ES2957209T3 - Polipéptidos inmunogénicos mosaicos del VIH de región conservada - Google Patents
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Abstract
En el presente documento se describen polipéptidos de VIH de región conservada en mosaico y polipéptidos inmunogénicos que incluyen uno o más de los polipéptidos de región conservada en mosaico. En algunas realizaciones, los polipéptidos inmunogénicos se incluyen en una composición inmunogénica, tal como una composición inmunogénica polivalente. También se describen en el presente documento métodos para tratar o inhibir el VIH en un sujeto que incluyen la administración de uno o más de los polipéptidos o composiciones inmunogénicas divulgadas a un sujeto que tiene o está en riesgo de infección por VIH. En algunas realizaciones, los métodos incluyen inducir una respuesta inmune en un sujeto que comprende administrar al sujeto al menos uno de los polipéptidos inmunogénicos divulgados o un ácido nucleico que codifica al menos uno de los polipéptidos inmunogénicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Polipéptidos inmunogénicos mosaicos del VIH de región conservada
CAMPO
Esta divulgación se refiere a polipéptidos inmunogénicos, particularmente polipéptidos que pueden provocar una respuesta inmune al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en un sujeto,
RECONOCIMIENTO DEL APOYO GUBERNAMENTAL
Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno en virtud del Contrato N2DE-AC52-06NA25396 otorgado por el Departamento de Energía de EE,UU, y la subvención número AI100645 de los Institutos Nacionales de Salud, El gobierno tiene ciertos derechos en la invención,
ANTECEDENTES
Se estima que aproximadamente 35 millones de personas en todo el mundo están infectadas con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), Aunque las tasas de infección están disminuyendo, en 2012 alrededor de 2,3 millones de personas se infectaron de nuevo y alrededor de 1,6 millones murieron a causa de enfermedades relacionadas con el SIDA, Por tanto, sigue siendo necesario desarrollar vacunas eficaces para tratar e inhibir la infección por VIH en todo el mundo, Sin embargo, la diversidad viral en el VIH y la aparición de variantes de escape de células T plantean desafíos importantes para el desarrollo de vacunas eficaces contra el VIH, Sampa Santra et al,, Nat, Med, 2010, p324-328 describe vacunas mosaico que provocan respuestas de linfocitos T CD8+ que confieren una cobertura inmune mejorada de diversas cepas de VIH en monos, El documento W02015/148602 A1 describe genes mosaicos del VIH 1 diseñados para inducir respuestas de células T, El documento W 02010/040847 A2 describe un adyuvante específico de inmunógeno para una vacuna o inóculo compuesto por ensamblajes tipo cuerpo de proteína recombinante en partículas (RPBLAs, por sus siglas en inglés) que contienen una proteína de fusión recombinante que contiene dos porciones unidas por péptidos, Letourneau et al,, PLOS One, 10:e984-1 describe un inmunógeno de células T, que es una proteína quimérica que comprende polipéptidos del VIH que induce respuestas de células T,
SUMARIO
En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido inmunogénico aislado que consiste en: SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 8 y 17, para uso en provocar una respuesta inmune al VIH en un sujeto,
En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido inmunogénico que consiste en: SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 8 y 17, para uso en provocar una respuesta inmune al VIH en un sujeto,
En otro aspecto, la invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido inmunogénico que consiste en: SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 8 y 17, para uso en provocar una respuesta inmune al VIH en un sujeto,
En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido inmunogénico aislado que consiste en: SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 8 y 17; o uno o más ácidos nucleicos aislados que codifican un polipéptido inmunogénico que consiste en: SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 8 y 17; o uno o más vectores que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido inmunogénico que consiste en: SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 8 y 17; y un soporte farmacéuticamente aceptable, en donde la composición farmacéutica es para uso en provocar una respuesta inmune al VIH en un sujeto,
En el presente documento se describen polipéptidos de VIH con regiones conservadas en mosaico que pueden provocar una respuesta inmune al VIH (tal como células T citotóxicas (CTL), células T auxiliares y/o respuestas humorales), También se describen en el presente documento polipéptidos inmunogénicos que incluyen uno o más de los polipéptidos de regiones mosaico conservadas, En algunos ejemplos, dos o más de los polipéptidos mosaico de regiones conservadas están incluidos en un polipéptido inmunogénico de fusión (o quimérico), Los polipéptidos inmunogénicos descritos pueden incluirse en una composición inmunogénica, tal como una composición inmunogénica polivalente,
También se describen en el presente documento métodos para tratar o inhibir el VIH en un sujeto que incluyen la administración de uno o más (tal como dos o más) de los polipéptidos o composiciones inmunogénicos descritos a un sujeto infectado con VIH o en riesgo de infección por VIH, También se describen métodos para inducir una respuesta inmune al VIH en un sujeto administrando al sujeto al menos uno (tal como dos o más) de los polipéptidos inmunogénicos o un ácido nucleico que codifica al menos uno de los polipéptidos inmunogénicos descritos en el presente documento,
Lo anterior y otras características de la divulgación resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que procede con referencia a las figuras adjuntas,
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las FIGS. 1A y 1B son conjuntos de gráficos que muestran la cobertura poblacional de epftopos potenciales en Gag, Nef, Pol y Env (FIG. 1A) en el diseño de primera generación o en Gag y Pol (FIG. 1B) en el diseño de segunda generación. Comenzando en cada posición en el alineamiento, la fracción de 9-meros coincidente con uno de los dos candidatos en la población se muestra en negro, y la fracción que solo está separada por un aminoácido se muestra en gris. La fracción que coincide con las dos formas más comunes en esa región se muestra con la línea negra de puntos. Los péptidos que portan epítopos asociados con un buen resultado (carga viral baja) se muestran en barras ligeramente sombreadas en la parte inferior de cada gráfico y aquellos asociados con una carga viral alta se muestran como barras grises sombreadas oscuras (Mothe et al., J. Transí. Med. 9:208, 2011). Las regiones encuadradas muestran las regiones seleccionadas para el polipéptido mosaico de región conservada. Las barras encima de los gráficos muestran las regiones conservadas utilizadas para un diseño descrito anteriormente (Letourneau et al., PLoS One 2:e894, 2007).
Las FIGS. 2A y 2B son conjuntos de gráficos que muestran la cobertura poblacional de epítopos potenciales en Tat, Rev, Vif, Vpr y Vpu (FIG. 2A; diseño de primera generación) o en Tat, Rev, Vif, Vpr, Vpu, Nef y Env (FIG. 2B; diseño de segunda generación), marcado como se describe en las FIGS. 1A y 1B.
Las FIGS. 3A y 3B son pares de gráficos que muestran las ocho regiones incluidas (arriba) y las regiones de VIH excluidas (abajo) en el diseño de primera generación (FIG. 3A) y el diseño de segunda generación (FIG. 3B), marcados como se describe en las FIGS. 1A y 1B.
Las FIGS. 4A y 4B son pares de gráficos que muestran la frecuencia de respuestas de células T definidas experimentalmente monitorizadas en la base de datos de VIH. Las regiones en el diseño de primera generación del polipéptido mosaico de región conservada (FIG. 4A) y el diseño de segunda generación (FIG. 4B) están sombreadas. Cada una de las regiones abarca múltiples respuestas de células T que se han detectado en infecciones naturales. Arriba, respuestas de células T citotóxicas (CTL); abajo, respuestas de las células T auxiliares.
LISTADO DE SECUENCIAS
Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos descritas en el presente documento y en el listado de secuencias adjunto se muestran utilizando abreviaturas de letras estándares para bases de nucleótidos y un código de una letra para aminoácidos. Solo se muestra una cadena de cada secuencia de ácido nucleico, pero se entiende que la cadena complementaria está incluida por cualquier referencia a la cadena presentada.
Las SEQ ID NOs: 1-18 son polipéptidos mosaico de región conservada del VIH ejemplares.
Las SEQ ID NOs: 19 y 20 son polipéptidos mosaico de región conservada de Pol adicionales ejemplares.
La SEQ ID NO: 21 es la secuencia de aminoácidos de un péptido conductor activador del plasminógeno tisular.
Las SEQ ID NOs: 22-30 son las secuencias de aminoácidos de la secuencia de referencia HBX2 correspondiente a los péptidos mosaico de región conservada del VIH.
Las SEQ ID NOs: 31-39 son las secuencias de aminoácidos de secuencias consenso de los péptidos mosaico de la región conservada del VIH.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En el presente documento se describen polipéptidos mosaico del VIH que pueden provocar una respuesta inmune al VIH (tales como células T citotóxicas (CTL), células T auxiliares y/o respuestas humorales). Los polipéptidos mosaico descritos incluyen regiones conservadas de tramos de diferentes cepas naturales del VIH, seleccionadas de la base de datos completa de secuencias del VIH de Los Álamos National Laboratory (disponible en la World Wide Web en hiv.lanl.gov) para producir la máxima cobertura de epítopos de la población global de VIH. En particular, los polipéptidos abarcan las regiones más conservadas del proteoma del VIH y forman un mosaico para capturar las variantes más comunes. Dos o más de los polipéptidos mosaico (también denominados "polipéptidos de región conservada" o "polipéptidos mosaico de región conservada ") pueden incluirse en un polipéptido quimérico o de fusión.
Los polipéptidos descritos pueden administrarse a un sujeto para provocar una respuesta inmune al VIH. Los polipéptidos pueden incluirse en una composición inmunogénica polivalente que incluye dos o más de los polipéptidos mosaico de región conservada descritos. Estas composiciones polivalentes están diseñadas para capturar las variantes más comunes de fragmentos de longitud de epítopo. Estudios anteriores indican que las proteínas mosaico de longitud completa pueden provocar respuestas de células T que generan más respuestas que reconocen de forma cruzada cepas naturales (mayor amplitud) y respuestas que reconocen más variantes naturales por respuesta (mayor profundidad) que las composiciones inmunogénicas del VIH anteriores. (Santra et al., Nat. Med. 16:324-328, 2010). Los polipéptidos mosaicos descritos se centran en las regiones conservadas, para generar una respuesta inmune más eficaz y centrada.
I. Términos y Expresiones
A menos que se indique lo contrario, las expresiones y Ios términos técnicos se utilizan de acuerdo con el uso convencional. Las definiciones de términos comunes en biología molecular se pueden encontrar en Benjamin Lewin, Genes VII, publicado por Oxford University Press, 1999; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada por Blackwell Science Ltd., 1994; y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995; y otras referencias similares.
Tal como se utilizan en este documento, las formas en singular "un", "una" y "el", "la" se refieren tanto al singular como al plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión "un antígeno" incluye antígenos simples o plurales y puede considerarse equivalente a la expresión "al menos un antígeno". Tal como se utiliza en el presente documento, el término "comprende" significa "incluye". Por tanto, "que comprende un antígeno" significa "que incluye un antígeno" sin excluir otros elementos.
Debe entenderse además que todos y cada uno de los tamaños de bases o aminoácidos, y todos los pesos moleculares o valores de masa molecular dados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados y se proporcionan con fines descriptivos, a menos que se indique lo contrario. Aunque se pueden usar muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, más adelante se describen métodos y materiales particularmente adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las explicaciones de los términos y expresiones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Para facilitar la revisión de las diversas realizaciones de la divulgación, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos:
Adyuvante:Un vehículo o composición usado para mejorar la antigenicidad. Adyuvantes incluyen una suspensión de minerales (alumbre, hidróxido de aluminio o fosfato) en donde se adsorbe el antígeno; o emulsión de agua en aceite en donde la solución de antígeno se emulsiona en aceite mineral (adyuvante incompleto de Freund), a veces con la inclusión de micobacterias muertas (adyuvante completo de Freund) para potenciar aún más la antigenicidad (inhibe la degradación del antígeno y/o provoca la entrada de macrófagos). Los oligonucleótidos inmunoestimulantes (tales como los que incluyen un motivo CpG) también se pueden usar como adyuvantes (por ejemplo, véanse la Patente de EE.UU. N26.194.388; la Patente de EE.UU. N26.207.646; la Patente de EE.UU. N26.214.806; la Patente de EE.UU N26.218.371; la Patente de EE.UU. 26.239.116; la Patente de EE.UU. N26.339.068; la Patente de EE.UU. N26.406.705; y la Patente de EE.UU. N26.429.199). Adyuvantes incluyen moléculas biológicas (un "adyuvante biológico"), tales como moléculas co-estimulantes. Adyuvantes ejemplares incluyen IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-a, |Fn -y, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L y 41 BBL. Los adyuvantes se pueden usar en combinación con los polipéptidos de región conservada y polipéptidos quiméricos inmunogénicos descritos.
Administración:La introducción de una composición en un sujeto por una vía elegida. Por ejemplo, si la vía elegida es intravenosa, la composición (tal como un antígeno descrito) se administra introduciendo la composición por vía intramuscular en un sujeto.
Antígeno:Un compuesto, una composición o sustancia que puede estimular la producción de anticuerpos o una respuesta de células T en un sujeto, incluidas composiciones que se inyectan o absorben en un sujeto. Un antígeno reacciona con los productos de inmunidad humoral o celular específica, incluidos aquellos inducidos por antígenos heterólogos, tales como los antígenos descritos. "Epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a la región de un antígeno a la que responden las células B y/o T. Las células T pueden responder al epítopo cuando el epítopo se presenta junto con una molécula de M<h>C. Los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como a partir de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos son retenidos típicamente tras la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario se pierden típicamente durante el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo incluye típicamente al menos 3, y más habitualmente, al menos 5, aproximadamente 9 o aproximadamente 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Métodos para determinar la conformación espacial de epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear.
Ejemplos de antígenos incluyen, pero no se limitan a péptidos, lípidos, polisacáridos y ácidos nucleicos que contienen determinantes antigénicos, tales como los reconocidos por una célula inmunitaria. En algunos ejemplos, los antígenos incluyen péptidos derivados de un patógeno de interés. Patógenos ejemplares incluyen bacterias, hongos, virus y parásitos. En ejemplos específicos, un antígeno deriva del VIH, por ejemplo, uno o más polipéptidos del VIH o un fragmento de los mismos, tal como al menos una porción de una proteína Env, Gag o Pol.
Polipéptido de fusión (o quimérico):Un polipéptido que incluye dos o más péptidos enlazados para producir una única cadena polipeptídica, tal como una cadena polipeptídica de origen no natural. En algunos ejemplos, el polipéptido de fusión (también denominado en el presente documento polipéptido quimérico) incluye dos o más péptidos que están directamente enlazados mediante un enlace peptídico. En otros ejemplos, el polipéptido de fusión incluye dos o más péptidos que están enlazados indirectamente (por ejemplo, mediante un enlazador intermedio).
Sistema de numeración HXB2:Un sistema de numeración de referencia para secuencias de proteínas y ácidos nucleicos del VIH (Korber et al., Human Retroviruses and AIDS 1998: A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences. Korber B, Kuiken CL, Foley B, Hahn B, McCutchan F, Mellors JW, y Sodroski J, Eds.; Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad). El sistema HXB2 utiliza secuencias de la cepa HXB2 del VIH-1 como referencia para todas las demás secuencias de la cepa del VIH. El experto ordinario en la técnica está familiarizado con el sistema de numeración HXB2. HXB2 también se conoce como: HXBc2, para el clon 2 de HXB; HXB2R, en la base de datos de VIH de Los Alamos, con la R de revisado, ya que fue ligeramente revisado en relación con la secuencia HXB2 original; y HXB2CG en la base de datos NCBI GenBank, para el genoma completo de HXB2. La numeración utilizada en los polipéptidos de inserción de región conservada descritos en el presente documento es relativa al esquema de numeración de HXB2.
Células huésped:Células en las que se puede propagar un virus o vector y expresar su ADN. La célula puede ser procariótica o eucariótica. La expresión también incluye cualquier progenie de la célula huésped en cuestión. Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica a la célula parental, ya que pueden ocurrir mutaciones durante la replicación. Sin embargo, una progenie de este tipo está incluida cuando se utiliza la expresión "célula huésped".
Polipéptido inmunogénico:Una proteína o una porción de la misma que es capaz de inducir una respuesta inmune en un sujeto, tal como un sujeto infectado o en riesgo de infección con un patógeno. La administración de un polipéptido inmunogénico derivado de un patógeno de interés puede inducir una respuesta inmune. La administración de un polipéptido inmunogénico puede conducir, en algunos ejemplos, a inmunidad protectora contra un patógeno de interés. En algunos ejemplos, un polipéptido inmunogénico es un polipéptido que incluye una o más regiones conservadas de un proteoma del VIH, por ejemplo, una proteína quimérica o de fusión que incluye dos o más de los polipéptidos de regiones conservadas del VIH descritos.
Respuesta inmune:Una respuesta de una célula del sistema inmunológico, tal como una célula B, una célula T o un monocito, a un estímulo. En una realización, la respuesta es específica para un antígeno particular (una "respuesta específica de antígeno"). Una respuesta inmune puede ser una respuesta de células T, tal como una respuesta CD4+ o una respuesta CD8+. La respuesta puede ser una respuesta de células B y da como resultado la producción de anticuerpos específicos.
Composición inmunogénica:Una composición que comprende un polipéptido inmunogénico o un ácido nucleico que codifica un polipéptido inmunogénico que induce una respuesta de CTL mensurable contra virus que expresan el polipéptido inmunogénico o una porción del mismo, induce una respuesta de células T auxiliares mensurable o induce una respuesta de células B mensurable (tal como producción de anticuerpos) contra el polipéptido inmunogénico o una porción del mismo. En un ejemplo, una "composición inmunogénica" es una composición que incluye uno o más polipéptidos de regiones conservadas del VIH, tales como las regiones conservadas descritas en el presente documento. Se refiere, además, a ácidos nucleicos aislados que codifican un polipéptido inmunogénico, tal como un ácido nucleico que puede usarse para expresar el polipéptido inmunogénico (y así usarse para provocar una respuesta inmune contra el polipéptido o una porción del mismo).
Para su usoin vitro,una composición inmunogénica puede consistir en al menos un (tal como dos o más) polipéptido, epítopo peptídico o ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido o epítopo peptídico. Para el usoin vivo,la composición inmunogénica incluirá típicamente al menos un (tal como uno, dos, tres, cuatro, cinco o más) polipéptido, péptido o ácido nucleico en soportes farmacéuticamente aceptables, y/u otros agentes (tales como adyuvantes). Cualquier péptido particular, tal como un polipéptido de región conservada descrito o un ácido nucleico que codifica el polipéptido, puede ensayarse fácilmente para determinar su capacidad para inducir una respuesta de CTL, células T auxiliares o células B mediante ensayos reconocidos en la técnica. Las composiciones inmunogénicas pueden incluir adyuvantes, que son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Inhibir o tratar una enfermedad:Inhibir el desarrollo completo de una enfermedad o afección, por ejemplo, en un sujeto que está en riesgo de padecer una enfermedad tal como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), afecciones relacionadas con el SIDA, infección por VIH (tal como infección por VIH-1) o combinaciones del mismo. "Tratamiento" se refiere a una intervención terapéutica que mejora un signo o síntoma de una enfermedad o afección patológica (tal como SIDA o afecciones relacionadas con el SIDA) después de que haya comenzado a desarrollarse. El término "mejorar", con referencia a una enfermedad o afección patológica, se refiere a cualquier efecto beneficioso observable del tratamiento. El efecto beneficioso puede evidenciarse, por ejemplo, mediante un retraso en la aparición de los síntomas clínicos de la enfermedad en un sujeto susceptible, una reducción de la gravedad de algunos o todos los síntomas clínicos de la enfermedad, una progresión más lenta de la enfermedad, una mejora en la salud o bienestar general del sujeto, o por otros parámetros bien conocidos en la técnica que son específicos de la enfermedad particular. Un tratamiento "profiláctico" es un tratamiento administrado a un sujeto que no presenta signos de una enfermedad o que solo muestra signos tempranos de una enfermedad con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar patología.
Aislado:Un componente biológico "aislado" (tal como una proteína, por ejemplo, un polipéptido descrito o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de este tipo) se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos en donde el componente se encuentra de forma natural, tales como otros ADN cromosómicos y extracromosómicos, ARN y proteínas, Las proteínas, péptidos y ácidos nucleicos que han sido "aislados" incluyen proteínas purificadas mediante métodos de purificación estándares, El término también abarca proteínas o péptidos preparados mediante expresión recombinante en una célula huésped, así como proteínas, péptidos y moléculas de ácido nucleico sintetizados químicamente, Aislado no requiere una pureza absoluta, y puede incluir moléculas de proteínas, péptidos o ácidos nucleicos que están al menos en un 50 % aisladas, tales como al menos un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o incluso 99,9 % aislados,
Polipéptido mosaico:Un polipéptido ensamblado a partir de fragmentos de secuencias naturales mediante optimización computacional (p. e j,Fischer et al,, Nat, Med, 13:100-106, 2007), Se utilizan múltiples secuencias (por ejemplo, miles de secuencias) como entrada y las secuencias evolucionan mediante recombinaciónin silico.Los recombinantes están obligados a tener puntos de interrupción naturales y se diseña un conjunto de mosaicos para maximizar la cobertura de epítopos de células T potenciales para una población viral,
Enlazado operativamente:Un primer ácido nucleico está enlazado operativamente con un segundo ácido nucleico cuando el primer ácido nucleico se coloca en una relación funcional con el segundo ácido nucleico, Por ejemplo, un promotor está enlazado operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia codificante, Generalmente, los ácidos nucleicos enlazados operativamente son contiguos y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, están en el mismo marco de lectura, En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos enlazados operativamente son heterólogos, por ejemplo, el primer y segundo ácidos nucleicos son de diferentes organismos, diferentes genes o diferentes polipéptidos y el ácido nucleico resultante no se produce de forma natural,
Soportes farmacéuticamente aceptables:Los soportes farmacéuticamente aceptables útiles en esta divulgación son convencionales, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, The University of the Sciences in Philadelphia, Editor, Lippincott, Williams, & Wilkins, Philadelphia, PA, 21a Edición (2005), describe composiciones y formulaciones adecuadas para la administración farmacéutica de las proteínas, ácidos nucleicos y otras composiciones aquí descritas,
En general, la naturaleza del soporte dependerá del modo particular de administración que se emplee, Por ejemplo, las formulaciones parenterales comprenden habitualmente fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como un vehículo, Para composiciones sólidas, formas de polvo, píldora, tableta o cápsula, soportes sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio, Además de soportes biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas a administrar pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes tamponadores del pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitán,
Polipéptido:Cualquier compuesto formado por aminoácidos, análogos de aminoácidos, unidos químicamente, El término polipéptido como se usa en el presente documento incluye oligómeros de aminoácidos, análogos de aminoácidos o péptidos pequeños y grandes, incluidas proteínas, Cualquier cadena de aminoácidos, independientemente de su longitud o modificación postraduccional (tal como glicosilación o fosforilación), se denomina un polipéptido, El término polipéptido se aplica a polímeros de aminoácidos que incluyen polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural, así como polímeros en donde uno o más residuos de aminoácidos son un aminoácido no natural, por ejemplo, un mimético químico artificial de un correspondiente aminoácido natural, Como se usa en el presente documento, polipéptido también se refiere a polímeros de aminoácidos recombinantes, tales como polímeros que incluyen porciones que se obtienen de diferentes porciones (típicamente no contiguas) de un genoma (tal como un genoma de VIH) y/o se obtienen de diferentes genomas (tales como como dos o más cepas de VIH), Un "residuo" se refiere a un aminoácido o mimético de aminoácido incorporado en un polipéptido mediante un enlace amida o un mimético de enlace amida,
Composición inmunogénica polivalente:Una composición que incluye dos o más polipéptidos inmunogénicos separados (tal como un "cóctel" de polipéptidos inmunogénicos) que son capaces de provocar una respuesta inmune en un sujeto, por ejemplo, una respuesta inmune al VIH, En algunos ejemplos, una composición inmunogénica polivalente incluye dos o más de los polipéptidos mosaico de región conservada descritos (o ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos), En algunos ejemplos, una composición inmunogénica polivalente incluye dos polipéptidos mosaico que se optimizaron computacionalmente para usarse en combinación para proporcionar una cobertura global óptima de variantes de epítopos, En un ejemplo específico, una composición inmunogénica polivalente incluye un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de cada una de las SEQ ID NOs: 1-8 o cada una de las SEQ ID NOs: 1,2, 3, 6, 7, 8 y 17 y un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de cada una de las SEQ ID NOs: 9-16 o cada una de las SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 14, 15, 16 y 18,
Purificado:El término purificado no requiere pureza absoluta; más bien, pretende ser un término relativo. Así, por ejemplo, una proteína purificada es aquella en donde la proteína está más enriquecida que la proteína en su entorno natural dentro de una célula. Preferiblemente, una preparación se purifica de manera que la proteína represente al menos el 50 % del contenido de proteína de la preparación.
Ácido nucleico o polipéptido recombinante:Una molécula de ácido nucleico o polipéptido que no se produce de forma natural o que tiene una secuencia formada por una combinación artificial de dos segmentos de secuencia de nucleótidos o aminoácidos que de otro modo estarían separados. Esta combinación artificial se logra mediante síntesis química o, más comúnmente, mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos.p. e j,mediante técnicas de ingeniería genética como las descritas en Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. El término "recombinante" incluye ácidos nucleicos o polipéptidos que han sido alterados únicamente mediante adición, sustitución o deleción de una porción de una molécula o péptido de ácido nucleico natural.
Identidad/similitud de secuencia:La identidad de secuencia entre dos o más secuencias de ácidos nucleicos o entre dos o más secuencias de aminoácidos se puede medir en términos de porcentaje de identidad; cuanto mayor sea el porcentaje, más idénticas serán las secuencias. Los homólogos u ortólogos de secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos poseen un grado relativamente alto de identidad/similitud de secuencia cuando se alinean usando métodos estándares.
Métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Diversos programas y algoritmos de alineamiento se describen en: Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. Us a 85:2444, 1988; Higgins y Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins y Sharp, c Ab IOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; y Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990, presenta una consideración detallada de los métodos de alineamiento de secuencias y cálculos de homología. La herramienta de búsqueda de alineamiento local básica del NCBI (BLAST, por sus siglas en inglés) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990) está disponible de varias fuentes, incluido el National Center for Biological Information (NCBI, National Library of Medicine, Edificio 38A, Sala 8N805, Bethesda, MD 20894) y en Internet, para su uso en conexión con los programas de análisis de secuencia blastp, blastn , blastx, tblastn y tblastx. Blastn se utiliza para comparar secuencias de ácidos nucleicos, mientras que blastp se utiliza para comparar secuencias de aminoácidos. Se puede encontrar información adicional en el sitio web del NCBI.
En algunos ejemplos, la similitud de secuencia se evalúa mediante la conservación de fragmentos de longitud de epítopo. El uso de esta medida de similitud se desarrolló en Los Alamos National Laboratory y las herramientas están disponibles en la World Wide Web en hiv.lanl.gov.
Sujeto:Organismos vertebrados multicelulares vivos, una categoría que incluye mamíferos tanto humanos como no humanos (incluidos los primates no humanos).
Cantidad terapéuticamente eficazoCantidad eficaz:La cantidad de agente, tal como ácido nucleico, polipéptido u otro agente terapéutico, que es suficiente para prevenir, tratar (incluida la profilaxis), reducir y/o mejorar los síntomas y/o las causas subyacentes de cualquiera de un trastorno o enfermedad, por ejemplo, para prevenir, inhibir y/o tratar el VIH. Una "cantidad eficaz" puede ser suficiente para reducir o eliminar un síntoma de una enfermedad tal como el SIDA. Por ejemplo, dicha cantidad puede ser la cantidad necesaria para inhibir la replicación viral o para alterar de manera mensurable los síntomas externos de la infección viral tal como aumentar el recuento de células T en el caso de una infección por el VIH. En general, esta cantidad será suficiente para inhibir de manera mensurable la replicación o infectividad del virus (por ejemplo, VIH). Un "agente anti-viral" o "fármaco anti-viral" es un agente que inhibe específicamente que un virus se replique o infecte células. De manera similar, un "agente anti-retroviral" es un agente que inhibe específicamente que un retrovirus se replique o infecte células.
Célula T :Un glóbulo blanco fundamental para la respuesta inmune. Las células T incluyen, pero no se limitan a Células T CD4+ y Células T CD8+. Un linfocito T CD4+ es una célula inmunitaria que porta un marcador en su superficie conocido como "grupo de diferenciación 4" (CD4). Estas células, también conocidas como células T auxiliares, ayudan a orquestar la respuesta inmune, incluidas las respuestas de anticuerpos y las respuestas de células T asesinas. Las células T CD8+ portan el marcador "grupo de diferenciación 8" (CD8). Una célula T CD8 puede ser un linfocito T citotóxico (CTL). Una célula CD8 puede ser una célula T supresora.
Transformada:Una célula transformada es una célula en donde se ha introducido una molécula de ácido nucleico mediante técnicas de biología molecular. Tal como se utiliza en el presente documento, el término transformación abarca todas las técnicas mediante las cuales se podría introducir una molécula de ácido nucleico en una célula de este tipo, incluida la transfección con vectores virales, la transformación con vectores plasmídicos y la introducción de ADN mediante electroporación, lipofección y aceleración con pistola de partículas.
Vacuna:Una composición farmacéutica que provoca una respuesta inmune profiláctica o terapéutica en un sujeto. En algunos casos, la respuesta inmune es una respuesta inmune protectora y puede bloquear una infección posterior; en otros casos, puede limitar el impacto patológico de una infección al contenerla. Típicamente, una vacuna provoca una respuesta inmune específica de antígeno a un antígeno de un patógeno, por ejemplo, un patógeno viral, o a un constituyente celular correlacionado con una condición patológica. Una vacuna puede incluir un polinucleótido (tal como un ácido nucleico que codifica un antígeno descrito), un péptido o polipéptido (tal como un antígeno descrito), un virus, una célula o uno o más constituyentes celulares.
Vector:una molécula de ácido nucleico que puede introducirse en una célula huésped, produciendo con ello una célula huésped transformada. Los vectores de ADN recombinante son vectores que tienen ADN recombinante. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permitan replicarse en una célula huésped, tal como un origen de replicación. Un vector también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos conocidos en la técnica. Los vectores virales son vectores de ADN recombinante que tienen al menos algunas secuencias de ácido nucleico derivadas de uno o más virus.
Virus:Un virus consiste esencialmente en un núcleo de ácido nucleico rodeado por una cubierta proteica y tiene la capacidad de replicarse solo dentro de una célula viva. La "replicación viral" es la producción de virus adicional mediante la aparición de al menos un ciclo de vida viral. Un virus puede subvertir las funciones normales de la célula huésped, haciendo que la célula se comporte de una manera determinada por el virus. Por ejemplo, una infección viral puede provocar que una célula produzca una citoquina o responda a una citoquina, cuando la célula no infectada normalmente no lo hace. En algunos ejemplos, un virus es un patógeno.
Los "retrovirus" son virus de ARN en donde el genoma viral es ARN. Cuando una célula huésped se infecta con un retrovirus, el ARN genómico se transcribe de forma inversa en un ADN intermedio que se integra de manera muy eficiente en el ADN cromosómico de las células infectadas. El intermediario de ADN integrado se denomina provirus. El término "lentivirus" se utiliza en su sentido convencional para describir un género de virus que contienen transcriptasa inversa. Los lentivirus incluyen los "virus de inmunodeficiencia" que incluyen el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 1 y tipo 2 (VIH-1 y VIH-2), el virus de inmunodeficiencia de simios (VIS) y el virus de inmunodeficiencia felina (VI F).
El VIH-1 es un retrovirus que causa inmunosupresión en seres humanos (enfermedad por VIH) y conduce a un complejo de enfermedad conocido como síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). "Enfermedad del VIH" se refiere a una constelación bien reconocida de signos y síntomas (incluido el desarrollo de infecciones oportunistas) en personas infectadas por un virus del VIH, según lo determinado mediante estudios de anticuerpos o de transferencia Western o la detección de ácidos nucleicos del VIH. Hallazgos de laboratorio asociados con esta enfermedad incluyen una disminución progresiva de las células T.
II. Descripción de Varias Realizaciones
En el presente documento se describen polipéptidos mosaico de región conservada de proteínas del VIH. Los polipéptidos mosaico de región conservada incluyen regiones de proteínas del VIH (tales como proteínas Gag, Pol y/o Env) que son las más conservadas entre diferentes cepas del VIH. Los polipéptidos mosaico se ensamblan a partir de fragmentos de secuencias naturales mediante un método de optimización computacional (p. ej.,Publicación de Solicitud de Pat. de EE.UU. N22012/0231028). Los polipéptidos mosaico se asemejan a los polipéptidos de proteínas naturales, pero no existen en la naturaleza. Se utilizan miles de secuencias como entrada y las secuencias evolucionan mediante recombinaciónin silico.Los recombinantes están obligados a tener puntos de ruptura naturales, y un conjunto de mosaicos maximizará la cobertura de potenciales epítopos de células T (péptidos de nueve aminoácidos) presentes como variantes para una población viral (tal como el VIH). Se seleccionan combinaciones de mosaicos para dar la cobertura óptima de epítopos potenciales encontrados en secuencias naturales para un número determinado de mosaicos. Los polipéptidos mosaico de región conservada descritos en el presente documento se describen con mayor detalle en la Sección IIA y los Ejemplos 1 y 2.
Los polipéptidos mosaico de región conservada y los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos descritos en el presente documento son capaces de provocar una respuesta inmune al VIH en un sujeto. Se pueden ensamblar dos o más polipéptidos de región conservada (o ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos) en una cadena enlazada (por ejemplo, un polipéptido quimérico o de fusión o un ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico o de fusión). La expresión "polipéptido inmunogénico" se utiliza en el presente documento para referirse a polipéptidos de regiones conservadas individuales, así como a polipéptidos quiméricos o de fusión descritos en el presente documento.
A. Polipéptidos inmunogénicos
Secuencias de aminoácidos ejemplares de polipéptidos mosaico de región conservada de proteínas del VIH diseñadas como se describe en los Ejemplos 1 y 2 incluyen las SEQ ID NOs: 1-18 descritas en el presente documento. En algunos ejemplos, los polipéptidos mosaico de región conservada incluyen, consisten esencialmente en o consisten en una secuencia de aminoácidos al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta como una de las SEQ ID NOs: 1-18, tal como al menos 95 % idéntica, al menos 96 % idéntica, al menos 97 % idéntica, al menos 98 % idéntica, al menos 99 % idéntica o incluso 100 % idéntica a la secuencia expuesta como una de las SEQ ID NOs: 118. La numeración de aminoácidos proporcionada para cada fragmento es con respecto al esquema de numeración de HXB2. La designación "2.1" o "2.2" identifica las dos secuencias de mosaico independientes, que típicamente capturan las variantes más comunes de fragmentos de longitud de epítopo (Tabla 1). Las secuencias de aminoácidos de la secuencia HXB2 correspondiente como comparador para el análisis se proporcionan en el presente documento como SEQ ID NOs : 22-30 y las versiones de consenso (Mcon) para comparaciones de secuencias 2.1 frente a 2.2 se proporcionan en el presente documento como SEQ ID NOs : 31-39.
Tabla 1. Numeración de aminoácidos para péptidos mosaico de región conservada
Un polipéptido inmunogénico puede comprender uno o más (tales como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18) de los polipéptidos mosaico de región conservada descritos (tales como una o más de SEQ ID NOs : 1 18). En algunos ejemplos, dos o más de los polipéptidos mosaico de región conservada están enlazados para formar un único polipéptido inmunogénico (por ejemplo, un polipéptido quimérico o de fusión).
En ejemplos particulares, los dos o más polipéptidos mosaico de región conservada enlazados incluyen dos o más (tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o todas) SEQ ID NOs : 1 -8, o secuencias que tienen al menos un 95 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-8. En un ejemplo, un polipéptido inmunogénico incluye secuencias de aminoácidos que incluyen, que consisten esencialmente en o que consisten en todas las SEQ ID NOs : 1-8. En otro ejemplo particular, Ios dos o más polipéptidos de región conservada enlazados Incluyen dos o más (tales como 2, 3, 4, 5, 6 o todos) de SEQ ID NOs : 1, 2, 3, 6, 7, 8, y 17, o secuencias que tienen al menos un 95 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NOs : 1, 2, 3, 6, 7, 8 y 17. En un ejemplo, un polipéptido inmunogénico incluye secuencias de aminoácidos que incluyen, que consisten esencialmente en o que consisten en todas las SEQ ID NOs : 1,2, 3, 6, 7, 8 y 17. En aún otro ejemplo, Ios dos o más polipéptidos de región conservada enlazados incluyen dos o más (tales como 2, 3, 4, 5 o todas) las SEQ ID NOs : 2, 3, 5, 6, 7, 8 y 17, tal como un polipéptido inmunogénico que incluye secuencias de aminoácidos que incluyen, que consisten esencialmente en<o>que consisten en todas las SEQ ID NOs : 2, 3, 5, 6, 7, 8 y 17.
En otros ejemplos particulares, Ios dos o más polipéptidos de región conservada enlazados incluyen dos o más (tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7 o todas) SEQ ID NOs : 9-16 o secuencias que tienen al menos 95 % identidad a una cualquiera de las SEQ ID NOs : 9-16. En un ejemplo, un polipéptido inmunogénico incluye todas las SEQ ID NOs : 1-9. En otro ejemplo particular, las dos o más regiones conservadas enlazadas incluyen dos o más (tales como 2, 3, 4, 5, 6 o todas) las SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 14, 15, 16 y 18. En un ejemplo, un polipéptido inmunogénico incluye secuencias de aminoácidos que incluyen, que consisten esencialmente en<o>que consisten en todas las SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 14, 15, 16 y 18. En aún otro ejemplo, Ios dos o más polipéptidos de región conservada enlazados incluyen dos o más (tales como 2, 3, 4, 5<o>todos) SEQ ID NO: 10, 11, 14, 15, 16 y 18, tales como un polipéptido inmunogénico que incluye secuencias de aminoácidos que incluyen, que consisten esencialmente en<o>que consisten en todas las SEQ ID NO<s>: 10, 11, 14, 15, 16 y 18.
En algunos ejemplos, un péptido conductor<o>señal está enlazado al polipéptido inmunogénico, por ejemplo, para aumentar la expresión y/o la inmunogenicidad del polipéptido. En un ejemplo, el péptido conductor es un péptido conductor del activador del plasminógeno tisular (tPA), por ejemplo, un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSAR (SEQ ID n O: 21). Un experto en la técnica puede identificar otros péptidos conductores adecuados que pueden usarse para optimizar la expresión de Ios polipéptidos descritos.
L<os>polipéptidos inmunogénicos descritos pueden incluir uno<o>más enlazadores peptídicos, por ejemplo, para unir dos<o>más polipéptidos de región conservada en una única cadena polipeptídica. L<os>péptidos enlazadores son, típicamente, una secuencia corta de aminoácidos que proporciona un conector flexible que permite la unión de polipéptidos, tales como un polipéptido de región conservada, sin alteración de la estructura ni agregación (p. e j,multimerización),<o>actividad del componente polipeptídico. Típicamente, un péptido de enlace lineal consiste en entre dos y 25 aminoácidos. Habitualmente, el péptido de enlace lineal tiene una longitud de entre dos y 15 aminoácidos, aunque en determinadas circunstancias puede tener solo uno tal como, por ejemplo, un único residuo glicina. En un ejemplo, el polipéptido enlazador tiene una longitud de dos a tres aminoácidos, tal como una serina y una arginina,<o>dos residuos serina y un residuo arginina, o dos residuos arginina y un residuo serina, dos glicinas y una serina, dos serinas y una glicina<o>cualquier combinación de I<os>mismos. Un experto ordinario en la técnica puede identificar enlazadores adecuados adicionales. (p. ej.,Chaudhary et al., Nature 339:394-397, 1989).
L<os>polipéptidos de la región conservada pueden incluirse en un polipéptido quimérico<o>de fusión (polipéptido inmunogénico) en un orden seleccionado. En algunos ejemplos, el orden de Ios polipéptidos de la región conservada se selecciona para minimizar las respuestas inmunes dirigidas hacia uniones peptídicas de origen no natural en I<os>polipéptidos de fusión. En la Tabla 2 se muestran órdenes ejemplares de I<os>polipéptidos mosaico de región conservada en un polipéptido de fusión. Sin embargo, estos son solo ejemplos, y el polipéptido inmunogénico puede incluir las secuencias de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs : 1-8 y 17<o>SEQ ID NOs : 1-8 y 17<o>SEQ ID NOs : 9-16 y 18 en cualquier orden.
Tabla 2. Polipéptidos mosaico de fusión de regiones conservadas ejemplares
Los polipéptidos inmunogénicos pueden proporcionarse como conjuntos de polipéptidos inmunogénicos. En un ejemplo, un conjunto de polipéptidos inmunogénicos incluye tHIVconsvI y tHIVconsv2. En otro ejemplo, un conjunto de polipéptidos inmunogénicos incluye tHIVconsv3 y tHIVconsv4. En aún otro ejemplo, un conjunto de polipéptidos inmunogénicos incluye tHIVconsv5 y tHIVconsv6. Los conjuntos de polipéptidos inmunogénicos se pueden administrar a un sujeto (se comenta con más detalle en la Sección III, que figura más adelante). En algunos ejemplos, se incluye un conjunto de polipéptidos inmunogénicos en una composición inmunogénica.
L<os>polipéptidos inmunogénicos descritos en el presente documento pueden sintetizarse químicamente mediante métodos estándares o pueden producirse de forma recombinante, por ejemplo, mediante expresión del polipéptido a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Un procedimiento ejemplar para la producción de polipéptidos se describe en Lu et al., FEBS Lett. 429:31 -35, 1998. También pueden aislarse mediante métodos que incluyen cromatografía preparativa y separaciones inmunológicas.
B. Ácidos Nucleicos
Ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de región conservada descritos (p. ej.SEQ ID NOs : 1-18) y los polipéptidos quiméricos<o>de fusión descritos que incluyen dos<o>más de los polipéptidos de región conservada también se describen en el presente documento. A menos que se especifique lo contrario, un "ácido nucleico que codifica un polipéptido" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y codifican la misma secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido inmunogénico descrito incluye una secuencia de ácido nucleico que está degenerada como resultado del código genético. Hay 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales están especificados por más de un codón. Por lo tanto, se incluyen todas las secuencias de nucleótidos degeneradas siempre que la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos no se modifique. Las secuencias polipeptídicas pueden retrotraducirse a ADN optimizado en codones utilizando métodos estándares.
Los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de región conservada o un polipéptido inmunogénico (tal como un polipéptido quimérico que incluye dos o más de los polipéptidos de región conservada descritos) incluyen un ADN recombinante que se incorpora a un vector, tal como un plásmido<o>virus que se replica de forma autónoma,<o>en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (tal como un ADNc) independiente de otras secuencias. Métodos para la manipulación e inserción de los ácidos nucleicos de esta divulgación en vectores son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sarnbrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989, y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., 1994). Las secuencias de ADN que codifican el polipéptido se pueden expresarin vitro<o>in vivomediante transferencia de ADN a una célula huésped adecuada. La célula puede ser procariótica o eucariótica. En la técnica se conocen métodos de transferencia estable, lo que significa que el ADN extraño se mantiene continuamente en el huésped.
Secuencias de polinucleótidos que codifican los polipéptidos descritos pueden enlazarse operativamente a secuencias de control de la expresión. Una secuencia de control de la expresión enlazada operativamente a una secuencia codificante se liga de manera que la expresión de la secuencia codificante se logre en condiciones compatibles con las secuencias de control de la expresión. Las secuencias de control de la expresión incluyen, pero no se limitan a promotores, potenciadores, terminadores de la transcripción, un codón de inicio (es decir,A<t>G) apropiados delante de un gen que codifica una proteína, señal de corte y empalme para intrones, mantenimiento del marco de lectura correcto de ese gen para permitir la traducción adecuada del ARNm y codones de parada.
L<os>huéspedes pueden incluir organismos microbianos, levaduras, insectos y mamíferos. Métodos para expresar secuencias de ADN que tienen secuencias eucarióticas o virales en procariotas son bien conocidos en la técnica. Ejemplos no limitantes de células huésped adecuadas incluyen bacterias, arqueas, insectos, hongos (por ejemplo, levaduras), células vegetales y animales (por ejemplo, células de mamíferos, tales como células humanas). Células de uso ejemplares incluyenEscherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Salmonella typhimurium,células SF9, células C129,Neurosporay líneas celulares mieloides y linfoides de mamíferos inmortalizadas. Técnicas para la propagación de células de mamíferos en cultivo son bien conocidas (véase, Jakoby y Pastan (eds), 1979, Cell Culture, Methods in Enzymology, volumen 58, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich, N.Y.). Ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos comúnmente utilizadas son células VERO y HeLa, células CHO, células HEK 293 y líneas celulares WI38, BHK y COS, aunque se pueden usar otras líneas celulares, tales como células diseñadas para proporcionar una mayor expresión, patrones de glicosilación deseables u otras características.
Se han construido varios vectores virales que pueden usarse para expresar los polipéptidos descritos, incluido el polioma, p. ej., SV40 (Madzak et al., 1992, J. Gen. Virol., 73:1533-1536); adenovirus (Berkner, 1992, Cur. Top. Microbiol. Immunol., 158:39-6; Berliner et al., 1988, Bio Techniques, 6:616-629; Gorziglia et al., 1992, J. Virol., 66:4407-4412; Quantin et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584; Rosenfeld et al., 1992, Cell, 68:143-155; Wilkinson et al., 1992, Nucl. Acids Res., 20:2233-2239; Stratford-Perricaudet et al., 1990, Hum. Gene Ther., 1:241-256); adenovirus no replicantes de origen chimpancé (ChAdv; Tatsis et al., Gene Ther. 13:421-429, 2006); virus vaccinia (Mackett et al., 1992, Biotechnoligy, 24:495-499); virus vaccinia Ankara modificado (MVA) (Kremer et al., Methods Mol. Biol. 890:59-92, 2012); virus adeno-asociado (Muzyczka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:91-123; On et al., 1990, Gene, 89:279-282); virus del herpes, incluidos HSV y EBV (Margolskee, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:67-90; Johnson et al., 1992, J. Virol., 66:2952-2965; Fink et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3: 11-19; Breakfield et al., 1987, Mol. Neurobiol., 1:337-371; Fresse et al., 1990, Biochem. Pharmacol., 40:2189-2199); virus Sindbis (Herweijer et al., 1995, Human Gene Therapy 6:1161-1167; Pat. de EE.UU. N2s. 5.091.309 y 5.2217.879); alfavirus (Schlesinger, 1993, Trends Biotechnol. 11:18-22; Frolov et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11371-11377); y retrovirus de aves (Brandyopadhyay et al., 1984, Mol. Cell Biol., 4:749-754; Petropouplos et al., 1992, J. Virol., 66:3391 -3397), murino (Miller, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:1-24; Miller et al., 1985, Mol. Cell Biol., 5:431-437; Sorge et al., 1984, Mol. Cell Biol., 4:1730-1737; Mann et al., 1985, J. Virol., 54:401-407), y origen humano (Page et al., 1990, J. Virol., 64:5370-5276; Buchschalcher et al., 1992, J. Virol., 66:2731-2739). Vectores de baculovirus (virus de la poliedrosis multinuclear de Autographa californica; AcMNPV) también se conocen en la técnica y pueden obtenerse de fuentes comerciales (tales como PharMingen, San Diego, Calif.; Protein Sciences Corp., Meriden, Conn.; Stratagene, La Jolla) , Calif.).
III. Métodos Terapéuticos y Composiciones Farmacéuticas
L<os>polipéptidos inmunogénicos descritos en el presente documento (tales como al menos uno de SEQ ID NOs : 1-18 o proteínas de fusión que incluyen dos o más de SEQ ID NOs : 1-18) o ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos inmunogénicos descritos se pueden administrar a un sujeto para provocar una respuesta inmune en el sujeto, tal como una respuesta inmune al VIH. Una composición que incluye uno<o>más de los polipéptidos descritos (<o>uno<o>más ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos descritos) puede administrarse a un sujeto con infección por VIH (por ejemplo, como una inmunización terapéutica)<o>con riesgo de infección por VIH (por ejemplo, como una inmunización protectora), por ejemplo, para tratar<o>inhibir la infección por VIH. La composición puede administrarse a un sujeto como parte de un régimen de inmunización. La composición se puede administrar en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmune al VIH en el sujeto. En algunos ejemplos, la administración de la composición inhibe (o en algunos casos incluso previene) la infección por VIH y/o reduce los signos y síntomas del VIH en un sujeto infectado.
Se pueden administrar al sujeto dos o más de Ios polipéptidos o ácidos nucleicos descritos que codifican Ios polipéptidos. En algunos ejemplos, los métodos incluyen administrar al sujeto al menos dos polipéptidos, cada uno de los cuales incluye la(s) misma(s) región(es) conservada(s) del proteoma del VIH, pero de diferentes cepas del VIH y, por lo tanto, difieren en la secuencia de aminoácidos en uno o más aminoácidos (por ejemplo, una composición inmunogénica polivalente). En un ejemplo particular, los métodos incluyen administrar al sujeto un primer polipéptido inmunogénico que incluye secuencias de aminoácidos que comprenden, que consisten esencialmente en o que consisten en SEQ ID NOs : 1-8 y un segundo polipéptido inmunogénico que incluye secuencias de aminoácidos que comprenden o consisten en SEQ ID NOs : 9-16. En otros ejemplos, los métodos incluyen administrar al sujeto un primer polipéptido inmunogénico que incluye secuencias de aminoácidos que comprenden, que consisten esencialmente en o que consisten en SEQ ID NOs : 1, 2, 3, 6, 7, 8 y 17 y un segundo polipéptido inmunogénico que incluye secuencias de aminoácidos que comprenden, que consisten esencialmente en o que consisten en SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 14, 15, 16 y 18. En un ejemplo, los métodos incluyen administrar al sujeto un primer polipéptido inmunogénico que comprende tHIVconsv1 y un segundo polipéptido inmunogénico que comprende tHIVconsv2. En otro ejemplo, los métodos incluyen administrar al sujeto un primer polipéptido inmunogénico que comprende tHIVconsv3 y un segundo polipéptido inmunogénico que comprende tHIVconsv4. En aún otro ejemplo, los métodos incluyen administrar al sujeto un primer polipéptido inmunogénico que comprende tHIVconsv5 y un segundo polipéptido inmunogénico que comprende tHIVconsv6.
En algunos ejemplos, los dos o más polipéptidos inmunogénicos se administran simultáneamente (por ejemplo, como una mezcla), sustancialmente de manera simultánea (por ejemplo, con unos pocos minutos de diferencia entre sí, tal como con menos de 5 minutos de diferencia entre sí), o secuencialmente (por ejemplo, dentro de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 12 horas, 24 horas o más de diferencia entre sí).
Uno o más de los polipéptidos o ácidos nucleicos descritos que codifican los polipéptidos (incluidos vectores que incluyen el ácido nucleico) se pueden administrar por cualquier medio conocido por un experto en la técnica (véase Banga, "Parenteral Controlled Delivery of Therapeutic Peptides and Proteins," en Therapeutic Peptides and Proteins, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA, 1995) ya sea local o sistémicamente, tal como mediante inyección intramuscular, subcutánea o intravenosa, pero incluso se contempla la administración oral, nasal o anal. La administración puede ser mediante inyección subcutánea o intramuscular. Para extender el tiempo durante el cual los polipéptidos descritos están disponibles para estimular una respuesta, el polipéptido o ácido nucleico que codifica el polipéptido se puede proporcionar como un implante, una inyección oleosa o como un sistema en partículas. El sistema en partículas puede ser una micropartícula, una microcápsula, una microesfera, una nanocápsula o una partícula similar. (Véase,p. e j,Banga,supra).Se ha demostrado que un soporte en partículas basado en un polímero sintético actúa como adyuvante para potenciar la respuesta inmune, además de proporcionar una liberación controlada. Las sales de aluminio también se pueden utilizar como adyuvantes para producir una respuesta inmune.
Opcionalmente, una o más citoquinas, tales como interleuquina (IL)-2, IL-6, IL-12, IL-15, RANTES, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF)-a, interferón (IFN)-a o IFN-y, uno o más factores de crecimiento, tales como GM-CSF o G-CSF, una o más moléculas co-estimulantes, tales como ICAM-1, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2 u otras moléculas relacionadas con B7; una o más moléculas tales como OX-40L o 41 BBL, o combinaciones de estas moléculas, se pueden usar como adyuvantes biológicos (véase, por ejemplo, Salgaller et al., 1998, J. Surg. Oncol. 68(2): 122-38; Lotze et al., 2000, Cáncer J Sci. Am. 6 (Suμl. 1):S61-6; Cao et al., 1998, Stem Cells 16 (Suμl. 1): 251-60; Kuiper et al., 2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465:381-90) con los polipéptidos inmunogénicos descritos. Estas moléculas se pueden administrar sistémicamente (o localmente) al huésped. En varios ejemplos, se administran IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-a, IFN-y, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, B7-1 B.7-2, OX-40L, 41 BBL e ICAM-1.
También se describen en el presente documento composiciones farmacéuticas que incluyen los polipéptidos mosaico de región conservada, polipéptidos quiméricos y/o ácidos nucleicos descritos que codifican los polipéptidos. La composición farmacéutica puede incluir uno o más soportes farmacéuticamente aceptables, adyuvantes (tales como los descritos anteriormente), un detergente estabilizante (tal como detergentes polisorbato 80 (TWEEN® 80), interpolación® 40, Tween® 20, Tween® 60, ZWITTERGENT® 3-12, TEEPOL® HB7 y SPAN® 85, por ejemplo, en una cantidad de aproximadamente 0,05 a 0,5 %, tal como aproximadamente 0,2 %), un agente formador de micelas (tal como PLURONIC® copolímero de bloque L62LF, L101 y L64, polietilenglicol 1000 y TETRONIC® copolímero de bloque 1501, 150R1,701,901, 1301 y 130R1, por ejemplo, entre 0,5 y 10 %, o en una cantidad entre 1,25 y 5 %), y un aceite (escualeno, escualano, eicosano, tetratracontano, glicerol y aceite de cacahuete u otros aceites vegetales, por ejemplo, en una cantidad entre 1 y 10 %, o entre 2,5 y 5 %). La composición farmacéutica puede incluir una mezcla de detergentes estabilizantes, agente formador de micelas y aceite disponible con el nombre de PROVAX® (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA).
Una composición farmacéutica puede incluir un ácido nucleico que codifica un polipéptido descrito. Se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del ácido nucleico a un sujeto para generar una respuesta inmune. El ácido nucleico que codifica un adyuvante biológico (tal como los descritos anteriormente) se puede clonar en el mismo vector que el ácido nucleico que codifica un polipéptido descrito, o los ácidos nucleicos se pueden clonar en uno o más vectores separados para su co-administración. Además, se pueden co-administrar factores inmunomoduladores inespecíficos tales como el bacilo de Calmette-Guérin (BCG) y levamisol.
Un enfoque para la administración de ácidos nucleicos es la inmunización directa con ADN plasmídico, tal como con un plásmido de expresión de mamífero. Como se describió anteriormente, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido inmunogénico descrito se puede colocar bajo el control de un promotor para aumentar la expresión de la molécula. La inmunización mediante construcciones de ácido nucleico es bien conocida en la técnica y se enseña, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N25.643.578 (que describe métodos de inmunización de vertebrados mediante la introducción de ADN que codifica un antígeno deseado para provocar una respuesta humoral o mediada por células) y la Patente de EE,UU, N25.593.972 y la Patente de EE.UU. N25.817.637 (que describen el enlace operativo de una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno a secuencias reguladoras que permiten la expresión). La Patente de EE.UU. N25.880.103 describe varios métodos de suministro de ácidos nucleicos que codifican péptidos inmunogénicos u otros antígenos a un organismo. Los métodos incluyen el suministro liposomal de los ácidos nucleicos (o de los propios péptidos sintéticos) y construcciones inmuno-estimulantes, o ISCOM<s>, estructuras en forma de jaula cargadas negativamente de 30 a 40 nm de tamaño que se forman espontáneamente al mezclar colesterol y Quil A™ (saponina).
En otro enfoque para usar ácidos nucleicos para la inmunización, un polipéptido inmunogénico descrito también puede expresarse mediante huéspedes o vectores virales atenuados o vectores bacterianos. Se pueden usar virus vaccinia recombinantes, virus adeno-asociados (AAV), virus del herpes, retrovirus, citomegalovirus u otros vectores virales (tales como los descritos anteriormente) para expresar el péptido o la proteína. Por ejemplo, vectores de vaccinia y métodos útiles en protocolos de inmunización se describen en la Patente de EE.UU. N24.722.848. BCG (Bacillus Calmette Guerin) proporciona otro vector para la expresión de los péptidos (véase Stover, Nature 351:456-460, 1991).
Un ácido nucleico que codifica un polipéptido inmunogénico descrito puede introducirse directamente en las células. Por ejemplo, el ácido nucleico puede cargarse en microesferas de oro mediante métodos estándares e introducirse en la piel mediante un dispositivo tal como pistola de genes HELIOS™ (Bio-Rad). Los ácidos nucleicos pueden estar "desnudos" y consistir en plásmidos bajo el control de un promotor fuerte. Típicamente, el ADN se inyecta en el músculo, aunque también se puede inyectar directamente en otros sitios.
La cantidad del polipéptido inmunogénico descrito, o molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido inmunogénico, puede variar dependiendo del o de los polipéptidos específicos, de la vía y del protocolo de administración y de la población diana. Cada dosis puede incluir aproximadamente de 1 gg a 1 mg de proteína, tal como de aproximadamente 1 gg a aproximadamente 500 gg, por ejemplo, de aproximadamente 1 gg a aproximadamente 100 gg, o de aproximadamente 1 gg a aproximadamente 50 gg, tal como aproximadamente 1 gg, aproximadamente 2 gg, aproximadamente 5 gg, aproximadamente 10 gg, aproximadamente 15 gg, aproximadamente 20 gg, aproximadamente 25 gg, aproximadamente 30 gg, aproximadamente 40 gg, aproximadamente 50 gg, aproximadamente 75 gg, aproximadamente 100 gg, aproximadamente 200 gg, aproximadamente 300 gg, aproximadamente 400 gg o aproximadamente 500 gg. Se puede determinar una cantidad óptima para una composición particular mediante estudios estándares que implican la observación de títulos de anticuerpos y otras respuestas en sujetos (tales como CTL o respuestas de células T auxiliares).
Los polipéptidos de región conservada o polipéptidos quiméricos y/o ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos descritos se pueden usar en un régimen de inmunización de múltiples etapas. En algunos ejemplos, el régimen incluye administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un primer polipéptido inmunogénico (o mezcla de polipéptidos inmunogénicos) y potenciar la respuesta inmunogénica con un segundo polipéptido inmunogénico (o mezcla de polipéptidos inmunogénicos) después de un período de tiempo apropiado. Este método de provocar una reacción inmunitaria de este tipo se denomina régimen de inmunización "de cebado-refuerzo". Se pueden utilizar diferentes dosis en una serie de inoculaciones secuenciales. Por lo tanto, un médico puede administrar una dosis relativamente grande en una inoculación primaria (cebado) y luego reforzar con dosis relativamente más pequeñas.
En algunos ejemplos, el polipéptido inmunogénico o una mezcla del mismo administrado tanto en la inoculación de cebado como en la de refuerzo es el mismo polipéptido inmunogénico o una mezcla de los mismos. En otros ejemplos, el polipéptido inmunogénico o mezcla del mismo administrado en el refuerzo es diferente del administrado en la inoculación de cebado. Sin estar ligado a teoría alguna, se cree que cambiar el orden de los péptidos en los polipéptidos inmunogénicos para los cebados-refuerzos de vacunas y para el suministro polivalente de los polipéptidos inmunogénicos minimizará las respuestas inmunes dirigidas hacia uniones peptídicas de origen no natural en los polipéptidos de fusión.
Por ejemplo, la composición inmunogénica administrada como cebado podría incluir al menos dos polipéptidos inmunogénicos descritos en el presente documento (tal como un polipéptido inmunogénico que incluye las secuencias de SEQ ID NOs : 1-8, SEQ ID NOs : 1,2, 3, 6, 7, 8 y 17 o SEQ ID No s : 2, 3, 6, 7, 8 y 17, y un polipéptido inmunogénico que incluye las secuencias de SEQ ID n Os : 9-16, SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 14, 15, 16 y 18 o SEQ ID NOs: 10, 11, 14, 15, 16 y 18) y el refuerzo podría incluir dos polipéptidos inmunogénicos diferentes descritos en el presente documento (tal como un polipéptido inmunogénico que incluye las secuencias de SEQ ID NOs: 1-8, SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 6, 7, 8 y 17 o SEQ ID NOs : 2, 3, 6, 7, 8 y 17, en un orden diferente al de polipéptido inmunogénico usado en el cebado; y un polipéptido inmunogénico que incluye las secuencias de SEQ ID NOs: 9-16, SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 14, 15, 16 y 18 o SEQ ID NOs : 10, 11 , 14, 15, 16 y 18, en un orden diferente al del polipéptido inmunogénico utilizado en el cebado). En otros ejemplos, el cebado podría incluir un polipéptido inmunogénico que incluye las secuencias de SEQ ID NOs: 1-8 y un polipéptido ¡nmunogénico que incluye las secuencias de SEQ ID NOs : 9-16 y el refuerzo podría incluir un polipéptido ¡nmunogénico que incluye las secuencias de SEQ ID NOs : 1, 2, 3, 6, 7, 8 y 17 y un polipéptido ¡nmunogénico que incluye SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 14, 15, 16 y 18, o viceversa. En un ejemplo de un régimen de cebado-refuerzo, la combinación polivalente de tHIVconsv1 y tHIVconsv2 se administra como cebado inicial, y los refuerzos en serie se administran como tHIVconsv3 y tHIVconsv4 y, en algunos ejemplos, seguidos de tHIVconsv5 y tHIVconsv6. Un experto en la técnica entenderá que estas combinaciones son solo ejemplos, y que también se pueden usar combinaciones adicionales de polipéptidos inmunogénicos y diferentes órdenes de los polipéptidos en los polipéptidos de fusión.
El cebado se puede administrar como una dosis única o dosis múltiples, por ejemplo, se pueden administrar dos dosis, tres dosis, cuatro dosis, cinco dosis, seis dosis o más a un sujeto durante días, semanas o meses. El refuerzo se puede administrar como una dosis única o dosis múltiples, por ejemplo, de dos a seis dosis, o se pueden administrar más a un sujeto durante un día, una semana o meses. También se pueden dar múltiples refuerzos, tal como uno a cinco o más. Se pueden utilizar diferentes dosis en una serie de inoculaciones secuenciales. Por ejemplo, una dosis relativamente grande en una inoculación primaria y luego un refuerzo con dosis relativamente más pequeñas. Se puede generar una respuesta inmune contra uno o más de los polipéptidos de la región conservada mediante una o más inoculaciones de un sujeto con una composición inmunogénica descrita en el presente documento.
La presente divulgación se ¡lustra mediante los siguientes Ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Diseño de Mosaico de Región Conservada de Primera Generación
Este ejemplo describe el diseño y la selección de inserciones para una primera generación de polipéptidos mosaico de región conservada.
Alineamientos del grupo M del VIH-1 que contienen una secuencia por persona (hay miles de secuencias disponibles para cada proteína en este conjunto, tomadas de muestras de todo el mundo) se obtuvieron de la base de datos de Los Alamos (disponible en la World Wide Web en hiv.lanl .gov). Se realizó un diseño optimizado de dos mosaicos para cada una de las proteínas del VIH. Se representó gráficamente la cobertura de cada 9-meros en cada alineamiento de proteínas mediante la combinación de vacunas mosaico. Se seleccionó una longitud total de 800-900 aminoácidos para el polipéptido basándose en la capacidad de los vectores genéticos de vacunas utilizados actualmente. Se seleccionó un límite de cobertura de población del 80 % mediante el diseño de dos mosaicos para definir las regiones más conservadas que llenan la restricción de espacio de 800-900 aminoácidos (FIGS. 1A y 2A). La cobertura del 80 % permite una discrepancia de 8/9 entre la inserción seleccionada y el epítopo potencial. Se calculó la frecuencia de variantes globales de cada uno de los epítopos potenciales (cobertura de 9-meros) que coincidían perfectamente con uno de los dos mosaicos o estaban desviados en un aminoácido en comparación con los dos mosaicos.
Para determinar los puntos de ruptura precisos de cada región conservada mostrada en la FIG. 1A, se calculó la frecuencia de cada aminoácido en los alineamientos de proteínas de la base de datos y, utilizando esta información, se definieron los puntos de transición precisos entre las regiones conservadas y variables (representados en las figuras de cobertura de epítopos potenciales; FIGS. 1A y 2A). Trabajos anteriores han descrito epítopos que tenían respuestas ventajosas, en términos de estar asociados con cargas virales más bajas en la infección natural, y epítopos que eran desventajosos y estaban asociados con cargas virales más altas (Motheet al., J. Transí. Med.9:208, 2011). Aunque los péptidos asociados con el control viral están significativamente más conservados que los asociados con una viremia alta, estas buenas respuestas no siempre se centran en los tramos más conservados de las proteínas. Otra interpretación de estos datos es que las respuestas a algunas proteínas son buenas (p. ej.,Gag) y otros no son buenas (p. ej.,Env), y es la proteína, más que el nivel de conservación, lo que impulsa las respuestas buenas frente a malas. En vista de esto, el diseño abarcó regiones en donde la cobertura cayó por debajo del 80 % durante un período muy corto si, al incluir estos tramos, se pudieran abarcar más regiones de respuesta favorable. Los péptidos asociados con respuestas favorables se representan como cuadros sombreados en las FIGS. 1A, 2A y 3A, y aquellos asociados con respuestas negativas se representan en gris claro. Además, cada una de las regiones conservadas se seleccionó para abarcar epítopos que se observan en la infección natural (FIG. 4A), para garantizar que no se seleccionaran regiones que están inmunosuprimidas.
La estrategia de diseño incluía originalmente el requisito de que cada región conservada tuviera al menos 30 aminoácidos de longitud para su inclusión. Sin embargo, como este límite se seleccionó arbitrariamente, se hizo una excepción para un fragmento de 29 aminoácidos en Pol que está altamente conservado y contiene un epítopo favorable.
Se ha observado previamente que se pueden provocar respuestas inmunes a dominios de unión (lugares donde dos fragmentos conservados se unen creando epítopos potenciales que no ocurren de forma natural). Para minimizar el impacto de dichas regiones, el diseño abarcó regiones cortas (por ejemplo, una o unas pocas posiciones) que introducen variabilidad, con el fin de generar fragmentos algo más largos y reducir el número total de fragmentos para su inclusión en el polipéptido.
La longitud total de los fragmentos seleccionados fue de 844 aminoácidos, que es aproximadamente el 30 % del proteoma viral, Las regiones seleccionadas incluyen una región Env (SEQ ID NOs : 1 y 9), que contiene el tramo más conservado de Env en gp41 (por ejemplo, para proporcionar ayuda a las células T), dos regiones en Gag (SEQ ID NOs : 2, 3, 10 y 11) incluyendo la totalidad de p24, que se reconoce de manera muy intensa en la infección natural, y cinco regiones en Pol (SEQ ID NOs : 4-8 y 12-16) que se reconocen menos intensamente en la infección natural pero que están altamente conservadas, La región Env seleccionada está cerca del comienzo de gp41 y abarca el péptido de Avery, el péptido de fusión y la secuencia tipo cremallera de leucina/isoleucina, La primera región Gag incluye casi la totalidad de p24, La segunda región Gag está en p15 e incluye algunas variaciones, pero abarca un epítopo "bueno", La primera región Pol seleccionada tiene regiones intermitentes en donde la cobertura cae para los dos mosaicos, pero las regiones son cortas, por lo que no se espera que alteren los tramos muy conservados más que los dominios de unión, La región Pol seleccionada también abarca algunos de los epítopos que se han identificado previamente como asociados con un buen resultado (Mothe et al,, J, Transí, Med, 9:208, 2011), La segunda región Pol es corta, pero está altamente conservada y también abarca epítopos asociados con buenos resultados (Id,),
Ejemplo 2
Diseño de Mosaico de Región Conservada de Segunda Generación
Este ejemplo describe el diseño y la selección de las inserciones para una segunda generación de polipéptidos mosaico de región conservada,
El diseño y la selección de los polipéptidos mosaicos de regiones conservadas de segunda generación fueron como se describe en el Ejemplo 1, En esta segunda generación, se utilizó una única región (SEQ ID NOs : 17 y 18) que abarca las regiones Pol 1 y 2 del primer diseño (SEQ ID NOs : 4, 5, 12 y 13) (FIGS, 1B, 2B, 3B y 4B). Esta región abarca completamente la región entre el inicio de la región Pol 1 del diseño de primera generación y se extiende ligeramente más allá del final de la región Pol 2 del diseño de segunda generación y reemplaza estos dos polipéptidos (SEQ ID NOs : 4, 5, 12 y 13), Esto incluye una mayor extensión de regiones bastante conservadas y abarca dos péptidos adicionales (KNPEIVIYQYMDDLYV (SEQ ID NO: 19) y VIYQYMDDLYVGSDL (SEQ ID NO: 20)) que previamente han demostrado ser bastante reactivos (Letourneau et al,, PLoS One 2:e894, 2007), El primer péptido adicional (SEQ ID NO: 19) abarca una región algo variable y ambos están incorporados en un péptido que era un objetivo de CTL previamente asociado con una mayor carga viral (Mothe et al,, J, Transí, Med, 9:208, 2011), Sin embargo, la inclusión de la región conservada adicional indica que la región Pol 1/2 expandida puede usarse en la composición inmunogénica, La inclusión de la región conservada más larga eleva la longitud total del polipéptido quimérico a más de 900 aminoácidos, Con el fin de reducir la longitud del polipéptido quimérico a menos de 900 aminoácidos, el polipéptido mosaico Env original (SEQ ID NOs : 1 y 9) no se incluyó en la selección final de polipéptidos para su inclusión en el diseño, Los polipéptidos mosaico de región conservada restantes del diseño de primera generación se conservaron en el diseño de segunda generación,
Ejemplo 3
Inmunización de animales
Este ejemplo describe procedimientos ejemplares para la inmunización de animales con los polipéptidos inmunogénicos descritos, Aunque se proporcionan métodos particulares, un experto ordinario en la técnica apreciará que también se pueden utilizar métodos adicionales o variaciones de los métodos descritos,
En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos inmunogénicos descritos se clonan en un plásmido o un vector viral (tal como un vector adenoviral o un vector del virus vaccinia Ankara modificado), A los animales de estudio (por ejemplo, ratones o monos) se les administra por vía intramuscular un plásmido o un ácido nucleico de vector viral, Se pueden administrar cantidades variables del ácido nucleico, por ejemplo, para testar una cantidad óptimamente eficaz,
En otros ejemplos, las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos inmunogénicos descritos se clonan en un vector de expresión y se expresan en una célula huésped, Los polipéptidos se purifican usando métodos estándares, A los animales del estudio (por ejemplo, ratones o monos) se les administran los polipéptidos por vía intramuscular o subcutánea, Se administran dosis variables para determinar cantidades óptimas para provocar una respuesta inmune,
Se evalúan las respuestas inmunes provocadas por los polipéptidos inmunogénicos administrados (o ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos), Por ejemplo, las respuestas inmunes celulares se evalúan usando ensayos de citoquinas y/o ensayos ELISPOT de interferón-Y, Las respuestas inmunes humorales se evalúan mediante ELISA directo utilizando una o más proteínas del VIH (tal como Env), También se usan ensayos de neutralización (por ejemplo, un ensayo de neutralización de pseudovirus basado en luciferasa) para evaluar las respuestas inmunes humorales,
Ejemplo 4
Tratamiento del VIH en un sujeto
Este ejemplo describe métodos ejemplares para tratar o Inhibir una Infección por VIH en un sujeto, tal como un sujeto humano, mediante la administración de uno o más de los polipéptidos inmunogénicos o uno o más ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos inmunogénicos descritos en el presente documento. Aunque se proporcionan métodos, dosis y modos de administración particulares, un experto en la técnica apreciará que se pueden realizar variaciones sin afectar sustancialmente el tratamiento.
Brevemente, el método incluye examinar a los sujetos para determinar si tienen VIH, tal como VIH-1 o VIH-2. Los sujetos que tienen VIH se seleccionan para recibir tratamiento adicional. En un ejemplo, se seleccionan sujetos que tienen niveles elevados de anticuerpos contra el VIH en su sangre, como se detecta con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, transferencia Western, ensayo de inmunofluorescencia o prueba de ácido nucleico, incluidos métodos de amplificación de ARN viral o ADN proviral. En un ejemplo, la mitad de los sujetos siguen el protocolo establecido para el tratamiento del VIH (como una terapia antirretroviral de gran actividad). La otra mitad sigue el protocolo establecido para el tratamiento del VIH (tal como el tratamiento con compuestos antirretrovirales altamente activos) en combinación con la administración de los agentes que incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido inmunogénico descrito que induce una respuesta inmune al VIH. Sin embargo, no se requiere una selección previa antes de la administración de las composiciones terapéuticas descritas en el presente documento.
En ejemplos particulares, el sujeto se trata antes del diagnóstico de SIDA con la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los polipéptidos inmunogénicos descritos. En algunos ejemplos, el sujeto se trata con un protocolo establecido para el tratamiento del SIDA (tal como una terapia antirretroviral altamente activa) antes del tratamiento con la administración de un agente terapéutico que incluye uno o más de los polipéptidos inmunogénicos descritos. Sin embargo, este tratamiento previo no siempre es necesario y puede ser determinado por un médico experto.
Después de la selección, una cantidad eficaz de uno o más (tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más) polipéptidos inmunogénicos descritos en el presente documento, o uno o más (tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más) ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos inmunogénicos descritos se administran al sujeto (tal como un ser humano adulto o un recién nacido en riesgo de contraer VIH o que se sabe que está infectado con VIH). También se pueden administrar al sujeto agentes adicionales, tales como agentes antivirales, simultáneamente o antes o después de la administración de los agentes descritos. La administración se puede lograr mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como administración oral, inhalación, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea.
La cantidad de composición inmunogénica administrada para prevenir, reducir, inhibir y/o tratar el VIH o una afección asociada con él depende del sujeto que se está tratando, la gravedad del trastorno y la forma de administración de la composición inmunogénica. Idealmente, una cantidad eficaz de la composición inmunogénica es una cantidad suficiente para prevenir, reducir y/o inhibir y/o tratar la afección (por ejemplo, VIH) en un sujeto sin causar un efecto citotóxico sustancial en el sujeto. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente una cantidad eficaz, por ejemplo, utilizando ensayos de rutina que establezcan curvas de respuesta a la dosis. Además, anteriormente se proporcionan dosificaciones ejemplares particulares. Las composiciones se pueden administrar en un suministro de dosis única,a través desuministro continuo durante un período de tiempo prolongado, en un protocolo de administración repetida (por ejemplo, mediante un protocolo de administración repetida diaria, semanal o mensual). En un ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido descrito que induce una respuesta inmune al VIH se administra por vía intravenosa o intramuscular a un ser humano. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un soporte farmacéuticamente aceptable. Las composiciones inmunogénicas se pueden administrar a largo plazo (por ejemplo, durante un período de meses o años).
Después de la administración de una o más terapias, se puede controlar a los sujetos que tienen VIH (por ejemplo, VIH-1 o VIH-2) para detectar reducciones en los niveles de VIH, aumentos en el recuento de células T CD4+ de un sujeto o reducciones en uno o más síntomas clínicos asociados con la infección por VIH. En ejemplos particulares, los sujetos se analizan una o más veces, comenzando 7 días después del tratamiento. Los sujetos pueden controlarse utilizando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se pueden obtener muestras biológicas del sujeto, incluida sangre, y evaluar las alteraciones en los niveles de VIH o células T CD4+.
En ejemplos particulares, si los sujetos están estables o tienen una respuesta menor, mixta o parcial al tratamiento, se les puede volver a tratar después de la re-evaluación con el mismo programa o uno diferente y/o preparación de agentes que recibieron previamente la cantidad deseada de tiempo, incluida la duración de la vida de un sujeto. Una respuesta parcial es una reducción, tal como una reducción de al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 % o al menos un 70 % de la carga viral del VIH, la replicación del VIH o una combinación de los mismos. Una respuesta parcial también puede ser un aumento en el recuento de células T CD4+, tal como al menos 350 células T por microlitro.
Ejemplo 5
Tratamiento de Sujetos
Este ejemplo describe métodos ejemplares que se pueden usar para tratar a un sujeto que tiene o está en riesgo de tener una infección por VIH que puede tratarse provocando una respuesta inmune, tal como una respuesta de anticuerpos neutralizantes al VIH. Aunque se proporcionan métodos, dosis y modos de administración particulares, un experto en la técnica apreciará que se pueden realizar variaciones sin afectar sustancialmente el tratamiento.
En ejemplos particulares, el método incluye examinar a un sujeto que tiene, se cree que tiene o está en riesgo de tener una infección por VIH. Se pueden examinar sujetos con un estado de infección desconocido para determinar si tienen una infección, por ejemplo, usando pruebas serológicas, examen físico, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), detección radiológica u otra técnica de diagnóstico conocida por los expertos en la técnica. En algunos ejemplos, los sujetos son examinados para identificar una infección por VIH, con un test serológico o con una sonda de ácido nucleico específica para un VIH. A los sujetos que se encuentra que tienen (o se sabe que tienen) una infección por VIH se les puede administrar uno o más polipéptidos inmunogénicos descritos. También se pueden seleccionar sujetos que estén en riesgo de desarrollar VIH, por ejemplo, sujetos expuestos al VIH.
A los sujetos seleccionados para el tratamiento se les puede administrar una cantidad eficaz de los polipéptidos inmunogénicos descritos o ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos inmunogénicos descritos. La dosis particular puede ser determinada por un médico experto. Los polipéptidos (o ácidos nucleicos) se pueden administrar en una o varias dosis, por ejemplo, de forma continua, diaria, semanal o mensual. Cuando se administra secuencialmente, el tiempo que separa la administración de las dosis de los polipéptidos inmunogénicos puede ser de segundos, minutos, horas, días o incluso semanas.
Los sujetos se someten periódicamente a pruebas para detectar la presencia de VIH o anticuerpos contra el VIH en la sangre, según se detecta con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, transferencia Western, ensayo de inmunofluorescencia o test de ácido nucleico, incluidos métodos de amplificación de ARN viral o ADN proviral.
Las referencias a los métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía o métodos de diagnóstico in vivo en los ejemplos descritos en el presente documento deben interpretarse como referencias a compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en esos métodos.
Claims (7)
1. Un polipéptido ¡nmunogénico aislado que consiste en: SEQ ID NOs : 2, 3, 6, 7, 8 y 17, para uso en provocar una respuesta inmune al VIH en un sujeto.
2. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido ¡nmunogénico que consiste en: SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 8 y 17, para uso en provocar una respuesta inmune al VIH en un sujeto.
3. El ácido nucleico aislado para uso de la reivindicación 2, enlazado operativamente a un promotor.
4. El ácido nucleico aislado para uso de la reivindicación 2 o la reivindicación 3, enlazado operativamente a un ácido nucleico que codifica un péptido conductor.
5. Un vector que comprende un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido ¡nmunogénico que consiste en: SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 8 y 17, para uso en provocar una respuesta inmune al VIH en un sujeto.
6. Una composición farmacéutica que comprende:
un polipéptido ¡nmunogénico aislado que consiste en: SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 8 y 17;
o
uno o más ácidos nucleicos aislados que codifican un polipéptido inmunogénico que consiste en: SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 8 y 17; o
uno o más vectores que comprenden un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido ¡nmunogénico aislado que consiste en: SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 8 y 17; y
un soporte farmacéuticamente aceptable, en donde la composición farmacéutica se utiliza para provocar una respuesta inmune al VIH en un sujeto.
7. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 6, que comprende, además, uno o más de un adyuvante, un detergente, un agente formador de micelas y un aceite.
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