ES2952525T3 - Variantes de endonucleasa homing PD-1, composiciones y métodos de uso - Google Patents

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Abstract

La presente divulgación proporciona composiciones y métodos de edición del genoma mejorados para editar un gen PD-1. La divulgación proporciona además células editadas con genoma para la prevención, tratamiento o mejora de al menos un síntoma de un cáncer, una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria o una inmunodeficiencia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Variantes de endonucleasa homing PD-1, composiciones y métodos de uso
ANTECEDENTES
Campo técnico
La presente divulgación se refiere a composiciones de edición de genoma mejoradas. Más particularmente, la divulgación se refiere a variantes de nucleasas, composiciones y métodos de uso de las mismas para editar el gen de la muerte celular del programa humano 1 (PD-1).
Descripción de la técnica relacionada
La carga global de cáncer se ha duplicado entre 1975 y 2000. El cáncer es la segunda causa principal de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, con aproximadamente 14,1 millones casos nuevos y 8,2 millones de muertes relacionadas con el cáncer en 2012. Los cánceres más comunes son el cáncer de mama, el cáncer de pulmón y bronquios, el cáncer de próstata, el cáncer de colon y recto, el cáncer de vejiga, melanoma de la piel, linfoma no Hodgkin, cáncer de tiroides, cáncer de riñón y pelvis renal, cáncer de endometrio, leucemia y cáncer de páncreas. Se prevé que el número de nuevos casos de cáncer aumente a 22 millones en las próximas dos décadas.
El sistema inmunitario tiene un papel clave en la detección y la lucha contra el cáncer humano. La mayoría de las células transformadas son detectadas rápidamente por centinelas inmunitarios y destruidas mediante la activación de células T específicas de antígeno a través de receptores de células T (TCR) expresadas clonalmente. Por consiguiente, el cáncer puede considerarse un trastorno inmunológico, un fallo del sistema inmunitario para generar la respuesta antitumoral necesaria para suprimir y eliminar de manera duradera la enfermedad. Para combatir el cáncer de manera más eficaz, ciertas intervenciones de inmunoterapia desarrolladas en las últimas décadas se han centrado específicamente en potenciar la inmunidad de las células T. Estos tratamientos han producido solo casos esporádicos de remisión de la enfermedad y no han tenido un éxito general sustancial. Terapias más recientes que usan anticuerpos monoclonales dirigidos a moléculas que inhiben la activación de las células T, como CTLA-4 o PD-1, han mostrado un efecto antitumoral más sustancial; sin embargo, estos tratamientos también están asociados con una toxicidad sustancial debido a la activación inmunitaria sistémica.
Más recientemente, las estrategias de inmunoterapia celular adoptiva, que se basan en el aislamiento, la modificación, la expansión y la reinfusión de células T, se han explorado y probado en ensayos clínicos de etapas tempranas. Las células T han sido a menudo las células efectoras elegidas para la inmunoterapia contra el cáncer debido a su reconocimiento selectivo y sus potentes mecanismos efectores. Estos tratamientos han mostrado tasas mixtas de éxito, pero un pequeño número de pacientes ha experimentado remisiones duraderas, destacando el potencial aún no realizado de las inmunoterapias basadas en células T.
El reconocimiento con éxito de los antígenos asociados a las células tumorales por parte de las células T citolíticas inicia la lisis tumoral dirigida y respalda cualquier enfoque eficaz de inmunoterapia contra el cáncer. Las células T infiltrantes de tumores (TIL) expresan antígenos asociados a tumores específicamente dirigidos por TCR; sin embargo, un número sustancial de TIL se limita a solo unos pocos cánceres humanos. Los receptores de células T (TCR) y los receptores de antígenos quiméricos (CAR) manipulados aumentan potencialmente la aplicabilidad de la inmunoterapia basada en células T para muchos tipos de cáncer y otros trastornos inmunitarios.
Además, las células T manipuladas del estado de la técnica todavía están reguladas por un microambiente tumoral inmunosupresor complejo que consiste en células cancerosas, células inflamatorias, células del estroma y citoquinas. Entre estos componentes, las células cancerosas, las células inflamatorias y las citoquinas supresoras regulan el fenotipo y la función de las células T. Colectivamente, el microambiente tumoral impulsa a las células T a diferenciarse terminalmente en células T agotadas.
El agotamiento de las células T es un estado de disfunción de las células T en un entorno crónico marcado por una expresión aumentada o una señalización aumentada de los receptores inhibidores; producción de citoquinas efectoras reducida; y una capacidad disminuida para persistir y eliminar el cáncer. Las células T agotadas también muestran pérdida de función de una manera jerárquica: la producción de IL-2 disminuida y la capacidad de matar ex vivo se pierden en la etapa temprana del agotamiento, la producción de TNF-a se pierde en la etapa intermedia y la producción de IFN-y y GzmB se pierden en la etapa avanzada del agotamiento. La mayoría de las células T en el microambiente tumoral se diferencian en células T agotadas y pierden la capacidad de eliminar el cáncer y eventualmente se depuran.
La muerte celular programada 1 (PD-1) se expresa en las células T y media la inmunosupresión al unirse a factores inmunosupresores, por ejemplo, PD-L1 y PD-L2, presentes en el microambiente tumoral. La expresión de PD-L1 y PD-L2 se correlaciona con el pronóstico de algunas enfermedades malignas humanas. La vía de señalización de PD-L1/PD-1 es una vía reguladora importante del agotamiento de las células T. PD-L1 se expresa abundantemente en células cancerosas y células del estroma, y el bloqueo de PD-L1/PD-1 usando anticuerpos monoclonales mejora la función antitumoral de las células T. PD-L2 también se une a PD-1 y regula negativamente la función de las células T.
La WO2014184741 describe métodos para manipular células T alogénicas y altamente activas para inmunoterapia. La WO2015017214 describe proteínas de señalización multipartitas y usos de las mismas. La US2016102323 describe una endonucleasa homing LAGLIDADG que escinde el gen del receptor de quimiocinas C­ C tipo 5 (CCR5) y usos de los mismos. La WO2013/126794 describe composiciones y métodos para el tratamiento de hemoglobinopatías y endonucleasa homing I-Onu-I, SEQ 15. XP002798406 es una secuencia de endonucleasa homing I-OnuI de una base de datos. Marlene Belfort et al. (2014, Methods in Molecular Biology) describe las endonucleasas homing: desde anomalías genéticas hasta recortadores genómicos programables. Ryo Takeuchi et al. (2014, Methods in Molecular Biology) describe la manipulación de meganucleasas personalizadas a través de la compartimentación in vitro y la optimización in cellulo.
BREVE RESUMEN
El polipéptido de la invención que comprende una variante de la endonucleasa homing (HE) I-OnuI que escinde un sitio objetivo en el gen de muerte celular programada human a1 (PD-1), en donde la variante de HE de I-OnuI comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63.
La invención proporciona además un polinucleótido, un ARNm o un ADNc que codifica el polipéptido de la invención.
La invención proporciona además un vector que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención.
La invención proporciona además una célula que comprende el polipéptido de la invención, el polinucleótido de la invención o el vector de la invención.
La invención proporciona además una composición que comprende una o más células de acuerdo con la invención.
La presente divulgación se refiere de manera general, en parte, a composiciones que comprenden variantes de endonucleasas homing y megaTAL que escinden un sitio objetivo en el gen de PD-1 humano y métodos para usar las mismas.
En varias realizaciones, la presente divulgación contempla, en parte, un polipéptido que comprende una variante de endonucleasa homing (HE) que escinde un sitio objetivo en el gen de muerte celular programada 1 (PD-1 ) humano.
En realizaciones particulares, la variante de HE es una variante de la endonucleasa homing LAGLIDADG (LHE).
En ciertas realizaciones, el polipéptido comprende un fragmento biológicamente activo de la variante de HE.
En algunas realizaciones, el fragmento biológicamente activo carece de los 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos N-terminales en comparación con una HE de tipo salvaje correspondiente.
En realizaciones adicionales, el fragmento biológicamente activo carece de los 4 aminoácidos N-terminales en comparación con una HE de tipo salvaje correspondiente.
En ciertas realizaciones, el fragmento biológicamente activo carece de los 8 aminoácidos N-terminales en comparación con una HE de tipo salvaje correspondiente.
En realizaciones particulares, el fragmento biológicamente activo carece de los 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos C-terminales en comparación con una HE de tipo salvaje correspondiente.
En realizaciones particulares, en donde el fragmento biológicamente activo carece del aminoácido C-terminal en comparación con una Hc de tipo salvaje correspondiente.
En algunas realizaciones, el fragmento biológicamente activo carece de los 2 aminoácidos C-terminales en comparación con una HE de tipo salvaje correspondiente.
En realizaciones adicionales, la variante de HE es una variante de una LHE seleccionada del grupo que consiste en: I-AabMI, I-AaeMI, I-Anil, I-ApaMI, I-CapIII, I-CapIV, I-CkaMI, I-CpaMI, I-CpaMII, I-CpaMIII, I-CpaMIV, 1-CpaMV, I-CpaV, I-CraMI, I-EjeMI, 1-GpeMI, I-Gpil, 1-GzeMI, I-GzeMII, I-GzeMIII, 1-HjeMI, I-LtrII, I-LtrI, I-LtrWI, I-MpeMI, I-MveMI, I-NcrII, I-NcrI, 1-NcrMI, I-OheMI, I-OnuI, I-OsoMI, I-OsoMII, I-OsoMIII, I-OsoMIV, I-PanMI, I-PanMII, I-PanMIII, I-PnoMI, I-ScuMI, ISmaMI, I-SscMI, e I-Vdi141I.
En realizaciones particulares, la variante de HE es una variante de una LHE seleccionada del grupo que consiste en: I-CpaMI, 1-HjeMI, I-OnuI, I-PanMI y SmaMI.
En realizaciones adicionales, la variante de HE es una variante I-OnuI LHE.
En realizaciones adicionales, la variante de HE comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la interfaz de reconocimiento de ADN en posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: 19, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 59, 68, 70, 72, 75, 76 77, 78, 80, 82, 168, 180, 182, 184, 186, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 223, 225, 227, 229, 231, 232, 234, 236, 238, y 240 de una secuencia de aminoácidos de I-OnuI LHE como se expone en la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones particulares, la variante de HE comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más sustituciones de aminoácidos en la interfaz de reconocimiento de ADN en posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: 19, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 59, 68, 70, 72, 75, 7677, 78, 80, 82, 168, 180, 182, 184, 186, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 195, 197, 199, 201,203, 223, 225, 227, 229, 231, 232, 234, 236, 238 y 240 de una secuencia de aminoácidos de I-OnuI LHE como se expone en la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones particulares, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 5 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más sustituciones de aminoácidos en por lo menos una posición seleccionada del grupo de posiciones que consiste en las posiciones: 26, 28, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 59, 68, 70, 72, 75, 76, 78, 80, 138, 143, 159, 168, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 197, 199, 201, 203, 207, 223, 224, 225, 227, 229, 232, 236 y 238 de cualquiera de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En ciertas realizaciones, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 5 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más, o todas las sustituciones siguientes de aminoácidos: L26Q, R28E, N32V, K34P, S35N, S36I, V37P, G38R, S40K, S40R, E42R, G44R, Q46E, T48D, N59D, V68K, A70Y, S72Q, S72R, N75S, A76Y, S78K, K80R, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180H, F182G, N184I, I186A, S188R, K189R, S190P, K191A, L192S, G193P, Q197R, V199R, S201A, S201M, T203G, K207R, Y223R, I224T, K225R, K229I, F232K, D236E, y V238E de cualquiera de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En algunas realizaciones, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 5 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más, o todas las sustituciones siguientes de aminoácidos: L26Q, R28E, N32V, K34P, S35N, S36I, V37P, G38R, S40K, E42R, G44R, Q46E, T48D, V68K, A70Y, S72Q, N75S, A76Y, S78K, K80R, L138M, T143N, S159P, F168L, C180H, F182G, N184I, I186A, S188R, K189R, S190P, K191A, L192S, G193P, Q197R, V199R, S201A, T203G, K207R, Y223R, K225R, K229I, F232K, D236E, y V238E de cualquiera de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones particulares, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 5 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más, o todas las sustituciones siguientes de aminoácidos: L26Q, R28E, N32V, K34P, S35N, S36I, V37P, G38R, S40R, E42R, G44R, Q46E, T48D, N59D, V68K, A70Y, S72R, N75S, A76Y, K80R, L138M, T143N, S159P, F168L, C180H, F182G, N184I, I186A, S188R, K189R, S190P, K191A, L192S, G193P, Q197R, V199R, S201A, T203G, K207R, Y223R, I224T, K225R, K229I, F232K, D236E, y V238E de cualquiera de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones adicionales, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 5 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más, o todas las sustituciones siguientes de aminoácidos: L26Q, R28E, N32V, K34P, S35N, S36I, V37P, G38R, S40R, E42R, G44R, Q46E, T48D, N59D, V68K, A70Y, S72Q, N75S, A76Y, K80R, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180H, F182G, N184I, I186A, S188R, K189R, S190P, K191A, L192S, G193P, Q197R, V199R, S201A, T203G, K207R, Y223R, I224T, K225R, K229I, F232K, D236E, y V238E de cualquiera de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones adicionales, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 5 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más, o todas las sustituciones siguientes de aminoácidos: L26Q, R28E, N32V, K34P, S35N, S36I, V37P, G38R, S40R, E42R, G44R, Q46E, T48D, N59D, V68K, A70Y, S72Q, N75S, A76Y, K80R, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180H, F182G, N184I, I186A, S188R, K189R, S190P, K191A, L192S, G193P, Q197R, V199R, S201A, T203G, K207R, Y223R, K225R, F232K, D236E, y V238E de cualquiera de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones particulares, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 5 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más, o todas las sustituciones siguientes de aminoácidos: L26Q, R28E, N32V, K34P, S35N, S36I, V37P, G38R, S40R, E42R, G44R, Q46E, T48D, N59D, V68K, A70Y, S72Q, N75S, A76Y, K80R, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180H, F182G, N184I, I186A, S188R, K189R, S190P, K191A, L192S, G193P, Q197R, V199R, S201M, T203G, Y223R, K225R, F232K, D236E, y V238E de cualquiera de las SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones particulares, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 1 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más sustituciones de aminoácidos en por lo menos una posición seleccionada del grupo de posiciones que consiste en las posiciones: 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 68, 70, 72, 75, 76, 78, 80, 100, 132, 138, 143, 155, 159, 178, 180, 184, 186, 189, 190, 191, 192, 193, 195, 201, 203, 207, 223, 225, 227, 232, 236, 238, y 240 de cualquiera de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En algunas realizaciones, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 1 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más sustituciones de aminoácidos en por lo menos una posición seleccionada del grupo de posiciones que consiste en las posiciones: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, V37G, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46A, Q46T, T48V, T48M, V68I, V68S, A70T, A70Y, A70L, S72D, S72N, N75R, N75H, A76Y, S78R, S78T, K80R, K80C, K80E, K80V, T82F, T82Y, I100V, V132A, L138M, T143N, S155G, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R, y T240E de cualquiera de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones adicionales, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 1 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más, o todas las sustituciones siguientes de aminoácidos: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46A, T48V, V681, A70T, S72D, N75R, A76Y, S78R, K80R, I100V, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R, y T240E de cualquiera de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En ciertas realizaciones, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 1 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más, o todas las sustituciones siguientes de aminoácidos: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, V37G, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48V, V68I, A70T, S72D, N75R, A76Y, S78R, K80C, I100V, V132A, L138M, T143N, S155G, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R, y T240E de cualquiera de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En ciertas realizaciones, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 1 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más, o todas las sustituciones siguientes de aminoácidos: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48M, V68I, A70T, S72N, N75H, A76Y, S78T, K80R, I100V, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R, yd T240E de cualquiera de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En ciertas realizaciones, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 1 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más, o todas las sustituciones siguientes de aminoácidos: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48M, V68S, A70Y, S72N, N75H, A76Y, K80E, T82F, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, 1186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R, y T240E de cualquiera de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En ciertas realizaciones, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 1 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más, o todas las sustituciones siguientes de aminoácidos: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48M, V68S, A70L, S72N, N75H, A76Y, K80V, T82Y, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R, y T240E de cualquiera de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En ciertas realizaciones, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 1 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más, o todas las sustituciones siguientes de aminoácidos: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37G, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48M, V68S, A70T, S72N, N75H, A76Y, K80V, T82Y, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R, y T240E de cualquiera de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones particulares, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 2 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más sustituciones de aminoácidos en por lo menos una posición seleccionada del grupo de posiciones que consiste en las posiciones: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 44, 46, 48, 68, 70, 72, 74, 75, 76, 78, 80, 82, 116, 138, 143, 159, 168, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 195, 199, 203, 207, 225, 227, 229, 232, 2 36, y 238 de cualquiera de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones adicionales, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 2 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más sustituciones de aminoácidos en por lo menos una posición seleccionada del grupo de posiciones que consiste en las posiciones: S24C, L26Q, R28Y, R28H, R30S, N32V, N32L, K34N, K34R, S35N, S35T, S36R, V37S, V37T, G38R, G38K, S40R, T41A, E42R, G44S, G44R, Q46E, Q46A, T48E, V68I, A70N, S72I, D74N, N75T, N75R, A76S, A76R, S78R, K80S, T82G, T82R, V116L, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180N, F182Y, N184H, I186K, K189G, S190R, K191T, L192T, G193R, Q195Y, V199R, T203A, T203S, K207R, K225N, K225T, K227W, K227S, K229A, K229P, F232R, W234A, W234D, D236E, y V238R de cualquiera de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones particulares, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 2 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más, o todas las sustituciones siguientes de aminoácidos: L26Q, R28Y, R30S, N32V, K34N, S35N, S36R, V37S, G38R, S40R, T41A, E42R, G44R, Q46A, T48E, A70N, S72I, N75T, A76S, S78R, K80S, T82G, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180N, F182Y, N184H, I186K, K189G, S190R, K191T, L192T, G193R, Q195Y, V199R, T203A, K207R, K225N, K227W, K229A, F232R, W234A, D236E, y V238R de cualquiera de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En algunas realizaciones, la variante de HE escinde un sitio objetivo de exón 2 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más, o todas las sustituciones siguientes de aminoácidos: S24C, R28H, N32L, K34R, S35T, V37T, G38K, S40R, E42R, G44S, Q46E, T48E, V68I, A70N, S72I, D74N, N75R, A76R, S78R, K80S, T82R, V116L, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180N, F182Y, N184H, I186K, K189G, S190R, K191T, L192T, G193R, Q195Y, V199R, T203S, K207R, K225T, K227S, K229P, F232R, W234D, D236E, y V238R de cualquiera de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones de la invención, la variante de HE comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En algunas realizaciones, la variante de HE comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 60, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En algunas realizaciones, la variante de HE comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En algunas realizaciones, la variante de HE comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 62, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En algunas realizaciones, la variante de HE comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 63, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones particulares, el polipéptido se une a la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 25.
En realizaciones particulares, el polipéptido se une a la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 30.
En realizaciones particulares, el polipéptido se une a la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 35.
En realizaciones adicionales, el polipéptido comprende además un dominio de unión a ADN.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a ADN se selecciona del grupo que consiste en: un dominio de unión a ADN de TALE y un dominio de unión a ADN con dedos de zinc.
En ciertas realizaciones, el dominio de unión al ADN de TALE comprende de aproximadamente 9,5 unidades de repetición de TALE a aproximadamente 15,5 unidades de repetición de TALE.
En realizaciones adicionales, el dominio de unión al ADN de TALE se une a una secuencia de polinucleótidos en el gen de PD-1.
En realizaciones particulares, el dominio de unión al ADN de TALE se une a la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 26.
En ciertas realizaciones, el polipéptido se une y escinde la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 27.
En realizaciones particulares, el dominio de unión al ADN de TALE se une a la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 31.
En ciertas realizaciones, el polipéptido se une y escinde la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 32.
En realizaciones particulares, el dominio de unión al ADN de TALE se une a la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 36.
En ciertas realizaciones, el polipéptido se une y escinde la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 37.
En ciertas realizaciones, el dominio de unión al ADN con dedos de zinc comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 motivos de dedos de zinc.
En realizaciones adicionales, el polipéptido comprende además un conector peptídico y una enzima de procesamiento de extremos o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones particulares, el polipéptido comprende además un péptido 2A de autoescisión viral y una enzima de procesamiento de extremos o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones adicionales, la enzima de procesamiento de extremos o el fragmento biológicamente activo de la misma tiene actividad de exonucleasa 5'-3', exonucleasa alcalina 5'-3', exonucleasa 3'-5', endonucleasa de aleta 5', helicasa o ADN polimerasa independiente de plantilla.
En realizaciones particulares, la enzima de procesamiento de extremos comprende Trex2 o un fragmento biológicamente activo del mismo.
En realizaciones adicionales, el polipéptido escinde el gen de PD-1 humano en una secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 25, 27, 30, 32, 35 o 37.
En varias realizaciones, la presente divulgación contempla, en parte, un polinucleótido que codifica un polipéptido contemplado en la presente.
En realizaciones particulares, la presente divulgación contempla, en parte, un ARNm que codifica un polipéptido contemplado en la presente.
En realizaciones particulares, el ARNm comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 40-42 y 65-68. En varias realizaciones, la presente divulgación contempla, en parte, un ADNc que codifica un polipéptido contemplado en la presente.
En ciertas realizaciones, la presente divulgación contempla, en parte, un vector que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido contemplado en la presente.
En varias realizaciones, la presente divulgación contempla, en parte, una célula que comprende un polipéptido contemplado en la presente.
En algunas realizaciones, la presente divulgación contempla, en parte, una célula que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido contemplado en la presente.
En varias realizaciones, la presente divulgación contempla, en parte, una célula que comprende un vector contemplado en la presente.
En realizaciones adicionales, la presente divulgación contempla, en parte, una célula que comprende una o más modificaciones del genoma introducidas por un polipéptido contemplado en la presente.
En realizaciones particulares, la célula comprende un polinucleótido que codifica uno o más de un potenciador de inmunopotencia, un amortiguador de señales inmunosupresoras o un receptor de antígeno manipulado.
En ciertas realizaciones, el polinucleótido comprende además un promotor de la ARN polimerasa II enlazado operativamente al polinucleótido que codifica el potenciador de la inmunopotencia, el amortiguador de señales inmunosupresoras o el receptor de antígeno manipulado.
En realizaciones particulares, el promotor de la ARN polimerasa II se selecciona del grupo que consiste en: un promotor de EF1a corto, un promotor de EF1a largo, un locus ROSA 26 humano, un promotor de Ubiquitina C (UBC), un promotor de fosfoglicerato quinasa-1 (PGK), un promotor de potenciador de citomegalovirus/p-actina de pollo (CAG), un promotor de p-actina y un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativa suprimida, promotor sustituido en el sitio de unión al cebador (MND) dl587rev.
En algunas realizaciones, el polinucleótido codifica además uno o más péptidos virales autoescindibles enlazados operativamente, intercalados entre y/o flanqueando al potenciador de inmunopotencia, amortiguador de señales inmunosupresoras o receptor de antígeno manipulado.
En algunas realizaciones, el péptido viral de autoescisión es un péptido 2A.
En ciertas realizaciones, el polinucleótido comprende además una señal de poliadenilación heteróloga. En algunas realizaciones, el amortiguador de señales inmunosupresoras comprende una función enzimática que contrarresta un factor inmunosupresor.
En algunas realizaciones, el amortiguador de señales inmunosupresoras comprende actividad de quinureninasa.
En realizaciones particulares, el amortiguador de señales inmunosupresoras comprende: un exodominio que se une a un factor inmunosupresor, opcionalmente en donde el exodominio es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo; un exodominio que se une a un factor inmunosupresor y un dominio transmembrana; o un exodominio que se une a un factor inmunosupresor, un dominio transmembrana y un endodominio modificado que no es capaz de transducir señales inmunosupresoras a la célula.
En ciertas realizaciones, el amortiguador de señales inmunosupresoras es un receptor de TGFpRBII negativo dominante.
En algunas realizaciones, el potenciador de inmunopotencia se selecciona del grupo que consiste en: una molécula acopladora de células T biespecífica (BiTE), un factor inmunopotenciador y un receptor flip.
En realizaciones particulares, el factor inmunopotenciador se selecciona del grupo que consiste en: una citoquina, una quimiocina, una citotoxina, un receptor de citoquinas y variantes de los mismos.
En realizaciones particulares, el receptor de citoquinas se selecciona del grupo que consiste en un receptor de IL-2, un receptor de IL-7, un receptor de IL-12, un receptor de IL-15, un receptor de IL-18 y un receptor de IL-21.
En una realización preferida, la célula comprende un polinucleótido que codifica un receptor de citoquinas seleccionado del grupo que consiste en un receptor de IL-2, un receptor de IL-7, un receptor de IL-12, un receptor de IL-15, un receptor de IL-18, y un receptor de IL-21 enlazado operativamente al promotor endógeno de PD-1.
En otra realización preferida, la célula comprende un polinucleótido que codifica un receptor de citoquinas de IL-12 enlazado operativamente al promotor endógeno de PD-1.
En realizaciones particulares, la citoquina se selecciona del grupo que consiste en IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-21.
En una realización preferida, la célula comprende un polinucleótido que codifica una citoquina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-21 enlazada operativamente al promotor endógeno de PD-1.
En otra realización preferida, la célula comprende un polinucleótido que codifica IL-12 enlazado operativamente al promotor endógeno de PD-1.
En realizaciones adicionales, el receptor flip comprende un exodominio de PD-1 y un dominio transmembrana; y un endodominio de CD28, CD134, CD137, CD278 y/o CD3Z fusionado en marco con el extremo C-terminal del dominio transmembrana de PD-1.
En ciertas realizaciones, el receptor flip comprende un exodominio de PD-1; un dominio transmembrana aislado de un polipéptido de CD3, CD4, CD8a, CD28, CD134 o CD137; y un endodominio de CD28, CD134, CD137, CD278 y/o CD3Z fusionado en marco con el extremo C-terminal del exodominio de PD-1.
En realizaciones particulares, el receptor flip comprende un exodominio de PD-1; y un dominio transmembrana y un endodominio aislado de un polipéptido de CD3, CD4, CD8a, CD28, CD134 o CD137 fusionado en marco con el extremo C-terminal del exodominio de PD-1.
En realizaciones adicionales, el receptor de antígeno manipulado se selecciona del grupo que consiste en: un TCR manipulado, un CAR, un Daric o una zetaquina.
En realizaciones particulares, el receptor manipulado no está integrado en el gen de PD-1.
En ciertas realizaciones, el polinucleótido que codifica uno o más de un potenciador de inmunopotencia, un amortiguador de señales inmunosupresoras o un receptor de antígeno manipulado está integrado en el gen de PD-1.
En realizaciones adicionales, una plantilla de reparación del donante que comprende el polinucleótido que codifica uno o más de un potenciador de inmunopotencia, un amortiguador de señales inmunosupresoras o un receptor de antígeno manipulado está integrado en el gen de PD-1 en un sitio de ruptura de cadena doble de ADN introducido por un polipéptido contemplado en la presente.
En realizaciones particulares, una plantilla de reparación de donante que comprende un polinucleótido que codifica una citoquina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-21, está integrada en el gen de PD-1 en un sitio de ruptura de cadena doble de ADN introducido por un polipéptido contemplado en la presente. En realizaciones preferidas, la citoquina está integrada en el gen de PD-1 en un enlace operativo con el promotor endógeno de PD-1.
En realizaciones particulares, una plantilla de reparación del donante que comprende un polinucleótido que codifica la citoquina IL-12 está integrada en el gen de PD-1 en un sitio de ruptura de cadena doble de ADN introducido por un polipéptido contemplado en la presente. En realizaciones preferidas, la citoquina de IL-12 está integrada en el gen de PD-1 en enlace operativo con el promotor endógeno de PD-1.
[0109]
En realizaciones particulares, una plantilla de reparación del donante que comprende un polinucleótido que codifica un receptor de citoquinas seleccionado del grupo que consiste en un receptor de IL-2, un receptor de IL-7, un receptor de IL-12, un receptor de IL-15, un receptor de IL-18, y un receptor de IL-21, se integra en el gen de PD-1 en un sitio de ruptura de cadena doble de ADN introducido por un polipéptido contemplado en la presente. En realizaciones preferidas, el receptor de citoquinas se integra en el gen de PD-1 en enlace operativo con el promotor endógeno de PD-1.
En realizaciones particulares, una plantilla de reparación donante que comprende un polinucleótido que codifica un receptor de citoquinas IL-12 se integra en el gen de PD-1 en un sitio de ruptura de cadena doble de ADN introducido por un polipéptido contemplado en la presente. En realizaciones preferidas, el receptor de citoquinas de IL-12 se integra en el gen de PD-1 en enlace operativo con el promotor endógeno de PD-1.
En algunas realizaciones, la célula es una célula hematopoyética.
En realizaciones adicionales, la célula es una célula T.
En realizaciones particulares, la célula es una célula CD3+, CD4+ y/o CD8+.
En realizaciones particulares, la célula es una célula efectora inmunitaria.
En realizaciones adicionales, la célula es un linfocito T citotóxico (CTL), un linfocito infiltrante de tumores (TIL) o una célula T auxiliar.
En ciertas realizaciones, la célula es una célula asesina natural (NK) o una célula T asesina natural (NKT). En realizaciones particulares, la fuente de la célula son células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre de cordón umbilical, tejido de timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido de bazo o tumores.
En realizaciones particulares, la presente divulgación contempla, en parte, una pluralidad de células que comprenden una o más células contempladas en la presente.
En varias realizaciones, la presente divulgación contempla, en parte, una composición que comprende una o más células contempladas en la presente.
En ciertas realizaciones, la presente divulgación contempla, en parte, una composición que comprende una 0 más células contempladas en la presente y un portador fisiológicamente aceptable.
En varias realizaciones, la presente divulgación contempla, en parte, un método para editar un gen de PD-1 humano en una célula que comprende: introducir un polinucleótido que codifica un polipéptido contemplado en la presente en la célula, en donde la expresión del polipéptido crea una ruptura de cadena doble en un sitio objetivo en un gen de PD-1 humano.
En algunas realizaciones, la presente divulgación contempla, en parte, un método para editar un gen de PD-1 humano en la célula que comprende: introducir un polinucleótido que codifica un polipéptido contemplado en la presente en la célula, en donde la expresión del polipéptido crea una ruptura de cadena doble en un sitio objetivo en un gen de PD-1 humano, en donde la rotura se repara mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ).
En varias realizaciones, la presente divulgación contempla, en parte, un método para editar un gen de PD-1 humano en una célula que comprende: introducir un polinucleótido que codifica un polipéptido contemplado en la presente y una plantilla de reparación de donante en la célula, en donde la expresión del polipéptido crea una rotura de cadena doble en un sitio objetivo en un gen de PD-1 humano y la plantilla de reparación del donante se incorporan en el gen de PD-1 humano mediante reparación dirigida por homología (HDR) en el sitio de la rotura de cadena doble (DSB).
En realizaciones adicionales, la célula es una célula hematopoyética.
En realizaciones particulares, la célula es una célula T.
En realizaciones particulares, la célula es una célula CD3+, CD4+ y/o CD8+.
En ciertas realizaciones, la célula es una célula efectora inmunitaria.
En algunas realizaciones, la célula es un linfocito T citotóxico (CTL), un linfocito infiltrante de tumores (TIL) o una célula T auxiliar.
En realizaciones particulares, la célula es una célula asesina natural (NK) o una célula T asesina natural (NKT).
En ciertas realizaciones, la fuente de la célula son células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre de cordón umbilical, tejido de timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido de bazo o tumores.
En realizaciones particulares, el polinucleótido que codifica el polipéptido es un ARNm.
En realizaciones adicionales, se introduce en la célula un polinucleótido que codifica una exonucleasa 3'-5'.
En algunas realizaciones, se introduce en la célula un polinucleótido que codifica Trex2 o un fragmento biológicamente activo del mismo.
En realizaciones adicionales, la plantilla de reparación de donante codifica un gen de PD-1 o una porción del mismo que comprende una o más mutaciones en comparación con el gen de PD-1 de tipo salvaje.
En realizaciones particulares, la plantilla de reparación del donante codifica uno o más de un potenciador de inmunopotencia, un amortiguador de señales inmunosupresoras o un receptor de antígeno manipulado.
En realizaciones adicionales, la plantilla de reparación del donante comprende además un promotor de ARN polimerasa II enlazado operativamente al potenciador de inmunopotencia, amortiguador de señales inmunosupresoras o receptor de antígeno manipulado.
En realizaciones adicionales, el promotor de la ARN polimerasa II se selecciona del grupo que consiste en: un promotor EF1a corto, un promotor EF1a largo, un locus ROSA 26 humano, un promotor de Ubiquitina C (UBC), un promotor de fosfoglicerato quinasa-1 (PGK), un promotor de potenciador de citomegalovirus/p-actina de pollo (CAG), un promotor de p-actina y un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativa suprimida, promotor sustituido en el sitio de unión al cebador (MND) dl587rev.
En ciertas realizaciones, la plantilla de reparación del donante codifica además uno o más péptidos virales autoescindibles enlazados operativamente, intercalados entre y/o flanqueando al potenciador de inmunopotencia, amortiguador de señales inmunosupresoras o receptor de antígeno manipulado.
En realizaciones adicionales, el péptido viral de autoescisión es un péptido 2A.
En algunas realizaciones, la plantilla de reparación del donante comprende además una señal de poliadenilación heteróloga.
En ciertas realizaciones, el amortiguador de señales inmunosupresoras comprende una función enzimática que contrarresta un factor inmunosupresor.
En realizaciones adicionales, el amortiguador de señales inmunosupresoras comprende actividad de quinureninasa.
En realizaciones particulares, el amortiguador de señales inmunosupresoras comprende: un exodominio que se une a un factor inmunosupresor, opcionalmente en donde el exodominio es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo; un exodominio que se une a un factor inmunosupresor y un dominio transmembrana; o un exodominio que se une a un factor inmunosupresor, un dominio transmembrana y un endodominio modificado que no es capaz de transducir señales inmunosupresoras a la célula.
En realizaciones adicionales, el amortiguador de señales inmunosupresoras es un receptor de TGFpRII negativo dominante.
En ciertas realizaciones, el potenciador de la inmunopotencia se selecciona del grupo que consiste en: una molécula acopladora de células T biespecífica (BiTE), un factor inmunopotenciador y un receptor flip.
En realizaciones adicionales, el factor inmunopotenciador se selecciona del grupo que consiste en: una citoquina, una quimiocina, una citotoxina, un receptor de citoquinas y variantes de las mismas.
En realizaciones particulares, el factor inmunopotenciador se selecciona del grupo que consiste en: una citoquina, una quimiocina, una citotoxina, un receptor de citoquinas y variantes de los mismos.
En realizaciones particulares, el receptor de citoquinas se selecciona del grupo que consiste en un receptor de IL-2, un receptor de IL-7, un receptor de IL-12, un receptor de IL-15, un receptor de IL-18 y un receptor de IL-21.
En una realización preferida, la célula comprende un polinucleótido que codifica un receptor de citoquinas seleccionado del grupo que consiste en un receptor de IL-2, un receptor de IL-7, un receptor de IL-12, un receptor de IL-15, un receptor de IL-18, y un receptor de IL-21 enlazado operativamente al promotor endógeno de PD-1.
En otra realización preferida, la célula comprende un polinucleótido que codifica un receptor de IL-12 enlazado operativamente al promotor endógeno de PD-1.
En realizaciones particulares, la citoquina se selecciona del grupo que consiste en IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-21.
En una realización preferida, la célula comprende un polinucleótido que codifica una citoquina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-21 enlazada operativamente al promotor endógeno de PD-1.
En otra realización preferida, la célula comprende un polinucleótido que codifica IL-12 enlazado operativamente al promotor endógeno de PD-1.
En realizaciones particulares, el receptor flip comprende un exodominio de PD-1 y un dominio transmembrana; y un endodominio de CD28, CD134, CD137, CD278 y/o CD3Z fusionado en marco con el extremo C-terminal del dominio transmembrana de PD-1.
En realizaciones adicionales, el receptor flip comprende un exodominio de PD-1; un dominio transmembrana aislado de un polipéptido de CD3, CD4, CD8a, Cd 28, CD134 o CD137; y un endodominio de CD28, CD134, CD137, CD278 y/o CD3Z fusionado en marco con el extremo C-terminal del exodominio de PD-1.
En realizaciones adicionales, el receptor flip comprende un exodominio de PD-1; y un dominio transmembrana y un endodominio aislado de un polipéptido de CD3, CD4, CD8a, CD28, CD134 o CD137 fusionado en marco con el extremo C-terminal del exodominio de PD-1.
En realizaciones adicionales, el receptor de antígeno manipulado se selecciona del grupo que consiste en: un TCR manipulado, un CAR, un Daric o una zetaquina.
En realizaciones adicionales, la plantilla de reparación del donante comprende un brazo de homología 5' homólogo a una secuencia 5' del gen de PD-1 humano del DSB y un brazo de homología 3' homólogo a una secuenci 3' del gen de PD-1 humano del DSB.
En realizaciones particulares, las longitudes de los brazos de homología 5' y 3' se seleccionan independientemente de aproximadamente 100 pb a aproximadamente 2500 pb.
En algunas realizaciones, las longitudes de los brazos de homología 5' y 3' se seleccionan independientemente de aproximadamente 600 pb a aproximadamente 1500 pb.
En algunas realizaciones, el brazo de homología 5' tiene aproximadamente 1500 pb y el brazo de homología 3' tiene aproximadamente 1000 pb.
En ciertas realizaciones, el brazo de homología 5' tiene aproximadamente 600 pb y el brazo de homología 3' tiene aproximadamente 600 pb.
En realizaciones particulares, se usa un vector viral para introducir la plantilla de reparación del donante en la célula.
En realizaciones adicionales, el vector viral es un vector viral recombinante adenoasociado (rAAV) o un retrovirus.
En realizaciones adicionales, el rAAV tiene uno o más ITR de AAV2.
En ciertas realizaciones, el rAAV tiene un serotipo seleccionado del grupo que consiste en: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 y AAV10.
En realizaciones adicionales, el rAAV tiene un serotipo AAV2 o AAV6.
En algunas realizaciones, el retrovirus es un lentivirus.
En realizaciones particulares, el lentivirus es un lentivirus deficiente en integrasa (IDLV).
En varias realizaciones, la presente divulgación contempla, en parte, un método para tratar, prevenir o mejorar por lo menos un síntoma de cáncer, enfermedad infecciosa, enfermedad autoinmune, enfermedad inflamatoria e inmunodeficiencia, o afección asociada con la misma, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición contemplada en la presente.
En varias realizaciones, la presente divulgación contempla, en parte, una composición de acuerdo con la invención para su uso en un método para tratar un cáncer sólido que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición contemplada en la presente.
En realizaciones adicionales, el cáncer sólido comprende cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de testículo, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, sarcoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de huesos, cáncer de tiroides, cáncer de riñón, o cáncer de piel.
En varias realizaciones, la presente divulgación contempla, en parte, una composición de acuerdo con la invención para su uso en un método para tratar una enfermedad maligna hematológica que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición contemplada en la presente.
En realizaciones adicionales, la enfermedad maligna hematológica es una leucemia, linfoma o mieloma múltiple.
BREVE DESCRIPCIÓN DE VARIAS VISTAS DE LOS DIBUJOS
La Figura 1A muestra un boceto que ilustra las posiciones del dominio de IgV y los motivos ITIM e ITSM de PD-1 en relación con la posición del sitio objetivo de megaTAL en el exón.
La Figura 1B muestra el gen de p D-1 y la secuencia del sitio objetivo en el motivo ITSM codificado por el exón 5 (SEQ ID NO: 106-108), destacando el motivo central-4 de HE localizado en el codón para el residuo de fosfotirosina ITSM en la posición 248.
La Figura 2 muestra cómo se reprogramó I-OnuI a través de la manipulación de NTD y CTD contra "medios sitios" quiméricos (SEQ ID NOS: 109 y 110) a través de dos rondas de clasificación, seguido de la fusión de los dominios reprogramados (SEQ ID NO: 111) y selección contra el sitio objetivo del exón 5 de PD-1 para aislar una HE completamente reprogramada.
La Figura 3A muestra la selección inicial de la variante de HE del exón 5 de PD-1 para la actividad en un ensayo de informador cromosómico.
La Figura 3B muestra que la variante de HE de PD-1 (PD-1.ITSM.ex5_RD1_CV3-08) tenía propiedades de afinidad de unión al ADN moderadas cuando se midió mediante titulación de sustrato en equilibrio.
La Figura 4 muestra la selección secundaria de actividad de Hc de PD-1 en un ensayo de informador cromosómico después del aislamiento de variantes potenciadas a partir de la clasificación de flujo basada en visualización de una biblioteca mutagenizada aleatoriamente de variantes de PD-1.ITSM.ex5_RD1_CV3-08 realizada bajo una escisión más estricta y condiciones de afinidad para aislar variantes con actividad mejorada.
La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo de secuenciación con bisulfito del exón 5 de PD-1 (SEQ ID NO: 112) en células T humanas primarias activadas para determinar el estado de metilación de los motivos CpG (SEQ ID NO: 113) presentes en la HE del exón 5 de PD-1.
La Figura 6 muestra los resultados de un análisis de escisión y afinidad de unión al ADN de la variante de HE PD-1.ITSM.ex5_RD5_CV23MK frente a sustratos del exón 5 de PD-1 parcial y completamente metilados.
La Figura 7A muestra que la coadministración de PD-1.ITSM.ex5_RD5_CV23MK megaTAL en las células T junto con TREX2 edita el locus objetivo a una tasa de aproximadamente el 60% según se mide mediante análisis TIDE.
La Figura 7B muestra la distribución de indeles en el motivo de consenso de ITSM de PD-1 cuando es escindido por PD-1.ITSM.ex5_RD5_CV23MK megaTAL en presencia de Trex2.
La Figura 8 muestra los resultados de realización de perfiles de la especificidad central-4 de la HE del exón 5 de PD-1.
La Figura 9A muestra un boceto que ilustra las posiciones de los dominios de IgV, ITIM e ITSM de PD-1 con respeto a la posición de exones 1, 2 y 5.
La Figura 9B muestra el gen de PD-1 y la ubicación de los sitios objetivo en los exones 1 (SEQ ID NOS: 114-116), 2 (SEQ ID NOS: 117-119) y 5 (SEQ ID NOS: 106-108).
La Figura 10 muestra los resultados de los ensayos de informadores cromosómicos después de la clasificación de flujo basada en visualización de la actividad catalítica para un I-OnuI inicialmente reprogramado que se dirige al exón 1 de PD-1 (PD-1.ile3.exon1_RD1_B1, panel superior); refinamiento de PD-1.ile3.exon1_RD1_B1 mediante mutagenización y selección en condiciones catalíticas más estrictas para identificar mutaciones que ayuden a la escisión del objetivo para identificar variantes más activas (PD-1.ile3.exon1_RD2_B1H8 y PD-1.ile3.exon1_RD2_B1G2 paneles intermedios); y I-OnuI inicialmente reprogramado que se dirige al exón 2 de PD-1 (PD-1.IgVexon2_RD1_G5, panel inferior). Los resultados se muestran para la nucleasa en presencia de Trex2 (paneles de la izquierda) y formateados como megaTAL (paneles de la derecha).
La Figura 11A muestra las afinidades de unión al ADN de PD-1.ile3.exon1_RD2_B1H8 y PD-1.IgV.exon2_RD1_G5 cuando se miden mediante titulación de sustrato en equilibrio usando sus secuencias objetivo respectivas.
La Figura 11B muestra una comparación de la actividad de escisión del ADN entre nucleasas refinadas por especificidad de PD-1.ile3.exon1 (RD2_B1G2, RD3_B1G2C4, RD3_B1G2C11, RD3_B1G2C5) frente a 64 objetivos de ADN variados en los pares de bases -8,-7 y -6. El mapa de calor representa la relación de los valores medianos que no escinden: que escinden obtenidos a partir de gráficos de puntos.
La Figura 12 muestra los resultados de un ensayo de secuenciación con bisulfito del exón 1 de PD-1 (SEQ ID NO: 120) y el exón 2 (SEQ ID NO: 122) en células T humanas primarias activadas (paneles de la izquierda), que demuestran que el motivo CpG del exón 1 de PD-1 (SEQ ID NO: 121) permanece sin metilar mientras que los motivos CpG del exón 2 de PD-1 (SEQ ID NO: 123) están metilados. La Figura 12 muestra además que PD-1.IgV.exon2_RD1_G5 escindió eficientemente tanto los sitios objetivo no metilados como los metilados (paneles derecho superior e inferior derecho, respectivamente).
La Figura 13A muestra la expresión superficial de PD-1 en células CAR T electroporadas con vehículo, CFP, un CCR5 megaTAL, PD-1.ITSM.ex5_RD5_CV23MK megaTAL o PD-1.ile3.exon1_RD2_B1H8 megaTAL y posteriormente estimuladas con vehículo o forbol 12-miristato 13 -acetato (PMA)/Lonomicina (P/I).
La Figura 13B muestra la expresión superficial de PD-1 en células T electroporadas con versiones refinadas de PD-1.ile3.exon1 (RD2_B1G2, RD3_B1G2C4, RD3_B1G2C11, RD3_B1G2C5) megaTAL
La Figura 14 muestra que la administración simultánea de PD-1.ITSM.ex5_RD5_CV23MK megaTAL y PD-1.ile3.exon1_RD2_B1H8 megaTAL con o sin Trex2 disminuye significativamente la expresión de PD-1 en la superficie celular.
La Figura 15A muestra que las célulaos T CAR anti-BCMA electroporadas con ARNm que codifica PD-1.ITSM.ex5_RD5_CV23MK o PD-1.ile3.exon1_RD2_B1H8 muestran una supresión de citoquinas mediada por PD-L1 reducida en comparación con las células T CAR anti-BCMA electroporadas con vehículo o ARNm que codifica CFP o un CCR5 megaTAL.
La Figura 15B muestra que las células T CAR anti-BCMA electroporadas con ARNm que codifica PD-1.ITSM.ex5_RD5_CV23MK o PD-1.ile3.exon1_RD2_B1H8 muestran una supresión de citoquinas mediada por PD-L1 reducida en comparación con las células T CAR anti-BCMA electroporadas con vehículo o ARNm que codifica un TCRa megaTAL catalíticamente inactivo (exp. sin tratar). La adición de anticuerpo de PD-1 a los cultivos anuló la supresión de citoquinas en células T CAR anti-BCMA electroporadas con vehículo, o ARNm que codifica un TCRa megaTAL catalíticamente inactivo.
La Figura 16A muestra estrategias para introducir varios casetes de expresión (GFP, panel superior; CAR anti-CD19, panel central; y CAR anti-BCMA, panel inferior) en el exón 1 de PD-1 por recombinación homóloga.
La Figura 16B muestra análisis de citometría de flujo representativos para determinar la expresión a largo plazo de los casetes integrados cromosómicamente en células T tratadas con vectores de direccionamiento de PD-1.ile3.exon1_RD2_B1H8 megaTAL y rAAV que contienen un casete de expresión de GFP, CAR anti-CD19 o CAR anti-BCMA.
La Figura 17 muestra una estrategia para introducir un gen informador mCherry en el codón de inicio de PD-1 en el exón 1, y un análisis de citometría de flujo de la expresión de mCherry en células T electroporadas con vehículo o PD-1.ile3.exon1_RD2_B1H8 megaTAL y transducido con vehículo o un vector de direccionamiento de rAAV que codifica mCherry tanto en presencia como en ausencia de 24 horas de tratamiento con PMA/lonomicina.
La Figura 18 muestra una estrategia para introducir un casete de expresión de promotor de MND-BFP en el motivo ITSM en el exón 5 de PD-1, y un análisis de citometría de flujo de la expresión de BFP en células T electroporadas con vehículo o PD-1.ITSM.ex5_RD5_CV23MK megaTAL y transducidas con vehículo o un vector de direccionamiento de rAAV que contiene el casete de expresión pMND-BFP.
La Figura 19 muestra una estrategia para introducir un casete de expresión de promotor de MND-BFP en el motivo ITSM en el exón 5 de PD-1, y un análisis de citometría de flujo para la expresión de PD-1 y BFP en células T electroporadas con vehículo o PD-1.ITSM.ex5_RD5_CV23MK megaTAL y transducidas con vehículo o un vector de direccionamiento de rAAV que contiene el casete de expresión pMND-BFP.
La Figura 20 muestra estrategias para introducir un casete de expresión de promotor de MND-BFP en el motivo ITSM en el exón 5 de PD-1, en donde los brazos de homología contienen polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) (panel superior). El panel inferior muestra un análisis de citometría de flujo de células T electroporadas con PD-1.ITSM.ex5_RD5_CV23MK megaTAL y transducidas con un vector de direccionamiento de rAAV que contiene el casete de expresión de pMND-BFP con brazos de homología de tipo salvaje, un brazo de homología 5' que contiene un SNP, o un brazo de homología 3' que contiene un SNP.
La Figura 21 muestra una estrategia para introducir un casete de expresión del receptor de promotorde MND-PD-1.CD28 flip en el motivo ITSM en el exón 5 de PD-1, y un análisis de citometría de flujo para la expresión de PD-1 y BFP en células T electroporadas con vehículo o PD-1.ITSM.ex5_RD5_CV23MK megaTAL y transducidas con vehículo o un vector de direccionamiento de rAAV que contiene el casete de expresión del receptor pMND-PD-1.CD28 flip. La Figura 22 muestra una estrategia para crear una deleción a gran escala en el gen de PD-1 mediante la administración de un PD-1.ITSM.ex5_RD5_CV23MK megaTAL y un casete de rAAV que contiene brazos de homología más de una kilobase en sentido ascendente del sitio objetivo del exón 5.
La Figura 23 muestra una estrategia para insertar una citoquina en el gen de PD-1, donde la expresión está bajo el control del promotor endógeno de PD-1 (panel superior). Después de 24 horas de tratamiento con PMA/lonomicina, las células T CAR anti-BCMA electroporadas con ARNm de megaTAL de PD-1 y transducidas con rAAV que codifica IL-12 mostraron una expresión disminuida de PD-1 en comparación con las células tratadas con control (panel inferior). La Figura 24A muestra que después de 24 horas de tratamiento con PMA/lonomicina, las células T CAR anti-BCMA electroporadas con ARNm de megaTAL de PD-1 y transducidas con rAAV que codifica IL-12 mostraron una producción de IL-12 aumentada en comparación con las células tratadas con control (panel izquierdo). Las células CAR T anti-BCMA electroporadas con ARNm de megaTAL de PD-1 y transducidas con rAAV que codifica IL-12 y cultivadas en presencia de células objetivo K562-BCMA mostraron una producción aumentada de IL-12 en comparación con las células tratadas con control (panel derecho).
La Figura 24B muestra los resultados de un ensayo de estimulación en serie. Se mezclaron células K52-BCMA y células T CAR anti-BCMA se cultivaron durante 7 días y se añadieron células objetivo K562-BCMA adicionales para imitar una estimulación repetida. Después de la reestimulación, las células T CAR anti-BCMA tratadas con IL-12 recombinante o que se habían tratado tanto con megaTAL de PD-1 como con la plantilla de HDR de IL-12 mostraron una producción de IFNy y citotoxicidad aumentadas en comparación con las células tratadas con control.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS IDENTIFICADORES DE SECUENCIA
SEQ ID NO: 1 es una secuencia de aminoácidos de una endonucleasa homing LAGLIDADG (LHE) I-OnuI de tipo salvaje.
SEQ ID NO: 2 es una secuencia de aminoácidos de una LHE I-OnuI de tipo salvaje.
SEQ ID NO: 3 es una secuencia de aminoácidos de un fragmento biológicamente activo de una LHE I-OnuI de tipo salvaje.
SEQ ID NO: 4 es una secuencia de aminoácidos de un fragmento biológicamente activo de una LHE I-OnuI de tipo salvaje.
SEQ ID NO: 5 es una secuencia de aminoácidos de un fragmento biológicamente activo de una LHE I-OnuI de tipo salvaje.
SEQ ID NO: 6 es una secuencia de aminoácidos de una variante de LHE I-OnuI reprogramada para unirse y escindir un sitio objetivo en el gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 7 es una secuencia de aminoácidos de una variante de LHE I-OnuI reprogramada para unirse y escindir un sitio objetivo en el gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 8 es una secuencia de aminoácidos de una variante de LHE I-OnuI reprogramada para unirse y escindir un sitio objetivo en el gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 9 es una secuencia de aminoácidos de una variante de LHE I-OnuI reprogramada para unirse y escindir un sitio objetivo en el gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 10 es una secuencia de aminoácidos de una variante de LHE I-OnuI reprogramada para unirse y escindir un sitio objetivo en el gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 11 es una secuencia de aminoácidos de una variante de LHE I-OnuI reprogramada para unirse y escindir un sitio objetivo en el gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 12 es una secuencia de aminoácidos de una variante de LHE I-OnuI reprogramada para unirse y escindir un sitio objetivo en el gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 13 es una secuencia de aminoácidos de una variante de LHE I-OnuI reprogramada para unirse y escindir un sitio objetivo en el gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 14 es una secuencia de aminoácidos de una variante de LHE I-OnuI reprogramada para unirse y escindir un sitio objetivo en el gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 15 es una secuencia de aminoácidos de un megaTAL que se une y escinde un sitio objetivo en un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 16 es una secuencia de aminoácidos de un megaTAL que se une y escinde un sitio objetivo en un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 17 es una secuencia de aminoácidos de un megaTAL que se une y escinde un sitio objetivo en un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 18 es una secuencia de aminoácidos de un megaTAL que se une y escinde un sitio objetivo en un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 19 es una secuencia de aminoácidos de un megaTAL que se une y escinde un sitio objetivo en un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 20 es una secuencia de aminoácidos de un megaTAL que se une y escinde un sitio objetivo en un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 21 es una secuencia de aminoácidos de un megaTAL que se une y escinde un sitio objetivo en un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 22 es una secuencia de aminoácidos de un megaTAL que se une y escinde un sitio objetivo en un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 23 es una secuencia de aminoácidos de un megaTAL que se une y escinde un sitio objetivo en un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 24 es una secuencia de aminoácidos que codifica Trex2 murino.
SEQ ID NO: 25 es un sitio objetivo variante de LHE I-OnuI en el exón 5 de un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 26 es un sitio objetivo de dominio de unión a ADN de TALE en el exón 5 de un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 27 es un sitio objetivo megaTAL en el exón 5 de un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 28 es un sitio objetivo de dominio N-terminal variante de LHE I-OnuI en el exón 5 de un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 29 es un sitio objetivo de dominio C-terminal variante de LHE I-OnuI en el exón 5 de un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 30 es un sitio objetivo variante de LHE I-OnuI en el exón 1 de un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 31 es un sitio objetivo de dominio de unión a ADN de TALE en el exón 1 de un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 32 es un sitio objetivo de megaTAL en el exón 1 de un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 33 es un sitio objetivo de dominio N-terminal variante de LHE I-OnuI en el exón 1 de un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 34 es un sitio objetivo de dominio C-terminal variante de LHE I-OnuI en el exón 1 de un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 35 es un sitio objetivo variante de LHE I-OnuI en el exón 2 de un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 36 es un sitio objetivo del dominio de unión a ADN de TALE en el exón 2 de un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 37 es un sitio objetivo de megaTAL en el exón 2 de un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 38 es un sitio objetivo de dominio N-terminal variante de LHE I-OnuI en el exón 2 de un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 39 es un sitio objetivo de dominio C-terminal variante de LHE I-OnuI en el exón 2 de un gen de PD-1 humano.
SEQ ID NO: 40 es un ARNm que codifica un PD-1 megaTAL.
SEQ ID NO: 41 es un ARNm que codifica un PD-1 megaTAL.
SEQ ID NO: 42 es un ARNm que codifica un PD-1 megaTAL.
SEQ ID NO: 43 es un ARNm que codifica una proteína Trex2 murina.
SEQ ID NO: 44 es una secuencia de polinucleótidos que codifica un vector de direccionamiento de rAAV con brazos de homología de PD-1 y un casete de expresión de pMND-BFP-SV40polyA.
SEQ ID NO: 45 es un polinucleótido que codifica el brazo de homología 5' de la SEQ ID NO: 44.
SEQ ID NO: 46 es un polinucleótido que codifica el brazo de homología 3' de la SEQ ID NO: 44.
SEQ ID NO: 47 es una secuencia de polinucleótidos que codifica un vector dirigido a rAAV con brazos de homología PD-1 y un casete de expresión pMND-BFP-SV40polyA. El 3' contiene un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) relativo a la secuencia genómica de tipo salvaje.
SEQ ID NO: 48 es una secuencia de polinucleótidos que codifica un vector de direccionamiento de rAAV con brazos de homología de PD-1 y un casete de expresión de pMND-BFP-SV40polyA. El 5' contiene un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) relativo a la secuencia genómica de tipo salvaje.
SEQ ID NO: 49 es un polinucleótido que codifica el brazo de homología 5' de la SEQ ID NO: 48.
SEQ ID NO: 50 es un polinucleótido que codifica el brazo de homología 3' de la SEQ ID NO: 47.
SEQ ID NO: 51 es una secuencia de polinucleótidos que codifica un vector de direccionamiento de rAAV con un casete de expresión de pMND-PD-1.receptor de intercambio de CD28.SV40polyA.
SEQ ID NO: 52 es una secuencia de polinucleótidos que codifica un vector de direccionamiento de rAAV con brazos de homología de PD-1 y un casete de expresión de pMND-BFP.SV40polyA con un brazo de homología 5' ~1,3 kb en sentido ascendente del motivo ITSM en el exón 5 de PD-1.
SEQ ID NO: 53 es una secuencia de polinucleótidos que codifica un vector de direccionamiento de rAAV con brazos de homología PD-1 y un casete de expresión de pMND-GFP-SV40polyA.
SEQ ID NO: 54 es un polinucleótido que codifica el brazo de homología 5' de la SEQ ID NO: 53.
SEQ ID NO: 55 es un polinucleótido que codifica el brazo de homología 3' de la SEQ ID NO: 53.
SEQ ID NO: 56 es una secuencia de polinucleótidos que codifica un vector de direccionamiento de rAAV con brazos de homología de PD-1 y un casete de expresión de pMND-anti-CD19 CAR-SV40polyA.
SEQ ID NO: 57 es una secuencia de polinucleótidos que codifica un vector de direccionamiento de rAAV con brazos de homología PD-1 y un casete de expresión de pMND-anti-BCMA CAR-SV40polyA.
SEQ ID NO: 58 es una secuencia de polinucleótidos que codifica un vector de direccionamiento de rAAV con brazos de homología de PD-1 y un ADNc que codifica mCherry.
SEQ ID NO: 60 es una secuencia de aminoácidos de una variante de LHE I-OnuI reprogramada para unirse y escindir un sitio objetivo en el gen de PD-1 humano
SEQ ID NO: 61 es una secuencia de aminoácidos de una variante de LHE I-OnuI reprogramada para unirse y escindir un sitio objetivo en el gen de PD-1 humano
SEQ ID NO: 62 es una secuencia de aminoácidos de una variante de LHE I-OnuI reprogramada para unirse y escindir un sitio objetivo en el gen de PD-1 humano
SEQ ID NO: 63 es una secuencia de aminoácidos de una variante de LHE I-OnuI reprogramada para unirse y escindir un sitio objetivo en el gen de PD-1 humano
SEQ ID NO: 64 es una secuencia de aminoácidos de un megaTAL que se une y escinde un sitio objetivo en un gen de PD-1 humano
SEQ ID NO: 65 es un ARNm que codifica un PD-1 megaTAL
SEQ ID NO: 66 es un ARNm que codifica un PD-1 megaTAL
SEQ ID NO: 67 es un ARNm que codifica un PD-1 megaTAL
SEQ ID NO: 68 es un ARNm que codifica un PD-1 megaTAL
SEQ ID NOS: 69-79 exponen las secuencias de aminoácidos de varios conectores.
SEQ ID NOS: 80-104 exponen las secuencias de aminoácidos de los sitios de escisión de proteasas y los sitios de escisión de polipéptidos de autoescisión.
En las secuencias anteriores, X, si está presente, se refiere a cualquier aminoácido o a la ausencia de un aminoácido.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
A. CONSIDERACIONES GENERALES
La presente divulgación se refiere de manera general, en parte, a composiciones de edición de genoma mejoradas y métodos de uso de las mismas. Sin querer estar limitados por ninguna teoría en particular, las composiciones de edición del genoma contempladas en varias realizaciones pueden usarse para prevenir o tratar un cáncer, una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria y una inmunodeficiencia, o una afección asociada con las mismas, o para mejorar por lo menos un síntoma de las mismas.
Una limitación o problema que molesta a la terapia celular adoptiva existente es la hiporeactividad de las células efectoras inmunitarias debido al agotamiento mediado por el microambiente tumoral. Las células T agotadas tienen una firma molecular única que es marcadamente distinta de las células T vírgenes, efectoras o de memoria. Se definen como células T con expresión de citoquinas y función efectora disminuidas. PD-1 es un marcador de agotamiento de células T; la expresión de PD-1 aumentada está asociada con la proliferación de células T disminuida y la producción reducida de IL-2, TNF y IFN-y.
En realizaciones particulares, las células efectoras inmunitarias editadas en el genoma contempladas en la presente se hacen más resistentes al agotamiento eliminando, disminuyendo o amortiguando la expresión y/o señalización de PD-1.
Las composiciones y métodos de edición del genoma contemplados en varias realizaciones comprenden variantes de nucleasas, diseñadas para unirse y escindir un sitio objetivo en el gen de muerte celular programada 1 (PD-1) humano. Las variantes de nucleasas contempladas en realizaciones particulares pueden usarse para introducir una ruptura de cadena doble en una secuencia de polinucleótidos objetivo, que puede repararse mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) en ausencia de una plantilla de polinucleótidos, por ejemplo, una reparación de plantilla de donante, o por reparación dirigida por homología (HDR), es decir, recombinación homóloga, en presencia de una plantilla de reparación de donante. Las variantes de nucleasas contempladas en ciertas realizaciones también pueden diseñarse como nickasas, que generan roturas de ADN de cadena sencilla que pueden repararse usando la maquinaria de reparación por escisión de base (BER) de la célula o recombinación homóloga en presencia de una plantilla de reparación de donante. El NHEJ es un proceso propenso a errores que con frecuencia da como resultado la formación de pequeñas inserciones y deleciones que alteran la función del gen. La recombinación homóloga requiere ADN homólogo como plantilla para la reparación y puede aprovecharse para crear una variedad ilimitada de modificaciones especificadas por la introducción de ADN donante que contiene la secuencia deseada en el sitio objetivo, flanqueado en cualquier lado por secuencias que tienen homología con las regiones que flanquean el sitio objetivo.
En realizaciones de la invención, las composiciones de edición del genoma contempladas en la presente comprenden una variante de endonucleasa homing o megaTAL que se dirige al gen de PD-1 humano.
En una realización preferida, las composiciones de edición del genoma contempladas en la presente comprenden una variante de endonucleasa homing o megaTAL y una enzima de procesamiento de extremos, por ejemplo, Trex2.
En varias realizaciones, se contemplan células editadas en el genoma. Las células editadas en el genoma comprenden un gen de PD-1 editado, en donde la estrategia de edición está diseñada para disminuir o eliminar la expresión de PD-1 y/o cooptar a PD-1 para que actúe como un negativo dominante al expresar el dominio de unión al ligando extracelular de PD-1 pero alterando su capacidad para transducir señales intracelulares inmunosupresoras.
En varias realizaciones, se genera una rotura de ADN en un sitio objetivo del gen de PD-1 en una célula T, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria, y el NHEJ de los extremos de la secuencia genómica escindida puede dar como resultado una célula con poca o ninguna expresión de PD-1, y preferiblemente una célula T que carece o carece sustancialmente de expresión y/o señalización funcional de PD-1, por ejemplo, carece de la capacidad de aumentar el agotamiento de las células T. Sin querer estar limitados por ninguna teoría en particular, las células T que carecen de expresión funcional de PD-1 son más resistentes a la inmunosupresión y al agotamiento de las células T y, por tanto, son más persistentes y terapéuticamente eficaces.
En varias otras realizaciones, se proporciona una plantilla de donante para la reparación de la secuencia genómica de PD-1 escindida. El gen de PD-1 se repara con la secuencia de la plantilla mediante recombinación homóloga en el sitio de ruptura del ADN. En realizaciones particulares, la plantilla de reparación comprende una secuencia de polinucleótidos que altera, y preferiblemente disminuye sustancialmente o elimina, la expresión de PD-1 funcional.
En realizaciones particulares, el gen de PD-1 se repara con una plantilla que codifica un exodominio de PD-1 con afinidad aumentada por sus ligandos.
En realizaciones particulares, el gen de PD-1 se repara con un polinucleótido que codifica un potenciador de inmunopotencia, amortiguador de señales inmunosupresoras o receptor de antígeno manipulado.
En realizaciones particulares, el gen de PD-1 se repara con un polinucleótido que codifica un potenciador de inmunopotencia, un amortiguador de señales inmunosupresoras o un receptor de antígeno manipulado y se introduce en el gen de PD-1 para cooptar el promotor de PD-1 endógeno para controlar transcripcionalmente la expresión del potenciador de inmunopotencia, amortiguador de señales inmunosupresoras o receptor de antígeno manipulado.
En realizaciones de la invención, las composiciones y los métodos de edición del genoma contemplados en la presente se usan para editar el gen de PD-1 humano.
Por consiguiente, los métodos y composiciones contemplados en la presente representan una mejora considerable en comparación con las terapias celulares adoptivas existentes.
La puesta en práctica de las realizaciones particulares empleará, a menos que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, química orgánica, biología molecular, microbiología, técnicas de ADN recombinante, genética, inmunología y biología celular que estén dentro de la capacidad de la técnica, muchos de los cuales se describen a continuación con propósitos ilustrativos. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Consultar, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a Edición, 2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edición, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, actualizado e julio de 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methodsfrom Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology; así como monografías en revistas comoAdvances in Immunology.
B. DEFINICIONES
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por los expertos en la técnica a la que pertenece la invención.
Aunque en la puesta en práctica o pruebas de las realizaciones particulares puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente, en la presente se describen realizaciones preferidas de composiciones, métodos y materiales. A los efectos de la presente divulgación, a continuació se definen n los siguientes términos.
Los artículos "un", "uno" y "el" se usan en la presente para referirse a uno o más de uno (es decir, por lo menos uno, o uno o más) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o uno o más elementos.
El uso de la alternativa (por ejemplo, "o") debe entenderse como una, ambas o cualquier combinación de las alternativas.
Debe entenderse que el término "y/o" significa o una o ambas alternativas.
Como se usa en la presente, el término "alrededor de" o "aproximadamente" se refiere a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía tanto como un 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia. En una realización, el término "alrededor de" o "aproximadamente" se refiere a un intervalo de cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud ±15%, ±10%, ±9%, ±8%, ±7%, ±6%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2% o ±1% sobre una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.
En una realización, un intervalo, por ejemplo, de 1 a 5, aproximadamente 1 a 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, se refiere a cada valor numérico comprendido en el intervalo. Por ejemplo, en una realización no limitativa y meramente ilustrativa, el intervalo "de 1 a 5" es equivalente a la expresión 1, 2, 3, 4, 5; o 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3.0, 3,5, 4,0, 4,5, o 5,0; o 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3.1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, o 5,0.
Como se usa en la presente, el término "sustancialmente" se refiere a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que es un 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más alta en comparación con una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia. En una realización, "sustancialmente el mismo" se refiere a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que produce un efecto, por ejemplo, un efecto fisiológico, que es aproximadamente el mismo que una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.
A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que las palabras "comprender", "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de un paso o elemento o grupo de pasos o elementos expuestos, pero no la exclusión de cualquier otro paso o elemento o grupo de pasos o elementos. Por "que consiste en" se entiende que incluye, y se limita a, todo lo que sigue a la frase "que consiste en". Por tanto, la frase "que consiste en" indica que se requieren los elementos enumerados o que son obligatorios, y que no puede haber otros elementos presentes. Por "que consiste esencialmente en" se entiende que incluye cualquier elemento enumerado después de la frase, y se limita a otros elementos que no interfieren ni contribuyen a la actividad o acción especificada en la divulgación de los elementos enumerados. Por lo tanto, la frase "que consiste esencialmente en" indica que se requieren los elementos enumerados o que son obligatorios, pero que no hay otros elementos presentes que afecten materialmente a la actividad o acción de los elementos enumerados.
La referencia a lo largo de esta memoria descriptiva a "una realización", "una realización particular", "una realización relacionada", "una cierta realización" o "una realización adicional" o combinaciones de los mismos significa que una característica, estructura o característica particular descrita en relación con la realización se incluye en por lo menos una realización. Por tanto, las apariciones de las frases anteriores en varios lugares a lo largo de esta memoria descriptiva no necesariamente se refieren todas a la misma realización. Además, las características, estructuras o características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones. También se entiende que la recitación positiva de una característica en una realización, sirve como base para excluir la característica en una realización particular.
El término "ex vivo" se refiere de manera general a actividades que tienen lugar fuera de un organismo, como experimentación o mediciones realizadas en o sobre tejido vivo en un entorno artificial fuera del organismo, preferiblemente con la mínima alteración de las condiciones naturales. En realizaciones particulares, los procedimientos "ex vivo" implican células vivas o tejidos tomados de un organismo y cultivados o modulados en un aparato de laboratorio, habitualmente en condiciones estériles, y típicamente durante unas pocas horas o hasta aproximadamente 24 horas, pero que incluyen hasta 48 horas o 72 horas, dependiendo de las circunstancias. En ciertas realizaciones, tales tejidos o células pueden recogerse y congelarse, y luego descongelarse para tratamiento ex vivo. Los experimentos o procedimientos de cultivo de tejidos que duran más de unos pocos días usando células vivas o tejido normalmente se consideran "in vitro", aunque en ciertas realizaciones, este término puede usarse indistintamente con ex vivo.
El término "in vivo" se refiere de manera general a actividades que tienen lugar dentro de un organismo. En una realización, los genomas celulares se manipulan, editan o modifican in vivo.
"Mejorar" o "promover" o "aumentar" o "expandir" o "potenciar" se refiere de manera general a la capacidad de una variante de nucleasa, una composición de edición del genoma o una célula editada en el genoma contemplada en la presente para producir, provocar o causar una mayor respuesta (es decir, respuesta fisiológica) en comparación con la respuesta provocada por el vehículo o el control. Una respuesta medible puede incluir un aumento de la actividad catalítica, la afinidad de unión, la persistencia, la actividad citolítica y/o un aumento de las citoquinas proinflamatorias, entre otras, evidentes a partir de la comprensión de la técnica y la descripción de la presente. Una cantidad "aumentada" o "mejorada" es típicamente una cantidad "estadísticamente significativa" y puede incluir un aumento de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (incluyendo todos los números enteros y puntos decimales entre y por encima de 1, por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) la respuesta producida por el vehículo o el control.
"Disminuir" o "bajar" o "decrecer" o "reducir" o "atenuar" o "extirpar" o "inhibir" o "amortiguar" se refiere de manera general a la capacidad de una variante de nucleasa, composición de edición del genoma o célula editada en el genoma contemplada en la presente para producir, provocar o causar una respuesta menor (es decir, una respuesta fisiológica) en comparación con la respuesta provocada por el vehículo o el control. Una respuesta medible puede incluir una disminución en la afinidad de unión fuera del objetivo, la especificidad de escisión fuera del objetivo, el agotamiento de las células T y similares. Una cantidad "disminuida" o "reducida" es típicamente una cantidad "estadísticamente significativa" y puede incluir una disminución de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) de la respuesta (respuesta de referencia) producida por el vehículo, o control.
"Mantener", o "preservar", o "mantenimiento", o "sin cambio", o "sin cambio sustancial" o "sin disminución sustancial" se refiere de manera general a la capacidad de una variante de nucleasa, composición de edición del genoma o célula editada en el genoma contemplada en la presente para producir, provocar o causar una respuesta fisiológica sustancialmente similar o comparable (es decir, efectos en sentido descendente) en comparación con la respuesta provocada por el vehículo o el control. Una respuesta comparable es aquella que no es significativamente diferente o medible diferente de la respuesta de referencia.
Los términos "afinidad de unión específica" o "se une específicamente" o "unido específicamente" o "unión específica" o "se dirige específicamente" como se usan en la presente, describen la unión de una molécula a otra, por ejemplo, el dominio de unión al ADN de un polipéptido que se une al ADN, con mayor afinidad de unión que la unión de fondo. Un dominio de unión "se une específicamente" a un sitio objetivo si se une o se asocia con un sitio objetivo con una afinidad o Ka (es decir, una constante de asociación de equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de 1/M) de, por ejemplo, mayor que o igual a aproximadamente 105 M-1. En ciertas realizaciones, un dominio de unión se une a un sitio objetivo con una Kamayoro igual a aproximadamente 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1, o 1013 M-1. Los dominios de unión de "alta afinidad" se refieren a aquellos dominios de unión con una Ka de por lo menos 107 M-1, por lo menos 108 M-1, por lo menos 109 M-1, por lo menos 1010 M-1, por lo menos 1011 M-1, por lo menos 1012 M-1, por lo menos 1013 M-1, o más.
Alternativamente, la afinidad puede definirse como una constante de disociación de equilibrio (Kd) de una interacción de unión particular con unidades de M (por ejemplo, de 10-5 M a 10-13 M, o menos). Las afinidades de las variantes de nucleasas que comprenden uno o más dominios de unión a ADN para los sitios objetivo de ADN contemplados en realizaciones particulares pueden determinarse fácilmente usando técnicas convencionales, por ejemplo, presentación en superficie de células de levadura, o mediante asociación de unió, o ensayos de desplazamiento usando ligandos marcados.
En una realización, la afinidad de la unión específica es aproximadamente 2 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 5 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 10 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 20 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 50 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 100 veces mayor que la unión de fondo, o aproximadamente 1000 veces mayor que la unión de fondo o más.
Los términos "se une selectivamente" o "unido selectivamente" o "que se une selectivamente" o "se dirige selectivamente" describen la unión preferencial de una molécula a una molécula objetivo (unión en el objetivo) en presencia de una pluralidad de moléculas fuera del objetivo. En realizaciones particulares, una HE o megaTAL se une selectivamente a un sitio de unión de ADN en el objetivo aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100 o 1000 veces más frecuentemente que lo que se une HE o megaTAL a un sitio de unión de ADN fuera del objetivo.
"En el objetivo" se refiere a una secuencia del sitio objetivo.
Fuera del objetivo se refiere a una secuencia similar pero no idéntica a una secuencia del sitio objetivo.
Un "sitio objetivo" o "secuencia objetivo" es una secuencia de ácido nucleico cromosómica o extracromosómica que define una porción de un ácido nucleico al que se unirá y/o se escindirá una molécula de unión, siempre que existan condiciones suficientes para la unión y/o escisión. Cuando se hace referencia a una secuencia de polinucleótidos o SEQ ID NO. que hace referencia solo a una cadena de un sitio objetivo o secuencia objetivo, se entendería que el sitio objetivo o secuencia objetivo unida y/o escindida por una variante de nucleasa es de cadena doble y comprende la secuencia de referencia y su complemento. En una realización preferida, el sitio objetivo es una secuencia en un gen de PD-1 humano.
"Recombinación" se refiere a un proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos, que incluye, pero no se limita a, la captura de donantes mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la recombinación homóloga. Para los propósitos de esta divulgación, "recombinación homóloga (HR)" se refiere a la forma especializada de dicho intercambio que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas de cadena doble en las células a través de mecanismos de reparación dirigida por homología (HDR). Este proceso requiere homología de secuencia de nucleótidos, usa una molécula "donante" como plantilla para reparar una molécula "objetivo" (es decir, la que experimentó la ruptura de la cadena doble), y se conoce de varias maneras como "conversión de genes no cruzada" o "conversión de genes de tracto corto", porque lleva a la transferencia de información genética del donante al objetivo. Sin desear estar limitados por ninguna teoría en particular, dicha transferencia puede implicar la corrección de malapareamiento del ADN heterodúplex que se forma entre el objetivo roto y el donante, y/o el "apareamiento de cadena dependiente de la síntesis", en la que el donante se usa para volver a sintetizar la información genética que pasará a formar parte del objetivo, y/o procesos relacionados. Tal HR especializada a menudo da como resultado una alteración de la secuencia de la molécula objetivo, de tal manera que parte o la totalidad de la secuencia del polinucleótido donante se incorpora en el polinucleótido objetivo.
"NHEJ" o "unión de extremos no homólogos" se refiere a la resolución de una rotura de cadena doble en ausencia de una plantilla de reparación donante o una secuencia homóloga. La NHEJ puede dar como resultado inserciones y deleciones en el sitio de la rotura. La NHEJ está mediada por varias subvías, cada una de las cuales tiene distintas consecuencias mutacionales. La vía de NHEJ clásica (cNHEJ) requiere el complejo KU/DNA-PKcs/Lig4/XRCC4, liga los extremos junto con un procesamiento mínimo y, a menudo, lleva a una reparación precisa de la ruptura. Las vías de NHEJ alternativas (altNHEJ) también son activas en la resolución de roturas de ADNdc, pero estas vías son considerablemente más mutagénicas y, a menudo, dan como resultado una reparación imprecisa de la rotura marcada por inserciones y deleciones. Aunque no desea estar limitado por ninguna teoría en particular, se contempla que la modificación de roturas de ADNdc por enzimas de procesamiento de extremos como, por ejemplo, exonucleasas, por ejemplo Trex2 puede aumentar la probabilidad de reparación imprecisa.
"Escisión" se refiere a la rotura de la estructura principal covalente de una molécula de ADN. La escisión puede iniciarse mediante una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, hidrólisis enzimática o química de un enlace fosfodiéster. Son posibles tanto la escisión de cadena sencilla como la escisión cadena doble. La escisión de cadena doble puede producirse como resultado de dos eventos distintos de escisión de cadena sencilla. La escisión del ADN puede dar como resultado la producción de extremos romos o extremos escalonados. En ciertas realizaciones, se usan variantes de polipéptidos y nucleasas, por ejemplo, variantes de endonucleasas homing, megaTAL, etc. contempladas en la presente, para la escisión dirigida de ADN de cadena doble. Los sitios de reconocimiento de escisión de endonucleasas pueden estar en cualquiera de las cadenas de ADN.
Una molécula "exógena" es una molécula que normalmente no está presente en una célula, pero que se introduce en una célula mediante uno o más métodos genéticos, bioquímicos o de otro tipo. Las moléculas exógenas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, moléculas orgánicas pequeñas, proteína, ácido nucleico, carbohidrato, lípido, glicoproteína, lipoproteína, polisacárido, cualquier derivado modificado de las moléculas anteriores o cualquier complejo que comprenda una o más de las moléculas anteriores. Los métodos para la introducción de moléculas exógenas en las células son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, transferencia mediada por lípidos (es decir, liposomas, incluyendo lípidos neutros y catiónicos), electroporación, inyección directa, fusión celular, bombardeo de partículas, nanopartículas de biopolímeros, coprecipitación de fosfato de calcio, transferencia mediada por DEAE-dextrano y transferencia mediada por vectores virales.
Una molécula "endógena" es aquella que normalmente está presente en una célula particular en una etapa de desarrollo particular bajo condiciones ambientales particulares. Las moléculas endógenas adicionales pueden incluir proteínas.
Un "gen" se refiere a una región de ADN que codifica un producto génico, así como a todas las regiones de ADN que regulan la producción del producto génico, estén o no tales secuencias reguladoras adyacentes a las secuencias codificantes y/o transcritas. Un gen incluye, pero no se limita a, secuencias promotoras, potenciadores, silenciadores, aislantes, elementos limítrofes, terminadores, secuencias de poliadenilación, elementos de respuesta posteriores a la transcripción, secuencias reguladoras de la traducción, como sitios de unión al ribosoma y sitios de entrada del ribosoma internos, orígenes de replicación, sitios de unión de matriz y regiones de control de locus.
"Expresión génica" se refiere a la conversión de la información, contenida en un gen, en un producto génico. Un producto génico puede ser el producto transcripcional directo de un gen (por ejemplo, ARNm, ARNt, ARNr, ARN antisentido, ribozima, ARN estructural o cualquier otro tipo de ARN) o una proteína producida por la traducción de un ARNm. Los productos génicos también incluyen ARN que se modifican mediante procesos como recubrimiento, poliadenilación, metilación y edición, y proteínas modificadas, por ejemplo, mediante metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, ADP-ribosilación, miristilación y glicosilación.
Como se usa en la presente, el término "manipulado genéticamente" o "modificado genéticamente" se refiere a la adición cromosómica o extracromosómica de material genético adicional en forma de ADN o ARN al material genético total en una célula. Las modificaciones genéticas pueden estar dirigidas o no dirigidas a un sitio particular en el genoma de una célula. En una realización, la modificación genética es específica del sitio. En una realización, la modificación genética no es específica del sitio.
Como se usa en la presente, el término "edición del genoma" se refiere a la sustitución, deleción y/o introducción de material genético en un sitio objetivo en el genoma de la célula, que restaura, corrige, altera y/o modifica la expresión y/o función de un gen o un producto génico. La edición del genoma contemplada en realizaciones particulares comprende la introducción de una o más variantes de nucleasas en una célula para generar lesiones de ADN en o próximo a un sitio objetivo en el genoma de la célula, opcionalmente en presencia de una plantilla de reparación de donante.
Como se usa en la presente, el término "terapia génica" se refiere a la introducción de material genético extra en el material genético total en una célula que restaura, corrige o modifica la expresión de un gen o producto génico, o con el propósito de expresar un polipéptido terapéutico. En realizaciones particulares, la introducción de material genético en el genoma de la célula mediante la edición del genoma que restaura, corrige, altera o modifica la expresión de un gen o producto génico, o con el propósito de expresar un polipéptido terapéutico, se considera terapia génica.
Un "trastorno inmunitario" se refiere a una enfermedad que provoca una respuesta del sistema inmunitario. En realizaciones particulares, el término "trastorno inmunitario" se refiere a un cáncer, una enfermedad de injerto contra huésped, una enfermedad autoinmune o una inmunodeficiencia. En una realización, los trastornos inmunitarios abarcan enfermedades infecciosas.
Como se usa en la presente, el término "cáncer" se refiere de manera general a una clase de enfermedades o afecciones en la que las células anormales se dividen sin control y pueden invadir los tejidos cercanos.
Como se usa en la presente, el término "maligno" se refiere a un cáncer en el que un grupo de células tumorales muestran uno o más de crecimiento descontrolado (es decir, división más allá de los límites normales), invasión (es decir, intrusión y destrucción de tejidos adyacentes) y metástasis (es decir, propagación a otras localizaciones del cuerpo a través de la linfa o la sangre).
Como se usa en la presente, el término "metástasis" se refiere a la propagación del cáncer desde una parte del cuerpo a otra. Un tumor formado por células que se han esparcido se denomina "tumor metastásico" o "metástasis". El tumor metastásico contiene células que son como las del tumor original (primario).
Como se usa en la presente, el término "benigno" o "no maligno" se refiere a tumores que pueden crecer más pero que no se propagan a otras partes del cuerpo. Los tumores benignos son autolimitados y típicamente no invaden ni metastatizan.
Una "célula cancerosa" o "célula tumoral" se refiere a una célula individual de un crecimiento o tejido canceroso. Un tumor se refiere de manera general a una hinchazón o lesión formada por un crecimiento anormal de células, que puede ser benigno, premaligno o maligno. La mayoría de los cánceres forman tumores, pero algunos, por ejemplo, la leucemia, no forman necesariamente tumores. Para aquellos cánceres que forman tumores, los términos (célula) cancerosa y (célula) tumoral se usan indistintamente. La cantidad de un tumor en un individuo es la "carga tumoral" que puede medirse como el número, volumen o peso del tumor.
La "enfermedad de injerto contra huésped" o "GVHD" se refiere a las complicaciones que pueden producirse después de un trasplante de células, tejidos u órganos sólidos. La GVHD puede producirse después de un trasplante de células madre o de médula ósea en el que las células del donante trasplantadas atacan el cuerpo del receptor del trasplante. La GVHD aguda en humanos tiene lugar en el plazo de los 60 días posteriores al trasplante y provoca daños en la piel, el hígado y el intestino por la acción de los linfocitos citolíticos. La GVHD crónica se produce más tarde y es una enfermedad autoinmune sistémica que afecta principalmente la piel, lo que da como resultado la activación policlonal de las células B y la hiperproducción de Ig y autoanticuerpos. La enfermedad de injerto contra huésped de trasplante de órgano sólido (SOT-GVHD) se produce de dos formas. El tipo más común es el mediado por anticuerpos, en donde los anticuerpos de un donante con tipo de sangre O atacan a los glóbulos rojos del receptor en receptores con tipo de sangre A, B o AB, lo que lleva a anemias hemolíticas transitorias leves. La segunda forma de SOT-GVHD es un tipo celular asociado con una alta mortalidad, en donde las células T derivadas del donante producen un ataque inmunológico contra el tejido del huésped inmunológicamente dispar, con mayor frecuencia en la piel, el hígado, el tracto gastrointestinal y la médula ósea, lo que provoca complicaciones en estos órganos.
"Injerto contra leucemia" o "GVL" se refiere a una respuesta inmunitaria a las células leucémicas de una persona por parte de las células inmunitarias presentes en el tejido trasplantado de un donante, como la médula ósea o la sangre periférica.
Una "enfermedad autoinmune" se refiere a una enfermedad en la que el cuerpo produce una respuesta inmunogénica (es decir, el sistema inmunitario) para algún constituyente de su propio tejido. En otras palabras, el sistema inmunitario pierde su capacidad de reconocer algún tejido o sistema dentro del cuerpo como "propio" y lo fija y ataca como si fuera extraño. Los ejemplos ilustrativos de enfermedades autoinmunes incluyen, pero no se limitan a: artritis, enfermedad inflamatoria intestinal, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, lupus, esclerosis múltiple, artritis reumática, anemia hemolítica, tiroiditis antiinmune, lupus eritematoso sistémico, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, colitis, diabetes, esclerodermia, psoriasis y similares.
Una "inmunodeficiencia" significa el estado de un paciente cuyo sistema inmunitario se ha visto comprometido por una enfermedad o por la administración de productos químicos. Esta condición hace que el sistema sea deficiente en la cantidad y el tipo de células sanguíneas necesarias para defenderse de una sustancia extraña. Las condiciones o enfermedades de inmunodeficiencia son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida), SCID (enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave), deficiencia de IgA selectiva, inmunodeficiencia variable común, agammaglobulinemia ligada al X, enfermedad granulomatosa crónica, síndrome de hiper-IgM, síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) y diabetes.
Una "enfermedad infecciosa" se refiere a una enfermedad que puede transmitirse de persona a persona o de organismo a organismo, y está provocada por un agente microbiano o viral (por ejemplo, un resfriado común). Las enfermedades infecciosas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, hepatitis, enfermedades de transmisión sexual (por ejemplo, clamidia, gonorrea), tuberculosis, VIH/SIDA, difteria, hepatitis B, hepatitis C, cólera y gripe.
Como se usa en la presente, los términos "individuo" y "sujeto" a menudo se usan indistintamente y se refieren a cualquier animal que muestre un síntoma de un trastorno inmunitario que pueda tratarse con variantes de nucleasas, composiciones de edición del genoma, vectores de terapia génica, vectores de edición del genoma, células editadas en el genoma y métodos contemplados en otra parte de la presente. Los sujetos adecuados (por ejemplo, pacientes) incluyen animales de laboratorio (como ratones, ratas, conejos o cobayas), animales de granja y animales domésticos o mascotas (como gatos o perros). Se incluyen primates no humanos y, preferiblemente, sujetos humanos. Los sujetos típicos incluyen pacientes humanos que tienen, o se les ha diagnosticado o están en riesgo de tener un trastorno inmunitario.
Como se usa en la presente, el término "paciente" se refiere a un sujeto al que se le ha diagnosticado un trastorno inmunitario que puede tratarse con variantes de nucleasas, composiciones de edición del genoma, vectores de terapia génica, vectores de edición del genoma, células editadas en el genoma y métodos contemplados en otras partes de la presente.
Como se usa en la presente, "tratamiento" o "tratar", incluye cualquier efecto beneficioso o deseable sobre los síntomas o la patología de una enfermedad o condición patológica, y puede incluir incluso reducciones mínimas en uno o más marcadores medibles de la enfermedad o afección que se esté tratando, por ejemplo, cáncer, GVHD, enfermedad infecciosa, enfermedad autoinmune, enfermedad inflamatoria e inmunodeficiencia. El tratamiento puede implicar opcionalmente el retraso de la progresión de la enfermedad o afección. "Tratamiento" no indica necesariamente la erradicación o cura completa de la enfermedad o afección, o los síntomas asociados de la misma.
Como se usa en la presente, "prevenir" y palabras similares como "prevención", "prevenido", "que previene", etc., indican un enfoque para prevenir, inhibir o reducir la probabilidad de aparición o recurrencia de una enfermedad o afección, por ejemplo, cáncer, GVHD, enfermedad infecciosa, enfermedad autoinmune, enfermedad inflamatoria e inmunodeficiencia. También se refiere a retrasar la aparición o recurrencia de una enfermedad o afección o retrasar la aparición o recurrencia de los síntomas de una enfermedad o afección. Como se usa en la presente, "prevención" y palabras similares también incluyen reducir la intensidad, el efecto, los síntomas y/o la carga de una enfermedad o afección antes del inicio o recurrencia de la enfermedad o afección.
Como se usa en la presente, la frase "mejorar por lo menos un síntoma de" se refiere a disminuir uno o más síntomas de la enfermedad o afección por la que se está tratando al sujeto, por ejemplo, cáncer, GVHD, enfermedad infecciosa, enfermedad autoinmune, enfermedad inflamatoria e inmunodeficiencia. En realizaciones particulares, la enfermedad o afección que se está tratando es un cáncer, en donde el uno o más síntomas mejorados incluyen, pero no se limitan a, debilidad, fatiga, dificultad para respirar, fácil de hematomas y sangrado, infecciones frecuentes, ganglios linfáticos agrandados, abdomen distendido o doloroso (debido a órganos abdominales agrandados), dolor de huesos o articulaciones, fracturas, pérdida de peso no planificada, falta de apetito, sudores nocturnos, fiebre leve persistente y disminución de la orina (debido a una función renal alterada).
Como se usa en la presente, el término "cantidad" se refiere a "una cantidad eficaz" de una variante de nucleasas, una composición de edición del genoma o una célula editada en el genoma suficiente para lograr un resultado profiláctico o terapéutico beneficioso o deseado, incluyendo resultados clínicos.
Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad de una variante de nucleasas, una composición de edición del genoma o una célula editada en el genoma suficiente para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, pero no necesariamente, como se usa una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz es menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una variante de nucleasas, una composición de edición del genoma o una célula editada en el genoma puede variar de acuerdo con factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial se ve compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" incluye una cantidad que es eficaz para "tratar" a un sujeto (por ejemplo, un paciente). Cuando se indica una cantidad terapéutica, un médico puede determinar la cantidad precisa de las composiciones contempladas en realizaciones particulares, a administrar, en vista de la memoria descriptiva y teniendo en cuenta las diferencias individuales en edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la infección o metástasis, y condición del paciente (sujeto).
C. VARIANTES DE NUCLEASAS
Las variantes de nucleasas contempladas en realizaciones particulares en la presente son adecuadas para la edición del genoma en un sitio objetivo en el gen de PD-1 y comprenden uno o más dominios de unión a ADN y uno 0 más dominios de escisión de ADN (por ejemplo, uno o más dominios de endonucleasas y/o exonucleasas), y opcionalmente, uno o más conectores contemplados en la presente. Los términos "nucleasa reprogramada", "nucleasa manipulada" o "variante de nucleasa" se usan indistintamente y se refieren a una nucleasa que comprende uno o más dominios de unión a ADN y uno o más dominios de escisión de ADN, en donde la nucleasa ha sido diseñada y/o modificada a partir de una nucleasa original o de origen natural, para unir y escindir una secuencia objetivo de a Dn de cadena doble en un gen de PD-1.
En realizaciones particulares, una variante de nucleasa se une y escinde una secuencia objetivo en el exón 5 de un gen de PD-1, preferiblemente en la SEQ ID NO: 25 en el exón 5 de un gen de PD-1, y más preferiblemente en la secuencia "ATAC" en la SEQ ID NO: 25 en el exón 5 de un gen de PD-1.
En realizaciones particulares, una variante de nucleasa se une y escinde una secuencia objetivo en el exón 1 de un gen de PD-1, preferiblemente en la SEQ ID NO: 30 en el exón 1 de un gen de PD-1, y más preferiblemente en la secuencia "ATCC" en la SEQ ID NO: 30 en el exón 1 de un gen de PD-1.
En realizaciones particulares, una variante de nucleasa se une y escinde una secuencia objetivo en el exón 2 de un gen de PD-1, preferiblemente en la SEQ ID NO: 35 en el exón 2 de un gen de PD-1, y más preferiblemente en la secuencia "ACTT" en la SEQ ID NO: 35 en el exón 2 de un gen de PD-1.
La variante de nucleasa puede diseñarse y/o modificarse a partir de una nucleasa de origen natural o de una variante de nucleasa anterior. Las variantes de nucleasas contempladas en realizaciones particulares pueden comprender además uno o más dominios funcionales adicionales, por ejemplo, un dominio enzimático de procesamiento de extremos de una enzima de procesamiento de extremos que muestra actividad de exonucleasa 5'-3', exonucleasa alcalina 5'-3', exonucleasa alcalina, exonucleasa 3'-5' (por ejemplo, Trex2), endonucleasa de aleta 5', helicasa, polimerasas de ADN dependientes de plantilla o de polimerasa de ADN independiente de plantilla.
Los ejemplos ilustrativos de variantes de nucleasas que se unen y escinden una secuencia objetivo en el gen de PD-1 incluyen, pero no se limitan a, variantes de endonucleasas homing (meganucleasas) y megaTAL.
1. VARIANTES DE ENDONUCLEASAS HOMING (MEGANUCLEASAS)
En varias realizaciones, una endonucleasa homing o meganucleasa se reprograma para introducir una ruptura de cadena doble (DSB) en un sitio objetivo en un gen de PD-1. En realizaciones particulares, una variante de endonucleasa homing introduce una rotura de cadena doble en el exón 5 de un gen de PD-1, preferiblemente en la SEQ ID NO: 25 en el exón 5 de un gen de PD-1, y más preferiblemente en la secuencia "ATAC" en la SEQ ID NO: 25 en el exón 5 de un gen de PD-1. En realizaciones particulares, una variante de endonucleasa homing introduce una rotura de cadena doble en el exón 1 de un gen de PD-1, preferiblemente en la SEQ ID NO: 30 en el exón 1 de un gen de PD-1, y más preferiblemente en la secuencia "ATCC" en la SEQ ID NO: 30 en el exón 1 de un gen de PD-1. En realizaciones particulares, una variante de endonucleasa homing introduce una ruptura de cadena doble en el exón 2 de un gen de PD-1, preferiblemente en la SEQ ID NO: 35 en el exón 2 de un gen de PD-1, y más preferiblemente en la secuencia "ACTT" en la SEQ ID NO: 35 en el exón 2 de un gen de PD-1.
"Endonucleasa homing" y "meganucleasa" se usan indistintamente y se refieren a endonucleasas homing de origen natural que reconocen sitios de escisión de 12 a 45 pares de bases y se agrupan comúnmente en cinco familias sobre la base de los motivos de secuencia y estructura: lAg LIDADG, GIY-YIG, HNH, caja His-Cys y PD-(D/E)XK.
Una "endonucleasa homing de referencia" o "meganucleasa de referencia" se refiere a una endonucleasa homing de tipo salvaje o una endonucleasa homing que se encuentra en la naturaleza. En una realización, una "endonucleasa homing de referencia" se refiere a una endonucleasa homing de tipo salvaje que se ha modificado para aumentar la actividad basal.
Una "endonucleasa homing manipulada", "endonucleasa homing reprogramada", "variante de endonucleasa homing", "meganucleasa manipulada", "meganucleasa reprogramada" o "variante de meganucleasa" se refiere a una endonucleasa homing que comprende uno o más dominios de unión al ADN y uno o más dominios de escisión de ADN, en donde la endonucleasa homing se ha diseñado y/o modificado a partir de una endonucleasa homing original o de origen natural, para unir y escindir una secuencia objetivo de ADN en un gen de PD-1. La variante de endonucleasa homing puede diseñarse y/o modificarse a partir de una endonucleasa homing de origen natural o a partir de otra variante de endonucleasa homing. Las variantes de endonucleasas homing contempladas en realizaciones particulares pueden comprender además uno o más dominios funcionales adicionales, por ejemplo, un dominio enzimático de procesamiento de extremos de una enzima de procesamiento de extremos que muestra actividad de exonucleasa 5'-3', exonucleasa alcalina 5'-3', exonucleasa 3'-5' (por ejemplo, Trex2), endonucleasa de aleta 5', helicasa, ADN polimerasa dependiente de plantilla o de ADN polimerasa independiente de plantilla.
Las variantes de endonucleasas homing (HE) no existen en la naturaleza y pueden obtenerse mediante tecnología de ADN recombinante o mediante mutagénesis aleatoria. Las variantes de HE pueden obtenerse realizando una o más alteraciones de aminoácidos, por ejemplo, mutando, sustituyendo, añadiendo o eliminando uno o más aminoácidos, en una HE de origen natural o variante de HE. En realizaciones particulares, una variante de HE comprende una o más alteraciones de aminoácidos en la interfaz de reconocimiento de ADN.
Las variantes de HE contempladas en realizaciones particulares pueden comprender además uno o más conectores y/o dominios funcionales adicionales, por ejemplo, un dominio enzimático de procesamiento de extremos de una enzima de procesamiento de extremos que muestra actividad de exonucleasa 5'-3', exonucleasa alcalina 5'-3', exonucleasa 3'-5' (por ejemplo, Trex2), endonucleasa de aleta 5', helicasa, ADN polimerasa dependiente de plantilla o de ADN polimerasa independiente de plantilla. En realizaciones particulares, las variantes de HE se introducen en una célula T con una enzima de procesamiento de extremos que muestra actividad de exonucleasa 5'-3', exonucleasa alcalina 5'-3', exonucleasa 3'-5' (por ejemplo, Trex2), endonucleasa de aleta 5', helicasa, ADN polimerasa dependiente de plantilla o de ADN polimerasa independiente de plantilla. La variante de HE y la enzima de procesamiento 3' pueden introducirse por separado, por ejemplo, en diferentes vectores o ARNm separados, o juntas, por ejemplo, como una proteína de fusión, o en un constructo policistrónico separado por un péptido de autoescisión viral o un elemento IRES.
Una "interfaz de reconocimiento de ADN" se refiere a los residuos de aminoácidos de HE que interactúan con las bases objetivo de los ácidos nucleicos, así como a aquellos residuos que son adyacentes. Para cada HE, la interfaz de reconocimiento de ADN comprende una red extensa de contactos de cadena lateral a cadena lateral y de cadena lateral a ADN, la mayoría de los cuales son necesariamente únicos para reconocer una secuencia objetivo de ácido nucleico particular. Por tanto, la secuencia de aminoácidos de la interfaz de reconocimiento de ADN correspondiente a una secuencia de ácido nucleico particular varía significativamente y es una característica de cualquier variante natural o HE. A modo de ejemplo no limitativo, una variante de HE contemplada en realizaciones particulares puede derivarse mediante la construcción de bibliotecas de variantes de HE en las que se varían uno o más residuos de aminoácidos localizados en la interfaz de reconocimiento de ADN de la HE natural (o una variante de HE generada con anterioridad). Las bibliotecas pueden seleccionarse para determinar la actividad de escisión del objetivo frente a cada sitio objetivo de PD-1 previsto usando ensayos de escisión (consultar, por ejemplo, Jarjour et al., 2009. Nuc. Ácidos Res. 37(20): 6871-6880).
Las endonucleasas homing LAGLIDADG (LHE) son la familia de endonucleasas homing más estudiada, se codifican principalmente en arqueas y en ADN de organelos en algas verdes y hongos, y muestran la especificidad de reconocimiento de ADN general más alta. Las LHE comprenden uno o dos motivos catalíticos LAGLIDADG por cadena de proteína y funcionan como homodímeros o monómeros de cadena sencilla, respectivamente. Los estudios estructurales de las proteínas LAGLIDADG identificaron una estructura central altamente conservada (Stoddard 2005), caracterizada por un pliegue appappa, con el motivo LAGLIDADG perteneciente a la primera hélice de este pliegue. La escisión altamente eficiente y específica de LHE representa un andamiaje de proteínas para derivar endonucleasas novedosas y altamente específicas. Sin embargo, la ingeniería de LHE para unir y escindir un sitio objetivo no natural o no canónico requiere la selección del andamiaje de la LHE apropiado, el examen del locus objetivo, la selección de sitios objetivo putativos y la alteración extensiva de la LHE para alterar sus puntos de contacto con el ADN y la especificidad de escisión, hasta en dos tercios de las posiciones de los pares de bases en un sitio objetivo.
En una realización, las LHE a partir de los cuales pueden diseñarse las LHE reprogramadas o variantes de LHE incluyen, pero no se limitan a, I-Crel e I-Scel.
Los ejemplos ilustrativos de LHE a partir de las cuales pueden diseñarse LHE reprogramadas o variantes de LHE incluyen, pero no se limitan a, I-AabMI, I-AaeMI, I-Anil, I-ApaMI, I-CapIII, I-CapIV, I-CkaMI, I-CpaMI, I-CpaMII, I-CpaMIII, 1-CpaMIV, I-CpaMV, I-CpaV, I-CraMI, I-EjeMI, I-GpeMI, I-Gpil, I-GzeMI, I-GzeMII, I-GzeMIII, 1-HjeMI, I-LtrII, I-LtrI, I-LtrWI, I-MpeMI, I-MveMI, I-NcrII, I-Ncrl, 1-NcrMI, I-OheMI, I-OnuI, I-OsoMI, I-OsoMII, I-OsoMIII, I-OsoMIV, I-PanMI, I-PanMII, I-PanMIII, 1-PnoMI, 1-ScuMI, I-SmaMI, 1-SscMI, y I-Vdi141I.
En una realización, la LHE reprogramada o variante de LHE se selecciona del grupo que consiste en: una variante I-CpaMI, una variante I-HjeMI, una variante I-OnuI, una variante I-PanMI y una variante I-SmaMI.
En realizaciones de la invención, la LHE reprogramada o la variante de LHE es una variante I-OnuI. Consultar, por ejemplo, 60-63.
En una realización, las LHE I-OnuI reprogramadas o las variantes de I-OnuI dirigidas al gen de PD-1 se generaron a partir de un I-OnuI natural o un fragmento biológicamente activo del mismo (SEQ ID NO: 4). En una realización preferida, las LHE I-OnuI reprogramadas o las variantes de I-OnuI dirigidas al gen de PD-1 humano se generaron a partir de una variante de I-OnuI existente. En una realización, las LHE I-OnuI reprogramadas se generaron frente a un sitio objetivo del gen de PD-1 humano expuesto en la SEQ ID NO: 25. En una realización, las LHE I-OnuI reprogramadas se generaron frente a un conjunto de sitios objetivo del gen de PD-1 humano expuestos en la SEQ ID NO: 30. En una realización, se generaron LHE I-OnuI reprogramadas frente a un sitio objetivo del gen de PD-1 humano expuesto en la SEQ ID NO: 35.
En una realización particular, la LHE I-OnuI reprogramada o variante de I-OnuI que se une y escinde un gen de PD-1 humano comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la interfaz de reconocimiento de ADN. En realizaciones particulares, la LHE I-OnuI que se une y escinde un gen de PD-1 humano comprende por lo menos el 70%, por lo menos el 71%, por lo menos el 72%, por lo menos el 73%, por lo menos el 74%, por lo menos el 75%, por lo menos el 76%, por lo menos el 77%, por lo menos el 78%, por lo menos el 79%, por lo menos el 80%, por lo menos el 81%, por lo menos el 82%, por lo menos el 83%, por lo menos el 84%, por lo menos el 85%, por lo menos el 86%, por lo menos el 87%, por lo menos el 88%, por lo menos el 89%, por lo menos el 90%, por lo menos el 91%, por lo menos el 92%, por lo menos el 93%, por lo menos el 94%, por lo menos el 95%, por lo menos el 96%, por lo menos el 97%, por lo menos el 98% o por lo menos el 99% de identidad de secuencia con la interfaz de reconocimiento de ADN de I-OnuI (Taekuchi et al. 2011. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 9 de agosto de 2011; 108(32): 13077-13082) o una variante de LHE I-OnuI como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, fragmentos biológicamente activos de la misma y/o variantes adicionales de la misma.
En una realización, la LHE I-OnuI que se une y escinde un gen de PD-1 humano comprende por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos el 97%, más preferiblemente por lo menos el 99% de identidad de secuencia con la interfaz de reconocimiento de ADN de I-OnuI (Taekuchi et al. 2011. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 9 de agosto de 2011; 108(32): 13077- 13082) o una variante de LHE I-OnuI como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, fragmentos biológicamente activos de la misma y/o variantes adicionales de la misma.
En una realización particular, una variante de LHE I-OnuI que se une y escinde un gen de PD-1 humano comprende una o más sustituciones o modificaciones de aminoácidos en la interfaz de reconocimiento de ADN de un I-OnuI como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 4 y 60-63, fragmentos biológicamente activos de las mismas y/o variantes adicionales de las mismas.
En una realización particular, una variante de LHE I-OnuI que se une y escinde un gen de PD-1 humano comprende una o más sustituciones o modificaciones de aminoácidos en la interfaz de reconocimiento de ADN, particularmente en los submotivos situados desde las posiciones 24-50, 68 a 82, 180 a 203 y 223 a 240 de I-OnuI (SEQ ID NO: 4) o una variante de I-OnuI como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, fragmentos biológicamente activos de la misma, y/o otras variantes de la misma.
En una realización particular, una LHE I-OnuI que se une y escinde un gen de PD-1 humano comprende una o más sustituciones o modificaciones de aminoácidos en la interfaz de reconocimiento de ADN en las posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: 19, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 68, 70, 72, 75, 7677, 78, 80, 82, 168, 180, 182, 184186188189190191 192193195197199201 203223225227 229231 232234236238 y 240 de I-OnuI (SEQ ID NO: 4) o una variante de I-OnuI como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, fragmentos biológicamente activos de la misma y/o variantes adicionales de la misma.
En una realización particular, una variante de LHE I-OnuI que se une y escinde un gen de PD-1 humano comprende 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 o más sustituciones o modificaciones de aminoácidos en la interfaz de reconocimiento de ADN, particularmente en los submotivos situados desde las posiciones 24-50, 68 a 82, 180 a 203 y 223 a 240 de I-OnuI (s Eq ID NO: 4) o una variante de I-OnuI como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 60­ 63, fragmentos biológicamente activos de la misma y/o variantes adicionales de la misma.
En una realización particular, una variante de LHE I-OnuI que se une y escinde un gen de PD-1 humano comprende 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 o más sustituciones o modificaciones de aminoácidos en la interfaz de reconocimiento de ADN en las posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: 19, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 59, 68, 70, 72, 75, 7677, 78, 80, 82, 168, 180, 182, 184, 186, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 223, 225, 227, 229, 231, 232, 234, 236, 238 y 240 de I-OnuI (SEQ ID NO: 4) o una variante de I-OnuI como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, fragmentos biológicamente activos de la misma, y/o variantes adicionales de la misma.
En una realización, una variante de LHE de I-OnuI que se une y escinde un gen de PD-1 humano comprende una o más sustituciones o modificaciones de aminoácidos en posiciones adicionales situadas en cualquier lugar dentro de la secuencia completa de I-OnuI. Los residuos que pueden sustituirse y/o modificarse incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos que contactan con el objetivo de ácido nucleico o que interactúan con la estructura principal del ácido nucleico o con las bases de nucleótidos, directamente o a través de una molécula de agua. En un ejemplo no limitativo, una variante de LHE I-OnuI contemplada en la presente que se une y escinde un gen de PD-1 humano comprende una o más sustituciones y/o modificaciones, preferiblemente por lo menos 5, preferiblemente por lo menos 10, preferiblemente por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 20, más preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 30, incluso más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más sustituciones de aminoácidos en por lo menos una posición seleccionada del grupo de posiciones que consiste en las posiciones 26, 28, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 59, 68, 70, 72, 75, 76, 78, 80, 138, 143, 159, 168, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 197, 199, 201, 203, 207, 223, 224, 225, 227, 229, 232, 236, y 238 de I-OnuI (SEQ ID NO: 4) o una variante de I-OnuI como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, fragmentos biológicamente activos de la misma, y/o variantes adicionales de la misma.
En ciertas realizaciones, la variante de HE escinde un sitio objetivo del exón 5 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35 o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: L26Q, R28E, N32V, K34P, S35N, S36I, V37P, G38R, S40K, S40R, E42R, G44R, Q46E, T48D, N59D, V68K, A70Y, S72Q, S72R, N75S, A76Y, S78K, K80R, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180H, F182G, N184I, I186A, S188R, K189R, S190P, K191A, L192S, G193P, Q197R, V199R, S201A, S201M, T203G, K207R, Y223R, I224T, K225R, K229I, F232K, D236E y V238E de I-OnuI (SEQ ID NO: 4).
En algunas realizaciones, la variante de HE escinde un sitio objetivo del exón 5 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35 o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: L26Q, R28E, N32V, K34P, S35N, S36I, V37P, G38R, S40K, E42R, G44R, Q46E, T48D, V68K, A70Y, S72Q, N75S, A76Y, S78K, K80R, L138M, T143N, S159P, F168L, C180H, F182G, N184I, I186A, S188R, K189R, S190P, K191A, L192S, G193P, Q197R, V199R, S201A, T203G, K207R, Y223R, K225R, K229I, F232K, D236E, y V238E de I-OnuI (SEQ ID NO: 4)
En realizaciones particulares, la variante de HE escinde un sitio objetivo del exón 5 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: L26Q, R28E, N32V, K34P, S35N, S36I, V37P, G38R, S40R, E42R, G44R, Q46E, T48D, N59D, V68K, A70Y, S72R, N75S, A76Y, K80R, L138M, T143N, S159P, F168L, C180H, F182G, N184I, I186A, S188R, K189R, S190P, K191A, L192S, G193P, Q197R, V199R, S201A, T203G, K207R, Y223R, I224T, K225R, K229I, F232K, D236E y V238E de I-OnuI (SEQ ID NO: 4).
En realizaciones adicionales, la variante de HE escinde un sitio objetivo del exón 5 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35 o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: L26Q, R28E, N32V, K34P, S35N, S36I, V37P, G38R, S40R, E42R, G44R, Q46E, T48D, N59D, V68K, A70Y, S72Q, N75S, A76Y, K80R, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180H, F182G, N184I, I186A, S188R, K189R, S190P, K191A, L192S, G193P, Q197R, V199R, S201A, T203G, K207R, Y223R, I224T, K225R, K229I, F232K, D236E y V238E de I- OnuI (SEQ ID NO: 4).
En realizaciones adicionales, la variante de HE escinde un sitio objetivo del exón 5 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: L26Q, R28E, N32V, K34P, S35N, S36I, V37P, G38R, S40R, E42R, G44R, Q46E, T48D, N59D, V68K, A70Y, S72Q, N75S, A76Y, K80R, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180H, F182G, N184I, I186A, S188R, K189R, S190P, K191A, L192S, G193P, Q197R, V199R, S201A, T203G, K207R, Y223R, K225R, F232K, D236E, y V238E de I-OnuI (SEQ ID NO: 4).
En realizaciones particulares, la variante de HE escinde un sitio objetivo del exón 5 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: L26Q, R28E, N32V, K34P, S35N, S36I, V37P, G38R, S40R, E42R, G44R, Q46E, T48D, N59D, V68K, A70Y, S72Q, N75S, A76Y, K80R, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180H, F182G, N184I, I186A, S188R, K189R, S190P, K191A, L192S, G193P, Q197R, V199R, S201M, T203G, Y223R, K225R, F232K, D236E y V238E de I-OnuI (SEQ ID NO: 4).
En realizaciones particulares, la variante de HE escinde un sitio objetivo del exón 1 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más sustituciones de aminoácidos en por lo menos una posición seleccionada del grupo de posiciones que consiste en las posiciones: 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 68, 70, 72, 75, 76232, 236, 238 y 240 de I-OnuI (s Eq ID NO: 4) o una variante de I-OnuI como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, fragmentos biológicamente activos de la misma y/o variantes adicionales de la misma.
En algunas realizaciones, la variante de HE escinde un sitio objetivo del exón 1 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35 o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46A, Q46T, T48V, V68I, A70T, S72D, N75R, A76Y, S78R, K80R, K80C, I100V, V132A, L138M, T143N, S155G, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R y T240E de I-OnuI (SEQ ID NO: 4) o una variante de I-OnuI como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, fragmentos biológicamente activos de la misma y/o variantes adicionales de la misma.
En realizaciones adicionales, la variante de HE escinde un sitio objetivo del exón 1 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46A, T48V, V68I, A70T, S72D, N75R, A76Y, S78R, K80R, I100V, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R, y T240E de I-OnuI (SEQ ID NO: 4) o una variante de I-OnuI como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, fragmentos biológicamente activos de la misma y/o variantes adicionales de la misma.
En ciertas realizaciones, la variante de HE escinde un sitio objetivo del exón 1 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35 o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48V, V68I, A70T, S72D, N75R, A76Y, S78R, K80C, I100V, V132A, L138M, T143N, S155G, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R y T240E de I- OnuI (SEQ ID NO: 4) o una variante de I-OnuI como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, fragmentos biológicamente activos de la misma y/o variantes adicionales de la misma.
En ciertas realizaciones, la variante de HE escinde un sitio objetivo del exón 1 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35 o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48M, V68I, A70T, S72N, N75H, A76Y, S78T, K80R, I100V, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R, y T240E de I-OnuI (SEQ ID NO: 4) o una variante de I-OnuI como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, fragmentos biológicamente activos de la misma y/o variantes adicionales de la misma.
En ciertas realizaciones, la variante de HE escinde un sitio objetivo del exón 1 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35 o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48M, V68S, A70L, S72N, N75H, A76Y, K80V, T82Y, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R y T240E de I-OnuI (SEQ ID NO: 4) o una variante de I-OnuI como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, fragmentos biológicamente activos de la misma y/o variantes adicionales de la misma.
En ciertas realizaciones, la variante de HE escinde un sitio objetivo del exón 1 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35 o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37G, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48M, V68S, A70T, S72N, N75H, A76Y, K80V, T82Y, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R y T240E de I-OnuI (SEQ ID NO: 4) o una variante de I-OnuI como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, fragmentos biológicamente activos de la misma y/o variantes adicionales de la misma.
En ciertas realizaciones, la variante de HE escinde un sitio objetivo del exón 1 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35 o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48M, V68S, A70Y, S72N, N75H, A76Y, K80E, T82F, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R y T240E de I-OnuI (SEQ ID NO: 4) o una variante de I-OnuI como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, fragmentos biológicamente activos de la misma y/o variantes adicionales de la misma.
En realizaciones particulares, la variante de HE escinde un sitio objetivo del exón 2 de PD-1 y comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más sustituciones de aminoácidos en por lo menos una posición seleccionada del grupo de posiciones que consiste en las posiciones: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 44, 46, 48, 68, 70, 72, 74, 75, 76, 78, 80, 82, 116, 138, 143, 159, 168, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 195, 199, 203, 207, 225, 227, 229, 232, 236 y 238 de I-OnuI (SEQ ID NO: 4).
En realizaciones adicionales, la variante de HE comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: S24C, L26Q, R28Y, R28H, R30S, N32V, N32L, K34N, K34R, S35N, S35T, S36R, V37S, V37T, G38R, G38K, S40R, T41A, E42R, G44S, G44R, Q46E, Q46A, T48E, V68I, A70N, S72I, D74N, N75T, N75R, A76S, A76R, S78R, K80S, T82G, T82R, V116L, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180N, F182Y, N184H, I186K, K189G, S190R, K191T, L192T, G193R, Q195Y, V199R, T203A, T203S, K207R, K225N, K225T, K227W, K227S, K229A, K229P, F232R, W234A, W234D, D236E, y V238R de I-OnuI (SEQ ID NO: 4).
En realizaciones particulares, la variante de HE comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35, o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: L26Q, R28Y, R30S, N32V, K34N, S35N, S36R, V37S, G38R, S40R, T41A, E42R, G44R, Q46A, T48E, A70N, S72I, N75T, A76S, S78R, K80S, T82G, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180N, F182Y, N184H, I186K, K189G, S190R, K191T, L192T, G193R, Q195Y, V199R, T203A, K207R, K225N, K227W, K229A, F232R, W234A, D236E y V238R de I-OnuI (SEQ ID NO: 4).
En algunas realizaciones, la variante de HE comprende por lo menos 5, por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 35 o incluso más preferiblemente por lo menos 40 o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: S24C, R28H, N32L, K34R, S35T, V37T, G38K, S40R, E42R, G44S, Q46E, T48E, V68I, A70N, S72I, D74N, N75R, A76R, S78R, K80S, T82R, V116L, L138M, T143N, S159P, F168L, E178D, C180N, F182Y, N184H, I186K, K189G, S190R, K191T, L192T, G193R, Q195Y, V199R, T203S, K207R, K225T, K227S, K229P, F232R, W234D, D236E y V238R de I-OnuI (SEQ ID NO: 4).
En realizaciones de la invención, una variante de LHE I-OnuI que se une y escinde un gen de PD-1 humano comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 60 -63, o un fragmento biológicamente activo del mismo.
En realizaciones particulares, una variante de LHE I-OnuI comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones particulares, una variante de LHE I-OnuI comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 60, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones particulares, una variante de LHE I-OnuI comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones particulares, una variante de LHE I-OnuI comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 62, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En realizaciones particulares, una variante de LHE I-OnuI comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 63, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
2. MECATALs
En varias realizaciones, se reprograma un megaTAL que comprende una variante de endonucleasa homing para introducir una ruptura de cadena doble (DSB) en un sitio objetivo en un gen de PD-1. En realizaciones particulares, un megaTAL introduce un DSB en el exón 5 de un gen de PD-1, preferiblemente en la SEQ ID NO: 27 en el exón 5 de un gen de PD-1, y más preferiblemente en la secuencia "ATAC" en la SEQ ID NO: 27 en el exón 5 de un gen de PD-1. En realizaciones particulares, un megaTAL introduce una rotura de cadena doble en el exón 1 de un gen de PD-1, preferiblemente en la SEQ ID NO: 32 en el exón 1 de un gen de PD-1, y más preferiblemente en la secuencia "ATCC" en la SEQ ID NO: 32 en el exón 1 de un gen de PD-1. En realizaciones particulares, un megaTAL introduce una ruptura de cadena doble en el exón 2 de un gen de PD-1, preferiblemente en la SEQ ID NO: 37 en el exón 2 de un gen de PD-1, y más preferiblemente en la secuencia "ACTT" en la SEQ ID NO: 37 en el exón 2 de un gen de PD-1.
Un "megaTAL" se refiere a un polipéptido que comprende un dominio de unión a ADN de TALE y una variante de endonucleasa homing que se une y escinde una secuencia objetivo de ADN en un gen de PD-1, y opcionalmente comprende uno o más conectores y/o dominios funcionales adicionales, por ejemplo, un dominio enzimático de procesamiento de extremos de una enzima de procesamiento de extremos que muestra actividad de exonucleasa 5'-3', exonucleasa alcalina 5'-3', exonucleasa 3'-5' (por ejemplo, Trex2), endonucleasa de aleta 5', helicasa o ADN polimerasa independiente de la plantilla.
En realizaciones particulares, puede introducirse un megaTAL en una célula junto con una enzima de procesamiento de extremos que muestra actividad de exonucleasa 5'-3', exonucleasa alcalina 5'-3', exonucleasa 3'-5' (por ejemplo, Trex2), endonucleasa de aleta 5', helicasa, ADN polimerasa dependiente de plantilla o ADN polimerasa independiente de plantilla. La megaTAL y la enzima de procesamiento 3' pueden introducirse por separado, por ejemplo, en diferentes vectores o ARNm separados, o juntos, por ejemplo, como una proteína de fusión, o en un constructo policistrónico separado por un péptido de autoescisión viral o un elemento IRES.
Un "dominio de unión al ADN de TALE" es la porción de unión al ADN de los efectores de tipo activador de la transcripción (efectores TALE o TAL), que imita a los activadores transcripcionales de las plantas para manipular el transcriptoma de la planta (ver, por ejemplo, Kay et al., 2007. Science 318: 648-651). Los dominios de unión a ADN de TALE contemplados en realizaciones particulares se manipulan de novo o a partir de TALE de origen natural, por ejemplo, AvrBs3 de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xanthomonas gardneri, Xanthomonas translucens, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas perforans, Xanthomonas alfalfa, Xanthomonas citri, Xanthomonas euvesicatoria y Xanthomonas oryzae y brg11 y hpx17 de Ralstonia solanacearum. Los ejemplos ilustrativos de proteínas de TALE para derivar y diseñar dominios de unión a ADN se divulgan en la Patente de Estados Unidos N° 9.017.967.
En realizaciones particulares, un megaTAL comprende un dominio de unión a ADN de TALE que comprende una o más unidades de repetición que están implicadas en la unión del dominio de unión a ADN de TALE a su secuencia de ADN objetivo correspondiente. Una única "unidad de repetición" (también conocida como "repetición") tiene típicamente una longitud de 33-35 aminoácidos. Cada unidad de repetición del dominio de unión al ADN de TALE incluye 1 o 2 residuos de unión al ADN que componente el diresiduo variable de repetición (RVD), típicamente en las posiciones 12 y/o 13 de la repetición. El código natural (canónico) para el reconocimiento de ADN de estos dominios de unión de a Dn de TALE se ha determinado de tal manera que una secuencia HD en las posiciones 12 y 13 lleva a una unión a citosina (C), NG se une a T, NI a A, NN se une a G o A, y NG se une a T. En ciertas realizaciones, se contemplan RVD no canónicos (atípicos).
Los ejemplos ilustrativos de RVD no canónicos adecuados para su uso en megaTAL particulares contemplados en realizaciones particulares incluyen, pero no se limitan a, HH, KH, NH, NK, NQ, RH, RN, SS, NN, SN, KN para el reconocimiento de guanina (G); NI, KI, RI, HI, SI para reconocimiento de adenina (A); NG, HG, KG, RG para reconocimiento de timina (T); RD, SD, HD, ND, KD, y G para reconocimiento de citosina (C); NV, HN para el reconocimiento de A o G; y H*, hA, KA, N*, NA, NC, NS, RA, S* para el reconocimiento de A o T o G o C, en donde (*) significa que el aminoácido en la posición 13 está ausente. Los ejemplos ilustrativos adicionales de RVD adecuados para su uso en megaTAL particulares contemplados en realizaciones particulares incluyen además los divulgados en la Patente de Estados Unidos N° 8.614.092.
En realizaciones particulares, un megaTAL contemplado en la presente comprende un dominio de unión a ADN de TALE que comprende de 3 a 30 unidades de repetición. En ciertas realizaciones, un megaTAL comprende 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 unidades de repetición del dominio de unión al ADN de TALE. En una realización preferida, un megaTAL contemplado en la presente comprende un dominio de unión a ADN de TALE que comprende 5-15 unidades de repetición, más preferiblemente 7­ 15 unidades de repetición, más preferiblemente 9-15 unidades de repetición y más preferiblemente 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 unidades de repetición.
En realizaciones particulares, un megaTAL contemplado en la presente comprende un dominio de unión a ADN de TALE que comprende de 3 a 30 unidades de repetición y una unidad adicional de repetición de TALE truncada única que comprende 20 aminoácidos localizados en el extremo C-terminal de un conjunto de unidades de repetición de TALE, es decir, una unidad adicional de repetición del dominio de unión al ADN de la mitad C-terminal de TALE (aminoácidos -20 a -1 de la caperuza C divulgada en otra parte de la presente, infra). Por tanto, en realizaciones particulares, un megaTAL contemplado en la presente comprende un dominio de unión al ADN de TALE que comprende de 3,5 a 30,5 unidades de repetición. En ciertas realizaciones, un megaTAL comprende 3,5, 4,5, 5,5, 6,5, 7.5, 8,5, 9,5, 10,5, 11,5, 12,5, 13,5, 14,5, 15,5, 16,5, 17,5, 18,5, 19,5, 20,5, 21,5, 22,5, 23,5, 24,5, 25,5, 26,5, 27,5, 28.5, 29,5 o 30,5 unidades de repetición del dominio de unión al ADN de TALE. En una realización preferida, un megaTAL contemplado en la presente comprende un dominio de unión al ADN de TALE que comprende 5,5-15,5 unidades de repetición, más preferiblemente 7,5-15,5 unidades de repetición, más preferiblemente 9,5-15,5 unidades de repetición y más preferiblemente 9,5, 10,5, 11,5, 12,5, 13,5, 14,5 o 15,5 unidades de repetición.
En realizaciones particulares, un megaTAL comprende una arquitectura efectora TAL que comprende un polipéptido de "dominio N-terminal (NTD)", uno o más dominios/unidades de repetición de TALE, un polipéptido de "dominio C-terminal (CTD)" y una variante de endonucleasa homing. En algunas realizaciones, los dominios de NTD, repeticiones de TALE y/o CTD son de la misma especie. En otras realizaciones, uno o más de los dominios de NTD, repeticiones de TALE y/o CTD son de diferentes especies.
Como se usa en la presente, el término polipéptido "de dominio N-terminal (NTD)" se refiere a la secuencia que flanquea la porción o fragmento N-terminal de un dominio de unión al ADN de TALE de origen natural. La secuencia de NTD, si la hay, puede tener cualquier longitud siempre que las unidades de repetición del dominio de unión al ADN de TALE conserven la capacidad de unirse al ADN. En realizaciones particulares, el polipéptido de NTD comprende de por lo menos 120 a por lo menos 140 o más aminoácidos N-terminales al dominio de unión al ADN de TALE (0 es el aminoácido 1 de la unidad de repetición más N-terminal). En realizaciones particulares, el polipéptido de NTD comprende por lo menos aproximadamente 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, o por lo menos 140 aminoácidos N-terminales al dominio de unión al ADN de TALE. En una realización, un megaTAL contemplado en la presente comprende un polipéptido de NTD de por lo menos aproximadamente los aminoácidos 1 a 122 a por lo menos aproximadamente 1 a 137 de una proteína de TALE de Xanthomonas (0 es el aminoácido 1 de la unidad de repetición más N-terminal). En realizaciones particulares, el polipéptido de NTD comprende por lo menos aproximadamente 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 o 137 aminoácidos N-terminales al dominio de unión al ADN de TALE de una proteína TALE de Xanthomonas. En una realización, un megaTAL contemplado en la presente comprende un polipéptido de NTD de por lo menos los aminoácidos 1 a 121 de una proteína TALE de Ralstonia (0 es el aminoácido 1 de la unidad de repetición más N-terminal). En realizaciones particulares, el polipéptido de NTD comprende por lo menos aproximadamente 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 o 137 aminoácidos N-terminales al dominio de unión al ADN de TALE de una proteína de TALE de Ralstonia.
Como se usa en la presente, el término polipéptido de "dominio C-terminal (CTD)" se refiere a la secuencia que flanquea la porción o fragmento C-terminal de un dominio de unión al ADN de TALE de origen natural. La secuencia de CTD, si la hay, puede tener cualquier longitud siempre que las unidades de repetición del dominio de unión al ADN de TALE conserven la capacidad de unirse al ADN. En realizaciones particulares, el polipéptido de CTD comprende de por lo menos 20 a por lo menos 85 o más aminoácidos C-terminales a la última repetición completa del dominio de unión al ADN de TALE (los primeros 20 aminoácidos son la unidad de media repetición C-terminal a la última unidad de repetición completa C-terminal). En realizaciones particulares, el polipéptido de CTD comprende por lo menos aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 443, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, o por lo menos 85 aminoácidos C-terminales hasta la último repetición completa del dominio de unión al ADN de TALE. En una realización, un megaTAL contemplado en la presente comprende un polipéptido de CTD de por lo menos aproximadamente los aminoácidos -20 a -1 de una proteína de TALE de Xanthomonas (-20 es el aminoácido 1 de una unidad de repetición media C-terminal a la última unidad de repetición completa C-terminal). En realizaciones particulares, el polipéptido de CTD comprende por lo menos aproximadamente 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácido C-terminal a la última repetición completa del dominio de unión al ADN de TALE de una proteína de TALE de Xanthomonas. En una realización, un megaTAL contemplado en la presente comprende un polipéptido de CTD de por lo menos aproximadamente los aminoácidos -20 a -1 de una proteína de TALE de Ralstonia (-20 es el aminoácido 1 de una unidad de repetición media C-terminal a la última unidad de repetición completa C-terminal). En realizaciones particulares, el polipéptido de CTD comprende por lo menos aproximadamente 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 , 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácido C-terminal a la última repetición completa del dominio de unión al ADN de TALE de una proteína de TALE de Ralstonia.
En realizaciones particulares, un megaTAL contemplado en la presente comprende un polipéptido de fusión que comprende un dominio de unión a ADN de TALE manipulado para unirse a una secuencia objetivo, una endonucleasa homing reprogramada para unirse y escindir una secuencia objetivo y, opcionalmente, un polipéptido de NTD y/o CTD, opcionalmente unidos entre sí con uno o más polipéptidos conectores contemplados en otra parte de la presente. Sin pretender estar limitados por ninguna teoría en particular, se contempla que un megaTAL que comprende un dominio de unión al ADN de TALE y, opcionalmente, un polipéptido de NTD y/o CTD se fusiona con un polipéptido conector que se fusiona además con una variante de endonucleasa homing. Por tanto, el dominio de unión al ADN de TALE se une a una secuencia objetivo de ADN que está dentro de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 nucleótidos de distancia de la secuencia objetivo unida por el dominio de unión al ADN de la variante de endonucleasa homing. De esta manera, los megaTAL contemplados en la presente aumentan la especificidad y la eficiencia de la edición del genoma.
En una realización, un megaTAL comprende una variante de endonucleasa homing y un dominio de unión de ADN de TALE que se une a una secuencia de nucleótidos que está dentro de aproximadamente 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos, preferiblemente, 2 o 4 nucleótidos en sentido ascendente del sitio de unión de la endonucleasa homing reprogramada.
En una realización, un megaTAL comprende una variante de endonucleasa homing y un dominio de unión a ADN de TALE que se une a la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 26, que está 5 nucleótidos en sentido ascendente de la secuencia de nucleótidos unida y escindida por la variante de endonucleasa homing (SEQ ID NO: 25). En realizaciones preferidas, la secuencia objetivo de megaTAL es la SEQ ID NO: 27.
En una realización, un megaTAL comprende una variante de endonucleasa homing y un dominio de unión de ADN de TALE que se une a la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 31, que está 2 nucleótidos en sentido ascendente de la secuencia de nucleótidos unida y escindida por la variante de endonucleasa homing (SEQ ID NO: 30). En realizaciones preferidas, la secuencia objetivo de megaTAL es la SEQ ID NO: 32.
En una realización, un megaTAL comprende una variante de endonucleasa homing y un dominio de unión a ADN de TALE que se une a la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 36, que está 5 nucleótidos en sentido ascendente de la secuencia de nucleótidos unida y escindida por la variante de endonucleasa homing (SEQ ID NO: 35). En realizaciones preferidas, la secuencia objetivo de megaTAL es la SEQ ID NO: 37.
En realizaciones particulares, un megaTAL contemplado en la presente comprende una o más unidades de repetición de unión al ADN de TALE y una variante de LHE diseñada o reprogramada a partir de una LHE seleccionada del grupo que consiste en: I-AabMI, IAaeMI, I-Anil, I-ApaMI, I-CapIII, I-CapIV, I-CkaMI, I-CpaMI, I-CpaMII, I-CpaMIII, I-CpaMIV, I-CpaMV, I-CpaV, I-CraMI, I-EjeMI, I-GpeMI, I-Crpil, I-GzeMI, I-GzeMII, I-GzeMIII, I-HjeMI, I-LtrII, I-LtrI, I-LtrWI, I-MpeMI, I-MveMI, I-NcrII, I-Ncrl, INcrMI, I-OheMI, I-OnuI, I-OsoMI, I-OsoMII, I-OsoMIII, I-OsoMIV, I-PanMI, I-PanMII, I-PanMIII, I-PnoMI, I-ScuMI, I-Sma-MI, I-SscMI, I-Vdi 141I y variantes de los mismos, o preferiblemente I-CpaMI, I-HjeMI, I-OnuI, I-PanMI, SmaMI y variantes de los mismos, o más preferiblemente I-OnuI y variantes de los mismos.
En realizaciones particulares, un megaTAL contemplado en la presente comprende un NTD, una o más unidades de repetición de unión al ADN de TALE, un CTD y una variante de LHE seleccionada del grupo que consiste en: I-AabMI, I-AaeMI, I-Anil, I-ApaMI, I-CapIII, I-CapIV, I-CkaMI, I-CpaMI, I-CpaMII, I-CpaMIII, I-CpaMIV, I-CpaMV, I-CpaV, I-CraMI, I-EjeMI, I-GpeMI, I-Crpil, I-GzeMI, I-GzeMII, I-GzeMIII, 1-HjeMI, I-LtrII, I-LtrI, I-LtrWI, I-MpeMI, I-MveMI, I-NcrII, I-Ncrl, I-NcrMI, I-OheMI, I-OnuI, I-OsoMI, I-OsoMII, I-OsoMIII, I-OsoMIV, I-PanMI, I-PanMII, I-PanMIII, I-PnoMI, I-ScuMI, I-SmaMI, I-SscMI, I-Vdi 141I y variantes de los mismos, o preferiblemente I-CpaMI, I-HjeMI, I-OnuI, I-PanMI, SmaMI y variantes de los mismos, o más preferiblemente I-OnuI y variantes de los mismos.
En realizaciones particulares, un megaTAL contemplado en la presente comprende un NTD, de aproximadamente 9,5 a aproximadamente 15,5 unidades de repetición de unión al ADN de TALE y una variante de LHE seleccionada del grupo que consiste en: I-AabMI, I-AaeMI, I-Anil, I-ApaMI, I-CapIII, I-CapIV, I-CkaMI, I-CpaMI, ICpaMIl, I-CpaMIII, I-CpaMIV, I-CpaMV, I-CpaV, I-CraMI, I-EjeMI, I-GpeMI, I -Crpil, I-GzeMI, I-GzeMII, I-GzeMIII, 1-HjeMI, I-LtrII, I-LtrI, I-LtrWI, I-MpeMI, I-MveMI, I-NcrII, I-Ncrl, I-NcrMI, I-OheMI, I-OnuI, I-OsoMI, I-OsoMII, I-OsoMIII, I-OsoMIV, I-PanMI, I-PanMII, I-PanMIII, I-PnoMI, I-ScuMI, I-SmaMI, I -SscMI, I-Vdi 141I y variantes de los mismos, o preferiblemente I-CpaMI, I-HjeMI, I-OnuI, I-PanMI, SmaMI y variantes de los mismos, o más preferiblemente I-OnuI y variantes de los mismos.
En realizaciones particulares, un megaTAL contemplado en la presente comprende un NTD de aproximadamente 122 aminoácidos a 137 aminoácidos, aproximadamente 9,5, aproximadamente 10,5, aproximadamente 11,5, aproximadamente 12,5, aproximadamente 13,5, aproximadamente 14,5 o aproximadamente 15,5 unidades de repetición de unión, un CTD de aproximadamente 20 aminoácidos a aproximadamente 85 aminoácidos, y una variante de LHE I-OnuI. En realizaciones particulares, uno cualquiera, dos o todos los NTD, el dominio de unión al ADN y el CTD pueden diseñarse a partir de la misma especie o de especies diferentes, en cualquier combinación adecuada.
En realizaciones particulares, un megaTAL contemplado en la presente comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 15-23 y 64.
En ciertas realizaciones, un megaTAL contemplado en la presente está codificado por una secuencia de ARNm expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 40-42 y 65-68.
En realizaciones particulares, una proteína de fusión megaTAL-Trex2 contemplada en la presente comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 24.
En ciertas realizaciones, un megaTAL comprende un dominio de unión al ADN de TALE y una variante de LHE I-OnuI se une y escinde la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 27. En realizaciones particulares, el megaTAL que se une y escinde la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 27 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 15-19.
En ciertas realizaciones, un megaTAL comprende un dominio de unión al ADN de TALE y una variante de LHE I-OnuI se une y escinde la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 32. En realizaciones particulares, el megaTAL que se une y escinde la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 32 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 20-21 y 64.
En ciertas realizaciones, un megaTAL comprende un dominio de unión al ADN de TALE y una variante de LHE I-OnuI se une y escinde la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 37. En realizaciones particulares, el megaTAL que se une y escinde la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 37 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 22-23.
3. ENZIMAS DE PROCESAMIENTO DE EXTREMOS
Las composiciones y métodos de edición de genomas contemplados en realizaciones particulares comprenden la edición de genomas celulares usando una variante de nucleasa y una o más copias de una enzima de procesamiento de extremos. En realizaciones particulares, un único polinucleótido codifica una variante de endonucleasa homing y una enzima de procesamiento de extremos, separados por un conector, una secuencia peptídica autoescindible, por ejemplo, secuencia 2A, o por una secuencia IRES. En realizaciones particulares, las composiciones de edición del genoma comprenden un polinucleótido que codifica una variante de nucleasa y un polinucleótido separado que codifica una enzima de procesamiento de extremos. En realizaciones particulares, las composiciones de edición del genoma comprenden un polinucleótido que codifica una fusión polipeptídica única de enzima de procesamiento de extremos de variante de endonucleasa homing además de una copia en tándem de la enzima de procesamiento de extremos separada por un péptido autoescindible.
El término "enzima de procesamiento de extremos" se refiere a una enzima que modifica los extremos expuestos de una cadena de polinucleótidos. El polinucleótido puede ser ADN de cadena doble (ADNdc), ADN de cadena sencilla (ADNmc), ARN, híbridos de cadena doble de ADN y ARN, y ADN sintético (por ejemplo, que contiene bases distintas de A, C, G y T). Una enzima de procesamiento de extremos puede modificar los extremos de la cadena de polinucleótidos expuestos añadiendo uno o más nucleótidos, eliminando uno o más nucleótidos, eliminando o modificando un grupo fosfato y/o eliminando o modificando un grupo hidroxilo. Una enzima de procesamiento de extremos puede modificar los extremos en los sitios de corte de la endonucleasa o en los extremos generados por otros medios químicos o mecánicos, como cizallamiento (por ejemplo, al pasar a través de una aguja de calibre fino, calentamiento, sonicación, volteo de mini perlas y nebulización), radiación por ionización, radiación ultravioleta, radicales de oxígeno, hidrólisis química y agentes de quimioterapia.
En realizaciones particulares, las composiciones y métodos de edición del genoma contemplados en realizaciones particulares comprenden la edición de genomas celulares usando una variante de endonucleasa homing o megaTAL y una enzima de procesamiento de extremos de ADN.
El término "enzima de procesamiento de extremos de ADN" se refiere a una enzima que modifica los extremos expuestos del ADN. Una enzima de procesamiento de extremos de ADN puede modificar extremos romos o extremos escalonados (extremos con salientes de 5' o 3'). Una enzima de procesamiento de extremos del ADN puede modificar el ADN de cadena sencilla o de cadena doble. Una enzima de procesamiento de extremos de ADN puede modificar los extremos en los sitios de corte de endonucleasas o en los extremos generados por otros medios químicos o mecánicos, como cizallamiento (por ejemplo, al pasar a través de una aguja de calibre fino, calentamiento, sonicación, volteo de mini perlas y nebulización), radiación por ionización, radiación ultravioleta, radicales de oxígeno, hidrólisis química y agentes de quimioterapia. La enzima de procesamiento de extremos de ADN puede modificar los extremos de ADN expuestos añadiendo uno o más nucleótidos, eliminando uno o más nucleótidos, eliminando o modificando un grupo fosfato y/o eliminando o modificando un grupo hidroxilo.
Los ejemplos ilustrativos de enzimas de procesamiento de extremos del ADN adecuadas para su uso en realizaciones particulares contempladas en la presente incluyen, pero no se limitan a: exonucleasas 5'-3', exonucleasas alcalinas 5'-3', exonucleasas 3'-5', endonucleasas de aleta 5', helicasas, fosfatasas, hidrolasas y ADN polimerasas independientes de la plantilla.
Los ejemplos ilustrativos adicionales de enzimas de procesamiento de extremos del ADN adecuadas para su uso en realizaciones particulares contempladas en la presente incluyen, pero no se limitan a, Trex2, Trex1, Trex1 sin dominio transmembrana, Apollo, Artemis, DNA2, Exo1, ExoT, ExoIII, Fen1, Fan1, MreII, Rad2, Rad9, TdT (desoxinucleotidil transferasa terminal), PNKP, RecE, RecJ, RecQ, exonucleasa lambda, Sox, ADN polimerasa de Vaccinia, exonucleasa I, exonucleasa III, exonucleasa VII, NDK1, NDK5, NDK7, NDK8, WRN, gen 6 de exonucleasa T7, proteína de integración del virus de la mieloblastosis aviar (IN), Bloom, fosfatasa antártica, fosfatasa alcalina, polinucleótido quinasa (PNK), ApeI, nucleasa de frijol mungo, Hex1, TTRAP (TDP2), Sgs1, Sae2, CUP, Pol mu, Pol lambda, MUS81, EME1, EME2, SLX1, SLX4 y UL-12.
En realizaciones particulares, las composiciones de edición del genoma y los métodos para editar genomas celulares contemplados en la presente comprenden polipéptidos que comprenden una variante de endonucleasa homing o megaTAL y una exonucleasa. El término "exonucleasa" se refiere a las enzimas que escinden los enlaces fosfodiéster al final de una cadena de polinucleótidos a través de una reacción de hidrólisis que rompe los enlaces fosfodiéster en el extremo 3' o 5'.
Los ejemplos ilustrativos de exonucleasas adecuadas para su uso en realizaciones particulares contempladas en la presente incluyen, pero no se limitan a: hExoI, ExoI de levadura, ExoI de E. coli, hTREX2, TREX2 de ratón, TREX2 de rata, hTREX1, TREX1 de ratón, TREX1de rata y TREX1 de rata.
En realizaciones particulares, la enzima de procesamiento de extremos del ADN es una exonucleasa de 3' a 5', preferiblemente Trex 1 o Trex2, más preferiblemente Trex2, e incluso más preferiblemente Trex2 humana o de ratón.
D. SITIOS OBJETIVO
Las variantes de nucleasas contempladas en realizaciones particulares pueden diseñarse para unirse a cualquier secuencia objetivo adecuada y pueden tener una especificidad de unión novedosa, en comparación con una nucleasa de origen natural. En realizaciones particulares, el sitio objetivo es una región reguladora de un gen que incluye, pero no se limita a, promotores, potenciadores, elementos represores y similares. En realizaciones particulares, el sitio objetivo es una región codificante de un gen o un sitio de corte y empalme. En ciertas realizaciones, las variantes de nucleasas están diseñadas para regular por disminución o disminuir la expresión de un gen. En realizaciones particulares, puede diseñarse una variante de nucleasa y una plantilla de reparación del donante para reparar o eliminar una secuencia objetivo deseada.
En varias realizaciones, las variantes de nucleasas se unen y escinden una secuencia objetivo en un gen del receptor de muerte programada 1 (PD-1). PD-1 también se conoce como muerte celular programada 1 (PDCD1), susceptibilidad al lupus eritematoso sistémico 2 (SLEB2), CD279, HPD1, PD1, HPD-L y HSLE1. PD-1 es un miembro de la familia B7/CD28 de receptores coestimuladores. La molécula de PD-1 consiste en un dominio de IgV de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular que tiene sitios de fosforilación potenciales localizados con motivo inhibidor basado en tirosina inmune (ITIM) y motivo de interruptor basado en tirosina inhibidor del receptor inmune (ITSM). PD-1 es un coreceptor inhibidor expresado en células T, Tregs, células T agotadas, células B, monocitos activados, células dendríticas (DC), células asesinas naturales (NK) y células T asesinas naturales (NKT). PD-1 regula negativamente la activación de las células T mediante la unión a sus ligandos, el ligando de muerte programada 1 (PD-L1) y el ligando de muerte programada 2 (PD-L2). La unión de PD-1 inhibe la proliferación de células T y la producción de interferón-Y (IFN-y), factor de necrosis tumoral-a e IL-2, y reduce la supervivencia de las células T. La expresión de PD-1 es un sello distintivo de las células T "agotadas" que han experimentado altos niveles de estimulación. Este estado de agotamiento, que se produce durante las infecciones crónicas y el cáncer, se caracteriza por la disfunción de las células T, lo que da como resultado un control subóptimo de las infecciones y los tumores.
En realizaciones particulares, una variante de endonucleasa homing o megaTAL introduce una ruptura de cadena doble (DSB) en un sitio objetivo en un gen de PD-1. En realizaciones particulares, una variante de endonucleasa homing o megaTAL introduce un DSB en el exón 5 de un gen de PD-1, preferiblemente en la SEQ ID NO: 25 (o SEQ ID NO: 27) en el exón 5 de un gen de PD-1, y más preferiblemente en la secuencia "ATAC" en la SEQ ID NO: 25 (o SEQ ID NO: 27) en el exón 5 de un gen de PD-1.
En una realización preferida, una variante de endonucleasa homing o megaTAL escinde el ADN de cadena doble e introduce un DSB en la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 25 o 27.
En realizaciones particulares, una variante de endonucleasa homing o megaTAL introduce un DSB en el exón 1 de un gen de PD-1, preferiblemente en la SEQ ID NO: 30 (o SEQ ID NO: 32) en el exón 1 de un gen de PD-1, y más preferiblemente en la secuencia "ATCC" en la SEQ ID NO: 30 (o SEQ ID NO: 32) en el exón 1 de un gen de PD-1.
En una realización preferida, una variante de endonucleasa homing o megaTAL escinde el ADN de cadena doble e introduce un DSB en la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 30 o 32.
En realizaciones particulares, una variante de endonucleasa homing o megaTAL introduce un DSB en el exón 2 de un gen de PD-1, preferiblemente en la SEQ ID NO: 35 (o SEQ ID NO: 37) en el exón 2 de un gen de PD-1, y más preferiblemente en la secuencia "ACTT" en la SEQ ID NO: 35 (o SEQ ID NO: 37) en el exón 2 de un gen de PD-1.
En una realización preferida, una variante de endonucleasa homing o megaTAL escinde el ADN de cadena doble e introduce un DSB en la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 35 o 37.
En realizaciones de la invención, el gen de PD-1 es un gen de PD-1 humano.
E. PLANTILLAS DE REPARACIÓN DE DONANTES
Pueden usarse variantes de nucleasas para introducir un DSB en una secuencia objetivo; el DSB puede repararse a través de mecanismos de reparación dirigida por homología (HDR) en presencia de una o más plantillas de reparación de donantes.
En varias realizaciones, la plantilla de reparación del donante comprende uno o más polinucleótidos que codifican un potenciador de inmunopotencia, un amortiguador de señales inmunosupresoras o un receptor de antígeno manipulado.
En varias realizaciones, se contempla que proporcionar a una célula una nucleasa manipulada en presencia de una pluralidad de plantillas de reparación de donantes que codifican independientemente potenciadores de inmunopotencia y/o amortiguadores de señales inmunosupresoras dirigidos a diferentes vías inmunosupresoras, produce células T editadas en el genoma con mayor eficacia y persistencia terapéutica. Por ejemplo, en realizaciones particulares pueden preferirse los potenciadores de la inmunopotencia o las combinaciones de direccionamiento de la señal inmunosupresora de las vías PD-1, LAG-3, CTLA-4, TIM3, IL-10R, TIGIT y TGFpRII.
En realizaciones particulares, la plantilla de reparación del donante se usa para insertar una secuencia en el genoma. En realizaciones particularmente preferidas, la plantilla de reparación del donante se usa para reparar o modificar una secuencia en el genoma.
En varias realizaciones, se introduce una plantilla de reparación del donante en una célula hematopoyética, por ejemplo, una célula T, mediante la transducción de la célula con un virus adenoasociado (AAV), retrovirus, por ejemplo, lentivirus, IDLV, etc., virus del herpes simple, vector de adenovirus o virus vaccinia que comprende la plantilla de reparación del donante.
En realizaciones particulares, la plantilla de reparación del donante comprende uno o más brazos de homología que flanquean el sitio DSB.
Como se usa en la presente, el término "brazos de homología" se refiere a una secuencia de ácido nucleico en una plantilla de reparación de donante que es idéntica, o casi idéntica, a la secuencia de ADN que flanquea la rotura de ADN introducida por la nucleasa en un sitio objetivo. En una realización, la plantilla de reparación del donante comprende un brazo de homología 5' que comprende una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o casi idéntica a la secuencia de ADN 5' del sitio de rotura de ADN. En una realización, la plantilla de reparación del donante comprende un brazo de homología 3' que comprende una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o casi idéntica a la secuencia de ADN 3' del sitio de ruptura de ADN. En una realización preferida, la plantilla de reparación del donante comprende un brazo de homología 5' y un brazo de homología 3'. La plantilla de reparación del donante puede comprender homología con la secuencia del genoma inmediatamente adyacente al sitio DSB, u homología con la secuencia genómica dentro de cualquier número de pares de bases desde el sitio DSB. En una realización, la plantilla de reparación del donante comprende una secuencia de ácido nucleico que es homóloga a una secuencia genómica de aproximadamente 5 pb, aproximadamente 10 pb, aproximadamente 25 pb, aproximadamente 50 pb, aproximadamente 100 pb, aproximadamente 250 pb, aproximadamente 500 pb, aproximadamente 1000 pb, aproximadamente 2500 pb, aproximadamente 5000 pb, aproximadamente 10000 pb o más, incluyendo cualquier longitud intermedia de secuencia homóloga.
Los ejemplos ilustrativos de longitudes adecuadas de brazos de homología contemplados en realizaciones particulares pueden seleccionarse independientemente e incluyen, pero no se limitan a: aproximadamente 100 pb, aproximadamente 200 pb, aproximadamente 300 pb, aproximadamente 400 pb, aproximadamente 500 pb, aproximadamente 600 pb, aproximadamente 700 pb, aproximadamente 800 pb, aproximadamente 900 pb, aproximadamente 1000 pb, aproximadamente 1100 pb, aproximadamente 1200 pb, aproximadamente 1300 pb, aproximadamente 1400 pb, aproximadamente 1500 pb, aproximadamente 1600 pb, aproximadamente 1700 pb, aproximadamente 1800 pb, aproximadamente 1900 pb, aproximadamente 2000 pb, aproximadamente 2100 pb, aproximadamente 2200 pb, aproximadamente 2300 pb, aproximadamente 2400 pb, aproximadamente 2500 pb, aproximadamente 2600 pb, aproximadamente 2700 pb, aproximadamente 2800 pb, aproximadamente 2900 pb, o aproximadamente 3000 pb, o brazos de homología más largos, incluyendo todas las longitudes intermedias de los brazos de homología.
Ejemplos ilustrativos adicionales de longitudes de brazo de homología adecuadas incluyen, pero no se limitan a: de aproximadamente 100 pb a aproximadamente 3000 pb, de aproximadamente 200 pb a aproximadamente 3000 pb, de aproximadamente 300 pb a aproximadamente 3000 pb, de aproximadamente 400 pb a aproximadamente pb, de aproximadamente 500 pb a aproximadamente 3000 pb, de aproximadamente 500 pb a aproximadamente pb, de aproximadamente 500 pb a aproximadamente 2000 pb, de aproximadamente 750 pb a aproximadamente pb, de aproximadamente 750 pb a aproximadamente 1500 pb, o de aproximadamente 1000 pb a aproximada 1500 pb, incluyendo todas las longitudes intermedias de los brazos de homología.
En una realización particular, las longitudes de los brazos de homología 5' y 3' se seleccionan independientemente entre aproximadamente 500 pb y aproximadamente 1500 pb. En una realización, el brazo de homología 5' tiene aproximadamente 1500 pb y el brazo de homología 3' tiene aproximadamente 1000 pb. En una realización, el brazo de homología 5' tiene entre aproximadamente 200 pb y aproximadamente 600 pb y el brazo de homología 3' tiene entre aproximadamente 200 pb y aproximadamente 600 pb. En una realización, el brazo de homología 5' tiene aproximadamente 200 pb y el brazo de homología 3' tiene aproximadamente 200 pb. En una realización, el brazo de homología 5' tiene aproximadamente 300 pb y el brazo de homología 3' tiene aproximadamente
300 pb. En una realización, el brazo de homología 5' tiene aproximadamente 400 pb y el brazo de homología 3' tiene aproximadamente 400 pb. En una realización, el brazo de homología 5' tiene aproximadamente 500 pb y el brazo de homología 3' tiene aproximadamente 500 pb. En una realización, el brazo de homología 5' tiene aproximadamente
600 pb y el brazo de homología 3' tiene aproximadamente 600 pb.
Las plantillas de reparación de donantes pueden comprender además uno o más polinucleótidos, como promotores y/o potenciadores, regiones no traducidas (UTR), secuencias de Kozak, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, sitios de entrada ribosomales internos (IRES), sitios de reconocimiento de recombinasa (por ejemplo, sitios LoxP, FRT y Att), codones de terminación, señales de terminación de la transcripción y polinucleótidos que codifican polipéptidos autoescindibles, etiquetas de epítopos, contemplados en otra parte de la presente.
En una realización, la plantilla de reparación del donante comprende un polinucleótido que comprende un gen de PD-1 o una porción del mismo y está diseñado para introducir una o más mutaciones en una secuencia genómica de PD-1 de tal manera que se exprese un producto del gen de PD-1 mutante. En una realización, el PD-1 mutante tiene una unión de ligando disminuida y/o una reducción en la señalización intracelular.
En varias realizaciones, la plantilla de reparación del donante comprende un brazo de homología 5', un promotor de ARN polimerasa II, uno o más polinucleótidos que codifican un potenciador de la inmunopotencia, un amortiguador de señales inmunosupresoras o un receptor de antígeno manipulado y un brazo de homología 3'.
En varias realizaciones, un sitio objetivo se modifica con una plantilla de reparación del donante que comprende un brazo de homología 5', uno o más polinucleótidos que codifican un péptido viral autoescindible, por ejemplo, T2A, un potenciador de inmunopotencia, un amortiguador de señales inmunosupresoras o un receptor de antígeno manipulado, opcionalmente una señal de poli(A) o péptido autoescindible, y un brazo de homología 3', en donde la expresión del uno o más polinucleótidos está regida por el promotor de PD-1 endógeno.
1. POTENCIADORES DE LA INMUNOPOTENCIA
En realizaciones particulares, las células efectoras inmunitarias editadas en el genoma contempladas en la presente se vuelven más potentes y/o resistentes a los factores inmunosupresores mediante la introducción de un
DSB en el gen de PD-1 en presencia de una plantilla de reparación del donante que codifica un potenciador de la inmunopotencia. Como se usa en la presente, el término "potenciador de la inmunopotencia" se refiere a moléculas de origen no natural que estimulan y/o potencian la activación y/o función de las células T, factores inmunopotenciadores y polipéptidos de origen no natural que convierten las señales inmunosupresoras del microambiente tumoral en una señal inmunoestimuladora en una célula T u otras células inmunitarias.
En realizaciones particulares, el potenciador de la inmunopotencia se selecciona del grupo que consiste en: una molécula acopladora de células T biespecífica (BiTE); un factor inmunopotenciador que incluye, pero no se limita a, citoquinas, quimiocinas, citotoxinas y/o receptores de citoquinas; y un receptor flip.
En algunas realizaciones, el potenciador de la inmunopotencia, el factor inmunopotenciador o el receptor flip son polipéptidos de fusión que comprenden un dominio de desestabilización de proteína.
a. Moléculas acopladoras de células T biespecíficas (BiTE)
En realizaciones particulares, las células efectoras inmunitarias editadas en el genoma contempladas en la presente se vuelven más potentes mediante la introducción de un DSB en el gen de PD-1 en presencia de una plantilla de reparación del donante que codifica moléculas acopladoras de células T biespecíficas (BiTE). Las moléculas BiTE son moléculas bipartitas que comprenden un primer dominio de unión que se une a un antígeno objetivo, un conector o espaciador como se contempla en otra parte de la presente, y un segundo dominio de unión que se une a una molécula estimuladora o coestimuladora en una célula efectora inmunitaria. El primer y el segundo dominios de unión pueden seleccionarse independientemente de ligandos, receptores, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, lectinas y carbohidratos.
En realizaciones particulares, el primer y el segundo dominios de unión son dominios de unión a antígeno.
En realizaciones particulares, el primer y el segundo dominios de unión son anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En una realización, el primer y el segundo dominios de unión son fragmentos variables de cadena sencilla (scFv).
Los ejemplos ilustrativos de antígenos objetivo que pueden ser reconocidos y unidos por el primer dominio de unión en realizaciones particulares incluyen, pero no se limitan a: receptor de alfa folato, 5T4, integrina avp6 , BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, familia EGFR incluyendo ErbB2 (HER2), EGFRvlII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, AchR fetal, FRa, GD2, GD3, Glipicano-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Ra, IL-13Ra2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, mesotelina, Muc1, Muc16, NCAM, ligandos NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivina, TAG72, TEM, VEGFR2 y WT-1.
Otras realizaciones ilustrativas de antígenos objetivo incluyen complejos MHC-péptido, opcionalmente en donde el péptido se procesa a partir de: receptor de alfa folato, 5T4, integrina avp6, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, familia EGFR incluyendo ErbB2 (HER2), EGFRvlII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, AchR fetal, FRa, GD2, GD3, Glipicano-3 (GPC3), MAGE1, NY-ESO-1, IL-11Ra, IL-13Ra2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, mesotelina, Muc1, Muc16, NCAm , ligandos NKG2D, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivins, TAG72, TEM, VEGFR2y WT-1.
Los ejemplos ilustrativos de moléculas estimuladoras o coestimuladoras en células efectoras inmunes reconocidas y unidas por el segundo dominio de unión en realizaciones particulares incluyen, pero no se limitan a: CD3y, CD36, CD3£, CD3Z, CD28, CD134, CD137 y CD278.
En realizaciones particulares, se induce un DSB en un gen de PD-1 mediante una nucleasa manipulada, y se introduce en la célula una plantilla de reparación de donante que comprende una BiTE y se inserta en el gen de PD-1 mediante recombinación homóloga.
b. Factores inmunopotenciadores
En realizaciones particulares, las células efectoras inmunitarias editadas en el genoma contempladas en la presente se hacen más potentes aumentando los factores inmunopotenciadores en las células editadas en el genoma o en las células del microentorno tumoral. Los factores inmunopotenciadores se refieren a citoquinas, quimiocinas, citotoxinas y receptores de citoquinas particulares que potencian la respuesta inmunitaria en las células efectoras inmunitarias. En una realización, las células T se manipulan introduciendo un DSB en el gen de PD-1 en presencia de una plantilla de reparación del donante que codifica una citoquina, quimioquina, citotoxina o receptor de citoquina.
En realizaciones particulares, la plantilla de reparación del donante codifica una citoquina seleccionada del grupo que consiste en: IL-2, insulina, IFN-y, IL-7, IL-21, IL-10, IL-12, IL-15yTNF-a.
En una realización preferida, la plantilla de reparación del donante codifica una citoquina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-7, IL-12, iL-15, IL-18 e IL-21, que cuando se integra en un sitio objetivo en el gen de PD-1, enlaza operativamente la citoquina al promotor endógeno de PD-1, colocando de este modo el control transcripcional de la citoquina bajo el control del promotor endógeno de PD-1.
En otra realización preferida, la plantilla de reparación del donante codifica IL-12 que, cuando se integra en un sitio objetivo en el gen de PD-1, enlaza operativamente la citoquina al promotor endógeno de PD-1, colocando de este modo el control transcripcional de la citoquina bajo el control del promotor endógeno de PD-1.
En realizaciones particulares, la plantilla de reparación del donante codifica una quimioquina seleccionada del grupo que consiste en: MIP-1a, MIP-1p, MCP-1, MCP-3 y RANTES.
En realizaciones particulares, la plantilla de reparación del donante codifica una citotoxina seleccionada del grupo que consiste en: Perforina, Granzima A y Granzima B.
En realizaciones particulares, la plantilla de reparación del donante codifica un receptor de citoquinas seleccionado del grupo que consiste en: un receptor de IL-2, un receptor de IL-7, un receptor de IL-12, un receptor de IL-15 y un receptor de IL-21.
En una realización preferida, la plantilla de reparación del donante codifica un receptor de citoquinas seleccionado del grupo que consiste en un receptor de IL-2, un receptor de IL-7, un receptor de IL-12, un receptor de IL-15, un receptor de IL-18 y un receptor de IL-21, que cuando se integra en un sitio objetivo en el gen de PD-1, enlaza operativamente el receptor de citoquinas al promotor endógeno de PD-1, colocando de este modo el control transcripcional del receptor de citoquinas bajo el control del promotor endógeno de PD-1.
En otra realización preferida, la plantilla de reparación del donante codifica un receptor de IL-12 que, cuando se integra en un sitio objetivo en el gen de PD-1, enlaza operativamente el receptor de citoquinas con el promotor endógeno de PD-1, colocando de este modo el control transcripcional del receptor de citoquinas bajo el control del promotor endógeno de PD-1.
C. Receptores Flip
En realizaciones adicionales, la plantilla de reparación del donante codifica un receptor flip o una parte del mismo. Como se usa en la presente, el término "receptor flip" se refiere a un polipéptido de origen no natural que convierte las señales inmunosupresoras del microambiente tumoral en una señal inmunoestimuladora en una célula T. En realizaciones particulares, un receptor flip de PD-1 se refiere a un polipéptido que comprende un exodominio de PD-1 o un dominio de unión a ligando o una variante del mismo, un dominio transmembrana y un endodominio que transduce una señal inmunoestimuladora a una célula T. En realizaciones particulares, un receptor flip de PD-1 se refiere a un polipéptido que comprende un exodominio de PD-1 o un dominio de unión a ligando o una variante del mismo, un dominio transmembrana de PD-1 y un endodominio que transduce una señal inmunoestimuladora a una célula T. En realizaciones particulares, un receptor flip de PD-1 se refiere a un polipéptido que comprende un exodominio de PD-1 o un dominio de unión a ligando o una variante del mismo y un dominio transmembrana y un endodominio de una proteína que transduce una señal inmunoestimuladora a una célula T. En ciertas realizaciones, la variante del exodominio de PD-1 tiene una afinidad de unión aumentada por PD-L1 y/o PD-L2.
En una realización, la transmembrana se aísla de CD36, CD3e, CD3y, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD154, AMN y PD-1.
En una realización, la transmembrana se aísla de CD4, CD8a, CD8p, CD27, CD28, CD134, CD137, un polipéptido de CD3, receptor de IL-2, receptor de IL-7, receptor de IL-12, receptor de IL-15 o receptor de IL-21.
En una realización, el endodominio se aísla de un receptor de IL-2, receptor de IL-7, receptor de IL-12, receptor de IL-15 o receptor de IL-21.
En una realización, la plantilla de reparación del donante comprende un receptor flip de PD-1 que comprende un exodominio de PD-1 o un dominio de unión a ligando, un dominio transmembrana y uno o más dominios de señalización coestimuladores intracelulares y/o dominios de señalización primarios. La transmembrana y los endodominios pueden aislarse a partir de la misma proteína o de proteínas diferentes.
En una realización, la plantilla de reparación del donante comprende un receptor flip de PD-1 que comprende un exodominio de PD-1 o un dominio de unión a ligando, un dominio transmembrana de PD-1 y uno o más dominios de señalización coestimuladores intracelulares y/o dominios de señalización primarios.
2. AMORTIGUADORES DE SEÑALES INMUNOSUPRESORES
Una limitación o problema que molesta a la terapia celular adoptiva existente es la falta de respuesta de las células efectoras inmunitarias debido al agotamiento mediado por el microambiente tumoral. Las células T agotadas tienen una firma molecular única que es marcadamente distinta de las células T vírgenes, efectoras o de memoria. Se definen como células T con expresión de citoquinas y función efectora disminuidas.
En realizaciones particulares, las células efectoras inmunitarias editadas en el genoma contempladas en la presente se hacen más resistentes al agotamiento al disminuir o amortiguar la señalización por factores inmunosupresores. En una realización, las células T se manipulan introduciendo un DSB en el gen de PD-1 en presencia de una plantilla de reparación del donante que codifica un amortiguador de señales inmunosupresor.
Como se usa en la presente, el término "amortiguador de señales inmunosupresor" se refiere a un polipéptido de origen no natural que disminuye la transducción de señales inmunosupresoras desde el microambiente tumoral a una célula T. En una realización, el amortiguador de señales inmunosupresoras es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un factor inmunosupresor. En realizaciones preferidas, un amortiguador de señales inmunosupresoras se refiere a un polipéptido que provoca un efecto supresor, amortiguador o negativo dominante sobre un factor inmunosupresor particular o vía de señalización porque el amortiguador comprende un exodominio que se une a un factor inmunosupresor y, opcionalmente, un dominio transmembrana, y opcionalmente, un endodominio modificado (por ejemplo, dominio de señalización intracelular).
En realizaciones particulares, el exodominio es un dominio de unión extracelular que reconoce y se une a un factor inmunosupresor.
En realizaciones particulares, el endodominio modificado se muta para disminuir o inhibir las señales inmunosupresoras. Las estrategias de mutación adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sustitución, adición o deleción de aminoácidos. Las mutaciones adecuadas incluyen además, pero no se limitan a, el truncamiento del endodominio para eliminar los dominios de señalización, la mutación de endodominios para eliminar residuos importantes para la actividad del motivo de señalización y la mutación de endodominios para bloquear el ciclo del receptor. En realizaciones particulares, el endodominio, cuando está presente, no transduce señales inmunosupresoras, o tiene una señalización sustancialmente reducida.
Por tanto, en algunas realizaciones, un amortiguador de señales inmunosupresoras actúa como sumidero para uno o más factores inmunosupresores del microambiente tumoral e inhibe las vías de señalización inmunosupresoras correspondientes en la célula T.
Una señal inmunosupresora está mediada por el catabolismo del triptófano. El catabolismo del triptófano por la indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO) en las células cancerígenas lleva a la producción de quinureninas que han demostrado tener un efecto inmunosupresor sobre las células T en el microambiente tumoral. Consultar, por ejemplo, Flatten et al. (2012) Cancer Res. 72(21):5435-40.
En una realización, una plantilla de reparación del donante comprende una enzima con actividad de quinureninasa.
Los ejemplos ilustrativos de enzimas que tienen actividad de quinureninasa adecuadas para su uso en realizaciones particulares incluyen, pero no se limitan a, L-quinurenina hidrolasa.
En una realización, la plantilla de reparación del donante comprende uno o más polinucleótidos que codifican un amortiguador de señales inmunosupresoras que disminuye o bloquea la señalización inmunosupresora mediada por un factor inmunosupresor.
Los ejemplos ilustrativos de factores inmunosupresores dirigidos por los amortiguadores de señales inmunosupresoras contemplados en realizaciones particulares incluyen, pero no se limitan a: ligando de muerte programada 1 (PD-L1), ligando de muerte programada 2 (PD-L2), factor de crecimiento transformante p (TGFp), factor estimulante de colonias de macrófagos 1 (M-CSF1 ), ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL), antígeno de cáncer de unión al receptor expresado en ligando de células SiSo (RCAS1), ligando Fas (FasL), CD47, interleucina-4 (IL-4), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8), interleucina-10 (IL-10) e interleucina-13 (IL-13).
En varias realizaciones, el amortiguador de señales inmunosupresoras comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un factor inmunosupresor.
En varias realizaciones, el amortiguador de señales inmunosupresoras comprende un exodominio que se une a un factor inmunosupresor.
En realizaciones particulares, el amortiguador de señales inmunosupresoras comprende un exodominio que se une a un factor inmunosupresor y un dominio transmembrana.
En otra realización, el amortiguador de señales inmunosupresoras comprende un exodominio que se une a un factor inmunosupresor, un dominio transmembrana y un endodominio modificado que no transduce o que tiene una capacidad sustancialmente reducida para transducir señales inmunosupresoras.
Como se usa en la presente, el término "exodominio" se refiere a un dominio de unión a antígeno. En una realización, el exodominio es un dominio de unión a ligando extracelular de un receptor inmunosupresor que transduce señales inmunosupresoras desde el microambiente tumoral a una célula T. En realizaciones particulares, un exodominio se refiere a un dominio de unión a ligando extracelular de un receptor que comprende un motivo inhibidor de tirosina de inmunorreceptor (ITIM) y/o un motivo de cambio de tirosina de inmunorreceptor (ITSM).
Los ejemplos ilustrativos de exodominios adecuados para su uso en realizaciones particulares de amortiguadores de señales inmunosupresoras incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, o dominios de unión a ligandos extracelulares aislados de los siguientes polipéptidos: proteína 1 de muerte celular programada (PD-1), proteína del gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3), dominio de inmunoglobulina de células T y proteína de dominio de mucina 3 (TIM3), antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), atenuador de linfocitos T de banda (BTLA), inmunoglobulina de células T y dominio de motivo inhibidor basado en inmunorreceptor de tirosina (TIGIT), receptor II de factor de crecimiento transformante p (TGFpRIl), receptor de factor 1 estimulante de colonias de macrófagos (CSF1R), receptor de interleucina 4 (IL4R), receptor de interleucina 6 (IL6R), receptor de quimiocina (motivo C-X-C) 1 (CXCR1), receptor 2 de quimiocinas (motivo C-X-C) (CXCR2),subunidad alfa del receptor de interleucina 10 (IL10R), subunidad alfa 2 del receptor de interleucina 13 (IL13Ra2), ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAILR1), antígeno de cáncer de unión al receptor expresado en células SiSo (RCAS1R) y receptor de muerte de superficie celular Fas (FAS).
En una realización, el exodominio comprende un dominio de unión a ligando extracelular de un receptor seleccionado del grupo que consiste en: PD-1, lAg -3, TIM3, CTLA-4, IL10R, TIGIT, CSF1R y TGFpRII.
Pueden usarse usa serie de dominios transmembrana en realizaciones particulares. Los ejemplos ilustrativos de dominios transmembrana adecuados para su uso en realizaciones particulares de amortiguadores de señales inmunosupresoras contemplados en realizaciones particulares incluyen, pero no se limitan a, dominios transmembrana de las siguientes proteínas: cadena alfa o beta del receptor de células T, CD8, CD3e, CDy, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD154 y PD-1.
En realizaciones particulares, las terapias celulares adoptivas contempladas en la presente comprenden un amortiguador de señales inmunosupresoras que inhibe o bloquea la transducción de señales TGFp inmunosupresoras del microambiente tumoral a través de TGFpRII. En una realización, el amortiguador de señales inmunosupresoras comprende un exodominio que comprende un dominio de unión de ligando extracelular de TGFpRII, un dominio transmembrana de TGFpRII y un endodominio de TGFpRII no funcional truncado. En otra realización, el amortiguador de señales inmunosupresoras comprende un exodominio que comprende un dominio de unión de ligando extracelular de TGFpRII, un dominio transmembrana de TGFpRII y carece de un endodominio.
3. RECEPTORES DE ANTÍGENOS MANIPULADOS
En realizaciones particulares, las células efectoras inmunitarias editadas en el genoma contempladas en la presente comprenden un receptor de antígenos manipulado. En una realización, las células T se manipulan introduciendo un DSB en uno o más genes de PD-1 en presencia de una plantilla de reparación del donante que codifica un receptor de antígeno manipulado.
En realizaciones particulares, el receptor de antígeno manipulado es un receptor de células T (TCR), un receptor de antígeno quimérico (CAR), un receptor Daric o componentes del mismo, o un receptor de citoquina quimérico.
a. TCR manipulados
En realizaciones particulares, las células efectoras inmunitarias editadas en el genoma contempladas en la presente comprenden un TCR manipulado. En una realización, las células T se manipulan introduciendo un DSB en uno o más genes de PD-1 en presencia de una plantilla de reparación del donante que codifica un TCR manipulado. En una realización particular, se inserta un TCR manipulado en un DSB en un único gen de PD-1. En otra realización, la cadena alfa de un TCR manipulado se inserta en un DSB en un gen de PD-1 y la cadena beta del TCR manipulado se inserta en un DSB en el otro gen de PD-1.
En una realización, las células T manipuladas contempladas en la presente comprenden un TCR manipulado que no está insertado en un gen de PD-1 y uno o más amortiguadores de señales inmunosupresoras, un receptor flip, una cadena alfa y/o beta de una célula T (TCR), manipulada un receptor de antígeno quimérico (CAR), un receptor Daric o componentes de los mismos, o un receptor de citoquina quimérico se inserta en un DSB en uno o más genes de PD-1.
Los receptores de células T de origen natural comprenden dos subunidades, una subunidad de cadena alfa y una de cadena beta, cada una de las cuales es una proteína única producida por un evento de recombinación en el genoma de cada célula T. Las bibliotecas de TCR pueden explorarse en cuanto a su selectividad para antígenos objetivo particulares. De esta manera, los TCR naturales, que tienen una alta avidez y reactividad hacia los antígenos objetivo, pueden seleccionarse, clonarse y posteriormente introducirse en una población de células T usadas para inmunoterapia adoptiva.
En una realización, las células T se modifican introduciendo una plantilla de reparación del donante que comprende un polinucleótido que codifica una subunidad de un TCR en un DSB en uno o más genes de PD-1, en donde la subunidad de TCR tiene la capacidad de formar TCR que confieren especificidad a las células T para células tumorales que expresan un antígeno objetivo. En realizaciones particulares, las subunidades tienen una o más sustituciones, deleciones, inserciones o modificaciones de aminoácidos en comparación con la subunidad de origen natural, siempre que las subunidades conserven la capacidad de formar TCR y confieran a las células T transfectadas la capacidad de dirigirse a las células objetivo y participen en la señalización de citoquinas inmunológicamente relevantes. Los TCR manipulados preferiblemente también se unen a las células objetivo que muestran el péptido asociado al tumor relevante con gran avidez, y opcionalmente median la destrucción eficiente de células objetivo que presentan el péptido relevante in vivo.
Los ácidos nucleicos que codifican los TCR manipulados se aíslan preferiblemente de su contexto natural en un cromosoma (de origen natural) de una célula T, y pueden incorporarse en vectores adecuados como se describe en otra parte de la presente. En realizaciones particulares tanto los ácidos nucleicos como los vectores que los comprenden pueden transferirse a una célula, preferiblemente una célula T. Luego las células T modificadas pueden expresar una o más cadenas de un TCR codificado por el ácido nucleico o los ácidos nucleicos transducidos. En realizaciones preferidas, el TCR manipulado es un TCR exógeno porque se introduce en células T que normalmente no expresan el TCR particular. El aspecto esencial de los TCR manipulados es que tienen una gran avidez por un antígeno tumoral presentado por un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) o un componente inmunológico similar. A diferencia de los TCR diseñados, los c A r se manipulan para unirse a antígenos objetivo de una manera independiente del MHC.
El TCR puede expresarse con polipéptidos adicionales unidos a la porción amino-terminal o carboxilo-terminal de la cadena alfa o la cadena beta inventiva de un TCR siempre que el polipéptido adicional unido no interfiera con la capacidad de la cadena alfa o la cadena beta para formar un receptor de células T funcional y el reconocimiento de antígeno dependiente de MHC.
Los antígenos que son reconocidos por los TCR manipulados contemplados en realizaciones particulares incluyen, pero no se limitan a, antígenos de cáncer, incluyendo antígenos tanto en cánceres hematológicos como en tumores sólidos. Los antígenos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, receptor de alfafolato, receptor de alfafolato, 5T4, integrina avp6 , BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, familia EGFR incluyendo ErbB2 (HER2), EGFRvlII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, AchR fetal, FRa, GD2, GD3, Glipicano-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+ NY-ESO-1, IL-11Ra, IL-13Ra2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, mesotelina, Muc1, Muc16, NCAM, ligandos NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivina, TAG72, TEM, VEGFR2 y WT-1.
En una realización, una plantilla de reparación del donante comprende un polinucleótido que codifica un promotor de ARN polimerasa II o un primer péptido viral autoescindible y un polinucleótido que codifica la cadena alfa y/o la cadena beta del TCR manipulado integrado en un gen de PD-1 modificado y/o no funcional.
En una realización, una plantilla de reparación del donante comprende un polinucleótido que codifica un promotor de ARN polimerasa II o un primer péptido viral autoescindible y un polinucleótido que codifica la cadena alfa y la cadena beta del TCR manipulado integrado en un gen de PD-1 modificado y/o no funcional.
En una realización particular, la plantilla de reparación del donante comprende de 5' a 3', un polinucleótido que codifica un primer péptido viral autoescindible, un polinucleótido que codifica la cadena alfa del TCR manipulado, un polinucleótido que codifica un segundo péptido viral autoescindible, y un polinucleótido que codifica la cadena beta del TCR manipulado integrado en un gen de PD-1 modificado y/o no funcional. En tal caso, el otro gen de PD-1 puede ser funcional o puede tener una función disminuida o volverse no funcional por un DSB y reparación por NHEj . En una realización, el otro gen de PD-1 ha sido modificado por una nucleasa manipulada contemplada en la presente y puede tener una función disminuida o volverse no funcional.
En una cierta realización, ambos genes de PD-1 están modificados y tienen una función disminuida o no son funcionales: el primer gen de PD-1 modificado comprende un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un primer péptido viral autoescindible y un polinucleótido que codifica la cadena alfa del TCR manipulado, y el segundo gen de p D-1 modificado comprende un polinucleótido que codifica un segundo péptido viral autoescindible y un polinucleótido que codifica la cadena beta del TCR manipulado.
b. Receptores de antígenos quiméricos (CAR)
En realizaciones particulares, las células efectoras inmunitarias manipuladas contempladas en la presente comprenden uno o más receptores de antígenos quiméricos (CAR). En una realización, las células T se manipulan introduciendo un DSB en uno o más genes de p D-1 en presencia de una plantilla de reparación del donante que codifica un CAR. En una realización particular, se inserta un CAR en un DSB en un único gen de PD-1.
En una realización, las células T manipuladas contempladas en la presente un CAR que no está insertado en un gen de PD-1 y uno o más de un amortiguador de señales inmunosupresor, un receptor flip, una cadena alfa y/o beta de un receptor de células T manipulado (TCR), un receptor de antígeno quimérico (CAR), un receptor Daric o componentes del mismo, o un receptor de citoquina quimérico se inserta en un DSB en uno o más genes de PD-1.
En varias realizaciones, las células T editadas en el genoma expresan CAR que redirigen la citotoxicidad hacia las células tumorales. Los CAR son moléculas que combinan la especificidad basada en anticuerpos para un antígeno objetivo (por ejemplo, antígeno tumoral) con un dominio intracelular activador del receptor de células T para generar una proteína quimérica que muestra una actividad inmunitaria celular antitumoral específica. Como se usa en la presente, el término "quimérico" describe estar compuesto por partes de diferentes proteínas o ADN de diferentes orígenes.
En varias realizaciones, un CAR comprende un dominio extracelular que se une a un antígeno objetivo específico (también denominado dominio de unión o dominio de unión específico de antígeno), un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular. Las características principales de los CAR son su capacidad para redirigir la especificidad de las células efectoras inmunitarias, lo que desencadena la proliferación, la producción de citoquinas, la fagocitosis o la producción de moléculas que pueden mediar en la muerte celular de la célula que expresa el antígeno objetivo de manera independiente de la histocompatibilidad mayor (MHC), explotando la capacidades de direccionamiento específicas de células de anticuerpos monoclonales, ligandos solubles o correceptores específicos de células.
En realizaciones particulares, los CAR comprenden un dominio de unión extracelular que se une específicamente a un polipéptido objetivo, por ejemplo, un antígeno objetivo, expresado en una célula tumoral. Como se usan en la presente, los términos "dominio de unión", "dominio extracelular", "dominio de unión extracelular", "dominio de unión a antígeno", "dominio de unión específico de antígeno" y "dominio de unión específico de antígeno extracelular" se usan indistintamente y proporcionan un receptor quimérico, por ejemplo, un CAR o Daric, con la capacidad de unirse específicamente al antígeno objetivo de interés. Un dominio de unión puede comprender cualquier proteína, polipéptido, oligopéptido o péptido que posea la capacidad de reconocer y unirse específicamente a una molécula biológica (por ejemplo, un receptor de superficie celular o proteína tumoral, lípido, polisacárido, u otra molécula objetivo de la superficie celular, o componente de la misma). Un dominio de unión incluye cualquier compañero de unión producido de manera natural, sintético, semisintético o recombinante para una molécula biológica de interés.
En realizaciones particulares, el dominio de unión extracelular comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.
Un "anticuerpo" se refiere a un agente de unión que es un polipéptido que comprende por lo menos una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera o de cadena pesada que reconoce y se une específicamente a un epítopo de un antígeno objetivo, como un péptido, lípido, polisacárido o ácido nucleico que contiene un determinante antigénico, como los reconocidos por una célula inmunitaria. Los anticuerpos incluyen fragmentos de unión a antígeno, por ejemplo, Camel Ig (un anticuerpo de camélido o un fragmento VHH del mismo), Ig NAR, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, fragmentos F(ab)'3, Fv, anticuerpo Fv de cadena sencilla ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2, minicuerpo, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, proteína Fv estabilizada con disulfuro ("dsFv") y anticuerpo de dominio único (sdAb, nanocuerpo) u otros fragmentos de anticuerpo del mismo. El término también incluye formas manipuladas genéticamente como anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados), anticuerpos heteroconjugados (como anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Consultar también, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3a Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997.
En una realización preferida, el dominio de unión es un scFv.
En otra realización preferida, el dominio de unión es un anticuerpo de camélido.
En realizaciones particulares, el CAR comprende un dominio extracelular que se une a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en: receptor de alfa folato, 5T4, integrina avp6, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, familia EGFR incluyendo ErbB2 (HER2), EGFRvIlI, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, AchR fetal, FRa, GD2, GD3, Glipicano-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+ NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Ra, IL-13Ra2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, mesotelina, Muc1, Muc16, NCAM, ligandos NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivina, TAG72, TEM, VEGFR2 yWT-1.
En realizaciones particulares, los CAR comprenden un dominio de unión extracelular, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un antígeno, en donde el antígeno es un complejo MHC-péptido, como un complejo MHC-péptido de clase I o un complejo MHC-péptido de clase II.
En ciertas realizaciones, los CAR comprenden residuos de conectores entre los varios dominios. Una "secuencia de enlace de región variable" es una secuencia de aminoácidos que conecta una región variable de cadena pesada con una región variable de cadena ligera y proporciona una función espaciadora compatible con la interacción de los dos dominios de unión para que el polipéptido resultante conserve una afinidad de unión específica para la misma molécula objetivo que un anticuerpo que comprende las mismas regiones variables de cadena ligera y pesada. En realizaciones particulares, los CAR comprenden uno, dos, tres, cuatro o cinco o más conectores. En realizaciones particulares, la longitud de un conector es de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 aminoácidos, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 aminoácidos, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos, o cualquier longitud intermedia de aminoácidos. En algunas realizaciones, el conector tiene 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o más aminoácidos de longitud.
En realizaciones particulares, el dominio de unión del CAR va seguido de uno o más "dominios espaciadores", que se refiere a la región que aleja el dominio de unión del antígeno de la superficie de la célula efectora para permitir el contacto célula/célula, la unión al antígeno y la activación adecuados. (Patel et al., Gene Therapy, 1999; 6: 412­ 419). El dominio espaciador puede derivar de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante. En ciertas realizaciones, un dominio espaciador es una parte de una inmunoglobulina incluyendo, pero no limitadas a, una o más regiones constantes de cadena pesada, por ejemplo, CH2 y CH3. El dominio espaciador puede incluir la secuencia de aminoácidos de una región bisagra de inmunoglobulina de origen natural o una región bisagra de inmunoglobulina alterada.
En una realización, el dominio espaciador comprende la CH2 y la CH3 de IgG1, IgG4 o IgD.
En una realización, el dominio de unión de CAR está enlazado a uno o más "dominios bisagra", que desempeñan un papel en el posicionamiento del dominio de unión al antígeno lejos de la superficie de la célula efectora para permitir el contacto célula/célula, la unión al antígeno y la activación apropiados. Un CAR generalmente comprende uno o más dominios bisagra entre el dominio de unión y el dominio transmembrana (TM). El dominio bisagra puede derivarse de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante. El dominio bisagra puede incluir la secuencia de aminoácidos de una región bisagra de inmunoglobulina natural o una región bisagra de inmunoglobulina alterada.
Los dominios bisagra ilustrativos adecuados para su uso en los CAR descritos en la presente incluyen la región bisagra derivada de las regiones extracelulares de proteínas de membrana tipo 1 como CD8a y CD4, que pueden ser regiones bisagra de tipo salvaje de estas moléculas o pueden estar alteradas. En otra realización, el dominio bisagra comprende una región bisagra de CD8a.
En una realización, la bisagra es una bisagra de PD-1 o una bisagra de CD152.
El "dominio transmembrana" es la porción del CAR la que fusiona la porción de unión extracelular y el dominio de señalización intracelulary ancla el CAR a la membrana plasmática de la célula efectora inmunitaria. El dominio TM puede derivarse de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante.
Los dominios TM ilustrativos pueden derivar de (es decir, comprender por lo menos la región o regiones transmembrana de la cadena alfa o beta del receptor de células T, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154, AMN y PD-1.
En una realización, un CAR comprende un dominio TM derivado de CD8a. En otra realización, un CAR contemplado en la presente comprende un dominio TM derivado de CD8a y un conector oligo- o polipeptídico corto, preferiblemente de entre 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de longitud que enlaza el dominio Tm y el dominio de señalización intracelular del CAR. Un conector de glicina-serina proporciona un conector particularmente adecuado.
En realizaciones particulares, un CAR comprende un dominio de señalización intracelular. Un "dominio de señalización intracelular'' se refiere a la parte de un CAR que participa en la transducción del mensaje de unión del CAR efectiva a un antígeno objetivo en el interior de la célula efectora inmunitaria para provocar la función de la célula efectora, por ejemplo, activación, producción de citoquinas, proliferación y actividad citotóxica, incluyendo la liberación de factores citotóxicos a la célula objetivo unida a CAR, u otras respuestas celulares provocadas con la unión del antígeno al dominio de CAR extracelular.
El término "función efectora" se refiere a una función especializada de la célula. La función efectora de la célula T, por ejemplo, puede ser actividad o ayuda citolítica o actividad que incluye la secreción de una citoquina. Por tanto, el término "dominio de señalización intracelular" se refiere a la porción de una proteína que transduce la señal de función efectora y que dirige a la célula para que realice una función especializada. Aunque habitualmente puede emplearse todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario usar todo el dominio. En la medida en que se use una porción truncada de un dominio de señalización intracelular, dicha porción truncada puede usarse en lugar del dominio completo siempre que transduzca la señal de función efectora. Se pretende que el término dominio de señalización intracelular incluya cualquier parte truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de función efectora.
Se sabe que las señales generadas a través del TCR solo son insuficientes para la activación completa de la célula T y que también se requiere una señal secundaria o coestimuladora. Por tanto, puede decirse que la activación de las células T está mediada por dos clases distintas de dominios de señalización intracelular: dominios de señalización primarios que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (por ejemplo, un complejo TCR/CD3) y dominios de señalización coestimuladores que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora. En realizaciones preferidas, un CAR comprende un dominio de señalización intracelular que comprende uno o más "dominios de señalización coestimuladores" y un "dominio de señalización primario".
Los dominios de señalización primarios regulan la activación primaria del complejo TCR ya sea de manera estimuladora o de manera inhibidora. Los dominios de señalización primarios que actúan de manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptores o ITAM.
Los ejemplos ilustrativos de dominios de señalización primarios que contienen ITAM adecuados para su uso en los CAR contemplados en realizaciones particulares incluyen los derivados de FcRy, FcRp, CD3y, CD36, CD3e, CD3Z, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En realizaciones particularmente preferidas, un CAR comprende un dominio de señalización primario de CD3Z y uno o más dominios de señalización coestimuladores. Los dominios de señalización primarios intracelulares y de señalización coestimuladores pueden enlazarse en cualquier orden en tándem al extremo terminal carboxilo del dominio transmembrana.
En realizaciones particulares, un CAR comprende uno o más dominios de señalización coestimuladores para mejorar la eficacia y expansión de las células T que expresan los receptores CAR. Como se usa en la presente, el término "dominio de señalización coestimulador" o "dominio coestimulador" se refiere a un dominio de señalización intracelular de una molécula coestimuladora.
Los ejemplos ilustrativos de tales moléculas coestimuladoras adecuadas para su uso en los CAR contemplados en realizaciones particulares incluyen TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70. En una realización, un CAR comprende uno o más dominios de señalización coestimuladores seleccionados del grupo que consiste en CD28, CD137 y CD134, y un dominio de señalización primario de CD3Z.
En varias realizaciones, el CAR comprende: un dominio extracelular que se une a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en: BCMA, CD19, CSpG4, PSCA, ROR1 y TAG72; un dominio transmembrana aislado de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: CD4, CD8a, CD154 y PD-1; uno o más dominios de señalización coestimuladores intracelulares aislados de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en CD28, CD134 y CD137; y un dominio de señalización aislado de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: FcRy, FcRp, CD3y, CD36, CD3£, CD3Z, CD22, CD79a, CD79b y CD66d.
C. Receptores Daric
En realizaciones particulares, las células efectoras inmunitarias manipuladas comprenden uno o más receptores Daric. Como se usa en la presente, el término "receptor Daric" se refiere a un receptor de antígeno manipulado multicadena. En una realización, las células T se manipulan introduciendo un DSB en uno o más genes de PD-1 en presencia de una plantilla de reparación del donante que codifica uno o más componentes de un Daric. En una realización particular, se inserta un Daric o uno o más de sus componentes en un DSB en un solo gen de PD-1.
En una realización, las células T manipuladas comprenden un Daric que no está insertado en un gen de PD1 y se inserta uno o más de un amortiguador de señales inmunosupresor, un receptor flip, una cadena alfa y/o beta de un receptor de células T (TCR) manipulado, un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor Daric o componentes de los mismos en un DSB en uno o más genes de PD-1.
Los ejemplos ilustrativos de arquitecturas y componentes Daric se divulgan en la Publicación de PCT N° WO2015/017214 y la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 20150266973.
En una realización, una plantilla de reparación del donante comprende los siguientes componentes de Daric: un polipéptido de señalización que comprende un primer dominio de multimerización, un primer dominio transmembrana y uno o más dominios de señalización coestimuladores intracelulares y/o dominios de señalización primarios; y un polipéptido de unión que comprende un dominio de unión, un segundo dominio de multimerización y, opcionalmente, un segundo dominio transmembrana. Un Daric funcional comprende un factor puente que promueve la formación de un complejo receptor Daric en la superficie celular con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización del polipéptido de señalización y el polipéptido de unión.
En realizaciones particulares, el primer y el segundo dominios de multimerización se asocian con un factor puente seleccionado del grupo que consiste en: rapamicina o un rapálogo del mismo, cumermicina o un derivado de la misma, giberelina o un derivado de la misma, ácido abscísico (ABA) o un derivado del mismo, metotrexato o un derivado del mismo, ciclosporina A o un derivado de la misma, FKCsA o un derivado del mismo, ligando sintético de trimetoprima (Tmp) para f Kb P (SLF) o un derivado del mismo, y cualquier combinación de los mismos.
Los ejemplos ilustrativos de análogos de rapamicina (rapálogos) incluyen los divulgados en la Patente de Estados Unidos N° 6.649.595. En ciertas realizaciones, un factor puente es un rapálogo con un efecto inmunosupresor sustancialmente reducido en comparación con la rapamicina. Un "efecto inmunosupresor sustancialmente reducido" se refiere a un rapálogo que tiene por lo menos menos de 0,1 a 0,005 veces el efecto inmunosupresor observado o esperado para una cantidad equimolar de rapamicina, medido clínicamente o en un estudio in vitro apropiado (por ejemplo, inhibición de proliferación de células T) o sustituto in vivo de la actividad inmunosupresora humana. En una realización, "efecto inmunosupresor sustancialmente reducido" se refiere a un rapálogo que tiene un valor de EC50 en dicho ensayo in vitro que es por lo menos de 10a 250 veces mayor que el valor de EC50 observado para la rapamicina en el mismo ensayo.
Otros ejemplos ilustrativos de rapálogos incluyen, pero no se limitan a, everolimus, novolimus, pimecrolimus, ridaforolimus, tacrolimus, temsirolimus, umirolimus y zotarolimus.
En ciertas realizaciones, los dominios de multimerización se asociarán con un factor puente que es una rapamicina o un rapálogo de la misma. Por ejemplo, el primero y el segundo dominios de multimerización son un par seleccionado de FκΒP y FRB. Los dominios FRB son regiones polipeptídicas ("dominios" de proteínas) que son capaces de formar un complejo tripartito con una proteína FκΒP y rapamicina o rapálogo de la misma. Los dominios FRB están presentes en varias proteínas de origen natural, incluyendo las proteínas mTOR (también denominadas en la bibliografía como FRAP, RAPT1 o RAFT) de humanos y otras especies; proteínas de levadura que incluyen Tor1 y Tor2; y un homólogo FRAP de Candida. La información referente a las secuencias de nucleótidos, la clonación y otros aspectos de estas proteínas ya se conoce en la técnica. Por ejemplo, un número de registro de secuencia de proteína para un mTOR humano es el N° de registro de GenBank L34075.1 (Brown et al., Nature 369:756, 1994).
Los dominios de FRB adecuados para su uso en realizaciones particulares contempladas en la presente generalmente contienen por lo menos de aproximadamente 85 a aproximadamente 100 residuos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, una secuencia de aminoácidos de FRB para su uso en las proteínas de fusión de esta divulgación comprenderá una secuencia de 93 aminoácidos Ile-2021 a Lys-2113 y una mutación de T2098L, sobre la base de la secuencia de aminoácidos del N° de registro de GenBank L34075.1. Un dominio de FRB para su uso en Darics contemplados en realizaciones particulares será capaz de unirse a un complejo de una proteína FκΒP unida a rapamicina o un rapálogo de la misma. En ciertas realizaciones, una secuencia peptídica de un dominio de FRB comprende (a) una secuencia peptídica de origen natural que abarca por lo menos la región de 93 aminoácidos indicada de mTOR humano o regiones correspondientes de proteínas homólogas; (b) una variante de un FRB de origen natural en el que se han eliminado, insertado o sustituido hasta aproximadamente diez aminoácidos, o de aproximadamente de 1 a aproximadamente 5 aminoácidos o de aproximadamente de 1 a aproximadamente 3 aminoácidos, o en algunas realizaciones solo un aminoácido, del aminoácido de origen natural el péptido; o (c) un péptido codificado por una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar selectivamente con una molécula de ADN que codifica un dominio de FRB de origen natural o por una secuencia de ADN que sería capaz, salvo por la degeneración del código genético, de hibridar selectivamente con un molécula de ADN que codifica un dominio FRB natural.
Las FκΒP (proteínas de unión a FK506) son los receptores citosólicos para los macrólidos, como FK506, FK520 y la rapamicina, y están altamente conservadas entre especies. Las f Kb P son proteínas o dominios de proteínas que son capaces de unirse a la rapamicina o a un rapálogo de la misma y formar además un complejo tripartito con una proteína que contiene FRB o una proteína de fusión. A un dominio de FκΒP también puede hacerse referencia como "dominio de unión a rapamicina". La información referente a las secuencias de nucleótidos, la clonación y otros aspectos de varias especies de FκΒP se conoce en la técnica (consultar, por ejemplo, Staendart et al., Nature 346:671, 1990 (FκΒP12 humano); Kay, Biochem. J. 314:361, 1996). También se conocen en la técnica las proteínas de FκΒP homólogas en otras especies de mamíferos, en levaduras y en otros organismos y pueden usarse en las proteínas de fusión divulgadas en la presente. Un dominio de FκΒP contemplado en realizaciones particulares será capaz de unirse a la rapamicina o un rapálogo de la misma y participar en un complejo tripartito con una proteína que contiene FRB (como puede determinarse mediante cualquier medio, directo o indirecto, para detectar dicha unión).
Los ejemplos ilustrativos de dominios de FκΒP adecuados para su uso en un Daric contemplado en realizaciones particulares incluyen, pero no se limitan a: una secuencia peptídica de FκΒP de origen natural, preferiblemente aislada de la proteína FκΒP12 humana (N° de registro de GenBank AAA58476.1) o una secuencia peptídica aislada de la misma, de otra FκΒP humana, de una FκΒP murina o de otro mamífero, o de alguna otra FκΒP animal, de levadura o fúngica; una variante de una secuencia de FκΒP de origen natural en la que se han eliminado, insertado o sustituido hasta aproximadamente diez aminoácidos, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 aminoácidos o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 aminoácidos, o en algunas realizaciones solo un aminoácido, del péptido de origen natural; o una secuencia peptídica codificada por una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar selectivamente con una molécula de a Dn que codifica un FκΒP de origen natural o por una secuencia de ADN que sería capaz, salvo por la degeneración del código genético, de hibridar selectivamente con una molécula de ADN que codifica un FκΒP de origen natural.
Otros ejemplos ilustrativos de pares de dominios de multimerización adecuados para su uso en un Daric contemplado en realizaciones particulares incluyen, pero no se limitan a, FκΒP y FRB, FκΒP y calcineurina, FκΒP y ciclofilina, FκΒP y DHFR bacteriano, calcineurina y ciclofilina, PYL1 y ABI1, o GIB1 y GAI, o variantes de los mismos.
En otras realizaciones más, un factor antipuente bloquea la asociación de un polipéptido de señalización y un polipéptido de unión con el factor de puente. Por ejemplo, podrían usarse ciclosporina o FK506 como factores antiuente para titular la rapamicina y, por lo tanto, detener la señalización ya que solo se une un dominio de multimerización. En ciertas realizaciones, un factor antipuente (por ejemplo, ciclosporina, FK506) es un agente inmunosupresor. Por ejemplo, puede usarse un factor antipuente inmunosupresor para bloquear o minimizar la función de los componentes Daric contemplados en realizaciones particulares y al mismo tiempo inhibir o bloquear una respuesta inflamatoria no deseada o patológica en un entorno clínico.
En una realización, el primer dominio de multimerización comprende FRB T2098L, el segundo dominio de multimerización comprende FKΒP12 y el factor de puente es rapálogo de AP21967.
En otra realización, el primer dominio de multimerización comprende FRB, el segundo dominio de multimerización comprende FKΒP12 y el factor puente es rapamicina, temsirolimus o everolimus.
En realizaciones particulares, un polipéptido de señalización, un primer dominio transmembrana y un polipéptido de unión comprende un segundo dominio transmembrana o anclaje GPI. Los ejemplos ilustrativos del primer y el segundo dominios transmembrana se aíslan de un polipéptido seleccionado independientemente del grupo que consiste en: CD38, CD3e, CD3y, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154, AMNyPD-1.
En una realización, un polipéptido de señalización comprende uno o más dominios de señalización coestimuladores intracelulares y/o dominios de señalización primarios.
Los ejemplos ilustrativos de dominios de señalización primarios adecuados para su uso en componentes de señalización Daric contemplados en realizaciones particulares incluyen los derivados de FcRy, FcRp, CD3y, CD38, CD3e, CD3Z, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En realizaciones particularmente preferidas, un componente de señalización de Daric comprende un dominio de señalización primario de CD3Z y uno o más dominios de señalización coestimuladores. Los dominios de señalización primaria intracelular y de señalización coestimuladora pueden enlazarse en cualquier orden en tándem al extremo terminal carboxilo del dominio transmembrana.
Los ejemplos ilustrativos de tales moléculas coestimuladoras adecuadas para su uso en componentes de señalización Daric contemplados en realizaciones particulares incluyen TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6 , TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70. En una realización, un componente de señalización de Daric comprende uno o más dominios de señalización coestimuladores seleccionados del grupo que consiste en CD28, CD137 y CD134, y un dominio de señalización primario de CD3Z.
En realizaciones particulares, un componente de unión a Daric comprende un dominio de unión. En una realización, el dominio de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende por lo menos una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera o de cadena pesada que reconoce y se une específicamente a un epítopo de un antígeno objetivo como un péptido, lípido, polisacárido o ácido nucleico que contiene un determinante antigénico, como los reconocidos por una célula inmunitaria. Los anticuerpos incluyen fragmentos de unión a antígeno, por ejemplo, Camel Ig (un anticuerpo de camélido o un fragmento VHH del mismo), Ig NAR, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, fragmentos F(ab)'3, Fv, anticuerpo Fv de cadena sencilla ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2, minicuerpo, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, proteína Fv estabilizada con disulfuro ("dsFv") y anticuerpo de dominio único (sdAb, nanocuerpo) u otros fragmentos de anticuerpo de los mismos. El término también incluye formas manipuladas genéticamente como anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados), anticuerpos heteroconjugados (como anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Consultar también, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3a Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997.
En una realización preferida, el dominio de unión es un scFv.
En otra realización preferida, el dominio de unión es un anticuerpo de camélido.
En realizaciones particulares, el componente de unión a Daric comprende un dominio extracelular que se une a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en: receptor de alfa folato, 5T4, integrina avp6, BCMA, B7-H3, B7-H6 , CAIX, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, familia EGFR incluyendo ErbB2 (HER2), EGFRvlII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, AchR fetal, FRa, GD2, GD3, Glipicano-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Ra, IL-13Ra2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, mesotelina, Muc1, Muc16, NCAM, ligandos NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivina, TAG72, TEM, VEGFR2 y WT-1.
En una realización, el componente de unión a Daric comprende un dominio extracelular, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un complejo MHC-péptido, como un complejo MHC-péptido de clase I o un complejo MHC-péptido de clase II.
En realizaciones particulares, los componentes Daric contemplados en la presente comprenden un conector o espaciador que conecta dos proteínas, polipéptidos, péptidos, dominios, regiones o motivos. En ciertas realizaciones, un conector comprende de aproximadamente dos a aproximadamente 35 aminoácidos, o de aproximadamente cuatro a aproximadamente 20 aminoácidos o de aproximadamente ocho a aproximadamente 15 aminoácidos o de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 aminoácidos. En otras realizaciones, un espaciador puede tener una estructura particular, como un dominio CH2CH3 de anticuerpo, un dominio bisagra o similar. En una realización, un espaciador comprende los dominios CH2 y CH3 de IgG1, IgG4 o IgD.
En realizaciones particulares, los componentes de Daric contemplados en la presente comprenden uno o más "dominios bisagra", que desempeñan un papel en el posicionamiento de los dominios para permitir el contacto célula/célula, la unión al antígeno y la activación apropiados. Un Daric puede comprender uno o más dominios bisagra entre el dominio de unión y el dominio de multimerización y/o el dominio transmembrana (TM) o entre el dominio de multimerización y el dominio transmembrana. El dominio bisagra puede derivarse de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante. El dominio bisagra puede incluir la secuencia de aminoácidos de una región bisagra de inmunoglobulina de origen natural o una región bisagra de inmunoglobulina alterada. En una realización particular, la bisagra es una bisagra de CD8a o una bisagra de CD4.
En una realización, un Daric comprende un polipéptido de señalización que comprende un primer dominio de multimerización de FRB T2098L, un dominio transmembrana de CD8, un dominio coestimulador de 4-1BB y un dominio de señalización primario de CD3Z; el polipéptido de unión comprende un scFv que se une a CD19, un segundo dominio de multimerización de FKΒP12 y un dominio transmembrana de CD4; y el factor puente es rapálogo de AP21967.
En una realización, un Daric comprende un polipéptido de señalización que comprende un primer dominio de multimerización de FRB, un dominio transmembrana de CD8, un dominio coestimulador de 4-1BB y un dominio de señalización primario de CD3Z; el polipéptido de unión comprende un scFv que se une a CD19, un segundo dominio de multimerización de FKΒP12 y un dominio transmembrana de CD4; y el factor puente es rapamicina, temsirolimus o everolimus.
d. Zetaquinas
En realizaciones particulares, las células efectoras inmunitarias modificadas contempladas en la presente comprenden uno o más receptores de citoquinas quiméricos. En una realización, las células T se manipulan introduciendo un DSB en uno o más genes de PD-1 en presencia de una plantilla de reparación del donante que codifica un CAR. En una realización particular, se inserta un receptor de citoquinas quimérico en un DSB en un solo gen de PD-1.
En una realización, las células T manipuladas contempladas en la presente son un receptor de citoquinas quimérico que no está insertado en un gen de PD-1 y uno o más de un amortiguador de señales inmunosupresor, un receptor flip, una cadena alfa y/o beta de un receptor de células T (TCR) manipulado, un receptor de antígeno quimérico (CAR), un receptor Daric o componentes de los mismos, o un receptor de citoquina quimérico se inserta en un DSB en uno o más genes de PD-1.
En varias realizaciones, las células T editadas en el genoma expresan un receptor de citoquinas quimérico que redirige la citotoxicidad hacia las células tumorales. Las zetaquinas son inmunorreceptores transmembrana quiméricos que comprenden un dominio extracelular que comprende un ligando de receptor soluble enlazado a una región de soporte capaz de anclar el dominio extracelular a una superficie celular, una región transmembrana y un dominio de señalización intracelular. Las zetaquinas, cuando se expresan en la superficie de los linfocitos T, dirigen la actividad de las células T a aquellas células que expresan un receptor para el cual es específico el ligando del receptor soluble. Los inmunorreceptores quiméricos de zetaquina redirigen la especificidad antigénica de las células T, con aplicación al tratamiento de una variedad de cánceres, particularmente a través de los sistemas de citoquinas autocrinas/paracrinas utilizadas por la enfermedad maligna humana.
En realizaciones particulares, el receptor de citoquinas quimérico comprende una citoquina inmunosupresora o una variante de unión al receptor de citoquinas del mismo, un conector, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular.
En realizaciones particulares, la citoquina o la variante de unión al receptor de citoquinas de la misma se selecciona del grupo que consiste en: interleucina-4 (IL-4), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8), interleucina-10 (IL-10) e interleucina-13 (IL-13).
En ciertas realizaciones, el conector comprende un dominio CH2CH3, un dominio bisagra o similar. En una realización, un conector comprende los dominios CH2 y CH3 de IgG1, IgG4 o IgD. En una realización, un conector comprende un dominio bisagra de CD8a o CD4.
En realizaciones particulares, el dominio transmembrana se selecciona del grupo que consiste en: la cadena alfa o beta del receptor de células T, CD36, CD3e, CD3y, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154, AMN y PD-1.
En realizaciones particulares, el dominio de señalización intracelular se selecciona del grupo que consiste en: un dominio de señalización primario que contiene ITAM y/o un dominio coestimulador.
En realizaciones particulares, el dominio de señalización intracelular se selecciona del grupo que consiste en: FcRy, FcRp, CD3y, CD36, CD3e, CD3Z, CD22, CD79a, CD79b y CD66d.
En realizaciones particulares, el dominio de señalización intracelular se selecciona del grupo que consiste en: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70.
En una realización, un receptor de citoquinas quimérico comprende uno o más dominios de señalización coestimuladores seleccionados del grupo que consiste en CD28, CD137 y CD134, y un dominio de señalización primario de CD3Z.
F. POLIPÉPTIDOS
En la presente se contemplan varios polipéptidos incluyendo, pero no limitados a, variantes de endonucleasas homing, megaTAL y polipéptidos de fusión. En realizaciones de la invención, un polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 60-63. "Polipéptido", "fragmento de polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente, a menos que se especifique lo contrario, y de acuerdo con el significado convencional, es decir, como una secuencia de aminoácidos. En una realización, un "polipéptido" incluye polipéptidos de fusión y otras variantes. Los polipéptidos pueden prepararse usando cualquiera de una variedad de técnicas recombinantes y/o sintéticas bien conocidas. Los polipéptidos no están limitados a una longitud específica, por ejemplo, pueden comprender una secuencia de proteína de longitud completa, un fragmento de una proteína de longitud completa o una proteína de fusión, y pueden incluir modificaciones postraduccionales del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como de origen no natural.
Una "proteína aislada", "péptido aislado" o "polipéptido aislado" y similares, como se usa en la presente, se refieren a la síntesis, aislamiento y/o purificación in vitro de una molécula de péptido o polipéptido de un entorno celular y de la asociación con otros componentes de la célula, es decir, no se asocia significativamente con sustancias in vivo.
Los ejemplos ilustrativos de polipéptidos contemplados en realizaciones particulares incluyen, pero no se limitan a, variantes de endonucleasas homing, megaTAL, nucleasas de procesamiento de extremos, polipéptidos de fusión y variantes de los mismos.
Los polipéptidos incluyen "variantes de polipéptidos". Las variantes de polipéptidos pueden diferir de un polipéptido de origen natural en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones de aminoácidos. Tales variantes pueden producirse de manera natural o pueden generarse sintéticamente, por ejemplo, modificando uno o más aminoácidos de las secuencias de polipéptidos anteriores. Por ejemplo, en realizaciones particulares, puede ser deseable mejorar las propiedades biológicas de una endonucleasa homing, megaTAL o similar que se une y escinde un sitio objetivo en el gen de PD-1 humano mediante la introducción de una o más sustituciones, deleciones, adiciones y /o inserciones en el polipéptido. En realizaciones particulares, los polipéptidos incluyen polipéptidos que tienen por lo menos aproximadamente un 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,85%, 86%, 87%, 88%,89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de aminoácidos con cualquiera de las secuencias de referencia contempladas en la presente, típicamente donde la variante mantiene por lo menos una actividad biológica de la secuencia de referencia.
Las variantes de polipéptidos incluyen "fragmentos de polipéptidos" biológicamente activos. Los ejemplos ilustrativos de fragmentos de polipéptidos biológicamente activos incluyen dominios de unión a ADN, dominios de nucleasa y similares. Como se usa en la presente, el término "fragmento biológicamente activo" o "fragmento biológicamente activo mínimo" se refiere aun fragmento de polipéptido que retiene por lo menos el 100%, por lo menos el 90%, por lo menos el 80%, por lo menos el 70%, por lo menos el 60%, por lo menos el 50%, por lo menos el 40%, por lo menos el 30%, por lo menos el 20%, por lo menos el 10% o por lo menos el 5% de la actividad del polipéptido de origen natural. En realizaciones preferidas, la actividad biológica es la afinidad de unión y/o la actividad de escisión para una secuencia objetivo. En ciertas realizaciones, un fragmento de polipéptido puede comprender una cadena de aminoácidos de por lo menos 5 a aproximadamente 1700 aminoácidos de longitud. Se apreciará que en ciertas realizaciones, los fragmentos tienen por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700 o más aminoácidos de longitud. En realizaciones particulares, un polipéptido comprende un fragmento biológicamente activo de una variante de endonucleasa homing. En realizaciones particulares, los polipéptidos expuestos en la presente pueden comprender uno o más aminoácidos indicados como "X". "X", si lo hay en un una SEQ ID NO de aminoácido, se refiere a cualquier aminoácido. Uno o más residuos de "X" pueden estar presentes en los extremos N- y C-terminales de una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO particulares contempladas en la presente. Si no hay aminoácidos "X", la secuencia de aminoácidos restante expuesta en la SEQ ID No puede considerarse un fragmento biológicamente activo.
En realizaciones particulares, un polipéptido comprende un fragmento biológicamente activo de una variante de endonucleasa homing, por ejemplo, las SeQ ID NO: 60-63, o un megaTAL (las SEQ ID NO: 15-23 y 64). El fragmento biológicamente activo puede comprender un truncamiento N-terminal y/o un truncamiento C-terminal. En una realización particular, un fragmento biológicamente activo carece o comprende una deleción de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos N-terminales de una variante de endonucleasa homing en comparación con una secuencia de endonucleasa homing de tipo salvaje correspondiente, más preferiblemente una deleción de los 4 aminoácidos N-terminales de una variante de endonucleasa homing en comparación con una secuencia de endonucleasa homing de tipo salvaje correspondiente. En una realización particular, un fragmento biológicamente activo carece o comprende una deleción de los 1, 2, 3, 4, o 5 aminoácidos C-terminales de una variante de endonucleasa homing en comparación con una secuencia de endonucleasa homing de tipo salvaje correspondiente, más preferiblemente una deleción de los 2 aminoácidos C-terminales de una variante de endonucleasa homing en comparación con una secuencia de endonucleasa homing de tipo salvaje correspondiente. En una realización preferida particular, un fragmento biológicamente activo carece o comprende una deleción de los 4 aminoácidos N-terminales y 2 aminoácidos C-terminales de una variante de endonucleasa homing en comparación con una secuencia de endonucleasa homing de tipo salvaje correspondiente.
En una realización particular, una variante I-OnuI comprende una deleción de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de los siguientes aminoácidos N-terminales: M, A, Y, M, S, R, R, E; y/o una deleción de los siguientes 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos C-terminales: R, G, S, F, V.
En una realización particular, una variante I-OnuI comprende una deleción o sustitución de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de los siguientes aminoácidos N-terminales: M, A, Y, M, S, R, R, E; y/o una deleción o sustitución de los siguientes 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos C-terminales: R, G, S, F, V.
En una realización particular, una variante I-OnuI comprende una deleción de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de los siguientes aminoácidos N-terminales: M, A, Y, M, S, R, R,E; y/o una deleción de los siguientes 1 o 2 aminoácidos C-terminales: F, V.
En una realización particular, una variante I-OnuI comprende una deleción o sustitución de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de los siguientes aminoácidos N-terminales: M, A, Y, M, S, R, R, E; y/o una deleción o sustitución de los siguientes 1 o 2 aminoácidos C-terminales: F, V.
Como se ha indicado anteriormente, los polipéptidos pueden alterarse de varias maneras, incluyendo sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. En la técnica generalmente se conocen los métodos para dichas manipulaciones. Por ejemplo, las variantes de secuencias de aminoácidos de un polipéptido de referencia pueden prepararse mediante mutaciones en el ADN. Los métodos para la mutagénesis y las alteraciones de secuencias de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Consultar, por ejemplo, Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), Patente de Estados Unidos N°. 4,873,192, Watson, J. D. et al., (Molecular Biology of the Gene, Cuarta Edición, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987) y las referencias citadas en los mismos. Orientación sobre las sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan a la actividad biológica de la proteína de interés pueden encontrarse en el modelo de Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).
En ciertas realizaciones, una variante contendrá una o más sustituciones conservadoras. Una "sustitución conservadora" es aquella en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de tal manera que un experto en la técnica de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanecieran sustancialmente sin cambios. Pueden realizarse modificaciones en la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos contemplados en realizaciones particulares, los polipéptidos incluyen polipéptidos que tienen por lo menos aproximadamente y todavía obtienen una molécula funcional que codifica un polipéptido variante o derivado con características deseables. Cuando se desea alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para crear un polipéptido variante equivalente, o incluso mejorado, un experto en la técnica, por ejemplo, puede cambiar uno o más de los codones de la secuenciad e ADN codificante, por ejemplo de acuerdo con la Tabla 1.
TABLA 1- n min i
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En la técnica puede encontrarse orientación para determinar qué residuos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o eliminarse sin suprimir la actividad biológica usando programas informáticos bien conocidos, como el software DNASTAR, DNA Strider, Geneious, Mac Vector o Vector NTI. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos en las variantes de proteínas divulgadas en la presente son cambios de aminoácidos conservadores, es decir, sustituciones de aminoácidos cargados o no cargados de manera similar. Un cambio conservador de aminoácidos implica la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos de origen natural generalmente se dividen en cuatro familias: aminoácidos ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En un péptido o proteína, los expertos en esta técnica conocen las sustituciones conservadoras adecuadas de aminoácidos y, en general, pueden realizarse sin alterar la actividad biológica de una molécula resultante. Los expertos en la técnica reconocerán que, en general, las sustituciones individuales de aminoácidos en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (consultar, por ejemplo, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4a Edición, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224).
En una realización, cuando se desea la expresión de dos o más polipéptidos, las secuencias de polinucleótidos que los codifican pueden separarse mediante una secuencia IRES como se divulga en otra parte de la presente.
Los polipéptidos contemplados en realizaciones particulares incluyen polipéptidos de fusión. En realizaciones particulares, se proporcionan polipéptidos de fusión y polinucleótidos que codifican polipéptidos de fusión. Los polipéptidos de fusión y las proteínas de fusión se refieren a un polipéptido que tiene por lo menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez segmentos de polipéptidos.
En otra realización, pueden expresarse dos o más polipéptidos como una proteína de fusión que comprende una o más secuencias de polipéptidos autoescindibles como se divulga en otra parte de la presente.
En una realización, una proteína de fusión contemplada en la presente comprende uno o más dominios de unión a ADN y una o más nucleasas, y uno o más conectores y/o polipéptidos autoescindibles.
En una realización, una proteína de fusión contemplada en la presente comprende una variante de nucleasa; un conector o péptido autoescindible; y una enzima de procesamiento de extremos que incluye pero no se limita a una exonucleasa 5'-3', una exonucleasa alcalina 5'-3' y una exonucleasa 3'-5' (por ejemplo, Trex2).
Los polipéptidos de fusión pueden comprender uno o más dominios o segmentos de polipéptidos que incluyen, pero no se limitan a, péptidos señal, dominios peptídicos permeables a células (CPP), dominios de unión a ADN, dominios de nucleasas, etc., etiquetas epitópicas (por ejemplo, proteína de unión a maltosa ("MBP"), glutatión S transferasa (GST), HIS6, MYC, FLAG, V5, VSV-G y HA), conectores de polipéptidos y señales de escisión de polipéptidos. Los polipéptidos de fusión típicamente se enlazan del extremo C-terminal al extremo N-terminal, aunque también pueden enlzarse del extremo C-terminal al extremo C-terminal, del extremo N-terminal al extremo N-terminal o del extremo N-terminal al extremo C-terminal. En realizaciones particulares, los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden. Los polipéptidos de fusión o las proteínas de fusión también pueden incluir variantes modificadas de manera conservadora, variantes polimórficas, alelos, mutantes, subsecuencias y homólogos entre especies, siempre que se conserve la actividad deseada del polipéptido de fusión. Los polipéptidos de fusión pueden producirse mediante métodos de síntesis química o mediante enlace químico entre las dos fracciones o, en general, pueden prepararse usando otras técnicas estándar. Las secuencias de ADN ligadas que comprenden el polipéptido de fusión se enlazan operativamente a elementos de control transcripcional o traduccional adecuados, como se describe en otra parte de la presente.
Los polipéptidos de fusión pueden comprender opcionalmente un conector que puede usarse para enlazar uno o más polipéptidos o dominios dentro de un polipéptido. Puede emplearse una secuencia peptídica conectora para separar dos o más componentes polipeptídicos cualquiera a una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliegue en sus estructuras secundarias y terciarias apropiadas para permitir que los dominios polipeptídicos ejerzan sus funciones deseadas. Dicha secuencia conectora peptídica se incorpora al polipéptido de fusión usando técnicas estándar en la técnica. Las secuencias conectoras peptídicas adecuadas pueden elegirse basándose en los siguientes factores: (1 ) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que podría interaccionar con epítopos funcionales en el primer y el segundo polipéptidos; y (3) la falta de residuos hidrófobos o cargados que puedan reaccionar con los epítopos polipeptídicos funcionales. Las secuencias conectoras peptídicas preferidas contienen residuos de Gly, Asn y Ser. En la secuencia conectora también pueden usarse otros aminoácidos casi neutros, como Thr y Ala. Las secuencias de aminoácidos que pueden emplearse de manera útil como conectores incluyen las divulgadas en Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; la Patente de Estados Unidos N° 4.935.233 y la Patente de Estados Unidos N° 4.751.180. Las secuencias conectoras no se requieren cuando un segmento de polipéptido de fusión particular contiene regiones de aminoácidos N-terminales no esenciales que pueden usarse para separar los dominios funcionales y evitar la interferencia estérica. Los conectores preferidos son típicamente subsecuencias de aminoácidos flexibles que se sintetizan como parte de una proteína de fusión recombinante. Los polipéptidos conectores pueden tener entre 1 y 200 aminoácidos de longitud, entre 1 y 100 aminoácidos de longitud o entre 1 y 50 aminoácidos de longitud, incluyendo todos los valores enteros intermedios.
Los conectores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, las siguientes secuencias de aminoácidos: polímeros de glicina (G)n; polímeros de glicina-serina (G1-5 S i-5)n, donde n es un número entero de por lo menos uno, dos, tres, cuatro o cinco; polímeros de glicina-alanina; polímeros de alanina-serina; GGG (SEQ ID NO: 69); DGGGS (SEQ ID NO: 70); TGEKP (SEQ ID NO: 71) (consultar, por ejemplo, Liu et al., PNAS 5525-5530 (1997)); GGRR (SEQ ID NO: 72) (Pomerantz et al. 1995, supra); (GGGGS)n en donde n = 1, 2, 3, 4 o 5 (SEQ ID NO: 73) (Kim et al., PNAS 93, 1156-1160 (1996); EGKSSGSGSESKVD (SEQ ID NO: 74) (Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
87:1066-1070); KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 75) (Bird et al., 1988, Science 242:423-426), GGRRGGGS (SEQ ID NO: 76); LRQRDGERP (SEQ ID NO: 77); LRQKDGGGSERP (SEQ ID NO: 78); LRQKD(GGGS)2ERP (SEQ ID NO: 79). Alternativamente, los conectores flexibles pueden diseñarse racionalmente usando un programa informático capaz de modelar tanto los sitios de unión al ADN como los mismos péptidos (Desjarlais & Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993), PNAS 91:11099-11103 (1994) o por métodos de presentación en fagos.
Los polipéptidos de fusión pueden comprender además una señal de escisión polipeptídica entre cada uno de los dominios polipeptídicos descritos en la presente o entre un marco de lectura abierto endógeno y un polipéptido codificado por una plantilla de reparación de donante. Además, puede ponerse un sitio de escisión de polipéptido en cualquier secuencia de péptido conector. Las señales de escisión de polipéptidos ejemplares incluyen sitios de reconocimiento de escisión de polipéptidos, como sitios de escisión de proteasas, sitios de escisión de nucleasas (por ejemplo, sitios de reconocimiento de enzimas de restricción raros, sitios de reconocimiento de ribozimas de autoescisión) y oligopéptidos virales de autoescisión (consultar deFelipe y Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26).
Los sitios de escisión de proteasas adecuados y los péptidos de autoescisión son conocidos por los expertos en la técnica (consultar, por ejemplo, en Ryan et al., 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722; Scymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5, 589-594). Los sitios de escisión de proteasas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los sitios de escisión de proteasas de potyvirus NIa (por ejemplo, proteasa del virus del grabado del tabaco), proteasas de potyvirus HC, proteasas de potyvirus P1 (P35), proteasas de byovirus NIa, proteasas codificadas por ARN-2 de byovirus, proteasas L de afthovirus, proteasas de enterovirus 2A, proteasas de rhinovirus 2A, proteasas de picoma 3C, proteasas de comovirus 24K, proteasas de nepovirus 24K, proteasa tipo 3C de RTSV (virus esférico del tungro del arroz), proteasa tipo 3C de PYVF (virus de la mancha amarilla de la pastinaca), heparina, trombina, factor Xa y enteroquinasa. Debido a su alta rigurosidad de escisión, en una realización se prefieren los sitios de escisión de la proteasa TEV (virus del grabado del tabaco), por ejemplo, EXXYXQ (G/S) (SEQ ID NO: 80), por ejemplo, ENLYFQG (SEQ ID NO: 81) y ENLYFQS (SEQ ID NO: 82), en donde X representa cualquier aminoácido (la escisión por TEV se produce entre Q y G o entre Q y S).
En ciertas realizaciones, el sitio polipeptídico de autoescisión comprende un sitio, secuencia o dominio 2A o similar a 2A (Donnelly et al., 2001. J. Gen. Virol. 82:1027-1041). En una realización particular, el péptido 2A viral es un péptido 2A de aftovirus, un péptido 2A de potyvirus o un péptido 2A de cardiovirus.
En una realización, el péptido viral 2A se selecciona del grupo que consiste en: un péptido 2A del virus de la fiebre aftosa (FMDV), un péptido 2a del virus de la rinitis equina A (ERAV), un péptido 2A del virus de la aftosa (TaV), un péptido 2A de teschovirus-1 porcino (PTV-1), un péptido 2A de theilovirus y un péptido 2A de virus de encefalomiocarditis.
En la Tabla 2 se proporcionan ejemplos ilustrativos de sitios 2A.
TABLA 2: L i i 2A m l r in l n l i i n n i :
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continuación
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G. POLINUCLEOTIDOS
En realizaciones particulares, se proporcionan polinucleótidos que codifican una o más variantes de endonucleasas homing, megaTAL, enzimas de procesamiento de extremos y polipéptidos de fusión contemplados en la presente. Como se usa en la presente, los términos "polinucleótido" o "ácido nucleico" se refieren a ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) e híbridos de ADN/ARN. Los polinucleótidos pueden ser de cadena sencilla o de cadena doble y recombinantes, sintéticos o aislados. Los polinucleótidos incluyen, pero no se limitan: pre-ARN mensajero (pre-ARNm), ARN mensajero (ARNm), ARN, ARN interferente corto (ARNip), ARN de horquilla corta (ARNhc), microARN (miARN), ribozimas, ARN genómico (ARNg), ARN de cadena positiva (ARN(+)), ARN de cadena negativa (ARN(-)), ARNtracr, ARNcr, ARN guía simple (ARNsg), ARN sintético, ARNm sintético, ADN genómico (ADNg), ADN amplificado por PCR, ADN complementario (ADNc), ADN sintético o ADN recombinante. Los polinucleótidos se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de por lo menos 5, por lo menos 10, por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 25, por lo menos 30, por lo menos 40, por lo menos 50, por lo menos 100, por lo menos 200, por lo menos 300, por lo menos 400, por lo menos 500, por lo menos 1000, por lo menos 5000, por lo menos 10000, o por lo menos 15000 o más nucleótidos de longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, así como todas las longitudes intermedias. Se entenderá fácilmente que "longitudes intermedias", en este contexto, significa cualquier longitud entre los valores citados, como 6, 7, 8, 9, etc., 101, 102, 103, etc.; 151, 152, 153, etc.; 201, 202, 203, etc. En realizaciones particulares, los polinucleótidos o variantes tienen por lo menos o aproximadamente el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de referencia.
En realizaciones particulares, los polinucleótidos pueden estar optimizados con codones. Como se usa en la presente, el término " optimizado con codón" se refiere a la sustitución de codones en un polinucleótido que codifica un polipéptido para aumentar la expresión, la estabilidad y/o la actividad del polipéptido. Los factores que influyen en la optimización de codones incluyen, pero no se limitan a uno o más de: (i) variación de desplazamientos de codones entre dos o más organismos o genes o tablas de desplazamiento construidas sintéticamente, (ii) variación en el grado de desplazamiento codones dentro de un organismo, gen o conjunto de genes, (iii) variación sistemática de codones, incluido el contexto, (iv) variación de codones de acuerdo con sus ARNt decodificadores, (v) variación de codones de acuerdo con el % de GC, ya sea en general o en una posición del triplete, (vi) variación en el grado de similitud con una secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia de origen natural, (vii) variación en el punto de corte de frecuencia del codón, (viii) propiedades estructurales de los ARNm transcritos a partir de la secuencia de ADN, (ix) conocimiento previo sobre la función de las secuencias de ADN en las que se va a basar el diseño del conjunto de sustitución de codones, (x) variación sistemática de conjuntos de codones para cada aminoácido, y/o (xi) eliminación aislada de sitios de inicio de traducción falsos.
Como se usa en la presente, el término "nucleótido" se refiere a una base nitrogenada heterocíclica en un enlace N-glicosídico con un azúcar fosforilado. Se entiende que los nucleótidos incluyen bases naturales y una amplia variedad de bases modificadas reconocidas en la técnica. Tales bases generalmente están localizadas en la posición 1' de una fracción de azúcar de nucleótido. Los nucleótidos generalmente comprenden una base, azúcar y un grupo fosfato. En el ácido ribonucleico (ARN), el azúcar es una ribosa, y en el ácido desoxirribonucleico (ADN), el azúcar es una desoxirribosa, es decir, un azúcar que carece de un grupo hidroxilo que está presente en la ribosa. Las bases nitrogenadas naturales ejemplares incluyen las purinas, adenosina (A) y guanidina (G), y las pirimidinas, citidina (C) y timidina (T) (o en el contexto del ARN, uracilo (U)). El átomo C-1 de la desoxirribosa está unido al N-1 de una pirimidina o al N-9 de una purina. Los nucleótidos habitualmente son mono-, di- o trifosfatos. Los nucleótidos pueden estar no modificados o modificados en la fracción de azúcar, fosfato y/o base (también denominados indistintamente análogos de nucleótidos, derivados de nucleótidos, nucleótidos modificados, nucleótidos no naturales y nucleótidos no estándar; consultar, por ejemplo, la WO 92/07065 y la WO 93/15187). Los ejemplos de bases de ácidos nucleicos modificadas se resumen por Limbach et al., (1994, Nucleic Acids Res. 22, 2183-2196).
Un nucleótido también puede considerarse como un éster de fosfato de un nucleósido, y la esterificación se produce en el grupo hidroxilo unido al C-5 del azúcar. Como se usa en la presente, el término "nucleósido" se refiere a una base nitrogenada heterocíclica en un enlace N-glicosídico con un azúcar. En la técnica se reconoce que los nucleósidos incluyen bases naturales y también bases modificadas bien conocidas. Tales bases generalmente se localizan en la posición 1' de una fracción de azúcar nucleosídica. Los nucleósidos generalmente comprenden una base y un grupo de azúcar. Los nucleósidos pueden estar no modificados o modificados en la fracción de azúcar y/o base (también denominados indistintamente análogos de nucleósidos, derivados de nucleósidos, nucleósidos modificados, nucleósidos no naturales o nucleósidos no estándar). Como también se ha indicado con anterioridad, los ejemplos de bases de ácidos nucleicos modificadas se resumen en Limbach et al., (1994, Nucleic Acids Res. 22, 2183­ 2196).
Los ejemplos ilustrativos de polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos que codifican las SEQ ID NO: 1-24 y 60-64, y secuencias de polinucleótidos expuestas en las SEQ ID NO: 25-59 y 65-68.
En varias realizaciones ilustrativas, los polinucleótidos contemplados en la presente incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos que codifican variantes de endonucleasas homing, megaTAL, enzimas de procesamiento de extremos, polipéptidos de fusión y vectores de expresión, vectores virales y plásmidos de transferencia que comprenden polinucleótidos contemplados en la presente.
Como se usan en la presente, los términos "variante de polinucleótido" y "variante" y similares se refieren a polinucleótidos que muestran una identidad de secuencia sustancial con una secuencia de polinucleótidos de referencia o polinucleótidos que hibridan con una secuencia de referencia en condiciones estrictas que se definen en la presente a continuación. Estos términos también abarcan polinucleótidos que se distinguen de un polinucleótido de referencia por la adición, deleción, sustitución o modificación de por lo menos un nucleótido. Por consiguiente, los términos "variante de polinucleótido" y "variante" incluyen polinucleótidos en los que se han añadido o eliminado, o modificado, o reemplazado con nucleótidos diferentes uno o más nucleótidos. A este respecto, es bien entendido en la técnica que pueden realizarse ciertas alteraciones, incluyendo mutaciones, adiciones, deleciones y sustituciones en un polinucleótido de referencia mientras que el polinucleótido alterado conserva la función o la actividad biológica del polinucleótido de referencia.
En una realización, un polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida con una secuencia de ácido nucleico objetivo en condiciones estrictas. Hibridar en "condiciones estrictas" describe protocolos de hibridación en los que las secuencias de nucleótidos que son por lo menos un 60% idénticas entre sí permanecen hibridadas. En general, las condiciones estrictas se seleccionan para que sean aproximadamente 5° C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica, pH y concentración de ácido nucleico definidos) a la cual el 50% de las sondas complementarias a la secuencia objetivo hibridan con la secuencia objetivo en equilibrio. Como las secuencias objetivo están generalmente presentes en exceso, a Tm, el 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio.
Las menciones "identidad de secuencia" o, por ejemplo, que comprende una "secuencia un 50% idéntica a", como se usan en la presente, se refieren al grado en que las secuencias son idénticas en una base de nucleótido por nucleótido o de aminoácido por aminoácido sobre una ventana de comparación. Por tanto, puede calcularse un "porcentaje de identidad de secuencia" comparando dos secuencias alineadas óptimamente en la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, I) o el residuo de aminoácido idéntico (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) se produce en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. Se incluyen nucleótidos y polipéptidos que tienen por lo menos aproximadamente un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de referencia descritas en la presente, típicamente donde la variante de polipéptido mantiene por lo menos una actividad biológica del polipéptido de referencia.
Los términos usados para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" tiene una longitud de por lo menos 12 pero frecuentemente de 15 a 18 y a menudo por lo menos 25 unidades de monómeros, incluyendo los nucleótidos y los residuos de aminoácidos. Como dos polinucleótidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, solo una porción de la secuencia de polinucleótidos completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan típicamente comparando las secuencias de los dos polinucleótidos sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de por lo menos 6 posiciones contiguas, generalmente de 50 a 100, más habitualmente de 100 a 150, en el que una secuencia se compara con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que se hayan alineado óptimamente las dos secuencias. La ventana de comparación puede incluir adiciones o deleciones (es decir, espacios) de aproximadamente el 20% o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse mediante implementaciones computarizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics edición 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA) o mediante inspección y la mejor alineación (es decir, que da como resultado el porcentaje más alto de homología sobre la ventana de comparación) generada por cualquiera de los varios métodos seleccionados. También puede hacerse referencia a la familia de programas BLAST como se divulga, por ejemplo, en Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389. Un análisis detallado del análisis de secuencias puede encontrarse en la Unidad 19.3 de Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994-1998, Capítulo 15.
Un "polinucleótido aislado", como se usa en la presente, se refiere a un polinucleótido que se ha purificado de las secuencias que lo flanquean en un estado natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que se ha eliminado de las secuencias que normalmente están adyacentes al fragmento. En realizaciones particulares, un "polinucleótido aislado" se refiere a un ADN complementario (ADNc), un polinucleótido recombinante, un polinucleótido sintético u otro polinucleótido que no existe en la naturaleza y que ha sido elaborado por la mano del hombre.
En varias realizaciones, un polinucleótido comprende un ARNm que codifica un polipéptido contemplado en la presente incluyendo, pero no limitado a, una variante de endonucleasa homing, un megaTAL y una enzima de procesamiento de extremos. En ciertas realizaciones, el ARNm comprende una caperuza, uno o más nucleótidos y una cola de poli(A).
Como se usa en la presente, los términos "caperuza 5'" o "estructura de caperuza 5 '" o "fracción de caperuza 5 '" se refieren a una modificación química que se ha incorporado en el extremo 5' de un ARNm. La caperuza 5' está implicada en la exportación nuclear, la estabilidad del ARNm y la traducción.
En realizaciones particulares, un ARNm contemplado en la presente comprende una caperuza 5' que comprende un enlace 5'-ppp-5'-trifosfato entre un residuo de caperuza de guanosina terminal y el nucleótido de sentido transcrito 5'-terminal de la molécula de ARNm. Esta caperuza 5'-guanilato puede metilarse luego para generar un residuo de N7-metil-guanilato.
Los ejemplos ilustrativos de caperuza 5' adecuada para su uso en realizaciones particulares de los polinucleótidos de ARNm contemplados en la presente incluyen, pero no se limitan a: análogos de caperuza 5' no metilados, por ejemplo, G(5')ppp(5')G, G(5')ppp(5')C, G(5')ppp(5')A; análogos de caperuza 5' metilados, por ejemplo, m7G(5')ppp(5')G, m7G(5')ppp(5')C, y m7G(5')ppp(5')A; análogos de caperuza 5' dimetilados, por ejemplo, m27G(5')ppp(5')G, m27G(5')ppp(5')C, y m27G(5') ppp(5')A; análogos de caperuza 5' trimetilados, por ejemplo, m227G(5')ppp(5')G, m227G(5')ppp(5')C, y m227G(5')ppp(5')A; análogos de caperuza 5' simétricos dimetilados, por ejemplo, m7G(5')pppm7(5')G, m7G(5')pppm7(5')C, y m7G(5')pppm7(5')A; y análogos de caperuza 5' anti inversa, por ejemplo, análogo de caperuza anti-inversa (ARCA), designada 3'O-Me-m7G(5')ppp(5')G, 2'O-Me-m7G(5')ppp(5')G, 2'O-Me-m7G(5')ppp(5')C, 2'O-Me-m7G(5')ppp(5')A, m72'd(5')ppp(5')G, m72'd(5')ppp(5')C, m'2'd(5')ppp(5')A, 3'O-Mem7G(5')ppp(5')C, 3'O-Me-m7G(5')ppp(5')C, 3'O-Mem7G(5')ppp(5')A, m73'd(5')ppp(5')G, m'3'd(5')ppp(5')C, m73'd(5')ppp(5')A y sus derivados de tetrafosfato) (consultar, por ejemplo, Jemielity et al., Rn A, 9: 1108-1122 (2003)).
En realizaciones particulares, los ARNm comprenden una caperuza 5' que es un guanilato de 7-metilo ("m7G") enlazada a través de un puente trifosfato al extremo 5' del primer nucleótido transcrito, lo que da como resultado m7G(5')ppp(5')N, donde N es cualquier nucleósido.
En algunas realizaciones, los ARNm comprenden una caperuza 5' en donde la caperuza es una estructura Cap0 (las estructuras Cap0 carecen de un residuo 2'-O-metilo de la ribosa unido a las bases 1 y 2), una estructura Cap1 (las estructuras Cap1 tienen un residuo 2'-O-metilo en la base 2), o una estructura Cap2 (las estructuras Cap2 tienen un residuo 2'-O-metilo unido tanto a las bases 2 como 3).
En una realización, un ARNm comprende una caperuza m7G(5')ppp(5')G.
En una realización, un ARNm comprende una caperuza ARCA.
En realizaciones particulares, un ARNm contemplado en la presente comprende uno o más nucleósidos modificados.
En una realización, un ARNm comprende uno o más nucleósidos modificados seleccionados del grupo que consiste en: pseudouridina, piridin-4-ona ribonucleósido, 5-aza-uridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tiouridina, 4-tiopseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-hidroxiuridina, 3-metiluridina, 5-carboximetil-uridina, 1-carboximetilpseudouridina, 5-propinil-uridina, 1-propinil-pseudouridina, 5-taurinometiluridina, 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tio-uridina, 1-taurinometil-4-tio-uridina, 5-metil-uridina, 1-metil-pseudouridina, 4-tio-1-metilpseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metiM-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, dihidrouridina, dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tiouridina, 4-metoxi-pseudouridina,4-metoxi-2-tio-pseudouridina, 5-aza-citidina, pseudoisocitidina, 3-metil-citidina, N4-acetilcitidina, 5-formilcitidina, N4-metilcitidina, 5-hidroximetilcitidina, 1-metil-pseudoisocitidina, pirrolo-citidina, pirrolopseudoisocitidina, 2-tio-citidina, 2-tio-5-metil-citidina, 4-tio-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina, 1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina, zebularina, 5-aza-zebularina, 5-metil-zebularina, 5-aza-2-tio-zebularina, 2-tio-zebularina, 2-metoxi-citidina, 2-metoxi- 5-metil-citidina, 4-metoxi-pseudoisocitidina, 4-metoxi-1-metil-pseudoisocitidina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 7-deaza-adenina, 7-deaza-8-aza-adenina, 7-deaza-2-aminopurina, 7-deaza-8-aza-2-aminopurina, 7-deaza-2,6-diaminopurina, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurina, 1-metiladenosina, N6-metiladenosina, N6-isopenteniladenosina, N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina, 2-metiltio-N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina, N6-glicinilcarbamoiladenosina, N6-treonilcarbamoiladenosina, 2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina, N6,N6-dimetiladenosina, 7-metiladenina, 2-metiltio-adenina, 2-metoxi-adenina, inosina, 1-metilinosina, wyosina, wybutosina, 7-deaza-guanosina, 7-deaza-8-aza-guanosina, 6-tio-guanosina, 6-tio-7-deazaguanosina, 6-tio-7-deaza-8-aza-guanosina, 7-metil-guanosina, 6-tio-7-metil-guanosina, 7-metilinosina, 6-metoxiguanosina, 1-metilguanosina, N2-metilguanosina, N2,N2-dimetilguanosina, 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxoguanosina, 1-metil-6-tio-guanosina, N2-metil-6-tio-guanosina y N2, N2-dimetil-6-tio-guanosina.
En una realización, un ARNm comprende uno o más nucleósidos modificados seleccionados del grupo que consiste en: pseudouridina, piridin-4-ona ribonucleósido, 5-aza-uridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tiouridina, 4-tiopseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-hidroxiuridina, 3-metiluridina, 5-carboximetil-uridina, 1-carboximetilpseudouridina, 5-propinil-uridina, 1-propinil-pseudouridina, 5-taurinometiluridina, 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tio-uridina, 1-taurinometil-4-tio-uridina, 5-metil-uridina, 1-metil-pseudouridina, 4-tio-1-metilpseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, dihidrouridina, dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tiouridina, 4-metoxi-pseudouridina, y 4-metoxi-2-tio-pseudouridina.
En una realización, un ARNm comprende uno o más nucleósidos modificados seleccionados del grupo que consiste en: 5-aza-citidina, pseudoisocitidina, 3-metil-citidina, N4-acetilcitidina, 5-formilcitidina, N4-metilcitidina, 5-hidroximetilcitidina, 1-metil-pseudoisocitidina, pirrolo-citidina, pirrolo-pseudoisocitidina, 2-tio-citidina, 2-tio-5-metilcitidina, 4-tio-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina, 1 -metil-1-deaza-pseudoisocitidina, zebularina, 5-aza-zebularina, 5-metil-zebularina, 5-aza-2-tio-zebularina, 2-tio-zebularina, 2 -metoxi-citidina, 2-metoxi-5-metil-citidina, 4-metoxi-pseudoisocitidina y 4-metoxi-1-metil-pseudoisocitidina.
En una realización, un ARNm comprende uno o más nucleósidos modificados seleccionados del grupo que consiste en: 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 7-deaza-adenina, 7-deaza-8-aza-adenina, 7-deaza-2-aminopurina, 7-deaza-8-aza-2-aminopurina, 7-deaza-2,6-diaminopurina, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurina, 1-metiladenosina, N6-metiladenosina, N6-isopenteniladenosina, N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina, 2-metiltio-N6-(cishidroxiisopentenil)adenosina, N6-glicinilcarbamoiladenosina, N6-treonilcarbamoiladenosina, 2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina, N6,N6-dimetiladenosina, 7-metiladenina, 2-metiltio-adenina y 2-metoxi-adenina.
En una realización, un ARNm comprende uno o más nucleósidos modificados seleccionados del grupo que consiste en: inosina, 1-metil-inosina, wyosina, wybutosina, 7-deaza-guanosina, 7-deaza-8-aza-guanosina, 6-tioguanosina, 6-tio-7-deaza-guanosina, 6-tio-7-deaza-8-aza-guanosina, 7-metil-guanosina, 6-tio-7-metil-guanosina, 7-metilinosina, 6-metoxi-guanosina, 1-metilguanosina, N2-metilguanosina, N2,N2-dimetilguanosina, 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 1-metil-6-tio-guanosina, N2-metil-6-tio -guanosina y N2,N2-dimetil-6-tio-guanosina.
En una realización, un ARNm comprende una o más pseudouridinas, una o más 5-metil-citosinas y/o una o más 5-metil-citidinas.
En una realización, un ARNm comprende una o más pseudouridinas.
En una realización, un ARNm comprende una o más 5-metil-citidinas.
En una realización, un ARNm comprende una o más 5-metil-citosinas.
En realizaciones particulares, un ARNm contemplado en la presente comprende una cola de poli(A) para ayudar a proteger el ARNm de la degradación por exonucleasas, estabilizar el ARNm y facilitar la traducción. En ciertas realizaciones, un ARNm comprende una estructura de cola de poli(A) 3'.
En realizaciones particulares, la longitud de la cola poli(A) es de por lo menos aproximadamente 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, o por lo menos aproximadamente 500 o más nucleótidos de adenina o cualquier número intermedio de nucleótidos de adenina. En realizaciones particulares, la longitud de la cola de poli(A) es de por lo menos aproximadamente 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197,
Figure imgf000056_0001
198, 199, 200, 201, 202, 202, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271,272, 273, 274, o 275 o más nucleótidos de adenina
En realizaciones particulares, la longitud de la cola de poli(A) es de aproximadamente 10 a aproximadamente
500 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 150 a aproximadamente
500 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 200 a aproximadamente 500 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 250 a aproximadamente 500 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 300 a aproximadamente
500 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 50 a aproximadamente 450 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 50 a aproximadamente 400 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 50 a aproximadamente
350 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 nucleótidos de adenina nucleótidos, de aproximadamente 100 a aproximadamente 450 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 100 a aproximadamente 400 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 100 a aproximadamente 350 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 100 a aproximadamente 300 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 150 a aproximadamente 500 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 150 a aproximadamente 450 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 150 a aproximadamente 400 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 150 a aproximadamente 350 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 150 a aproximadamente 300 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 150 a aproximadamente 250 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 150 a aproximadamente 200 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 200 a aproximadamente 500 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 200 a aproximadamente 450 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 200 a aproximadamente 400 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 200 a aproximadamente 350 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 200 a aproximadamente 300 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 250 a aproximadamente 500 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 250 a aproximadamente 450 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 250 a aproximadamente 400 nucleótidos de adenina, de aproximadamente 250 a aproximadamente 350 nucleótidos de adenina, o de aproximadamente 250 a aproximadamente 300 nucleótidos de adenina o cualquier intervalo intermedio de nucleótidos de adenina.
Los términos que describen la orientación de los polinucleótidos incluyen: 5' (normalmente el extremo del polinucleótido que tiene un grupo fosfato libre) y 3' (normalmente el extremo del polinucleótido que tiene un grupo hidroxilo (OH) libre). Las secuencias de polinucleótidos pueden anotarse en la orientación 5' a 3' o en la orientación 3' a 5'. Para el ADN y el ARNm, la cadena 5' a 3' se designa cadena "sentido", "más" o "codificante" porque su secuencia es idéntica a la secuencia del pre-mensajero (pre-ARNm) [excepto para el uracilo (U) en el ARN, en lugar de timina
(T) en el ADN]. Para el ADN y el ARNm, la cadena complementaria 3' a 5' que es la cadena transcrita por la ARN polimerasa se designa como cadena "plantilla", "antisentido", "menos" o "no codificante". Como se usa en la presente, el término "orientación inversa" se refiere a una secuencia de 5' a 3' escrita en la orientación de 3' a 5' o una secuencia de 3' a 5' escrita en la orientación de 5' a 3'.
Los términos "complementario" y "complementariedad" se refieren a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las reglas de apareamiento de bases. Por ejemplo, la cadena complementaria de la secuencia de ADN 5' A G T CAT G 3' es 3' T C A G T A C 5'. La última secuencia a menudo se escribe como el complemento inverso con el extremo 5' a la izquierda y el extremo 3' a la derecha, 5' CAT G ACT 3'. Se dice que una secuencia que es igual a su complemento inverso es una secuencia palindrómica. La complementariedad puede ser "parcial", en la que solo algunas de las bases de los ácidos nucleicos se emparejan de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases. O puede haber una complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos.
El término "casete de ácido nucleico" o "casete de expresión", como se usa en la presente, se refiere a secuencias genéticas dentro del vector que pueden expresar un ARN y, posteriormente, un polipéptido. En una realización, el casete de ácido nucleico contiene un gen o genes de interés, por ejemplo, un polinucleótido o polinucleótidos de interés. En otra realización, el casete de ácido nucleico contiene una o más secuencias de control de la expresión, por ejemplo, un promotor, un potenciador, una secuencia poli(A) y un gen o genes de interés, por ejemplo, un polinucleótido o polinucleótidos de interés. Los vectores pueden comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más casetes de ácidos nucleicos. El casete de ácido nucleico se orienta posicional y secuencialmente dentro del vector de tal manera que el ácido nucleico en el casete pueda transcribirse en ARN y, cuando sea necesario, se traduzca en una proteína o un polipéptido, experimente las modificaciones postraduccionales apropiadas requeridas para la actividad en la célula transformada, y sea translocada al compartimiento apropiado para la actividad biológica dirigiéndose a compartimientos intracelulares apropiados o secreción en compartimientos extracelulares.
Preferiblemente, el casete tiene sus extremos 3' y 5' adaptados para una inserción fácil en un vector, por ejemplo, tiene sitios de endonucleasas de restricción en cada extremo. En una realización preferida, el casete de ácido nucleico contiene la secuencia de un gen terapéutico usado para tratar, prevenir o mejorar un trastorno genético. El casete puede retirarse e insertarse en un plásmido o vector viral como una única unidad.
Los polinucleótidos incluyen polinucleótidos de interés. Como se usa en la presente, el término "polinucleótido
de interés" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido o polipéptido de fusión o un polinucleótido que sirve como plantilla para la transcripción de un polinucleótido inhibidor, como se contempla en la presente.
Además, los expertos en la técnica apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que pueden codificar un polipéptido, o fragmento de variante del mismo, como se contempla en la presente. Algunos de estos polinucleótidos tienen una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, los polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones se contemplan específicamente en realizaciones particulares, por ejemplo, polinucleótidos que están optimizados para la selección de codones en humanos y/o primates. En una realización, se proporcionan polinucleótidos que comprenden secuencias alélicas particulares. Los alelos son secuencias de polinucleótidos endógenos que se alteran como resultado de una o más mutaciones, como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos.
En una cierta realización, un polinucleótido de interés comprende una plantilla de reparación de donante.
En una cierta realización, un polinucleótido de interés comprende un polinucleótido inhibidor que incluye, pero no se limita a, un ARNip, un miARN, un ARNhc, una ribozima u otro ARN inhibidor.
En una realización, una plantilla de reparación del donante que comprende un ARN inhibidor comprende una o más secuencias reguladoras como, por ejemplo, una pol III constitutiva fuerte, por ejemplo, el promotor de ARNsn U6 humano o de ratón, el promotor de ARN H1 humano y de ratón, o el promotor de tARN-val humano, o un promotor de pol II constitutivo fuerte, como se describe en otra parte de la presente.
Los polinucleótidos contemplados en realizaciones particulares, independientemente de la longitud de la propia secuencia codificante, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, como promotores y/o potenciadores, regiones no traducidas (UTR), secuencias Kozak, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, sitios de entrada ribosomales internos (IRES), sitios de reconocimiento de recombinasa (por ejemplo, sitios LoxP, FRT y Att), codones de terminación, señales de terminación transcripcional, elementos de respuesta posteriores a la transcripción y polinucleótidos que codifican polipéptidos autoescindibles, etiquetas de epítopos, como se divulga en otra parte de la presente o como se conoce en la técnica, de tal manera que su longitud total puede variar considerablemente. Por lo tanto, se contempla en realizaciones particulares que puede emplearse un fragmento de polinucleótido de casi cualquier longitud, la longitud total estando limitada preferiblemente por la facilidad de preparación y el uso de ADN recombinante pretendido.
Los polinucleótidos pueden prepararse, manipularse, expresarse y/o administrarse usando cualquiera de una variedad de técnicas bien establecidas conocidas y disponibles en la técnica. Para expresar un polipéptido deseado, puede insertarse una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en el vector apropiado. Un polipéptido deseado también puede expresarse administrando un ARNm que codifica el polipéptido en la célula.
Los ejemplos ilustrativos de vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, secuencias de replicación autónoma y elementos transponibles, por ejemplo, Sleeping Beauty, PiggyBac.
Los ejemplos ilustrativos adicionales de vectores incluyen, sin limitación, plásmidos, fagémidos, cósmidos, cromosomas artificiales como el cromosoma artificial de levadura (YAC), cromosoma artificial bacteriano (BAC) o cromosoma artificial derivado de P1 (PAC), bacteriófagos como el fago lambda o fago M13 y virus animales.
Los ejemplos ilustrativos de virus útiles como vectores incluyen, sin limitación, retrovirus (incluyendo lentivirus), adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple), virus de la viruela, baculovirus, papilomavirus y papovavirus (por ejemplo, SV40).
Los ejemplos ilustrativos de vectores de expresión incluyen, pero no se limitan a, vectores pClneo (Promega) para la expresión en células de mamífero; pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ y μLenti6.2/V5-GW/lacZ (Invitrogen) para la transferencia y expresión de genes mediada por lentivirus en células de mamífero. En realizaciones particulares, las secuencias codificantes de los polipéptidos divulgados en la presente pueden ligarse en tales vectores de expresión para la expresión de los polipéptidos en células de mamífero.
En realizaciones particulares, el vector es un vector episomal o un vector que se mantiene extracromosómicamente. Como se usa en la presente, el término "episomal" se refiere a un vector que es capaz de replicarse sin integración en el ADN cromosómico del huésped y sin pérdida gradual de una célula huésped en división, lo que también significa que dicho vector se replica extracromosómicamente o episomalmente.
Las "secuencias de control de la expresión", los "elementos de control" o las "secuencias reguladoras" presentes en un vector de expresión son aquellas regiones no traducidas del vector de origen de la replicación, casetes de selección, promotores, potenciadores, señales de inicio de la traducción (secuencia Shine Dalgarno o secuencia de Kozak), intrones, elementos reguladores postranscripcionales, una secuencia de poliadenilación, regiones no traducidas en 5' y 3', que interactúan con las proteínas celulares del huésped para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Tales elementos pueden variar en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y el huésped utilizado, puede usarse cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo los promotores ubicuos y los promotores inducibles.
En realizaciones particulares, un polinucleótido comprende un vector incluyendo, pro no limitados a, vectores de expresión y vectores virales. Un vector puede comprender una o más secuencias de control exógenas, endógenas o heterólogas como promotores y/o potenciadores. Una "secuencia de control endógena" es aquella que está enlazada naturalmente con un gen dado en el genoma. Una "secuencia de control exógena" es aquella que se coloca en yuxtaposición a un gen por medio de manipulación genética (es decir, técnicas de biología molecular) de tal manera que la transcripción de ese gen esté dirigida por el potenciador/promotor enlazado. Una "secuencia de control heteróloga" es una secuencia exógena que es de una especie diferente a la célula que se está manipulando genéticamente. Una secuencia de control "sintética" puede comprender elementos de una o más secuencias endógenas y/o exógenas y/o secuencias determinadas in vitro o in silico que proporcionan una actividad promotora y/o potenciadora óptima para la terapia particular.
El término "promotor" como se usa en la presente se refiere a un sitio de reconocimiento de un polinucleótido (ADN o ARN) al que se une una ARN polimerasa. Una ARN polimerasa inicia y transcribe polinucleótidos enlazados operativamente al promotor. En realizaciones particulares, los promotores operativos en células de mamífero comprenden una región rica en AT localizada aproximadamente de 25 a 30 bases en sentido ascendente del sitio donde se inicia la transcripción y/u otra secuencia que se encuentra de 70 a 80 bases en sentido ascendente del comienzo de la transcripción, una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido.
El término "potenciador" se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias capaces de proporcionar una transcripción mejorada y, en algunos casos, puede funcionar independientemente de su orientación con respecto a otra secuencia de control. Un potenciador puede funcionar cooperativa o aditivamente con promotores y/u otros elementos potenciadores. El término "promotor/potenciador" se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias capaces de proporcionar funciones tanto de promotor como de potenciador.
El término "enlazado operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. En una realización, el término se refiere a un enlace funcional entre una secuencia de control de expresión de ácidos nucleicos (como un promotor y/o potenciador) y una segunda secuencia de polinucleótidos, por ejemplo, un polinucleótido de interés, en donde la secuencia de control de expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.
Como se usa en la presente, el término "secuencia de control de la expresión constitutiva" se refiere a un promotor, potenciador o promotor/potenciador que permite continuamente o de manera continua la transcripción de una secuencia enlazada operativamente. Una secuencia de control de expresión constitutiva puede ser un promotor, potenciador o promotor/potenciador "ubicuo" que permite la expresión en una amplia variedad de tipos de células y tejidos o un promotor, potenciador o promotor/potenciador "específico de células", "específico del tipo de célula", "específico del linaje celular" o "específico de tejido" que permite la expresión en una variedad restringida de tipos de células y tejidos, respectivamente.
Las secuencias de control de expresión ubicuas ilustrativas adecuadas para su uso en realizaciones particulares incluyen, pero no se limitan a, un promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), un virus viral de simio 40 (SV40) (por ejemplo, temprano o tardío), un promotor LTR del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), un LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), un promotor del virus del herpes simple (HSV) (timidina quinasa), promotores H5, P7.5yP11 del virus vaccinia, un promotor del factor de elongación corto 1 -alfa (EF1a-corto), un promotor del factor de elongación largo 1 -alfa (EF1a-largo), respuesta de crecimiento temprano 1 (EGR1), ferritina H (FerH), ferritina L (FerL), gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), factor de inicio de la traducción eucariota 4A1 (EIF4A1), proteína de choque térmico 5 de 70kDa (HSPA5), proteína de choque térmico 90kDa beta, miembro 1 (HSP90B 1), proteína de choque térmico de 70kDa (HSP70), p-quinesina (p-KlN), el locus ROSA 26 humano (Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477-1482 (2007)), un promotor de ubiquitina C (UBC), un promotor de fosfoglicerato quinasa-1 (PGK), un promotor de citomegalovirus/promotor de p-actina de pollo (CAG), un promotor de p-actina y un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativa eliminada, promotor del sitio de unión al cebador sustituido (MND) dl587rev (Chalita et al., J Virol. 69(2):748-55 (1995)).
En una realización particular, puede ser deseable usar una secuencia de control de expresión específica de célula, tipo de célula, linaje celular o tejido para lograr la expresión específica de tipo celular, específica de linaje o específica de tejido de una secuencia de polinucleótidos deseada (por ejemplo, para expresar un determinado ácido nucleico que codifica un polipéptido en solo un subconjunto de tipos de células, linajes celulares o tejidos o durante etapas específicas de desarrollo).
Como se usa en la presente, "expresión condicional" puede referirse a cualquiertipo de expresión condicional que incluye, pero no se limita a, expresión inducible; expresión reprimible; expresión en células o tejidos que tienen un estado fisiológico, biológico o de enfermedad particular, etc. No se pretende que esta definición excluya el tipo de célula o la expresión específica de tejido. Ciertas realizaciones proporcionan la expresión condicional de un polinucleótido de interés, por ejemplo, la expresión se controla sometiendo una célula, tejido, organismo, etc., a un tratamiento o condición que hace que se exprese el polinucleótido o que provoca un aumento o disminución en la expresión del polinucleótido codificado por el polinucleótido de interés.
Los ejemplos ilustrativos de sistemas/promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, promotores inducibles por esteroides como promotores de genes que codifican receptores de glucocorticoides o estrógenos (inducibles mediante tratamiento con la hormona correspondiente), promotores de metalotionina (inducibles mediante tratamiento con varios metales pesados), promotor MX-1 (inducible por interferón), el sistema de regulación de mifepristona "GeneSwitch" (Sirin et al., 2003, Gene, 323:67), el interruptor genético inducible cumate (WO 2002/088346), sistemas reguladores dependientes de tetraciclina, etc.
La expresión condicional también puede lograrse usando una recombinasa de ADN específica del sitio. De acuerdo con ciertas realizaciones, los polinucleótidos comprenden por lo menos un sitio (típicamente dos) para la recombinación mediada por una recombinasa específica del sitio. Como se usa en la presente, los términos "recombinasa" o "recombinasa específica de sitio" incluyen proteínas, enzimas, cofactores o proteínas asociadas excisivas o integradoras que están implicadas en reacciones de recombinación que implican uno o más sitios de recombinación (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más), que pueden ser proteínas de tipo salvaje (consultar Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)), o mutantes, derivados (por ejemplo, proteínas de fusión que contienen las secuencias de proteínas de recombinación o fragmentos de las mismas), fragmentos y variantes de las mismas. Los ejemplos ilustrativos de recombinasas adecuadas para su uso en realizaciones particulares incluyen, pero no se limitan a: Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, OC31, Cin, Tn3 resolvasa, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCEl, y ParA.
Los polinucleótidos pueden comprender uno o más sitios de recombinación para cualquiera de una amplia variedad de recombinasas específicas de sitio. Debe entenderse que el sitio objetivo para una recombinasa específica del sitio se suma a cualquier sitio requerido para la integración de un vector, por ejemplo, un vector retroviral o un vector lentiviral. Como se usa en la presente, los términos "secuencia de recombinación", "sitio de recombinación" o "sitio de recombinación específico del sitio" se refieren a una secuencia de ácido nucleico particular que reconoce una recombinasa y a la que se une.
Por ejemplo, un sitio de recombinación para la recombinasa Cre es loxP, que es una secuencia de 34 pares de bases que comprende dos repeticiones invertidas de 13 pares de bases (que sirven como sitios de unión de la recombinasa) que flanquean una secuencia central de 8 pares de bases (ver la FIG. 1 de Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)). Otros sitios loxP ejemplares incluyen, pero no se limitan a: lox511 (Hoess et al., 1996; Bethke y Sauer, 1997), lox5171 (Lee y Saito, 1998), lox2272 (Lee y Saito, 1998), m2 (Langer et al., 2002), lox71 (Albert et al., 1995) y lox66 (Albert et al., 1995).
Los sitios de reconocimiento adecuados para la recombinasa FLP incluyen, pero no se limitan a: FRT (McLeod, et al., 1996), F1, F2, F3 (Schlake y Bode, 1994), F4, F5 (Schlake y Bode, 1994), FRT(LE) (Senecoff et al., 1988), FRT(RE) (Senecoff et al., 1988).
Otros ejemplos de secuencias de reconocimiento son las secuencias attB, attP, attL y attR, que son reconocidas por la enzima recombinasa A Integrasa, por ejemplo, phi-c31. El 0 C31 SSR media la recombinación solo entre los sitios heterotípicos attB (34 pb de longitud) y attP (39 pb de longitud) (Groth et al., 2000). attB y attP, denominados así por los sitios de unión para la integrasa del fago en los genomas bacteriano y de fago, respectivamente, contienen ambos repeticiones invertidas imperfectas que probablemente están unidas por homodímeros $C31 (Groth et al., 2000). Los sitios del producto, attL y attR, son efectivamente inertes a una recombinación mediada por $C31 adicional (Belteki et al., 2003), haciendo que la reacción sea irreversible. Para catalizar las inserciones, se ha descubierto que el ADN portador de attB se inserta en un sitio attP genómico más fácilmente que un sitio attP en un sitio attB genómico (Thyagarajan et al., 2001; Belteki et al., 2003). Por tanto, las estrategias típicas colocan mediante recombinación homóloga un "sitio de interacción" que lleva attP en un locus definido, que luego se asocia con una secuencia entrante que lleva attB para la inserción.
En una realización, un polinucleótido contemplado en la presente comprende un polinucleótido plantilla de reparación donante flanqueado por un par de sitios de reconocimiento de recombinasa. En realizaciones particulares, el polinucleótido plantilla de reparación está flanqueado por sitios LoxP, sitios FRT o sitios att.
En realizaciones particulares, los polinucleótidos contemplados en la presente incluyen uno o más polinucleótidos de interés que codifican uno o más polipéptidos. En realizaciones particulares, para lograr una traducción eficiente de cada uno de la pluralidad de polipéptidos, las secuencias de polinucleótidos pueden separarse por una o más secuencias de IRES o secuencias de polinucleótidos que codifican polipéptidos autoescindibles.
Como se usa en la presente, un "sitio de entrada de ribosoma interno" o "IRES" se refiere a un elemento que promueve la entrada de ribosoma interno directo al codón de inicio, como ATG, de un cistrón (una región codificante de proteína), lo que lleva a la traducción independiente de la caperuza del gen. Consultar, por ejemplo, Jackson et al., 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83) y Jackson y Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000. Los ejemplos de IRES generalmente empleados por los expertos en la técnica incluyen los descritos en la Patente de Estados Unidos N° 6.692.736. Ejemplos adicionales de "IRES" conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a, IRES que pueden obtenerse de picornavirus (Jackson et al., 1990) e IRES que pueden obtenerse de fuentes de ARNm viral o celular, como por ejemplo, proteína de unión a cadena pesada de inmunoglobulina (BiP), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEg F) (Huez et al. 1998. Mol. Cell. Biol. 18(11):6178-6190), el factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF-2) y factor de crecimiento similar a la insulina (IGFII), el factor de inicio de la traducción eIF4G y los factores de transcripción de levadura TFIID y HAP4, el virus de la encefelomicarditis (EMCV) que está disponible comercialmente de Novagen (Duke et al., 1992. J. Virol 66(3):1602-9) y el IRES de VEGF (Huez et al., 1998. Mol Cell Biol 18(11):6178-90). También se han notificado IRES en genomas virales de las especies Picomaviridae, Dicistroviridae y Flaviviridae y en el VHC, el virus de la leucemia murina de Friend (FrMI,V) y el virus de la leucemia murina de Moloney (MoMI,V).
En una realización, el IRES usado en los polinucleótidos contemplados en la presente es un IRES de EMCV.
En realizaciones particulares, los polinucleótidos comprenden polinucleótidos que tienen una secuencia Kozak de consenso y que codifican un polipéptido deseado. Como se usa en la presente, el término "secuencia de Kozak" se refiere a una secuencia de nucleótidos corta que facilita en gran medida la unión inicial del ARNm a la subunidad pequeña del ribosoma y aumenta la traducción. La secuencia de consenso de Kozak es (GCC)RCCATGG (SEQ ID NO: 105), donde R es una purina (A o G) (Kozak, 1986. Cell. 44(2):283-92, y Kozak, 1987. Nucleic Acids Res.
15(20):8125-48).
Los elementos que dirigen la terminación eficaz y la poliadenilación de los transcritos de ácidos nucleicos heterólogos aumentan la expresión de genes heterólogos. Las señales de terminación de la transcripción generalmente se encuentran en sentido descendente de la señal de poliadenilación. En realizaciones particulares, los vectores comprenden una secuencia de poliadenilación 3' de un polinucleótido que codifica un polipéptido a expresar. Los términos "sitio poliA", "secuencia poliA", "sitio poli(A)" o "secuencia poli(A)", como se usan en la presente, indican una secuencia de ADN que dirige tanto la terminación como la poliadenilación del transcrito de ARN naciente por la ARN polimerasa II. Las secuencias de poliadenilación pueden promover la estabilidad del ARNm mediante la adición de una cola poli(A) al extremo 3' de la secuencia codificante y, por lo tanto, contribuir a aumentar la eficiencia de la traducción. Es deseable una poliadenilación eficiente del transcrito recombinante ya que los transcritos que carecen de una cola poli(A) son inestables y se degradan rápidamente. Los ejemplos ilustrativos de señales de poli(A) que pueden usarse en un vector incluyen una secuencia de poli(A) ideal (por ejemplo, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA), una secuencia de poli(A) de hormona de crecimiento bovina (BGHpA), una secuencia poli(A) de p-globina de conejo (rμgpA), u otra secuencia de poli(A) endógena o heteróloga adecuada conocida en la técnica.
En algunas realizaciones, un polinucleótido o célula que alberga el polinucleótido utiliza un gen suicida, incluyendo un gen suicida inducible para reducir el riesgo de toxicidad directa y/o proliferación incontrolada. En realizaciones específicas, el gen suicida no es inmunogénico para el huésped que alberga el polinucleótido o la célula. Un cierto ejemplo de un gen suicida que puede usarse es caspasa-9 o caspasa-8 o citosina desaminasa. La caspasa-9 puede activarse usando un inductor químico de dimerización (CID) específico.
En ciertas realizaciones, los polinucleótidos comprenden segmentos de genes que hacen que las células modificadas genéticamente contempladas en la presente sean susceptibles a la selección negativa in vivo. "Selección negativa" se refiere a una célula infundida que puede eliminarse como resultado de un cambio en la condición in vivo del individuo. El fenotipo seleccionable negativo puede resultar de la inserción de un gen que confiere sensibilidad a un agente administrado, por ejemplo, un compuesto. Los genes de selección negativa son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a: el gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple tipo I (HSV-I TK) que confiere sensibilidad al ganciclovir; el gen de la hipoxantina fosforribosiltransferasa celular (HPRT), el gen de la adenina fosforribosiltransferasa celular (APRT) y la citosina desaminasa bacteriana.
En algunas realizaciones, las células modificadas genéticamente comprenden un polinucleótido que comprende además un marcador positivo que permite la selección de células del fenotipo seleccionable negativo in vitro. El marcador seleccionable positivo puede ser un gen que, tras ser introducido en la célula huésped, expresa un fenotipo dominante que permita la selección positiva de células portadoras del gen. Los genes de este tipo son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, el gen de la higromicina-B fosfotransferasa (hph) que confiere resistencia a la higromicina B, el gen de la aminoglucósido fosfotransferasa (neo o aph) de Tn5 que codifica la resistencia al antibiótico G418, el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR), el gen de la adenosina desaminasa (ADA) y el gen de resistencia a múltiples fármacos (MDR).
En una realización, el marcador seleccionable positivo y el elemento seleccionable negativo están enlazados de tal manera que la pérdida del elemento seleccionable negativo necesariamente también va acompañada de la pérdida del marcador seleccionable positivo. En una realización particular, los marcadores seleccionables positivo y negativo están fusionados de tal manera que la pérdida de uno lleva obligatoriamente a la pérdida del otro. Un ejemplo de un polinucleótido fusionado que proporciona como producto de expresión un polipéptido que confiere tanto las características de selección positiva como negativa deseadas descritas anteriormente es un gen de fusión de higromicina fosfotransferasa timidina quinasa (HyTK). La expresión de este gen proporciona un polipéptido que confiere resistencia a la higromicina B para la selección positiva in vitro y sensibilidad al ganciclovir para la selección negativa in vivo. Consultar también las publicaciones de PCT US91/08442 y PCT/US94/05601, de S.D. Lupton, que describe el uso de genes de fusión seleccionables bifuncionales derivados de la fusión de marcadores seleccionables positivos dominantes con marcadores seleccionables negativos.
Los marcadores seleccionables positivos preferidos se derivan de genes seleccionados del grupo que consiste en hph, nco y gpt, y los marcadores seleccionables negativos preferidos se derivan de genes seleccionados del grupo que consiste en citosina desaminasa, HSV-I TK, VZV TK, HPRT, APRT y gpt. Los genes de fusión seleccionables bifuncionales ejemplares contemplados en realizaciones particulares incluyen, pero no se limitan a, genes en los que el marcador seleccionable positivo se deriva de hph o neo, y el marcador seleccionable negativo se deriva de citosina desaminasa o un gen TK o marcador seleccionable.
En realizaciones particulares, los polinucleótidos que codifican una o más variantes de nucleasa, megaTAL, enzimas de procesamiento de extremos o polipéptidos de fusión pueden introducirse en células hematopoyéticas, por ejemplo, células T, mediante métodos virales y no virales. En realizaciones particulares, la administración de uno o más polinucleótidos que codifican nucleasas y/o plantillas de reparación de donantes puede proporcionarse mediante el mismo método o mediante diferentes métodos, y/o mediante el mismo vector o mediante diferentes vectores.
El término "vector" se usa en la presente para referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transferir o transportar otra molécula de ácido nucleico. El ácido nucleico transferido generalmente se enlaza, por ejemplo, se inserta en la molécula de ácido nucleico del vector. Un vector puede incluir secuencias que dirijan la replicación autónoma en una célula o puede incluir secuencias suficientes para permitir la integración en el ADN de la célula huésped. En realizaciones particulares, los vectores no virales se usan para administrar uno o más polinucleótidos contemplados en la presente a una célula T.
Los ejemplos ilustrativos de vectores no virales incluyen, pero no se limitan a, plásmidos (por ejemplo, plásmidos de ADN o plásmidos de ARN), transposones, cósmidos y cromosomas artificiales bacterianos.
Los métodos ilustrativos de administración no viral de polinucleótidos contemplados en realizaciones particulares incluyen, pero no se limitan a: electroporación, sonoporación, lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, nanopartículas, policatión o conjugados de lípido:ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales, transferencia mediada por DEAE-dextrano, pistola de genes y choque térmico.
Los ejemplos ilustrativos de sistemas de administración de polinucleótidos adecuados para su uso en realizaciones particulares contempladas en la presente incluyen, pero no se limitan a, los proporcionados por Amaxa Biosystems, Maxcyte, Inc., BTX Molecular Delivery Systems, ThermoFisher Scientific y Copernicus Therapeutics Inc. Los reactivos de lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Transfectam™ y Lipofectin™). En la bibliografía se han descrito lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección de polinucleótidos con reconocimiento de receptor eficiente. Consultar, por ejemplo, Liu et al. (2003) Gene Therapy. 10:180-187; y Balazs et al. (2011) Journal of Drug Delivery. 2011:1-12. En realizaciones particulares también se contempla la administración basada en nanocélulas no vivas, derivadas de bacterias y dirigidas a anticuerpos.
Los vectores virales que comprenden polinucleótidos contemplados en realizaciones particulares pueden administrarse in vivo mediante administración a un paciente individual, típicamente mediante administración sistémica (por ejemplo, infusión intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica o intracraneal) o aplicación tópica, como se describe a continuación. Alternativamente, los vectores pueden administrarse a células ex vivo, como células explantadas de un paciente individual (por ejemplo, sangre periférica movilizada, linfocitos, aspirados de médula ósea, biopsia de tejido, etc.) o células madre hematopoyéticas de donantes universales, seguido de la reimplantación de las células en un paciente.
En una realización, los vectores virales que comprenden variantes de nucleasas y/o plantillas de reparación de donantes de acuerdo con la invención pueden usarse para la administración directamente a un organismo para la transducción de células in vivo. Alternativamente, puede administrarse ADN desnudo. La administración se realiza por cualquiera de las vías normalmente usadas para introducir una molécula en contacto final con células sanguíneas o tisulares incluyendo, pero no limitadas a, inyección, infusión, aplicación tópica y electroporación. Los métodos adecuados para administrar tales ácidos nucleicos están disponibles y son bien conocidos por los expertos en la técnica y, aunque puede usarse más de una vía para administrar una composición particular, una vía particular a menudo puede proporcionar una reacción más inmediata y más eficaz que otra vía.
Los ejemplos ilustrativos de sistemas de vectores virales adecuados para su uso en realizaciones particulares contempladas en la presente incluyen, pero no se limitan a, vectores de virus adenoasociados (AAV), retrovirus, virus del herpes simple, adenovirus y virus vaccinia.
En varias realizaciones, uno o más polinucleótidos que codifican una variante de nucleasa y/o una plantilla de reparación del donante se introducen en una célula hematopoyética, por ejemplo, una célula T, transduciendo la célula con un virus adenoasociado recombinante (rAAV), que comprende uno o más polinucleótidos.
El AAV es un virus pequeño (~26 nm) con replicación defectuosa, principalmente episomal, sin envoltura. El AAV puede infectar tanto células en división como no en división y puede incorporar su genoma en el de la célula huésped. Los AAV recombinantes (rAAV) se componen típicamente de, como mínimo, un transgén y sus secuencias reguladoras, y repeticiones terminales invertidas (ITR) de 5' y 3' de AAV. Las secuencias ITR tienen una longitud de aproximadamente 145 pb. Los vectores de rAAV que comprenden dos ITR tienen una capacidad de carga útil de aproximadamente 4,4 kB.
Los vectores de rAAV autocomplementarios contienen una tercera ITR y empaquetan dos cadenas de la porción recombinante del vector dejando solo aproximadamente 2,1 kB para los polinucleótidos contemplados en la presente. En una realización, el vector de AAV es un vector de scAAV.
Se han logrado capacidades de empaquetamiento extendidas que son aproximadamente el doble de la capacidad de empaquetamiento de un rAAV (aproximadamente 9 kB) usando estrategias de vector dual de rAAV. Las estrategias de vectores duales útiles para producir rAAV contempladas en la presente incluyen, pero no se limitan a corte empalme (corte y empalme trans), recombinación homóloga (superposición), o una combinación de los dos (híbrido). En la estrategia de corte y empalme trans de AAV dual, se coloca una señal de donante de corte y empalme (SD) en el extremo 3' del medio vector 5' y se coloca una señal de aceptor de corte y empalme (SA) en el extremo 5' del medio vector 3'. Tras la coinfección de la misma célula por los vectores AAV duales y la concatemerización de cabeza a cola mediada por la repetición terminal invertida (ITR) de las dos mitades, el corte y empalme trans da como resultado la producción de un ARNm maduro y una proteína de tamaño completo (Yan et al. al, 2000). El corte y empalme trans se ha usado con éxito para expresar genes grandes en el músculo y la retina (Reich et al, 2003; Lai et al, 2005). Alternativamente, las dos mitades de un casete de expresión de transgén grande contenido en vectores de AAV duales pueden contener secuencias superpuestas homólogas (en el extremo 3' de la mitad del vector 5' y en el extremo 5' de la mitad del vector 3', el AAV dual superposición), que mediará la reconstitución de un único genoma grande por recombinación homóloga (Duan et al, 2001). Esta estrategia depende de las propiedades recombinogénicas de las secuencias superpuestas del transgén (Ghosh et al, 2006). Una tercera estrategia de AAV dual (híbrida) se basa en añadir una región altamente recombinogénica de un gen exógeno (es decir, fosfatasa alcalina; Ghosh et al, 2008, Ghosh et al, 2011)) a los vectores de corte y empalme trans. La región añadida se coloca en sentido descendente de la señal SD en el vector medio 5' y en sentido ascendente de la señal SA en el vector medio 3' para aumentar la recombinación entre los AAV duales.
Un "AAV híbrido", "AAVr híbrido", "AAV quimérico" o "AAVr quimérico" se refiere a un genoma de rAAV empaquetado con una cápside de un serotipo de a Av diferente (y preferiblemente, de un serotipo diferente de uno o más ITR de AAV) y, de lo contrario, puede denominarse rAAV pseudotipado. Por ejemplo, un genoma de rAAV tipo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 puede encapsidarse dentro de una cápside de AAV tipo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 o variantes de los mismos, siempre que la cápside y el genoma de AAV (y preferiblemente, el uno o más ITR de AAV) sean de serotipos diferentes. En ciertas realizaciones, puede hacerse referencia a una partícula de rAAV seudotipada como del tipo "x/y", donde "x" indica la fuente de las ITR e "y" indica el serotipo de la cápside, por ejemplo una partícula 2/5 rAAV tiene ITR de AAV2 y una cápside de AAV6.
En realizaciones particulares, el rAAV comprende ITR y secuencias de la cápside aisladas de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV 12, AAV13, AAV 14, AAV15 y AAV16.
En algunas realizaciones, se usa un rAAV quimérico, las secuencias de ITR se aíslan de un serotipo de AAV y las secuencias de la cápside se aíslan de un serotipo de AAV diferente. Por ejemplo, un rAAV con secuencias ITR derivadas de AAV2 y secuencias de la cápside derivadas de AAV6 se denomina AAV2/AAV6. En realizaciones particulares, el vector de rAAV puede comprender ITR de AAV2 y proteínas de la cápside de cualquiera de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, Aa V6 , AAV7, AAV8, AAV9 o AAV10. En una realización preferida, el rAAV comprende secuencias ITR derivadas de AAV2 y secuencias de la cápside derivadas de AAV6. En una realización preferida, el rAAV comprende secuencias ITR derivadas de AAV2 y secuencias de la cápside derivadas de AAV2.
En algunas realizaciones, pueden aplicarse métodos de manipulación y selección las cápsides de AAV para hacerlas más propensas a transducir células de interés.
La construcción de vectores de rAAV, su producción y purificación se han divulgado, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 9.169.494; 9.169.492; 9.012.224; 8.889.641; 8.809.058; y 8.784.799.
En varias realizaciones, se introducen uno o más polinucleótidos que codifican una variante de nucleasa y/o una plantilla de reparación del donante en una célula hematopoyética, transduciendo la célula con un retrovirus, por ejemplo, lentivirus, que comprende el uno o más polinucleótidos.
Como se usa en la presente, el término "retrovirus" se refiere a un virus de ARN que transcribe inversamente su ARN genómico en una copia de ADN lineal de cadena doble y posteriormente integra covalentemente su ADN genómico en un genoma huésped. Los retrovirus ilustrativos adecuados para su uso en realizaciones particulares incluyen, pero no se limitan a: virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV), virus del sarcoma murino de Moloney (MoMSV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV), virus de la leucemia del simio gibón (GaLV), virus de la leucemia felina (FLV), spumavirus, virus de la leucemia murina de Friend, virus de células madre murinas (MSCV) y virus del sarcoma de Rous (RSV)) y lentivirus.
Como se usa en la presente, el término "lentivirus" se refiere a un grupo (o género) de retrovirus complejos. Los lentivirus ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: VIH (virus de inmunodeficiencia humana; incluyendo VIH tipo 1 y VIH tipo 2); virus del virus visna-maedi (VMV); el virus de la artritisencefalitis caprina (CAEV); virus de la anemia infecciosa equina (EIAV); virus de la inmunodeficiencia felina (FIV); virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV); y el virus de la inmunodeficiencia simia (SIV). En una realización, se prefieren las estructuras principales de vector basadas en VIH (es decir, elementos de secuencia que actúan en cis de VIH).
En varias realizaciones, un vector lentiviral contemplado en la presente comprende uno o más LTR, y uno o más, o todos, de los siguientes elementos accesorios: un cPPT/FLAP, una señal de empaquetamiento Psi (V), un elemento de exportación, secuencias poli (A), y puede comprender opcionalmente un w Pr E o HPRE, un elemento aislante, un marcador seleccionable y un gen de suicidio celular, como se analiza en otra parte de la presente.
En realizaciones particulares, los vectores lentivirales contemplados en la presente pueden ser lentivirus integradores o no integradores o de integración defectuosa. Como se usa en la presente, el término "lentivirus de integración defectuosa" o "IDLV" se refiere a un lentivirus que tiene una integrasa que carece de la capacidad para integrar el genoma viral en el genoma de las células huésped. Los vectores virales incompetentes para la integración se han descrito en la solicitud de patente WO 2006/010834.
Las mutaciones ilustrativas en el gen pol del VIH-1 adecuadas para reducir la actividad de la integrasa incluyen, pero no se limitan a: H12N, H12C, H16C, H16V, S81 R, D41A, K42A, H51A, Q53C, D55V, D64E, D64V, E69A, K71A, E85A, E87A, D116N, D1161, D116A, N120G, N1201, N120E, E152G, E152A, D35E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, K160A, R166A, D167A, E170A, H171A, K173A, K186Q, K186T, K188T, E198A, R199c, R199T, R199A, D202A, K211A, Q214L, Q216L, Q221 L, W235F, W235E, K236S, K236A, K246A, G247W, D253A, R262A, R263A y K264H.
En una realización, el gen pol deficiente en integrasa de VIH-1 comprende una mutación D64V, D116I, D116A, E152G o E152A; mutaciones D64V, D116I y E152G; o mutaciones D64V, D116Ay E152A.
En una realización, el gen pol deficiente en integrasa de VIH-1 comprende una mutación D64V.
El término "repetición terminal larga (LTR)" se refiere a dominios de pares de bases localizados en los extremos de los ADN retrovirales que, en su contexto de secuencia natural, son repeticiones directas y contienen regiones U3, R y U5.
Como se usa en la presente, el término "elemento FLAP" o "cPPT/FLAP" se refiere a un ácido nucleico cuya secuencia incluye el tracto de polipurina central y las secuencias de terminación central (cPPT y CTS) de un retrovirus, por ejemplo, VIH-1 o VIH-2. Los elementos FLAP adecuados se describen en la Patente de Estados Unidos N° 6.682.907 y en Zennou, et al., 2000, Cell, 101:173. En otra realización, un vector lentiviral contiene un elemento FLAP con una o más mutaciones en los elementos cPPT y/o CTS. En otra realización más, un vector lentiviral comprende un elemento cPPT o CTS. En otra realización más, un vector lentiviral no comprende un elemento cPPT o CTS.
Como se usa en la presente, el término "señal de empaquetamiento" o "secuencia de empaquetamiento" se refiere a secuencias psi [V] localizadas dentro del genoma retroviral que se requieren para la inserción del ARN viral en la cápside o partícula viral, consultar, por ejemplo, Clever et al., 1995. J. of Virology, vol. 69, N°. 4; págs. 2101­ 2109.
El término "elemento de exportación" se refiere a un elemento regulador postranscripcional que actúa en cis que regula el transporte de un transcrito de ARN desde el núcleo hasta el citoplasma de una célula. Los ejemplos de elementos de exportación de ARN incluyen, pero no se limitan a, el elemento de respuesta rev (RRE) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (consultar, por ejemplo, Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053; y Cullen et al., 1991. Cell 58: 423), y el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis B (HPRE).
En realizaciones particulares, la expresión de secuencias heterólogas en vectores virales aumenta mediante la incorporación de elementos reguladores postranscripcionales, sitios de poliadenilación eficientes y, opcionalmente, señales de terminación de la transcripción en los vectores. Una variedad de elementos reguladores postranscripcionales pueden aumentar la expresión de un ácido nucleico heterólogo en la proteína, por ejemplo, el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE; Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73:2886); el elemento regulador postranscripcional presente en el virus de la hepatitis B (HPRe ) (Huang et al., Mol. Cell. Biol., 5:3864); y similares (Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766).
Los vectores lentivirales preferiblemente contienen varias mejoras de seguridad como resultado de la modificación de las LTR. Los vectores "autoinactivantes" (SIN) se refieren a vectores defectuosos en la replicación, por ejemplo, en los que la región promotora-potenciadora LTR derecha (3'), conocida como región U3, ha sido modificada (por ejemplo, por deleción o sustitución) para prevenir la transcripción viral más allá de la primera ronda de replicación viral. Se proporciona una mejora de seguridad adicional al reemplazar la región U3 de la LTR 5' con un promotor heterólogo para impulsar la transcripción del genoma viral durante la producción de partículas virales. Los ejemplos de promotores heterólogos que pueden usarse incluyen, por ejemplo, promotores del virus simio viral 40 (SV40) (por ejemplo, temprano o tardío), citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), del virus del sarcoma de Rous (RSV) y del virus del herpes simple (HSV) (timidina cinasa).
Los términos "pseudotipo" o "pseudotipado", como se usan en la presente, se refieren a un virus cuyas proteínas de envoltura viral han sido sustituidas por las de otro virus que posee características preferibles. Por ejemplo, el VIH puede pseudotipificarse con proteínas de la envoltura de la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), lo que permite que el VIH infecte una gama más amplia de células porque las proteínas de la envoltura del VIH (codificadas por el gen env) normalmente dirigen el virus a células presentadoras de CD4+.
En ciertas realizaciones, los vectores lentivirales se producen de acuerdo con métodos conocidos. Consultar, por ejemplo, Kutner et al., BMC Biotechnol. 2009;9:10. doi: 10.1186/1472-6750-9-10; Kutner et al. Nat. Protoc.
2009;4(4):495-505. doi: 10.1038/nprot.2009.22.
De acuerdo con ciertas realizaciones específicas contempladas en la presente, la mayoría o todas las secuencias de la estructura principal del vectorviral se derivan de un lentivirus, por ejemplo, VIH-1. Sin embargo, debe entenderse que pueden usarse, o combinarse, muchas fuentes diferentes de secuencias retrovirales y/o lentivirales y pueden acomodarse numerosas sustituciones y alteraciones en ciertas secuencias lentivirales sin afectar a la capacidad de un vector de transferencia para realizar las funciones descritas en la presente. Además, en la técnica se conocen una variedad de vectores lentivirales, consultar Naldini et al., (1996a, 1996b y 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, Patentes de Estados Unidos N° 6.013.516; y 5,994,136, muchos de los cuales pueden adaptarse para producir un vector viral o plásmido de transferencia contemplado en la presente.
En varias realizaciones, uno o más polinucleótidos que codifican una variante de nucleasa y/o una plantilla de reparación del donante se introducen en una célula hematopoyéticatransduciendo la célula con un adenovirus que comprende uno o más polinucleótidos.
Los vectores basados en adenovirus son capaces de una eficiencia de transducción muy alta en muchos tipos de células y no requieren división celular. Con tales vectores, se han obtenido altos títulos y altos niveles de expresión. Este vector puede producirse en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. La mayoría de los vectores de adenovirus están manipulados de tal manera que un transgén reemplaza los genes Ad E1a, E1b y/o E3; posteriormente, el vector defectuoso en la replicación se propaga en células 293 humanas que proporcionan la función del gen eliminado en trans. Los vectores Ad pueden transducir múltiples tipos de tejidos in vivo, incluyendo células diferenciadas que no se dividen, como las que se encuentran en el hígado, los riñones y los músculos. Los vectores Ad convencionales tienen una gran capacidad de carga.
La generación y la propagación de los vectores de adenovirus actuales, que son deficientes en la replicación deficiente, pueden utilizar una línea de células auxiliares única, designada 293, que se transformó a partir de células de riñón embrionario humano mediante fragmentos de ADN de Ad5 y expresa constitutivamente proteínas E1 (Graham et al., 1977). Como la región E3 es prescindible del genoma del adenovirus (Jones & Shenk, 1978), los vectores de adenovirus actuales, con la ayuda de células 293, transportan ADN extraño en cualquiera de E1, la D3 o en ambas regiones (Graham & Prevec, 1991). Los vectores de adenovirus se han usado en la expresión de genes eucariotas (Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) y desarrollo de vacunas (Grunhaus & Horwitz, 1992; Graham & Prevec, 1992). Los estudios sobre la administración de adenovirus recombinantes a diferentes tejidos incluyen instilación traqueal (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), inyección muscular (Ragot et al., 1993), inyecciones intravenosas periféricas (Herz & Gerard, 1993) e inoculación estereotáctica en el cerebro (Le Gal La Salle et al., 1993). Un ejemplo del uso de un vector Ad en un ensayo clínico implicó la terapia con polinucleótidos para la inmunización antitumoral con inyección intramuscular (Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)).
En varias realizaciones, uno o más polinucleótidos que codifican la variante de nucleasa y/o la plantilla de reparación del donante se introducen en una célula hematopoyética transduciendo la célula con un virus del herpes simple, por ejemplo, HSV-1, HSV-2, que comprende uno o más polinucleótidos.
El virión maduro de HSV consiste en una cápside icosaédrica envuelta con un genoma viral que consiste en una molécula de ADN lineal de cadena doble que tiene 152 kb. En una realización, el vector viral basado en HSV es deficiente en uno o más genes de HSV esenciales o no esenciales. En una realización, el vector viral basado en HSV es deficiente en replicación. La mayoría de los vectores de HSV deficientes en replicación contienen una deleción para eliminar uno o más genes de HSV intermedio-temprano, temprano o tardío para evitar la replicación. Por ejemplo, el vector de HSV puede ser deficiente en un gen temprano inmediato seleccionado del grupo que consiste en: ICP4, ICP22, ICP27, ICP47 y una combinación de los mismos. Las ventajas del vector de HSV son su capacidad para entrar en una etapa latente que puede dar como resultado una expresión de ADN a largo plazo y su genoma de ADN viral grande que puede acomodar insertos de ADN exógeno de hasta 25 kb. Los vectores basados en HSV se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 5.837.532, 5.846.782, y 5.804.413 y las Solicitudes de Patente Internacional WO 91/02788, WO 96/04394, WO 98/15637, y WO 99/06583.
H. CÉLULAS EDITADAS EN EL GENOMA
Las células editadas en el genoma fabricadas mediante los métodos contemplados en realizaciones particulares comprenden una o más ediciones de genes en un gen de PD-1 y proporcionan agentes terapéuticas basados en células mejorados para su uso en la prevención, el tratamiento o la mejora de por lo menos un síntoma de un cáncer, GVHD, enfermedad infecciosa, enfermedad autoinmune, inmunodeficiencia o afección asociada con la misma. Sin querer estar limitados por ninguna teoría en particular, se cree que las composiciones y métodos contemplados en la presente aumentan la eficacia de las terapias celulares adoptivas, en parte, haciendo que las células terapéuticas sean más resistentes a las señales inmunosupresoras y al agotamiento.
Las células editadas en el genoma contempladas en realizaciones particulares pueden ser autólogas/autogénicas ("propias") o no autólogas ("no propias", por ejemplo, alogénicas, singénicas o xenogénicas). "Autólogo", como se usa en la presente, se refiere a células del mismo sujeto. "Alogénico", como se usa en la presente, se refiere a células de la misma especie que difieren genéticamente de la célula en comparación. "Singénico", como se usa en la presente, se refiere a células de un sujeto diferente que son genéticamente idénticas a la célula en comparación. "Xenogénico", como se usa en la presente, se refiere a células de una especie diferente a la célula en comparación. En realizaciones preferidas, las células se obtienen de un sujeto mamífero. En una realización más preferida, las células se obtienen de un sujeto primate, opcionalmente un primate no humano. En la realización más preferida, las células se obtienen de un sujeto humano.
Una "célula aislada" se refiere a una célula que no se produce de manera natural, por ejemplo, una célula que no existe en la naturaleza, una célula modificada, una célula manipulada, una célula recombinante, etc., que se ha obtenido de un tejido u órgano in vivo y está sustancialmente libre de matriz extracelular.
Como se usa en la presente, el término "población de células" se refiere a una pluralidad de células que pueden estar formadas por cualquier número y/o combinación de tipos de células homogéneos o heterogéneos, como se describe en otra parte de la presente. Por ejemplo, para la transducción de células T, puede aislarse u obtenerse una población de células de sangre periférica. Una población de células puede comprender aproximadamente el 10%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90% o aproximadamente el 100% del tipo celular objetivo a editar. En ciertas realizaciones, las células T pueden aislarse o purificarse de una población de células heterogéneas usando métodos conocidos en la técnica.
Los ejemplos ilustrativos de tipos de células cuyo genoma puede editarse usando las composiciones y métodos contemplados en la presente incluyen, pero no se limitan a, líneas celulares, células primarias, células madre, células progenitoras y células diferenciadas, y mezclas de las mismas.
En una realización preferida, las composiciones y los métodos de edición del genoma se usan para editar células hematopoyéticas, más preferiblemente células inmunitarias e incluso más preferiblemente células T.
Los términos "célula T" o "linfocito T" se reconocen en la técnica y se pretende que incluyan timocitos, células efectoras inmunitarias, células T reguladoras, linfocitos T vírgenes, linfocitos T inmaduros, linfocitos T maduros, linfocitos T en reposo o linfocitos T activados. Una célula T puede ser una célula T auxiliar (Th), por ejemplo, una célula T auxiliar 1 (Th1) o una célula T auxiliar 2 (Th2). La célula T puede ser una célula T auxilia (HTL; célula T CD4+), una célula T CD4+, una célula T citotóxica (CTL; célula T CD8+), una célula T citotóxica infiltrante de tumores (TIL; célula T CD8+), célula T CD4+CD8+, Célula T CD4'CD8‘, o cualquier otro subconjunto de células T. En una realización, la célula T es una célula efectora inmunitaria. En una realización, la célula T es una célula NKT. Otras poblaciones ilustrativas de células T adecuadas para su uso en realizaciones particulares incluyen células T vírgenes y células T de memoria.
En varias realizaciones, las células editadas en el genoma comprenden células efectoras inmunitarias que comprenden un gen de PD-1 editado por las composiciones y métodos contemplados en la presente. Una "célula efectora inmunitaria" es cualquier célula del sistema inmunitario que tiene una o más funciones efectoras (por ejemplo, actividad destructora de células citotóxicas, secreción de citoquinas, inducción de ADCC y/o CDC). Las células efectoras inmunitarias ilustrativas contempladas en realizaciones particulares son linfocitos T, en particular células T citotóxicas (CTL; células T CD8+), TIL y células T auxiliares (HTL; células T CD4+). En una realización, las células efectoras inmunitarias incluyen células asesinas naturales (NK). En una realización, las células efectoras inmunitarias incluyen células T asesinas naturales (NKT).
"Células T potentes" y "células T jóvenes" se usan indistintamente en realizaciones particulares y se refieren a fenotipos de células T en los que la célula T es capaz de proliferación y una disminución concomitante en la diferenciación. En realizaciones particulares, la célula T joven tiene el fenotipo de una "célula T virgen". En realizaciones particulares, las células T jóvenes comprenden uno o más, o todos los marcadores biológicos siguientes: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197 y CD38. En una realización, las células T jóvenes comprenden uno o más, o todos los marcadores biológicos siguientes: CD62L, CD127, CD197 y CD38. En una realización, las células T jóvenes carecen de expresión de CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, PD-1 y LAG3.
Las células T se pueden obtener de varias fuentes que incluyen, pero no se limitan a, células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de los ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo, y tumores.
En realizaciones particulares, una población de células que comprende células efectoras inmunitarias o células T comprende un gen de PD-1 editado, en donde la edición es un d Sb reparado por NHEJ. En realizaciones particulares, una célula efectora inmunitaria o célula T comprende un gen de PD-1 editado, en donde la edición es un DSB reparado por NHEJ. En realizaciones particulares, la edición es una inserción o eliminación (INDEL) de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 1415, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 o más nucleótidos en una secuencia codificante del gen de PD-1, preferiblemente en el exón 5, exón 1 o exón 2 del gen de PD-1, más preferiblemente en la SEQ ID NO: 25 (o SEQ ID NO: 27) en el exón 5 del gen de PD-1, en la SEQ ID NO: 30 (o SEQ ID NO: 32) en el exón 1 del gen de PD-1, o en la SEQ ID NO: 35 (o SEQ ID NO: 37) en el exón 2 del gen de PD-1.
En una realización particular, la edición es una deleción de 1, -1, -2, -3 o -4 nucleótidos en la secuencia codificante del gen de PD-1, preferiblemente en el exón 5, exón 1 o exón 2 del gen de PD-1, más preferiblemente en la SEQ ID NO: 25 (o SEQ ID NO: 27) en el exón 5 del gen de PD-1, en la SEQ ID NO: 30 (o SEQ ID NO: 32) en el exón 1 de el gen de PD-1, o en la SEQ ID NO: 35 (o SEQ ID NO: 37) en el exón 2 del gen de PD-1.
En realizaciones particulares, una población de células que comprende células efectoras inmunitarias o células T comprende un gen de PD-1 editado que comprende una plantilla de reparación del donante incorporada en un DSB reparado por HDR.
En realizaciones particulares, una población de células que comprende células efectoras inmunitarias o células T comprende un gen de PD-1 editado que comprende una plantilla de reparación del donante que comprende un gen de PD-1 o una porción del mismo y está diseñada para introducir una o más mutaciones en una secuencia de PD-1 genómico para modificar la expresión o señalización de PD-1, y preferiblemente, para disminuir o eliminar la expresión y/o señalización de PD-1.
En varias realizaciones, una célula editada en el genoma comprende una edición en el gen de PD-1 y comprende además un polinucleótido que codifica el receptor flip de PD-1, una molécula acopladora de células T biespecífica (BiTE); una citoquina (por ejemplo, IL-2, insulina, IFN-y, IL-7, IL-21, IL-10, IL-12, IL-15 y TNF-a), una quimiocina (por ejemplo, MIP-1a, MIP-1p, MCP-1, MCP-3 y RANTES), una citotoxina (por ejemplo, Perforina, Granzima A y Granzima B), un receptor de citoquinas (por ejemplo, un receptor de IL-2, un receptor de IL-7, un receptor de IL-12, un receptor de IL-15 y un receptor de IL-21), o un receptor de antígeno manipulado (por ejemplo, un receptor de células T manipulado (TCR), un receptor de antígeno quimérico (CAR), un receptor Daric o componentes de los mismos, o un receptor de citoquinas quimérico). En una realización, se introduce en la célula una plantilla de reparación donante que comprende el polinucleótido y una variante de nucleasa y el polinucleótido se incorpora al genoma de la célula en el sitio DSB en el gen de PD-1 mediante reparación HDR. El polinucleótido también puede introducirse en la célula en un sitio distinto al del gen de PD-1, por ejemplo, transduciendo la célula con un vector que comprende el polinucleótido.
I. COMPOSICIONES Y FORMULACIONES
Las composiciones contempladas en realizaciones particulares pueden comprender uno o más polipéptidos, polinucleótidos, vectores que comprenden los mismos, y composiciones de edición del genoma y composiciones de células editadas en el genoma, como se contempla en la presente. Las composiciones y métodos de edición del genoma contemplados en realizaciones particulares son útiles para editar un sitio objetivo en el gen de muerte celular programada 1 (PD-1) humano en una célula o una población de células. En realizaciones preferidas, se usa una composición de edición del genoma para editar un gen de PD-1 en una célula hematopoyética, por ejemplo, una célula T o una célula efectora inmunitaria.
En varias realizaciones, las composiciones contempladas en la presente comprenden una variante de nucleasa y, opcionalmente, una enzima de procesamiento de extremos, por ejemplo, una exonucleasa 3'-5' (Trex2). La variante de nucleasa puede estar en forma de un ARNm que se introduce en una célula a través de métodos de administración de polinucleótidos descritos anteriormente, por ejemplo, electroporación, nanopartículas lipídicas, etc. En una realización, se introduce una composición que comprende un ARN, que codifica una variante de endonucleasa homing de megaTAL y opcionalmente una exonucleasa 3'-5' en una célula a través de los métodos de administración de polinucleótidos divulgados anteriormente. La composición puede usarse para generar una célula editada en el genoma o una población de células editada en el genoma por NHEJ propenso a errores.
En varias realizaciones, las composiciones contempladas en la presente comprenden una plantilla de reparación de donante. La composición puede administrarse a una célula que expresa o expresará una variante de nucleasa y, opcionalmente, una enzima de procesamiento de extremos. En una realización, la composición puede administrarse a una célula que expresa o expresará una variante de endonucleasa homing o megaTAL y, opcionalmente, una exonucleasa 3'-5'. La expresión de las enzimas de edición de genes en presencia de la plantilla de reparación del donante puede usarse para generar una célula editada en el genoma o una población de células editadas en el genoma mediante HDR.
En realizaciones particulares, las composiciones contempladas en la presente comprenden una población de células, una variante de nucleasa y, opcionalmente, una plantilla de reparación del donante. En realizaciones particulares, las composiciones contempladas en la presente comprenden una población de células, una variante de nucleasa, una enzima de procesamiento de extremos y, opcionalmente, una plantilla de reparación del donante. La variante de nucleasa y/o la enzima de procesamiento de extremos pueden estar en forma de un ARNm que se introduce en la célula a través de métodos de administración de polinucleótidos divulgados anteriormente.
En realizaciones particulares, las composiciones contempladas en la presente comprenden una población de células, una variante de endonucleasa homing o megaTAL y, opcionalmente, una plantilla de reparación del donante. En realizaciones particulares, las composiciones contempladas en la presente comprenden una población de células, una variante de endonucleasa homing o megaTAL, una exonucleasa 3'-5' y, opcionalmente, una plantilla de reparación del donante. La variante de endonucleasa homing, megaTAL y/o exonucleasa 3'-5' puede estar en forma de un ARNm que se introduce en la célula a través de métodos de administración de polinucleótidos divulgados anteriormente.
En realizaciones particulares, la población de células comprende células efectoras inmunitarias genéticamente modificadas.
Las composiciones incluyen, pero no se limitan a, composiciones farmacéuticas. Una "composición farmacéutica" se refiere a una composición formulada en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables para la administración a una célula o un animal, ya sea sola o en combinación con una o más de otras modalidades de terapia. También se entenderá que, si se desea, las composiciones también pueden administrarse en combinación con otros agentes, como, por ejemplo, citoquinas, factores de crecimiento, hormonas, moléculas pequeñas, agentes quimioterapéuticos, profármacos, fármacos, anticuerpos u otros varios agentes farmacéuticamente activos. Prácticamente no hay límite para otros componentes que también pueden incluirse en las composiciones, siempre que los agentes adicionales no afecten negativamente a la composición.
La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en la presente para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin una toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación excesivas, acorde con una proporción razonable de beneficio/riesgo.
El término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere aun diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administran las células terapéuticas. Los ejemplos ilustrativos de portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como medios de cultivo celular, agua y aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. También pueden emplearse como portadores líquidos las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados en realizaciones particulares incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. En las composiciones también pueden incorporarse ingredientes activos suplementarios.
En una realización, una composición que comprende un portador farmacéuticamente aceptable es adecuada para la administración a un sujeto. En realizaciones particulares, una composición que comprende un portador es adecuada para la administración parenteral, por ejemplo, administración intravascular (intravenosa o intraarterial), intraperitoneal o intramuscular. En realizaciones particulares, una composición que comprende un portador farmacéuticamente aceptable es adecuada para la administración intraventricular, intraespinal o intratecal. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas estériles, medios de cultivo celular o dispersiones. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con las células transducidas, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas.
En realizaciones particulares, las composiciones contempladas en la presente comprenden células T modificadas genéticamente y un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición que comprende una composición basada en células contemplada en la presente puede administrarse por separado mediante métodos de administración enteral o parenteral o en combinación con otros compuestos adecuados para lograr los objetivos de tratamiento deseados.
El portador farmacéuticamente aceptable debe tener una pureza suficientemente alta y una toxicidad suficientemente baja para que sea adecuado para la administración al sujeto humano que se está tratando. Además, debería mantener o aumentar la estabilidad de la composición. El portador farmacéuticamente aceptable puede ser líquido o sólido y se selecciona, teniendo en cuenta la forma planificada de administración, para proporcionar el volumen, la consistencia, etc. deseados, cuando se combina con otros componentes de la composición. Por ejemplo, el portador farmacéuticamente aceptable puede ser, sin limitación, un agente aglutinante (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.), un relleno (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos, hidrogenofosfato de calcio, etc.), un lubricante (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.), un disgregante (por ejemplo, almidón, glicolato de almidón de sodio, etc.) o un agente humectante (por ejemplo, laurilsulfato de sodio, etc.).Otros portadores farmacéuticamente aceptables adecuados para las composiciones contempladas en la presente incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatinas, amilosas, estearatos de magnesio, talcos, ácidos silícicos, parafinas viscosas, hidroximetilcelulosas, polivinilpirrolidonas y similares.
Tales soluciones portadoras también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. El término "tampón", como se usa en la presente, se refiere a una solución o líquido cuya composición química neutraliza ácidos o bases sin un cambio significativo en el pH. Los ejemplos de tampones contemplados en la presente incluyen, pero no se limitan a, solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS), solución de Ringer, dextrosa al 5% en agua (D5W), solución salina normal/fisiológica (0,9% de NaCl).
Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden estar presentes en cantidades suficientes para mantener un pH de la composición de aproximadamente 7. Alternativamente, la composición tiene un pH en un intervalo de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,4, por ejemplo, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3 y 7,4. En otra realización más, la composición tiene un pH de aproximadamente 7,4.
Las composiciones contempladas en la presente pueden comprender un medio no tóxico farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden ser una suspensión. El término "suspensión", como se usa en la presente, se refiere a condiciones no adherentes en las que las células no están unidas a un soporte sólido. Por ejemplo, las células mantenidas como suspensión pueden removerse o agitarse y no se adhieren a un soporte, como una placa de cultivo.
En realizaciones particulares, las composiciones contempladas en la presente se formulan en una suspensión, donde las células T editadas en el genoma se dispersan en un medio o solución líquida aceptable, por ejemplo, solución salina o medio libre de suero, en una bolsa intravenosa (IV) o similar. Los diluyentes aceptables incluyen, pero no se limitan a, agua, PlasmaLyte, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio (salina), medio de cultivo celular sin suero y medio adecuado para almacenamiento criogénico, por ejemplo, medio Cryostor®.
En ciertas realizaciones, un portador farmacéuticamente aceptable está sustancialmente libre de proteínas naturales de origen humano o animal y es adecuado para almacenar una composición que comprende una población de células T editadas en el genoma. La composición terapéutica está destinada a ser administrada a un paciente humano y, por lo tanto, está sustancialmente libre de componentes de cultivo celular como albúmina de suero bovino, suero de caballo y suero bovino fetal.
En algunas realizaciones, las composiciones se formulan en un medio de cultivo celular farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones son adecuadas para la administración a sujetos humanos. En realizaciones particulares, el medio de cultivo celular farmacéuticamente aceptable es un medio libre de suero.
El medio libre de suero tiene varias ventajas sobre el medio que contiene suero, incluyendo una composición simplificada y mejor definida, un grado reducido de contaminantes, la eliminación de una fuente potencial de agentes infecciosos y un coste más bajo. En varias realizaciones, el medio libre de suero está libre de animales y opcionalmente puede estar libre de proteínas. Opcionalmente, el medio puede contener proteínas recombinantes biofarmacéuticamente aceptables. Medio "libre de animales" se refiere a un medio en donde los componentes se derivan de fuentes no animales. Las proteínas recombinantes reemplazan a las proteínas animales nativas en un medio libre de animales y los nutrientes se obtienen de fuentes sintéticas, vegetales o microbianas. El medio "libre de proteínas", por el contrario, se define como sustancialmente libre de proteínas.
Los ejemplos ilustrativos de medios libres de suero usados en composiciones particulares incluyen, pero no se limitan a, QBSF-60 (Quality Biological, Inc.), StemPro-34 (Life Technologies) y X-VIVO 10.
En una realización preferida, las composiciones que comprenden células T editadas con genoma se formulan en PlasmaLyte.
En varias realizaciones, las composiciones que comprenden células T editadas en el genoma se formulan en un medio de crioconservación. Por ejemplo, pueden usarse medios de crioconservación con agentes de crioconservación para mantener un resultado de alta viabilidad celular después de la descongelación. Los ejemplos ilustrativos de medios de crioconservación usados en composiciones particulares incluyen, pero no se limitan a, CryoStor CS10, CryoStor CS5 y CryoStor CS2.
En una realización, las composiciones se formulan en una solución que comprende 50:50 de PlasmaLyte A a CryoStor CS10.
En realizaciones particulares, la composición está sustancialmente libre de contaminación micoplasmática, por endotoxinas y microbiana. Por "sustancialmente libre" con respecto a la endotoxina se entiende que hay menos endotoxina por dosis de células que la permitida por la FDA para un producto biológico, que es una endotoxina total de 5 UE/kg de peso corporal por día, que para una persona media de 70 kg es de 350 u E por dosis total de células. En realizaciones particulares, las composiciones que comprenden células progenitoras o madre hematopoyéticas transducidas con un vector retroviral contemplado en la presente contienen de aproximadamente 0,5 UE/ml a aproximadamente 5,0 UE/ml, o aproximadamente 0,5 UE/ml, 1,0 UE/ml, 1,5 UE/ml, 2,0 UE/ml, 2,5 UE/ml, 3,0 UE/ml, 3,5 UE/ml, 4,0 UE/ml, 4,5 UE/ml o 5,0 UE/ml.
En ciertas realizaciones, se contemplan composiciones y formulaciones adecuadas para la administración de polinucleótidos que incluyen, pero no se limitan a, uno o más ARNm que codifican una o más nucleasas reprogramadas y, opcionalmente, enzimas de procesamiento de extremos.
Las formulaciones ejemplares para la administración ex vivo también pueden incluir el uso de varios agentes de transfección conocidos en la técnica, como fosfato de calcio, electroporación, choque térmico y varias formulaciones de liposomas (es decir, transfección mediada por lípidos). Los liposomas, como se describe con mayor detalle a continuación, son bicapas lipídicas que atrapan una fracción de líquido acuoso. El ADN se asocia espontáneamente a la superficie externa de los liposomas catiónicos (en virtud de su carga) y estos liposomas interactuarán con la membrana celular.
En realizaciones particulares, la formulación de soluciones portadoras farmacéuticamente aceptables es bien conocida por los expertos en la técnica, al igual que el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en la presente en una variedad de regímenes de tratamiento, incluyendo, por ejemplo, enteral y parenteral, por ejemplo, administración y formulación intravascular, intravenosa, intraarterial, intraósea, intraventricular, intracerebral, intracraneal, intraespinal, intratecal e intramedular. El experto en la materia entenderá que las realizaciones particulares contempladas en la presente pueden comprender otras formulaciones, como las que son bien conocidas en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, volumen I y volumen II. 22a edición. Editado por Loyd V. Allen Jr. Filadelfia, PA: Pharmaceutical Press; 2012.
J. TERAPIAS CELULARES EDITADAS EN EL GENOMA
Las células editadas en el genoma fabricadas mediante las composiciones y los métodos contemplados en la presente proporcionan productos farmacéuticos mejorados para su uso en la prevención, el tratamiento o la mejora de por lo menos un síntoma de un cáncer, GVHD, una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria o una inmunodeficiencia. Como se usa en la presente, el término "producto farmacéutico" se refiere a células modificadas genéticamente producidas usando las composiciones y métodos contemplados en la presente. En realizaciones particulares, el producto farmacéutico comprende células efectoras inmunitarias o células T editadas genéticamente. Además, las células T editadas en el genoma contempladas en realizaciones particulares proporcionan terapias de células adoptivas más seguras y eficaces porque son resistentes al agotamiento de las células T y muestran una durabilidad y persistencia aumentadas en el microambiente tumoral que puede llevar a una terapia sostenida
En realizaciones particulares, se usa una cantidad eficaz de células efectoras inmunitarias editadas en el genoma o células T que comprenden un gen de PD-1 editado para prevenir, tratar o mejorar por lo menos un síntoma de un cáncer, GVHD, una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, o una inmunodeficiencia.
En realizaciones particulares, las células editadas en PD-1 no expresan sustancialmente o carecen de expresión de PD-1 y, por lo tanto, carecen o carecen sustancialmente de expresión funcional de PD-1, por ejemplo, carecen de la capacidad de aumentar el agotamiento de las células T y de inhibir la expresión de citoquinas proinflamatorias. En realizaciones particulares, las células efectoras inmunitarias editadas en el genoma que carecen de PD-1 son más resistentes a las señales inmunosupresoras del microambiente tumoral y muestran una persistencia y resistencia aumentadas al agotamiento de las células T.
En realizaciones particulares, las células efectoras inmunitarias editadas en el genoma o las células T que comprenden un gen de PD-1 editado de acuerdo con la invención se usan en un método para prevenir, tratar o mejorar por lo menos un síntoma de un cáncer, en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de células efectoras inmunitarias editadas en el genoma o células T que comprenden un gen de PD-1 editado y un TCR, CAR o Daric manipulado u otro transgén terapéutico para redirigir las células a un tumor o cáncer. Las células modificadas genéticamente son un producto farmacéutico más duradero y persistente porque las células son más resistentes a las señales inmunosupresoras del microambiente tumoral en virtud de la edición del gen de PD-1 para disminuir o eliminar la expresión de PD-1.
En realizaciones particulares, las células editadas en el genoma contempladas en la presente se usan en el tratamiento de tumores sólidos o cánceres.
En realizaciones particulares, las células editadas en el genoma contempladas en la presente se usan en el tratamiento de tumores sólidos o cánceres que incluyen, pero no se limitan a: cáncer suprarrenal, carcinoma adrenocortical, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma, tumorteratoideo/rabdoideo atípico, carcinoma de células basales, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer de cerebro/SNC, cáncer de mama, tumores bronquiales, tumores cardíacos, cáncer de cuello uterino, colangiocarcinoma, condrosarcoma, cordoma, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, carcinoma ductal in situ (DCIS) cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, sarcoma de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer ocular, cáncer de las trompas de Falopio, histiosarcoma fibroso, fibrosarcoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumores carcinoides gastrointestinales, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumores de células germinales, glioma, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, hemangioblastoma, cáncer hepatocelular, cáncer de hipofaringe, melanoma intraocular, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leiomiosarcoma, cáncer de labio, liposarcoma, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, tumor carcinoide de pulmón, mesotelioma maligno, carcinoma medular, meduloblastoma, menangioma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, carcinoma del tracto de la línea media, cáncer de boca, mixosarcoma, síndrome mielodisplásico, neoplasias mieloproliferativas, cáncer de la cavidad nasal y senos paranasales, cáncer de nasofaringe, neuroblastoma, oligodendroglioma, cáncer oral, cáncer de cavidad oral, cáncer de orofaringe, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, tumores de células de los islotes pancreáticos, carcinoma papilar, paraganglioma, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, pinealoma, tumor pituitario, blastoma pleuropulmonar, cáncer peritoneal primario, cáncer de próstata, cáncer de recto, retinoblastoma, carcinoma de células renales, cáncer de pelvis renal y uréter, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, carcinoma de glándulas sebáceas, cáncer de piel, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, carcinoma de glándulas sudoríparas, sinovioma, cáncer testicular, cáncer de garganta, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer de uretra, cáncer uterino, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer vascular, cáncer de vulva y tumor de Wilms.
En realizaciones particulares, las células editadas en el genoma contempladas en la presente se usan en el tratamiento de tumores sólidos o cánceres que incluyen, sin limitación, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de huesos, cáncer de tiroides, cáncer de riñón o cáncer de piel.
En realizaciones particulares, las células editadas en el genoma contempladas en la presente se usan en el tratamiento de varios tipos de cáncer que incluyen, pero no se limitan a, de páncreas, de vejiga y de pulmón.
En realizaciones particulares, las células editadas en el genoma contempladas en la presente se usan en el tratamiento de cánceres líquidos o cánceres hematológicos.
En realizaciones particulares, las células editadas en el genoma contempladas en la presente se usan en el tratamiento de enfermedades malignas de células B, que incluyen, pero no se limitan a: leucemias, linfomas y mieloma múltiple.
En realizaciones particulares, las células editadas en el genoma contempladas en la presente se usan en el tratamiento de cánceres líquidos que incluyen, pero no se limitan a, leucemias, linfomas y mielomas múltiples: leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, eritroleucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocítica crónica (CLL) y leucemia mieloide crónica (CML), leucemia mielomonocítica crónica (CMML) y policitemia vera, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin con predominio de linfocitos nodulares, linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeño (SLL), linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma inmunoblástico de células grandes, linfoma linfoblástico B precursor, linfoma de células del manto, linfoma de la zona marginal, micosis fungoide, linfoma anaplásico de células grandes, síndrome de Sézary, linfoma linfoblástico T precursor, mieloma múltiple, mieloma múltiple manifiesto, mieloma múltiple latente, leucemia de células plasmáticas, mieloma no secretor, mieloma de IgD, mieloma osteoesclerótico, plasmacitoma solitario de hueso y plasmacitoma extramedular.
Las células preferidas para usar en los métodos de edición del genoma contemplados en la presente incluyen células autólogas/autogénicas ("propias"), preferiblemente células hematopoyéticas, más preferiblemente células T y más preferiblemente células efectoras inmunitarias o células Treg.
En realizaciones particulares, se proporcionan células editadas en el genoma o una composición que comprende las mismas de acuerdo con la invención que se usan en métodos que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de células editadas en el genoma contempladas en la presente o una composición que comprende las mismas, a un paciente con necesidad de las mismas, solas o en combinación con uno o más agentes terapéuticos. En ciertas realizaciones, las células se usan en el tratamiento de pacientes con riesgo de desarrollar cáncer, GVHD, una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria o una inmunodeficiencia. Por tanto, las realizaciones particulares comprenden células editadas en el genoma para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de por lo menos un síntoma de un cáncer, una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria o una inmunodeficiencia que comprende administrar a un sujeto con necesidad de ello, una cantidad terapéuticamente eficaz de las células editadas en el genoma contempladas en la presente.
En una realización, una composición que comprende células editadas en el genoma de acuerdo con la invención se usa en un método para tratar un cáncer, GVHD, una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria o una inmunodeficiencia en un sujeto con necesidad de ello, en donde el método comprende administrar una cantidad eficaz, por ejemplo, cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende células editadas en el genoma contempladas en la presente. La cantidad y la frecuencia de administración estarán determinadas por factores como la condición del paciente y el tipo y la gravedad de la enfermedad del paciente, aunque las dosificaciones apropiadas pueden determinarse mediante ensayos clínicos.
En una realización ilustrativa, la cantidad eficaz de células editadas en el genoma proporcionadas a un sujeto es de por lo menos 2 x 106 células/kg, por lo menos 3 x 106 células/kg, por lo menos 4 x 106 células/kg, por lo menos 5 x 106 células/kg, por lo menos 6 x 106 células/kg, por lo menos 7 x 106 células/kg, por lo menos 8 x 106 células/kg, por lo menos 9 x 106 células/kg, o por lo menos 10x 106 células/kg, o más células/kg, incluyendo todas las dosis intermedias de células.
En otra realización ilustrativa, la cantidad eficaz de células editadas en el genoma proporcionadas a un sujeto es de aproximadamente 2 x 106 células/kg, aproximadamente 3 x 106 células/kg, aproximadamente 4 x 106 células/kg, aproximadamente 5 x 106 célula /kg, aproximadamente 6 x 106 células/kg, aproximadamente 7 x 106 células/kg, aproximadamente 8 x 106 células/kg, aproximadamente 9 x 106 células/kg, o aproximadamente 10x 106 células/kg, o más células/kg, incluyendo todas las dosis intermedias de células.
En otra realización ilustrativa, la cantidad eficaz de células editadas en el genoma proporcionadas a un sujeto es de aproximadamente 2 x 106 células/kg a aproximadamente 10x 106 células/kg, de aproximadamente 3 x 106 células/kg a aproximadamente 10x 106 células/kg, de aproximadamente 4 x 106 células/kg a aproximadamente 10x 106 células/kg, de aproximadamente 5 x 106 células/kg a aproximadamente 10x 106 células/kg, de 2 x 106 células/kg a aproximadamente 6 x 106 células/kg, de 2 x 106 células/kg a aproximadamente 7 x 106 células/kg, de 2 x 106 células/kg a aproximadamente 8 x 106 células/kg, de 3 x 106 células/kg a aproximadamente 6 x 106 células/kg, de 3 x 106 células/kg a aproximadamente 7 x 106 células/kg, de 3 x 106 células/kg a aproximadamente 8 x 106 células/kg, de 4 x 106 células/kg a aproximadamente 6 x 106 células/kg, de 4 x 106 células/kg a aproximadamente 7 x 106 células/kg, de 4 x 106 células/kg a aproximadamente 8 x 106 células/kg, de 5 x 106 células/kg a aproximadamente 6 x 106 células/kg, de 5 x 106 células/kg a aproximadamente 7 x 106 células/kg, de 5 x 106 células/kg a aproximadamente 8 x 106 células/kg, o de 6 x 106 células/kg a aproximadamente 8 x 106 células/kg, incluyendo todas las dosis intermedias de células.
Un experto en la técnica reconocería que pueden requerirse múltiples administraciones de las composiciones contempladas en realizaciones particulares para efectuar la terapia deseada. Por ejemplo, una composición puede administrarse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces en un lapso de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 1 año, 2 años, 5 años, 10 años o más.
En ciertas realizaciones, puede ser deseable administrar células T activadas a un sujeto y luego volver a extraer sangre (o realizar una aféresis), activar las células T de la misma y volver a infundir al paciente estas células T activadas y expandidas. Este proceso puede llevarse a cabo varias veces cada pocas semanas. En ciertas realizaciones, las células T pueden activarse a partir de extracciones de sangre de 10 cc a 400 cc. En ciertas realizaciones, las células T se activan a partir de extracciones de sangre de 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc, 100 cc, 150 cc, 200 cc, 250 cc, 300 cc, 350 cc o 400 cc o más. Para no ceñirse a la teoría, el uso de este protocolo de múltiples extracciones de sangre/múltiples reinfusiones puede servir para seleccionar ciertas poblaciones de células T.
La administración de las composiciones contempladas en realizaciones particulares puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, incluyendo por inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación 0 trasplante. En una realización preferida, las composiciones se administran por vía parenteral. Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral", como se usan en la presente, se refieren a modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, habitualmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravascular, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbitaria, intratumoral, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intraesternal. En una realización, las composiciones contempladas en la presente se administran a un sujeto mediante inyección directa a un tumor, ganglio linfático, o sitio de infección.
En una realización, una población de efectores inmunitarios editados en el genoma de acuerdo con la invención se usa en un método para tratar a un sujeto diagnosticado con un cáncer, en donde el método comprende eliminar células efectoras inmunitarias del sujeto, editar el genoma de dichas células efectoras inmunitarias y producir una población de células efectoras inmunitarias editadas en el genoma, y administrar la población de células efectoras inmunitarias editadas en el genoma al mismo sujeto. En una realización preferida, las células efectoras inmunitarias comprenden células T.
Los métodos para administrar las composiciones celulares contempladas en realizaciones particulares incluyen cualquier método que sea eficaz para dar como resultado la reintroducción de células efectoras inmunitarias editadas en el genoma ex vivo o la reintroducción de progenitores editados en el genoma de células efectoras inmunitarias que tras introducirse en un sujeto se diferencian en células efectoras inmunitarias maduras. Un método comprende editar el genoma de células T de sangre periférica ex vivo y devolver las células transducidas al sujeto.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
REPROGRAMACIÓN DE I-ONUI PARA ALTERAR EL MOTIVO DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR DENTRO DEL GEN DEL RECEPTOR-1 DE MUERTE PROGRAMADA (PD-1)
PD-1 se expresa en la membrana plasmática de las células T después de la estimulación y activación del receptor de antígeno. PD-1 comprende un péptido señal, un dominio extracelular similar a IgV, un dominio que abarca la transmembrana y una cola intracelular que contiene tanto un motivo de inhibición basado en tirosina de inmunorreceptor (ITIM, secuencia de consenso S/I/V/LxYxxI/V/L) como un motivo de cambio basado en tirosina de inmunorreceptor (ITSM, secuencia de consenso TxYxxV/I). Figura 1A. La tirosina en la posición de aminoácidos 248 dentro de ITSm del PD-1 se fosforila con la unión del ligando PD-L1/2 concomitante con la activación de las células T, estableciendo un sustrato de unión para la proteína tirosina fosfatasa-2 que contiene el dominio SH2 (SHP2, consultar Chemnitz JM et al., J Immunol., 15 de julio de 2004; 173(2):945-54). El reclutamiento de SHP2 en la membrana plasmática contrarresta las señales de activación impulsadas por fosfotirosina en las células T (Yokosuka T et. al., J Exp Med. 4 de junio de 2012 ;209(6): 1201-17) y suprime la duración del estado activado de las células T. El codón para la tirosina de ITSM fosforilada está englobado por un motivo de escisión “central-4” I-OnuI canónico, ATAC. Figura 1B. Se desarrolló una variante de endonucleasa homing dirigida a la secuencia objetivo de 22 pb (SEQ ID NO: 25) centrada en este motivo central-4 en el exón 5 del gen de PD-1.
Sin querer estar limitados a ninguna teoría particular, se contempla que todos los eventos putativos de inserción/eliminación ('indeles') en y proximales a la secuencia central-4 de ATAC abolirían por completo una o más características esenciales del motivo ITSM, con la mayoría plausible indeles alterando el propio codón de tirosina-248. Es probable que estos indeles generen proteínas PD-1 negativas dominantes que comprenden un dominio extracelular normal y un dominio de señalización intracelular no funcional. Las proteínas PD-1 negativas dominantes pueden actuar como un "sumidero" para los ligandos de PD-1, reduciendo o eliminando de este modo la señalización inmunosupresora. Además, debido a que las células T activadas regulan por incremento la expresión de PD-L1; debido a que las interacciones PD-1:PD-L1 se producen entre las células T, ya sea en cis o trans; y debido a que estas interacciones son importantes para la función de las células T, la edición de genes para alterar la señalización de PD-1 sin impactar en la expresión puede conservar las funciones impulsadas por PD-L1 putativas.
Por lo tanto, I-OnuI se reprogramó para dirigirse a la región de codificación de ITSM mediante la construcción de bibliotecas modulares que contienen residuos de aminoácidos variables en la interfaz de reconocimiento de ADN. Para construir las variantes, se incorporaron codones degenerados en dominios de unión a ADN I-OnuI usando oligonucleótidos. Los oligonucleótidos que codifican los codones degenerados se usaron como plantillas de PCR para generar bibliotecas de variantes mediante recombinación de espacios en la cepa de levadura S. cerevisiae. Cada biblioteca variante abarcó el dominio de reconocimiento de ADN I-OnuI N- o C-terminal y contenía de ~107 a 108 transformantes únicos. Las bibliotecas de presentación en superficie resultantes se seleccionaron mediante citometría de flujo para determinar la actividad de escisión frente a los sitios objetivo que comprenden los "medios sitios" de los dominios correspondientes (SEQ ID NO: 28-29), como se muestra en la Figura 2.
Se purificó la levadura que presentaba los dominios N- y C-terminales reprogramados I-OnuI HE y se extrajo el ADN del plásmido. Se realizaron reacciones de PCR para amplificar los dominios reprogramados, que posteriormente se transformaron en S. cerevisiae para crear una biblioteca de combinaciones de dominios reprogramados. Las variantes de I-OnuI completamente reprogramadas que reconocen el sitio objetivo completo (SEQ ID NO: 25) presentes en la región codificante de ITSM en el exón 5 del gen de PD-1 se identificaron a partir de esta biblioteca y se purificaron.
La actividad de las HE I-OnuI reprogramadas que se dirigen a la región de codificación de ITSM de PD-1 en el exón 5 se midió usando un sistema indicador fluorescente integrado cromosómicamente (Certo et. al., 2011). Las HE I-OnuI completamente reprogramadas que se unen y escinden la secuencia objetivo de ITSM de PD-1 se clonaron en plásmidos de expresión de mamíferos y luego se transfectaron individualmente en una línea celular de fibroblastos HEK 293T que contenía la secuencia objetivo del exón 5 de PD-1 en sentido ascendente de un gen fuera de marco que codifica la proteína mCherry fluorescente. La escisión del sitio objetivo incrustado por la HE y la acumulación de indeles después de la reparación del ADN a través de la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ) da como resultado aproximadamente uno de cada tres loci reparados que colocan el gen informador fluorescente de nuevo "en marco". Por lo tanto, el porcentaje de células HEK 293T fluorescentes de mCherry se usa como lectura de la actividad de la endonucleasa en la secuencia objetivo cromosómicamente incrustada. La HE I-OnuI completamente reprogramada (PD-1.ITSM.ex5_RD1_CV3-08, SEQ ID NO:6) dirigida al sitio del exón 5 de PD-1 mostró una eficiencia muy moderada de expresión de mCherry en un contexto cromosómico celular. Figura 3A. La variante de HE tenía propiedades de afinidad por el ADN moderadas cuando se midió mediante titulación de sustrato de equilibrio (Figura 3B).
A continuación, se generó una biblioteca secundaria de variantes I-OnuI realizando una mutagénesis aleatoria en la variante de HE PD-1.ITSM.ex5_RD1_CV3-08. La clasificación de flujo basada en presentación se realizó en condiciones de escisión más estrictas en un esfuerzo por aislar variantes con eficiencia catalítica mejorada. Este proceso identificó una variante de I-OnuI PD-1.ITSM.ex5_RD2_73, SEQ ID NO: 7), que contenía cuatro mutaciones de aminoácidos con respecto a la variante RD1, y tiene una tasa varias veces mayor de células que expresan mCherry frente a la variante RD1. Figura 4. Se realizaron tres rondas adicionales de selecciones de refinamiento de actividad para aumentar la eficiencia de edición de genes en el sitio objetivo del exón 5 (PD-1.ITSM.ex5_RD3_03, SEQ ID NO: 8; PD-1.ITSM.ex5_RD4_CV23, SEQ ID NO: 9; y PD-1.ITSM.ex5_RD5_CV23MK, SEQ ID NO: 10).
EJEMPLO 2
CARACTERIZACIÓN DE UNA VARIANTE I-ONUI Y UNA MEGATAL DIRIGIDO AL EXÓN 5 DE PD-1
El sitio objetivo del exón 5 de PD-1 comprende motivos de dinucleótidos CpG tanto en el sitio de unión a la meganucleasa como en el sitio de unión de la matriz TAL adyacente (Figura 1B). El estado de metilación de estos dinucleótidos se evaluó mediante secuenciación con bisulfito en células T humanas primarias activadas con CD3 y CD28 y cultivadas en medios completos suplementados con IL-2. Después de 3 días, se aisló el ADN genómico y se trató con bisulfito para convertir cualquier base de citosina no metilada en uracilo. Luego, se secuenció el sitio objetivo del exón 5 para revelar el estado no metilado (convertido en timina) frente al estado metilado (permanece citosina) de cada citosina. Los resultados muestran que ambas citosinas del motivo CpG en el sitio objetivo estaban predominantemente metiladas (Figura 5), en consonancia con los patrones de metilación típicos del 'cuerpo génico'.
Para confirmar que la variante de HE PD-1 ITSM.ex5_RD5_CV23MK reconocía y escindía el sitio objetivo del exón 5 metilado, se realizaron análisis de afinidad de unión al ADN y de escisión usando sustratos que contenían 5-metilcitosina en la posición p5 del sitio objetivo, o en el complemento inverso de la base de guanina en p6, o en ambas cadenas de la secuencia objetivo, que es representativa del estado de metilación del sitio objetivo en las células T activadas. Figura 6. La variante de HE se unió y escindió los sustratos de ADN metilados y el sustrato no modificado de manera similar.
La variante de HE PD-1.ITSM.ex5_RD5_CV23MK se formateó como megaTAL (SEQ ID NO: 19) agregando la matriz TAL de 10,5 unidades tolerante a 5-metilcitosina, correspondiente a un sitio objetivo de la matriz TAL de 11 pares de bases (SEQ ID NO: 26), al extremo N-terminal del dominio de meganucleasas (como se describe en Boissel et al., 2013). La secuencia del sitio objetivo de megaTAL se expone en la SEQ ID NO: 27. El megaTAL se analizó frente al dinucleótido CpG metilado presente en el sitio objetivo de la matriz TAL. La matriz TAL se diseñó para tolerar la base metilada mediante la incorporación de un RVD 'N*' en la posición de la matriz correspondiente.
La eficiencia de edición de megaTAL se evaluó preestimulando las células T humanas primarias con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 en medios suplementados con citoquinas durante 48-72 horas, y luego electroporando las células con ARNm transcrito in vitro (IVT), protegido y poliadenilado (SEQ ID NO: 40) que codifica PD-1.ITSM.ex5_RD5_CV23MK megaTAL. Además, se añadió IVT-ARNm que codifica la exonucleasa Trex2 de 3' a 5' para mejorar el procesamiento de roturas mediante la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ) (ver Certo et al., 2012). Después de la electroporación, las células se cultivaron durante 7-10 días en medios suplementados con citoquinas, tiempo durante el cual se retiraron alícuotas para el aislamiento del ADN genómico seguido de amplificación por PCR en el sitio objetivo del exón 5 de PD-1.
La frecuencia de indeles se midió usando Seguimiento de Indeles por Descomposición (TIDE, consultar Brinkman et al., 2014) o secuenciación de alto rendimiento. La eficiencia de edición de megaTAL PD-1.ITSM.ex5_RD5_CV23MK en presencia de Trex2 fue de aproximadamente el 60%. Figura 7A. Los tipos de indeles predominantes observados en el sitio objetivo fueron 1, -1, -2, -3 o -4 nucleótidos. Figura 7B. Este análisis confirmó que la variante PD-1.ITSM.ex5_RD5_CV23MK alteró el motivo de consenso PD-1 ITSM en una parte significativa de las células T humanas tratadas con megaTAL.
EJEMPLO 3
REPROGRAMACIÓN DE DOMINIOS DE MEGANUCLEAS I-ONUI PARA ALTERAR LOS DOMINIOS EXTRACELULARES DENTRO DEL GEN DEL RECEPTOR 1 DE MUERTE PROGRAMADA (PD-1)
La especificidad central-4 de una variante de HE I-OnuI que se dirige al sitio objetivo del exón 5 de PD-1 (SEQ ID NO: 25) se perfiló usando ensayos de endonucleasa in vitro de presentación en superficie de levadura de alto rendimiento (Jarjour, West- Foyle et al., 2009). Un plásmido que codifica una variante de HE que se dirige al exón 5 de PD-1 se transformó en S. cerevisiae para su presentación en superficie, luego se probó la actividad de escisión contra sustratos de ADN de cadena doble generados por PCR que comprenden la secuencia de ADN del sitio objetivo del exón 5 de PD-1 que contiene cada una de las 256 posibles secuencias centrales-4. El perfil de especificidad mostró que este I-OnuI reprogramado es altamente selectivo para los sitios de objetivos del objetivo central-4 (Figura 8), pero también puede escindir sitios objetivo central-4 no canónicos adicionales. Como hay muy pocos sitios objetivo canónicos I-OnuI central-4 localizados en otras partes del gen de PD-1, los sitios objetivo no canónicos central-4 en el exón 1 y el exón 2 de PD-1 se usaron para reprogramar endonucleasas homing adicionales.
Estos sitios objetivo central-4 no canónicos en el exón 1 y el exón 2 de PD-1 están en regiones que codifican el péptido señal y el dominio de IgV, respectivamente. Sin querer estar limitados por ninguna teoría en particular, se contempla que el direccionamiento de estas regiones mediante indeles de edición de genes anula o desestabiliza la expresión de la proteína PD-1 para crear un fenotipo knock-out limpio. Además, el acceso a estos sitios para operaciones de edición de genes más avanzadas que incluyen, pero no se limita an, la inserción dirigida de casetes transgénicos, podría crear fenotipos que están bajo un control regulatorio único.
I-OnuI se reprogramó para dirigirse a dos sitios objetivo que contienen central-4 no canónicos (SEQ ID NO: 30 y 35), uno en cada uno de estos dos exones/motivos, y se extiende a los sitios objetivo de la matriz TAL correspondientes (SEQ ID NO: 26 y 31) y sitios objetivo megaTAL completos (SEQ ID NO: 31 y 37). Figura 9Ay 9B. I-OnuI se reprogramó para dirigirse al exón 1 o al exón 2 del gen de PD-1 mediante la construcción de bibliotecas modulares que contenían residuos de aminoácidos variables en la interfaz de reconocimiento del ADN. Para construir las variantes, se incorporaron codones degenerados en dominios de unión a ADN I-OnuI usando oligonucleótidos. Los oligonucleótidos que codifican los codones degenerados se usaron como plantillas de PCR para generar bibliotecas de variantes mediante recombinación de espacios en la cepa de levadura S. cerevisiae. Cada biblioteca variante abarcaba el dominio de reconocimiento de ADN I-OnuI N- o C-terminal y contenía de ~107 a 108transformantes únicos. Las bibliotecas de presentación en superficie resultantes se seleccionaron mediante citometría de flujo para determinar la actividad de escisión frente a los sitios objetivo que comprenden los "medios sitios" de los dominios correspondientes (exón 1: SEQ ID NO: 34 y 35; exón 2: SEQ ID NO: 38 y 39).
Se purificó la levadura que presentaba las HE I-OnuI reprogramadas en los dominios N- y C-terminales y se extrajo el ADN del plásmido. Se realizaron reacciones de PCR para amplificar los dominios reprogramados, que posteriormente se transformaron en S. cerevisiae para crear bibliotecas de combinaciones de dominios reprogramados. Se identificaron y purificaron a partir de estas bibliotecas variantes de I-OnuI completamente reprogramadas activas contra el sitio objetivo completo en la región que codifica el péptido señal en el exón 1 de PD-1 y en la región que codifica el dominio de IgV en el exón 2 de PD-1.
Las HE I-OnuI reprogramadas que se dirigen a los sitios objetivo del exón 1 y el exón 2 de PD-1 se clonaron en plásmidos de expresión de mamíferos y luego se transfectaron individualmente en una línea celular de fibroblastos HEK 293T que contenía las secuencias objetivo correspondientes en sentido ascendente de un gen fuera de marco que codifica la proteína iRFP fluorescente.
Una HE I-OnuI reprogramada dirigida al sitio del exón 1 de PD-1 (PD-1.ile3.exon1_RD1_B1, SEQ ID NO: 11) mostró una eficiencia moderada de expresión de iRFP en un contexto cromosómico celular, ya sea como una variante de HE independiente o, después de formatearla como megaTAL (SEQ ID NO: 20). Se generó una biblioteca secundaria de variantes I-OnuI mediante la realización de mutagénesis aleatoria sobre la variante RD1 del exón 1 de PD-1 identificada en el proceso inicial de selección de la biblioteca. La clasificación de flujo basada en presentación se realizó en condiciones de escisión más estrictas en un esfuerzo por aislar variantes con eficiencia catalítica mejorada. Este proceso identificó dos variantes de I-OnuI (PD-1.ile3.exon1_RD2_B1H8, PD-1.ile3.exon1_RD2_B1G2, SeQ ID NO: 12 y 60 respectivamente). Las variantes contenían cuatro (PD-1.ile3.exon1_RD2_B1H8) o cinco (PD-1.ile3.exon1_RD2_B1G2) mutaciones de aminoácidos con respecto a la variante RD1, y tenían una tasa significativamente mayor de células que expresaban iRFP en comparación con la variante RD1 del exón 1 de PD-1, tanto como una variante de HE independiente como después de formatear como un megaTAL (SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 64). Figura 10.
Un HE I-OnuI reprogramada dirigida al sitio del exón 2 de PD-1 (PD-1.IgV.exon2_RD1_G5; SEQ ID NO: 13) mostró una alta eficiencia de expresión de iRFP cuando se administró como una variante de HE independiente o, después de formatear como un megaTAL (SEQ ID NO: 22).
Las variantes de HE de direccionamiento del exón 1 y el exón 2 mostraron fuertes propiedades de afinidad por el ADN cuando se midieron mediante titulación de sustrato en equilibrio usando sus respectivas secuencias objetivo. Figura 11A.
La nucleasa del exón 1 se refinó adicionalmente para mejorar su especificidad en la región en contacto con el par de bases -8, -7 y -6. Se construyeron microbibliotecas aleatorizando los residuos de aminoácidos 68, 70, 78, 80 y 82, y después de 6 rondas de clasificación por citómetro de flujo, tres clones (PD-1.ile3.exon1_RD2_B1G2C4, PD-1.ile3.exon1_RD2_B1G2C11 y PD-1.ile3.exon1_RD2_B1G2C5; SEQ ID NO: 61,62 y 63, respectivamente) mostraron una especificidad más alta que la nucleasa original (PD-1.ile3.exon1_RD2_B1G2; SEQ ID NO: 60). Figura 11B.
Se usó secuenciación con bisulfito para evaluar el estado de metilación de los motivos CpG presentes en los sitios objetivo del exón 1 y el exón 2 de PD-1. Figura 12. Se demostró que el motivo CpG en el sitio objetivo del exón 1 de PD-1 no estaba metilado en las células T activadas, mientras que ambos motivos CpG en el objetivo del exón 2 de PD-1 estaban metilados. Se realizó un análisis de actividad basado en presentación para confirmar que la secuencia objetivo del exón 2 de PD-1 completamente metilada con CpG fue escindida de manera eficiente por la variante de h E correspondiente.
Además, se usó el sitio objetivo del exón 2 completamente metilado con CpG para identificar una variante I-OnuI (PD-1.IgV.exon2_RD1_PS3, SEQ ID NO: 14) con actividad de unión y escisión mejoradas contra el sitio objetivo metilado con CpG.
EJEMPLO 4
LA ALTERACIÓN DIRIGIDA DEL GEN DE PD-1 EN LAS CÉLULAS T HUMANAS PRIMARIAS RECUPERA LA SUPRESIÓN DE LA FUNCIÓN DE LAS CELULAS T MEDIADA POR PD-L1
El impacto funcional de los megaTAL reprogramados para escindir varias secuencias objetivo en el gen de PD-1 se evaluó en células T humanas primarias activadas con CD3 y CD28 y cultivadas en medios completos suplementados con IL-2. Las PBMC activadas se transdujeron con un vector lentiviral que codifica un CAR anti-BCMA. Las células CAR T anti-BCMA se sometieron a electroporación con ARNm transcrito in vitro que codifica o el exón 5 de PD-1 o el exón 1 de PD-1 dirigidos a megaTAL (s Eq ID NO: 40 y 41, respectivamente) y el ARNm que codifica Trex2 (SEQ ID NO: 43). Los controles incluyeron células T no tratadas o células T tratadas con ARNm que codifica proteína fluorescente cian (CFP) o un megaTAL dirigido a CCR5 (consultar Sather et. al., Sci Transl Med. 30 de septiembre de 2015;7 (307): 307ra156). Después de una expansión de 10 días, las células T se estimularon con un reactivo de activación policlonal forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)/ionomicina (P/I). PD-1 se regula por incremento de manera natural en la superficie celular después de la activación de las células T. La regulación por incremento de PD-1 se suprimió después de la transfección de ARNm de megaTAL del exón 1 de PD-1, lo que indica que los indeles en esta región alteran la producción normal de la proteína de PD-1. Por el contrario, el tratamiento con ARNm que codifica un megaTAL de CCR5 de control o el exón 5 de PD-1 dirigido a megaTAL no tuvo impacto en la expresión de superficie de PD-1 a pesar de la alta tasa de indeles inducida en el ITSM por este megaTAL. Figura 13A. Experimentos adicionales repetidos en condiciones similares con versiones refinadas de especificidad del ARNm de megaTAL del exón 1 de PD-1 (SEQ ID NO: 65, 66, 67 y 68) también mostraron una alteración similar de la expresión de PD-1 en las células T. Figura 13B.
La administración simultánea de los megaTAL del exón 1 y del exón 5 de PD-1 mejoró significativamente la alteración de la expresión de la superficie celular de PD-1, independientemente de la administración de la exonucleasa Trex2. Figura 14. Esto indica que la formación simultánea de rupturas proximales de ADN es un mecanismo para promover grandes eventos de deleción de genes con alta eficiencia, independientemente de la mejora de indeles impulsada por exonucleasas.
El impacto de la alteración de la señalización de PD-1 en las células T al dirigirse a su expresión o a sus funciones de señalización se analizó mediante la producción de citoquinas de células CAR-T en respuesta a células tumorales manipuladas para expresar el ligando de PD-1, PD-L1. El cocultivo de células T CAR anti-BCMA con líneas de células tumorales que expresan BCMA dio como resultado la activación de las células T y la posterior secreción de citoquinas inflamatorias, ejemplificada por los altos niveles de TNFα e IL-17A medidos en el sobrenadante. La coexpresión de PD-L1 en células tumorales que expresan BCMA suprimió la producción de citoquinas inflamatorias. Sin embargo, la transfección de las células T CAR anti-BCMA con ARNm que codifica los megaTAL del exón 1 o del exón 5 de PD-1 reduce la supresión de citoquinas mediada por PD-L1, ya que la producción de citoquinas inflamatorias se rescata a los niveles de referencia en estas muestras. Figura 15A.
EJEMPLO 5
RECOMBINACIÓN HOMOLOGA DE UN TRANSGÉN EN EL EXÓN 1 DEL GEN DE PD-1
Se diseñó y construyó un plásmido de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que contenía un casete de promotor-transgén que comprendía un promotor heterólogo, un transgén que codifica una proteína fluorescente y una señal de poliadenilación, situado entre regiones de homología dirigidas a genes. La integridad de los elementos ITR de AAV se verificó con digestión XmaI. El casete del transgén se colocó entre dos regiones de homología, de aproximadamente 600-700 pb de longitud, que flanqueaban el sitio de escisión megaTAL del exón 1 de PD-1 (SEQ ID NO: 27). El brazo de homología 5' (SEQ ID NO: 54) contenía una parte del primer exón de PD-1 y otras secuencias en sentido ascendente del sitio de escisión de megaTAL. El brazo de homología 3' (SEQ ID NO: 55) contenía una parte del exón de PD-1 y otras secuencias en sentido descendente del sitio de escisión de megaTAL. Ninguna región de homología contenía el sitio objetivo de megaTAL completo. Este casete de expresión ejemplar contenía el potenciador del virus de sarcoma mieloproliferativo, región de control negativa eliminada, promotor sustituido del sitio de unión al cebador d1587rev (MND) enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido fluorescente, por ejemplo, proteína fluorescente azul (BFP), proteína fluorescente roja (RFP), proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente verde (GFP), etc. Además, el casete de expresión contenía la señal de poliadenilación tardía SV40 colocada en sentido descendente del codón de terminación del transgén. Figura 16A. El AAV recombinante (rAAV) se preparó cotransfectando transitoriamente células HEK 293T con plásmidos que proporcionaban la replicación, la cápside y los elementos auxiliares adenovirales necesarios para la producción viral. El rAAV se purificó a partir del cultivo celular HEK 293T cotransfectado mediante ultracentrifugación en un gradiente basado en yodixanol.
La recombinación homóloga inducida por MegaTAL se evaluó en células T humanas primarias activadas con CD3 y CD28 y cultivadas en medios completos suplementados con IL-2. Después de 3 días en cultivo, las células T se lavaron y sometieron a electroporación con ARNm de megaTAL del exón 1 de PD-1 transcrito in vitro (SEQ ID NO: 41), y posteriormente se transdujeron con AAV recombinante purificado que codificaba el casete del transgén MND-GFP (SEQ ID NO: 53). Los controles incluían células T tratadas con ARNm de megaTAL o vector de direccionamiento de rAAV. Se usó citometría de flujo en múltiples puntos temporales para medir la frecuencia de las células T que expresan la proteína fluorescente y para diferenciar la expresión transitoria de la proteína fluorescente del vector de direccionamiento episomal de rAAV de la expresión a largo plazo del casete integrado cromosómicamente. Figura 16B. La alteración del gen de PD-1 mediada por MegaTAL se detectó por secuenciación y por la pérdida de la expresión de PD-1 después de la activación de células T policlonales.
Se observó expresión transgénica a largo plazo en el 20-60% de las células T que se trataron tanto con el megaTAL como con el vector de direccionamiento de rAAV. En las muestras de control, el tratamiento solo con rAAV produjo niveles variables de expresión transitoria de proteínas fluorescentes y niveles muy bajos (<1%) de expresión de proteínas fluorescentes a largo plazo en las células T tratadas, consistente con una falta de integración en el genoma. Los resultados se confirmaron en experimentos realizados en células T aisladas de varios donantes independientes.
EJEMPLO 6
RECOMBINACIÓN HOMOLOGA DE UN TRANSGEN QUE CODIFICA UN RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO
(CAR) EN EL GEN DE PD-1
Los plásmidos de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) se diseñaron, construyeron y verificaron como se ha descrito anteriormente, excepto que se colocó un casete transgénico que codificaba un CAR anti-CD19 (SEQ ID NO: 56) o CAR anti-BCMA (SEQ ID NO: 57) entre las regiones de homología de direccionamiento del exón 1 de PD-1. Los casetes de expresión de CAR contenían un promotor de MND enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica un CAR que comprende un péptido señal derivado de CD8a, un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) dirigido o al antígeno CD19 o al antígeno de maduración de células B (BCMA), una región bisagra y dominio transmembrana derivad osde CD8a, un dominio coestimulador de 4-1BB intracelular, un dominio de señalización zeta de CD3 y brazos de homología diseñados para dirigirse al sitio objetivo del exón 1 de PDCD1 (SEQ ID NO: 54 y 55).
Las células T humanas primarias se activaron con CD3 y CD28 y se cultivaron en medios suplementados con citoquinas como se ha descrito anteriormente. Se evaluó la recombinación homóloga de los transgenes CAR en el sitio objetivo del exón 1 de PD-1 usando células T humanas primarias activadas electroporadas con ARNm de megaTAL del exón 1 de PD-1 transcrito in vitro (SEQ ID NO: 41) y luego se transdujo posteriormente con rAAV que codificaba el CAR anti-CD19 o anti-BCMA. La citometría de flujo para detectar la expresión de CAR se realizó en el punto temporal de 10 días, 7 días después de la electroporación y la transducción. Las muestras de control incluían células T tratadas con ARNm de megaTAL o vector de direccionamiento de rAAV. La expresión de CD19-CAR y BCMA-CAR se analizó usando reactivos de tinción de CD19-Fc conjugado con PE recombinante o BCMA-Fc conjugado con PE. Las células T tratadas con ARNm de megaTAL y rAAV-CAR mostraron expresión de CD19-CAR en el 30-60% de las células T y expresión de BCMA-CAR en el 10-20% de las células T. Figura 16B. Se observaron tasas similares de expansión de células T y fenotipos de células T indistinguibles entre células T no tratadas, tratadas con rAAV y tratadas con CAR de megaTAL/rAAV.
EJEMPLO 7
RECOMBINACIÓN HOMOLOGA DE UN TRANSGEN MENOS PROMOTOR EN EL GEN DE PD-1
Se diseñó, construyó y verificó un plásmido de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que contenía un transgén informador fluorescente (mCherry) y una señal de poliadenilación, pero que carecía de un promotor exógeno (SEQ ID NO: 58). Figura 17. El codón de inicio de mCherry se fusiona y se superpone con el codón de inicio de PD-1 endógeno, a la vez que reemplaza el resto del exón 1 de PD-1 con un ADNc que codifica la proteína mCherry. Esta estrategia impulsa la expresión de la proteína fluorescente del promotor de PD-1 endógeno a la vez que altera la expresión normal de la proteína de PD-1.
Las células T humanas primarias se activaron, se sometieron a electroporación con ARNm de megaTAL transcrito in vitro y se transdujeron con rAAV como se ha descrito anteriormente. Las muestras de control incluían células T tratadas o con ARNm de megaTAL o con vector de direccionamiento de rAAV. La expresión del informador fluorescente se analizó mediante citometría de flujo en varios momentos posteriores a la transfección, en presencia o ausencia de activación de células T policlonales usando forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)/ionomicina (PII). La expresión del informador no se observó en células T tratadas con ARNm de megaTAL o vector de direccionamiento de rAAV solo. Se observaron tasas similares de actividad de megaTAL con o sin transducción de rAAV. Se observó expresión de informador fluorescente de bajo nivel en células T que recibieron el vector de direccionamiento megaTAL y rAAV y se activaron con P/I durante 48 horas. La expresión de informador fluorescente impulsada por el promotor de PD-1 endógeno fue menor en comparación con la expresión del receptor impulsada por un promotor heterólogo (reducción de ~5 veces en la intensidad de la fluorescencia).
EJEMPLO 8
EXPRESIÓN CONSTITUTIVA DE PD-1 DESPUÉS DE LA RECOMBINACIÓN HOMOLOGA DE UN TRANSGÉN QUE CODIFICA UNA PROTEÍNA FLUORESCENTE EN EL EXÓN 5 DEL GEN DE PD-1
Se diseñó, construyó y verificó un plásmido de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que contenía un promotor heterólogo, un transgén de proteína fluorescente azul (BFP) y una señal de poliadenilación (SEQ ID NO: 44) para introducirlo en el exón 5 de PD-1 El casete de transgén se colocó entre brazos de homología de 1,3 kb y 1,0 kb que flanqueaban el sitio de escisión de megaTAL del exón 5 de PD-1. El brazo de homología 5' (SEQ ID NO: 45) incluía una porción del exón 5 de PD-1 en sentido ascendente del sitio de escisión de megaTAL y otras secuencias en sentido ascendente. El brazo de homología 3' (SEQ ID NO: 46) contenía la secuencia de codificación terminal del exón 5 de PD-1 y otras secuencias en sentido descendente. Ninguna región de homología contenía el sitio objetivo de megaTAL completo. Figura 18.
Las células T humanas primarias se activaron con CD3 y CD28, se sometieron a electroporación con ARNm de megaTAL del exón 5 de PD-1 transcrito in vitro (SEQ ID NO: 40) y luego se transdujeron con rAAV que codificaba el transgén informador fluorescente. Los controles incluyeron células T no tratadas y células T tratadas con el vector de direccionamiento de rAAV solo. La expresión del informador fluorescente se analizó mediante citometría de flujo en varios puntos temporales posteriores a la transfección. Las células tratadas con rAAV solo mostraron una expresión transitoria de BFP que disminuyó a niveles de fondo durante la expansión celular. Las células T que recibieron tanto el ARNm de megaTAL del exón 5 de PD-1 como el vector rAAV mostraron una población estable de células T que expresaban BFP que persistió a lo largo del curso del cultivo ex vivo.
Las células T tratadas tanto con el ARNm de megaTAL del exón 5 de PD-1 como con el vector rAAV tenían un patrón de expresión de PD-1 distinto por el cual, en ausencia de activación, casi todas las células que expresaban BFP también expresaban la proteína PD-1. Esto indica que la estrategia de direccionamiento ha alterado la regulación normal del gen de PD-1 a un patrón de expresión constitutivo en lugar de inducible. Además, debido a que se dirige al exón 5 de PD-1, la proteína expresada constitutivamente en esta estrategia de direccionamiento es una variante de PD-1 que tiene una señalización inhibidora disminuida y que puede actuar como un receptor negativo dominante. La expresión de PD-1 no se reguló por incremento en las células T tratadas con el ARNm de megaTAL del exón 5 de PD-1 solo o en las células T tratadas con ARNm de megaTAL y rAAV que comprenden brazos de homología con el exón 1. Figura 19.
EJEMPLO 9
LA RECOMBINACIÓN HOMOLOGA DE UN TRANSGÉN EN EL GEN DE PD-1 ES INDEPENDIENTE DEL POLIMORFISMO DE UN SOLO NUCLEÓTIDO (SNP)
El locus de PD-1 es genéticamente heterogéneo, con una alta prevalencia de SNP presentes tanto en regiones intrónicas como exónicas. La presencia de SNP divergentes cerca del sitio de escisión de megaTAL podría afectar potencialmente a la eficiencia de la recombinación homóloga en el locus de PD-1. Se diseñaron plásmidos de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) que incluían un promotor heterólogo, un transgén de proteína fluorescente y una señal de poliadenilación SV40 tardía para evaluar el impacto de los SNP, luego se construyeron y verificaron como se ha descrito anteriormente (SEQ ID NO: 47 y 48). Los brazos de homología o eran idénticos a la secuencia consenso de PD-1 o estaban diseñados para incluir mutaciones puntuales de SNP comunes proximales al sitio de direccionamiento megaTAL del exón 5 de PD-1. En estos diseños, el brazo de homología 5' (L-SNP, SEQ ID NO: 49) contiene un SNP G/A intrónico (rs6705653) localizado 220 pb en sentido descendente del sitio de escisión megaTAL, mientras que el brazo de homología 3' (R-SNP, SEQ ID NO: 50) contiene un SNP C/T silencioso (rs2227981) localizado 68 pb en sentido descendetne del sitio de escisión de megaTAL de PD-1. Figura 20.
Las células T humanas primarias se activaron con CD3 y CD28, se sometieron a electroporación con ARNm de megaTAL transcrito in vitro, y se transdujeron con rAAV que codificaba los brazos de homología de consenso, o con rAAV que llevaba los brazos de homología de L-SNP o R-SNP. Los controles incluyeron células T transducidas con el vector de direccionamiento de rAAV solo. La expresión de la proteína fluorescente se analizó mediante citometría de flujo en diferentes puntos temporales posteriores a la transducción. La expresión de la proteína fluorescente disminuyó a los niveles de fondo en las muestras que solo recibieron rAAV, mientras que las células T tratadas con megaTAL en combinación con rAAV demostraron niveles estables de expresión de la proteína fluorescente. Todas las muestras mostraron niveles de fluorescencia similares a pesar de haber sido tratadas con vectores rAAV que no contenían SNP o con variantes de SNP L o R, lo que indica que los SNP proximales al sitio objetivo de megaTAL no afectan o no afectan sustancialmente a la HR en el sitio objetivo.
EJEMPLO 10
RECOMBINACIÓN HOMOLOGA DE UN TRANSGÉN QUE CODIFICA UN RECEPTOR DE INTERRUPTOR EN EL LOCUS DE PDCD1
Los receptores de interruptores son moléculas quiméricas manipuladas que pueden convertir señales inhibidoras extracelulares en señales de activación intracelular, sin embargo, su eficacia a menudo se correlaciona con su capacidad para abrumar la expresión nativa de los receptores naturales. Una manera de eludir esta limitación es incrustar un receptor de interruptor en el locus nativo y alterar el receptor natural. Un plásmido de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que contiene un promotor heterólogo, un transgén que codifica un dominio de unión a ligando extracelular de PD-1 y un dominio de señalización de CD28 intracelular (receptor de interruptor de PD-1, SEQ ID NO: 59), y la señal de poliadenilación SV40 tardía se diseñó para dirigirse al exón 5 de PD-1, se construyó y se verificó. El brazo de homología 5' incluía una porción del exón 5 de PD-1 en sentido ascendente del sitio de escisión de megaTAL que contenía ITIM y otras secuencias en sentido ascendente. El brazo de homología 3' contenía la secuencia de codificación terminal del exón 5 de PD-1 y una porción de la región UTR, y se acortó a -650 pb para acomodar el ADNc del receptor de interruptor. Ninguna región de homología contenía el sitio objetivo megaTAL completo. Figura 21.
Se activaron células T humanas primarias con CD3 y CD28, se sometieron a electroporación con ARNm de megaTAL del exón 5 de PD-1 transcrito in vitro y se transdujeron con el vector de direccionamiento de rAAV que codifica el receptor de interruptor de PD-1. Los controles incluyeron muestras que recibieron megaTAL o rAAV solo. La expresión del receptor del interruptor de PD-1 se analizó mediante tinción con anticuerpo anti-PD-1 en ausencia de estimulación de células T. Se observaron altos niveles de expresión en células T tratadas con ARNm de megaTAL del exón 5 de PD-1 y transducidas con rAAV.
EJEMPLO 11
ESCISIÓN DE LARGO ALCANCE DE LA REGIÓN DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR DE PD-1 USANDO HDR
Se sabe que el mecanismo de recombinación homóloga implica mecanismos de 'búsqueda' de homología que pueden abarcar secuencias genómicas distantes. Sin querer estar limitados por ninguna teoría en particular, se contempla que tramos más sustanciales de genes objetivo o regiones cromosómicas pueden ser propensos a una manipulación eficiente usando una combinación de administración de megaTAL y rAAV. Se diseñó, construyó y verificó un plásmido de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que incluía un promotor heterólogo, un transgén de BFP y una señal de poliadenilación de SV40 tardía flanqueada por brazos de homología para evaluar los eventos de h R distal (SEQ ID NO: 52). El transgén estaba flanqueado por un brazo de homología 5' de 1,3 kb diseñado para comenzar en sentido ascendente del exón 3 de PD-1 y terminar inmediatamente antes del comienzo del exón 4. El brazo de homología 3' contenía la secuencia de codificación terminal del exón 5 de PD-1 y una porción de la región UTR. Ninguna región de homología contenía el sitio objetivo de megaTAL completo. La recombinación homóloga con éxito está diseñada para eliminar la totalidad de la región de señalización intracelular de PD-1, quedando solo la porción extracelular y transmembrana de PD-1 en la célula tratada. Figura 22.
Las células T humanas primarias se activan con CD3 y CD28, se someten a electroporación con ARNm de megaTAL transcrito in vitro y se transducen con el vector de direccionamiento de rAAV que codifica BFP que comprende el brazo de homología 5' distal. Los controles incluyen células T tratadas con vector de direccionamiento de megaTAL o rAAV. La expresión estable de BFP se observa solo en muestras que recibieron ARNm de megaTAL dirigido al exón 5 de PDCD1 y rAAV.
EJEMPLO 12
ALTERACIÓN DEL GEN DE PD-1 Y BLOQUEO DE PD1 MEDIADO POR ANTICUERPOS EN CÉLULAS T HUMANAS PRIMARIAS IN VITRO
Se evaluó el impacto funcional de los megaTAL reprogramados para escindir varias secuencias objetivo en el gen de PD-1 en células T humanas primarias activadas con CD3 y CD28 y cultivadas en medios completos suplementados con IL-2. Las PBMC activadas se transdujeron con un vector lentiviral que codificaba un CAR anti-BCMA. Las células T CAR T anti-BCMA se sometieron a electroporación con ARNm transcrito in vitro que codificaba el exón 5 de PD-1 o el exón 1 de PD-1 dirigido a megaTAL (SEQ ID NO: 40 y 41, respectivamente) y el ARNm que codifica Trex2 (SEQ ID NO: 43). Los controles incluyeron células T electroporadas sin ARNm (EP simulado) o células T electroporadas con ARNm que codifica un megaTAL específico para TCRa que carece de actividad catalítica.
Después de 10 días de expansión, las células T se cocultivaron con células A549 transducidas con un vector lentiviral que codifica BCMA-GFP. Las células T CAR se cocultivaron con células objetivo A549 solas o en presencia de 20 |jg/ml de anticuerpo anti-PD-1. Las células se cocultivaron durante 72 horas y los niveles de citoquinas en los sobrenadantes se analizaron usando un ensayo basado en perlas (Intellicyt QBeads). En ausencia de anticuerpos anti-PD-1, las células que se trataron con megaTAL PD1-Ex1 o PD1-Ex5 mostraron una producción elevada de iFNy y TNFα en comparación con los controles muertos de EP y TCRa simulados. La adición del anticuerpo aPD-1 anuló esta diferencia, dando como resultado un nivel equivalente de secreción de IFNy y TNFα en los sobrenadantes obtenidos de las células con control y tratadas con PD1 megaTAL (Figura 15B).
EJEMPLO 13
RECOMBINACIÓN HOMOLOGA DE UN TRANSGÉN SIN PROMOTOR EN EL GEN DE PD-1
Se diseñó, construyó y verificó un plásmido de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que contenía un transgén informador fluorescente (mCherry) y una señal de poliadenilación, pero que carecía de un promotor exógeno (SEQ ID NO: 58). Figura 17. El codón de inicio de mCherry se fusiona y se superpone con el codón de inicio de PD-1 endógeno, a la vez que reemplaza el resto del exón 1 de PD-1 con un ADNc que codifica la proteína mCherry. Esta estrategia impulsa la expresión de la proteína fluorescente del promotor de PD-1 endógeno a la vez que altera la expresión normal de la proteína PD-1.
Las células T humanas primarias se activaron, se sometieron a electroporación con ARNm de megaTAL transcrito in vitro y se transdujeron con rAAV como se ha descrito anteriormente. Las muestras de control incluían células T tratadas con ARNm de megaTAL o vector de direccionamiento rAAV. La expresión del informador fluorescente se analizó mediante citometría de flujo a las 24 horas después de la estimulación, en presencia o ausencia de activación de células T policlonales usando forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)/ionomicina (P/I). La expresión del informador no se observó en las células T no tratadas. Antes de la estimulación con P/I, se observaron niveles basales bajos de expresión de informador fluorescente en las células T que recibieron el vector de direccionamiento de rAAV y megaTAL para HDR. Veinticuatro horas de estimulación con P/I regularon por incremento la expresión del informador fluorescente impulsada por el PD-1 endógeno del 3% al 27,3% (comparar los paneles de arriba a abajo más a la derecha en la Figura 17).
EJEMPLO 14
RECOMBINACIÓN HOMOLOGA DE UN TRANSGÉNN DE CITOQUINAS SIN PROMOTOR EN EL LOCUS DE PD-1
Se diseñó, construyó y verificó un plásmido de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que contenía un transgén de IL-12 o IL-15 y una señal de poliadenilación, pero que carecía de un promotor exógeno (SEQ ID NO: 58). El codón de inicio del transgén se fusiona y se superpone con el codón de inicio de PD-1 endógeno, mientras que se reemplaza el resto del exón 1 de PD-1 con ADNc que codifica la citoquina IL-12 o IL-15 (Figura 23, panel superior). Esta estrategia impulsa la expresión del transgén del promotor endógeno de PD-1 a la vez que altera la expresión normal de PD-1.
Las células T humanas primarias se activaron y transdujeron con un vector lentiviral que codificaba un CAR anti-BCMA 24 horas después de la activación. Las células se propagaron durante 2 días, se sometieron a electroporación con ARNm de megaTAL transcrito in vitro y se transdujeron con rAAV como se ha descrito anteriormente. Las muestras de control incluían células T no transducidas, células T tratadas con CAR anti-BCMA solo o células T tratadas con CAR anti-BCMA y cultivadas en presencia de IL-12 recombinante. Se accedió a la actividad de megaTAL de PD-1 mediante análisis de citometría de flujo de la expresión de PD-1 en células T estimuladas durante 24 horas con PMA/ionomicina. El megaTAL de PD-1 combinado con IL-12 AAV mostró una disminución de aproximadamente un 40% en la expresión de PD-1 en comparación con las muestras de control (Figura 23, panel inferior).
Se midieron los niveles de expresión de IL-12 mediante ELISA después de la activación con PMA/ionomicina o después del cocultivo de células T con la línea celular K562-BCMA que expresa antígeno. Hubo una producción mínima de IL-12 en células T no estimuladas y tanto la estimulación con PMA/ionomicina como el cocultivo con células K562 positivas para antígeno dieron como resultado la secreción de IL-12 (Figura 24A). Se usaron ensayos de estimulación repetidos para medir el agotamiento funcional de las células T BCMA-CAR. Se mezclaron células tumorales y células T anti-BCMA-CAR, se cultivaron durante 7 días y se añadieron células objetivo K562-BCMA adicionales para imitar una estimulación repetida. Después de la 1a estimulación, los niveles de producción de IFNy y citotoxicidad fueron similares en todas las muestras de células T. Después de la 2a estimulación, la producción de IFNy y la citotoxicidad aumentaron en las células T anti-BCMA-CAR tratadas con IL-12 recombinante o que fueron tratadas con megaTAL de PD-1 y la plantilla HDR de IL-12 en comparación con las células tratadas con control (Figura 24B).

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido que comprende una variante de la endonucleasa homing (HE) I-OnuI que escinde un sitio objetivo en el gen de la muerte celular programada 1 (PD-1) humano, en donde la variante de HE I-OnuI comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63.
2. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde la variante de HE I-OnuI escinde un sitio objetivo del exón 1 de PD-1 y comprende las siguientes sustituciones de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4:
(a) L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46A, T48V, V68I, A70T, S72D, N75R, A76Y, S78R, K80R, I100V, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R, yT240E; (b) L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, V37G, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48V, V68I, A70T, S72D, N75R, A76Y, S78R, K80C, I100V, V132A, L138M, T143N, S155G, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R, y T240E;
(c) L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48M, V68I, A70T, S72N, N75H, A76Y, S78T, K80R, I100V, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R, yT240E; (d) L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48M, V68S, A70Y, S72N, N75H, A76Y, K80E, T82F, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R, y T240E; (e) L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37A, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48M, V68S, A70L, S72N, N75H, A76Y, K80V, T82Y, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R, y T240E; o (f) L26G, R28S, R30L, N32R, K34R, S35G, S36T, V37G, G38R, S40H, E42R, G44S, Q46T, T48M, V68S, A70T, S72N, N75H, A76Y, K80V, T82Y, L138M, T143N, S159P, E178D, C180S, N184R, I186R, K189N, S190V, K191N, L192A, G193R, Q195R, S201E, T203S, K207R, Y223H, K225Y, K227G, F232R, D236Q, V238R, y T240E.
3. El polipéptido de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el polipéptido se une y escinde la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 30.
4. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además un dominio de unión a ADN de TALE, preferiblemente un dominio de unión a ADN de TALE que comprende aproximadamente 9,5 unidades de repetición TALE a aproximadamente 15,5 unidades de repetición TALE.
5. El polipéptido de la reivindicación 4, en donde el dominio de unión al ADN de TALE se une a la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 31.
6. El polipéptido de la reivindicación 5, en donde el polipéptido se une y escinde la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 32.
7. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además un conector peptídico o un péptido 2A de autoescisión viral y una exonucleasa 3'-5' Trex2 o un fragmento biológicamente activo de la misma.
8. Un polinucleótido, un ARNm o un ADNc que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Un vector que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Una célula que comprende el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el polinucleótido de la reivindicación 8 o el vector de la reivindicación 9.
11. La célula de la reivindicación 10, en donde la célula comprende un polinucleótido que codifica un receptor de células T (TCR), un receptor de antígeno quimérico (CAR), un Dane o una zetaquina.
12. La célula de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde la célula es una célula hematopoyética, una célula T, una célula CD3+, una célula CD4+, una célula CD8+, una célula inmunoefectora, un linfocito T citotóxico (CTL), un linfocito infiltrante de tumores (TIL), una célula T auxiliar, una célula asesina natural (NK) o una célula T asesina natural (NKT).
13. Una composición que comprende una o más células de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.
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