ES2959342T3 - Derivados del ergosterol y el estigmasterol modificados por cadena lateral como moduladores del receptor hepático X - Google Patents
Derivados del ergosterol y el estigmasterol modificados por cadena lateral como moduladores del receptor hepático X Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a nuevos moduladores del receptor X del hígado (LXR), su uso en diagnóstico y terapia, más particularmente en el tratamiento de enfermedades asociadas con LXR, tales como cáncer, inflamación, enfermedades metabólicas y autoinmunes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Derivados del ergosterol y el estigmasterol modificados por cadena lateral como moduladores del receptor hepático X Sumario de la invención
La presente invención versa sobre moduladores del receptor hepático X (LXR, por sus siglas en inglés), para su uso en terapia, más en particular para su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas con el LXR, como cáncer, inflamación y enfermedades metabólicas y autoinmunitarias.
Antecedentes técnicos
Los oxiesteroles son productos intermedios o finales de 27 carbonos del metabolismo del colesterol, caracterizados estructuralmente por la presencia de funciones oxigenadas como restos hidroxi, ceto, hidroperoxi, epoxi y carboxi. Se producenin vivoa través de procesos tanto enzimáticos como no enzimáticos (autooxidación).12 Las enzimas específicas de la familia del citocromo P450 (CYP, por sus siglas en inglés) oxidan preferentemente la cadena lateral del colesterol (el 7a-hidroxicolesterol (1a), el 24(S)-hidroxicolesterol (2), el 22(R)-hidroxicolesterol (22R-HC,3), y el 24(S),25-epoxicolesterol (4) son ejemplos de oxiesteroles generados por los CYP, véaseinfra),mientras que el doble enlace de anillo de colesterol B representa una diana privilegiada para las reacciones que implican a radicales libres. Por tanto, el 7-cetocolesterol (5), el 7p-hidroxicolesterol (1b), los 5a,6a- y 5p,6p-epoxicolesteroles (6a,b) constituyen los oxiesteroles principales producidos no enzimáticamente (véase infra).12
Una definición más general para la clase de los oxiesteroles no está limitada a productos de oxidación del colesterol, sino que también incluye derivados oxigenados esteroideos que los seres humanos pueden asimilar mediante la dieta, ya sea como constituyentes primarios (esteroles de plantas y mariscos) o como componentes derivados del almacenamiento y la cocción.1
Las últimas dos décadas han puesto de manifiesto un incremento exponencial en el número de estudios en cuanto a los papeles fisiológicos de los oxiesteroles en mamíferos, así como en cuanto a su contribución a la patogenia de diferentes enfermedades.3456 El avance fundamental fue la identificación de un subconjunto específico de oxiesteroles (2-4)78 como ligandos endógenos de los receptores hepáticos X a y p (LXR).9,10111213 Así, dada la acción de los LXR (isoformas a y p) como sensores de colesterol de todo el cuerpo y reguladores clave de la lipogénesis, los oxiesteroles tienen el potencial de asumir un papel clave en la modulación del metabolismo de los lípidos y de la homeostasia de la glucosa.
Los LXR y sus ligandos también pueden suprimir las respuestas inflamatorias, ya sea activando los genes que codifican las proteínas antiinflamatorias o suprimiendo los genes que están bajo el control de factores de transcripción proinflamatorios.414
Sin embargo, las funciones de los oxiesteroles no están limitadas a su unión al LXR,15 sino que interactúan de forma significativa con otras proteínas celulares, dando lugar a diferentes efectos. Ejemplos de proteínas afectadas por los oxiesteroles son: a) proteínas del gen inducido por la insulina (INSIG, por sus siglas en inglés), que regulan la función de la proteína de unión al elemento de respuesta a los esteroles (SREBP, por sus siglas en inglés);16 b) Niemann-Pick C1 (NPC1) y la familia de proteínas de unión a los oxiesteroles (OSBP/ORP, por sus siglas en inglés), implicada en el metabolismo del colesterol;17 y c) la oncoproteína Smoothened (alisada), que interfiere en la señalización Hedgehog (erizo).18
Hasta ahora, la química medicinal de los oxiesteroles se ha centrado fundamentalmente en la identificación de los moduladores del LXR, aunque el número de los derivados naturales y sintéticos del oxiesterol estudiados es solo marginal cuando se compara con el de los ligandos no esteroideos.19,20 La primera serie de ligandos esteroideos sintéticos permitió la identificación del farmacóforo mínimo para el LXRa, es decir, un esterol con un aceptor de enlaces de hidrógeno en C-24.21 El derivado más potente de esta serie, concretamente la dimetilamida 7 del ácido colánico, era un eficaz agonista del LXRa,21 capaz de promover una modulación selectiva de genes (véasein fra)22Se demostró que el 5a,6a-epoxicolesterol (6a), identificado en los alimentos procesados, era un modulador del LXR con actividades dependientes del contexto celular y génico,23 mientras que los dos derivados del 5p-colano —3a,6a,24-trihidroxi-24,24-di(trifluorometil)-5p-colano (ATI-829,8)24 y 3a,6a,24-trihidroxi-22-en-24,24-di(trifluorometil)-5p-colano (ATI-111,9),25 cuyo diseño fue inspirado por la estructura del potente agonista no esteroideo sulfonamida de N-(2,2,2-trifluoroetil)-N-[4-[2,2,2-trifluoro-1-hidroxi-1-(trifluorometil)etil]fenil]benceno (T0901317)26— demostraron tener efectos antiateroscleróticos.24,25 En vista del muy conocido efecto de los fitoesteroles en la reducción del colesterol en sangre,27 y considerando el hecho de que se descubrió que el tratamiento de las células intestinales con estos compuestos aumentaba la expresión de los genes diana de LXR,28 Kanekoet al.29estudiaron la actividad del LXR de una serie de fitoesteroles, incluyendo derivados naturales y semisintéticos. Identificaron el (22E)-ergost-22-eno-1a,3pdiol (YT-32,10)29 como un agonista de LXR potente y no selectivo de isoformas, capaz de inducir selectivamente la expresión de genes transportadores ABC en el intestino. Curiosamente, la administración oral del compuesto10dio lugar a la inhibición de la adsorción de colesterol intestinal sin aumentar los niveles plasmáticos de triglicéridos, a diferencia de lo que se observó con ligandos no esteroideos.19,30
El estudio de fitoesteroles como agonistas de LXR está limitado al mencionado compuesto10,a la hormona vegetal 28-homobrassinolida (11),31 y al 24(S)-saringosterol (12), componente secundario aislado de algas marinas que resultaron actuar como agonista selectivo del LXRp.32
De hecho, la química medicinal de los moduladores de los receptores hepáticos X (LXR) se ha centrado hasta ahora principalmente en los compuestos no esteroideos. A pesar de que se han descubierto algunos componentes dotados con gran potencia, estos están caracterizados por una selectividad génica baja o nula, impidiendo, por tanto, sus aplicaciones clínicas. De hecho, los compuestos no esteroideos T0901317 y GW3965 que tienen las siguientes fórmulas
Inducen efectos lipogénicos al aumentar los niveles de triglicéridos en el hígado y en circulación. Los efectos lipogénicos han impedido un mayor desarrollo clínico de estos compuestos.
Hasta la fecha, pocos moduladores esteroideos documentados de momento han mostrado actividades dependientes del contexto celular y génico. Por lo tanto, existe la necesidad de moduladores del LXR a base de esteroides que estén dotados de mejores propiedades farmacocinéticas y tengan menor toxicidad que los agonistas del LXR de la técnica anterior.
Russ. J. Bioorg. Chem. Vol. 31(5), 475-481, 2005, da a conocer la síntesis del (22R,23R)- y (22S,23S)-22,23-epoxiestigmast-5-eno-3p-ol, pero no se da información alguna en cuanto a la posible actividad de dicho compuesto. El documento documenta generalmente que los oxiesteroles controlan la actividad del LXR y da por sentado que algunos derivados podrían ser más estables y eficaces en la regulación del metabolismo lipídico en el hígado.
Objetos de la invención
Es un objeto de la invención proporcionar compuestos a base de esteroides que sean moduladores del LXR, en particular agonistas, para su uso en terapia.
Es un objeto adicional de la invención proporcionar dichos moduladores del LXR a base de esteroides, especialmente agonistas, para su uso en terapia, especialmente en el tratamiento de enfermedades asociadas con el LXR, como cáncer, inflamación y enfermedades metabólicas y autoinmunitarias.
Es un objeto adicional de la invención proporcionar composiciones farmacéuticas que comprenden dichos moduladores del LXR a base de esteroides para su uso en terapia.
Definiciones
En la presente solicitud se usarán las siguientes abreviaturas (generalmente por sus siglas en inglés):
ABCA1, transportador A1 de casete de unión a ATP;
ARN, ácido ribonucleico;
CYP, citocromo;
DMF, dimetilformamida;
DMSO, dimetilsulfóxido;
FASN, ácido graso sintasa;
FXR, receptor farnesoide X;
hLXR, receptor hepático X humano;
INSIG, gen inducido por la insulina;
LPS, lipopolisacáridos;
LXR, receptor hepático X;
MCP-1, proteína quimioatrayente de monocitos 1;
mCPBA, ácido m-cloroperoxibenzoico;
mpc, cromatografía de presión media;
NPC1, Niemann-Pick C1;
ORP, proteína relacionada con la OSBP;
OSBP, proteína de unión a oxiesteroles;
PCR, reacción en cadena de la polimerasa;
PMA, forbol 12-miristato 13-acetato;
PPAR<y>, receptor activado por proliferadores de peroxisoma de tipo<y>;
PPTS, p-toluenosulfonato de piridinio;
PXR, receptor X de pregnano;
qPCR, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa;
RXR, receptor X retinoide;
SCD1, estearil-CoA 1-desaturasa;
SD, desviación típica;
SREBP, proteína de unión al elemento de respuesta a los esteroles;
TLR, receptor de tipo Toll;
TNF, factor de necrosis tumoral.
Breve descripción de las Figuras
La Figura 1 muestra el diagrama de flujo para la asignación estructural de los derivados de estigmastano.
La Figura 2 muestra el diagrama de flujo para la asignación estructural de los derivados de ergostano.
La Figura 3 muestra la regulación de genes ABCA1 (A), SREBP1c (B), FASN (C) y SCD1 (D) por los compuestos base evaluada mediante qPCR. Células U937 diferenciadas con PMA durante 72 horas fueron tratadas con T0901317 (10 |jM), 22R-HC (3) o con el compuesto objeto de ensayo (10 jM ). Los resultados muestran la media ± SD de tres muestras biológicas. (n = 3/grupo). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
La Figura 4 muestra la regulación de genes SREBP1c (A), FASN (B) y SCD1 (C) por los compuestos base evaluada mediante qPCR. Se trataron células HepG2 con T0901317 (10 jM ), 22R-HC (3) (10 jM ) o con el compuesto objeto de ensayo (10 jM ). Los resultados muestran la media ± SD de tres muestras biológicas. (n = 3/grupo). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
La Figura 5 muestra la regulación de genes CCL2 (A) y TNFa (B) por los compuestos base evaluada mediante qPCR. Células U937 diferenciadas con PMA durante 72 horas fueron tratadas con LPS (100 ng/ml) en combinación con T0901317 (10 jM ) o con los compuestos base (10 jM ). Los resultados muestran la media ± SD de tres muestras biológicas. (n = 3/grupo). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
La Figura 6 muestra la activación del LXRa con derivados del ergosterol. Se cotransfectaron células renales embrionarias humanas 293 con el plásmido de expresión GAL4-hLXRa junto con el elemento sensible a GAL4 pMHC100X4-TK-luc y plásmidos Renilla. Tras 24 horas las células fueron incubadas con diferentes concentraciones de agonistas sintéticos derivados del ergosterol y se determinó su actividad mediante un ensayo de luciferasa. La actividad de la luciferasa se expresa como la inducción de factores multiplicativos del compuesto con respecto al vehículo. Los valores representan la media ± SD. RLA, actividad relativa de la luciferasa (por sus siglas en inglés).
La Figura 7 muestra la activación del LXRa con derivados del estigmasterol. Se cotransfectaron células renales embrionarias humanas 293 con el plásmido de expresión GAL4-hLXRa junto con el elemento sensible a GAL4 pMHC100X4-TK-luc y plásmidos Renilla. Tras 24 horas las células fueron incubadas con diferentes concentraciones de agonistas sintéticos derivados del estigmasterol y se determinó su actividad mediante un ensayo de luciferasa. La actividad de la luciferasa se expresa como la inducción de factores multiplicativos del compuesto con respecto al vehículo. Los valores representan la media ± SD. RLA, actividad relativa de la luciferasa.
La Figura 8 muestra la activación del LXRp con derivados del ergosterol. Se cotransfectaron células renales embrionarias humanas 293 con el plásmido de expresión GAL4-hLXRp junto con el elemento sensible a GAL4 pMHC100X4-TK-luc y plásmidos Renilla. Tras 24 horas las células fueron incubadas con diferentes concentraciones de agonistas sintéticos derivados del ergosterol y se determinó su actividad mediante un ensayo de luciferasa. La actividad de la luciferasa se expresa como la inducción de factores multiplicativos del compuesto con respecto al vehículo. Los valores representan la media ± SD. RLA, actividad relativa de la luciferasa.
La Figura 9 muestra la activación del LXRp con derivados del estigmasterol. Se cotransfectaron células renales embrionarias humanas 293 con el plásmido de expresión GAL4-hLXRp junto con el elemento sensible a GAL4 pMHC100X4-TK-luc y plásmidos Renilla. Tras 24 horas las células fueron incubadas con diferentes concentraciones de agonistas sintéticos derivados del estigmasterol y se determinó su actividad mediante un ensayo de luciferasa. La actividad de la luciferasa se expresa como la inducción de factores multiplicativos del compuesto con respecto al vehículo. Los valores representan la media ± SD. RLA, actividad relativa de la luciferasa.
La Figura 10 muestra el análisis de activación de los receptores nucleares RXR, PPAR<y>, PXR y FXR mediante los derivados de ergosterol y estigmasterol. Se cotransfectaron células renales embrionarias humanas 293 con plásmidos de expresión GAL4-hRXR (A), GAL4-hPPARy (B), GAL4-hPXR (C) y GAL4-hFXR (D) junto con el elemento sensible a GAL4 pMHC100X4-TK-luc y plásmidos Renilla. Las células se incubaron con vehículo (DMSO), con varios PFM a una concentración de 10<j>M, y los ligandos específicos del receptor nuclear ácido retinoico 9cis (100 nM) (A), Rosiglitazona (RSG 100 nM) (B), T0901317 (100 nM) (C) y GW4064 (100 nM) (D) durante seis horas. Los valores representan la media ± SD. RLA, actividad relativa de la luciferasa.
La Figura 11 muestra los efectosin vitrode PFM009 (13) y PFM018 (25) sobre células tumorales de LLC.
La Figura 12 muestra la expresión del gen diana Abca1 de LXR en células tumorales LLC inducida por PFM009 (13) y PFM018 (25).
La Figura 13 muestra los efectos controladores del crecimiento de tumores LLC en ratones tratados con PFM009 (13) y PFM018 (25).
Descripción de la invención
Según uno de sus aspectos, la invención versa sobre compuestos de fórmula (I)
en donde
el enlace indicado por la flecha es un enlace simple o doble; y
R' es el grupo siguiente:
en donde
- la línea de puntos indica el enlace por medio del cual dicho grupo está unido a la parte restante de la molécula; - R es un alquilo C1-C6 saturado lineal o ramificado, preferiblemente un alquilo C1-C4;
para su uso en terapia.
Según la presente invención, el alquilo C1-C6 saturado lineal o ramificado, preferiblemente alquilo C1-C4, es más preferiblemente un metilo o un grupo etilo.
Según la presente invención, el compuesto (I) se selecciona entre las siguientes fórmulas
Compuestos particularmente preferidos son aquellos que tienen las siguientes fórmulas 13 a 16:
Un compuestos particularmente preferido es el compuesto 13.
Los compuestos de la invención son útiles como moduladores del LXR, especialmente como agonistas de LXRa y/o LXRp, especialmente el compuesto 13 es un agonista no selectivo de LXR.
Los compuestos de la presente invención pueden prepararse según procedimientos conocidos en la técnica.
Por ejemplo, para los compuestos anteriores, los epóxidos 13-16 pueden obtenerse oxidando el doble enlace entre las posiciones C-22 y C-23 del estigmasterol y el ergosterol.
El (22E)-3a,5a-ciclo-6p-metoxiestigmast-22-eno (29), obtenido en dos etapas a partir de estigmasterol, como ya se ha documentado,34 representó el material de partida para la preparación de los derivados de estigmastano (Esquema 1). La reacción de epoxidación del compuesto 29 dio lugar a la formación de los dos epóxidos diastereoisoméricos 30 y 31, que fueron separados mediante cromatografía con un rendimiento del 30 y el 18%, respectivamente.35 La recuperación del resto 3p-hidroxi-5,6-eno se llevó a cabo mediante el conocido procedimiento en dos etapas,35 que consta en primer lugar en el tratamiento con ácido acético glacial, seguido por la hidrólisis alcalina en presencia de una solución hidroalcohólica de carbonato potásico. Así, partiendo de los compuestos 30 y 31, se obtuvieron los compuestos deseados del (22R,23R)-22,23-epoxiestigmast-5-eno-3p-ol (13) y su isómero (22S,23S) 14, respectivamente.
aReactivos y condiciones: (a)i.m-CPBA, NaHCO3, CH2CI2, reflujo, 2 h;ii.mpc; (b) i. AcOH glacial, reflujo, 5h;ii.K2CO3, MeOH/H2O, reflujo, 3 h.
La apertura reductora del anillo de oxirano del compuesto 30 (Esquema 2), promovida por el LiAlH4, dio la mezcla inseparable de los correspondientes derivados 23S- y 22S-hidroxi 32 33, que fue tratada en primer lugar con ácido acético glacial y luego en condiciones básicas para obtener, tras cromatografía de presión media (mpc), muestras puras de (23S)-3p-estigmast-5-eno-3,23-diol (17) y (22S)-3p-estigmast-5-eno-3,22-diol (18). Sin embargo, ni este compuesto ni su indicación para ningún uso terapéutico forman parte de la presente invención.
aReactivos y condiciones: (a) LiAlH4, THF, reflujo, 36 h; (b)i.AcOH glacial, reflujo, 6 h;ii.KOH 2M, MeOH, reflujo, 3h;iii.mpc.
De modo similar, la apertura reductora del epóxido 31 dio la mezcla inseparable de los correspondientes derivados 23R- y 22R-hidroxi 34 35 (Esquema 3). En este caso, la separación cromatográfica de los dos componentes de la mezcla solo fue posible en forma de 3p-acetato. Así, la mezcla de los compuestos 34 35 fue calentada en ácido acético glacial y el crudo sometido a mpc para lograr los dos isómeros puros 36 y 37. Su hidrólisis alcalina final dio los compuestos deseados de (23R)-3p-estigmast-5-eno-3,23-diol (19) y (22R)-3p-estigmast-5-eno-3,22-diol (20), respectivamente, completando así la serie de estigmastanodioles. Sin embargo, ni el compuesto (19) ni el compuesto (20) ni ninguna indicación terapéutica de los mismos forman parte de la presente invención.
aReactivos y condiciones: (a) LÍAIH4, THF, reflujo, 36 h; (b)i.AcOH glacial, reflujo, 6h;ii.mpc; (c) KOH 2M, MeOH, reflujo, 3h.
La oxidación de Swern de (23R)-3p-acetoxiestigmast-5-eno-23-ol (36) proporcionó el correspondiente derivado 23-ceto 38 (Esquema 4), que, bajo hidrólisis básica, dio la 3p-hidroxiestigmast-5-eno-23-ona deseada (25). Sin embargo, ni este compuesto ni su indicación para ningún uso terapéutico forman parte de la presente invención.
Esquema 4: Síntesis de 3(3-hidroxiestigmast-5-eno-23-ona (25)a (para la comparación únicamente)
a Reactivos y condiciones: (a) (COCl)2, DMSO, CH2CE -78°C, 2h, luego Et3N, t.a.; (b) KOH 2M, acetona, reflujo, 3h.
De forma análoga, el (22R)-3p-acetoxiestigmast-5-eno-22-ol (37) se convirtió en la 3p-hidroxiestigmast-5-eno-22-ona deseada (26) (Esquema 5). Sin embargo, ni este compuesto ni su indicación para ningún uso terapéutico forman parte de la presente invención.
aReactivos y condiciones: (a) (COCl)2, DMSO, CH2CE -78°C, 2h, luego Et3N, t.a.; (b) KOH 2M, acetona, reflujo, 3h.
El cicloaducto 40 de 3p-acetoxi, obtenido por cicloadición de Diels-Alder entre ergosterol-3p-acetato y 4-fenil-1,2,4-triazolina-3,5-diona,36 constituyó el material de partida para la síntesis de los derivados de ergostano: Su reacción de epoxidación con mCPBA dio acceso a la mezcla inseparable de los dos epóxidos diastereoisoméricos 41a.36 De manera análoga, también se preparó la correspondiente mezcla de epóxidos 41b protegidos por 3p-tetrahidropiranilo partiendo del cicloaducto de 3p-tetrahidropiraniloxi.37 El tratamiento de la mezcla 41a con carbonato potásico anhidro dio lugar a la reacción de retro 1,4-cicloadición, dando, tras mpc, los dos isómeros simples 42 y 43 (Esquema 6). El componente secundario 42, menos polar, cuya configuración absoluta fue asignada como 22R,23R (véaseinfra),fue sometido a hidrólisis alcalina para proporcionar (22R,23R)-22,23-epoxiergosta-5,7-dieno-3p-ol (15). El mismo procedimiento, partiendo del epóxido principal 43, más polar, dio el correspondiente (22S,23S)-22,23-epoxiergosta-5,7-dieno-3p-ol (16).
La apertura reductora de la mezcla 41b de epóxidos dio, tras la separación por mpc, tres fracciones diferentes, constituidas por (23R)-3p-tetrahidropiraniloxiergost-5,7-dieno-23-ol (44), la mezcla inseparable de dioles (45 46) protegidos por (23S)- y (22S)-3p-tetrahidropiranilo, y (22R)-3p-tetrahidropiraniloxiergost-5,7-dieno-22-ol (47) (Esquema 7). La desprotección del grupo 3p-hidroxi del compuesto 44 por p-toluenosulfonato de piridinio (PPTS)38 proporcionó el(23R)-3p-ergost-5,7-dieno-3,23-diol deseado (23). Sin embargo, ninguno de estos productos ni ninguna indicación terapéutica de los mismos forman parte de la presente invención.
Esquema 7: Síntesis de (23R)-3p-ergost-5,7-dieno-3,23-diol (23), (22R)-3B-estigmast-5-eno-3,22-diol (24), 3B-hidroxiergosta-5,7-dieno-23-ona (27) y 3B-hidroxiergosta-5,7 dieno-22-ona (28)a (para la comparación únicamente)
44 R = 48. R
23. R 27. R
47, R = 49, R =
24. R 28. R
aReactivos y condiciones: (a) LÍAIH4, THF-Et2O, reflujo, 36 h; (b) (COCl)2, DMSO, CH2CI2, -78°C, 2h, luego Et3N, t.a.; (c) PPTS, EtOH, reflujo, 1h; (d) PPTS, acetona, reflujo, 5h.
La subsiguiente oxidación de Swern del alcohol simple 44 proporcionó el derivado 3p-tetrahidropiranil-23-ceto 48, que fue desprotegido en condiciones análogas ácidas suaves para proporcionar finalmente 3p-hidroxiergosta-5,7-dieno-23-ona (27). Una secuencia análoga, partiendo del derivado puro 22R-hidroxi 47, más polar, dio acceso a los compuestos deseados de (22R)-3p-ergost-5,7-dieno-3,22-diol (24) y 3p-hidroxiergosta-5,7-dieno-22-ona (28).
La serie de ergostanodioles se completó reduciendo el derivado 3p-tetrahidropiranil-23-ceto 48 con borohidruro de sodio, logrando casi cuantitativamente la mezcla de los dos epímeros 23-hidroxi, los cuales, tras su desprotección en la posición C-3, dieron el ya obtenido (23R)-3p-ergost-5,7-dieno-3,23-diol (23), y el epímero 23S 21 que faltaba (Esquema 8). De forma análoga, partiendo del derivado 22-ceto 49, se obtuvo el (22S)-3p-ergost-5,7-dieno-3,22-diol (22) junto con el compuesto 24 ya obtenido (Esquema 9). Sin embargo, ninguno de estos compuestos ni ninguna indicación para ningún uso terapéutico forman parte de la presente invención.
Esquema 8: Síntesis de (23R)-3p-ergost-5,7-dieno-3,23-diol (23) y (23S)-3pergost-5,7-dieno-3,23-diol (21)a (para la comparación únicamente)
aReactivos y condiciones: (a)i.NaBH4, THF, 2-propanol, H2O, t.a.;ii.PPTS, EtOH, reflujo, 1h;iii.mpc.
Esquema 9: Síntesis de (22S)-3p-ergost-5,7-dieno-3,22-diol (22) y (22R)-3pergost-5,7-dieno-3,22-diol (24)a (para la comparación únicamente)
aReactivos y condiciones: (a)i.NaBH4, THF, 2-propanol, H2O, t.a.;ii.PPTS, EtOH, reflujo, 1h;iii.mpc.
aReactivos y condiciones: (a)i.Ph3P=CHC(O)CH(CH3)2, tolueno, 92 h, reflujo;ii.H2, 40 psi, 10% Pd/C, NaHCO3, EtOAc/THF, 30 h, t.a.; 60% de rendimiento. (b) 1M CH2=CHMgBr en THF, Et2O, 2 h, reflujo;ii.mpc, 79% de rendimiento. (c) pTosOH-^O, dioxano acuoso al 75%, 75°C, 1 h; (d) H2, 40 psi, 10% Pd/C, NaHCO3, EtOAc/THF, 12 h, t.a.
En el anterior proceso del Esquema 10, 40psi = 275790Pa.
Asignación de configuración absoluta
En las Figuras 1 y 2 se representan los flujos de trabajo para la elucidación estereoquímica de los centros asimétricos recién creados.
En el caso de los miembros de la serie de estigmastano se usó el análisis de difracción monocristalina de rayos X documentado para el (22R)-3p-estigmast-5-eno-3,22-diol, único derivado conocido entre los estigmastanodioles aquí documentados.3940 Mediante la comparación de sus datos espectroscópicos documentados con los de nuestros compuestos, se estableció que el diol más polar 20 correspondía al (22R)-3p-estigmast-5-eno-3,22-diol. En consecuencia, dado que se había obtenido el compuesto 20 a partir de la apertura reductora del isómero 14 de oxirano más polar, este tenía que estar dotado de la configuración absoluta 22S,23s . Así, al otro diol derivado de su apertura reductora, concretamente el compuesto 19, se le asignó, en vez de ello, la configuración 23R (Figura 1). Por exclusión, los dioles 17 y 18 se caracterizaron por la configuración S en el centro quiral de la cadena lateral recién formado, y el epóxido 13 menos polar por la configuración 22R,23R. La respectiva posición del grupo hidroxilo en los dos dioles 17 y 18 se estableció definitivamente mediante su comparación con los compuestos resultantes de la reducción de la 3phidroxiestigmast-5-eno-22-ona (26).
Aunque ya se había documentado la síntesis de algunos de nuestros derivados de ergostano, únicamente se había dado por sentada su asignación estructural.364142 Para proceder sin ambigüedades con la elucidación estructural, se sometió al diol 23, derivado por hidrólisis del compuesto 44, fracción principal menos polar obtenida por la apertura reductora de la mezcla de epóxidos 41b (Esquema 7), a análisis monocristalino de rayos X (Figura 1) y, así, se lo caracterizó como isómero (23R). En consecuencia, al diol 24, dado que se obtuvo mediante hidrólisis del otro isómero más abundante 47 resultante de la misma reacción de apertura (Esquema 7), se catalogó como (22R)-3p-ergost-5,7dieno-3,22-diol (Figura 2). Dado que estos dos isómeros principales derivaban con certeza de la apertura de un único epóxido, se asignó la configuración absoluta 22S,23S al epóxido más abundante 16, y, en consecuencia, la configuración 22R,23R al menos abundante 15. El diol obtenido por la reducción del derivado 27 de 23-ceto, diferente del compuesto 23, tenía que ser el isómero 21 (23S), y el otro diol obtenido del derivado 22-ceto 28 y distinto del compuesto 24, fue el derivado 22S 22.
En la Tabla (I) se enumeran otros compuestos preferidos para su uso según la presente invención.
Los compuestos de fórmula (I), y especialmente los compuestos preferidos, son moduladores de LXR, más en particular agonistas de LXR.
Según otro de sus aspectos, la invención versa sobre compuestos de fórmula (I) y, en especial, sobre los compuestos preferidos para su uso en terapia.
Más en particular, los anteriores compuestos son útiles en la prevención de enfermedades relacionadas con el LXR, como, sin limitación, cáncer, enfermedades inflamatorias y/o inmunológicas. Es particularmente preferido su uso en la prevención y/o el tratamiento de melanoma, cáncer de próstata y carcinoma de la piel. También se prefieren para enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades metabólicas y enfermedades autoinmunitarias.
Para su uso en terapia, los compuestos de la invención se formulan en composiciones farmacéuticas junto con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable según los procedimientos conocidos en la técnica; dichas composiciones constituyen otro aspecto de la presente invención.
El experto en la técnica es consciente del tipo de vehículo que ha de elegirse, en función de la vía de administración prevista. Las composiciones de la invención son adecuadas para la administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, transdérmica u oral. Vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles.
Las composiciones para su uso según la invención también pueden comprender ingredientes activos adicionales.
Según otro de sus aspectos, la invención versa sobre compuestos de fórmula (I) para ser usados en un procedimiento para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades relacionadas con el LXR, que comprende administrar a un mamífero necesitado de ello, una cantidad efectiva de al menos un compuesto de fórmula (I). Una realización preferida, según la invención, versa sobre compuestos de fórmula (I) para su uso en un procedimiento para la prevención y/o el tratamiento de cáncer, enfermedades inflamatorias y/o inmunológicas. Son particularmente preferidos los procedimientos en la prevención y/o el tratamiento de melanoma, cáncer de próstata y carcinoma de la piel. También se prefieren para enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades metabólicas y enfermedades autoinmunitarias.
Según otro de sus aspectos, la invención versa sobre compuestos intermedios de síntesis que tienen las siguientes fórmulas
en donde R es un grupo acetilo.
La invención está ilustrada a continuación de forma no limitante en la Sección experimental.
Sección experimental
La siguiente sección experimental está relacionada con el contenido de la presente invención solo en la medida en la que está relacionada con la actividad terapéutica de los compuestos 13-16 de 22,23-epoxi y de los compuestos 42 y 43per se.
Actividad de los LXR
Todos los compuestos sintetizados se sometieron verificaron en primer lugar para comprobar su capacidad de activar los LXR usando ensayos de luciferasa con receptores quiméricos de GAL-4. Estos se llevaron a cabo cotransfectando plásmidos que codificaban dominios de unión a hLXRa- y p fusionados a GAL-4, con el respectivo elemento sensible conjuntado con el gen indicador de luciferasa en células renales embrionarias humanas 293. Los resultados de los ensayos se enumeran en la Tabla 2: la mayoría de los compuestos presentaron una baja actividad micromolar de los LXR, reteniendo o, en algunos casos, mejorando la magnitud de la actividad del ligando endógeno 22RHC (3).
Tabla 2. Perfil agonista de LXR de los compuestos 13-28
En cuanto al perfil de selectividad de isoformas, además de los agonistas de LXRa no selectivos y poco preferentes (13, 16 y 19) (Figuras 6-9), otros compuestos, como 21,27 y 28, merecen ser destacados como agonistas selectivos de LXRa. Entre ellos el derivado 27 demostró ser el agonista a-selectivo más prometedor gracias a su menor valor de EC50 y a su mayor eficacia con respecto al compuesto de referencia 3.
Además, los compuestos 20, 22 y 25 y 29 mostraron una buena selectividad para la isoforma LXRp en términos de EC50.
Los compuestos documentados25y29demostraron estar dotados de mejor selectividad de isoformas que el derivado conocido 12.
Las relaciones de eficacia beta/alfa para los compuestos25y29fueron, de hecho, 3,7 y 4,4, respectivamente, con respecto al valor de 1,4 para el compuesto12.
En particular, puede considerarse al 25 un agonista selectivo del LXRp, siendo casi inactivo (EC50 = 14,51<j>M) en el LXRa (Figuras 7 y 9). Cabe destacar que, aunque mostraba una eficacia de aproximadamente el 50% en términos de activación del LXRp, el compuesto 25 estaba dotado de la menor eficacia en el LXRa en comparación con el 22R-HC (3) (Tabla 2), confirmando así su selectividad para la isoforma LXRp. Desde un punto de vista estructural, todos los agonistas selectivos del LXRa son derivados del ergostano, mientras que los ligados preferentes del LXRp pertenecen a las dos clases; sin embargo, el compuesto más interesante en este sentido, concretamente el compuesto 25, es un derivado del estigmastano.
Además, el sistema esquelético, más que la naturaleza y, cuando fuera aplicable, la estereoquímica de la modificación de la cadena lateral, parecía influir estrictamente tanto en la potencia como en la selectividad de isoformas. De hecho, con los derivados de R,R-epoxi 13 y 15, como excepciones únicas, ningún derivado de ergostano y estigmastano modificado igualmente en su cadena lateral mostró un perfil biológico similar.
La selectividad de nuestros compuestos dentro de la superfamilia de receptores nucleares también fue evaluada mediante ensayos de luciferasa usando plásmidos GAL4-RXR, -PPAR<y>, -PXR y -FXR. Ningún compuesto fue capaz de activar el rX r o el PPARy, mientras que se observó una ligera activación del PXR por los compuestos 21, 22 y 15, y una fuerte activación del FXR por el compuesto 20 (Figura 10).
Perfil de expresión génica
Los agonistas de LXR inducen la expresión de genes diana, que están implicados en la homeostasia del colesterol, en particular en la vía inversa de transporte del colesterol.43 De hecho, los agonistas de LXR inducen la expresión de ABCA1 tanto en macrófagos como en muchos tejidos de la periferia, como el intestino.44 Además, el ABCA1 regula el eflujo de colesterol a los aceptores de APOA-I.45 En el hígado, la activación del LXR promueve la biosíntesis de ácidos grasos, proceso también denominado lipogénesisde novo,induciendo la expresión del regulador maestro de la lipogénesis hepática, la proteína 1C de unión al elemento regulador de los esteroles (SREBP-1c), así como varios genes aguas abajo en la vía del SREBP-1c, incluyendo la estearil-CoA 1-desaturasa (SCD1) y la ácido graso sintasa (FASN).43 Por lo tanto, se investigó, mediante PCR cuantitativa (qPCR), la expresión de ABCA1, SREBP1c, FASN y SCD1, usando ARN de células monocíticas U937 (Figura 3) y de células hepáticas HepG2 (Figura 4) estimuladas con nuestros compuestos, usando como controles positivos el agonista no esteroideo T0901317 o el ligando endógeno 22R-HC (3). Como se muestra en la Figura 3A, todos los compuestos, salvo el 18 y el 15, fueron capaces de inducir la expresión de ABCA1, aunque en un grado diferente. Con la mayoría de los derivados se observó una leve regulación al alza de la expresión génica (2 veces), mientras que, curiosamente, con los compuestos 13, 19, 20 y 25 se detectó una intensa inducción de la expresión de ABCA1, comparable a la causada por T0901317. Cabe destacar que, para todos nuestros compuestos, el nivel de regulación al alza del SREBP-1c fue mucho menor que el observado para T0901317 y comparable al nivel obtenido con el ligando natural 22R-HC (3) (Figura 3B). Los efectos observados en los genes FASN y SCD1 fueron aún más interesantes: ningún compuesto reguló al alza los niveles de ARNm de FASN (Figura 3C); se detectó una ligera activación (por debajo de 2 veces) de SCD1 únicamente para los compuestos 16 y 25, siendo este estadísticamente significativo (Figura 3D). Además el ligando natural 22R-HC (3) no indujo la regulación al alza de los transcritos de FASN y SCD1 (Figuras 3C y 3D). Estos datos fueron confirmados en momentos posteriores (es decir, tras 16 horas). Luego se evaluó la inducción de genes implicados en la lipogénesis usando la línea celular hepática HepG2.4322 Mediante análisis de qPCR se observó únicamente una regulación significativa al alza de SREBP-1c inducida por los compuestos 13 y 16, mientras que todos los demás compuestos resultaron ser negativos (Figura 4A). Ningún compuesto reguló al alza los niveles de ARNm de FASN (Figura 4B) y SCD1 (Figura 4C). Según todas estas evidencias, los derivados 13, 19, 20 y 25, siendo fuertes inductores de ABCA1 y deficientes activadores de SREBP1c y SCD1 en la línea celular U937, demostraron ser derivados muy prometedores. De hecho, con el paso del tiempo, se han dedicado esfuerzos sustanciales a la identificación de ligandos de LXR capaces de activar los genes transportadores ABC sin afectar los niveles de genes lipogénicos. Esta tarea sigue siendo una tarea que supone el reto fundamental para el descubrimiento de un modulador de LXR clínicamente útil para la aterosclerosis. Según el perfil de selectividad de isoformas, el 13 y el 19 fueron ligandos no selectivos, el 20 y el 25 fueron un agonista de LXRp preferente y selectivo, respectivamente, poniendo así de manifiesto que en nuestro modelo la capacidad de no regular los genes al alza implicada en la lipogénesis no era un fenómeno exclusivo de los moduladores selectivos del LXRp.
Siendo los LXR no solo reguladores transcripcionales de la homeostasia del colesterol y los lípidos, sino también capaces de ejercer potentes efectos antiinflamatorios a través de la interferencia de la señalización de los TLR 2, 4 y 9,46 se decidió verificar si nuestros compuestos también eran capaces de modular genes implicados en los sistemas inflamatorios, como los genes MCP-1/CCL2 y TNFa, que se ha demostrado que son inhibidos cuando se emplean los LXR en presencia de LPS.47 Con este fin, se trataron células U937 diferenciadas durante 6 horas con nuestros compuestos en combinación con LPS (100 ng/ml) y luego se evaluaron mediante qPCR las células tratadas en busca de la expresión de CCL y TNFa. La mayoría de los compuestos fueron capaces de inhibir la expresión de CCL2, mostrando 21, 22, 19 y 16 el mismo grado de potencia del control positivo T0901317 (Figura 5A). La mayoría de los compuestos también fueron capaces de inhibir el TNFa, siendo los más activos el 21, el 13, el 19 y el 25 (Figura 5B). Se obtuvieron resultados similares usando el ligando endógeno 22R-HC (3).
Química
Las temperaturas de fusión se determinaron usando el procedimiento capilar en un aparato electrotérmico Büchi 535 y no se corrigieron. Se tomaron espectros de RMN 1H y 13C en un espectrómetro Bruker AC 400 como soluciones en CDCl3, a no ser que se indique algo distinto. Las multiplicidades de espín se indican mediante los símbolos s (singlete), d (doblete), t (triplete), q (cuartete), m (multiplete) y bs (singlete ancho). Se efectuó cromatografía en columna rápida sobre gel de sílice Merck (0,040-0,063 mm). Se efectuó cromatografía de presión media (mpc) en columnas Merck LiChroprep Si 60 Lobar. Se realizaron microanálisis en un analizador elemental Carlo Erba 1106 y los resultados se encontraron dentro de un ± 0,4% de los valores teóricos. Todos los disolventes fueron destilados y secados según procedimientos estándar. Mediante microanálisis, se determinó que la pureza era >95% para todos los compuestos finales.
Ejemplo 1
(22R,23R)-22,23-epoxiestigmast-5-eno-3p-ol (13). El epóxido 30 (0,067 g, 0,15 mmol) fue sometido a reflujo en ácido acético glacial (5 ml) durante 5 h. El residuo obtenido por la eliminación del disolvente al vacío fue disuelto directamente en metanol/agua (2:1, 12 ml) y la solución resultante tratada con K2CO3 (0,26 g, 1,86 mmol) y sometida a reflujo durante 3 h. Después de enfriar, la mezcla de reacción fue extraída con CH2Ch (3*10 ml) y las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo fue sometido a mpc. La elución con petróleo ligero-acetato de etilo (80:20) proporcionó una muestra pura de 13: 36% de rendimiento; tf 173,2-175,4°C; RMN 1H (400 MHz) 80,69 (s, 3H), 2,28-2,29 (m, 2H), 2,49-2,50 (m, 1H), 2,75 (dd, 1H, J = 9,32 y 2,21 Hz), 3,52 (m, 1H), 5,35-5,36 (m, 1H); RMN 13C (100 MHz) 8 11,82, 12,45, 16,17, 19,37, 19,54, 20,17, 20,85, 21,01, 24,53, 27,93, 29,13, 31,61, 31,88 (2C), 36,48, 37,22, 38,66, 39,55, 42,24, 42,62, 48,28, 50,07, 53,42, 56,35, 62,14 (2C), 71,74, 121,54, 140,79; Anál. calculado para C29H48O2: C, 81,25%; H, 11,29%. Anál. encontrado: C, 81,17%; H, 11,24%.
Ejemplo 2
(22S,23S)-22,23-epoxiestigmast-5-eno-3p-ol (14). El epóxido 31 fue tratado como se ha documentado para el compuesto 30 para producir el compuesto 14 con un 29% de rendimiento; tf 127,8-130,2°C; RMN 1H (400 MHz) 80,68 (s, 3H), 2,24-2,30 (m, 2H), 2,49-2,54 (m, 2H), 3,53 (m, 1H), 5,35-5,37 (m, 1H); RMN 13C (100 MHz) 11,97, 12,36, 16,28, 19,36 (2C), 20,92, 21,06, 24,51, 27,07, 29,31, 29,68, 31,62, 31,87 (2C), 36,48, 37,25, 38,87, 39,67, 42,27, 42,67, 48,77, 50,17, 56,02, 56,32, 58,55, 63,13, 71,77, 121,67, 140,67; Anál. calculado para C29H48O2: C, 81,25%; H, 11,29%. Anál. encontrado: C, 81,33%; H, 11,27%.
Ejemplo 3
(22R,23R)-22,23-epoxiergosta-5,7-dieno-3p-ol (15). Se agregó una solución de KOH 2M (0,2 ml) a una solución del compuesto 42 (0,037 g, 0,08 mmol) en EtOH (3,8 ml) y la mezcla resultante fue sometida a reflujo durante 15 min. Después de enfriar, la mezcla de reacción fue extraída con EtOAc (4*5 ml) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (8 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el disolvente se eliminó al vacío para dar un residuo que fue sometido a cromatografía en columna rápida. La elución con petróleo ligero-acetato de etilo (80:20) proporcionó el compuesto 15 con un 64% de rendimiento; tf: 163,8-165,2°C; RMN 1H (400 MHz) 80,61 (s, 3H), 3,61 3,65 (m, 1H), 5,39-5,41 (m, 1H), 5,57-5,58 (m, 1H); RMN 13C (100 MHz) 11,9, 13,7, 16,2, 16,3, 19,5, 20,4, 21,0, 23,2, 26,8, 31,1, 31,9, 37,0, 38,3, 39,0 (2C), 40,7, 42,3, 43,2, 46,2, 54,0, 55,6, 60,4, 64,3, 70,3, 116,5, 119,5, 139,8, 140,8; Anál. calculado para C28H44O2: C, 81,50%; H, 10,76%. Anál. encontrado: C, 81,17%; H, 10,74%.
Ejemplo 4
(22S,23S)-22,23-epoxiergosta-5,7-dieno-3p-ol (16). El derivado 43 fue tratado como se documentó para el compuesto 42 para producir el compuesto 16 con un 89% de rendimiento: tf: 138,3-139,6°C; RMN 1H (400 m Hz ) 80,60 (s, 3H), 3,60-3,66 (m, 1H), 5,39-5,41 (m, 1H), 5,56-5,58 (m, 1H); RMN 13C (100 MHz) 11,8, 12,5, 16,2, 17,1, 18,5, 20,2, 21,0, 23,3, 27,8, 31,0, 31,9, 37,0, 38,3, 39,0, 39,8, 40,7, 42,5, 43,2, 46,1, 53,3, 54,0, 63,1, 63,8, 70,3, 116,5, 119,4, 140,0, 140,7; Anál. calculado para C28H44O2: C, 81,50%; H, 10,76%. Anál. encontrado: C, 81,32%; H, 10,77%.
Ejemplo 5 (no según la invención)
(23S)-3p-estigmast-5-eno-3,23-diol (17) y (22S)-3p-estigmast-5-eno-3,22-diol (18). Se agregó LiAlH4 (0,25 g, 6,71 mmol) en porciones a la solución del epóxido 30 (0,27 g, 0,61 mmol) en THF anhidro (15 ml). La mezcla resultante fue sometida a reflujo durante 36 h en atmósfera de argón. Después de enfriar, se agregaron con cuidado primero EtOAc y luego agua. Se separó la fase orgánica y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (3*15 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (20 ml) y luego se secaron sobre Na2SO4. Tras el filtrado, el disolvente fue evaporado al vacío para dar un residuo, que fue disuelto en acético glacial (5 ml) y la solución resultante fue sometida a reflujo durante 6 h. Después de enfriar, la mezcla de los compuestos 32 33, obtenida por la eliminación del disolvente al vacío, fue disuelta directamente en metanol (16 ml) y tratada con una solución de KOH 2M (8 ml). Después de refluir durante 3 h, la mezcla de reacción fue extraída con EtOAc (3 3 15 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el disolvente se eliminó al vacío, para dar un residuo que fue sometido a mpc. La elución con petróleo ligero-acetato de etilo (70:30) proporcionó muestras puras de los compuestos deseados con un 69% de rendimiento total; 17: tf 178,2-181,4°C; RMN 1H (400 MHz) 80,69 (s, 3H), 2,23-2,31 (m, 2H), 3,53 (m, 1H), 3,91 (m, 1H), 5,36 (m, 1H); RMN 13C (100 MHz) 11,79, 13,82, 18,28, 19,38 (2C), 19,85, 21,03, 21,12, 24,24, 28,45, 28,54, 31,58, 31,82 (2C), 34,16, 36,44, 37,19, 39,73, 42,22, 42,35, 42,46, 49,13, 50,01, 56,66, 56,88, 70,55, 71,73, 121,62, 140,72; Anál. calculado para C29H50O2: C, 80,87%; H, 11,70%. Anál. encontrado: C, 80,63%; H, 11,72%; 18: tf 168,9-172,4°C; RMN 1H (400 MHz) 80,70 (s, 3H), 2,24-2,31 (m, 2H), 3,53 (m, 1H), 3,75 (t, 1H, J = 6,77 Hz), 5,35 (d, 1H, J = 5,21 Hz); RMN 13C (100 MHz) 11,39, 11,73, 11,85, 18,89, 19,10, 19,38, 21,05, 23,27, 24,18, 27,8, 28,84, 31,58, 31,80, 31,88, 35,77, 36,43, 37,20, 39,72, 39,92, 42,04, 42,20 (2C), 50,02, 52,58, 56,61, 71,71, 71,86, 121,60, 140,73; Anál. calculado para (C29H50O2): C, 80,87%; H, 11,70%. Anál. encontrado: C, 80,70%; H, 11,65%.
Ejemplo 6 (no según la invención)
(23R)-3p-estigmast-5-eno-3,23-diol (19). Una solución del compuesto 36 (0,03 g, 0,06 mmol) en MeOH (3 ml) fue tratada con una solución de KOH 2M (1 ml) y la mezcla resultante fue sometida a reflujo durante 30 min. Después de enfriar, la mezcla de reacción fue extraída con EtOAc (3*10 ml) y las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el disolvente se eliminó al vacío. El residuo así obtenido fue purificado por cromatografía en columna rápida: la elución con petróleo ligero-acetato de etilo (80:20) proporcionó el compuesto 19 con un 55% de rendimiento: tf 158,1-158,6°C; RMN 1H (400 MHz) 80,72 (s, 3H), 2,27-2,28 (m, 2H), 3,51 (m, 1H), 3,69-3,74 (m, 1H), 5,35 (d, 1H, J = 5,25 Hz); RMN 13C (100 MHz) 11,94, 14,48, 18,63, 18,96, 19,17, 19,36, 21,09, 21,44, 24,25, 27,80, 28,50, 31,67, 31,90 (2C), 32,78, 36,51, 37,28, 39,87, 41,11, 42,32, 42,51, 50,17, 52,49, 56,92 (2C), 70,25, 71,76, 121,60, 140,81; Anál. calculado para C29H50O2: C, 80,87%; H, 11,70%. Anál. encontrado: C, 80,67%; H, 11,66%.
Ejemplo 7 (no según la invención)
(22R)-3p-estigmast-5-eno-3,22-diol (20). El derivado 37 fue tratado como se ha documentado para el compuesto 36 para obtener el compuesto 20 con un 72% de rendimiento: tf: 149,2-149,9°C; RMN 1H (400 MHz) 80,72 (s, 3H), 3,51 (m, 1H), 3,69-3,74 (m, 1H), 5,35 (d, 1H, J = 5,25 Hz); RMN 13C (100 MHz) 11,75 (2C), 12,32, 17,74, 19,38, 20,45, 21,11, 23,60, 24,45, 27,50, 28,92, 29,65, 30,11, 31,70, 31,92, 36,54, 37,30, 39,81, 41,53, 42,33, 42,59, 42,70, 50,22, 53,07, 56,39, 71,39, 71,78, 121,59, 140,85; Anál. calculado para C29H50O2: C, 80,87%; H, 11,70%. Anál. encontrado: C, 80,91%; H, 11,69%.
Ejemplo 8 (no según la invención)
(23R)-3p-ergost-5,7-dieno-3,23-diol (23) y (23S)-3p-ergost-5,7-dieno-3,23-diol (21). Se agregó NaBH4 (0,13 g, 3,44 mmol) a una solución de la cetona 48 (0,10 g, 0,2 mmol) en THF-2-propanol (2:1, 6 ml), y la mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante la noche. A continuación, la mezcla de reacción fue diluida con H2O (5 ml) y extraída con Et2O (3*5 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el disolvente se eliminó al vacío. El residuo así obtenido se disolvió en EtOH (10 ml) y se trató con PPTS (0,012 g, 0,047 mmol). Después de refluir durante 1 h, se dejó que la mezcla de reacción enfriara hasta la temperatura ambiente, y el disolvente se eliminó al vacío para dar un residuo, que fue sometido a mpc. La elución con petróleo ligero-acetato de etilo (90:10) proporcionó muestras puras de los compuestos deseados con un 78% de rendimiento total; 21: tf 129,8-130,7°C; RMN 1H (400 MHz) 80,65 (s, 3H), 3,62-3,69 (m, 2H), 5,40-5,42 (m, 1H), 5,59 (dd, 1H, J = 7,89, 2,35 Hz). RMN 13C (100 MHz) 10,54, 11,71, 16,27, 17,92, 20,67, 21,04, 21,75, 23,05, 27,74, 28,40, 31,92, 35,75, 36,97, 38,32, 39,09, 40,70 (2xC), 43,00, 45,32, 46,16, 54,37, 56,76, 70,44, 73,30, 116,33, 119,54, 139,80, 141,24; Anál. calculado para C28H46O2: C, 81,10%; H, 11,18%. Anál. encontrado: C, 80,97%; H, 11,19%.
Ejemplo 9 (no según la invención)
(22R)-3p-ergost-5,7-dieno-3,22-diol (24) y (22S)-3p-ergost-5,7-dieno-3,22-diol (22). El derivado 49 fue tratado como se documentó para el compuesto 48 para obtener muestras puras de los compuestos deseados 24 y 22 con un 83% de rendimiento total. 22: tf 117,3-121,0°C; RMN 1H (400 MHz) 80,65 (s, 3H), 0,79 (d, 3H, J = 6,84 Hz), 3,63-3,66 (m, 1H), 3,78-3,81 (m, 1H), 5,40-5,42 (m, 1H), 5,59-5,61 (m, 1H); RMN 13C (100 MHz) 11,79, 12,49, 15,55, 16,02, 16,22, 21,04, 21,12, 23,15, 23,80, 27,39, 29,53, 31,92, 34,60, 35,27, 36,98, 38,30, 39,09, 40,72, 43,00, 46,14, 52,73, 54,01, 70,40, 71,67, 116,43, 119,54, 139,90, 140,96; Anál. calculado para C28H46O2: C, 81,10%; H, 11,18%. Anál. encontrado: C, 81,09%; H, 11,17%.
Ejemplo 10 (no según la invención)
(23R)-3p-ergost-5,7-dieno-3,23-diol (23). Se agregó PPTS (0,010 g, 0,039 mmol) a una solución del compuesto 44 (0,050 g, 0,1 mmol) en EtOH (5 ml) y la mezcla resultante fue sometida a reflujo durante 5 h. Después de enfriar, el disolvente se eliminó al vacío y el residuo se purificó por cromatografía en columna rápida. La elución con petróleo ligero-acetato de etilo (80:20) proporcionó el compuesto 23 con un 70% de rendimiento: tf 167,8-169,4°C; RMN 1H (400 MHz) 80,68 (s, 3H), 3,68 (m, 1H), 3,82 (m, 1H), 5,44 (s, 1H), 5,61 (s, 1H). RMN 13C (100 MHz) 9,83, 11,88, 16,25, 18,45, 18,79, 21,05, 21,50, 22,98, 28,33, 29,55, 31,92, 33,11, 36,97, 38,33, 39,18, 40,73, 42,11, 43,01, 45,37, 46,17, 54,52, 56,47, 70,38, 70,64, 116,34, 119,53, 139,80, 141,19; Anál. calculado para C28H46O2: C, 81,10%; H, 11,18%. Anál. encontrado: C, 81,26%; H, 11,16%.
Ejemplo 11 (no según la invención)
(22R)-3p-ergost-5,7-dieno-3,22-diol (24). El derivado 47 fue tratado como se documentó para el compuesto 44 para obtener el compuesto 24 con un 73% de rendimiento: tf 197,7-201,2°C; RMN 1H (400 MHz) 80,65 (s, 3H), 0,79 (d, 3H, J = 6,84 Hz), 3,63-3,66 (m, 1H), 3,78-3,81 (m, 1H), 5,40-5,42 (m, 1H), 5,59-5,61 (m, 1H); RMN 13C (100 MHz) 11,79, 12,49, 15,55, 16,02, 16,22, 21,04, 21,12, 23,15, 23,80, 27,39, 29,53, 31,92, 34,60, 35,27, 36,98, 38,30, 39,09, 40,72, 43,00, 46,14, 52,73, 54,01, 70,40, 71,67, 116,43, 119,54, 139,90, 140,96; Anál. calculado para C28H46O2: C, 81,10%; H, 11,18%. Anál. encontrado: C, 80,86%; H, 11,20%.
Ejemplo 12 (no según la invención)
3p-hidroxiestigmast-5-eno-23-ona (25). Una solución de DMSO (0,03 g, 0,38 mmol) en CH2Ch anhidro (0,5 ml) fue añadida a una solución de cloruro de oxalilo (0,025 g, 0,2 mmol) en CH2Ch anhidro (1 ml), mantenido a -60°C en atmósfera de argón. Después de que se hubo agitado la mezcla resultante durante 15 min a -60°C, se agregó la solución del alcohol 36 (0,048 g, 0,1 mmol) en CH2Ch anhidro (1 ml). La mezcla fue agitada durante 2 h a -55/60°C antes de la adición de Et3N (0,08 g, 0,76 mmol). Después de dejar que la mezcla de reacción alcanzara la temperatura ambiente, la agitación continuó durante 15 min, y luego se agregó agua (10 ml). La mezcla de reacción se extrajo con CH2Cl2 (3*5 ml), las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el disolvente se eliminó al vacío, para dar la cetona cruda 38, que fue disuelta en acetona (2 ml) y tratada con una solución de KOH 2M (0,5 ml). La solución resultante fue sometida a reflujo durante 40 min, enfriada y extraída con EtOAc (3*5 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el disolvente se eliminó al vacío para dar un residuo, posteriormente sometido a cromatografía en columna rápida. La elución con petróleo ligero-acetato de etilo (80:20) proporcionó el compuesto 25 con un 51% de rendimiento: tf: 174,2-174,8°C; RMN 1H (400 MHz) 80,62 (s, 3H), 2,40-2,42 (m, 2H), 3,40-3,47 (m, 1H), 5,26 (d, 1H, J = 4,9 Hz); RMN 13C (100 MHz) 11,77, 12,02, 16,57, 18,46, 19,37, 19,61, 21,04, 23,90, 24,52, 27,64, 28,93, 31,64, 31,83, 31,90, 36,50, 37,27, 39,66, 39,82, 42,29, 42,47, 43,27, 49,66, 50,12, 51,95, 56,11, 71,72, 121,51, 140,78, 214,50; Anál. calculado para C29H48O2: C, 81,25%; H, 11,29%. Anál. encontrado: C, 81,32%; H, 11,31%.
Ejemplo 13 (no según la invención)
3p-hidroxiestigmast-5-eno-22-ona (26). El derivado 37 fue tratado como se documentó para el compuesto 36 para obtener el compuesto 26 con un 59% de rendimiento: tf: 151,7-152,8°C; RMN 1H (400 MHz) 80,72 (s, 3H), 3,48-3,53 (m, 1H), 5,32-5,33 (m, 1H); RMN 13C (100 MHz) 11,85, 19,35, 19,70, 20,06, 21,18, 21,57, 24,22, 28,37, 29,17, 31,62, 31,71, 31,85, 36,47, 37,24, 39,66, 42,26, 42,42, 50,06, 51,04, 55,70, 56,82, 60,82, 71,73, 121,52, 140,81, 214,58; Anál. calculado para C29H48O2: C, 81,25%; H, 11,29%. Anál. encontrado: C, 81,49%; H, 11,28%.
Ejemplo 14 (no según la invención)
3p-hidroxiergost-5,7-dieno-23-ona (27). Se agregó PPTS (0,010 g, 0,039 mmol) a una solución del compuesto 48 (0,050 g, 0,1 mmol) en acetona (5 ml) y la mezcla resultante fue sometida a reflujo durante 5 h. Después de enfriar, el disolvente se eliminó al vacío y el residuo fue purificado por cromatografía en columna rápida. La elución con petróleo ligero-acetato de etilo (80:20) proporcionó el compuesto 27 con un 78% de rendimiento: tf 104,4-105,6°C; Rm N 1H (400 MHz) 85,57 (m, 1H), 5,39 (m, 1H), 3,6 (m, 1H), 5,38-5,40 (m, 1H), 5,56-5,58 (m, 1H); RMN 13C (100 MHz) 11,8, 12,6, 16,2, 18,6, 20,0, 21,0, 21,4, 22,9, 28,2, 30,0, 31,8, 32,2, 36,9, 38,3, 39,0, 40,7, 42,9, 46,1, 49,0, 52,7, 54,4, 55,5, 70,3, 116,4, 119,4, 139,91, 140,9, 215,1; Anál. calculado para C28H44O2: C, 81,50%; H, 10,75%. Anál. encontrado: C, 81,73%; H, 10,71%.
Ejemplo 15 (no según la invención)
3p-hidroxiergost-5,7-dieno-22-ona (28). El derivado 49 fue tratado como se documentó para el compuesto 48 para obtener el compuesto 28 con un 58% de rendimiento: tf 118,2-122,6°C. RMN 1H (400 MHz) 80,65 (s, 3H), 3,63-3,68 (m, 1H), 5,39-5,40 (m, 1H), 5,57-5,59 (m, 1H); RMN 13C (100 MHz) 11,94, 15,88, 16,23, 16,70, 18,17, 20,95, 23,19, 27,34, 31,82, 31,92, 33,61, 36,93, 38,26, 38,95, 40,65, 43,00, 46,07, 46,66, 49,98, 51,81, 53,66, 70,30, 116,56, 119,42, 139,97, 140,47, 214,79; Anál. calculado para C28H44O2: C, 81,50%; H, 10,75%. Anál. encontrado: C, 81,70%; H, 10,78%.
Ejemplo 16
(22R,23R)-22,23-epoxi-3a,5a-ciclo-6p-metoxiestigmastano (30) y (22S,23SR)-22,23-epoxi-3a,5a-ciclo-6pmetoxiestigmastano (31). Se agregaron NaHCO3 (7,34 g, 87 mmol,) y m-CPBA al 77% (3,54 g, 16,8 mmol) a la solución de (22E)-3a,5a-ciclo-6p-metoxiestigmast-22-eno 34 (29) (3,0 g, 7,0 mmol) en CHCh (60 ml) y la mezcla resultante fue sometida a reflujo durante 2 h. Después de enfriar, la mezcla de reacción se lavó con una solución de Na2S2O3 al 10% (3*50 ml), agua (50 ml), y luego se secó sobre Na2SO4. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo fue sometido a mpc. La elución con petróleo ligero-acetato de etilo (95:5) proporcionó muestras puras de los compuestos 30 y 31 con un 30% y un 18% de rendimiento, respectivamente. Sus datos espectrales coincidían con los documentados anteriormente.48
Ejemplo 17 (no según la invención)
(23R)-3p-acetoxiestigmast-5-eno-23-ol (36) y (22R)-3p-acetoxiestigmast-5-eno-22-ol (37). Se agregó LiAlH4 (0,22 g, 5,94 mmol) en porciones a la solución del epóxido 31 (0,24 g, 0,54 mmol) en THF anhidro (15 ml). La mezcla resultante fue sometida a reflujo durante 36 h en atmósfera de argón. Después de enfriar, se agregaron con cuidado primero EtOAc y luego agua. Se separó la fase orgánica y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (3*15 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (20 ml) y luego se secaron sobre Na2SO4. Después del filtrado, el disolvente se evaporó al vacío para dar la mezcla de los compuestos 34 35, que fue disuelta en ácido acético glacial (10 ml) y la solución resultante fue sometida a reflujo durante 3 h. Después de enfriar, el disolvente fue eliminado al vacío para dar un residuo, que fue sometido a mpc. La elución con petróleo ligero-acetato de etilo (80:20) proporcionó una muestra pura de (23R)-3p-acetoxiestigmast-5-eno-23-ol (36): 36% de rendimiento; tf 132,1-132,6°C; Rm N 1H (400 MHz) 80,70 (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 2,30 (d, 2H, J = 7,56 Hz), 3,67-3,71 (m, 1H), 4,58 (m, 1H), 5,36 (d, 1H, J = 4,25 Hz); RMN 13C (100 MHz) 11,86, 14,56, 18,53, 18,82, 19,03, 19,22, 20,93, 21,37 (2C), 24,17, 27,69 (2C), 28,45, 31,72, 31,79, 32,70, 36,47, 36,89, 38,02, 39,68, 40,93, 42,38, 49,88, 52,33, 56,70, 56,76, 70,04, 73,88, 122,53, 139,51, 170,48. Una elución adicional con el mismo eluyente proporcionó (22R)-3p-acetoxiestigmast-5-eno-22-ol (37): 21% de rendimiento; tf 123,9-125,2°C; RMN 1H (400 MHz) 80,70 (s, 3H), 2,03 (s, 3H), 2,31 (d, 2H, J = 7,11 Hz), 3,71 (d, 1H, J = 10,12 Hz), 4,60 (m, 1H), 5,37 (s, 1H); RMN 13C (100 MHz) 11,77, 11,81, 12,26, 17,53, 19,26, 20,52, 20,96, 21,41, 23,50, 24,36, 27,39, 27,69, 28,62, 29,77, 31,80 (2C), 36,50, 36,93, 38,04, 39,61, 41,30, 42,45, 42,57, 49,97, 52,90, 56,18, 71,19, 73,88, 122,51, 139,59, 170,54.
Ejemplo 18
3p-acetoxi-5a,8a-(3,5-dioxo-4-fenil-1,2,4-triazolidino)-22,23-epoxiergost-6-eno (41a). Se agregó m-CPBA al 77% (0,42 g, 1,87 mmol) a la solución del aducto 4036 de acetato de ergosterol (1,0 g, 1,63 mmol) en CH2Ch (10 ml) y la mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 5 h. A continuación, la mezcla de reacción se filtró y la solución se lavó con una solución de NaHCO3 al 5% (2*10 ml) y salmuera (10 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y el disolvente se eliminó al vacío para dar un residuo que fue sometido a cromatografía en columna rápida. La elución con petróleo ligero-acetato de etilo (90:10) proporcionó el compuesto deseado 41a con un 80% de rendimiento: tf: 138,1-144,1°C; RMN 1H (400 MHz) 82,25-2,75 (m, 4H), 3,15-3,25 (m, 1H), 5,40 (m, 1H), 6,25 (m, 1H), 6,40 (m, 1H), 7,25-7,50 (m, 5H). RMN 13C (100 MHz) 8: 12,3, 12,8, 13,0, 13,4, 17,1, 17,3, 18,5, 19,2, 20,1,20,3, 21,1, 22,2, 25,7, 30,7, 30,9, 33,5, 37,8, 39,3, 40,9, 42,3, 44,0, 48,8, 52,6, 54,9, 60,1,62,8, 63,9, 64,6, 64,7, 65,1, 70,2, 126,0, 127.6, 128,6, 128,9, 131,5, 135,0, 135,3, 146,4, 148,8, 148,9, 169,8.
Ejemplo 19 (no según la invención)
(22R,23R)-3p-acetoxi-22,23-epoxiergosta-5,7-dieno (42) y (22S,23S)-3p-acetoxi-22,23-epoxiergosta-5,7-dieno (43). Se agregó K2CO3 anhidro (0,13 g, 0,93 mmol) a una solución del epóxido 41a (0,59 g, 0,93 mmol) en DMF anhidro (50 ml). La mezcla resultante fue sometida a reflujo durante 6 h, luego se enfrió hasta la temperatura ambiente y se agregó alúmina neutra. La mezcla resultante se filtró y se trató con agua para producir un precipitado, que fue filtrado al vacío a continuación lavando con agua. El sólido fue sometido a mpc. La elución con petróleo ligero-acetato de etilo (90:10) proporcionó muestras puras de los compuestos deseados con un 65% de rendimiento total; 42: tf 158,8 160,2°C; RMN 1H (400 MHz) 80,62 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,46-2,48 (m, 2H), 2,60-2,62 (m, 1H), 4,71 (m, 1H), 5,40-5,41 (m, 1H), 5,57-5,58 (m, 1H). RMN 13C (100 MHz) 11,92, 13,70, 16,09, 16,29, 19,51, 20,43, 20,94, 21,43, 23,21, 26,83, 28.06, 31,10, 36,60, 37,04, 37,87, 39,00, 42,29, 43,20, 46,00, 53,94, 55,63, 60,37, 64,22, 72,74, 116,52, 120,19, 138,59, 141,05, 170,56; 43: tf 133,5-135,2°C; RMN 1H (400 MHz) 80,61 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,37-2,52 (m, 3H), 2,69 (d, 1H, J = 7,70 Hz), 4,71 (m, 1H), 5,40 (bs, 1H), 5,57 (bs, 1H). RMN 13C (100 MHz) 11,88, 12,56, 16,13, 17,14, 18,57, 20,24, 20,92, 21,43, 23,32, 27,80, 28,05, 31,00, 36,61, 37,05, 37,86, 38,92, 39,89, 42,50, 43,22, 45,95, 53,28, 53,97, 63.07, 63,83, 72,72, 116,53, 120,08, 138,78, 140,94, 170,57.
Ejemplo 20 (no según la invención)
(23R)-3p-(tetrahidro-2H-piran-2-Noxi)ergost-5,7-dieno-23-ol (44) y (22R)-3p-(tetrahidro-2H-piran-2-Noxi)ergost-5,7-dieno-22-ol (47). Se agregó LiAlH4 (1,87 g, 49 mmol) en porciones a la solución del epóxido 41b (2,83 g, 4,2 mmol) en
THF anhidro (110 ml). La mezcla resultante fue sometida a reflujo durante 36 h en atmósfera de argón. Después de enfriar, se agregaron con cuidado primer EtOAc y luego agua. Se separó la fase orgánica y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (3*25 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (30 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el disolvente se eliminó al vacío para dar un residuo que fue sometido a mpc. La elución con petróleo ligero-acetato de etilo (95:5) dio una muestra pura del compuesto 44 con un 20,5% de rendimiento: tf 95,1-96,9°C;
RMN 1H (400 MHz) 80,66 (s, 3H), 3,49-3,51 (m, 1H), 3,62-3,74 (m, 2H), 3,93-3,95 (m, 1H), 4,74-4,77 (m, 1H), 5,39 (s,
1H), 5,57 (s, 1H); RMN 13C (100 MHz) 9,79, 11,82, 16,14, 18,40, 18,76, 19,78, 19,95, 20,97, 21,46, 22,94, 25,42, 28,20, 28,28, 29,50, 29,92, 31,13, 31,22, 33,05, 37,19, 37,34, 38,17, 38,46, 38,68, 39,17, 42,09, 42,95, 45,35, 46,12, 54,46, 56,45, 62,54, 62,77, 70,53, 74,55, 74,69, 96,60, 97,00, 116,31, 116,40, 119,34, 119,47, 139,89, 140,14, 140,78, 141,01. Una elución adicional dio la mezcla inseparable de (23S)-3p-tetrahidropiraniloxiergost-5,7-dieno-23-ol (45) y (22S)-3p-tetrahidropiraniloxiergost-5,7-dieno-22-ol (46) con un 30% de rendimiento. Después de la elución se obtuvo una muestra pura del compuesto 47 con un 21% de rendimiento: tf 180,2-181,5°C; RMN 1H (400 MHz) 80,63 (s, 3H),
1,07 (d, 3H, J = 6,50 Hz), 3,47-3,50 (m, 1H), 3,61-3,65 (m, 2H), 3,76 (d, 1H, J = 10,66 Hz), 3,91-3,93 (m, 1H), 4,73
4,75 (m, 1H), 5,37 (s, 1H), 5,55 (s, 1H); RMN 13C (100 MHz) 10,54, 11,68, 11,76, 12,48, 15,57, 16,06, 16,18, 17,91, 19,84, 20,01, 20,67, 21,01, 21,74, 23,05, 23,15, 25,45, 27,40, 27,73, 28,23, 28,38, 29,57, 29,96, 31,17, 31,26, 34,59, 35,31, 35,73, 37,23, 37,37, 38,22, 38,50, 38,73, 39,12, 40,72, 42,97, 43,05, 43,20, 45,35, 46,11, 46,16, 52,75, 53,98, 54,34, 56,78, 62,61, 62,84, 71,61, 74,20, 74,60, 74,68, 96,67, 97,05, 116,33, 116,43, 116,52, 119,36, 119,48, 139,98, 140.07, 140,22, 140,31, 140,57, 140,81, 141,07.
Ejemplo 21 (no según la invención)
3p-(tetrahidro-2H-piran-2-iloxi)ergost-5,7-dieno-23-ona (48). Se agregó una solución de DMSO (0,20 g, 2,51 mmol) en CH2Cl2 anhidro (0,5 ml) a una solución de cloruro de oxalilo (0,17 g, 1,32 mmol) en CH2Ch anhidro (1 ml), mantenido a -60°C en atmósfera de argón. Después de que se hubo agitado la mezcla resultante durante 15 min a -60°C, se agregó la solución del alcohol 44 (0,33 g, 0,66 mmol) en CH2Ch anhidro (2 ml). La mezcla se agitó durante 2 h a -55/60°C antes de la adición de Et3N (0,51 g, 5,0 mmol). Después de que se hubo dejado que la mezcla de reacción alcanzara la temperatura ambiente, la agitación continuó durante 15 min, y luego se agregó agua (10 ml). La mezcla de reacción se extrajo con CH2Ch (3*5 ml), las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el disolvente se eliminó al vacío, para dar un residuo que fue sometido a cromatografía en columna rápida. La elución con petróleo ligero-acetato de etilo (90:10) proporcionó el compuesto 48 con un 65% de rendimiento: tf 135,9-136,3°C; RMN 1H (400 MHz) 80,66 (s, 3H), 3,49 (m, 1H), 3,63 (m, 1H), 3,93 (m,
2H), 5,38 (s, 1H), 5,56 (s, 1H); RMN 13C (100 MHz) 11,82, 12,58, 16,23, 18,67, 20,07, 21,38, 22,98, 25,48, 28,20, 30,08, 31,30, 32,28, 37,28, 38,00, 39,09, 43,01,46,16, 49,09, 52,80, 54,47, 55,66, 62,91, 74,70, 74,76, 97,13, 116,53, 119,45, 139,89, 140,91, 214,81.
Biología
Se adquirieron en Sigma T0901317, GW4064 y ácido 9-cis-retinoico. La rosiglitazona se adquirió en Cayman Chemical
(Ann Arbor, Michigan).
Ensayos de cultivos celulares y cotransfección. Se cultivaron células renales embrionarias humanas 293 (American
Type Culture Collection) en caldo Eagle modificado de Dulbecco que contenía un 10% de suero fetal bovino a 37°C en una atmósfera humectada con un 5% de CO2. Se transfectaron de manera transitoria células HEK293 (4*104 células por pocillo) en una placa de 48 pocillos con los plásmidos indicadores pMH100X4-TK-luc (100 ng/pocillo), Renilla (22 ng/pocillo) junto con 100 ng/pocillo de plásmidos pCMX-Gal4-RXR, pCMXGal4-PPAR-Y, pCMX-Gal4-PXR, pFA-CMV-FxR pCMX-Gal4-LXR-a o pCMX-Gal4-LXR-p usando el reactivo de transfección de<a>DN X-tremeGENE 9 (Roche). Seis horas tras la transfección, las células fueron tratadas con el compuesto apropiado durante 24 horas. Las actividades de la luciferasa se analizaron mediante Luciferase Dual Reporter Assay Systems (Promega) según el protocolo del fabricante. Los plásmidos GAL4-LXRs, GAL4-PPAR-Y, GAL4-RXR y TK-MHC100-luc se describieron en Villablanca et al.49 El GAL4-PXR fue un amable regalo del Dr. Enrique Sainz (The Scripps Research Institute, La Jolla,
EE. UU.). El GAL4-FXR fue un amable regalo del Dr. Daniel Merk (Goethe Universitat, Francfort del Meno). Los resultados obtenidos por los ensayos de luciferasa y documentados en la Tabla 1 son de tres a cinco experimentos independientes.
PCR cuantitativa en tiempo real. Se diferenció la línea celular U937 en macrófagos espumosos con forbol 12-miristato
13-acetato (PMA) a razón de 10 ng/ml (Sigma) durante 72 horas a 37°C en una placa de 10 mm a una concentración de 3*106 células en 10 ml de RPMI con suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en inglés) al 10%. Al tercer día se agregaron ligandos de receptores nucleares durante 6 horas. Se trataron células HepG2 con los ligandos según describen Quinet et al.22 El ARN total fue purificado mediante TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, California, EE. UU.). Se
realizó una transcripción inversa incubando 2 |jg de ARN total 1 hora a 42°C con MLV-Reverse Transcriptase (Promega). Se efectuó una PCR cuantitativa usando la Sybr Green Master Mix (Applied Biosystems) y una PCR en tiempo real (ViiA 7 Real Time PCR System, Applied Biosystems). Todas las reacciones de PCR se realizaron por triplicado. Se usó el procedimiento Ct comparativo para cuantificar transcritos que se normalizaron para la GAPDH humana. Se usaron los siguientes pares de cebadores:
GAPDH-F ACA TCA TCC CTG CCT CTA CTG
GAPDH-R ACC ACC TGG TGC TCA GTG TA
ABCA1-F CCA GGC CAG TAC GGA ATT C
ABCA1-R CCT CGC CAA ACC AGT AGG A
SREBP-1c-F GGC GGG CGC AGA TC
SREBP-1c-R TTG TTG ATA AGC TGA AGC ATG TCT
MCP-1-F AGA AGC TGT GAT CTT CAA GAC CAT T
MCP-1-R TGC TTG TCC AGG TGG TCC AT
FAS-F ACA GCG GGG AAT GGG TAC T
FAS-R GAC TGG TAC AAC GAG CGG AT
SCD1-F TTC AGA AAC ACA TGC TGA TCC TCA TAA TTC
SCD1-R ATT AAG CAC CAC AGC ATA TCG CAA GAA AGT
TNFa-F TCT TCT CGA ACC CCG AGT GA
TNFa-R CCT CTG ATG GCA CCA CCA G
Análisis estadístico
Los datos se expresan como media ± SEM (error estándar) y su importancia se analizó por ANOVA con pruebas de comparación múltiple de Dunnet. El análisis se llevó a cabo con el soporte lógico Prism. Los datos de la Tabla 1 se expresan como EC50 ± SD. En particular, las desviaciones típicas se obtuvieron calculando la media de la EC50 de cada experimento (de tres a cinco experimentos independientes). La eficacia (%) de los compuestos se calculó como el porcentaje del efecto del compuesto, en términos de activación de LXRa o p, con respecto a 8 jM de 22R-HC ± SD. Los análisis se realizaron con el soporte lógico Prism.
Análisis de rayos X
Se sometió a un monocristal del compuesto 23 a una recogida de datos de rayos X en un difractómetro Oxford-Diffraction Xcalibur Sapphire 3 con una radiación de Mo-Ka monocromática de grafito (A = 0,71073 A) a 293 K. La estructura se resolvió por procedimientos directos implementados en el programa SHELXS (versión 2013/1).50 La mejora se llevó a cabo mediante análisis de mínimos cuadrados anisotrópicos de matriz completa en F2 para todas las reflexiones para los átomos que no sean H por medio del programa SHELXL (versión 2013/4).50 Los datos cristalográficos (excluyendo los factores de estructura) del compuesto 23 se han depositado en el Cambridge Crystallographic Data Centre como la publicación complementaria n° CCDC 1526884. Pueden obtenerse copias de los datos, de forma gratuita, previa solicitud a CCDC, 12 Union Road, Cambridge CB2 1EZ, Reino Unido (deposit@ccdc.cam.ac.uk).
Ensayos farmacológicos en células de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) murinoin vitroein vivo
Los inventores llevaron a cabo un conjunto de experimentos para evaluar si algunos moduladores del LXR, en particular PFM009 (13) y PFM018 (25), influyen en el crecimiento de las células de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) murinoin vitroein vivo.El tratamiento de células tumorales LLC durante 96 horas con 10 jM de los compuestos anteriormente documentados no fue capaz de alterar el crecimiento tumoral de LLCin vitro(Figura 11). Los inventores comprobaron por qPCR si estos compuestos eran capaces de inducir la expresión de los genes diana del LXR en células LLC, y observaron que tanto PFM009 como PFM018 inducían la expresión del gen diana del LXR Abca1 en células tumorales LLC (Figura 12).
A continuación, los inventores comprobaron si estos compuestos podían influir en el crecimiento tumoral de LLCin vivo.Para hacerlo, se agredió a ratones subcutáneamente con 1*10® células tumorales de LLC. Seis días después, se trató a los ratones portadores de tumores con PFM009 o PFM018 (30 mg/Kg/día) durante cinco días consecutivos y luego se evaluó el crecimiento de los tumores. Según los datos obtenidos por los experimentos de qPCR, los inventores observaron un control significativo del crecimiento de los tumores de LLC cuando los ratones eran tratados a la vez con PFM009 y PFM018 (Figuras 13A y 13B). Sin desear entrar en consideraciones teóricas particulares, estos experimentos parecen indicar que PFM009 y PFM018, que son agonistas selectivos de LXRap y p, respectivamente, controlan el crecimiento tumoral interfiriendo posiblemente en las células no tumorales del microentorno, ya que estos compuestos no bloquen la proliferación celular tumoralin vitro(Figura 11).
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Claims (7)
- REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de fórmula (I)en donde el enlace indicado por la flecha es un enlace simple o doble; y R' es el grupo siguiente:en donde - la línea de puntos indica el enlace por medio del cual dicho grupo está unido a la parte restante de la molécula; - R es un alquilo C1-C6 saturado lineal o ramificado; así como todos sus posibles estereoisómeros para su uso en terapia.
- 2. El compuesto de fórmula (I) para su uso según la reivindicación 1 caracterizado porque se selecciona entre los siguientes compuestos:
- 3. Un compuesto de fórmula (I) para su uso según la reivindicación 1 o 2 seleccionado entre los compuestos que tienen las siguientes fórmulas:
- 4. Un compuesto de fórmula (I) para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades relacionadas con el LXR, así como en la prevención y/o el tratamiento de cáncer, enfermedades inflamatorias y/o inmunológicas, melanoma, cáncer de próstata y carcinoma de la piel, enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades metabólicas y enfermedades autoinmunitarias.
- 5. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades relacionadas con el LXR, así como en la prevención y/o el tratamiento de cáncer, enfermedades inflamatorias y/o inmunológicas, melanoma, cáncer de próstata y carcinoma de la piel, enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades metabólicas y enfermedades autoinmunitarias.
- 6. La composición para su uso según la reivindicación 5 que comprende uno o más ingredientes activos adicionales.
- 7. Un compuesto de fórmula (II)en donde R es un grupo acetilo.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP17182811 | 2017-07-24 | ||
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