ES2954409T3 - Tratamiento del cáncer e inhibición de la metástasis - Google Patents
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Abstract
Se describen compuestos y métodos para reducir o prevenir el comportamiento metastásico en VGSC que expresan cáncer mediante el efecto de al menos reducir la parte persistente de la corriente del canal de sodio dependiente de voltaje sin eliminar la parte transitoria. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Tratamiento del cáncer e inhibición de la metástasis
Campo de la invención
Esta invención se refiere a inhibidores de los canales de sodio dependientes de voltaje para su uso en la prevención o reducción del comportamiento metastásico en pacientes que padecen cáncer.
Antecedentes de la invención
La enfermedad metastásica es responsable de más del 90 % de todos los fallecimientos relacionadas con el cáncer. La progresión del cáncer metastásico, tales como cáncer de mama, colon y próstata, generalmente se considera que comprende cinco fases, como se indica a continuación:
1. Génesis, en concreto, la transformación inicial de una célula normal en una célula cancerosa;
2. Proliferación, en concreto, el aumento en el número de células cancerosas para formar un tumor primario de tamaño creciente;
3. Cambio, durante la fase de génesis o proliferación, de una condición en la que las células cancerosas no tienen potencial de comportamiento metastásico a una condición en la que sí lo tienen;
4. Desprendimiento de células cancerosas del tumor primario seguido por el movimiento de esas células desprendidas hacia las regiones circundantes de tejido dentro del mismo órgano hacia el sistema de circulación; 5. Metástasis, en concreto, el movimiento de las células desprendidas a través de la circulación (sangre o linfa) a otros órganos para crear tumores secundarios en esos otros órganos.
Un cambio significativo que tiene lugar en la célula y provoca el cambio en la condición de la fase 3 anterior es la expresión de un canal de sodio dependiente de voltaje (VGSC, por sus siglas en inglés) funcional. En seres humanos, hay nueve subunidades alfa de VGSC o proteínas "NaV" (Nav1.1 a Nav1.9) diferentes y se ha encontrado que todas se expresan en diferentes tipos de células cancerosas (Brackenbury, 2012; Roger et al., 2015). En los cánceres de mama y colon, normalmente es el canal Nav1.5 el que se expresa y, en el caso del cáncer de próstata, normalmente es el canal Nav1.7. Los VGSC pueden expresarse en forma neonatal y/o adulta. En el caso del cáncer de mama y de colon, es la forma neonatal del canal Nav1.5 (nNav1.5) la que se expresa. En el caso del cáncer de próstata, además, es la variante de corte y empalme neonatal de Nav1.7 la que se expresa (Diss et al., 2001). A falta de dichos canales, las células tumorales no tienen el potencial para la invasión y por lo tanto para el comportamiento metastásico. En algunos casos, la fase de génesis implica el crecimiento de células cancerosas que, desde el comienzo, tienen potencial metastásico. Asimismo, los cánceres hematológicos tales como la leucemia tienen características metastásicas inherentes y pueden invadir y acumularse en otros órganos, como el hígado o el bazo (Trendowski, 2015).
Se ha sugerido tratar de encontrar un tratamiento para prevenir la metástasis mediante uno o más de prevenir la expresión de VGSC funcionales, bloquear completamente la actividad de los VGSC funcionales que se han expresado, o destruir las células. La presente invención se refiere a un enfoque diferente.
El documento WO 2012/049439 divulga el uso de inhibidores de VGSC para prevenir el comportamiento metastásico en el cáncer.
La corriente fluye de manera intermitente a través de los VGSC, es decir la corriente fluye en pulsos. Se sabe que cada pulso comprende una parte (o pico) transitoria seguida de una parte de DC de bajo nivel, conocida como corriente tardía o persistente. Esta última está promovida por hipoxia, que se sabe bien que se produce en tumores en crecimiento. La actividad de VGSC aumenta la capacidad de invasión al promover la salida de protones y acidificar el espacio pericelular. Los VGSC también controlan la sensación de dolor. La eleclazina, 4-(pirimidin-2-ilmetil)-7-(4-(trifluorometoxi)fenil)-3,4-dihidrobenzo[f][1,4]oxazepin-5(2H)-ona, de la fórmula Ia
y 4-(pirimidin-2-ilmetil)-7-(4-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidrobenzo[f][1,4]oxazepin-5(2H)-ona, de la fórmula Ib
son conocidas ambas para el tratamiento de afecciones cardíacas. Se sabe además que cada una de ellas afecta diferencialmente la magnitud de las partes transitoria y persistente de las corrientes de los VGSC, siendo el efecto dependiente de la dosis. Altas dosis de estos fármacos bloquean completamente las corrientes de los VGSC. Dosis de estos, o de cualquier otro fármaco, que tendrían el efecto de bloquear completamente las corrientes de los VGSC en el tejido cardíaco serían mortales para el paciente porque el corazón necesita estas corrientes para realizar su función. Se sabe además que los compuestos de fórmula Ia y Ib son inhibidores potentes y selectivos de la corriente tardía de sodio cardiaca (Inbl), también conocida como corriente persistente de sodio (INaP) y es eficaz en el tratamiento del síndrome de QT largo en seres humanos; específicamente el síndrome de QT largo de tipo 3 (LQT3), cf. El documento US 2015/0038489 A1.
JEFF A. ZABLOCKI ET AL: "Discovery of Dihydrobenzoxazepinone (GS-6615) Late Sodium Current Inhibitor (Late INai), a phase II Agent with Demonstrated Preclinical Anti-Ischemic and Antiarrhythmic Properties",JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 59, 22 de septiembre de 2016 (2016-09-22), páginas 9005-9017, analiza el uso de los compuestos de la presente fórmula I como inhibidores de VGSC.
Sumario de la invención
La presente invención se basa, al menos en parte, en el hallazgo de que:
(i) inhibir la parte persistente de las corrientes de Nav1.5 y Nav1.7 en el cáncer de mama y colon y en el cáncer de próstata, respectivamente, inhibe el comportamiento metastásico;
(ii) no es necesario inhibir la parte transitoria de estas corrientes para inhibir el comportamiento metastásico; (iii) las dosis apropiadas de un compuesto de la fórmula I como se define a continuación inhibirán el comportamiento metastásico sin evitar la proliferación o destruir las células del tumor; y
(iv) los efectos inhibidores de un compuesto de la fórmula I sobre la parte persistente de la corriente son mayores en células con exposición previa a hipoxia, que es una condición que se produce en tumores en crecimiento y realiza una contribución positiva crítica al proceso metastásico.
Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de la fórmula I:
en la que R1 es trifluorometoxi o trifluorometilo, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, para su uso en un método para reducir o prevenir el comportamiento metastásico en un paciente que padece cáncer. En una realización, el cáncer es un cáncer que expresa canales de sodio dependientes de voltaje (VGSC). En otra realización, el cáncer no es un cáncer que expresa VGSC. Por ejemplo, el paciente puede estar padeciendo un cáncer asociado con un riesgo de expresión de VGSC y/o comportamiento metastásico, pero aún no se ha determinado la expresión de VGSC y/o el comportamiento metastásico.
En una realización de la invención, R1 en el compuesto de la fórmula I es trifluorometoxi, es decir el compuesto de la
fórmula I es eleclazina, 4-(pirimidin-2-ilmetil)-7-(4-(trifluorometoxi)fenil)-3,4-dihidrobenzo[f][1,4]oxazepin-5(2H)-ona, de la fórmula Ia
En otra realización de la invención, R1 en el compuesto de la fórmula I es trifluorometilo, es decir el compuesto de la fórmula I es 4-(pirimidin-2-ilmetil)-7-(4-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidrobenzo[f][1,4]oxazepin-5(2H)-ona, de la fórmula Ib
En una realización de la invención, el cáncer un cáncer de tumor no sólido. En una realización particular, el cáncer es leucemia. En otra realización particular, el cáncer es linfoma.
En una realización de la invención, el cáncer es un cáncer de tumor sólido, tal como un carcinoma, mesotelioma, sarcoma, melanoma o un neuroblastoma. En una realización particular, el cáncer es cáncer de mama. En otra realización particular, el cáncer es cáncer de colon. En otra realización particular, el cáncer es cáncer de próstata. En otra realización particular, el cáncer es cáncer de pulmón no microcítico (NSCLS, por sus siglas en inglés). En otra realización particular, el cáncer es cáncer de cuello uterino. En otra realización particular, el cáncer es cáncer gástrico. En otra realización particular, el cáncer es neuroblastoma.
Según una realización de la invención, el cáncer está en fase 3, 4 o 5. Según otra realización preferida de la invención, el cáncer está en fase 1 o 2.
Según una realización de la invención, el comportamiento metastásico se inhibe o reduce en el cáncer mediante la administración de un compuesto de la fórmula I, es decir, ya sea 1a o 1b, a una dosificación apropiada en un paciente que padece cáncer que expresa canales de sodio dependientes de voltaje (VGSC).
Según una realización adicional de la invención, el comportamiento metastásico se inhibe o reduce en el cáncer mediante la administración de un compuesto de la fórmula I en una dosis apropiada para inhibir o reducir la parte persistente de la corriente de VGSC sin bloquear, o al menos sin bloquear completamente, la parte transitoria. De este modo, la metástasis en el cáncer puede inhibirse o reducirse de esta manera sin tener que administrar dosis de fármacos que serían mortales.
Según una realización adicional de la invención, que se explicará más detalladamente a continuación, un compuesto de la fórmula I se administra a un nivel de dosificación que inhibirá la parte persistente de la corriente de VGSC sin bloquear o bloquear completamente la parte transitoria y sin provocar directamente la muerte celular. De este modo, el tumor o la metástasis pueden inhibirse sin causar la muerte de la célula cancerosa.
El hecho de que el comportamiento metastásico pueda inhibirse o reducirse sin causar la muerte celular puede ser una ventaja significativa, ya que un trabajo reciente ha sugerido que el tratamiento del cáncer mediante la destrucción de las células puede, al menos en algunos casos, ser contraproducente en el sentido de que, si bien habrá un beneficio a corto plazo, sin embargo, el cáncer volverá y proliferará. De este modo, la invención proporciona la posibilidad de inhibir o prevenir el comportamiento metastásico sin los posibles problemas que pueden surgir de destruir realmente las células cancerosas.
Según una realización de la invención, el comportamiento metastásico se reduce o previene:
(a) reduciendo la capacidad de invasión de las células cancerosas;
(b) reduciendo la motilidad de las células cancerosas, opcionalmente en condiciones hipóxicas pero no normóxicas;
(c) disminuyendo la expresión de células cancerosas de al menos un VGSC, opcionalmente en condiciones tanto normóxicas como hipóxicas;
(d) aumentando la capacidad de adherencia de las células cancerosas;
(e) reduciendo la capacidad de migración de las células cancerosas; o
(f) mediante una combinación de (a) y (b), (b) y (c), (a) y (c), (a) a (c), o (a) a (e).
El compuesto normalmente se administra a una dosis terapéuticamente eficaz. Las realizaciones relativas a pautas posológicas específicas se describen con más detalle a continuación. En una realización particular, el compuesto se administra en una dosificación o pauta posológica que proporciona una reducción o prevención de un comportamiento metastásico según una cualquiera de (a) a (f) anteriores.
Según una realización adicional de la invención, el compuesto de la fórmula I se usa a un nivel de dosificación correspondiente al intervalo de 1 pmol a 10 pmol.
Estos y otros aspectos y realizaciones de la invención se describen con más detalle a continuación, con referencia a los dibujos adjuntos y datos experimentales expuestos en los ejemplos.
Leyenda de las figuras
La figura 1 es una representación esquemática de una línea de tiempo para la progresión del cáncer desde la tumorigénesis primaria hasta la formación de tumores secundarios (metástasis).
La figura 2 es una ilustración esquemática de los procesos celulares que se producen durante el inicio del cáncer y la progresión a metástasis.
La figura 3 (a) es un esquema que ilustra la corriente a través de los VGSC, mostrando las partes transitorias y persistentes de la corriente y también mostrando la corriente en condiciones normóxicas e hipóxicas.
La figura 4 es una ilustración esquemática de un aparato de medición de la adherencia celular para medir la adherencia de células sueltas.
La figura 5 es una ilustración esquemática del aparato utilizado para medir la motilidad lateral de las células; la vista (a) es una vista en planta desde arriba de una placa de cultivo celular que contiene una capa semiconfluente de células; la vista (b) es una vista en sección lateral esquemática de las células sembradas en placa; la vista (c) es una vista en planta de las células sembradas en placa en el momento t = cero cuando se ha creado una cicatriz a través de la capa de células, y la vista (d) es una vista en planta de las células sembradas en placas en un momento posterior (t = 24 horas) después de que las células se hayan movido y la herida se haya cerrado parcialmente.
La figura 6 es una vista en sección lateral esquemática del aparato utilizado para medir la migración transversal de células.
La figura 7 es una vista en sección lateral esquemática del aparato utilizado para medir la capacidad de invasión de las células.
La figura 8 es un gráfico que muestra el efecto dependiente de la concentración de la hipoxia inducida químicamente sobre la adherencia de células sueltas de células MDA-MB-231 de cáncer de mama metastásico humano. La adherencia aumenta ('presión negativa de desprendimiento' - DNP (por sus siglas en inglés - disminuye) en hipoxia.
La figura 9 es un gráfico que muestra los resultados de una exclusión de células con azul tripano (es decir ensayo de viabilidad celular). Las células MDA-MB-231 se trataron con eleclazina 20 μM o DMSO al 0,2 % (control negativo con disolvente) durante 48 horas. La viabilidad celular fue casi del 100 % tanto para los grupos de tratamiento como de control, mostrando que la eleclazina no era tóxica.
La figura 10 muestra los resultados de un ensayo MTT (proliferación). A. Curva patrón. El número total de células (por pocillo) aumenta linealmente con las lecturas de absorbancia (570 nm). La lectura de fondo de 0,04 (pocillo vacío) se restó de todos los conjuntos de datos. B. Datos normalizados que muestran la proliferación de células MDA-MB-231 durante 48 horas en condiciones hipóxicas y normóxicas. Se administraron eleclazina y ranolazina a una concentración de 10 μM. DMSO (0,2 %), TTX (10 μM) y los medios fueron controles negativos. TEA 2 mM (bloqueador de canales de K+) sirvió como control positivo.
La figura 11 muestra los resultados de un ensayo de cicatrización de heridas. Índice de motilidad de las células hipóxicas tratadas con DMSO al 0,2 % o eleclazina 10 μM durante 48 horas. La eleclazina tuvo una motilidad lateral
disminuida en todos los puntos de tiempo.
La figura 12 muestra el efecto de eleclazina 0,5 μM y tetrodotoxina (TTX) 20 μM sobre la invasión de células MDA MB-231 en hipoxia (O2 al 1 %) in vitro. El diagrama de caja indica el número normalizado de células MDA MB-231 que invaden durante 16 h después del tratamiento con eleclazina o TTX en comparación con el control. Las células se habían incubado previamente con las condiciones de tratamiento correspondientes durante 24 h antes del inicio del ensayo. Se evaluaron 12 campos de visión de 4 insertos individuales para cada condición; *** indica p < 0,001). Eleclazina 0,5 μM no afecta a la capacidad de invasión; y TTX 20 μM la disminuye (control positivo).
La figura 13 muestra el efecto de eleclazina 1 μM y ranolazina 1 μM sobre la invasión de células MDA MB-231 en hipoxia (O2 al 1 %) in vitro. El diagrama de caja indica el número de células MDA MB-231 que invaden durante 16 horas después del tratamiento con eleclazina o ranolazina en comparación con el control. Las células se habían incubado previamente con las condiciones de tratamiento correspondientes durante 24 h antes del inicio del ensayo. Los valores medianos y el intervalo intercuartílico fueron los siguientes: Control: 175,0 (113 y 255); eleclazina 1 μM, 131,5 (100 y 175) y ranolazina 1 μM, 106,3 (181 y 161). 12 campos de visión de 8 insertos individuales para cada condición; *** indica p < 0,001; X indica p > 0,05. La eleclazina y la ranolazina (ambas 1 μM) suprimen la capacidad de invasión de forma significativa pero similar.
La figura 14 muestra el efecto de eleclazina 5 μM y ranolazina 5 μM sobre la invasión de células MDA MB-231 en hipoxia (O2 al 1 %) in vitro. El diagrama de caja indica el número de células MDA MB-231 que invaden durante 16 horas después del tratamiento con eleclazina o ranolazina en comparación con el control. Las células se habían incubado previamente con las condiciones de tratamiento correspondientes durante 24 h antes del inicio del ensayo.
12 campos de visión de 8 insertos individuales para cada condición; *** indica p < 0,001; X indica p > 0,05. La eleclazina y la ranolazina (ambas 5 μM) suprimen la capacidad de invasión significativamente, pero el efecto de la eleclazina fue significativamente mayor.
La figura 15 muestra el efecto de eleclazina (10 μM) sobre la fluorescencia celular total corregida de células MDA-MB-231 teñidas para expresión de la proteína nNav1.5. El tratamiento con eleclazina disminuye la expresión.
La figura 16 muestra los efectos de eleclazina, ranolazina (ambas 5 μM) y TTX (0,1 y 10 μM) sobre la capacidad de invasión de la línea celular leucémica humana FLG 29.1 en condiciones de normoxia e hipoxia (O2 al 1 %). Todos los agentes (TTX utilizado como control positivo) inhibieron significativamente la capacidad de invasión.
Divulgación detallada de la invención
El comportamiento metastásico implica varias etapas, en concreto:
(a) desprendimiento de células del tumor;
(b) movimiento de las células desprendidas hacia el tejido circundante;
(c) movimiento a través de ese tejido circundante hacia el sistema de circulación; y
(d) movimiento hacia el sistema de circulación (del cual las células pueden salir finalmente para formar tumores secundarios).
La inhibición o reducción de la actividad de las células en una cualquiera o más de estas etapas contribuirá por lo tanto a, por lo menos, una reducción de la metástasis. Se puede determinar el efecto de los fármacos en cada una de estas subetapas, como se explica con más detalle a continuación, por una serie de experimentos, en concreto:
(a) probar el efecto del fármaco sobre la capacidad de adherencia de las células;
(b) probar el efecto del fármaco sobre la motilidad lateral de las células;
(c) probar el efecto del fármaco sobre la migración transversal de las células; y
(d) probar el efecto del fármaco sobre la capacidad de invasión de las células, en concreto, la capacidad de las células para moverse a través de un medio que consumen las células.
La administración de un compuesto de la fórmula I en varios niveles de dosificación puede aumentar la capacidad de adherencia de las células y/o reducir uno o más de la motilidad lateral, migración transversal y capacidad de invasión de las células.
En consecuencia, según otro aspecto de la invención, se proporciona un compuesto, composición u otra sustancia que se utiliza o se pretende utilizar, en una dosis apropiada, para inhibir o reducir la parte persistente de la corriente de VGSC en las células cancerosas metastásicas mientras que la parte transitoria no se ve afectada o solo se reduce parcialmente, para inhibir o reducir la metástasis, preferentemente sin causar directamente la muerte celular.
Las ventajas que se derivan de la invención, al menos en determinados aspectos o formas, incluyen lo siguiente:
Según la invención, el cáncer de mama, colon y próstata (y otros cánceres en los que se expresan o pueden expresarse VGSC, como se describe en el presente documento) puede contenerse para que el paciente pueda vivir con dicho
cáncer sin perjuicio grave. Como resultado, puede evitarse la necesidad de que el paciente se someta a tratamientos agresivos para destruir las células cancerosas, tales como quimioterapia o radioterapia. Si se sospecha que un paciente tiene cáncer de mama, colon o próstata u otro cáncer metastásico, se puede administrar tratamiento inmediato con dosis apropiadas de un compuesto de la fórmula I para inhibir o prevenir la metástasis mientras se esperan los resultados de las pruebas definitivas. La dosis necesaria para lograr esto solo tiene que ser lo suficientemente alta como para inhibir la parte persistente de la corriente de VGSC. Dosis terapéuticamente aceptables de un compuesto de la fórmula I lograrán la inhibición necesaria de la parte persistente de estas corrientes, dejando la parte transitoria sustancialmente intacta.
Con referencia a la figura 1, la línea de tiempo 101 es una representación de tres fases sucesivas en el desarrollo de un tumor, es decir, una fase 102 anterior al desarrollo de células cancerosas, una fase 103 posterior a la fase 102 durante la cual tiene lugar la génesis de las células cancerosas y una fase 104, posterior a la fase 103, durante el cual las células cancerosas proliferan hasta formar un tumor en crecimiento. La fase 104 de proliferación puede comenzar poco después de que comience la fase 103 de génesis.
Se ha establecido que muchas células cancerosas humanas, tal como las de cáncer de mama, colon y próstata, puede que inicialmente no incluyan ningún VGSC funcional y que, a menos que tales canales se expresen en el tumor, las células tumorales no serán invasivas. Sin embargo, en muchos de estos tumores, aunque inicialmente no hay VGSC, en algún momento se expresarán VGSC funcionales. Esto desencadena un cambio a una condición en la que el tumor puede dispersarse. La figura 1 representa una situación en la que inicialmente las células no contienen VGSC funcionales pero en algún punto 105 en el tiempo comienza la expresión de VGSC funcionales. Esto puede producirse en cualquier momento después del comienzo de la fase 103 de génesis.
La línea de tiempo 106 en la figura 1 ilustra las fases que surgen después del tiempo 105, cuando el cáncer se vuelve metastásico. En la primera fase 107 posterior al tiempo 105, las células metastásicas se desprenden del tumor. Posteriormente, en la fase 108, invaden y se mueven a través del tejido circundante en el mismo órgano hacia el sistema de circulación, en particular el sistema vascular y/o linfático. En la fase 109, las células metastásicas entran al sistema de circulación que luego puede transportarlas a otros órganos del cuerpo, en los que pueden causar la formación de tumores secundarios.
Las fases anteriores se representan pictóricamente en la figura 2 en la que el número 200 de referencia representa una parte de un órgano tal como una mama o una próstata. Las células 201 de la mama o la próstata sanas se muestran apoyadas en una membrana 202 basal y rodeando un tumor 203 canceroso, que se supone que ha pasado por la fase 103 de génesis y a la fase 104 de proliferación.
Se muestra que ciertas células 204 del tumor 202 canceroso se desprenden del tumor 203 y pasan a través de una región 202a degradada de la membrana 202 basal hacia la región 205 adyacente del órgano que contiene el tumor 203, cuya región puede comprender principalmente fibras de colágeno. Las células 206 cancerosas, que se han desprendido del tumor y han atravesado la membrana 202 basal, se muestran pasando a través de la región 205 hacia un vaso sanguíneo 207. Se muestra una célula 208 cancerosa migrando a través de la pared del vaso sanguíneo 207 hacia el torrente sanguíneo 209.
Las células 210, que ya han entrado en el torrente sanguíneo, se muestran transportadas dentro del torrente sanguíneo hacia una región 211 donde se muestra que las células 212 han migrado hacia el exterior a través de la pared del vaso sanguíneo 207 hacia otro órgano 213, tal como los ganglios linfáticos o el hígado, en el que pueden formar un tumor secundario (no mostrado).
El número 214 de referencia representa células cancerosas latentes que simplemente se asentaron en la pared del vaso sanguíneo 207 o junto a ella.
Como se explica con más detalle a continuación, la invención proporciona un tratamiento o medio para prevenir o reducir uno o más de los comportamientos metastásicos de las células cancerosas que tiene lugar en las diversas fases descritas. En particular, la invención proporciona un tratamiento o medio para:
(a) aumentar la capacidad de adherencia de las células en el tumor para que sea menos probable que se desprendan; y/o
(b reducir la motilidad de las células que se han desprendido para que sea menos probable que se muevan hacia y a través de la membrana basal hacia el tejido circundante; y/o
(c) reducir la capacidad de invasión de las células que han entrado en el tejido circundante al reducir su capacidad para moverse a través de ese tejido hacia el sistema de circulación; y/o
(d) reducir la capacidad de las células para migrar desde ese tejido al sistema circulatorio a través de las paredes del mismo.
Se ha explicado anteriormente que las células cancerosas que no tienen VGSC funcionales expresados en las mismas no se comportan de forma invasiva. Asimismo, se sabe que la corriente pasa a través de los VGSC en pulsos, cada uno de los cuales comprende una parte transitoria o pico seguida de una parte persistente o tardía de nivel mucho
más bajo. Según un aspecto de la invención, uno o más de los comportamientos metastásicos anteriores se inhibe o reduce al inhibir o reducir la parte persistente de la corriente sin eliminar la parte pico, permitiendo así utilizar un fármaco que reducirá preferentemente la parte persistente de la corriente.
Algunos de estos fármacos son conocidos por tratar afecciones cardíacas como la arritmia o la angina. En el caso de tratamiento del corazón, es vital asegurarse de que no se elimine la parte pico de la corriente porque esta es fundamental para mantener la funcionalidad del corazón y su ritmo. De este modo, según un aspecto de la invención, un fármaco conocido, tal como un compuesto de la fórmula I, descrito anteriormente para su uso para inhibir o reducir la parte persistente de la corriente de VGSC sin eliminar la parte pico se usa para inhibir o reducir el comportamiento metastásico en el cáncer, especialmente en cáncer de mama, colon o próstata.
La naturaleza de la corriente de VGSC se describirá con más detalle con referencia a la figura 3(a).
Haciendo referencia a la Figura 3(a), la curva 301, mostrada como una línea continua, representa un pulso de corriente que fluye a través de VGSC funcional en condiciones normóxicas, siendo el eje horizontal el tiempo y siendo el eje vertical la amplitud o magnitud de la corriente. Como puede observarse, este pulso de corriente comprende una parte 302 pico o transitoria y la parte 303 persistente o tardía. En la práctica, el período de tiempo durante el cual persiste la parte 303 persistente es mucho mayor que el período de tiempo de la parte 302 transitoria aunque, debido a que la figura 3(a) es un diagrama esquemático en lugar de una curva realmente obtenida a partir de datos experimentales, esto no se muestra en la figura.
La curva 304, dibujada mediante líneas de puntos en cadena, muestra un pulso de corriente de VGSC en condiciones hipóxicas. Como puede observarse, la parte 305 pico de la corriente en condiciones hipóxicas es más pequeña que la parte 301 pico en condiciones normóxicas, pero la parte 306 persistente en condiciones hipóxicas es mayor que la parte 303 persistente en condiciones normóxicas. La diferencia entre estas curvas en condiciones de hipoxia y normoxia es relevante, porque muchas de las células de un tumor canceroso son hipóxicas debido a su aislamiento parcial, por otras células cancerosas, del sistema de circulación sanguínea.
Definiciones
Los "canales de sodio dependientes de voltaje" o "VGSC" son una clase conocida de proteínas integrales de membrana que forman canales iónicos, que dirigen iones de sodio ( Na+) a través de la membrana plasmática de una célula. En seres humanos, hay nueve genes (SCN1A, SCN2A, SCN3A, SCN4A, SCN5A, SCN8A, SCN9A, SCN10A y SCN11A) que codifican nueve subunidades alfa de VGSC o proteínas "NaV" diferentes (Nav1.1 a Nav1.9, respectivamente). Como se usa en el presente documento, a menos que el contexto lo contradiga, la expresión puede referirse a todos y cada uno de los VGSC conocidos, incluidos, pero sin limitación, Nav1.5 (SCN5A) (en forma neonatal o adulta), Nav1.6 (SCN8A) y Nav1.7 (SCN9A) (Fraser et al., 2005; Djamgoz et al., 2011). Nav1.5 puede denominarse como alternativa, NAV-1.5 en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" de un cáncer incluye, pero sin limitación, reducir el comportamiento metastásico de un cáncer, prevenir el comportamiento metastásico de un cáncer, reducir la sensación de dolor, o cualquier combinación de los mismos.
Por "cantidad terapéuticamente eficaz" o "dosis terapéuticamente eficaz", se entiende una cantidad o dosificación de compuesto de Fórmula I, que cuando se administra a un paciente que padece cáncer provoca una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento del paciente, tal como, por ejemplo, reducción del comportamiento metastásico del cáncer, prevención del comportamiento metastásico del cáncer, reducción del dolor o similares.
Por "reducción del comportamiento metastásico" del cáncer, se entiende una reducción de cualquier comportamiento asociado con el movimiento de células cancerosas desprendidas a través de la circulación (sanguínea o linfática) para acumularse y/o crear tumores secundarios en otros órganos o invadir localmente los tejidos circundantes. Normalmente, el paciente está en fase 3, 4 o 5, tal como en fase 4 o 5.
La reducción del comportamiento metastásico puede incluir, por ejemplo, una o más de (i) reducción de la motilidad de las células cancerosas (por ejemplo, reducción de la motilidad lateral), (ii) reducción de la migración de células cancerosas (por ejemplo, migración transversal), (iii) reducción de la capacidad de adherencia de las células cancerosas, (iv) reducción de la capacidad de invasión de las células cancerosas, (v) reducción de la parte persistente de la corriente de VGSC sin eliminar la parte transitoria, y (vi) reducción de la expresión de al menos un VGSC en las células cancerosas, en comparación con un control. El VGSC puede ser, por ejemplo, una o más de Nav1.5 (en forma adulta y/o neonatal), Nav1.6 y Nav1.7. Como se explica en otra parte en el presente documento, la "motilidad" refleja la capacidad de las células tumorales para moverse inicialmente hacia y a través de la membrana basal hacia el tejido circundante; la "capacidad de invasión" de las células refleja la capacidad de las células tumorales que han entrado en el tejido circundante para moverse a través de ese tejido hacia el sistema de circulación; y "migración" refleja la capacidad de las células tumorales para migrar desde ese tejido al sistema circulatorio a través de las paredes del mismo.
Por "prevenir el comportamiento metastásico" del cáncer, se pretende hacer referencia al tratamiento profiláctico de un paciente con cáncer en riesgo de, pero aún sin diagnosticar con, una enfermedad metastásica, para prevenir o reducir el riesgo de un comportamiento metastásico del cáncer como se describe anteriormente. Normalmente, el paciente está en fase 1,2 o 3. La prevención del comportamiento metastásico puede incluir, por ejemplo, la prevención o reducción de la expresión de al menos un VGSC, tal como, por ejemplo, una o más de Nav1.5 (en forma adulta y/o neonatal), Nav1.6 y Nav1.7.
El cáncer hematológico como tal no forma metástasis de la forma en que lo hacen los cánceres de tumores sólidos, pero se caracteriza por un comportamiento metastásico en el que las células cancerosas hematológicas pueden invadir y acumularse en otros órganos. En consecuencia, en la presente divulgación, cualquier realización relativa a "prevenir un comportamiento metastásico" o "reducir el comportamiento metastásico" puede, particularmente en el contexto de un cáncer hematológico, expresarse como alternativa como "prevenir el comportamiento invasivo" y "prevenir el comportamiento invasivo".
Realizaciones específicas de la invención
Como se muestra en el presente ejemplo 2, un compuesto según la Fórmula I (eleclazina) sometido a prueba en células de cáncer de mama no tuvo efecto sobre la viabilidad celular (20 j M); no tuvo efecto sobre la actividad proliferativa de las células (10 j M); redujo la motilidad lateral en condiciones hipóxicas pero no en normóxicas; suprimió significativamente la capacidad de invasión de Matrigel en concentraciones clínicamente relevantes (< l0 j M; dependiente de la concentración); pareció, al menos en algunas concentraciones, más eficaz que un compuesto de referencia (5 j M); y redujo la expresión de la proteína Nav1.5 neonatal en condiciones normóxicas e hipóxicas (10 j M). Asimismo, tal como se muestra en el ejemplo 3, un compuesto según la Fórmula I (Eleclazina) tuvo efectos antiinvasivos de eleclazina y ranolazina en una línea celular leucémica humana.
Compuesto
La presente invención se refiere a un compuesto de la fórmula I, en donde R1 es trifluorometilo o trifluorometoxi o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un paciente que padece cáncer, particularmente reduciendo el comportamiento metastásico de un cáncer y previniendo el comportamiento metastásico de un cáncer.
En algunas realizaciones, R1 es trifluorometilo y el compuesto es 4-(pirimidin-2-ilmetil)-7-(4-(trifluorometoxi)fenil)-3,4-dihidrobenzo[f][1,4]oxazepin-5(2H)-ona (es decir, eleclazina), o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. En algunas realizaciones, R1 es trifluorometilo y el compuesto es 4-(pirimidin-2-ilmetil)-7-(4-(trifluorometil)fenil)-3,4-dihidrobenzo[f][1,4]oxazepin-5(2H)-ona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. En realizaciones separadas y específicas, el compuesto no es citotóxico para las células cancerosas, no afecta sustancialmente la proliferación de células cancerosas, y/o tiene el efecto de al menos reducir la parte persistente de la corriente del canal de sodio dependiente de voltaje sin eliminar la parte transitoria, preferentemente en concentraciones terapéuticamente eficaces, es decir, concentraciones en las que el compuesto reduce uno o más comportamientos metastásicos de las células cancerosas. Es decir, las células cancerosas en sí mismas no se ven afectadas, excepto que se inhibe su crecimiento y expansión en el tejido circundante, por la degradación del tejido causada por el mecanismo de VGSC. La propia proliferación no se ve sustancialmente afectada.
En el documento US 2017/007617 A1 se describen sales adecuadas de un compuesto según la Fórmula I, tal como Ia e Ib. En particular, dichas sales incluyen sales farmacéuticamente aceptables que son seguras para la administración a un paciente y que conservan la eficacia biológica y las propiedades del compuesto. Además se pueden preparar sales de adición de base farmacéuticamente aceptables a partir de bases inorgánicas y orgánicas. Las sales obtenidas a partir de bases inorgánicas incluyen, únicamente a modo de ejemplo, sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio. Las sales procedentes de bases orgánicas incluyen, pero sin limitación, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias. Ejemplos específicos de aminas apropiadas incluyen, únicamente a modo de ejemplo, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, tri(iso-propil) amina, tri(n-propil) amina, etanolamina, 2-dimetilaminoetanol, trometamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, etilendiamina, glucosamina, NN-alquilglucaminas, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, morfolina, N-etilpiperidina, y similares. Las sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables pueden prepararse a partir de ácidos inorgánicos y orgánicos. Las sales procedentes de ácidos inorgánicos incluyen ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares. Las sales procedentes de ácidos orgánicos incluyen ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-tolueno-sulfónico, ácido salicílico y similares.
Según una realización de la invención, el compuesto de fórmula I es selectivo de uno o más VGSC, tal como selectivo de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o la totalidad de NAV-1.1 a 1.9. En algunas realizaciones, el compuesto de fórmula I es selectivo de al menos NAV-1.5, NAV-1.6 y NAV-1.7. En una realización de la invención, el compuesto de la fórmula I es selectivo para nNAV-1.5 por encima de NAV-1.5 de forma adulta.
Aplicaciones terapéuticas
Los pacientes adecuados incluyen pacientes mamíferos, tales como seres humanos, monos, conejos, perros, gatos, vacas, caballos, cerdos, ratones y ratas, que padecen cáncer. Preferentemente, el paciente es un paciente humano, tal como un paciente humano adulto. Normalmente, dicho un paciente humano adulto puede tener un peso en el intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 150 kg, tal como de aproximadamente 60 a aproximadamente 100 kg, tal como de aproximadamente 70 kg.
Normalmente, un cáncer seleccionado para el tratamiento según la invención es un cáncer que expresa VGSC o un cáncer asociado con un riesgo conocido de expresión de VGSC y, por lo tanto, de comportamiento metastásico.
En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer hematológico tal como leucemia o linfoma. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de tumor sólido, tal como, por ejemplo, un carcinoma, mesotelioma, sarcoma o melanoma. En realizaciones particulares, el cáncer de tumor sólido es cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón no microcítico; NSCLC), cáncer pleural (por ejemplo, mesotelioma), cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer gástrico o neuroblastoma. En una realización específica, el cáncer es leucemia. En otra realización específica, el cáncer es cáncer de mama.
La Tabla 1 a continuación muestra los vínculos que se han encontrado entre algunas formas de cáncer particulares y su expresión de VGSC.
TABLA 1
En algunas realizaciones, el paciente padece un cáncer que expresa VGSC. Un cáncer que expresa VGSC puede identificarse, por ejemplo, mediante inmunohistoquímica o análisis de una muestra que contenga células cancerosas (como una biopsia de un tumor o una muestra de sangre) obtenida del paciente, usando anticuerpos monoclonales o policlonales detectables específicos para uno o más VGSC para detectar la expresión de un VGSC en las células cancerosas.
Un cáncer que expresa VGSC puede expresar una o más de Nav1.1 a Nav1.9, en forma adulta o neonatal. En una realización, el cáncer expresa al menos una de Nav1.5, Nav1.6 y Nav1.7, en forma adulta y/o neonatal. En una realización específica, el cáncer expresa Nav1.5, en forma adulta y/o neonatal, tal como, por ejemplo, Nav1.5 neonatal. En otra realización específica, el cáncer expresa Nav1.6, en forma adulta o neonatal, tal como la forma neonatal. En otra realización, el cáncer expresa Nav1.7, en forma adulta o neonatal, tal como la forma neonatal.
Un cáncer que expresa VGSC está en fase 3, 4 o 5 como se describe anteriormente.
En una realización, el paciente está en estadio 3, 4 o 5, tal como en fase 4 o 5. En una realización, el cáncer está en estadio 1, 2 o 3, tal como en fase 1 o 2.
En una realización, el cáncer está en fase 3. Un paciente que padece un cáncer en fase 3 normalmente no ha sido diagnosticado con enfermedad metastásica, pero está en riesgo de comportamiento metastásico del cáncer, es decir,
progresión a la fase 4 o 5. Un paciente que padece un cáncer en fase 3 puede tratarse según la invención para prevenir el comportamiento metastásico del cáncer.
En una realización, el cáncer está en fase 4. Un paciente que padece un cáncer en fase 4 puede no haber sido diagnosticado con enfermedad metastásica, pero el cáncer ha progresado hacia un comportamiento metastásico. Un paciente que padece un cáncer en fase 4 puede tratarse según la invención para reducir el comportamiento metastásico del cáncer.
En una realización, el cáncer está en fase 5. Un paciente que padece un cáncer en fase 5 puede haber sido diagnosticado con enfermedad metastásica y el cáncer se caracteriza por un comportamiento metastásico. Un paciente que padece un cáncer en fase 5 puede tratarse según la invención para reducir el comportamiento metastásico del cáncer.
En algunas realizaciones, el paciente puede estar padeciendo un cáncer asociado con un riesgo de expresión de VGSC y/o comportamiento metastásico, pero aún no se ha determinado la expresión de VGSC y/o el comportamiento metastásico. Los cánceres que son propensos al comportamiento metastásico incluyen, por ejemplo, leucemia, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón no microcítico; NSCLC), cáncer pleural (por ejemplo, mesotelioma), cáncer de cuello uterino y cáncer de ovario (Roger et al., 2015). Por ejemplo, un análisis inmunohistoquímico de una muestra que contiene células cancerosas, tal como una biopsia de tumor o una muestra de sangre obtenida del paciente, puede haber indicado que las células tumorales de la muestra no expresaban los VGSC o los VGSC analizados. Por lo tanto, el cáncer puede estar en la fase 1 o (más probablemente) en fase 2.
En una realización, el cáncer está en fase 2. Un paciente que padece un cáncer en fase 2 normalmente no ha sido diagnosticado con enfermedad metastásica, pero está en riesgo de expresión de VGSC y comportamiento metastásico del cáncer, es decir, progresión a la fase 3, 4 o superior. Un paciente que padece un cáncer en fase 2 puede tratarse según la invención para prevenir la expresión de VGSC o el comportamiento metastásico del cáncer.
En un aspecto no reivindicado, un paciente que padece un cáncer en una cualquiera de las fases 1-5, preferentemente en una cualquiera de 2-5, también puede padecer dolor causado por el cáncer, por ejemplo, por un tumor primario y, por lo tanto, puede tratarse para reducir la sensación de dolor.
En una realización, cuando se utiliza en un método según la presente invención, el compuesto reduce o previene el comportamiento metastásico en cáncer que expresa VGSC sin destruir las células cancerosas.
En una realización, cuando se utiliza en un método según la presente invención, el compuesto reduce o previene el comportamiento metastásico en el cáncer que expresa VGSC sin afectar sustancialmente a la proliferación de las células cancerosas.
En una realización, cuando se utiliza en un método según la presente invención, el compuesto reduce o previene el comportamiento metastásico en cáncer que expresa VGSC por el efecto de al menos reducir la parte persistente de la corriente de VGSC sin eliminar la parte transitoria. Se conocen en la técnica ensayos adecuados para evaluar el efecto del compuesto sobre la corriente de VGSC (véase, por ejemplo, Rajamani et al., 2016).
En otras realizaciones separadas y específicas, el compuesto reduce o previene el comportamiento metastásico:
(a) reduciendo la capacidad de invasión de las células cancerosas;
(b) reduciendo la motilidad de las células cancerosas, opcionalmente en condiciones hipóxicas pero no normóxicas;
(c) disminuyendo la expresión de células cancerosas de al menos un VGSC, opcionalmente en condiciones tanto normóxicas como hipóxicas;
(d) aumentando la capacidad de adherencia de las células cancerosas;
(e) reduciendo la capacidad de migración de las células cancerosas; o
(f) mediante una combinación de (a) y (b), (b) y (c), (a) y (c), (a) a (c), o (a) a (e).
En una realización, el al menos un VGSC comprende una, dos o la totalidad de Nav1.5, Nav1.6 y Nav1.7. En una realización, el al menos un VGSC comprende o consiste en Nav1.5 neonatal.
En una realización, el tratamiento de células cancerosas con el compuesto da como resultado que la expresión en las células cancerosas de al menos un VGSC sea significativamente menor que la de un control, tal como un valor de control predeterminado, la de células cancerosas no expuestas al compuesto o la de células cancerosas expuestas a un compuesto de referencia. En una realización, el tratamiento de las células cancerosas con el compuesto da como resultado que la capacidad de invasión, motilidad y/o capacidad para migrar de las células cancerosas tratadas con el compuesto sean significativamente menores que las de un control, tal como un valor de control predeterminado, las de células cancerosas no expuestas al compuesto o las de células cancerosas expuestas a un compuesto de referencia seleccionado.
Los ensayos para evaluar (a) a (d) son conocidos en la técnica y se describen a continuación y en los ejemplos.
Modos de administración
El compuesto se puede administrar por cualquier vía adecuada al paciente, incluyendo, pero sin limitación, administración oral, bucal, sublabial, sublingual, rectal, intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramuscular, transdérmica e intranasal y/o administración directa a un tumor, tal como un tumor primario. Preferentemente, el compuesto se administra por vía oral, por ejemplo, como comprimido o cápsula. En algunos casos, el comprimido o cápsula se puede formular o recubrir de modo que el compuesto no se libere hasta que alcance el destino deseado, por ejemplo, el estómago. También se pueden utilizar sistemas de liberación sostenida, particularmente para liberar el compuesto durante un período de tiempo prolongado.
El compuesto normalmente se formula junto con uno o más excipientes, diluyentes o transportadores farmacéuticamente aceptables según métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el documento US 2017/0007617 A1 describe formulaciones adecuadas de compuestos según la fórmula I para administración intravenosa.
Pautas posológicas
El compuesto se administra al paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz para el fin pretendido, y con una frecuencia y durante un período de tiempo determinado por un médico capacitado.
En una realización, una dosis terapéuticamente eficaz es aquella que da como resultado una concentración plasmática, preferentemente en estado estacionario, del compuesto de aproximadamente 0,01 μM a aproximadamente 10 μM. En consecuencia, en algunas realizaciones, el compuesto se administra para lograr una concentración plasmática en estado estacionario de aproximadamente 0,01 μM a aproximadamente 10 μM, tal como aproximadamente 1 μM o aproximadamente 5 μM.
En una realización, el compuesto se administra a una dosis de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg, tal como de 1 a aproximadamente 15 mg, tal como de aproximadamente 1 a 10 mg, tal como de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg, tal como de aproximadamente 2 mg a aproximadamente 4 mg al paciente, tal como un paciente humano adulto. En otra realización, el compuesto se administra a una dosis de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 mg, tal como de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 15 mg, tal como de aproximadamente 12 a aproximadamente 14 mg al paciente, tal como un paciente humano adulto. En otra realización, el compuesto se administra a una dosis de aproximadamente 8 mg a aproximadamente 13 mg al paciente, tal como un paciente humano adulto.
En una realización, el compuesto se administra a una dosis de aproximadamente 1 mg, 3 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 12 mg, aproximadamente 15 mg, aproximadamente 18 mg, aproximadamente 21 mg, aproximadamente 24 mg, aproximadamente 27 mg o aproximadamente 30 mg. mg al paciente, tal como un paciente humano adulto
En una realización, el compuesto se administra una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada 3 días, una vez cada 5 días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas o una vez al mes, tal como una vez al día. Preferentemente, el compuesto se administra una vez al día, preferentemente por vía oral (por vía oral (p.o)), para la terapia de mantenimiento.
En una realización, el compuesto se administra como terapia de mantenimiento durante un período de al menos 4 semanas, tal como al menos 8 semanas, tal como al menos 12 semanas, tal como al menos 24 semanas, tal como al menos 48 semanas o más.
En una realización, antes del inicio de la terapia de mantenimiento, por ejemplo, uno o dos días antes, se administra una dosis de refuerzo inicial única del compuesto de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 100 mg, tal como de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 80 mg, tal como de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 70 mg, tal como de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 60 mg, tal como de aproximadamente 30 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 90 mg o aproximadamente 95 mg al paciente, tal como un paciente humano adulto.
Sin desear quedar limitado a teoría alguna, del conocimiento actual de la farmacocinética de la eleclazina, la dosificación diaria para una terapia de mantenimiento según la invención utilizando, por ejemplo, un compuesto según la fórmula la (eleclazina, 451,83 g/mol; CID de PubChem: 71183216) después de una dosis de refuerzo inicial de aproximadamente 95 mg y proporcionando una concentración deseada del orden de aproximadamente 5 μM en un paciente humano adulto (suponiendo que tenga un peso de aproximadamente 70 kg y un volumen de distribución de aproximadamente 42 litros) se puede estimar de la siguiente manera:
En consecuencia, en una realización, el compuesto para su uso según la invención se administra primero por vía oral (p.o.) como una dosis de refuerzo (o de carga) inicial única de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 100 mg, seguido de la administración oral de una dosis de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 mg, una vez al día durante un período de al menos 4 semanas.
En una realización particular, el compuesto para su uso según la invención se administra primero por vía oral (p.o.) como una dosis de refuerzo (o de carga) inicial única de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 mg, seguido de la administración oral de una dosis de aproximadamente 3 mg a aproximadamente 20 mg, tal como de aproximadamente 3 mg, aproximadamente 4 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 7 mg, aproximadamente 8 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 12 mg, aproximadamente 15 mg, aproximadamente 19 mg o aproximadamente 20 mg una vez al día, durante un período de al menos 4 semanas. En realizaciones separadas y específicas, la dosis de carga inicial es de aproximadamente 30 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 80 mg y aproximadamente 95 mg.
En una realización particular, el compuesto para su uso según la invención se administra primero por vía oral (p.o.) como una dosis de refuerzo (o carga) inicial única de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 mg, seguido de la administración oral de una dosis de aproximadamente 3 mg a aproximadamente 10 mg, tal como de aproximadamente 3 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 9 mg o aproximadamente 10 mg una vez al día, durante un período de al menos 4 semanas. En realizaciones separadas y específicas, la dosis de carga inicial es de aproximadamente 30 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 80 mg y aproximadamente 95 mg.
En una realización particular, el compuesto para su uso según la invención se administra primero por vía oral (p.o.) como una dosis de refuerzo (o carga) inicial única de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 100 mg, seguido de la administración oral de una dosis de aproximadamente 3 mg una vez al día, durante un período de al menos 4 semanas. En realizaciones separadas y específicas, la dosis de carga inicial es de aproximadamente 30 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 80 mg y aproximadamente 95 mg.
En una realización particular, el compuesto para su uso según la invención se administra primero por vía oral (p.o.) como una dosis de refuerzo (o carga) inicial única de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 100 mg, seguido de la administración oral de una dosis de aproximadamente 5 mg una vez al día, durante un período de al menos 4 semanas. En realizaciones separadas y específicas, la dosis de carga inicial es de aproximadamente 30 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 80 mg y aproximadamente 95 mg.
En una realización particular, el compuesto para su uso según la invención se administra primero por vía oral (p.o.) como una dosis de refuerzo (o carga) inicial única de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 100 mg, seguido de la administración oral de una dosis de aproximadamente 6 mg una vez al día, durante un período de al menos 4 semanas. En realizaciones separadas y específicas, la dosis de carga inicial es de aproximadamente 30 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 80 mg y aproximadamente 95 mg.
En una realización particular, el compuesto para su uso según la invención se administra primero por vía oral (p.o.) como una dosis de refuerzo (o carga) inicial única de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 100 mg, seguido de la administración oral de una dosis de aproximadamente 9 mg una vez al día, durante un período de al menos 4 semanas. En realizaciones separadas y específicas, la dosis de carga inicial es de aproximadamente 30 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 80 mg y aproximadamente 95 mg.
En una realización particular, el compuesto para su uso según la invención se administra primero por vía oral (p.o.) como una dosis de refuerzo (o carga) inicial única de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 100 mg, seguido de la administración oral de una dosis de aproximadamente 10 mg una vez al día, durante un período de al menos 4 semanas. En realizaciones separadas y específicas, la dosis de carga inicial es de aproximadamente 30 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 80 mg y aproximadamente 95 mg.
En una realización particular, el compuesto para su uso según la invención se administra primero por vía oral (p.o.) como una dosis de refuerzo (o carga) inicial única de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 100 mg, seguido de la administración oral de una dosis de aproximadamente 19 mg una vez al día, durante un período de al menos 4 semanas. En realizaciones separadas y específicas, la dosis de carga inicial es de aproximadamente 30 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 80 mg y aproximadamente 95 mg.
En una realización particular, el compuesto para su uso según la invención se administra primero por vía oral (p.o.) como una dosis de refuerzo (o carga) inicial única de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 100 mg, seguido de la administración oral de una dosis de aproximadamente 20 mg una vez al día, durante un período de al menos 4 semanas. En realizaciones separadas y específicas, la dosis de carga inicial es de aproximadamente 30 mg,
aproximadamente 50 mg, aproximadamente 80 mg y aproximadamente 95 mg.
En otra realización particular, el compuesto para su uso según la invención se administra primero por vía oral (p.o.) como una dosis de refuerzo (o carga) inicial única de aproximadamente 30 mg, seguido de la administración oral de una dosis de aproximadamente 3 mg o aproximadamente 6 mg una vez al día, durante un período de al menos 4 semanas.
En otra realización particular, el compuesto para su uso según la invención se administra primero por vía oral (p.o.) como una dosis de refuerzo (o carga) inicial única de aproximadamente 48 mg, seguido de la administración oral de una dosis de aproximadamente 3 mg o aproximadamente 6 mg una vez al día, durante un período de al menos 4 semanas.
En una realización, el compuesto para un uso según la invención se administra a un nivel de dosificación correspondiente al intervalo de 1 pmol a 10 pmol, que corresponde a de aproximadamente 0,45 mg a aproximadamente 4,5 mg de un compuesto según la Fórmula la.
Ensayos
Los siguientes son ejemplos no limitantes de ensayos útiles para evaluar el efecto de un compuesto según la invención sobre el comportamiento metastásico u otras propiedades de las células cancerosas.
Ensayo de adherencia de células sueltas
La figura 4 es una ilustración esquemática del aparato de medición de adherencia de células sueltas (SCAMA, por sus siglas en inglés) descrito por primera vez en el artículo de Palmer. et al. (2008).
Se sembraron en placas células de cáncer de mama humano de la línea celular MDA-MB-231 a una densidad de 2,5 x 104 células/ml y se dejaron reposar en una placa 401 de cultivo celular durante 48 horas antes de las mediciones. Se retiró el medio y se aplicaron 2 ml del fármaco en estudio durante 10 minutos. La adherencia se midió utilizando una micropipeta 402 de vidrio conectada a una bomba 403 de vacío a través de un tubo de plástico. La punta de la micropipeta se extrajo hasta aproximadamente 20 μm (intervalo, 17-24 μm) de diámetro de punta. La bomba de vacío se usó para crear presión negativa dentro de un depósito 405 de manera que la presión negativa pudiera aplicarse a la punta de la micropipeta presionando el pulgar contra el extremo abierto de una pieza 406 en T sellable. Las células se observaron usando un objetivo 407 de microscopio 20x con la iluminación de una lámpara 408. La presión se midió usando un manómetro digital conectado a un ordenador 410 a través de un cable 411 RS232.
Usando un micromanipulador 412, la micropipeta 402 se colocó en la periferia de una célula suelta. Al cerrar la pieza 406 en T, la presión negativa se aplicó a la célula en investigación y, en el momento exacto en que se observó que la célula se desprendía de la placa 401 de cultivo, la presión se liberó abriendo la pieza 406 en T. La presión negativa necesaria para separar la célula se registró en el ordenador como un pico de presión. El máximo del pico ("presión negativa de desprendimiento" (DNP, por sus siglas en inglés)) se utilizó como medida de la capacidad de adherencia de la célula. Utilizando esta técnica, se pueden hacer varios registros de una sola placa de cultivo en minutos.
Para simular condiciones hipóxicas para las células, la hipoxia se indujo químicamente mediante la aplicación de peróxido de hidrógeno (1-500 μM) durante las últimas 24 horas antes de la prueba.
Para analizar la reversibilidad de un efecto dado, el agente farmacológico se lavó, se añadió medio fresco y la placa se incubó durante 10 minutos más antes de volver a medir. Cada tratamiento se realizó en al menos dos placas de cultivo de células, se midieron al menos 100 células por placa de cultivo y el experimento se repitió tres veces (con los controles correspondientes).
Ensayo de motilidad lateral
Este ensayo se utilizó para representar la motilidad "libre" de las células cancerosas durante la propagación local. La figura 5(a) es una vista en planta desde arriba de una placa 501 de cultivo celular que tiene una capa semiconfluente de células 502 en su superficie, estando las células en un medio 503 acuoso.
Para determinar la motilidad lateral, se realizó una prueba de "cicatrización de heridas ("rasponazos")", en el que se hizo un rasguño 504 de -0,5 mm a través de la capa de células, como se muestra en la figura 5(b), que es una vista en sección lateral de la placa de cultivo celular. Durante el período de 24 horas posteriores a la formación del rasponazo, las células se trasladaron al hueco.
Las figuras 5(c) y 5(d) son vistas en planta esquemáticas de la placa 501 de cultivo celular en el tiempo t = cero cuando el ancho del rasponazo 504 es w0 y el tiempo t = 24 horas cuando el ancho del rasponazo 504 es w24, respectivamente.
Ensayo de migración transversal
Este ensayo se usó para representar la capacidad de las células para migrar a medida que se intra/extravasan. La figura 6 muestra una vista en sección lateral esquemática de una cámara 601 de migración que tiene un inserto 602 Transwell® que separa la cámara en dos secciones que, por conveniencia, se denominarán las secciones 603 superior y 604 inferior de la cámara. El inserto 602 tiene una membrana 605 de filtro de migración en su base con poros 606 de 8 |jm que se extienden a través de ella.
Las células 607 se sembraron en placa a una densidad de 2 x 104/ml en la membrana 605 de filtro y se colocaron en un medio 608 de crecimiento que contenía suero bovino fetal (FBS, por sus siglas en inglés) al 1 %. Se creó un gradiente quimiotáctico a través de la membrana 605 del filtro colocando el medio 609 de crecimiento que contenía FBS al 10 % en la sección 604 inferior de la cámara.
Se permitió que las células migraran a través de la membrana 605 del filtro durante un período de 24 horas, migrando y adhiriéndose las células a la parte inferior de la membrana 605 del filtro. Al final de cada ensayo, las células que no migraron se eliminaron de la superficie superior del inserto 602 con dos hisopos diferentes
El número de células que migraron a la parte inferior del inserto 602 se determinó mediante tinción con cristal violeta. Las células migradas se fijaron durante 15 minutos con metanol enfriado con hielo. A continuación se añadió cristal violeta al 0,5 % (en metanol al 25 %) durante 15 minutos. Los insertos se hisoparon nuevamente y luego se lavaron con agua y se dejaron secar. A continuación se contaron las células usando doce campos de visión separados por inserto (aumento x200).
Ensayo de invasión
Este ensayo es una extensión del ensayo de migración transversal descrito anteriormente. Para "invadir", las células necesitan (i) moverse como en el ensayo de migración transversal y (ii) secretar una enzima proteolítica para digerir su entorno. Por lo tanto, se evaluó la capacidad de las células para invadir los tejidos vecinos mediante la secreción de enzimas utilizando una capa de Matrigel™ (BD Biosciences) dispersada por la membrana porosa de un inserto Transwell®. Matrigel™ está compuesto de laminina, colágeno IV, nidógeno/enactina y proteoglucano - una composición comparable a las proteínas de la membrana basal.
La figura 7 es una vista en sección lateral esquemática de una cámara 701 de invasión que tiene un inserto 702 Transwell® que separa la cámara en las secciones 703 superior y 704 inferior. El inserto 702 tiene una membrana 705 de filtro de migración en su base con poros 706 de 8 jm que se extienden a través de ella. Se muestra una capa 707 de Matrigel™ recubriendo la membrana 705 de filtro.
Las células 708 se sembraron en placa a una densidad de 2 x 104 /ml sobre la capa 707 de Matrigel™ en placas de 24 pocillos (Becton-Dickinson) según las instrucciones del fabricante. Se sembraron 50 j l de Matrigel™ a una dilución de 1:7 (10 mg/ml de solución madre) sobre los insertos y se dejaron durante la noche. Antes de sembrar con las células, el Matrigel™ se rehidrató utilizando un medio sin adiciones. Este medio se eliminó antes de sembrar las células.
Las células se sembraron en placa en un gradiente quimiotáctico de FBS al 1-5% durante la noche (12 horas). La concentración de nutrientes en el medio 709 en la sección 703 superior de la cámara fue menor que la concentración de nutrientes en el medio 710 en la sección 704 inferior para inducir el movimiento de las células a través de la capa 707 de Matrigel™ y a través de los poros 706 hacia el parte inferior de la membrana 705 del filtro. Al final de cada ensayo, las células que no invadieron/migraron se eliminaron de la superficie superior del inserto 702 con dos hisopos diferentes.
El número de células que invaden la parte inferior del inserto 702 se determinó mediante tinción con cristal violeta. Las células que invadieron se fijaron durante 15 minutos con metanol enfriado con hielo. A continuación se añadió cristal violeta al 0,5 % (en metanol al 25 %) durante 15 minutos. Los insertos se hisoparon nuevamente y luego se lavaron con agua y se dejaron secar. A continuación se contaron las células usando doce campos de visión separados por inserto (aumento x200). Si la diferencia en el número medio de células que invaden los dos insertos de control era superior al 40 %, el experimento se rechazaba.
Ensayo de viabilidad celular
Las células se sembraron a una densidad de 5 x 104 células/ml en placas de cultivo de tejido Falcon de 35 mm. Después del tratamiento con un fármaco dado, el medio se eliminó y se reemplazó con 800 j l de medio de cultivo y 200 j l de azul tripano al 0,4 % (Sigma, Dorset, Reino Unido) y se incubó durante 10 minutos en la estufa de incubación. Se eliminó el azul tripano y las células se lavaron una vez con 3 ml de medio de crecimiento. Para cada tratamiento, las células de 30 campos de visión aleatorios se contaron con un aumento de 100x. El número de células muertas, teñidas de azul, se contó en cada campo de visión. Los datos se expresaron como porcentajes de células vivas del número total de células en campos de visión dados. Se promediaron los porcentajes y se compararon las diferencias
entre el control y el tratamiento de al menos tres experimentos independientes.
Ensayo de crecimiento (proliferación) celular
Las células se sembraron en placas a 2 x 104 células/ml en placas de 24 pocillos (Becton-Dickinson) y se dejaron reposar durante la noche. Después, las células se trataron durante el tiempo necesario de incubación (24 horas ), con cambios de medio cada 24 horas. Al final del tratamiento, se eliminó el medio, y se siguió con el ensayo colorimétrico con bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (Grimes et al., 1995). Brevemente, se añadió 0,1 ml de MTT (5 mg/ml preparados en el medio de crecimiento) y 0,4 ml de medio de crecimiento en cada pocillo y la placa se incubó durante 3-4 horas a 37 °C. A continuación, se retiró el medio de las cámaras y se reemplazó con 0,5 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) y 0,063 ml de tampón de glicina (glicina 0,1 M y NaCl 0,1 M; pH 10,5). Se determinó la absorbancia a 570 nm 15 minutos después de la adición del tampón de glicina. Los resultados se calcularon como la media de nueve repeticiones de cada una de las lecturas del espectrofotómetro de tratamiento frente a las de control de los pocillos de invasión individuales.
Cultivo tisular
Los experimentos se realizaron en cuatro líneas celulares muy metastásicas:
(i) MDA-MB-231 de cáncer de mama metastásico humano,
(ii) células SW620 de cáncer de colon metastásico humano,
(iii) células FLG29.1 leucémicas humanas, y
(iv) Mat-LyLu de cáncer de próstata muy metastásico de rata.
Las células se cultivaron utilizando métodos conocidos (por ejemplo, Grimes et al., 1995; Fraser et al., 2005).
Condiciones normóxicas e hipóxicas
Con la excepción de las pruebas de adherencia de células sueltas, que se analizan en el siguiente párrafo, los experimentos se realizaron bien en;
(i) condiciones normóxicas normales (oxígeno al 95 %, dióxido de carbono al 5 %), o
(ii) después de 24 horas de pretratamiento hipóxico (O2 al 2 %, CO2 al 5 %, N2 al 93 %) continuado durante los ensayos.
En los experimentos de adherencia de células sueltas, la hipoxia se indujo químicamente mediante la aplicación de peróxido de hidrógeno (1 - 500 μM) durante 24 horas.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Efectos de la hipoxia química sobre la adherencia de células sueltas de células MDA-MB-231
La hipoxia química se indujo tratando las células con diferentes concentraciones de peróxido de hidrógeno durante 24 horas. La adherencia de células sueltas se midió utilizando la técnica descrita anteriormente e ilustrada en la figura 4. El cambio en la presión negativa de desprendimiento (ADNP, por sus siglas en inglés) se expresó como un porcentaje frente a una población de control de células sin tratar. La hipoxia redujo la adherencia celular y aumentó la concentración de peróxido de hidrógeno, es decir, aumentando el grado de hipoxia, se dio lugar a una mayor reducción en la adherencia celular como se muestra en la figura 8. En esta figura, el eje vertical representa el cambio en la presión negativa de desprendimiento (ADNP), en aumento hacia abajo de modo que un valor negativo más alto es indicativo de una adherencia celular más baja y, por lo tanto, su tendencia al desprendimiento. El eje horizontal es una escala logarítmica de la concentración de peróxido de hidrógeno, aumentando de izquierda a derecha.
Se sembraron células de cáncer de mama humano de la línea celular MDA-MB-23 1 en una placa de cultivo celular a una densidad de 2,5 x 104 células/ml y se dejaron reposar durante 48 horas antes de las mediciones. Las células se sometieron a concentraciones de peróxido de hidrógeno de 1 μM, 10 μM y 100 μM y se midió la presión negativa necesaria para separar las células del fondo de la placa de cultivo celular. En cada concentración de peróxido de hidrógeno, se tomaron medidas en al menos dos placas de cultivo de células para al menos 100 células por placa de cultivo. El experimento se repitió tres veces y las mediciones de la presión negativa de desprendimiento se presentan en la figura 8 como media ± EEM.
En la figura 8, se muestra que las células expuestas a peróxido de hidrógeno a una concentración de 1 μM tenían una presión negativa de desprendimiento media de aproximadamente -9 %, las células expuestas a peróxido de hidrógeno a una concentración de 10 μM tenían una presión negativa de desprendimiento media de aproximadamente -14 %, y las células expuestas a peróxido de hidrógeno a una concentración de 100 μM tenían una presión negativa de desprendimiento media de aproximadamente -20 %. Por lo tanto, el aumento de la concentración de peróxido de hidrógeno disminuyó la adherencia de las células y facilitó su desprendimiento. En otras palabras, el aumento de la
gravedad de las condiciones hipóxicas dio lugar a un aumento en la capacidad de desprendimiento de las células.
Ejemplo 2 - Efectos de eleclazina en una línea celular de cáncer de mama altamente metastásico
Este ejemplo describe los efectos de la eleclazina sobre la viabilidad, proliferación, motilidad, capacidad de invasión celular, expresión de nNAV-1.5 y corriente de sodio transitoria y persistente, utilizando la línea celular MDA-MB-231 de cáncer de mama humano altamente invasivo.
Material y métodos
Cultivo de tejidos y tratamientos:
Se sembraron células MDA-MB-231 de cáncer de mama humano en placas de 100x20 mm (Thermo Fisher Scientific) utilizando el medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) con 4 mmol/l de L-glutamina y suero fetal bovino al 5 % (en adelante denominado medio).
Las células MDA-MB-231 se adhieren de forma natural a las placas de cultivo de tejidos debido a su origen en el adenocarcinoma de mama humano. Se administraron 3 ml de Tripsina-EDTA al 0,25 % (Sigma Aldrich) durante 15 minutos para solubilizar las células adherentes, seguido por centrifugación durante 2 minutos a 1700 rpm. El sedimento se resuspendió en medio y se determinó el número de células utilizando un hemocitómetro. Los medios se renovaron cada 2-3 días y las células madre se mantuvieron en condiciones normóxicas a 37 °C.
La eleclazina se disolvió en DMSO y se almacenó en una concentración de 10 mM a -20 °C. Para el tratamiento de células MDA-MB-231, el fármaco se diluyó en medios de mama para lograr concentraciones de 10 o 20 μM. El control negativo patrón se preparó agregando el mismo volumen de DMSO al 99,9 % al medio.
Ensayo de viabilidad celular:
La viabilidad celular y, por lo tanto, la toxicidad del fármaco se determinó mediante el ensayo con azul de tripano. El procedimiento sigue el principio de que las células viables rodeadas por una doble membrana intacta no pueden absorber el colorante azul de tripano, mientras que las células muertas y fragmentadas sí. Se trataron previamente placas de cultico de 35x10 mm, que contienen inicialmente 3 x 104 células, con eleclazina 20 μM o DMSO al 0,4 % durante 48 horas.
Posteriormente, la solución se reemplazó con 0,2 ml de azul tripano al 0,4 % (Sigma-Aldrich) y 0,8 ml de medio. Después de 10 minutos, la mezcla de azul tripano se aspiró y se reemplazó con medio. La viabilidad celular se determinó contando la proporción de células viables y muertas en 30 campos de visión en cada placa de cultivo (microscopio de contraste de fase Zeiss Axiovert 25, aumento x40).
Ensayo de proliferación:
La proliferación se midió indirectamente utilizando MTT (3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolio). En principio, las células metabólicamente activas captan y procesan el MTT, produciendo formazán como subproducto. Formazán es un tinte púrpura que se puede cuantificar en un espectrofotómetro, proporcionando un vínculo entre las lecturas de absorbancia (570 nm) y el número de células.
Las células se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 2 x 104 células por pocillo y se trataron previamente con 1 ml de las correspondientes soluciones de fármaco (véase la figura. 5) durante 48 horas en hipoxia y normoxia. Se administró a cada pocillo 0,1 ml de MTT (1 mg/ml) diluido en 0,4 ml de medio, seguido de 4 horas de incubación en la oscuridad, condiciones normóxicas (MTT es sensible a la luz). Posteriormente, la solución se aspiró y se añadieron 0,5 ml de DMSO al 99,9 % en combinación con 75 μl de tampón de glicina. El colorante pudo disolverse en DMSO durante una incubación de 15 minutos en una plataforma de agitación a 150 ciclos/minuto. La absorbancia se leyó utilizando el lector universal de microplacas ELX800 (BioTek Instruments) con una medición de fondo de 0,04. Se normalizaron los datos de tres repeticiones técnicas (con 4 repeticiones biológicas cada una) y se realizó un análisis estadístico mediante SPSS.
Ensayo de motilidad lateral:
Se sembraron 106 células en cada placa de cultivo de 35x10 mm y se mantuvieron en condiciones normóxicas para sedimentar durante la noche. Cada placa de cultivo estaba marcada por 15 líneas verticales paralelas y 3 líneas horizontales no superpuestas. El medio se renovó y se hicieron tres heridas a lo largo de las líneas verticales marcadas utilizando una punta de pipeta Gilson de 1 ml. Las células flotantes se eliminaron mediante 3 lavados de medios consecutivos y las células adherentes se trataron con 1 ml de la solución de fármaco correspondiente (Eleclazina 10 μM/DMSO). El ancho inicial de la herida (W0) se midió en 45 puntos fijos (donde las líneas verticales cruzan las heridas) usando la retícula en un microscopio de contraste de fase (aumento x10). A continuación, las células se incubaron en condiciones normóxicas e hipóxicas, con soluciones de fármaco que se reemplazan cada 24 horas. Se
midió la anchura de la herida cada 12 horas y se analizó la motilidad de esta línea celular de cáncer de mama usando el "índice de motilidad" (IM = 1-(Wt/W0)). Un índice de motilidad de 1 representa el cierre completo de la herida, mientras que MI = 0 representa movimiento de células cero. Para cada una de las cuatro condiciones (Eleclazina y DMSO en normoxia e hipoxia), se realizaron cinco repeticiones técnicas (incluyendo tres repeticiones biológicas cada una). El análisis de datos se completó con análisis estadístico con SPSS.
Ensayo de invasión de Matrigel:
Las células se trataron previamente con eleclazina 10 μM o DMSO al 0,2 % durante 24 horas en condiciones hipóxicas. Se insertaron filtros Transwell con poros de 8 μm en placas de 24 pocillos y se recubrieron con 62,6 μg de Matrigel diluido en 50 μl de medio sin FBS. El matrigel solidificó en normoxia a 37 °C durante la noche y se hidrató en normoxia a 37 °C durante 3 horas utilizando 0,5 ml de medio sin FBS. Se administraron 300 μl de medios que contenían FBS al 5 % a la cámara inferior y la misma cantidad de medios que contenían FBS al 1 % se añadió a la cámara superior (filtros Transwell). Se añadieron 2 x 104 células a la solución al 1 %, permitiendo su invasión a través del matrigel a lo largo del gradiente quimiotáctico. Se dejó que las células se asentaran e invadieran en condiciones hipóxicas durante la noche.
Al día siguiente, se aspiró el medio de ambas cámaras y se eliminaron las células que no habían invadido con un hisopo de algodón. Se administró metanol al 100 % enfriado con hielo en la cámara inferior para fijar las células que habían invadido, que posteriormente se tiñeron con 300 μl de cristal violeta (0,5 g/ml diluidos en metanol al 25 %) durante 15 minutos. Los filtros Transwell se lavaron en agua destilada y se secaron a temperatura ambiente durante varias horas.
Inmunocitoquímica:
Las células se trataron previamente con Eleclazina 10 μM o DMSO en condiciones normóxicas e hipóxicas durante 24 horas. Al día siguiente, se colocaron cubreobjetos redondos de 13 mm en placas de 24 pocillos y se incubaron con 0,5 ml de poli-L-lisina durante 20 minutos. La solución se aspiró y se añadieron 2x104 células tratadas previamente encima de cada cubreobjetos. Los pocillos se llenaron hasta 0,5 ml con las correspondientes soluciones de fármaco y las células se dejaron sedimentar sobre los cubreobjetos en condiciones normóxicas e hipóxicas durante la noche.
Las células se lavaron con PBS y se fijaron incubando cubreobjetos con 0,5 ml de PFA al 4 % (en PBS) durante 15 minutos. A continuación, los cubreobjetos se lavaron en PBS tres veces durante 5 minutos. La mitad de las muestras se permeabilizó en saponina al 0,1 %/PBS (4 minutos), seguido de tres lavados de 5 minutos en PBS. Las células se bloquearon durante 1 hora con 0,5 ml de BSA al 5 %/PBS (pH 7,4). Los cubreobjetos se incubaron con 70 μl de NESOpAb (anticuerpo primario específico para Nav1.5 neonatal; dilución 1:100) durante 1 hora en cámara húmeda (temperatura ambiente). Tres lavados con PBS de 5 minutos enjuagaron el NESOpAb residual y el anticuerpo secundario (anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo Alexa Fluor 568, dilución 1:100) se administró durante 1 hora en la oscuridad. Se realizaron tres lavados de 5 minutos utilizando PBS con BSA al 0,1 % y los cubreobjetos se montaron con medio de montaje fluorescente Dako.
Las imágenes se realizaron en un microscopio invertido Zeiss axiovert 200. Las imágenes de contraste de fase se tomaron en formato jpeg, las imágenes fluorescentes se grabaron en formato raw. La fluorescencia celular total corregida se cuantificó utilizando ImageJ.
Resultados
• La eleclazina 20 μM no tuvo efecto sobre la viabilidad de las células MDA-MB-231.
• La eleclazina 10 μM y ranolazina 10 μM no influyeron en la proliferación celular durante los ensayos con MTT.
• La eleclazina 10 μM redujo la motilidad lateral de las células de cáncer de mama altamente metastásico en hipoxia, pero no condiciones normóxicas. Este efecto pasó de una reducción del 5 % después de 12 horas a una reducción del 30 % después de 48 horas.
• La eleclazina 5 μM redujo la capacidad de invasión en aproximadamente un 50 % y fue más eficaz que la ranolazina.
• La inmunocitoquímica indicó que la eleclazina 10 μM redujo la expresión de nNaV1.5 tanto en condiciones normóxicas como hipóxicas. Parecía que nNaV1.5 se expresaba más en normoxia en comparación con hipoxia.
La eleclazina no fue tóxica para las células MDA-MB-231:
El análisis de 270 campos de visión por condición de tratamiento mostró que la eleclazina 20 μM no tuvo un efecto significativo sobre la viabilidad celular en comparación con el DMSO al 0,2 % (figura 9). La proporción promedio de células viables por campo de visión fue del 99,96 % tanto para DMSO como para eleclazina. La proporción mínima de células viables fue del 93 %. Teniendo en cuenta estos resultados y los datos del pinzamiento zonal (no se muestran), se eligió 10 μM como la concentración con la que proceder (sabiendo que los resultados no se confunden con la muerte celular y que la corriente persistente se bloquea de manera eficaz).
Ni la eleclazina, ni la ranolazina influyeron en la proliferación:
Debido a que la proliferación es un sello distintivo esencial de las células cancerosas, era de interés determinar si la eleclazina, como un posible fármaco contra el cáncer, influye en este proceso. La curva de calibración presentada en la figura 10A muestra que el número de células sembradas en placa en cada pocillo se correlaciona linealmente con la absorbancia medida a 570 nm.
Los datos del ensayo con MTT no eran paramétricos y, por lo tanto, se analizaron mediante una prueba U de Mann-Whitney (intervalos de confianza del 95%). Como se presenta en la figura 10B, no hubo una diferencia estadísticamente significativa entre eleclazina 10 jM y ninguno de los controles negativos (DMSO al 0,2 %, TTX 10 |jM, medios). De forma similar, no hubo un efecto significativo de la ranolazina 10 jM en comparación con los controles negativos y la eleclazina. TEA 2 mM (control positivo) redujo la proliferación celular en aproximadamente un 50 %. Para todos los tratamientos, la hipoxia tuvo un pequeño efecto amortiguador sobre la proliferación celular. Para concluir, la eleclazina no afectó la proliferación de células de cáncer de mama triple negativas.
El efecto de la eleclazina sobre la motilidad lateral:
Se utilizó un índice de motilidad (IM) para describir la velocidad a la que se mueven las células MDA-MB-231 in vitro. Esta tasa fue mayor en hipoxia en comparación con la normoxia. La diferencia entre estas dos condiciones experimentales fue estadísticamente significativa para todos los puntos de tiempo (intervalos de confianza del 95 %) pero el efecto de la hipoxia sobre la motilidad no aumentó a lo largo del tiempo.
La eleclazina solo redujo la tasa de motilidad lateral durante las condiciones hipóxicas, pero no en condiciones normóxicas (figura 11). Este efecto sobre la motilidad celular aumentó a lo largo del tiempo. Comenzando con una elevación del IM del 5 % después de 12 horas, las células eran un 30 % menos móviles después de una incubación de 48 horas con eleclazina 10 jM .
Para concluir, la eleclazina 10 jM redujo de manera eficaz la motilidad de las células MDA-MB-231 en condiciones hipóxicas.
El efecto de la eleclazina sobre la capacidad de invasión:
La capacidad de invasión se cuantificó como el número de células por campo de visión que migraron a través del matrigel. Los ensayos preliminares habían demostrado que eleclazina 10 jM reducía drásticamente la capacidad de invasión de las células MDA-MB-231 en condiciones hipóxicas. Por lo tanto, los siguientes experimentos examinaron el efecto de concentraciones más bajas. Véase la figura 12 para los resultados con eleclazina 0,5 jM y tetrodotoxina (TTX) 20 jM sobre la invasión de células MDA MB-231 en hipoxia. Tanto la eleclazina como la ranolazina redujeron la capacidad de invasión en concentraciones tan bajas como 1 jM , pero no hubo diferencia estadísticamente significativa entre los dos bloqueadores de VGSC (figura 13). Como se presenta en la figura 14, la eleclazina 5 jM redujo la capacidad de invasión de las células MDA-MB-231 en aproximadamente un 50 % y fue significativamente más eficaz que la ranolazina 5 jM .
La eleclazina redujo la expresión de la proteína nNav1.5:
La influencia de la eleclazina sobre la expresión de la proteína NaV1.5 neonatal en células MDA-MB-231 se cuantificó utilizando inmunocitoquímica - parámetro: fluorescencia celular total corregida (CTCF, por sus siglas en inglés). Como se visualiza en la figura 15, el tratamiento de 24 horas con eleclazina 10 jM provocó una reducción estadísticamente significativa. Esto indica que la eleclazina bloquea tanto la actividad como la expresión de nNav1.5.
Ejemplo 3 Efecto de eleclazina sobre la capacidad de invasión de una línea celular leucémica humana
Este ejemplo describe los efectos contra la invasión de eleclazina y ranolazina en una línea celular leucémica humana (FLG29.1). Las células FLG 29.1 se cultivaron en medio RPMI complementado con suero de ternera fetal al 10 % y se incubaron a 37 °C en CO2 al 5 %. Para la hipoxia, las células se expusieron previamente a oxígeno al 1 % durante 24 horas. En los ensayos de invasión, las células se sembraron en placas en Matrigel (diluido 1:7) y se trataron (sin tratamiento previo) con eleclazina, ranolazina (5 jM cada una) o TTX (0,1 o 10 jM ). Se permitió que las células invadieran a través de filtros transwell con poros de 8 jm durante 18 h. Al día siguiente, se aspiró el medio de ambas cámaras y se eliminaron las células que no habían invadido con un hisopo de algodón. Se administró metanol enfriado con hielo al 100 % en la cámara inferior para fijar las células que invadieron que posteriormente se tiñeron con 300 j l de cristal violeta (0,5 g/ml diluido en metanol al 25 %) durante 15 minutos. Los filtros Transwell se lavaron en agua destilada y se secaron a temperatura ambiente durante varias horas. Las células que invadieron se contaron bajo un microscopio en campos de visión elegidos al azar. Los datos se expresaron como porcentaje de células que invaden.
Todos los agentes (TTX utilizado como control positivo) inhibieron significativamente la capacidad de invasión, como se muestra en la figura 16.
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Documento WO 2012/049440 A1 (Imperial Innovations Limited)
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Documento WO 2015/017661 A1 (Gilead Sciences, Inc.)
Documento US 2017/0007617 A1 (Strickley R)
Identificador de ClinicalTrials.gov NCT02291237
Identificador de ClinicalTrials.gov NCT02104583
Claims (15)
1. Un compuesto de la fórmula I
en en la que R1 es trifluorometilo o trifluorometoxi o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, para su uso en un método para reducir o prevenir el comportamiento metastásico en un paciente que padece cáncer.
2. El compuesto para el uso según la reivindicación 1,
en donde R1 es trifluorometoxi, es decir un compuesto de la fórmula 4-(pirimidin-2-ilmetil)-7-(4-(trifluorometoxi)fenil)-3,4-dihidrobenzo[f][1,4]oxazepin-5(2H)-ona, de la fórmula
en en la que R1 es trifluorometoxi, es decir un compuesto de la fórmula 4-(pirimidin-2-ilmetil)-7-(4-(trifluorometoxi)fenil)-3,4-dihidrobenzo[f][1,4]oxazepin-5(2H)-ona, de la fórmula
3. El compuesto para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el cáncer es un cáncer hematológico, tal como leucemia o linfoma, o un cáncer de tumor sólido, tal como un carcinoma, mesotelioma, sarcoma, un melanoma o un neuroblastoma.
4. El compuesto para el uso según la reivindicación 3, en donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), cáncer pleural (por ejemplo, mesotelioma), cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer gástrico o neuroblastoma.
5. El compuesto para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el cáncer es un cáncer que expresa canales de sodio dependientes de voltaje (VGSC).
6. El compuesto para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el cáncer está en fases 3, 4 o 5.
7. El compuesto para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el cáncer no es un cáncer que expresa VGSC.
8. El compuesto para el uso según la reivindicación 7, en donde el cáncer está en fases 1 o 2.
9. El compuesto para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el uso es en un método para reducir el comportamiento metastásico del cáncer en un paciente, prevenir el comportamiento metastásico del cáncer en un paciente, reducir o prevenir el comportamiento metastásico en un cáncer que expresa VGSC sin destruir las células cancerosas, reducir o prevenir el comportamiento metastásico en un cáncer que expresa VGSC sin afectar sustancialmente a la proliferación de las células cancerosas, o reducir o prevenir el comportamiento metastásico en un cáncer que expresa VGSC mediante el efecto de al menos reducir la parte persistente de la corriente de VGSC sin eliminar la parte transitoria.
10. El compuesto para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el comportamiento metastásico se reduce o previene:
(a) reduciendo la capacidad de invasión de las células cancerosas;
(b) reduciendo la motilidad de las células cancerosas, opcionalmente en condiciones hipóxicas pero no normóxicas;
(c) disminuyendo la expresión de células cancerosas de al menos un VGSC, opcionalmente en condiciones tanto normóxicas como hipóxicas;
(d) aumentando la capacidad de adherencia de las células cancerosas;
(e) reduciendo la capacidad de migración de las células cancerosas; o
(f) mediante una combinación de (a) y (b), (b) y (c), (a) y (c), (a) a (c), o (a) a (e).
11. El compuesto para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el compuesto se administra a una dosis terapéuticamente eficaz, opcionalmente a un nivel de dosificación correspondiente al intervalo de 1 |jmol a 10 jmol.
12. El compuesto para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el compuesto se administra a una dosis de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg, opcionalmente a una dosis de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg y en donde el paciente es un paciente humano adulto, tal como un paciente humano adulto que tiene un peso en el intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 150 kg, tal como una dosificación de aproximadamente 3 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 12 mg, aproximadamente 15 mg o aproximadamente 19 mg.
13. El compuesto para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el compuesto se administra una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada 3 días, una vez cada 5 días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas o una vez al mes, tal como una vez al día, tal como durante un periodo de al menos 4 semanas, tal como al menos 8 semanas, tal como al menos 12 semanas, tal como al menos 24 semanas, tal como al menos 48 semanas o más.
14. El compuesto para el uso según la reivindicación 13, que comprende administrar una dosis de refuerzo inicial única del compuesto de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 100 mg, tal como administrar el compuesto a una dosis de refuerzo inicial única de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 100 mg seguido de la administración de una dosis de aproximadamente de 1 mg a aproximadamente 20 mg una vez al día durante un período de al menos 4 semanas, tal como una dosis diaria de 3 mg o 6 mg.
15. El compuesto para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el compuesto se administra por vía oral.
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