ES2955984T3 - Factor de diferenciación de crecimiento 15 como biomarcador para metformina - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a metformina para su uso en el tratamiento de un paciente, en donde el paciente presenta un nivel aumentado de GDF15 en respuesta al tratamiento con metformina; a métodos para identificar un paciente que se beneficiará o no del tratamiento con metformina; métodos para tratar a un paciente con riesgo de desarrollar o sufrir una enfermedad o trastorno que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de metformina; métodos para adaptar la dosis de metformina; el uso de GDF15 como biomarcador para identificar un paciente que se beneficiará o no del tratamiento con metformina, kits para usar en la identificación de un paciente que se beneficiará del tratamiento con metformina y el uso de los kits, así como métodos para tratar a un paciente o que no se beneficiarán del tratamiento con metformina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Factor de diferenciación de crecimiento 15 como biomarcador para metformina
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende metformina y al menos un vehículo, adyuvante y/o excipiente farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de diabetes mellitus de tipo II en un paciente; a un método de identificación de un paciente con diabetes mellitus de tipo II que se beneficiará del tratamiento con metformina; a un método de identificación de un paciente con diabetes mellitus de tipo II que no se beneficiará del tratamiento con metformina y al uso de GDF15, o una variante funcional del mismo, como biomarcador para identificar un paciente con diabetes mellitus de tipo II que se beneficiará del tratamiento con metformina.
Antecedentes
La metformina es actualmente el hipoglucemiante más ampliamente usado en el mundo. Se ha estudiado extensamente en tanto modelos animales como en seres humanos y tiene varias propiedades clínicas y bioquímicas. Los ensayos clínicos han mostrado clara y reproduciblemente que reduce eficazmente los niveles de glucosa y se ha usado para ese fin desde 1957. También han mostrado que su efecto metabólico no se limita a personas con diabetes. Así, varios ensayos han mostrado que reduce modestamente el peso, y reduce eficazmente la progresión de disglucemia desde intolerancia a la glucosa a diabetes12. Otra investigación ha indicado fuertemente que puede reducir la incidencia de enfermedad cardíaca isquémica y la mortalidad tanto en participantes ambulatorios como en aquellos con otras enfermedades, y ha aumentado la posibilidad de que pueda reducir el desarrollo o la progresión de una variedad de tumores malignos34, así como aumentar la esperanza de vida373839 De hecho, más de 1500 ensayos clínicos que implican a la metformina están actualmente en curso en muchos tipos diferentes de enfermedades (www.clinicaltrials.gov).
Las anteriores propiedades clínicas del fármaco han suscitado un intenso interés durante más de 70 años. Es, por lo tanto, sorprendente que gran parte de su mecanismo de acción siga siendo desconocido. Estudios clínicos han mostrado que el mecanismo primario por el que la metformina reduce el azúcar en sangre es mediante reducciones en la producción de glucosa hepática ya sea directamente o potenciando los efectos de las insulinas. Bioquímicamente, existe una evidencia cada vez mayor de que la metformina provoca sus efectos terapéuticos a través de la alteración de la función mitocondrial6-8 y la activación de la proteína cinasa activada por AMP —una molécula crucial que regula el equilibrio de la energía celular y también inhibe la inflamación y mejora la acción de la insulina910. A pesar de este conjunto de investigaciones, es particularmente interesante que aparte de la glucosa y la glucohemoglobina, no se ha identificado biomarcador fiable para la presencia o dosis de metformina. Esto limita claramente la capacidad para evaluar los efectos de la metformina en personas con homeostasis normal de la glucosa. Además, actualmente se necesitan meses para descubrir (por ejemplo, por reducción de HbA1 c) si el tratamiento con metformina es en realidad beneficioso para un paciente, es decir, para determinar si un paciente responde a la metformina. Debido al bajo ritmo de renovación de eritrocitos, que son la base de las mediciones de HbA1c, se necesitan 3-6 meses para determinar si el tratamiento con metformina es satisfactorio o no en un paciente particular. Durante este periodo de tiempo de si un paciente es sensible o no al tratamiento con metformina, el paciente que no responde al tratamiento con metformina sigue básicamente sin tratamiento. Durante este largo periodo que no está tratándose, pueden ocurrir efectos perjudiciales adicionales en el paciente, tales como complicaciones microvasculares, que incluyen nefropatía diabética, retinopatía y úlceras en los pies, así como complicaciones macrovasculares que incluyen infarto de miocardio y muerte cardiovascular. Así, sería altamente deseable reducir el tiempo de diagnóstico de la eficacia del tratamiento con metformina para garantizar que los pacientes que no responden al tratamiento con metformina puedan obtener un tratamiento alternativo más adecuado tan pronto como sea posible. Además, dicha disminución en el tiempo de diagnóstico de la eficacia del tratamiento con metformina también reduce los costes sanitarios, ya que los pacientes que no responden al tratamiento con metformina no necesitan ser tratados con metformina durante meses sin efecto, dando como resultado la reducción del coste del tratamiento con metformina y la reducción de costes para el tratamiento de las complicaciones de seguimiento debido a una terapia tardía con un tratamiento alternativo más adecuado.
Williams et al. (J Health Care Poor Underserved., 2013, 24(10): 93-103) desvelan la inducción de un distintivo génico asociado a la senescencia en células de cáncer de mama por metformina.
Zhang et al. (Gynecologic Oncology, 2014, vol. 133, no. 1, 83-89) y Zhang et al., (Gynecologic Oncology, 2014, vol.
133, 155, Póster 388) desvelan CGRRF1 como un novedoso biomarcador de respuesta tisular a la metformina en el contexto de obesidad.
Zhou et al. (The Lancet; Diabetes- Endocrinology, 2014, vol. 2, 481-487) desvelan un análisis de rasgos complejos de genoma completo sobre la variación de heredabilidad en la respuesta glucémica a metformina.
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Ramu Adela et al. (Journal of Diabetes Research, 2015, ID de artículo 490842) revisan la función de GDF-15 como una diana y biomarcador para diabetes y enfermedades cardiovasculares.
El documento de patente EP 2439 535 desvela un método de diagnóstico de un trastorno cardíaco en un paciente con diabetes con cantidades de un péptido natriurético o variante del mismo y GDF-15 o una variante del mismo que proporcionan información contradictoria, que comprende las etapas de (a) determinar la cantidad de una troponina cardíaca o una variante de la misma y/o H-FABP o una variante de la misma en una muestra del paciente; y (b) comparar las cantidades medidas de los marcadores con cantidades de referencia para diagnosticar el trastorno cardíaco.
El documento de patente WO 2013/012648 desvela un método de determinación de un régimen de quimioterapia que comprende ensayar una muestra de un sujeto diagnosticado con cáncer para elevada expresión de GDF15 y correlacionar la elevada expresión de GDF15 en la muestra con una resistencia a una quimioterapia que comprende un anticuerpo contra HER2.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método de identificación de un paciente con diabetes mellitus de tipo II que se beneficiará del tratamiento con metformina, que comprende las etapas de
(i) determinar el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo en una muestra obtenida del paciente con diabetes mellitus de tipo II que recibe metformina en una cantidad eficaz, y
(ii) comparar el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo, determinado en la etapa (i), con el de una referencia, en donde un aumento del nivel de GDF15 en al menos el 25 % es indicativo de una respuesta del paciente a la administración de metformina,
en donde el GDF15 comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 1, y la variante funcional del mismo tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende metformina y al menos un vehículo, adyuvante y/o excipiente farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de diabetes mellitus de tipo II en un paciente,
en donde la dosis de metformina está adaptada por un método que comprende
(i) administrar metformina a un paciente,
(ii) determinar el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo en una muestra del paciente
(iii) comparar el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo determinado en la etapa (ii) con una referencia, y
(iv) ajustar la dosis de metformina de forma que el tratamiento con metformina se detenga en caso de que el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo no aumente en al menos el 25 %, y la dosis de metformina se mantiene o aumenta en caso de que el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo aumente en al menos el 25 %.
en donde el GDF15 comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 1, y la variante funcional del mismo tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere al uso de GDF15 como biomarcador para identificar un paciente o un grupo de pacientes que se beneficiará del tratamiento con metformina.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere al uso del kit que comprende medios para detectar el nivel de expresión de GDF15 en el método del primer aspecto.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un método de identificación de un paciente con diabetes mellitus de tipo 2 que no se beneficiará del tratamiento con metformina, que comprende las etapas de
(i) determinar el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo en una muestra obtenida del paciente con diabetes mellitus de tipo II que recibe metformina en una cantidad eficaz,
(ii) comparar el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo, determinado en la etapa (i), con el de una referencia, en donde un nivel inalterado o reducido de GDF15 o una variante funcional del mismo es indicativo de un paciente que no responde a la administración de metformina, y
(iii) el tratamiento con metformina se interrumpe si el paciente presenta un nivel inalterado o reducido de GDF15 o una variante funcional del mismo,
en donde el GDF15 comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 1, y la variante funcional del mismo tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.
En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a sulfonilureas, agonista de dopamina, inhibidores de DPP-4, péptidos de tipo glucagón, meglitinidas, amilinomimético, inhibidores de la alfa-glucosidasa, inhibidores de SGLT2 y/o tiazolidinadionas para su uso en el tratamiento de un paciente, en donde el paciente presenta un nivel inalterado o reducido de GDF15 en respuesta al tratamiento con metformina, y en donde el paciente está en riesgo de desarrollar o padecer diabetes mellitus de tipo II.
Lista de figuras
Fig. 1: Relación entre niveles de GDF15 y uso de metformina. Los modelos 1-5 en el panel A muestran la oportunidad relativa de estar recibiendo metformina por cada 1 desviación estándar más en el nivel de GDF15 transformado con el logaritmo natural, después de tener en cuenta los factores clínicos asociados al uso de metformina más todos los 237 biomarcadores disponibles. Los modelos 1-4 en el panel B muestran la oportunidad relativa de estar recibiendo metformina por cada 1 desviación estándar más en el nivel de GDF15 transformado con el logaritmo natural, después de tener en cuenta los factores clínicos asociados al uso de metformina.
Fig. 2: Relación entre dosis de metformina y niveles de GDF15. Se muestra la concentración de GDF15 en personas que toman dosis variables de metformina. Se muestran las medias y los errores estándar superiores de la media.
Fig. 3: Respuesta de GDF15 a metformina. El panel A muestra la concentración media de GDF15 y se muestra el EEM en los medios de hepatocitos primarios cultivados (basados en 4 experimentos independientes ensayados por triplicado) de 4 ratones C57BI6 naturales macho expuestos a o vehículo o metformina (0,5 mmol/l) durante 24 horas. El panel B muestra la expresión relativa de ARN mensajero de GDF15 (en unidades de logaritmo de base 2) en respuesta a o vehículo o metformina (0,5 mM).
Fig. 4: Efecto del activador de AMPK A769662 (AB-10 μM), peróxido de hidrógeno (H2O2 -0,5 mM) e insulina (10 nM) sobre la liberación de GDF15. Después de 24 horas de exposición de hepatocitos primarios de 4 ratones C57BI6 naturales, ninguna de estas sustancias afectó la concentración de GDF15 (basado en 2 experimentos independientes ensayados por triplicado) en los medios frente a no exposición. Los datos se expresan como media (EEM).
Fig. 5: Efecto de metformina en las concentraciones de GDF15 sérico en ratones naturales. Se muestran en el panel A concentraciones de GDF15 medidas en muestras de la vena de la cola obtenidas 90 minutos después de la inyección con o metformina 250 mg/kg de peso corporal (N=6) o vehículo (N=6). Se muestran en el panel B concentraciones medidas en muestras de la vena de la cola obtenidas en ratones naturales alimentados con dieta rica en grasa al 60 % durante 5 semanas seguido por dieta rica en grasa al 60 % que o no contiene fármaco (N=4) o contiene 2,5 g/kg de metformina (N=4) durante 5 semanas adicionales. Lista de secuencias
SEQ ID NO: 1
secuencia de aminoácidos de GDF15 humano (UniProtκΒ/Swiss-Prot: Q99988.3):
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Descripción detallada de la invención
Definiciones
Antes de describir la presente invención con detalle a continuación, se debe entender que la presente invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. También se debe entender que la terminología usada en el presente documento es con el fin de describir realizaciones particulares solo, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que se limitará solo por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que comúnmente son entendidos por un experto habitual en la técnica.
A continuación, se describirán los elementos de la presente invención. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas, sin embargo, se debe entender que se pueden combinar en cualquier modo y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Los ejemplos y realizaciones preferidas descritos de diversas formas no se deben interpretar para limitar la presente invención a únicamente las realizaciones explícitamente descritas. Se debe entender que esta descripción soporta y engloba realizaciones que combinan las realizaciones explícitamente descritas con cualquier número de elementos desvelados y/o preferidos. Además, cualquier permutación y combinación de todos los elementos descritos en la presente solicitud se debe considerar desvelada por la descripción de la presente solicitud, a menos que el contexto indique lo contrario.
En toda esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, se entenderá que la palabra "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", implica la inclusión de un número entero establecido o etapa o grupo de números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.
Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes al plural, a menos que el contenido dicte claramente lo contrario.
El término "aproximadamente", cuando se usa a propósito de un valor numérico, se indica para englobar valores numéricos dentro de un intervalo que tiene un límite inferior que es el 5 % más pequeño que el valor numérico indicado y que tiene un límite superior que es el 5 % más grande que el valor numérico indicado.
Los aminoácidos son compuestos orgánicos compuestos de grupos funcionales amina (-NH2) y ácido carboxílico (-COOH), junto con una cadena lateral específica de cada aminoácido. Normalmente, los aminoácidos se clasifican por las propiedades de sus cadenas laterales en cuatro grupos: la cadena lateral puede hacer que un aminoácido sea un ácido débil o una base débil, un hidrófilo si la cadena lateral es polar o un hidrófobo si es no polar.
En el contexto de los diferentes aspectos de la presente invención, el término "péptido" se refiere a un polímero de aminoácidos corto unidos por enlaces peptídicos. Tiene los mismos enlaces químicos (peptídicos) que las proteínas, pero es comúnmente de longitud más corta. El péptido más corto es un dipéptido, que consiste en dos aminoácidos unidos por un único enlace peptídico. También puede ser un tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, etc. Preferentemente, el péptido tiene una longitud de hasta 8, 10, 12, 15, 18 o 20 aminoácidos. Un péptido tiene un extremo amino y un extremo carboxilo, a menos que sea un péptido cíclico.
En el contexto de los diferentes aspectos de la presente invención, el término "polipéptido" se refiere a una única cadena de aminoácidos lineal unida por enlaces peptídicos y preferentemente comprende al menos aproximadamente 21 aminoácidos. Un polipéptido puede ser una cadena de una proteína que está compuesta por más de una cadena o puede ser la proteína en sí si la proteína está compuesta por una cadena.
En el contexto de los diferentes aspectos de la presente invención, el término "proteína" se refiere a una molécula que comprende uno o más polipéptidos que reanudan una estructura secundaria y terciaria y se refiere además a una proteína que está constituida por varios polipéptidos, es decir, varias subunidades, que forman estructuras cuaternarias. En el contexto de la presente invención, la estructura primaria de una proteína o polipéptido es la secuencia de aminoácidos en la cadena de polipéptidos. La estructura secundaria en una proteína es la forma tridimensional general de segmentos locales de la proteína. Sin embargo, no describe posiciones atómicas específicas en el espacio tridimensional, que se considera que son estructura terciaria. En las proteínas, la estructura secundaria se define por patrones de enlaces de hidrógeno entre grupos amida y carboxilo del esqueleto. La estructura terciaria de una proteína es la estructura tridimensional de la proteína determinada por las coordenadas atómicas. La estructura cuaternaria es la disposición de múltiples moléculas de proteína o moléculas de polipéptido plegadas o enrolladas en un complejo de múltiples subunidades. Los términos "cadena de aminoácido" y "cadena de polipéptidos" se usan sinónimamente en el contexto de la presente invención.
Las proteínas y los polipéptidos de la presente invención (incluyendo derivados de proteína, variantes de proteína, fragmentos de proteína, segmentos de proteína, epítopes de proteína y dominios de proteína) se pueden modificar adicionalmente por modificación química. Esto significa que dicho polipéptido químicamente modificado comprende otros grupos químicos distintos de los 20 aminoácidos naturales. Los ejemplos de dichos otros grupos químicos incluyen, sin limitación, aminoácidos glucosilados y aminoácidos fosforilados. Las modificaciones químicas de un polipéptido pueden proporcionar propiedades ventajosas en comparación con el polipéptido parental, por ejemplo, una o más de estabilidad potenciada, aumento de la semivida biológica o aumento de la solubilidad en agua. Las modificaciones químicas aplicables a las variantes utilizables en la presente invención incluyen sin limitación: PEGilación, glucosilación de polipéptidos parentales no glucosilados, o la modificación del patrón de glucosilación presente en el polipéptido parental. La proteína también puede tener grupos no de péptido unidos, tales como, por ejemplo, grupos prostéticos o cofactores.
El factor de diferenciación de crecimiento 15 (GDF15) es una proteína que pertenece a la superfamilia de los factores de crecimiento transformante beta y desempeña una función en regular las vías inflamatorias y apoptósicas en tejidos lesionados, así como durante procesos de enfermedad ( número de acceso de UniProtκΒ/Swiss-Prot.: Q99988.3). GDF15 también se conoce como TGF-PL, citocina-1 inhibidora de macrófagos (MIC-1), PDF, proteína B morfogenética ósea placentaria (PLAB) y factor de crecimiento transformante p placentario (PTGFB). El ARNm de GDF15 es más abundante en el hígado, observándose menores niveles en algunos otros tejidos. Su expresión en hígado puede ser significativamente regulada por incremento durante la lesión de órganos, tales como el hígado, el riñón, el corazón y el pulmón. El gen GDF15 (también conocido como gen-1 activado por fármaco antiinflamatorio no esteroideo (NAG-1)) está localizado en el cromosoma 19p12-13.1, y GDF15 se expresa como un propéptido de 40 kDa que se escinde en el retículo endoplásmico para liberar una proteína dimérica circulante activa de 25 kDa. La deleción del gen GDF15 en ratones da como resultado una elevada aterosclerosis2829, lesión renal diabética30 y obesidad debida a un aumento del apetito31, que indica que GDF15 puede contrarrestar estos efectos, quizás suprimiendo la inflamación28-30. Estas observaciones también están de acuerdo con la bibliografía que indica que la metformina es cardioprotectora y puede incluso aumentar la longevidad3233. Es, por lo tanto, notable que estudios en humanos hayan informado de niveles de GDF15 con enfermedad cardiovascular, diabetes e insuficiencia renal34-36.
Como se usa en el presente documento, el término "variante" se debe entender como un polipéptido o proteína que se diferencia en comparación con el polipéptido o proteína del que deriva por uno o más cambios en su longitud o secuencia. El polipéptido o proteína del que deriva una variante de polipéptido o variante de proteína también se conoce como el polipéptido o proteína parental. El término "variante" comprende "fragmentos" o "derivados" de la molécula parental. Normalmente, los "fragmentos" son de longitud o tamaño más pequeño que la molécula parental, mientras que los "derivados" presentan una o más diferencias en su secuencia en comparación con la molécula parental. También se engloban moléculas modificadas, tales como, pero no se limitan a, proteínas modificadas postraduccionalmente (por ejemplo, proteínas glucosiladas, biotiniladas, fosforiladas, ubiquitinadas, palmitoiladas o proteolíticamente escindidas). Una variante se puede construir artificialmente, preferentemente por medios de tecnología génica, mientras que el polipéptido o proteína parental sea un polipéptido o proteína natural. Sin embargo, también se debe entender que variantes naturales están englobadas por el término "variante", como se usa en el presente documento. Además, las variantes utilizables en la presente invención también pueden derivar de homólogos, ortólogos o parálogos de la molécula parental o de variantes artificialmente construidas, a condición de que la variante presente al menos una actividad biológica de la molécula parental, es decir, sea funcionalmente activa.
Una "variante", como se usa en el presente documento, se puede caracterizar por un cierto grado de identidad de secuencia con el polipéptido parental o la proteína parental de la que deriva. Con más precisión, una variante de proteína en el contexto de la presente invención presenta al menos el 80 % de identidad de secuencia con su polipéptido parental. El término "al menos el 80 % de identidad de secuencia" se usa en toda la memoria descriptiva con respecto a comparaciones de secuencias de polipéptidos. Esta expresión se refiere preferentemente a una identidad de secuencia de al menos el 80 %, al menos el 81 %, al menos el 82 %, al menos el 83 %, al menos el 84 %, al menos el 85 %, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 88 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % con respecto a polipéptido de referencia respectivo o al polinucleótido de referencia respectivo. Preferentemente, el polipéptido en cuestión y el polipéptido de referencia presentan la identidad de secuencia indicada con respecto a un tramo continuo de 20, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más aminoácidos o con respecto a la longitud entera del polipéptido de referencia.
Un derivado de la presente invención puede presentar un número total de hasta 100 (hasta 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50) cambios en la secuencia de aminoácidos (es decir, intercambios, inserciones, deleciones, truncaciones aminoterminales y/o truncaciones carboxiterminales). Los intercambios de aminoácido pueden ser conservativos y/o no conservativos. En realizaciones preferidas, un derivado de la presente invención se diferencia del polipéptido o proteína o dominio del que deriva en hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 intercambios de aminoácido, preferentemente cambios de aminoácido conservativos.
Los términos "variante de deleción" y "fragmento" se usan indistintamente en el presente documento. Dichas variantes comprenden truncaciones aminoterminales, truncaciones carboxiterminales y/o deleciones internas. Un fragmento puede existir de forma natural (por ejemplo, variantes de corte y empalme) o se puede construir artificialmente, preferentemente por medios de tecnología génica. Preferentemente, un fragmento (o variante de deleción) tiene una deleción de hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 aminoácidos en su extremo N y/o en su extremo C y/o internamente en comparación con el polipéptido parental, preferentemente en su extremo N, en su extremo N y C, o en su extremo C.
En el caso donde se comparan dos secuencias y la secuencia de referencia no se especifica en comparación con el porcentaje de identidad de secuencia a calcular, la identidad de secuencia se calcula con referencia a la más larga de las dos secuencias a comparar, si no se indica específicamente de otro modo. Si la secuencia de referencia se indica, la identidad de secuencia se determina basándose en la longitud completa de la secuencia de referencia indicada por SEQ ID, si no se indica específicamente de otro modo. La similitud de las secuencias de aminoácidos, es decir, el porcentaje de identidad de secuencia, se puede determinar por alineaciones de secuencias. Dichas alineaciones se pueden llevar a cabo con varios algoritmos conocidos en la técnica, preferentemente con el algoritmo matemático de Karlin y Altschul (Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877), con el algoritmo hmmalign (paquete HMMER, http://hmmer.wustl.edu/) o CLUSTAL (Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80) disponible, por ejemplo, en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ o en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html o en http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.μl?page=/NPSA/npsa_clustalw.html. Los parámetros preferidos usados son los parámetros por defecto como se exponen en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ o http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. El grado de identidad de secuencia (emparejamiento de secuencias) se puede calcular usando, por ejemplo, BLAST, BLAT o BlastZ (o BlastX). Un algoritmo similar se incorpora en los programas BLASTN y BLASTP de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Las búsquedas de proteína con BLAST se realizan con el programa BLASTP, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas al polipéptido parental. Para obtener alineaciones con huecos para fines comparativos, se utiliza Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se usan los parámetros por defecto de los programas respectivos. El análisis de emparejamiento de secuencias puede ser complementado por técnicas de cartografiado de homología establecidas, como Shuffle-LAGAN (Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1 :l54-l62) o cuerpos aleatorios de Markov. Cuando se hace referencia en la presente solicitud a los porcentajes de identidad de secuencia, estos porcentajes se calculan en relación con la longitud completa de la secuencia más larga, si no se indica específicamente lo contrario.
Adicionalmente o alternativamente, una variante de deleción puede ocurrir no debido a deleciones estructurales de los aminoácidos respectivos como se ha descrito anteriormente, sino debido a que estos aminoácidos están inhibidos o por el contrario no son capaces de cumplir su función biológica. Normalmente, dicha deleción funcional ocurre debido a las inserciones o intercambios en la secuencia de aminoácidos que cambian las propiedades funcionales de la proteína resultante, tales como, pero no se limitan a, alteraciones en las propiedades químicas de la proteína resultante (es decir, intercambio de aminoácidos hidrófobos con aminoácidos hidrófilos), alteraciones en las modificaciones postraduccionales de la proteína resultante (por ejemplo, escisión postraduccional o patrón de glucosilación), o alteraciones en la estructura secundaria o terciaria de la proteína. Adicionalmente o alternativamente, una deleción funcional también puede ocurrir debido al silenciamiento génico transcripcional o postranscripcional (por ejemplo, por ARNip) o a la presencia o ausencia de moléculas inhibidoras, tales como, pero no se limitan a, inhibidores de proteína o anticuerpos inhibidores.
Se prefieren sustituciones de aminoácidos semiconservativas y especialmente conservativas, en donde un aminoácido se sustituye con un aminoácido químicamente relacionado. Dichas sustituciones típicas son entre los aminoácidos alifáticos, entre los aminoácidos que tienen cadena lateral de hidroxilo alifática, entre los aminoácidos que tienen residuos ácidos, entre los derivados de amida, entre los aminoácidos con residuos básicos, o los aminoácidos que tienen residuos aromáticos. Cambiar de A, F, H, I, L, M, P, V, W o Y a C es semiconservativo si la nueva cisteína sigue como un tiol libre. Además, el experto apreciará que las glicinas en posiciones estéricamente exigentes no se deben sustituir y que P no se debe introducir en partes de la proteína que tienen una estructura de hélice alfa o de hoja beta.
Los términos "muestra" o "muestra de interés" se usan indistintamente en el presente documento, con referencia a una parte o trozo de un tejido, órgano o individuo, que normalmente es más pequeña que dicho tejido, órgano o individuo, prevista para representar todo el tejido, órgano o individuo. Tras los análisis, una muestra proporciona información sobre el estado del tejido o el estado de sano o enfermo de un órgano o individuo. Los ejemplos de muestras incluyen, pero no se limitan a, muestras de líquidos, tales como sangre, suero, plasma, líquido sinovial, orina, saliva y líquido linfático, o muestras sólidas, tales como extractos de tejido, cartílago, hueso, sinovio y tejido conjuntivo. El análisis de una muestra se puede llevar a cabo en una base visual o química. El análisis visual incluye, pero no se limita a, obtención de imágenes microscópicas o barridos radiográficos de un tejido, órgano o individuo que permite la evaluación morfológica de una muestra. El análisis químico incluye, pero no se limita a, la detección de la presencia o ausencia de indicadores específicos o alteraciones en su cantidad o nivel.
El término "muestra de referencia", como se usa en el presente documento, se refiere a una muestra que se analiza en un modo sustancialmente idéntico a la muestra de interés y cuya información se compara con la de la muestra de interés. Una muestra de referencia proporciona así un criterio que permite la evaluación de la información obtenida de la muestra de interés. Una muestra de referencia puede ser idéntica a la muestra de interés, excepto por un componente que se puede estar intercambiado, ausente o añadido.
El término "valor de referencia", como se usa en el presente documento, se refiere a un valor que se sabe que es indicativo de un cierto estado. El valor de referencia puede representar una cantidad o una concentración del biomarcador(es) desvelado en el presente documento. El término "el nivel de dicho biomarcador está alterado, en particular elevado o reducido, en comparación con un valor de referencia", como se usa en el presente documento, significa que la cantidad o concentración de dicho biomarcador está alterada, en particular elevada o reducida, en al menos el 5 %, en al menos el 10 %, en al menos el 20 %, en al menos el 30 %, en al menos el 40 %, en al menos el 50 %, en al menos el 60 %, en al menos el 70 %, en al menos el 80 %, en al menos el 90 %, en al menos el 100 %, en al menos el 110 %, en al menos el 120 %, en al menos el 130 %, en al menos el 140 %, en al menos el al menos 150 %, en al menos el 200 %, en al menos el 250 %, en al menos el 300 %, en al menos el 400 % o en al menos el 500 %, en comparación con un valor de referencia. El valor de referencia es el nivel de dicho biomarcador determinado midiendo una o más muestras de referencia aisladas de uno o más individuos sanos. El valor de referencia se puede determinar midiendo una o más muestras de referencia, tal como al menos 1, al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500, al menos 600, al menos 700, al menos 800, al menos 900, al menos 1000, al menos 1500 o al menos 2000 muestras de referencia, de uno o más sujetos sanos, tal como al menos 1, al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500, al menos 600, al menos 700, al menos 800, al menos 900, al menos 1000, al menos 1500 o al menos 2000 sujetos sanos. Normalmente, se mide una muestra de referencia por sujeto. Puede ser ventajoso probar al menos dos sujetos.
El valor de referencia se refiere a un nivel umbral con un valor del intervalo de confianza superior del 95 % y que pertenece al valor medio calculado a partir de individuos sanos. El intervalo de confianza del 95 % y el valor medio se pueden determinar por técnicas conocidas en la técnica. Para la determinación del valor medio, se prueban al menos dos sujetos sanos, en particular al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500, al menos 600, al menos 700, al menos 800, al menos 900, al menos 1000, al menos 1500, o al menos 2000 sujetos sanos. Cuando el control es un nivel umbral, el término "el nivel de dicho al menos un biomarcador es elevado (reducido) en comparación con un nivel umbral" se debe entender como "el nivel de dicho al menos un biomarcador es superior (inferior) al nivel umbral".
Los términos nivel "reducido" o "disminuido" de proteína se refiere al nivel de dicha proteína en la muestra que es reducido en comparación con la referencia, en particular la muestra de referencia o valor de referencia. Los términos nivel "elevado" o "incrementado" de una proteína se refiere al nivel de dicha proteína en la muestra que es mayor en comparación con el valor de referencia o muestra de referencia.
El término "enfermedad" y "trastorno" se usan indistintamente en el presente documento, con referencia a una afección anormal, especialmente una afección médica anormal, tal como una enfermedad o lesión, en donde un tejido, un órgano o un individuo ya no es capaz de cumplir eficientemente su función. Normalmente, pero no necesariamente, una enfermedad está asociada con síntomas o signos específicos que indican la presencia de dicha enfermedad. Por lo tanto, la presencia de dichos síntomas o signos puede ser indicativa de un tejido, un órgano o un individuo que padece una enfermedad. Una alteración de estos síntomas o signos puede ser indicativa de la progresión de dicha enfermedad. Una progresión de una enfermedad se caracteriza normalmente por un aumento o disminución de dichos síntomas o signos que puede indicar un "empeoramiento" o "mejoría" de la enfermedad. El "empeoramiento" de una enfermedad se caracteriza por una disminución de la capacidad de un tejido, órgano u organismo para cumplir su función eficientemente, mientras que la "mejoría" de una enfermedad se caracteriza normalmente por un aumento en la capacidad de un tejido, un órgano o un individuo para cumplir su función eficientemente. Un tejido, un órgano o un individuo que está en "riesgo de desarrollar" una enfermedad está en un estado sano, pero muestra potencial de una enfermedad emergente. Normalmente, el riesgo de desarrollar una enfermedad está asociado con signos o síntomas tempranos o débiles de dicha enfermedad. En dicho caso, la aparición de la enfermedad todavía se puede prevenir mediante tratamiento. Los ejemplos de una enfermedad incluyen, pero no se limitan a, enfermedades traumáticas, enfermedades inflamatorias, enfermedades infecciosas, afecciones cutáneas, enfermedades endocrinas, enfermedades intestinales, trastornos neurológicos, enfermedades articulares, trastornos genéticos, enfermedades autoinmunitarias y diversos tipos de cáncer.
Normalmente, pero no necesariamente, una enfermedad o lesión está asociada con "síntomas" o "signos" específicos que indican la presencia de dicha enfermedad o lesión. Por lo tanto, la presencia de dichos síntomas o signos puede ser indicativa de un tejido, un órgano o un individuo que padece una enfermedad o lesión. Una alteración de estos síntomas o signos puede ser indicativa de la progresión de dicha enfermedad o lesión. Una progresión de una enfermedad o lesión normalmente se caracteriza por un aumento o disminución de dichos síntomas o signos que puede indicar un "empeoramiento" o "mejoría" de la enfermedad o lesión. El "empeoramiento" de una enfermedad o lesión se caracteriza por una disminución de la capacidad de un tejido, órgano u organismo para cumplir su función eficientemente, mientras que la "mejoría" de una enfermedad o lesión se caracteriza normalmente por un aumento en la capacidad de un tejido, un órgano o un individuo para cumplir su función eficientemente. Un tejido, un órgano o un individuo que está en "riesgo de desarrollar" una enfermedad o lesión está en un estado sano, pero muestra potencial de una enfermedad o lesión emergente. Normalmente, el riesgo de desarrollar una enfermedad o lesión está asociado con signos o síntomas tempranos o débiles de dicha enfermedad. En dicho caso, la aparición y/o progresión de la enfermedad o lesión todavía se puede prevenir mediante tratamiento.
Los "síntomas" de una enfermedad son la implicación de la enfermedad perceptible por el tejido, órgano u organismo que tiene dicha enfermedad e incluyen, pero no se limitan a, dolor, debilidad, dolor con la palpación, distensión muscular, rigidez y espasmo del tejido, un órgano o un individuo. "Signos" o "señales" de una enfermedad incluyen, pero no se limitan a, el cambio o la alteración, tal como la presencia, ausencia, aumento o elevación, disminución o reducción, de indicadores específicos, tales como biomarcadores o marcadores moleculares, o el desarrollo, la presencia o el empeoramiento de los síntomas. Los síntomas del dolor incluyen, pero no se limitan a, una sensación desagradable que puede ser sentida como un ardor persistente o variable, dolor pulsante, picazón o escozor.
El término "indicador", como se usa en el presente documento, se refiere a un signo o señal de una afección o se usa para monitorizar una afección. Dicha "afección" se refiere al estado biológico de una célula, tejido u órgano o al estado de salud y/o enfermedad de un individuo. Un indicador puede ser la presencia o ausencia de una molécula, que incluye, pero no se limita a, un péptido, una proteína y un ácido nucleico, o puede ser un cambio en el nivel de expresión o patrón de dicha molécula en una célula, o tejido, órgano o individuo. Un indicador puede ser un signo de la aparición, desarrollo o presencia de una enfermedad en un individuo o de la progresión adicional de dicha enfermedad. Un indicador también puede ser un signo del riesgo de desarrollar una enfermedad en un individuo. Los términos nivel "reducido" o "disminuido" de un indicador se refieren al nivel de dicho indicador en la muestra que es reducido en comparación con la referencia o muestra de referencia. Los términos nivel "elevado" o "incrementado" de un indicador se refieren al nivel de dicho indicador en la muestra que son más altos en comparación con la referencia o muestra de referencia.
La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad crónica grave caracterizada por azúcar en sangre elevada. Los síntomas de la azúcar en sangre alta incluyen, pero no se limitan a, micción frecuente, aumento de la sed y aumento del hambre. Si se deja sin tratar, la diabetes puede provocar complicaciones tanto agudas como a largo plazo. Las complicaciones agudas incluyen, pero no se limitan a, cetoacidosis diabética y estados hiperosmolares no cetósicos. Las consecuencias a largo plazo incluyen, pero no se limitan a, infartos de miocardio, accidentes cerebrovasculares, enfermedad vascular periférica, TIA, insuficiencia renal, fallo renal, dolor neuropático crónico, ulceración de los pies, amputaciones, ceguera, daño retiniano, cataratas, fracturas, deterioro cognitivo, esteatohepatitis no alcohólica, cirrosis y una variedad de cánceres. La diabetes ocurre debido a que el páncreas es incapaz de producir insulina suficiente para mantener los niveles de glucosa normales tanto en ayudas como en situación posprandial y muchas personas con diabetes también tienen células que no responden apropiadamente a la insulina que se produce. La diabetes se puede clasificar en las siguientes categorías generales: 1. diabetes de tipo 1; 2. diabetes de tipo 2; 3. diabetes mellitus gestacional (GDM); y 4. tipos específicos de diabetes debidos a otras causas.
La diabetes mellitus de tipo 1 resulta del fallo del páncreas para producir insulina suficiente. Esta forma se denomino previamente "diabetes mellitus dependiente de insulina" (IDDM) o "diabetes juvenil". La diabetes mellitus de tipo 1 se caracteriza por pérdida de las células beta productoras de insulina de los islotes de Langerhans en el páncreas, que conduce a deficiencia de insulina. Este tipo se puede clasificar además como mediada por la inmunidad o idiopática. La mayoría de las diabetes de tipo 1 son de naturaleza mediada por la inmunidad, en la que un ataque autoinmunitario mediado por linfocitos T conduce a la pérdida de células beta y así de insulina.
La diabetes de tipo 2 ocurre cuando el páncreas no es capaz de producir suficiente insulina para vencer la resistencia a la acción de la insulina. Esta forma se denominó previamente "diabetes mellitus no dependiente de insulina" (NIDDM) o "diabetes de aparición en la adultez". La causa primaria es el excesivo peso corporal y sin ejercicio suficiente. La diabetes mellitus de tipo 2 se caracteriza por resistencia a la insulina, que se puede combinar con secreción de insulina relativamente reducida. Se cree que la sensibilidad defectuosa de los tejidos del cuerpo a la insulina implica al receptor de insulina. Sin embargo, no se conocen defectos específicos. La diabetes mellitus de tipo 2 es el tipo más común de diabetes mellitus. En la fase temprana del tipo 2, la anomalía predominante es la reducida sensibilidad a la insulina. En esta fase, se puede invertir el azúcar en sangre alta mediante una variedad de medidas y medicaciones que mejoran la sensibilidad a la insulina o reducen la producción de glucosa por el hígado.
La diabetes gestacional es la tercera forma principal y ocurre cuando mujeres embarazadas sin antecedentes previos de diabetes desarrollan un nivel de azúcar en sangre alta. La diabetes mellitus gestacional (GDM) se parece a la diabetes mellitus de tipo 2 en varios respectos, que implican una combinación de secreción de insulina relativamente inadecuada y sensibilidad. Ocurre en aproximadamente el 2-10 % de todos los embarazos y puede mejorar o desaparecer después del parto. Sin embargo, se encuentra que después del embarazo aproximadamente el 5-10 % de las mujeres con diabetes gestacional tienen diabetes mellitus, lo más comúnmente de tipo 2. La diabetes gestacional es completamente tratable, pero requiere una cuidadosa supervisión médica durante todo el embarazo.
Otros tipos de diabetes incluyen, pero no se limitan a, síndromes de diabetes monogénicas (tales como diabetes neonatal y diabetes hereditaria juvenil de tipo [MODY]), enfermedades del páncreas exocrino (tal como fibrosis quística) y diabetes inducida por fármacos o productos químicos (tal como en el tratamiento de VIH/SIDA o después de trasplante de órganos).
La prediabetes indica una afección que ocurre cuando los niveles de glucosa en sangre de una persona son superiores a la normalidad, pero no suficientemente altos como para un diagnóstico de diabetes de tipo 2. Muchas personas destinadas a desarrollar diabetes mellitus de tipo 2 pasan muchos años en un estado de prediabetes.
Además de la administración de insulina, se conocen varios otros tratamientos de la diabetes que incluyen, pero no se limitan a, la administración de metformina, sulfonilureas, agonista de dopamina, inhibidores de DPP-4, péptidos de tipo glucagón, meglitinidas, amilinomimético, inhibidores de la alfa-glucosidasa, inhibidores de SGLT2 y/o tiazolidinadionas.
La lipoproteína de baja densidad (LDL) y la lipoproteína de alta densidad (HDL) pertenecen al grupo de las lipoproteínas. Las lipoproteínas transfieren grasas por todo el cuerpo en el líquido extracelular, pueden muestrearse en sangre y permiten que las grasas sean captadas por las células del cuerpo por endocitosis mediada por receptor. Las lipoproteínas son partículas complejas compuestas de múltiples proteínas que transportan todas las moléculas de grasa (lípidos) por todo el cuerpo en el interior del agua fuera de las células. Normalmente están compuestas de 80­ 100 proteínas/partícula (organizadas por una apolipoproteína B individual para LDL y las partículas más grandes). Las grasas transportadas incluyen colesterol, fosfolípidos y triglicéridos; las cantidades de cada una varían considerablemente. Las partículas de LDL plantean un riesgo de enfermedad cardiovascular cuando invaden el endotelio y se oxidan, puesto que las formas oxidadas son más fácilmente retenidas por los proteoglicanos. Un conjunto complejo de reacciones bioquímicas regula la oxidación de partículas de LDL, estimulada principalmente por la presencia de residuo celular necrótico y radicales libres en el endotelio. Concentraciones crecientes de partículas de LDL están asociadas fuertemente a tasas crecientes de acumulación de aterosclerosis dentro de las paredes de las arterias con el tiempo, dando como resultado con el tiempo las repentinas roturas de placas y desencadenando coágulos en el interior de la abertura de la arteria, o un estrechamiento o cierre de la abertura, es decir, enfermedad cardiovascular, accidente cerebrovascular y otras complicaciones de enfermedad vascular. Las partículas de LDL se denominan algunas veces colesterol malo debido a que pueden transportar su contenido de moléculas de grasa en el interior de las paredes de las arterias, atraer a los macrófagos y así accionar la aterosclerosis. A diferencia, las partículas de HDL se denominan frecuentemente colesterol bueno o colesterol saludable debido a que pueden retirar moléculas de grasa de los macrófagos en la pared de las arterias.
La creatinina sérica (una medición de la sangre) es un indicador importante de la salud renal debido a que es un subproducto fácilmente medido del metabolismo muscular que es eliminado sin variar por los riñones. La creatinina en sí es producida por un sistema biológico que implica a la creatina, la fosfocreatina (también conocida como fosfato de creatina) y al trifosfato de adenosina (ATP, el suministro de energía inmediato del cuerpo). La creatina se sintetiza principalmente en el hígado a partir de la metilación de glucociamina (acetato de guanidino, sintetizado en el riñón a partir de los aminoácidos arginina y glicina) por S-adenosil metionina. Entonces es transportada a través de la sangre a los otros órganos, músculo, y al cerebro, donde, mediante fosforilación, se convierte en el compuesto de alta energía fosfocreatina. Durante la reacción, la creatina y la fosfocreatina son catalizadas por creatina cinasa, y puede ocurrir una conversión espontánea en creatinina. La creatinina se elimina de la sangre principalmente por los riñones, principalmente por filtración glomerular, pero también por secreción tubular proximal. Ocurre poca o ninguna reabsorción tubular de creatinina. Si la filtración en el riñón es deficiente, aumentan los niveles de creatinina en sangre. Por lo tanto, los niveles de creatinina en sangre y orina se pueden usar para calcular la depuración de creatinina (CrCl), que se correlaciona con la filtración glomerular (GFR). También se pueden usar los niveles de creatinina en sangre solos para calcular la GFR estimada (eGFR). La GFR es clínicamente importante debido a que es una medición de la función renal. Se puede hacer una estimación alternativa de la función renal cuando se interpreta la concentración de creatinina en sangre (plasma) junto con la de urea. La relación entre BUN y creatinina (la relación entre nitrógeno ureico y creatinina en sangre) puede indicar otros problemas, además de los intrínsecos al riñón; por ejemplo, un nivel de urea desproporcionado con respecto a la creatinina puede indicar un problema prerrenal, tal como hipovolemia.
Como se observa anteriormente, la diabetes está asociada con una gran variedad de consecuencias graves a largo plazo. Estas incluyen enfermedad cardíaca isquémica y sus secuelas, enfermedad cerebrovascular, hemorragia cerebral, enfermedad vascular periférica, polineuropatía o mononeuropatía, neuropatía dolorosa, insuficiencia renal, albuminuria, fallo renal, cataratas, disminución de la visión, ceguera, retinopatía, ulceración de los pies, amputaciones de extremidades inferiores, deterioro cognitivo, demencia, caídas, fracturas, debilidad, disfunción sexual, disfunción eréctil, cánceres, depresión, apnea del sueño, problemas intestinales y otros. Algunas de estas consecuencias pueden promover a su vez la progresión de la gravedad de la diabetes. Otras, tales como NAFLD, pueden estar presentes antes de que ocurra la diabetes y pueden contribuir a su patogénesis.
La albuminuria es una afección patológica en donde la proteína albúmina está presente en la orina.
Es un tipo de proteinuria. Los riñones normalmente no filtran moléculas grandes en la orina, por lo que la albuminuria puede ser un indicador de daño a los riñones o consumo excesivo de sal. También puede ocurrir en pacientes con diabetes de larga duración, especialmente diabetes de tipo 1.
El índice de masa corporal (IMC) o índice de Quetelet es un valor derivado de la masa (peso) y altura de un individuo. El IMC se define como la masa corporal dividida entre el cuadrado de la altura del cuerpo, y se expresa universalmente en unidades de kg/m2, resultante de la masa en kilogramos y la altura en metros. El IMC es un intento por cuantificar la cantidad de masa de tejido (músculo, grasa y hueso) en un individuo, y, a continuación, clasificar a esa persona en función de ese valor en peso insuficiente, peso normal, sobrepeso u obesidad. Los intervalos de IMC comúnmente aceptados son bajo peso: menos de 18,5; peso normal: de 18,5 a 25; sobrepeso: de 25 a 30; obesidad: más de 30.
Como se usa en el presente documento, "tratar", "que trata" o "tratamiento" de una enfermedad o lesión significa realizar uno o más de lo siguiente: (a) reducir la gravedad de la enfermedad o lesión; (b) limitar o prevenir el desarrollo de síntomas característicos de la enfermedad o lesión que está tratándose; (c) inhibir el empeoramiento de síntomas característicos de la enfermedad o lesión que está tratándose; (d) limitar o prevenir la reaparición de la enfermedad o lesión en un individuo que ha tenido previamente la enfermedad o lesión; y (e) limitar o prevenir la reaparición de síntomas en individuos que fueron previamente sintomáticos de la enfermedad o lesión.
Como se usa en el presente documento, "prevenir", "que previene", "prevención" o "profilaxis" de una enfermedad o lesión significa prevenir que dicha enfermedad o lesión ocurra en el paciente.
El término "retraso" o "retrasar" una enfermedad se refiere a una disminución en la progresión de la enfermedad o trastorno, es decir, retrasar una enfermedad se refiere a prolongar el periodo de tiempo en el que empeoran los síntomas o signos o causas de la enfermedad.
Los términos "farmacéutico", "composición farmacéutica", "medicamento" y "fármaco" se usan indistintamente en el presente documento con referencia a una sustancia y/o una combinación de sustancias que se usan para la identificación, prevención o tratamiento de una enfermedad o lesión.
La biguanida es el compuesto orgánico con la fórmula HN(C(NH)NH2)2. Se usa una variedad de derivados de biguanida como fármacos farmacéuticos que incluyen, pero no se limitan a, metformina y sus derivados funcionales. La metformina es un agente hipoglucémico de biguanida usado, por ejemplo, en el tratamiento de diabetes mellitus no dependiente de insulina (diabetes mellitus de tipo 2) en pacientes que no responden a la modificación dietética.
La estructura química de la metformina es la siguiente:
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La metformina mejora el control glucémico mejorando la sensibilidad a la insulina y disminuyendo la absorción intestinal de la glucosa, así como suprimiendo la producción de glucosa por el hígado. Es el fármaco de elección de primera línea para el tratamiento de la diabetes de tipo 2, en particular, en personas con sobrepeso y obesas y aquellas con función renal normal. Su uso en la diabetes gestacional se ha limitado por cuestiones de seguridad. También se usa en el tratamiento de síndrome del ovario poliquístico, y se ha investigado para otras enfermedades donde la resistencia a la insulina puede ser un factor importante, tales como enfermedad hepática grasa no alcohólica y pubertad prematura. Ayuda a reducir los niveles de colesterol LDL y triglicéridos y no está asociado a un aumento de peso; en algunas personas, promueve la pérdida de peso. La metformina es uno de los solo dos antidiabéticos orales en la Lista Modelo de Medicamentos Esenciales de la Organización Mundial de la Salud (siendo el otro la glibenclamida). La metformina provoca pocos efectos adversos cuando se prescribe apropiadamente (los más comunes son las molestias digestivas) y se ha asociado a un bajo riesgo de tener azúcar en sangre baja. La acidosis láctica (una acumulación de lactato en la sangre) puede ser un motivo de grave preocupación en caso de sobredosis y cuando se prescribe a personas con contraindicaciones, pero por lo demás, no existe ningún riesgo significativo. El término "metformina" también incluye los derivados de la misma.
La transferencia Western permite determinar proteínas específicas (nativas o desnaturalizadas) de extractos preparados a partir de células o tejidos, antes o después de cualquier etapa de purificación. Las proteínas, en general, se separan por tamaño usando electroforesis en gel antes de ser transferidas a una membrana sintética (normalmente nitrocelulosa o PVDF) por métodos de transferencia seca, semiseca o húmeda. La membrana puede entonces ser sondada usando anticuerpos usando métodos similares a la inmunohistoquímica, pero sin la necesidad de fijación. La detección se realiza normalmente usando anticuerpos unidos a peroxidasa para catalizar una reacción quimioluminiscente. La transferencia Western es un método rutinario de biología molecular que se puede usar para comparar semicuantitativamente o cuantitativamente niveles de proteína entre extractos. La separación por tamaño antes de la transferencia permite que el peso molecular de la proteína sea calibrado en comparación con marcadores de peso molecular conocidos. La transferencia Western es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra dada de homogeneizado o extracto de tejido. Usa electroforesis en gel para separar proteínas por la longitud del polipéptido (condiciones desnaturalizantes) o por la estructura 3D de la proteína (condiciones nativas/ no desnaturalizantes).
El término "enzimoinmunoanálisis de adsorción" o "ELISA" se refiere a un método de diagnóstico para determinar cuantitativa o semicuantitativamente concentraciones de proteína del plasma sanguíneo, suero o extractos de células/tejido en un formato de placa de múltiples pocillos (normalmente 96 pocillos por placa). Ampliamente, las proteínas en disolución se adsorben a placas de ELISA. Los anticuerpos específicos para la proteína de interés se usan para sondar la placa. El fondo se minimiza optimizando los métodos de bloqueo y lavado (como para IHC), y la especificidad se garantiza por la presencia de controles positivos y negativos. Los métodos de detección se basan normalmente en colorimetría o quimioluminiscencia.
La inmunoprecipitación (IP) es la técnica de precipitación de un antígeno de proteína en una disolución usando un anticuerpo que se une específicamente a esa proteína particular. Este proceso se puede usar para aislar y concentrar una proteína particular en una muestra que contiene muchos miles de proteínas diferentes. La inmunoprecipitación requiere que el anticuerpo se acople a un sustrato sólido en algún punto en el procedimiento.
Una micromatriz de proteína (o chip de proteína) es un método de alta resolución usado para determinar la presencia y actividades de proteínas, y para analizar su función, en particular a gran escala. El chip consiste en una superficie de soporte, tal como un portaobjetos de vidrio, membrana de nitrocelulosa, perla o placa de microtitulación, a la que se une una matriz de captura. Las moléculas de sonda, normalmente marcadas con un colorante fluorescente, se añaden a la matriz. Cualquier reacción entre la sonda y la proteína inmovilizada emite una señal fluorescente que es leída por un escáner de láser. Las micromatrices de proteína son rápidas, automatizadas, económicas y altamente sensibles, consumiendo pequeñas cantidades de muestras y reactivos.
Los inmunoensayos basados en anticuerpos, tales como un inmunoensayo simple que cuantifica un analito por ensayo y n analitos requerirían n ensayos independientes. En comparación con el ELISA para un único analito, los ensayos múltiples ofrecen la posibilidad de obtener información cuantitativa más fiable en un análisis altamente paralelo. Estos inmunoensayos múltiples cuantitativos acoplan el principio básico de las interacciones antígeno-anticuerpo a una amplia variedad de métodos de detección dando lecturas cuantitativas.
La secuenciación de proteínas es una técnica para determinar la secuencia de aminoácidos de una proteína, así como qué conformación adopta la proteína y el grado al que se compleja con cualquier otra molécula no peptídica. Los dos métodos directos principales de secuenciación de proteínas son espectrometría de masas y la reacción de degradación de Edman.
El término "espectrometría de masas (EM)" se refiere a una técnica de química analítica que permite identificar la cantidad y el tipo de sustancias químicas presentes en una muestra midiendo la relación entre masa y carga y la abundancia de iones en la fase gaseosa. El espectro de masas (plural espectros) es un gráfico de la señal del ion en función de la relación entre masa y carga. Los espectros se usan para determinar el distintivo elemental o isotópico de una muestra, las masas de partículas y de moléculas, y para aclarar las estructuras químicas de moléculas, tales como péptidos y otros compuestos químicos. La espectrometría de masas funciona ionizando compuestos químicos para generar moléculas o fragmentos de moléculas cargados y midiendo sus relaciones entre masa y carga. En un procedimiento de EM típico, una muestra, que puede ser sólida, líquida o gaseosa, se ioniza, por ejemplo, bombardeándola con electronos. Esto puede hacer que algunas de las moléculas de la muestra se rompan en fragmentos cargados. Estos iones se separan entonces según su relación entre masa y carga, normalmente acelerándolos y sometiéndolos a un campo eléctrico o magnético: iones de la misma relación entre masa y carga experimentarán la misma cantidad de deflexión. Los iones se detectan por un mecanismo capaz de detectar partículas cargadas, tales como un multiplicador de electrones. Los resultados se presentan como espectros de la abundancia relativa de iones detectados en función de la relación entre masa y carga. Los átomos o moléculas en la muestra se pueden identificar correlacionando masas conocidas con las masas identificadas o mediante un patrón de fragmentación característico.
El término "cromatografía" se refiere a un proceso de transferencia de masa que implica adsorción. La cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) se basa en bombas para hacer pasar un líquido presurizado y una mezcla de muestra a través de una columna llena de un sorbente, que conduce a la separación de los componentes de la muestra. El componente activo de la columna, el sorbente, es normalmente un material granulado fabricado de partículas sólidas (por ejemplo, sílice, polímeros, etc.), de 2-50 micrómetros de tamaño. Los componentes de la mezcla de muestra se separan entre sí debido a sus diferentes grados de interacción con las partículas de sorbente. El líquido presurizado es normalmente una mezcla de disolventes (por ejemplo, agua, acetonitrilo y/o metanol) y se denomina una "fase móvil". Su composición y temperatura desempeñan una función importante en el proceso de separación influyendo en las interacciones que tienen lugar entre los componentes de muestra y el sorbente. Estas interacciones son de naturaleza física, tales como hidrófobas (dispersivas), dipolo-dipolo e iónicas, casi siempre una combinación. La HPLC se distingue de la cromatografía de líquidos tradicional (a "baja presión") debido a que las presiones operacionales son significativamente mayores (50-350 bares), mientras que la cromatografía de líquidos habitual se basa normalmente en la fuerza de gravedad para hacer pasar la fase móvil a través de la columna. Debido a la pequeña cantidad de muestra separada en la HPLC analítica, dimensiones de columna típicas son 2,1-4,6 mm de diámetro y 30-250 mm de longitud. Las columnas de HPLC también están hechas de partículas de sorbente más pequeñas (2-50 micrómetros de tamaño de partículas promedio). Esto da a la HPLC potencia de resolución superior (la capacidad para distinguir entre compuestos) cuando se separan mezclas, que hace que sea una técnica cromatográfica popular.
Como se usa en el presente documento, "administrar" incluye administración in vivo, así como administración directamente al tejido ex vivo, tal como injertos de vena.
Una "cantidad eficaz" es una cantidad de un agente suficiente para lograr el fin previsto. La cantidad eficaz de un agente dado puede variar debido a factores tales como la naturaleza del agente, la vía de administración, el tamaño y la especie del sujeto para recibir el agente, y el fin de la administración. La cantidad eficaz en cada caso individual puede ser determinada empíricamente por un experto según métodos establecidos en la técnica.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad de un agente terapéutico suficiente para lograr el efecto preventivo o terapéutico previsto, es decir, la cantidad de dicho agente terapéutico que se considera para lograr una mejoría de los signos o síntomas del trastorno o enfermedad a tratar, o para prevenir la aparición de los signos o síntomas de un trastorno o enfermedad a prevenir. La cantidad eficaz de un agente terapéutico dado puede variar debido a factores tales como la naturaleza del agente, la vía de administración, el tamaño y la especie del animal a recibir el agente terapéutico, y el fin de la administración. La cantidad terapéuticamente eficaz en cada caso individual puede ser determinada empíricamente por un experto según métodos establecidos en la técnica.
"Farmacéuticamente aceptable" significa autorizado por una agencia reguladora del gobierno federal o un gobierno estatal y listado en la Farmacopea Estadounidense u otra farmacopea reconocida, en general, para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos.
El término "principio activo" se refiere a la sustancia en una composición farmacéutica o formulación que es biológicamente activa, es decir, que proporciona valor farmacéutico. Una composición farmacéutica puede comprender uno o más principios activos que pueden actuar juntos con o independientemente entre sí. El principio activo se puede formular como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con grupos amino libres, tales como las derivadas de ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con grupos carboxilo libres, tales como, pero no se limitan a, las derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y similares.
Los términos "preparado" y "composición" pretenden incluir la formulación del compuesto activo con material de encapsulación como vehículo para proporcionar una cápsula en la que el componente activo, con o sin otros vehículos, está rodeado por un vehículo, que está, por lo tanto, en asociación con él.
El término "vehículo", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia farmacológicamente inactiva, tal como, pero no se limita a, un diluyente, excipiente o vehículo con el que se administra el principio terapéuticamente activo. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos o sólidos. El vehículo líquido incluye, pero no se limita a, líquidos estériles, tales como soluciones salinas en agua y aceites, que incluye de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. También se pueden emplear soluciones salinas y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para disoluciones inyectables. Una solución salina es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin.
"Excipientes" farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, caliza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares.
El término "adyuvante" se refiere a agentes que aumentan, estimulan, activan, potencian o modulan el efecto terapéutico del principio activo. Los ejemplos de dichos adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes inorgánicos (por ejemplo, sales metálicas inorgánicas, tales como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio), adyuvantes orgánicos (por ejemplo, saponinas o escualeno), adyuvantes basados en aceite (por ejemplo, adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund), citocinas (por ejemplo, IL-1 p, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, GM-CFS e INF-y), adyuvantes en partículas (por ejemplo, complejos inmunoestimulantes (ISCOMS), liposomas o microesferas biodegradables), virosomas, adyuvantes bacterianos (por ejemplo, monofosforil lípido A, o muramil péptidos), adyuvantes sintéticos (por ejemplo, copolímeros de bloque no iónicos, análogos de muramil péptidos o lípido A sintético), o adyuvantes de polinucleótidos sintéticos (por ejemplo, poliarginina o polilisina).
Como se usa en el presente documento, un "paciente" significa cualquier mamífero, reptil o ave que puede beneficiarse de la presente invención. Preferentemente, un paciente se selecciona del grupo que consiste en animales de laboratorio (por ejemplo, ratón, rata o conejo), animales domésticos (incluyendo, por ejemplo, cobaya, conejo, caballo, burro, vaca, ovejas, cabra, cerdo, pollo, pato, camello, gato, perro, tortuga, galápago, serpiente o lagarto) o primates, que incluyen chimpancés, bonobos, gorilas y seres humanos. Se prefiere particularmente que el "paciente" sea un ser humano.
La materia reivindicada se define por las reivindicaciones.
Para identificar biomarcadores candidatos que permiten evaluar o predecir los efectos de la metformina, se cribó un gran panel de 237 marcadores bioquímicos. Estos se ensayaron en muestras basales de suero recogidas en 8.401 participantes (aproximadamente el 25 % de los cuales estaban tomando diversas dosis de metformina), y explorando resultados clave usando modelos de tejido y animales. Se Identificaron los niveles de GDF15 como un biomarcador adecuado, que indica la respuesta al uso de metformina en personas con disglucemia y factores de riesgo cardiovasculares adicionales. Además, se descubrió que la concentración de GDF15 refleja estrechamente la dosis de metformina.
En el presente documento se describe la metformina para su uso en el tratamiento de un paciente, en donde el paciente presenta un aumento del nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo, en respuesta al tratamiento con metformina.
La enfermedad o trastorno es diabetes de tipo II.
En particular, el GDF15 comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 1, o una variante funcional del mismo. En particular, la variante funcional presenta las mismas propiedades funcionales que GDF15 nativo. La variante funcional presenta al menos el 90 %, 95 %, 97 % o 99 % de identidad de secuencia con GDF15 según SEQ ID NO: 1.
El nivel de GDF15 aumenta en al menos el 25 %, es decir, el nivel de GDF15 o una variante del mismo aumenta en el 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 %. En particular, el nivel de GDF15 aumenta en al menos el 50 %, en particular en al menos el 75 % o al menos el 100 %. En particular, el nivel de GDF15 aumenta en del 25 % al 200 %, en particular en del 30 % al 150 %, en particular en del 50 al 100 %.
En particular, el paciente presenta un aumento del nivel de expresión de GDF15 o una variante funcional del mismo.
En particular, el nivel de GDF15 aumenta en comparación con una referencia. La referencia puede ser el nivel de GDF15 medido en una muestra de referencia del paciente antes de la administración de metformina, en particular en una muestra de referencia del paciente tomada en un momento de tiempo antes de la administración de metformina. La referencia puede ser un valor de referencia representativo, en particular un valor de referencia que es representativo del nivel de GDF-15 en un sujeto que no ha recibido administración de metformina. El valor de referencia se puede ajustar para factores asociados a la tendencia a prescribir metformina. En particular, estos factores se seleccionan del grupo que consiste en edad, sexo, peso, evento cardiovascular previo, un diagnóstico previo de diabetes, creatinina sérica, HbA1c y glucosa plasmática en ayunas.
En particular, el paciente es un individuo que puede beneficiarse de la presente invención. En particular, un paciente se selecciona del grupo que consiste en mamífero, reptil o ave que. En particular, el paciente se selecciona del grupo que consiste en animales de laboratorio (por ejemplo, ratón, rata o conejo), animales domésticos (incluyendo, por ejemplo, cobaya, conejo, caballo, burro, vaca, ovejas, cabra, cerdo, pollo, pato, camel, gato, perro, tortuga, galápago, serpiente o lagarto) o primates, que incluyen chimpancés, bonobos, gorilas y seres humanos. En particular, el paciente es un ser humano.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método de identificación de un paciente con diabetes mellitus de tipo II que se beneficiará del tratamiento con metformina, que comprende las etapas de
(i) determinar el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo en una muestra obtenida del paciente con diabetes mellitus de tipo II que recibe metformina en una cantidad eficaz, y
(ii) comparar el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo, determinado en la etapa (i), con el de una referencia, en donde un aumento del nivel de GDF15 en al menos el 25 % es indicativo de una respuesta del paciente a la administración de metformina,
en donde el GDF15 comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 1, y la variante funcional del mismo tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.
En realizaciones particulares, una cantidad eficaz de metformina administrada es suficiente para lograr el fin previsto, es decir, es suficiente para inducir una respuesta en un sujeto que responde al tratamiento con metformina. Por consiguiente, la cantidad eficaz de metformina es una cantidad que induce una respuesta al tratamiento con metformina en un sujeto que responde a la metformina. En realizaciones particulares, la metformina se administra en una cantidad de 500-2000 mg, en particular en una cantidad de 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 o 2000 mg. Es bien conocido por el experto en la técnica cómo determinar una cantidad de metformina suficiente para inducir una respuesta al tratamiento con metformina en un individuo que responde a la metformina.
En realizaciones particulares, el GDF15 determinado en la etapa (ii) comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 1. En realizaciones, la variante funcional presenta las mismas propiedades funcionales que GDF15 nativo. En particular, la variante funcional presenta al menos el 95 %, 97 % o 99 % de identidad de secuencia con GDF15 según SEQ ID NO: 1.
En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo se determina en la etapa (i) por cualquier método muy conocido en la técnica. En particular, el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo se determina en la etapa (i) por un método seleccionado del grupo que consiste en ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación, HPLC, micromatrices, espectroscopía de masas y secuenciación. En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 se determina usando un ensayo de inmunodetección, en particular por ELISA.
En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo se determina en la etapa (i) directa o indirectamente usando una molécula de unión a GDF15. En particular, el nivel de GDF15 se determina usando un anticuerpo específico para GDF15. En particular, el nivel de GDF15 se determina usando un anticuerpo monoclonal específico para GDF15. En particular, el anticuerpo compite con un anticuerpo que reconoce un péptido que comprende los aminoácidos 197-308 de GDF-15 según SEQ ID NO: 1. En particular, el anticuerpo reconoce un antígeno que comprende los aminoácidos 197-308 de GDF-15 según SEQ ID NO: 1.
En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo en una muestra del paciente se determina en horas después de la administración de metformina. En particular, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo se determina en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas después de la administración de metformina. En particular, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo se determina en 12 horas después de la administración de metformina, en particular en 6 horas después de la administración de metformina. En particular, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo se determina en 1 a 12 horas, 2 a 10 horas o 4 a 8 horas después de la administración de metformina.
En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo en una muestra del paciente se determina en días después de la administración de metformina. En particular, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo se determina en 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 días después de la administración de metformina. En particular, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo se determina en 1 a 7 días, en particular en 1 a 5 días, en particular en 1 a 2 días después de la administración de metformina.
En realizaciones particulares, la muestra del paciente se selecciona del grupo que consiste en líquido corporal y muestra de tejido. En particular, la muestra de líquido corporal se selecciona del grupo que consiste en sangre completa, suero, plasma, esputo, saliva y orina.
En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo, en particular el nivel de expresión, aumenta en el 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o 200 %. En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 aumenta en al menos el 50 %, en particular en al menos el 75 % o al menos el 100 %. En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo es elevado en del 25 % al 200 %, en particular en del 30 % al 150 %, en particular en del 50 al 100 %.
En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo es elevado en comparación con una referencia. La referencia puede ser el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo, medido en una muestra de referencia del paciente tomada antes de la administración de metformina. En particular, en una muestra de referencia del paciente tomada en un momento de tiempo antes de la administración de metformina. La referencia puede ser un valor de referencia representativo, en particular un valor de referencia que es representativo del nivel de GDF-15 o una variante funcional del mismo, en un sujeto que no ha recibido administración de metformina. El valor de referencia se puede ajustar para factores asociados a la tendencia a prescribir metformina. En particular, estos factores se seleccionan del grupo que consiste en edad, sexo, peso, evento cardiovascular previo, un diagnóstico previo de diabetes, creatinina sérica, HbA1c y glucosa plasmática en ayunas.
En realizaciones adicionales, se determinan uno o más factores, además de GDF-15, en una etapa opcional (iii). En particular, los uno o más factores adicionales se seleccionan de la lista que consiste en:
(a) Niveles de glucosa en ayunas,
(b) Niveles de glucosa posprandial
(c) Niveles de fructosamina
(d) Albúmina glicada
En realizaciones particulares, uno o más de los factores seleccionados de la lista que consiste en
(a) HbA1c
(b) Niveles de glucosa aleatorios
(c) Niveles de insulina en ayunas
(d) Evaluación de modelo hemostático de resistencia a la insulina (HOMAIR)
(e) Otras medidas de resistencia a la insulina
(f) Niveles de lípidos, en particular seleccionados del grupo que consiste en HDL, LDL, colesterol total, triglicéridos, apolipoproteína B,
(g) Albuminuria, en particular microalbuminuria o macroalbuminuria
(h) Creatinina o GFR estimado,
(i) Nivel de ALT
(j) Nivel de vitamina B12
(k) Nivel de cotinina
(l) Longitud de telómeros
(m) uno o más de los biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en NT-proBNP, factor de trébol 3, apolipoproteína B, angiopoyetina-2, osteoprotegerina, alfa-macroglobulina, receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, glutatión S transferasa alfa, cromogranina A, proteína de unión a IGF 4, tenascina-C, selenoproteína P, quimiocina derivada de macrófagos, YKL-40, proteína de unión a IGF 2
(n) uno o más de los factores seleccionados del grupo que consiste en tensión arterial, peso, IMC, relación entre cintura y cadera, perímetro de la cintura, duración de la diabetes, hábito de fumar, evidencia por imágenes de hígado graso, niveles de troponina, disfunción LV, riesgo cardiovascular, otras complicaciones de la diabetes, obtención de imágenes de la retina y estudios de conducción nerviosa,
se pueden detectar en una etapa opcional (iv), en particular para confirmar resultados obtenidos por el método de las etapas (i) a (ii) o (i) a (iii).
En realizaciones particulares, el paciente es un individuo que puede beneficiarse de la presente invención. En particular, un paciente se selecciona del grupo que consiste en mamífero, reptil o ave que. En realizaciones particulares, el paciente se selecciona del grupo que consiste en animales de laboratorio (por ejemplo, ratón, rata o conejo), animales domésticos (incluyendo, por ejemplo, cobaya, conejo, caballo, burro, vaca, ovejas, cabra, cerdo, pollo, pato, camello, gato, perro, tortuga, galápago, serpiente o lagarto) o primates, que incluyen chimpancés, bonobos, gorilas y seres humanos. En particular, el paciente es un ser humano.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende metformina y al menos un vehículo, adyuvante y/o excipiente farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de diabetes mellitus de tipo II en un paciente,
en donde la dosis de metformina está adaptada por un método que comprende
(i) administrar metformina a un paciente,
(ii) determinar el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo en una muestra del paciente
(iii) comparar el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo determinado en la etapa (ii), con una referencia, y
(iv) ajustar la dosis de metformina de forma que el tratamiento con metformina se detenga en caso de que el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo no aumente en al menos 25 %, y la dosis de metformina se mantiene o aumenta en caso de que el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo aumente, en donde el GDF15 comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 1, y la variante funcional del mismo tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.
En realizaciones particulares, la metformina se administra en la etapa (i) en una cantidad suficiente para lograr el fin previsto, es decir, es suficiente para inducir una respuesta en un sujeto que responde al tratamiento con metformina. Por consiguiente, la cantidad eficaz de metformina administrada en la etapa (i) es una cantidad que induce una respuesta al tratamiento con metformina en un sujeto que responde a la metformina. En realizaciones particulares, la metformina se administra en la etapa (i) en una cantidad de 500-2000 mg, en particular en una cantidad de 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 o 2000 mg. Es bien conocido por el experto en la técnica cómo determinar la cantidad de metformina suficiente para inducir una respuesta al tratamiento con metformina en un individuo que responde a la metformina.
En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo, en particular el nivel de expresión de GDF15 o la variante funcional del mismo, determinado en la etapa (ii) aumenta en el 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 %. En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 aumenta en al menos el 50 %, en particular en al menos el 75 % o al menos el 100 %. En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo es elevado en del 25 % al 200 %, en particular en del 30 % al 150 %, en particular en del 50 al 100 %.
En realizaciones particulares, el GDF15 determinado en la etapa (ii) comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 1. En realizaciones, la variante funcional presenta las mismas propiedades funcionales que GDF15 nativo. En particular, la variante funcional presenta al menos el 80 % de identidad de secuencia con GDF15 según SEQ ID NO: 1. En particular, la variante funcional presenta al menos el 95 %, 97 % o 99 % de identidad de secuencia con GDF15 según SEQ ID NO: 1.
En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo se determina en la etapa (ii) por cualquier método muy conocido en la técnica. En particular, el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo se determina en la etapa (ii) por un método seleccionado del grupo que consiste en ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación, HPLC, micromatrices, espectroscopia de masas y secuenciación. En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 se determina usando un ensayo de inmunodetección.
En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo se determina en la etapa (ii) directa o indirectamente usando una molécula de unión a GDF15. En particular, el nivel de GDF15 se determina usando un anticuerpo especifico para GDF15. En particular, el nivel de GDF15 se determina usando un anticuerpo monoclonal especifico para GDF15. En realizaciones, el anticuerpo compite con un anticuerpo que reconoce un péptido que comprende los aminoácidos 197-308 de GDF-15. En particular, el anticuerpo compite con un anticuerpo que reconoce un péptido que comprende los aminoácidos 197-308 de GDF-15 según SEQ ID NO: 1. En particular, el anticuerpo reconoce un péptido que comprende los aminoácidos 197-308 de GDF-15 según SEQ ID NO: 1.
En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo en una muestra del paciente se determina en la etapa (ii) en horas después de la administración de metformina. En particular, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo se determina en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas después de la administración de metformina. En particular, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo se determina en 12 horas después de la administración de metformina, en particular en 6 horas después de la administración de metformina. En particular, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo se determina en 1 a 12 horas, 2 a 10 horas o 4 a 8 horas después de la administración de metformina.
En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo en una muestra del paciente se determina en la etapa (ii) en dias después de la administración de metformina. En particular, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo se determina en 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 dias después de la administración de metformina. En particular, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo se determina en 1 a 7 dias, en particular en 1 a 5 dias, en particular en 1 a 2 dias después de la administración de metformina.
En realizaciones particulares, la muestra del paciente se selecciona del grupo que consiste en liquido corporal y muestra de tejido. En particular, la muestra de liquido corporal se selecciona del grupo que consiste en sangre completa, suero, plasma, esputo, saliva y orina.
En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo es elevado en comparación con una referencia. La referencia puede ser el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo, medido en una muestra de referencia del paciente tomada antes de la administración de metformina. En particular, en una muestra de referencia del paciente tomada en un momento de tiempo antes de la administración de metformina. La referencia puede ser un valor de referencia representativo, en particular un valor de referencia que es representativo del nivel de GDF-15 o una variante funcional del mismo, en un sujeto que no ha recibido administración de metformina. El valor de referencia se puede ajustar para factores asociados a la tendencia a prescribir metformina. En particular, estos factores se seleccionan del grupo que consiste en edad, sexo, peso, evento cardiovascular previo, un diagnóstico previo de diabetes, creatinina sérica, HbA1c y glucosa plasmática en ayunas.
En realizaciones, la dosis de metformina aumenta en la etapa (iv) en el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o 200 % en caso de que el nivel de GDF15 sea elevado, en particular en respuesta a la administración de metformina inicial.
En realizaciones particulares, el paciente es un individuo que puede beneficiarse de la presente invención. En particular, un paciente se selecciona del grupo que consiste en mamifero, reptil o ave que. En realizaciones particulares, el paciente se selecciona del grupo que consiste en animales de laboratorio (por ejemplo, ratón, rata o conejo), animales domésticos (incluyendo, por ejemplo, cobaya, conejo, caballo, burro, vaca, ovejas, cabra, cerdo, pollo, pato, camello, gato, perro, tortuga, galápago, serpiente o lagarto) o primates, que incluyen chimpancés, bonobos, gorilas y seres humanos. En particular, el paciente es un ser humano.
En realizaciones adicionales, se determinan uno o más factores, además de GDF-15, en una etapa opcional (v). En particular, los uno o más factores adicionales se seleccionan de la lista que consiste en:
(a) Niveles de glucosa en ayunas,
(b) Niveles de glucosa posprandial
(c) Niveles de fructosamina
(d) Albúmina glicada
En realizaciones particulares, uno o más de los factores seleccionados de la lista que consiste en
(a) HbA1c
(b) Niveles de glucosa aleatorios
(c) Niveles de insulina en ayunas
(d) Evaluación de modelo hemostático de resistencia a la insulina (HOMAIR)
(e) Otras medidas de resistencia a la insulina
(f) Niveles de lípidos, en particular seleccionados del grupo que consiste en HDL, LDL, colesterol total, triglicéridos, apolipoproteína B,
(g) Albuminuria, en particular microalbuminuria o macroalbuminuria
(h) Creatinina o GFR estimado,
(i) Nivel de ALT
(j) Nivel de vitamina B12
(k) Nivel de cotinina
(l) Longitud de telómeros
(m) uno o más de los biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en NT-proBNP, factor de trébol 3, apolipoproteína B, angiopoyetina-2, osteoprotegerina, alfa-2-macroglobulina, receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, glutatión S transferasa alfa, cromogranina A, proteína de unión a IGF 4, tenascina-C, selenoproteína P, quimiocina derivada de macrófagos, YKL-40, proteína de unión a IGF 2 (n) uno o más de los factores seleccionados del grupo que consiste en tensión arterial, peso, IMC, relación entre cintura y cadera, perímetro de la cintura, duración de la diabetes, hábito de fumar, evidencia por imágenes de hígado graso, niveles de troponina, disfunción LV, riesgo cardiovascular, otras complicaciones de la diabetes, obtención de imágenes de la retina y estudios de conducción nerviosa,
se pueden detectar en una etapa opcional (vi), en particular para confirmar resultados obtenidos por el método de las etapas (i) a (iii) o (v).
Cualquiera de estos factores adicionales determinados en la etapa opcional (v) o (vi) se determina posterior a la etapa (iii) y antes de la etapa (iv).
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona el uso de GDF15 o una variante funcional del mismo, como biomarcador para identificar un paciente que se beneficiará del tratamiento con metformina, en donde GDF15 comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 1, o una variante funcional del mismo que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.
En el presente documento se describe un kit para su uso en identificar un paciente que se beneficiará o que no se beneficiará del tratamiento con metformina, que comprende medios de detección del nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo.
En particular, los medios de detección del nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo son adecuados para detectar el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo, por cualquier método muy conocido en la técnica. En particular, los medios de detección del nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo son adecuados para detectar GDF15 o la variante funcional del mismo, por un método seleccionado del grupo que consiste en ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación, HPLC, micromatrices, espectroscopía de masas y secuenciación. En realizaciones particulares, los medios de detección del nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo son adecuados para detectar GDF15 o la variante funcional del mismo, por un ensayo de inmunodetección.
En particular, los medios de detección del nivel de expresión de GDF15 o la variante funcional del mismo son adecuados para determinar directa o indirectamente el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo. En realizaciones particulares, los medios de detección del nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo comprenden una molécula de unión a GDF15. En particular, los medios de detección del nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo comprenden un anticuerpo específico para GDF15. En particular, los medios de detección del nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo comprenden anticuerpo monoclonal específico para GDF15. En particular, el anticuerpo compite con un anticuerpo que reconoce un péptido que comprende los aminoácidos 197-308 de GDF-15 según SEQ ID NO: 1. En particular, el anticuerpo reconoce un péptido que comprende los aminoácidos 197-308 de GDF-15 según SEQ ID NO: 1.
En particular, el kit comprende además reactivos requeridos para realizar el método de detección deseado.
En particular, los reactivos se pueden seleccionar del grupo que consiste en tampones, diluyentes y disolventes.
En particular, el kit comprende además uno o más de los siguientes
(a) un recipiente,
(b) control adecuado, y/o
(c) un soporte de datos, en donde el soporte de datos comprende información tal como
(i) instrucciones referentes a métodos de identificación de un paciente que tiene una alta probabilidad de responder al tratamiento con metformina
(ii) instrucciones para el uso de los medios para detectar el nivel de GDF15,
(iii) información de calidad, tal como información sobre el lote/número de lote de los medios para detectar el nivel de GDF15 y/o del kit, el sitio de fabricación o ensamblaje o la fecha de caducidad o fecha límite de venta, información referente al correcto almacenamiento o manipulación del kit,
(iv) información referente a la composición del tampón (tampones), diluyente(s), reactivo(s) para detectar el nivel de GDF15,
(v) información referente a la interpretación de información obtenida cuando se realizan los métodos mencionados anteriormente de identificación de un paciente que tiene una alta probabilidad de responder al tratamiento con metformina,
(vi) un aviso referente a posibles malinterpretaciones o resultados erróneos cuando se aplican métodos no adecuados y/o medios no adecuados, y/o
(vii) un aviso referente a posibles malinterpretaciones o resultados erróneos cuando se una a reactivo(s) no adecuado(s) y/o tampón (tampones) no adecuados.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona el uso del kit como se describe en el presente documento en un método del primer aspecto. Por consiguiente, el kit desvelado anteriormente es para su uso en un método de identificación de un paciente que se beneficiará o que no se beneficiará del tratamiento con metformina detectando el nivel de GDF-15 en una muestra de dicho paciente.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un método de identificación de un paciente con diabetes de tipo 2 que no se beneficiará del tratamiento con metformina, que comprende las etapas de
(i) determinar el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo en una muestra obtenida del paciente con diabetes mellitus de tipo II que recibe metformina en una cantidad eficaz,
(ii) comparar el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo, determinado en la etapa (i), con el de una referencia, en donde un nivel inalterado o reducido de GDF15 o una variante funcional del mismo es indicativo de un paciente que no responde a la administración de metformina, y
(iii) el tratamiento con metformina se interrumpe si el paciente presenta un nivel inalterado o reducido de GDF15 o una variante funcional del mismo,
en donde el GDF15 comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 1, y la variante funcional del mismo tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.
En realizaciones particulares, una cantidad eficaz de metformina administrada es suficiente para lograr el fin previsto, es decir, es suficiente para inducir una respuesta en un sujeto que responde al tratamiento con metformina. Por consiguiente, la cantidad eficaz de metformina administrada es una cantidad que induce una respuesta al tratamiento con metformina en un sujeto que responde a metformina. En realizaciones particulares, la metformina se administra en la etapa (i) en una cantidad de 500-2000 mg, en particular en una cantidad de 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 o 2000 mg. Es bien conocido por el experto en la técnica cómo determinar la cantidad de metformina suficiente para inducir una respuesta al tratamiento con metformina en un individuo que responde a la metformina.
En realizaciones particulares, el GDF15 determinado en la etapa (ii) comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 1. En realizaciones, la variante funcional presenta las mismas propiedades funcionales que GDF15 nativo. En particular, la variante funcional el 90 %, 95 %, 97 % o 99 % de identidad de secuencia con GDF15 según SEQ ID NO: 1.
En particular, el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo se determina en la etapa (i) por un método seleccionado del grupo que consiste en ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación, HPLC, micromatrices, espectroscopía de masas y secuenciación. En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 se determina usando un ensayo de inmunodetección.
En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo se determina en la etapa (i) directa o indirectamente usando una molécula de unión a GDF15. En particular, el nivel de GDF15 se determina usando un anticuerpo específico para GDF15. En particular, el nivel de GDF15 se determina usando un anticuerpo monoclonal específico para GDF15. En realizaciones, el anticuerpo compite con un anticuerpo que reconoce un péptido que comprende los aminoácidos 197-308 de GDF-15. En particular, el anticuerpo compite con un anticuerpo que reconoce un péptido que comprende los aminoácidos 197-308 de GDF-15 según SEQ ID NO: 1. En particular, el anticuerpo reconoce un péptido que comprende los aminoácidos 197-308 de GDF-15 según SEQ ID NO: 1.
En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo en una muestra del paciente se determina en horas después de la administración de metformina. En particular, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo se determina en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 o 24 horas después de la administración de metformina. En particular, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo se determina en 12 horas después de la administración de metformina, en particular en 6 horas después de la administración de metformina. En particular, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo se determina en 1 a 12 horas, 2 a 10 horas o 4 a 8 horas después de la administración de metformina.
En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo en una muestra del paciente se determina en días después de la administración de metformina. En particular, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo se determina en 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 días después de la administración de metformina. En particular, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo se determina en 1 a 7 días, en particular en 1 a 5 días, en particular en 1 a 2 días después de la administración de metformina.
En realizaciones particulares, la muestra del paciente se selecciona del grupo que consiste en líquido corporal y muestra de tejido. En particular, la muestra de líquido corporal se selecciona del grupo que consiste en sangre completa, suero, plasma, esputo, saliva y orina.
En realizaciones adicionales, se determinan uno o más factores, además de GDF-15, en una etapa opcional (iv). En particular, los uno o más factores adicionales se seleccionan de la lista que consiste en:
(i) Niveles de glucosa en ayunas,
(j) Niveles de glucosa posprandial
(k) Niveles de fructosamina
(l) Albúmina glicada
En realizaciones particulares, uno o más de los factores seleccionados de la lista que consiste en
(cc) HbA1c
(dd) Niveles de glucosa aleatorios
(ee) Niveles de insulina en ayunas
(ff) Evaluación de modelo hemostático de resistencia a la insulina (HOMAIR)
(gg) Otras medidas de resistencia a la insulina
(hh) Niveles de lípidos, en particular seleccionados del grupo que consiste en HDL, LDL, colesterol total, triglicéridos, apolipoproteína B,
(ii) Albuminuria, en particular microalbuminuria o macroalbuminuria
(jj) Creatinina o GFR estimado,
(kk) Nivel de ALT
(ll) Nivel de vitamina B12
(mm) Nivel de cotinina
(nn) Longitud de telómeros
(oo) uno o más de los biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en NT-proBNP, factor de trébol 3, apolipoproteína B, angiopoyetina-2, osteoprotegerina, alfa-2-macroglobulina, receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, glutatión S transferasa alfa, cromogranina A, proteína de unión a IGF 4, tenascina-C, selenoproteína P, quimiocina derivada de macrófagos, YKL-40, proteína de unión a IGF 2 (pp) uno o más de los factores seleccionados del grupo que consiste en tensión arterial, peso, IMC, relación entre cintura y cadera, perímetro de la cintura, duración de la diabetes, hábito de fumar, evidencia por imágenes de hígado graso, niveles de troponina, disfunción LV, riesgo cardiovascular, otras complicaciones de la diabetes, obtención de imágenes de la retina y estudios de conducción nerviosa,
se pueden detectar en una etapa opcional (v), en particular para confirmar resultados obtenidos por el método de las etapas (i) a (iii).
En realizaciones particulares, el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo es reducida en comparación con una referencia. La referencia puede ser el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo, medido en una muestra de referencia del paciente tomada antes de la administración de metformina. En particular, en una muestra de referencia del paciente tomada en un momento de tiempo antes de la administración de metformina. La referencia puede ser un valor de referencia representativo, en particular un valor de referencia que es representativo del nivel de GDF-15 o una variante funcional del mismo, en un sujeto que no ha recibido administración de metformina. El valor de referencia se puede ajustar para factores asociados a la tendencia a prescribir metformina. En particular, estos factores se seleccionan del grupo que consiste en edad, sexo, peso, evento cardiovascular previo, un diagnóstico previo de diabetes, creatinina sérica, HbA1c y glucosa plasmática en ayunas.
En realizaciones particulares, un paciente se selecciona del grupo que consiste en mamífero, reptil o ave que. En realizaciones particulares, el paciente se selecciona del grupo que consiste en animales de laboratorio (por ejemplo, ratón, rata o conejo), animales domésticos (incluyendo, por ejemplo, cobaya, conejo, caballo, burro, vaca, ovejas, cabra, cerdo, pollo, pato, camello, gato, perro, tortuga, galápago, serpiente o lagarto) o primates, que incluyen chimpancés, bonobos, gorilas y seres humanos. En particular, el paciente es un ser humano.
En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a sulfonilureas, agonista de dopamina, inhibidores de DPP-4, péptidos de tipo glucagón, meglitinidas, amilinomimético, inhibidores de la alfa-glucosidasa, inhibidores de SGLT2 y/o tiazolidinadionas para su uso en el tratamiento de un paciente, en donde el paciente presenta un nivel inalterado o reducido de GDF15 en respuesta al tratamiento con metformina, y en donde el paciente está en riesgo de desarrollar o padecer diabetes mellitus de tipo II.
La invención se describe con más detalle en los ejemplos y figuras que no se deben entender como limitantes del alcance de la presente invención.
Ejemplos
Se reclutaron 12.537 personas con diabetes, intolerancia a la glucosa o estado en ayunas que tuvieron factores de riesgo CV adicionales1112. Después de ser asignados aleatoriamente a normoglucemia o tratamiento de referencia mediado por insulina glargina basal, y a suplementos de ácidos grasos omega 3 o placebo usando un diseño factorial, fueron seguidos durante una mediana de 6,2 años para eventos cardiovasculares y otros resultados de salud. Antes de la aleatorización, 8.494 (68 %) participantes proporcionaron una muestra de sangre basal que se centrifugó, se separó, se dividió en alícuotas, se congeló (en 2 horas desde la recogida) y se transportó al biobanco de Population Health Research Institute (PHRI) en Hamilton, Canadá, donde se almacenó en tanques enfriados con vapor de nitrógeno a -160° Celsius. Un subconjunto de estos participantes (5.078) dieron consentimiento adicional para el almacenamiento y análisis de material genético de muestras de capa leucocítica.
Después de completarse el ensayo, se transportó una alícuota de 1 ml de suero a Myriad RBM (Austin, Texas, EE. UU.) para el análisis múltiple de 284 biomarcadores que se había sugerido antes de la investigación que estaban relacionados con enfermedad cardiovascular o diabetes. En Myriad RBM Inc., las muestras se descongelaron a temperatura ambiente (TA), se mezclaron en vórtex, se centrifugaron a 13.000 g durante 5 minutos para la clarificación y se tomó una alícuota en una placa de microtitulación maestra para el análisis. Usando pipeteado automatizado, una alícuota de cada muestra se introdujo en una de las mezclas múltiples de microesferas de captura de Human DiscoveryMAP. Las mezclas de muestra y microesferas de captura se mezclaron minuciosamente y se incubaron a TA durante 1 hora. Entonces se añadieron robóticamente las mezclas múltiples de anticuerpos indicadores biotinilados para cada mezcla múltiple (tal como GDF-15), y después de una mezcla exhaustiva, se incubaron duranta una hora adicional a TA. Las mezclas múltiples se desarrollaron usando un exceso de disolución de estreptavidina-ficoeritrina que se mezcló minuciosamente en cada mezcla múltiple y se incubó durante 1 hora a TA. El volumen de cada reacción múltiple se redujo por filtración a vacío y luego se aumentó por dilución en tampón de matriz para el análisis. El análisis se realizó en instrumentos Luminex 100 y 200 y la corriente de datos resultante se interpretó usando software de análisis de datos patentado desarrollado en RBM. Para cada mezcla múltiple, se incluyeron tanto calibradores como controles en cada placa de microtitulación. Se sometieron a electroforesis calibradores de ocho puntos en la primera y última columna de cada placa y se incluyeron por duplicado controles de calidad de nivel 3. Los resultados de la prueba se determinaron primero para los controles altos, medios y bajos para cada mezcla múltiple para garantizar el adecuado rendimiento del ensayo. Se determinaron valores desconocidos para cada uno de los analitos localizado en una mezcla múltiple específica usando algoritmos de ajuste a curva de 4 y 5 parámetros, ponderados y no ponderados, incluidos en el paquete de análisis de datos40. Solo se facilitó un número de identificación (es decir, ninguna otra información) con las muestras. Como se ha informado previamente, después de la revisión enmascarada de los resultados informados, 237 biomarcadores de los 8.401 participantes fueron considerados adecuados para análisis adicional13. También se genotipó como se describe a continuación un subconjunto de 4390 de estos individuos que dieron su consentimiento para los análisis genéticos.
Ejemplo 1: Identificación de biomarcadores relacionados con el uso de metformina
Los 237 biomarcadores disponibles se analizaron para identificar los que fueron determinantes estadísticamente independientes del uso de metformina usando modelos de regresión logística no ajustada y selección hacia adelante. De los 31 biomarcadores significativos identificados usando este enfoque, 1 biomarcador (factor de diferenciación de crecimiento 15 - GDF15) tuvo un tamaño de efecto que fue más de 3 veces superior a cualquiera de los otros. Por lo tanto, todos los análisis restantes se centraron en este 1 biomarcador como se describe en detalle a continuación.
Un total de 2317/8401 (27,6 %) participantes con biomarcadores medidos estuvieron tomando metformina. Como se observa en la Tabla 1, en comparación con personas que no tomaban metformina, las que tomaban metformina tenían más posibilidades de: a) ser mujeres, más jóvenes y más pesadas; b) tener diabetes, hipertensión y albuminuria; c) tener mejor función renal; y d) tomar inhibidores de ACE o bloqueantes del receptor de la angiotensina. Tuvieron menos posibilidades de haber tenido un evento cardiovascular previo o tomar bloqueantes beta o agentes antiplaquetarios.
Tabla 1: r rí i l r i i n l i i m r r m n m f rmin
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Después de ajustar los factores asociados a la tendencia a prescribir metformina que incluyen edad, sexo, peso, evento cardiovascular previo, un diagnóstico previo de diabetes, creatinina sérica, HbA1c y la glucosa plasmática en ayunas, el enfoque de selección hacia adelante identificó 26 biomarcadores que se asociaron independientemente al uso de metformina (es decir, el valor de p para cada biomarcador era < 0,00021). Con la excepción de GDF15, la probabilidad de uso de metformina para cada 1 aumento de desviación estándar en el nivel de estos biomarcadores osciló desde 0,71 hasta 1,24 (Tabla 2).
Tabla 2: Determinantes de biomarcadores independientes del uso de metformina en el nivel inicial*
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En cambio, como se observa en la Figura 1A, la oportunidad relativa de uso de metformina por cada aumento de 1 unidad en el nivel de GDF15 varió de 3,73 (ID del 95 % 3,40, 3,49) a 3,94 (IC del 95 % 3,59, 4,33) dependiendo de las variables clínicas específicas que se incluyeron. Para determinar el grado al que los otros 236 biomarcadores afectaron la asociación observada entre GDF15 y el uso de metformina, se examinaron modelos de regresión logística que solo incluyeron GDF15 (es decir, ninguno de los otros biomarcadores) y las variables clínicas. Estos modelos mostraron coherentemente una oportunidad relativa más pequeña de aproximadamente 2,6 (Figura 1 B).
La concentración media de GDF15 aumentó con dosis progresivamente más altas de metformina (Figura 2). Después de tener en cuenta la edad, el sexo, el peso, un evento cardiovascular previo, diabetes previa, creatinina, HbA1c y FPG, cada 1 desviación estándar más en el nivel de GDF15 transformado con el logaritmo natural (equivalente a un incremento retrotransformado de 1,52 ng/ml) predijo aproximadamente una dosis de metformina más alta de 282 mg (P<0,0001).
Este análisis de 237 biomarcadores en el suero de personas con intolerancia a la glucosa, estado en ayunas o diabetes temprana ha identificado claramente GDF15 como un importante y novedoso biomarcador para el uso y dosis de metformina. El uso de metformina también se asoció independientemente (pero mucho menos fuertemente) a mayores o menores niveles de los otros 25 biomarcadores medidos (Tabla 2). Los restantes biomarcadores tampoco estuvieron asociados estadísticamente a la metformina debido a que: a) realmente no estuvieron asociados a la metformina; o b) su relación con la metformina se explicó estadísticamente por una relación con o GDF15 o 1 o más de los otros 25 biomarcadores que se asociaron con la metformina. Estas posibilidades se explotaron evaluando los determinantes genéticos y de biomarcadores de GDF15. La ausencia de cualquier relación entre el polimorfismo genético asociado a niveles de GDF15 y otros biomarcadores sugiere que es poco probable que el efecto de la metformina sobre cualquiera de los otros biomarcadores esté mediado por su efecto sobre GDF15.
La metformina es un fármaco hipoglucemiante eficaz y estos datos muestran claramente que el nivel de GDF15 es un fuerte indicador del uso y dosis de metformina. Estos análisis también muestran que es probable que el efecto de la metformina sobre los niveles de GDF15 sea independiente de su efecto sobre los niveles de glucosa por varios motivos. En primer lugar, como se observa anteriormente y en la Figura 1 y Tabla 2, la fuerte relación observada entre los niveles de GDF15 y tanto el uso como la dosis de metformina es independiente de la relación entre la metformina y los marcadores de metabolismo de la glucosa que incluyen niveles de HbA1c, nivel de glucosa en ayunas, niveles de insulina y niveles de proinsulina. En segundo lugar, la insulina en sí no tuvo efecto sobre la secreción de hepatocitos de GDF15. En tercer lugar, la variante genética asociada a mayores niveles de GDF15 no está asociada estadísticamente a ningún otro biomarcador asociado a la fisiología de la glucosa.
Ejemplo 2: Efecto de la metformina sobre la producción y secreción de GDF15 en estudios de hepatocitos de ratón
Para comprender mejor la relación entre la metformina y los niveles de GDF15, se realizaron experimentos in vitro usando hepatocitos de ratón. Se aislaron hepatocitos primarios de 4 ratones macho C57BI6 naturales diferentes mediante digestión con colagenasa como se ha descrito previamente14. Brevemente, las células se sembraron en placas de 12 pocillos recubiertas de colágeno durante la noche en medio E de William que contenía un 10 % de suero bovino fetal (FBS) y un 1% de antibiótico-antimicótico. A la mañana siguiente, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato y el medio se sustituyó por medio E de William nuevo que contenía 0,1 % de FBS y o ningún fármaco, metformina (concentraciones de 250-1000 μM), activador directo de AMPK A769662 (10 μM; LC Laboratories, Woburn, MA), insulina (10 nM; Life Technologies) o peróxido de hidrógeno (0,5 mM, EMD Millipore) durante 24 horas. A continuación, se ultracongeló el medio y se almacenó a -80 °C para su posterior análisis, y se recogieron las células en tampón de lisis celular para evaluar la proteína total o el ARN.
La liberación de GDF15 en el medio se midió utilizando un kit ELISA comercial (R&D Systems, Mineápolis, MN) y se expresó por mg de proteína de hepatocito. El ARN total se aisló con el kit Trizol plus RNA Purification (Ambion), se concentró con Speedvac (Thermo) y se cuantificó con Quant-IT RiboGreen (LifeTech). A continuación, el ARN total se retrotranscribió y se amplificó usando el kit de amplificación de ARN Illumina TotalPrep (LifeTech) según el protocolo del fabricante. Las muestras se hibridaron en el BeadChip de ADN complementario de Illumina Mouse Ref-8 v2.0 y se escanearon en el sistema iScan (Illumina). El perfil de sonda de la muestra sin procesar y el perfil de sonda de control se exportaron desde GenomeStudio versión 1.9.0 (Illumina). Los valores de expresión se ajustaron para el efecto de fondo utilizando las sondas de control negativo15 y se normalizaron usando normalización por cuantiles y se transformaron por In16. Se analizó un total de 12381 sondas de transcripción de ARN que tenían un valor de P de detección < 0,05 en >50 % de las muestras.
Dado que el hígado es el órgano primario en el que se acumula la metformina18, se probaron sus efectos en hepatocitos aislados de ratón. La metformina (0,5 mM), pero no el vehículo, aumentó la proteína GDF15 en el medio de hepatocitos (Figura 3, panel A). Además, el aumento de la secreción de proteína GDF15 se acompañó de un aumento de 1,6 veces en el ARNm de GDF15 (Figura 3, panel B; P=0,003). Cabe destacar que la secreción de GDF15 no se vio afectada ni por el activador directo de la AMPK A7696621920, ni por los factores que han demostrado que alteran la expresión de GDF15 en otras líneas celulares que incluyen la insulina21 y el peróxido de hidrógeno22 (Figura 4A).
El hecho de que la relación metformina-GDF15 únicamente se atenúe ligeramente tras ajustar los niveles de glucosa y HbA1c ilustra que GDF15 refleja un efecto no glucémico de la metformina.
Ejemplo 3: Efecto de la metformina sobre la producción y secreción de GDF15 en ratones en estudios in vivo
A continuación, se investigaron in vivo los efectos de la metformina sobre el GDF15 sérico tratando ratones con metformina tanto de forma aguda como crónica. Para los experimentos agudos, 12 ratones macho C57bl6 (Jackson Laboratories) de 20 semanas de edad (es decir, 6 por grupo) ayunaron durante 12 horas y luego se dejó que se alimentaran a voluntad durante 2 horas antes de la inyección con o metformina (250 mg/kg en 10 μl/g de peso corporal de solución salina) o vehículo (10 μl/g de peso corporal de solución salina) por vía intraperitoneal. Se recogió sangre 90 minutos más tarde por sangrado de la vena de la cola y se analizaron los niveles de GDF15 en suero usando el Elisa descrito anteriormente (R&D Systems, Mineápolis, MN). A continuación, se evaluó la durabilidad de este efecto en experimentos de tratamiento crónico midiendo los niveles séricos de GDF15 en ratones C57bl6 macho obesos de 8 semanas de edad alimentados con una dieta rica en grasa (HFD; 60% kcal de grasa) durante 6 semanas17. A ocho de estos ratones (es decir, 4 por grupo) se les añadió metformina (2,5 g/kg de dieta) o ningún fármaco a la HFD durante 6 semanas más. Al final del periodo de tratamiento, se tomaron muestras de sangre alimentada por sangrado de la vena de la cola de los animales y se midió el GDF15 sérico como antes. Todos los experimentos con animales fueron autorizados por el Comité de Ética Animal de la Universidad McMaster.
En comparación con una inyección de solución salina, la metformina (250 mg/kg) aumentó significativamente (P<0,05) los niveles séricos de GDF15 a los 90 minutos (Figura 5, panel A). La durabilidad de esta respuesta se evaluó en ratones obesos resistentes a la insulina tratados con una dieta rica en grasa suplementada con metformina (suministrada como 2,5 g/kg de metformina en una dieta rica en grasa al 60%, una dosis que produce concentraciones clínicamente relevantes de metformina sérica y mejora la homeostasis de la glucosa)1718 durante 6 semanas. Como se observa en la Figura 5 (panel B), la metformina aumentó significativamente los niveles séricos de GDF15 en comparación con los controles no tratados (P<0,05).
Ejemplo 4: Genotipado de los participantes
Se genotiparon muestras en el chip HumanCore Exome de Illumina. Se evaluaron las medidas estándar de control de calidad. Los SNP se excluyeron basándose en tasas de éxito bajas (<99 %), desviación de Hardy-Weinberg (p<10-7) y frecuencia alélica menor baja (MAF<0,01). También se eliminaron las muestras con tasas de éxito bajas (<99 %), parentesco críptico y falta de concordancia entre su genética y el sexo o etnia notificados. Tras el control de calidad, la muestra consistió en 4.390 participantes y 284.024 SNP. Se completó un GWAS para cada biomarcador en ORIGIN usando los 284.024 SNP tipificados. Se realizó una regresión lineal de cada SNP con cada biomarcador usando el software PLINK (versión 1.07), con la concentración del biomarcador como variable dependiente. Los modelos de regresión se calcularon primero en cada grupo étnico por separado (africanos, europeos/caucásicos y latinoamericanos), ajustando por edad, sexo y componentes principales 1 -5. A continuación, se realizó un metanálisis de los resultados en estos grupos para garantizar una tendencia relativamente coherente en todos los grupos étnicos, reducir el número de falsos positivos y minimizar el riesgo de confusión causada por la estratificación de la población.
Se utilizaron dos enfoques para explorar la relación entre GDF15 y otros biomarcadores que pueden cambiar en concierto con GDF15. En primer lugar, se mostró que un polimorfismo genético en el intrón del gen GDF15 estaba relacionado con niveles de GDF15 más elevados (rs1227731; aumento de 0,378 en la concentración por alelo, P=4,01e-40). En segundo lugar, se evaluó la relación entre este polimorfismo y cada uno de los 236 niveles de biomarcadores usando 236 modelos de regresión lineal en los 4390 participantes que dieron su consentimiento para los análisis genéticos. Ninguno de los otros biomarcadores se relacionó con este polimorfismo con un valor P inferior a 0,00021 antes o después del ajuste por uso de metformina.
Ejemplo 5: Análisis estadísticos
Se realizaron análisis estadísticos usando SAS versión 9.2 para UNIX (SAS Institute Inc., Cary, Carolina del Norte) o R (versión 3.0.1), y los análisis de datos se basaron en los niveles de GDF15 transformados con logaritmos naturales. Se usaron modelos de regresión para analizar los datos humanos y pruebas de la t de Student o la prueba de Tukey para analizar los datos del estudio de hepatocitos y ratones.
El biomarcador GDF15 se identificó analizando a fondo los resultados de cinco modelos de regresión diferentes que forzaban la edad, el sexo y las características clínicas que se sabe que están relacionadas con la propensión de los médicos a prescribir metformina (es decir, peso, enfermedad cardiovascular previa, diabetes previa, creatinina, HbA1c y glucosa plasmática en ayunas). Estos modelos usaron un enfoque de selección hacia adelante para identificar determinantes de biomarcadores independientes del uso de metformina a partir de los 237 biomarcadores basados en un valor de P de significación corregido por Bonferroni de 237/0,05 (es decir, 0,00021). Después de identificar el GDF15 como un determinante muy fuerte del uso de metformina, se volvieron a ejecutar estos análisis de regresión multivariable para determinar si la inclusión de esos biomarcadores atenuaba o amplificaba la relación entre el GDF15 y el uso de metformina. A continuación, se calculó la concentración media de GDF15 en personas que tomaban diferentes dosis de metformina, y se estimó la relación entre la dosis de metformina y el nivel de GDF15 usando una regresión lineal tras tener en cuenta las variables independientes indicadas anteriormente. Por último, se usó un enfoque similar de selección hacia adelante para identificar biomarcadores relacionados independientemente con GDF15.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Composición farmacéutica que comprende metformina y al menos un vehículo, adyuvante y/o excipiente farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de diabetes mellitus de tipo II en un paciente, en donde la dosis de metformina está adaptada por un método que comprende
(i) administrar metformina a un paciente,
(ii) determinar el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo en una muestra del paciente,
(iii) comparar el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo, determinado en la etapa (ii), con una referencia, y
(iv) ajustar la dosis de metformina de forma que el tratamiento con metformina se detenga en caso de que el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo no aumente en al menos el 25 %, y la dosis de metformina se mantiene o aumenta en caso de que el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo aumente en al menos el 25 %, en donde el GDF15 comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 1, y la variante funcional del mismo tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.
2. Un método de identificación de un paciente con diabetes mellitus de tipo II que se beneficiará del tratamiento con metformina, que comprende las etapas de
(i) determinar el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo en una muestra obtenida del paciente con diabetes mellitus de tipo II que recibe metformina en una cantidad eficaz, y
(ii) comparar el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo, determinado en la etapa (i), con el de una referencia, en donde un aumento del nivel de GDF15 en al menos el 25 % es indicativo de una respuesta del paciente a la administración de metformina,
en donde el GDF15 comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 1, y la variante funcional del mismo tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.
3. El método de la reivindicación 2, en donde el nivel de GDF15 o la variante funcional del mismo aumenta en al menos el 50 %, al menos el 75 % o al menos el 100 %.
4. Un método de identificación de un paciente con diabetes mellitus de tipo II que no se beneficiará del tratamiento con metformina, que comprende las etapas de
(i) determinar el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo en una muestra obtenida del paciente con diabetes mellitus de tipo II que recibe metformina en una cantidad eficaz,
(ii) comparar el nivel de GDF15 o una variante funcional del mismo, determinado en la etapa (i), con el de una referencia, en donde un nivel inalterado o reducido de GDF15 o una variante funcional del mismo es indicativo de un paciente que no responde a la administración de metformina, y
(iii) el tratamiento con metformina se interrumpe si el paciente presenta un nivel inalterado o reducido de GDF15 o una variante funcional del mismo,
en donde el GDF15 comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 1, y la variante funcional del mismo tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde se proporcionan medios de detección del nivel de expresión de GDF15 o una variante funcional del mismo en la etapa (i) como un kit.
6. Uso de GDF15 o una variante funcional del mismo como biomarcador para identificar un paciente con diabetes mellitus de tipo II que se beneficiará del tratamiento con metformina, en donde GDF15 comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 1, o una variante funcional del mismo que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.
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