adicionales de objeto/núcleo en el canal de ADN (características de forma e intensidad) se identificaron residuos/núcleos fragmentados. Con este fin por línea celular, las distribuciones de las características adicionales entre controles positivos (estaurosporina) y controles negativos (DMSO) se compararon manualmente. Las características que podían distinguir entre las condiciones (p. ej., un cambio en la distribución de una medición de características que compara DMSO con estaurosporina) se utilizaron para definir la población de «residuos» frente a la población de núcleos «viables». Los recuentos de residuos se restaron de los recuentos de núcleos en bruto. El número de núcleos resultante se utilizó como medida de la proliferación celular («recuento celular»).
El efecto del compuesto sobre la proliferación celular se calculó a partir de los recuentos celulares de los tratamientos en relación con los recuentos celulares del control negativo (DMSO), en la Figura 13 denominado «Recuento celular normalizado» (= «xnorm») en el eje de las y. Las combinaciones sinérgicas se identificaron utilizando el modelo de agente individual más alto (HSA) como hipótesis nula (Berenbaum 1989). El exceso respecto al modelo HSA predice una conexión funcional entre las dianas inhibidas (Lehar, Zimmermannet al.2007, Lehar, Kruegeret al.2009). Los datos de entrada del modelo fueron valores de inhibición por dosis de fármaco:
1 = 1 - xnorm
I: inhibición
xnorm: recuento celular normalizado (mediana de tres repeticiones)
En cada punto de dosis del tratamiento combinado, se calculó la diferencia entre la inhibición de la combinación y la inhibición del más potente de los dos agentes individuales (= residuales del modelo). De manera similar, para evaluar la sinergia de las combinaciones triples en cada punto de dosis, se calculó la diferencia entre la inhibición del triple fármaco y la inhibición del par de fármacos más potente. Para favorecer los efectos de la combinación en una inhibición alta, los residuales se ponderaron con la inhibición observada en el mismo punto de dosis. La puntuación general de la combinación C para una combinación farmacológica es la suma de los residuales ponderados para todas las concentraciones:
C E c<OIU'>(<dâto ( dâto ^modelo ) )>
Idato: inhibición medida
Imodelo: inhibición de acuerdo con la hipótesis nula de HSA
Se calcularon puntuaciones robustas z de la combinación (zC) como la relación de las puntuaciones de la combinación de los tratamientos C y la desviación absoluta mediana (dam) de combinaciones que no interactúan:
Ccero: puntuaciones de la combinación para combinaciones que no interactúan
zc es un indicador de la potencia de la combinación en donde:
zc > 3: sinergia
3 > zc > 2: sinergia débil
zc < 2: sin sinergia
La CI50 es la concentración del compuesto que da como resultado un 50 % de los recuentos celulares respecto al DMSO. Los cálculos de CI50 (véase la Tabla 9) se realizaron utilizando el paquete DRC en R (Ritz y Streibig 2005) y ajustando una función log-logística de cuatro parámetros a los datos.
El efecto del compuesto sobre la apoptosis se determinó calculando el porcentaje de células con Caspasa 3/7 activada por tratamiento y punto de evaluación respecto a los recuentos celulares en bruto (antes de la sustracción de los residuos) (eje de las y en la Figura 14). Los recuentos celulares en puntos de evaluación que no se midieron experimentalmente se obtuvieron mediante análisis de regresión ajustando un modelo lineal para recuentos celulares transformados logarítmicamente en el día 0 y al final del tratamiento (suponiendo un crecimiento celular exponencial).
CélulaC I50 p ara e l C O M P U E S T O A C I50 p a ra e l C O M P U E S T O B C I50 p ara e l C O M P U E S T O C Puntuación z d e la s inergia ( z j
GP2d 0,5 0,8 >10 7,4
HCT-116 9,8 0,1 >10 4,4
LoVo >10 0,6 >10 1,9
RKO 3,9 1,2 >10 1,8
LS-180 >10 0,7 >10 1,5
Tabla 9. Valores de CI50 de los agentes Individuales para cada compuesto y mediciones de las puntuaciones z
de la sinergia para la combinación del COMPUESTO A, COMPUESTO B y COMPUESTO C.
RESULTADOS
En este informe, se evaluaron las eficacias de un inhibidor de PIK3CA (BYL719, COMPUESTO A), un inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-dorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-cidohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO B) y un inhibidor de BCL-2/-XL (ABT-263, COMPUESTO C) de forma individual y combinada en un total de 5 líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural. Cuatro de las líneas tenían KRAS mutado (GP2d, LS-180, HCT-116, LoVo), una línea tenía BRAF mutado (RKO). El COMPUESTO A como agente individual inhibió el crecimiento de 2 de las líneas celulares con valores de IC50 del orden micromolar y fue activo solo con la dosis más alta (10 uM) en las otras 3 líneas (Figura 13 y Tabla 9). El COMPUESTO B como agente individual inhibió el crecimiento de las líneas celulares con valores de CI50 del orden submicromolar a micromolar, mientras que el COMPUESTO C no mostró ninguna eficacia como agente individual (Figura 13 y Tabla 9). La combinación triple (A+B+C) provocó una inhibición sinérgica (de acuerdo con el modelo HSA) en comparación con los pares de fármacos en 2/5 modelos celulares evaluados (Tabla 9). En cuatro de las líneas (HCT-116, LoVo, RKO, LS-180), la combinación triple mostró una apoptosis más potente (evaluada midiendo la inducción de la Caspasa 3/7) en comparación con las combinaciones por pares (Figura 14).
CONCLUSIONES
De forma colectiva, la inhibición combinada de PIK3CA, MDM2 y BCL-2/-XL en CCR con TP53 de origen natural puede proporcionar una modalidad terapéutica eficaz capaz de mejorar las respuestas en comparación con cada uno de los agentes individuales y conducir a respuestas más duraderas en el centro de salud.
Ejemplo de referencia 5: Efectoin vitrosobre la proliferación de combinar un inhibidor de MDM2 y un inhibidor de Bcl2.
Este estudio fue diseñado para explorar el efectoin vitrosobre la proliferación de combinar el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO A) y el inhibidor de BCL-2/-XL navitoclax (ABT-263) (COMPUESTO B) en líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural.
MÉTODOS
Los COMPUESTOS A y B se disolvieron en DMSO al 100 % (Sigma, número de catálogo D2650) con concentraciones de 20 mM y se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Los compuestos se distribuyeron en placas maestras de fármacos (Greiner, número de catálogo 788876) y se diluyeron en serie con un factor de 3 (7 pasos) con una concentración de 2000X.
Las líneas celulares de cáncer colorrectal utilizadas para este estudio se obtuvieron, cultivaron y procesaron a partir de los proveedores comerciales ATCC y ECACC (Tabla 10). Todos los medios de la línea celular se complementaron con FBS al 10 % (HyClone, número de catálogo SH30071.03).
<Línea celular>I<Mutaciones oncomiciadorai>Í1 Fuerte<Núm. de cat. de la foente Proveedor del medio Núm. de cat. del medio N.o de Tratamiento [h]>
HCT-116 KRAS, PIK3CA ATCC CCL-247 McCo/s 5A ATCC 30-2007 500 72
LS-180 KRAS. PIK3CA ATCC CCL-187 EMEM ATCC 30-2003 800 72
GP2d KRAS. PIK3CA ECACC 95090714 DMEM ATCC 30-2002 900 72
LoVo KRAS ATCC CCL-229 F-12K ATCC 30-2004 1250 96
RKO BRAF.PIK3CA ATCC CRL-2577 EMEM ATCC 30-2003 500 72
Tabla 10. Información sobre las líneas celulares
Las líneas celulares se cultivaron en una incubadora a 37 °C y con un 5% de CO2 y se expandieron en frascos T-75. En todos los casos, las células se descongelaron a partir de patrones congelados, se expandieron a través de > 1 pasaje utilizando diluciones 1:3, se contaron y se evaluaron para determinar la viabilidad utilizando un contador ViCell (Beckman-Coulter) antes de la colocación en placas. Para dividir y expandir las líneas celulares, las células se desprendieron de los frascos utilizando tripsina-EDTA al 0,25 % (GIBCO, número de catálogo 25200). Se determinó que todas las líneas celulares estaban exentas de contaminación por micoplasma según se determinó mediante una metodología de detección por PCR realizada en Idexx Radii (Columbia, MO, EE. UU.) y se identificaron correctamente mediante la detección de un panel de SNP.
Para evaluar el efecto de la combinación del COMPUESTO A y el COMPUESTO B sobre la proliferación celular, las células se sembraron en microplacas negras de 384 pocillos con fondo transparente (Matrix/Thermo Scientific, número de catálogo 4332) en 50 |jL de medio por pocillo con densidades celulares comprendidas entre 500 y 1250 células/pocillo (Tabla 10) y se dejaron incubar a 37 grados, con un 5 % de CO2 durante 24 h. Después de 24 h, se preparó una placa de 384 pocillos por línea celular para el recuento celular mediante microscopía (véase más adelante) sin recibir tratamiento (= «línea de base»). Las otras placas celulares se trataron transfiriendo 25 nL del compuesto 2000X desde las placas maestras del fármaco utilizando un dispensador de líquidos acústico ATS (ECD Biosystems) y dando como resultado una concentración final de 1X. El COMPUESTO A se utilizó en un intervalo de concentración final de 13 nM - 10 j M y el COMPUESTO B se utilizó en un intervalo de concentración final de 13 nM - 10 j M (7 pasos de dilución 1:3). Para la combinación del COMPUESTO A con el COMPUESTO B, los agentes individuales se combinaron en una proporción fija de 1:1 en cada dilución, dando como resultado 7 tratamientos combinados. Además, los controles negativos (DMSO = «vehículo») y los controles positivos (estaurosporina = destrucción de células, series de dilución 1:2 de 7 puntos para un intervalo de dosis de 16 nM - 1<j>M) se transfirieron como controles de tratamiento, y los compuestos sin eficacia en las líneas celulares evaluadas se utilizaron en combinaciones con el COMPUESTO A y el COMPUESTO B como controles de combinación (combinaciones que no exceden la eficacia del agente individual más eficaz = combinaciones «que no interactúan»). Después de la adición del compuesto, se añadieron 50 nL de reactivo de detección verde para Caspasa-3/7 CellEvent 2 mM (ThermoFisher, número de catálogo C10423) a una de las tres réplicas utilizando el dispensador digital HP D300 (Tecan). La inducción de la Caspasa 3/7 se midió como un indicador de la apoptosis inducida por los tratamientos. Las células se trataron durante de 72 h a 96 h dependiendo de su tiempo de duplicación (Tabla 10), y la activación de la Caspasa 3/7 se midió cada 24 h por microscopía utilizando un analizador InCell 2000 (GE Healthcare) dotado de un objetivo 4X y filtros de excitación/emisión de FITC. Al final del tratamiento, las células se prepararon para el recuento celular por microscopía. Las células se fijaron y se permeabilizaron durante 45 minutos en PFA al 4 % (Electron Microscopy Sciences, número de catálogo 15714), TX-100 al 0,12 % (Electron Microscopy Sciences, número de catálogo 22140) en PBS (Boston Bioproducts, número de catálogo BM-220). Después de lavar las células tres veces con PBS, su ADN se tiñó durante 30 minutos con Hoechst 33342 (ThermoFisher, número de catálogo H3570) con una concentración final de 4 jg/mL. Las células se lavaron tres veces con PBS y a continuación las placas se sellaron con calentamiento utilizando un PlateLoc (Agilent Technologies) con sellos de aluminio (Agilent Technologies, número de catálogo 06644 001) y se almacenaron a 4 °C hasta la obtención de imágenes. Todas las células por pocillo/tratamiento fueron capturadas en una sola imagen por microscopía de fluorescencia utilizando un analizador InCell 2000 (GE Healthcare) dotado de un objetivo 4X y filtros de excitación/emisión de DAPI.
Las imágenes se analizaron después de adaptar los métodos descritos anteriormente (Horn, Sandmannet al.2011) y utilizando el paquete Bioconductor EBImage en R (Pau, Fuchset al.2010). Los objetos en ambos canales, DAPI (para Hoechst/ADN) y FITC (para Caspasa 3/7), se segmentaron por separado mediante un umbral adaptativo y se contaron. Se definió manualmente un umbral para los objetos positivos de Caspasa 3/7 por línea celular después de comparar controles negativos (DMSO) y controles positivos (estaurosporina). Al analizar 17 características adicionales de objeto/núcleo en el canal de ADN (características de forma e intensidad) se identificaron residuos/núcleos fragmentados. Con este fin por línea celular, las distribuciones de las características adicionales entre controles positivos (estaurosporina) y controles negativos (DMSO) se compararon manualmente. Las características que podían distinguir entre las condiciones (p. ej., un cambio en la distribución de una medición de características que compara DMSO con estaurosporina) se utilizaron para definir la población de «residuos» frente a la población de núcleos «viables». Los recuentos de residuos se restaron de los recuentos de núcleos en bruto. El número de núcleos resultante se utilizó como medida de la proliferación celular («recuento celular»).
El efecto del compuesto sobre la proliferación celular se calculó a partir de los recuentos celulares de los tratamientos en relación con los recuentos celulares del control negativo (DMSO), en la Figura 15 denominado «Recuento celular normalizado» (= «xnorm») en el eje de las y. Las combinaciones sinérgicas se identificaron utilizando el modelo de agente individual más alto (HSA) como hipótesis nula (Berenbaum 1989). El exceso respecto al modelo HSA predice una conexión funcional entre las dianas inhibidas (Lehar, Zimmermannet al.2007, Lehar, Kruegeret al.2009). Los datos de entrada del modelo fueron valores de inhibición por dosis de fármaco:
1=1- xnorm
I: inhibición
xnorm: recuento celular normalizado (mediana de tres repeticiones)
En cada punto de dosis del tratamiento combinado, se calculó la diferencia entre la inhibición de la combinación y la inhibición del más potente de los dos agentes individuales (= residuales del modelo). Para favorecer los efectos de la combinación en una inhibición alta, los residuales se ponderaron con la inhibición observada en el mismo punto de dosis. La puntuación general de la combinación C para una combinación farmacológica es la suma de los residuales ponderados para todas las concentraciones:
c = Sconc ( 'dato* Odato- môdelo))
Idato: inhibición medida
Imodelo: inhibición de acuerdo con la hipótesis nula de HSA
Se calcularon puntuaciones robustas z de la combinación (zC) como la relación de las puntuaciones de la combinación de los tratamientos C y la desviación absoluta mediana (dam) de combinaciones que no interactúan:
Ccero: puntuaciones de la combinación para combinaciones que no interactúan
Zc es un indicador de la potencia de la combinación en donde:
zc > 3: sinergia
3 > zc > 2: sinergia débil
zc < 2: sin sinergia
La CI50 es la concentración del compuesto que da como resultado un 50 % de los recuentos celulares respecto al DMSO. Los cálculos de CI50 (véase la Tabla 11) se realizaron utilizando el paquete DRC en R (Ritz y Streibig 2005) y ajustando una función log-logística de cuatro parámetros a los datos.
El efecto del compuesto sobre la apoptosis se determinó calculando el porcentaje de células con Caspasa 3/7 activada por tratamiento y punto de evaluación respecto a los recuentos celulares en bruto (antes de la sustracción de los residuos) (eje de las y en la Figura 16). Los recuentos celulares en puntos de evaluación que no se midieron experimentalmente se obtuvieron mediante análisis de regresión ajustando un modelo lineal para recuentos celulares transformados logarítmicamente en el día 0 y al final del tratamiento (suponiendo un crecimiento celular exponencial).
Célula CI50 para el COMPUESTO A CI50 para el COMPUESTO B Puntuación z de la sinergia (zc)
GP2d 0,8 >10 14,6
HCT-116 0,1 >10 6,4
LoVo 0,6 >10 3,8
LS-180 0,7 >10 2,3
RKO 1,2 >10 1,6
Tabla 11. Valores de CI50 de los agentes individuales para cada compuesto y mediciones de
las puntuaciones z de la sinergia para la combinación del COMPUESTO A y COMPUESTO B.
RESULTADOS
En este informe, se evaluaron las eficacias de un inhibidor de MDM2 (COMPUESTO A) y un inhibidor de BCL-2/-XL (COMPUESTO B) de forma individual y combinada en un total de 5 líneas celulares de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural. Cuatro de las líneas tenían KRAS mutado (GP2d, LS-180, HCT-116, LoVo), una línea tenía BRAF mutado (RKO) y cuatro de las líneas también tenían PIK3CA mutado (GP2d, RKO, LS-180, HCT-116) (Tabla 10). El COMPUESTO A como agente individual inhibió el crecimiento de todas las líneas celulares con valores de CI50 del orden submicromolar a micromolar (Figura 15 y Tabla 11). El COMPUESTO B no mostró ninguna eficacia como agente individual (Figura 15 y Tabla 11). El tratamiento combinado provocó una inhibición sinérgica (de acuerdo con el modelo HSA) en 3/15 modelos celulares y una inhibición sinérgica débil en 1 modelo más (Tabla 11). La combinación también mostró una inducción de la apoptosis más potente (evaluada midiendo la inducción de la Caspasa 3/7) en comparación con los agentes individuales (Figura 16), observándose las inducciones más potentes en GP2d, HCT-116 y LoVo.
CONCLUSIONES
La inhibición combinada de MDM2 y BCL-2/-XL en cáncer colorrectal con TP53 de origen natural, KRAS y BRAF mutados puede proporcionar una modalidad terapéutica eficaz capaz de mejorar las respuestas en comparación con cada uno de los agentes individuales y conducir a respuestas más duraderas en el centro de salud.
Ejemplo de referencia 6: Efecto in vitro sobre la proliferación de combinar un inhibidor de MDM2 y un inhibidor de MEK y un inhibidor de Bcl2.
De manera similar a la descrita en los ejemplos previos, se evaluó una combinación triple de (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona, trametinib y RAF265 en 4 modelos con KRAS mutado (HCT-116, GP2d, LoVo y LS-180). La combinación mostró sinergia en 2/4 modelos (HCT-116, GP2d, con puntuaciones z de la combinación de 9,2 y 5,5, respectivamente) y mostró una sinergia débil en 1/4 (LoVo, con una puntuación z de la combinación de 2,8). No se observó sinergia en el modelo LS-180 (puntuación z de la combinación de 0,2). Además, la combinación triple mostró una inducción de la apoptosis más potente en comparación con los pares de fármacos (evaluada midiendo la activación de la Caspasa 3/7) en los modelos Gp2D y LoVo (en GP2d un máximo de un 67 % de apoptosis, en LoVo un 83 %). Los niveles observados de apoptosis provocados por la combinación triple en HCT-116 y LS-180 fueron de un 49 % y un 15 %, respectivamente.
Ejemplo de referencia 7: Efecto in vitro sobre la proliferación de combinar un inhibidor de MDM2 y un inhibidor de MEK y un inhibidor de BRAF.
De manera similar a la descrita en los ejemplos previos, se evaluó una combinación triple de (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona, trametinib y dabrafenib en 1 modelo con BRAF mutado (RKO). Se observó que la combinación triple era sinérgica (puntuación z de la combinación de 3,5) y esta mostró una inducción de la apoptosis más potente (pero en general débil, con un máximo de un 11 %) en comparación con los pares de fármacos (evaluada midiendo la activación de la Caspasa 3/7).
Ejemplo de referencia 8: Efecto in vitro sobre la proliferación de combinar un inhibidor de MDM2 y un inhibidor de BRAF y un inhibidor de Bcl2, opcionalmente junto con un inhibidor de PI3K o un inhibidor de cMET.
De manera similar a la descrita en los ejemplos previos, se evaluó una combinación triple de (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona, RAF265 y navitoclax (ABT-263) en 4 modelos con KRAS mutado (HCT-116, GP2d, LoVo y LS-180). La combinación mostró sinergia en 1/4 modelos (GP2d, puntuación z de la combinación de 5) y mostró una inducción de la apoptosis más potente en comparación con los pares de fármacos (evaluada midiendo la activación de la Caspasa 3/7) en los 4 modelos evaluados (en GP2d y LoVo un máximo de un 100 % de apoptosis, en HCT-116 un 64 % y en LS-180 un 32 %). No se observó ninguna sinergia en HCT-116, LS-180 ni LoVo (puntuaciones z de la combinación de 1,3, 1,2 y 0,5, respectivamente).
En la misma categoría, se evaluó una combinación triple de (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona, dabrafenib y navitoclax (ABT-263) en 1 modelo con BRAF mutado (RKO). Se observó que la combinación triple era sinérgica (puntuación z de la combinación de 3) y esta mostró una inducción de la apoptosis potente (máximo de un 100 %), mientras que todos los pares mostraron una inducción de la apoptosis de tan solo débil a nula (evaluada midiendo la activación de la Caspasa 3/7).
Además, se evaluaron dos combinaciones cuádruples que comprendían el inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxo-piperazin-1-il)-trans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona, el inhibidor de BRAF dabrafenib y el inhibidor de BCl navitoclax (ABT-263). La primera fue con el inhibidor de PI3K 2-amida y 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetiletil)piridin-4-il]tiazol-2-il}amida del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico y se observó que era débilmente sinérgica en 1 línea celular con 1 BRAF mutado (RKO, puntuación z de la combinación de 2) y que inducía la apoptosis de forma potente (máximo de un 79 %). La segunda incluía el inhibidor de cMET PF-04217903 (Pfizer). Una vez evaluada, se observó que era débilmente sinérgica en comparación con las combinaciones triples en 1 línea celular con 1 BRAF mutado (RKO, puntuación z de la combinación de 4,4) y que inducía la apoptosis de forma potente (máximo de un 77 %).
Ejemplo de referencia 9: Efecto in vitro sobre la proliferación de combinar un inhibidor de MDM2 y un inhibidor de MEK y un inhibidor de CDK4/6 o paclitaxel
La adición de un inhibidor de CDK4/6 (concretamente, 7-ciclopentil-N,N-dimetil-2-((5-(piperazin-1-il)piridin-2-il)amino)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida) a una combinación de (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxo-piperazin-1-il)-trans-cidohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona y trametinib condujo a un efecto sinérgico en 2/5 modelos evaluados (HCT-116, LoVo; puntuaciones z de 5,1, 3,3, respectivamente) y actuó de forma débilmente sinérgica en 2/5 modelos (LS-180, RKO; puntuaciones z de 2, 2,8, respectivamente). No se observó ninguna sinergia en GP2d (puntuación z de 1,7). No se observó inducción de la apoptosis.
La adición de paclitaxel (tratamiento asistencial habitual) a la combinación condujo a un efecto sinérgico en 1/5 modelos evaluados (GP2d, puntuación z de 4,3) y un efecto sinérgico débil en 3/5 modelos evaluados (HCT-116, LoVo, LS-180; puntuaciones z de 2,4, 2 y 2,4, respectivamente). No se observó ninguna sinergia en RKO (puntuación z de 1,1). Además, la combinación indujo apoptosis de forma potente (GP2d: 100 %, HCT-116: 59 %, LoVo: 61 %, LS-180: 20 % y RKO 65 %).
Ejemplo de referencia 10: Efecto in vivo sobre la proliferación de combinar un inhibidor de MDM2 con un inhibidor de MEK y un inhibidor de BCL-2/-XL en un modelo de cáncer colorrectal con TP53 de origen natural
Generación de ratones con tumores y tratamiento
Todos los experimentos con animales se realizaron cumpliendo estrictamente con la ley suiza para la protección de animales. Se adquirieron ratones Crl:NU(NCr)-Foxnlnu hembra en Charles River Laboratories International Inc (Alemania) y se mantuvieron en un entorno sometido a control patogénico. Se indujeron tumores subcutáneos de HCT-116 (con KRAS mutado, PIK3CA mutado, p53 de origen natural) concentrando 3 millones de células en 100 |jL de PBS e inyectándolas en el flanco derecho de ratones atímicos. Los ratones se agruparon al azar y el tratamiento se inició cuando el tamaño del tumor alcanzó de 50 a 250 mm3. Cada cohorte incluyó 8 ratones. Los tamaños de los tumores se monitorizaron tres veces a la semana y los volúmenes se calcularon con la siguiente fórmula: (mm3) = longitud x anchura2 x 0,5.
El inhibidor de MDM2 (S)-1-(4-clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-transciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (COMPUESTO A), el inhibidor de MEK trametinib (COMPUESTO B) y el inhibidor de BCL-2/-XL ABT-263 (COMPUESTO C) en forma de polvo se almacenaron a 4 °C. El COMPUESTO A se disolvió en hidroxipropilcelulosa al 0,5 %, el Compuesto B se disolvió en carboximetilcelulosa al 1 % que contenía Tween-80 al 0,5 % en agua destilada (pH 7,6-8,0) y el COMPUESTO C se disolvió en el preconcentrado 5 en forma de microemulsión. Todos los fármacos se suministraron por vía oral utilizando 5-10 mL/kg. El COMPUESTO A se administró tres veces a la semana(3qw)con una dosis de 100 mg/kg. El COMPUESTO B y el COMPUESTO C se administraron a diario (cada 24 h) con una dosis de 0,3 y 100 mg/kg, respectivamente. La pauta posológica combinada y su dosificación fueron las mismas que para los reactivos individuales.
Se evaluaron seis cohortes de tratamiento (G1-G6):
• G1: vehículo (DMSO)
• G2: COMPUESTO C
• G3: COMPUESTO A => después de 9 días de tratamiento, se añadió el COMPUESTO C
• G4: COMPUESTO B => después de 9 días de tratamiento, se añadió el COMPUESTO C
• G5: COMPUESTO A COMPUESTO B => después de 9 días de tratamiento, se añadió el COMPUESTO C
• G6: COMPUESTO A COMPUESTO B COMPUESTO C
Análisis estadístico
Para cada tumor en cada punto de evaluación, el tamaño se normalizó respecto al tamaño antes del inicio del tratamiento para obtener el «% de cambio del volumen tumoral» (Figura 17-18, eje de las y). Para la Figura 17, en cada punto de evaluación se calculó el tamaño medio de todos los tumores por cohorte y el error del tamaño utilizando el error estándar de la media (EEM). Para la Figura 18, los valores p se calcularon utilizando una prueba t de una cola.
Resultados
En un modelo de xenoinjerto de células HCT-116, el tratamiento combinado del COMPUESTO A y trametinib (G5) fue significativamente mejor (enfermedad estable) en comparación con cada uno de los tratamientos con un agente individual (G3-G4 que mostraron una enfermedad progresiva), y la combinación triple del COMPUESTO A, trametinib y ABT-263 (G6) condujo a una regresión tumoral marcada y tuvo una respuesta significativamente mejor en comparación con G5 (Figura 17 y Figura 18A). La Figura 17 muestra las curvas de supervivencia resumidas, y la Figura 18 muestra gráficas en cascada en el día 9 y el día 19 después del inicio de los tratamientos. La adición secuencial de ABT-263 después de 9 días al agente individual COMPUESTO A no tuvo ningún beneficio adicional, mientras que detuvo la progresión del tumor cuando se añadió al agente individual trametinib. ABT-263 produjo regresiones tumorales marcadas cuando se añadió a la combinación del COMPUESTO A y trametinib, y en el día 19 las respuestas de los tratamientos concomitantes y secuenciales fueron indistinguibles (Figura 18B).
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Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una combinación farmacéutica que comprende el inhibidor de MDM2 (6S)-5-(5-cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-dorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-(propan-2-il)-5,6-dihidropirrolo[3,4-d]imidazol-4(1H)-ona (HDM201), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y el inhibidor de Bcl2 ABT-199, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
2. La combinación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende además un inhibidor de MEK seleccionado del grupo que consiste en trametinib, (2-hidroxietoxi)-amida del ácido 6-(4-bromo-2-fluorofenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico, (S)-5-fluoro-2-(2-fluoro-4-(metiltio)fenilamino)-N-(2-hidroxipropoxi)-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropiridin-3-carboxamida, PD0325901, PD-184352, RDEA119, XL518, AS-701255, AS-701173, AS703026, RDEA436, E6201, RO4987655, RG7167 y RG7420, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
3. La combinación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la combinación comprende además un inhibidor de EGFR, un inhibidor de PI3K, un inhibidor de BRAF, un inhibidor de CDK4/6 o paclitaxel.
4. La combinación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la combinación comprende además un inhibidor de BRAF y opcionalmente comprende además también un inhibidor de cMET.
5. HDM201, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el tratamiento comprende además la administración de ABT-199, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
6. ABT-199, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el tratamiento comprende además la administración de HDM201, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
7. HDM201 para su uso de acuerdo con la reivindicación 5 o ABT-199 para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en un tumor benigno o maligno del pulmón (que incluye cáncer de pulmón microcítico y cáncer de pulmón no microcítico), bronquios, próstata, mama (que incluye cánceres de mama esporádicos y pacientes que padecen la enfermedad de Cowden), páncreas, tracto gastrointestinal, colon, recto, carcinoma de colon, cáncer colorrectal, de tiroides, hígado, vías biliares, conducto biliar intrahepático, hepatocelular, de glándula suprarrenal, estómago, gástrico, glioma, glioblastoma, endometrial, de riñón, pelvis renal, vejiga, útero, cuello uterino, vagina, ovario, mieloma múltiple, esófago, cuello o cabeza, cerebro, cavidad oral y faringe, laringe, intestino delgado, un melanoma, adenoma de colon velloso, un sarcoma, una neoplasia, una neoplasia de carácter epitelial, un carcinoma mamario, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, queratosis actínica, policitemia vera, trombocitemia esencial, una leucemia (que incluye leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica y leucemia mieloide), un linfoma (que incluye linfoma no hodgkiniano y linfoma de Hodgkin), mielofibrosis con metaplasia mieloide, enfermedad de Waldenstroem y adenocarcinoma de Barret.
8. HDM201para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 o ABT-199 para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el cáncer el cáncer es un cáncer colorrectal, liposarcoma, glioblastoma, neuroblastoma, linfoma, leucemia o melanoma.
9. HDM201 para su uso de acuerdo con la reivindicación 8 o ABT-199 para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el cáncer es cáncer colorrectal.
10. HDM201 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 y 7 a 9 o ABT-199 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde el cáncer comprende p53 funcional o TP53 de origen natural.
11. HDM201 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 y 7 a 10 o ABT-199 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en donde el cáncer comprende una o más de entre una mutación de KRAS y/o mutación de BRAF y/o mutación de MEK1 y/o mutación de PIK3CA y/o sobreexpresión de PIK3CA.
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