ES2951287T3 - Método para controlar la formación del color rosa durante la fabricación de anticuerpos - Google Patents
Método para controlar la formación del color rosa durante la fabricación de anticuerpos Download PDFInfo
- Publication number
- ES2951287T3 ES2951287T3 ES18734651T ES18734651T ES2951287T3 ES 2951287 T3 ES2951287 T3 ES 2951287T3 ES 18734651 T ES18734651 T ES 18734651T ES 18734651 T ES18734651 T ES 18734651T ES 2951287 T3 ES2951287 T3 ES 2951287T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- antibody
- cbl
- cell culture
- mab
- hydrogen peroxide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims description 7
- RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M cyanocobalamin Chemical compound N#C[Co+]N([C@]1([H])[C@H](CC(N)=O)[C@]\2(CCC(=O)NC[C@H](C)OP(O)(=O)OC3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)C)C/2=C(C)\C([C@H](C/2(C)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M 0.000 claims abstract description 54
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims abstract description 47
- 235000000639 cyanocobalamin Nutrition 0.000 claims abstract description 45
- 239000011666 cyanocobalamin Substances 0.000 claims abstract description 45
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 32
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims abstract description 25
- YOZNUFWCRFCGIH-BYFNXCQMSA-L hydroxocobalamin Chemical compound O[Co+]N([C@]1([H])[C@H](CC(N)=O)[C@]\2(CCC(=O)NC[C@H](C)OP(O)(=O)OC3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)C)C/2=C(C)\C([C@H](C/2(C)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O YOZNUFWCRFCGIH-BYFNXCQMSA-L 0.000 claims abstract description 24
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims abstract description 13
- 235000004867 hydroxocobalamin Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 239000011704 hydroxocobalamin Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229960001103 hydroxocobalamin Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 229960002104 cyanocobalamin Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 123
- FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2,7, Chemical compound [Co+3].N#[C-].C1([C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)[N-]\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L 0.000 claims description 58
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 29
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 12
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 abstract description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 46
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 45
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 38
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 29
- FBWADIKARMIWNM-UHFFFAOYSA-N N-3,5-dichloro-4-hydroxyphenyl-1,4-benzoquinone imine Chemical compound C1=C(Cl)C(O)=C(Cl)C=C1N=C1C=CC(=O)C=C1 FBWADIKARMIWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 18
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 17
- 230000008859 change Effects 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 14
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 13
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 13
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 13
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 10
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 9
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 9
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 239000002824 redox indicator Substances 0.000 description 9
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 8
- VTIIJXUACCWYHX-UHFFFAOYSA-L disodium;carboxylatooxy carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)OOC([O-])=O VTIIJXUACCWYHX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 229940045872 sodium percarbonate Drugs 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000010777 Disulfide Reduction Effects 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 229960001922 sodium perborate Drugs 0.000 description 6
- YKLJGMBLPUQQOI-UHFFFAOYSA-M sodium;oxidooxy(oxo)borane Chemical compound [Na+].[O-]OB=O YKLJGMBLPUQQOI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000306 component Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 5
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 5
- 229940045999 vitamin b 12 Drugs 0.000 description 5
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 4
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 4
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100476210 Caenorhabditis elegans rnt-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 101000655985 Plasmodium falciparum (isolate FCH-5) Thioredoxin reductase Proteins 0.000 description 3
- 101000772462 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Thioredoxin reductase 1 Proteins 0.000 description 3
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 3
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 239000013627 low molecular weight specie Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 3
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 3
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical group C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102100036407 Thioredoxin Human genes 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 2
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 2
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 2
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 2
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 2
- WLKSPGHQGFFKGE-UHFFFAOYSA-N 1-chloropropan-2-yl n-(3-chlorophenyl)carbamate Chemical compound ClCC(C)OC(=O)NC1=CC=CC(Cl)=C1 WLKSPGHQGFFKGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001427367 Gardena Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 125000000899 L-alpha-glutamyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108010076830 Thionins Proteins 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013368 capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000533 capillary isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 239000013000 chemical inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 125000003346 cobalamin group Chemical group 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N coenzyme Q10 Chemical class COC1=C(OC)C(=O)C(C\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N 0.000 description 1
- 230000007748 combinatorial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000011118 depth filtration Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M lipoate Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- MCPLVIGCWWTHFH-UHFFFAOYSA-L methyl blue Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC(S(=O)(=O)[O-])=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[NH+]C=2C=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(NC=3C=CC(=CC=3)S([O-])(=O)=O)=CC=2)C=C1 MCPLVIGCWWTHFH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001451 organic peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 108010091718 peptide L Proteins 0.000 description 1
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 238000012794 pre-harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000002407 reforming Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 238000013385 tryptic peptide mapping Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2511/00—Cells for large scale production
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
La invención es un método para prevenir la generación de color rosa durante la fabricación de anticuerpos, ya sea evitando la reducción de anticuerpos durante la fabricación y la recolección o inhibiendo la conversión de cianocobalamina (CN-Cbl) en hidroxocobalamina (HO-Cbl) durante la fabricación y la recolección. La sustitución de la luz blanca en las áreas de preparación y almacenamiento del medio de cultivo celular por luz roja inhibe la conversión de CN-Cbl en HO-Cbl. La adición de peróxidos a la masa clarificada en el momento de la cosecha inhibe la reducción de los enlaces disulfuro del anticuerpo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Método para controlar la formación del color rosa durante la fabricación de anticuerpos
Antecedentes
Las terapéuticas con anticuerpos monoclonales (mAb) se vuelven más populares en el tratamiento de múltiples enfermedades humanas. Como macromoléculas, los mAb tienen cierta heterogeneidad debido a una amplia gama de modificaciones postraduccionales. El control exitoso del proceso de fabricación es fundamental para garantizar la calidad y la seguridad del producto y la consistencia de lote a lote de las proteínas terapéuticas. De hecho, la directriz ICH Q6B requiere una especificación de apariencia del producto.
La fabricación normal de anticuerpos suele tener alguna variación de color que es aceptable (Derfus GE, et.al., MAbs (2014) 6(3):679-688, Prentice K.M., et al., MAbs (2013) 5(6):974-981, Vijayasankaran N., et.al., Biotechnol Prog 2013, 29(5):1270-1277, Xu J., et al., Process Biochemistry 2014, 49:130-1394). Sin embargo, la variación de color debido a las impurezas en el proceso es un asunto de la falta de control del proceso. Una de las principales fuentes de color rosa/rojo en el fármaco final ha sido identificada como el complejo vitamina B12-mAb (Derfus, 2014, Prentice, 2013). Aunque la naturaleza de la interacción no ha sido dilucidada, la unión de la vitamina B12 a la proteína parece lo suficientemente fuerte como para coeluirse a través de múltiples etapas de purificación posteriores, incluyendo la cromatografía de afinidad con proteína A, la inactivación viral a pH bajo, varias cromatografías de pulido y ultrafiltración y diafiltración.
Los anticuerpos se producen comúnmente en células de mamíferos, tales como las células de ovario de hámster chino (CHO), y se secretan extracelularmente en los medios de cultivo celular. Al final del proceso de cultivo, las células se separan de los medios de cultivo durante la etapa de recuperación primaria utilizando métodos tales como centrifugación, filtración profunda o floculación para clarificar el fluido de recolección. Durante este proceso, las células a menudo sufren diversas tensiones, incluyendo corte mecánico, exposición a un entorno con poco oxígeno disuelto (OD), o cambios de temperatura y pH. Estas tensiones provocan daños celulares que dan como resultado la liberación de componentes intracelulares no deseados en el fluido clarificado. Estos componentes citosólicos, tales como lípidos y enzimas, pueden afectar potencialmente a la calidad del producto y cuidadosamente se debe hacer un seguimiento de los mismos o eliminarlos. Por ejemplo, la liberación de agentes reductores intracelulares puede conducir a la reducción de los enlaces disulfuro de los anticuerpos (Mun M., et.al. Biotechnol Bioeng 2015; 112:734-742; Ruaudel J. , et al. BMC Proceedings 2015;9 (Suplemento 9):P24; Mullan B., et al. BMC Proc. 2011;5(Suplemento 8):P110; Trexler-Schmidt M., et al. Biotechnol Bioeng. 2010;106:452-461; Koterba, K.L., et al. J. Biotechnol. 2012;157:261-267; Handlogten M.W., et al. Biotechnol Bioeng. 2017;114:1469-1477; Hutchinson N., et al. Biotechnol Bioeng.
2006;95:483-491).
Durante el proceso de fabricación, se ha observado una gran reducción de anticuerpos después de la operación de recolección y/o la cromatografía de Proteína A. Múltiples parámetros de proceso pueden tener un impacto en el grado de reducción de anticuerpos. Por ejemplo, mantener altos niveles de oxígeno disuelto (OD) durante la recolección es vital para mantener intactas las moléculas de anticuerpo (Mun M. 2015; Trexler-Schmidt M., 2010). Las fuerzas cortantes mecánicas, que hacen que la lisis celular y los componentes celulares se filtren en los fluidos de recolección, también contribuye significativamente a la reducción (Kao YH, et.al. Biotechnol Bioeng. 2010; 107:622-632; Hutterer K. M., et al. MAbs. 2013;5:608-613). Otros parámetros del proceso, tales como el tiempo de retención de la recolección (Chung WK, et.al. Biotechnol Bioeng. 2017;114:1264-12741), componentes del medio (tales como iones de cobre, cisteína/cisteína) y pH y temperatura, (Trexler-Schmidt M., 2010; Chung, 2017) también tienen un efecto sobre el grado de reducción de disulfuro.
Para garantizar la calidad del producto anticuerpo, los controles en el proceso de fabricación son necesarios para controlar las especies de bajo peso molecular (BPM) formadas a partir de la reducción de los enlaces disulfuro de anticuerpos. Como resultado, se han propuesto varias estrategias en los últimos años para controlar la reducción de disulfuro. Se han probado inhibidores químicos para impedir la reducción de anticuerpos, incluido el tratamiento previo y posterior a la recolección con agentes antirreductores, tales como el sulfato cúprico (Chaderjian W.B., et.al. Biotechnol Prog. 2005;21:550-553), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), inhibidores de tiorredoxina, (Patente de EE. UU. No. 8.574.869) cisteína, azul de metilo (WO 2015/085003) y análogos de coenzima Q (Li WW, et.al. J. Am. Chem. Soc. 2005;127:6140-614). Aunque el conocimiento y los métodos relacionados con las estrategias de mitigación han aumentado con los años, la implementación de estos métodos en la producción no está exenta de dificultades, tales como la introducción de subproductos químicos que deben eliminarse mediante etapas de cromatografía, mayor tiempo de procesamiento y el riesgo de modificaciones distintas a las deseadas o daño al producto anticuerpo.
Luo et al. J. Pharm. Sci. 2005;94(2):304-316 estudia la cinética de reacción de la cisteína con peróxido de hidrógeno en tampones acuosos (en ausencia de iones metálicos) en un amplio intervalo de pH para comprender el mecanismo de la reacción tiol-H2O2.
El documento WO02015085003 enseña un método para minimizar la reducción de enlaces disulfuro en la producción de anticuerpos mediante la adición de un agente antirreductor también en el líquido de recolección; el agente
antirreductor es azul de metileno, quinona o un disulfuro.
Sumario de la invención
Los inventores descubrieron que la generación del color rosa durante la fabricación de anticuerpos requiere grupos sulfhidrilo libres en anticuerpos reducidos e hidroxocobalamina, la forma activa de la vitamina B12.
Por tanto, en un primer aspecto, la invención es un método para impedir la reducción de los enlaces disulfuro de los anticuerpos que comprende añadir peróxido de hidrógeno al volumen clarificado en el momento de la recolección. La invención también abarca el uso de peróxido de hidrógeno en la recolección para inhibir la formación del color rosa durante la fabricación de anticuerpos.
En un segundo aspecto, la invención es un método para inhibir la unión de la vitamina B12 a los anticuerpos durante la fabricación de los cultivos celulares; este método comprende (a) impedir la reducción de los enlaces disulfuro de los anticuerpos agregando peróxido de hidrógeno al volumen clarificado en el momento de la recolección; e (b) inhibir la conversión de CN-Cbl a HO-Cbl evitando la exposición del medio a la luz visible durante uno o más tiempos seleccionados de la preparación del medio, almacenamiento del medio, producción de anticuerpos y recolección de anticuerpos.
En una realización, CN-Cbl se expone únicamente a la luz roja (>600 nm) durante la preparación del medio, el almacenamiento del medio y, opcionalmente, durante la producción de anticuerpos y la recolección de anticuerpos.
En un aspecto adicional, la invención es un proceso de cultivo celular para la producción de anticuerpos que comprende 1) cultivar células que producen el anticuerpo de interés, 2) recolectar el anticuerpo de interés del cultivo celular y 3) añadir peróxido de hidrógeno al volumen clarificado en la recolección. En una realización, el proceso comprende además preparar y almacenar los medios de cultivo celular en condiciones de luz roja (>600 nm). En una realización adicional, el proceso comprende además cultivar células que producen el anticuerpo de interés y recoger el anticuerpo de interés del cultivo celular en condiciones de luz roja (>600 nm).
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A-1D muestran la absorción espectral de la vitamina B12 y dos lotes de mAb B. 1A es un espectro de absorción de la vitamina B12 y dos lotes de mAb B. Vitamina B12 (cianocobalamina) a 5 mg/l en PBS (línea azul), un lote de color rosa (línea roja) y un lote incoloro (línea morada) de 250 a 800 nm. 1B es un gráfico reescalado de (1A) para mostrar detalles. 1D es una botella de eluido de proteína A para mAb B que tiene un color rosa visible.
Las Figuras 2A - 2D muestran que la unión de la vitamina B12 al anticuerpo es una reacción de segundo orden. (2A) Dos lotes incoloros de mAb A, el lote sin moléculas de anticuerpo reducidas detectadas (el lote "bueno") y el otro con la mayoría de los anticuerpos reducidos (el lote "malo") se mezclaron con CN-Cbl o HO-Cbl. Después de la incubación, se eliminó el exceso de vitamina B12 libre. Muestras de izquierda a derecha, el lote bueno y CN-Cbl; el lote malo y CN-Cbl; el lote bueno y HO-Cbl; el lote malo y HO-Cbl; y el lote malo se trató primero con peróxido de hidrógeno, a continuación, se mezcló con HO-Cbl. (2b ) El peróxido de hidrógeno puede oxidar el anticuerpo reducido para reformar el monómero del anticuerpo como se muestra por CE SDS. (2C) Cuantificación de monómero de mAb y diferentes especies de bajo peso molecular en mAb tratado y no tratado con peróxido de hidrógeno mostrado en 2B. (2D) Análisis CE-SDS no reducido del material de mAb A Lote 2 antes (línea azul) y después (línea negra) de la unión de la vitamina B12. Los patrones de picos individuales cambiaron antes y después de la incubación con vitamina B12 muy probablemente debido a la oxidación de los grupos sulfhidrilo libres y la reformación de los enlaces disulfuro en el aire.
Las Figuras 3A - 3C muestran los datos del espectro de masas para la identificación de la conjugación de la vitamina B12. (3A) Espectros MS/MS de mlz = 664,79 de HO-Cbl y m/z = 678,29 de CN-Cbl. (3B) Espectros MS/MS de complejos péptido-cobalamina L19-cobalamina y L18-19-cobalamina. (3C) Ilustración de enlaces disulfuro de anticuerpos IgG4. Los residuos de cisteína que se unen a la vitamina B12 están marcados en azul y los pares de residuos de cisteína que forman enlaces disulfuro están encerrados en un círculo rojo.
Las Figuras 4A -4E muestran los espectros de transmitancia de luz de los filtros de color usados en el Ejemplo 1 (4A). Cromatogramas para la separación en RP-UPLC y detección a 360 nm de (4B) CN-Cbl y HO-Cbl en estándares; (4C) medios de cultivo frescos para mAb A; (4D) medios expuestos a luz de color rojo; y (4E) medios expuestos a luz de color verde. En (4D y 4E), las líneas negras, azules y rojas representan energías de exposición de 0,3, 0,6 y 1,2 millones de luxes h, respectivamente.
La Figura 5A-5C muestra el nivel de sulfhidrilo libre y el bajo peso molecular (BPM) en CB. (5A) Correlación de los niveles de tiol libre de las muestras de CB con mAb 1 y la presencia de BPM en las correspondientes muestras purificadas de Proteína A (PAVIB). Las PAVIB se analizaron por NR_Calibrador para especies de BPM. Aquellas muestras con BPM > 5 % se etiquetan como "Sí", lo contrario como "No". El análisis se realizó con el programa informático JMP. (5B) Medición de los niveles de tiol libre en CB bajo diferentes tratamientos de recolección. El
volumen de recolección clarificado (CB) de un biorreactor a escala de laboratorio (5-L), que contenía mAb 1 se trató reduciendo el pH a 4,8 en ausencia o presencia de sulfato de dextrano. Las muestras de CB se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente antes de que la muestra se filtrara en profundidad. Después de la filtración en profundidad, se incubó una alícuota de cada muestra a 37 °C durante 75 minutos con o sin adición de NAPDH 1 mM antes de medir el contenido de sulfhidrilo libre. También se incluyeron a modo de comparación un lote de fabricación con un alto porcentaje de BPM y un lote representativo (lote normal). (5C) El porcentaje de anticuerpo intacto para las muestras en (5B). El anticuerpo intacto se midió mediante NR_Calibrador después de la purificación de la Proteína A.
Las Figuras 6A-6F muestran el tratamiento del indicador redox DCPIP y la observación del cambio de color como marcador de pronóstico para la generación de BPM. (6A) Estructura y reacción de DCPIP. (6B) Las muestras de DS purificadas mAb2 de la izquierda con > 95 % de BPM (3,1 grupos sulfhidrilo por proteína de anticuerpo), se mostraron incoloras cuando se trataron con DCPIP. Las muestras de mAB2 de la derecha con más del 98 % de anticuerpos intactos (0,4 sulfhidrilo por proteína de anticuerpo) mostraron un color púrpura (en pH 5,5) en presencia de DCPIP. (6C) Cambio de color de d Cp IP en CB de mAb 2 de diferentes condiciones de cultivo. El Dc PiP en los dos tubos de la izquierda se volvió completamente incoloro, indicando que hubo mayor potencial reductor en el CB; el DCPIP en los dos tubos del medio tenía color azul, indicando eventos no reductores; y el DCPIP en el tubo derecho se llegó a reducir parcialmente. (6D) Concentraciones de tiol libre en función del porcentaje de mAb 2 de lisis celular. El lisado celular al 100 % de mAb 2 se mezcló con CB regular para generar una curva de dilución de lisados celulares y las concentraciones de tiol libre se midieron y se informaron como el promedio de muestras duplicadas. La ecuación de regresión lineal y R cuadrado se calcularon con Excel. (6E) Diseño de estudio para ensayar el orden de cambio de color de DCPIP y la cantidad de tiol libre. (6F) Imagen de los resultados del ensayo con DCPIP del estudio en la Tabla 7. Las muestras del panel superior recibieron aire antes y durante la recuperación primaria. Las muestras en el fondo tenían gas nitrógeno antes y durante la recuperación primaria. El orden de los tubos de ensayo de izquierda a derecha era el mismo que en la Tabla 7 desde la parte superior al fondo.
Las Figuras 7A-7K muestran el uso de peróxido de hidrógeno para evitar la reducción de enlaces disulfuro. El CB generado a escala de laboratorio de mAb 2 se dividió en alícuotas en recipientes con varias concentraciones de peróxido de hidrógeno. La condición sin aire dentro de los contenedores se generó mediante lavado con nitrógeno y se mantuvo a temperatura ambiente durante un día. Las muestras resultantes se analizaron directamente por Calibrador no reducido (7A, 7C, 7E, 7G, 7I) y reducido (7B, 7D, 7F, 7H, 7J) sin purificación de Proteína A. (7A y 7B) El CB sin adición de peróxido de hidrógeno se expuso al aire como control. Se mantuvo CB con 0 mM (7C y 7D), 0,33 mM (7E y 7F), 1 mM (7G y 7H) y 3 mM (7I y 7J) de peróxido de hidrógeno en condiciones sin aire. (7K) Sumario de los resultados del calibrador no reducido de la fragmentación de mAb. Puesto que había un exceso de cadena ligera de este mAb secretado por las células hospedadoras. La cantidad de cadena ligera no se incluyó como fragmento. Abreviaturas usadas para las especies de BPM: LC, cadena ligera; HC, cadena pesada; HL, medio anticuerpo con una cadena ligera y una cadena pesada; HHL, anticuerpo parcial con una cadena ligera y dos cadenas pesadas.
Las Figuras 8A-8F muestran la evaluación del uso de peróxido de hidrógeno para evitar la reducción de enlaces disulfuro en el peor de los casos. El CB de mAb 2 ensayado tuvo el 100 % de lisis celular como se describe en el Ejemplo 2. Las condiciones de mantenimiento con o sin aire fueron las mismas que en la Figura 7. (8A) Muestra de CB sin tratamiento con peróxido de hidrógeno y mantenida con aire sirve como control. (8B) Muestra de CB sin tratamiento con peróxido de hidrógeno y mantenida en condiciones sin aire. (8C) Se añadió peróxido de hidrógeno 5 mM a la muestra de CB antes de mantenerla en condiciones sin aire. (8C) Se añadió peróxido de hidrógeno 10 mM a la muestra de CB antes de mantenerla en condiciones sin aire. Las muestras de CB resultantes (8A a 8D) se analizaron directamente mediante calibrador no reducido sin purificación de Proteína A. (8E) Sumario de los resultados del calibrador no reducido de la fragmentación de mAb de CB sin purificar. (8F) Sumario de las purezas de los anticuerpos intactos de las muestras 8A a 8D usando cromatografía de Proteína A purificada y analizadas por calibrador no reducido.
Las Figuras 9A-9D muestran el uso de peróxidos alternativos para evitar la reducción de enlaces disulfuro de anticuerpos. Se usaron percarbonato de sodio y perborato de sodio en el peor de los casos de 2 CB de mAb con el 100 % de lisis celular. (9A) Muestra de CB mantenida con aire y sin peróxidos. (9B) Muestra de CB mantenida en condiciones sin aire y sin peróxidos. (9C) Un resultado representativo de una muestra de CB tratada con percarbonato de sodio 5 mM. El percarbonato de sodio se agregó antes de mantenerla en condiciones sin aire. Los resultados provinieron de calibrador no reducido en CB sin purificar (9A a 9C). (9D) Sumario del tratamiento con percarbonato de sodio y perborato de sodio. Los resultados provinieron de calibrador no reducido en CB sin purificar.
Descripción detallada
La invención se define en las reivindicaciones y está respaldada por las siguientes enseñanzas técnicas.
El control del proceso de fabricación de productos biológicos es fundamental para garantizar la calidad y la seguridad
del producto y la consistencia de lote a lote de las proteínas terapéuticas. La comprensión del mecanismo de generación de color durante la fabricación es fundamental para desarrollar una estrategia de control. Los inventores descubrieron que la generación del color rosa durante la fabricación de anticuerpos es una reacción de segundo orden que depende de las concentraciones de tanto los grupos sulfhidrilo libres en anticuerpos reducidos como de hidroxocobalamina, la forma activa de la vitamina B12. Ambos reactivos son necesarios y ninguno de ellos por sí solo es suficiente para generar el color rosa.
Los inventores descubrieron que la forma activa de la vitamina B12 se une al grupo sulfhidrilo libre de la cisteína ubicado en la cadena pesada 134 (HCl34), la cadena ligera 214 (LC214), la cadena pesada 321 (HC321), la cadena pesada 367 (HC367) y la cadena pesada 425 (HC425). Los cinco residuos de cisteína se distribuyen entre las regiones Fab y Fc. Hay dos pares de enlaces disulfuro entre estos cinco residuos de cisteína, LC214 con HCl34 y HC367 con HC425 (Figura 3c). Cuando estos enlaces disulfuro particulares se reducen durante la fabricación y la recolección, ambos residuos de cisteína en el par disulfuro tienen la misma accesibilidad para la unión de hidroxocobalamina.
Como se usa en el presente documento, "cianocobalamina" y "CN-Cbl" se usan indistintamente y se refieren al componente vitamina B12 (VB12) del medio de cultivo celular. Igualmente, "hidroxocobalamina" y "HO-Cbl" se usan indistintamente y se refieren a la forma activa de la vitamina B12 (VB 12) en el medio de cultivo celular disponible para unirse a los anticuerpos reducidos durante la fabricación y la recolección.
Los anticuerpos se producen comúnmente en células de mamíferos, tales como las células de ovario de hámster chino (CHO), y se secretan extracelularmente en los medios de cultivo celular. Al final del proceso de cultivo celular, las células se separan de los medios de cultivo durante la etapa de recuperación primaria utilizando métodos tales como centrifugación, filtración profunda o floculación para clarificar el fluido de recolección.
Como se usa en el presente documento, "volumen clarificado" y "CB" se usan indistintamente y se refieren a la solución recogida después de la etapa de recuperación primaria, tal como centrifugación, filtración profunda o floculación, que se usa para clarificar el fluido del cultivo celular.
Como se usa en el presente documento, "preparación del medio de cultivo celular" "almacenamiento del medio de cultivo celular", "proceso de cultivo celular" "fabricación de anticuerpos", "producción de anticuerpos" y "recolección de anticuerpos", "recolección", se refieren a las muchas etapas necesarias para producir anticuerpos. Cada etapa puede ocurrir en diferentes lugares dentro de una instalación de fabricación.
Uso de luz de color rojo en el entorno de fabricación como estrategia de control del color rosa.
Puesto que tanto la hidroxocobalamina como los anticuerpos reducidos son necesarios para la generación de productos de color rosa, el control de uno o ambos factores evitará la generación del color rosa.
La conversión de la vitamina B12 inducida por la luz puede ocurrir durante la preparación del medio, almacenamiento del medio y procesamiento del cultivo celular. El uso de bolsas de bioprocesamiento desechables transparentes en la preparación de medios, la duración del almacenamiento y la duración del cultivo celular en biorreactores de vidrio aumentan el riesgo de la exposición a la luz y la conversión de la vitamina B12. Estrategias generales de control, tales como el uso de recipientes apropiados (por ejemplo, recipientes de acero inoxidable), el recubrimiento con material de capa adicional, la evitación de la exposición innecesaria a la luz, pueden proporcionar protección frente a la luz. Sin embargo, la implementación de estas estrategias no está exenta de desafíos y, a menudo, incluye costos adicionales.
El Ejemplo 1 muestra que la luz roja no induce la conversión de CN-Cbl a HO-Cbl. Se añadió mAb A reducido a medios de cultivo que se habían expuesto a luz blanca, luz roja o luz verde, o se habían mantenido en la oscuridad. Tras la incubación nocturna, el mAb se purificó mediante una columna de proteína A y se midió la vitamina B12 unida por ensayo ELISA. Como se muestra en la Tabla 7, el orden de los índices de conjugación de la vitamina B12 fueron luz blanca > luz verde > luz roja y en control oscuro.
Por tanto, para inhibir o impedir la conversión de cianocobalamina a hidroxocobalamina, la luz blanca podría reemplazarse con luz de color rojo (longitudes de onda >600 nm) en las áreas donde se preparan y almacenan los medios de cultivo celular y, opcionalmente, en las áreas de fabricación y recolección de cultivos celulares.
Preferentemente, la luz blanca se reemplaza por luz de color rojo (longitudes de onda >600 nm) en las áreas donde se preparan y almacenan medios de cultivo celular y, opcionalmente, en las áreas de fabricación y recolección de cultivos celulares.
Con este fin, por ejemplo, las bombillas de luz blanca se pueden reemplazar por bombillas de luz LED de color rojo (longitudes de onda >600 nm) en dichas áreas.
Como otro ejemplo, se pueden colocar láminas de plástico de color rojo o alternativamente tubo de color rojo sobre las bombillas de luz blanca en dichas áreas.
Las luces blancas se pueden reemplazar por luz de color rojo de la manera mencionada anteriormente: en las áreas donde se prepara o almacena el medio de cultivo celular; y también en el área de fabricación del cultivo celular, en el área de recolección del cultivo celular, o en ambos.
Prevención de la reducción de anticuerpos durante la recolección de proteínas y la recuperación primaria como una estrategia de control del color rosa.
Puesto que tanto los anticuerpos reducidos como la hidroxocobalamina son necesarios para la generación de productos de color rosa, el control de uno o ambos factores evitará la generación del color rosa.
La reducción de los enlaces disulfuro durante la fabricación de mAb es una reacción redox enzimática y la causa principal de la formación de especies de bajo peso molecular () durante el proceso de fabricación de anticuerpos BPM. Aunque las causas de la generación de BPM no se comprenden bien, se cree que la aparición de BPM resulta de un efecto combinatorio de las condiciones de cultivo celular, tales como temperatura, oxígeno disuelto (OD), pH, viabilidad, densidad celular, porcentaje de lisis, etc., que crea un entorno reductor para el anticuerpo. Esto se ve agravado aún más por las condiciones de mantenimiento del volumen clarificado (CB) (por ejemplo, temperatura, duración, aireación), que retienen el anticuerpo en el entorno reductor. La detección de BPM generalmente se visualiza en el volumen clarificado o en las etapas de combinación de eluido de proteína A.
El Ejemplo 2 muestra que existe un riesgo bajo de generación de BPM si el nivel de tiol libre es inferior a 100 mM; un nivel de tiol libre de 100-200 mM es una señal de advertencia; y el nivel de tiol libre por encima de 200 mM es un alto riesgo de generación de BPM. Se han propuesto muchas estrategias de mitigación para impedir la reducción de anticuerpos para inhibir las enzimas involucradas en la reacción redox o para oxidar y agotar los cofactores enzimáticos críticos, tales como NADPH (Mun M 2015, Trexler-Schmidt M. 2010). Se ha demostrado que el rociado de aire es una forma sólida de impedir la reducción de anticuerpos. Sin embargo, el nivel de tiol libre total aún puede oscilar entre el nivel micromolar durante la fabricación y el nivel milimolar después de mantener el CB sin aire (Tabla 7). La Figura 8 muestra que, en el peor de los casos, en condiciones de volumen clarificado, la exposición al aire no pudo suprimir completamente la reducción de anticuerpos.
Los inventores descubrieron que la adición de peróxido al volumen clarificado durante la recolección evita la reducción del enlace disulfuro de anticuerpos y la generación de especies de BPM. Los beneficios de usar peróxido incluyen 1) el peróxido se puede mezclar con agua en cualquier proporción y 2) la eliminación del exceso de peróxido no debería ser una carga para la purificación posterior. Sin embargo, mientras que la descomposición completa de una solución de peróxido de hidrógeno (H2O2) 10 mM en agua y oxígeno teóricamente puede generar oxígeno 5 mM, este proceso es lento en ausencia de catalizadores.
El ejemplo 2 muestra que la adición de peróxido de hidrógeno, o peróxidos inorgánicos u orgánicos alternativos tales como el percarbonato de sodio o el perborato de sodio, al volumen clarificado puede impedir eficazmente la reducción de enlaces disulfuros de anticuerpos.
Por tanto, de acuerdo con la invención, la reducción de enlaces disulfuro de los anticuerpos se evita agregando peróxido de hidrógeno al volumen clarificado en el momento de la recolección.
En un ejemplo, la reducción de enlaces disulfuros de anticuerpos se evita manteniendo la concentración de peróxido de hidrógeno del volumen clarificado en la recolección en ≤ 10 mM.
En otro ejemplo, la reducción de enlaces disulfuros de anticuerpos se evita manteniendo la concentración de peróxido de hidrógeno del volumen clarificado en la recolección entre 3 mM y 10 mM.
Ejemplos
Ejemplo 1
Asociación de vitamina B12 con mAbs
Soluciones madre de proteína
En este estudio se utilizaron dos moléculas IgG4 terapéuticas diferentes (mAb A y B). Ambas tienen una única mutación puntual de serina a prolina en el motivo de la región bisagra CPSC de la IgG4 original para parecerse a la estructura de enlace disulfuro intercatenario de IgG1 (Liu H. et.al.: MAbs (2012) 4(1): 17-23; Aalberse R.C. et.al.Immunology 2002, 105(1):9-19). Los anticuerpos IgG4 se produjeron en células CHO y se purificaron por afinidad usando cromatografía de proteína A, cromatografía de pulido adicional y filtración UHDF final a un tampón basado en histidina. La concentración de proteína del fármaco (DS) se determinó por absorción a 280 nm.
ELISA de vitamina B12.
Para la determinación de la cantidad de vitamina B12 (VB12) asociada con la proteína purificada se utilizó un kit de medición comercial de VB12 (Monobind Inc., Lake Forest, CA) con los procedimientos recomendados por el fabricante.
Unión de la vitamina B12 in vitro al fármaco.
La solución de mAb A o mAb B (50 mg/ml) en un tampón a base de histidina se mezcló con CN-Cbl (Sigma-Aldrich, V2876, solución madre 1 mg/ml en agua) o HO-Cbl (Sigma-Aldrich, V5323, solución madre 1 mg/ml en agua) en una relación molar de 4:1 a 2:1 (proteína:VB12). La reacción fue a temperatura ambiente y en oscuridad durante 1 día. El intercambio de tampón con tampón de solución salina de fosfato (PBS, Sigma-Aldrich, D5652) se logró a través de un filtro centrífugo Amicon de corte de 50 kDa hasta que no hubo color visible en el flujo. La solución de reacción con intercambio de tampón se sometió a análisis de mapeo de péptidos.
Oxidación con peróxido de hidrógeno de anticuerpos reducidos.
En un lote de mAb A se redujo parcialmente los enlaces disulfuro durante la fabricación. El fármaco se mezcló con peróxido de hidrógeno al 0,1 % (30 mM) durante 4 horas a temperatura ambiente y el exceso de peróxido de hidrógeno se eliminó mediante intercambio de tampón como se ha mencionado anteriormente.
Estudios de exposición a la luz.
En el estudio de exposición a la luz se usó medio recién preparado para mAb A . Se añadió CN-Cbl hasta una concentración final de 10 mg/l (a partir de una solución madre de 1 mg/ml).
Se usó una bombilla de luz fluorescente compacta (CFL) de luz blanca de 13 W como fuente de luz visible. Se usó una bombilla de luz negra de 13 W disponible en el mercado centrada en 360 nm como fuente de luz UV. La lámpara se instaló en una campana de extracción con un caudal de aire de 200 pies cúbicos por minuto para evitar el calentamiento de las soluciones. La superficie de la mesa de trabajo estaba oscura para evitar el reflejo de la luz. Las muestras se colocaron a una distancia aproximada de 12 a 13 pulgadas de la lámpara (la intensidad promedio fue de 672 lux en la superficie de los tubos) para simular las condiciones normales de luz de la habitación (500 - 1.000 lux). Las intensidades de luz se midieron con fotómetros (fotómetro de UVA/B Sper Scientific Modelo 850009 y Extech HD400 para UVA y luz visible, respectivamente). Los filtros de color se adquirieron de Arbor Scientific (Kit 33-0190). Los espectros de transmitancia de los filtros se muestran en la Figura 4. Se compró una lámina de plástico de policarbonato (2,4 mm de espesor) en una ferretería y se usó para filtrar la luz UVA.
Todas las muestras del medio se expusieron a la fuente de luz y se tomaron muestras a 0,3, 0,6 y 1,2 millones de lux h (intensidad x tiempo de exposición) para luz visible o 71 y 212 Watts por metro cuadrado para luz UVA.
Ensayo de grupo sulfhidrilo libre.
El método utiliza el reactivo de Ellman, 3,3'-ditio-bis(ácido 6-nitrobenzoico), disulfuro de 3-carboxi-4-nitofenilo; ácido 2,2'-dinitro-5,5'-ditiobenzoico (DTNB) con una ligera modificación de la bibliografía (Arner ES et.al. Methods Enzymol 1999, 300:226-239). Resumiendo, se mezclaron 10 μl de muestra de fármaco con 15 μl de tampón TE (50 mM Tris-HCl, EDTA 20 mM, pH 7,6) en una placa de 96 pocillos. Se mezcló recién una solución de DTNB (5 mg/ml en etanol, de Sigma-Aldrich, D8130) con guanidina-HCl 8 M en Tris 0,2 M (pH 8) en una relación de volumen de 1:9 antes de su uso. A continuación, se añadieron 100 μl de la solución de DTNB/guanidina a cada pocillo y se mezclaron. Se midió la absorción espectral a 412 nm y se utilizó el valor del coeficiente de extinción molar de 13.600 M'1 cirr1 para el cálculo.
Pruebas de desnaturalización de anticuerpos.
Para la desnaturalización por calor, se calentó 1 ml de mAb A (después de la purificación en columna por afinidad de proteína A y neutralizada con Tris) a 80 °C durante 20 minutos en un tubo de ensayo Eppendorf. Se formó una precipitación visible después de calentar y enfriar. El tubo se centrifugó a 18.000 x g durante 20 minutos. El sobrenadante se usó para el ensayo de proteínas (DO 280) y ensayo ELISA de la vitamina B12. Para la desnaturalización de SDS, se mezclaron 0,25 ml del fármaco con 0,75 ml de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,3 % en solución salina de fosfato (PBS) y se dejó a temperatura ambiente durante 1 día. El SDS adicional se eliminó mediante intercambio de tampón con PBS a través de un filtro centrífugo Amicon de corte de 50 kDa.
Análisis de mapeo de péptidos de la mezcla de reacción de fármaco-vitamina B12 usando
LC/MS/MS. La muestra que contenía mAb A y vitamina B12 se digirió con tripsina sin reducción o alquilación previa. La mezcla de reacción de intercambio de tampón se diluyó a 1 mg/ml usando el tampón de digestión (tris HCl 50 mM, cloruro de calcio 10 mM y urea 2 M, pH 7,6) antes de añadir la tripsina en una relación de enzima y proteína de 1:25 (peso/peso). Después de la incubación a 37 °C, la mezcla digerida se sometió directamente a análisis LC/MS/MS. Aproximadamente 10 μg del digerido tríptico se separaron cromatográficamente usando una UPLC Waters Acquity™ antes de analizarlos con un espectrómetro de masas ThermoFisher Q-EXACTIVE PLUS Orbitrap. Se usó una columna
Waters Acquity BEH CSH™ C18 (1,7 |jm, 2,1x100 mm) para la separación (a 45 °C). Se usó un gradiente lineal del 1 % al 80 % de fase móvil B durante 60 minutos para eluir los péptidos (fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % y formato de amonio 5 mM) en agua; fase móvil B: fórmico al 0,1 % y formiato de amonio 5 mM en acetonitrilo) a un caudal de 0,2 ml/min. El espectrómetro de masas Orbitrap se hizo funcionar en el modo de iones positivos con un voltaje de pulverización de 3,0 kV. La temperatura del calentador y la temperatura del capilar se fijaron en 300 °C y 275 °C, respectivamente. La adquisición de MS se realizó con una resolución de 70.000 y los 10 iones más intensos en cada ciclo de trabajo se seleccionaron para el análisis de MS/MS con una resolución de 17.500. Se habilitó la función de exclusión dinámica. Se usó energía de colisión normalizada de 25 para obtener espectros de fragmentación.
Para generar el co lor rosa son necesarios tanto mAb reducido con d isulfuro como HO-Cbl. Durante la fabricación de mAbs, se observó que el color rosa generalmente aparecía en la etapa de elución de la proteína A, en la que se concentraron los mAb y se eliminó el color de fondo de las composiciones del medio. Analizamos el contenido de la vitamina B12 por el método ELISA y descubrimos que el lote de color rosa tenía aproximadamente 20 veces más vitamina B12 que un lote incoloro (Tabla 1, Lotes 1 contra 2).
Tabla 1. Unión de vitamina B12 VB12 tioles libres de mAb B
Basándose en los pesos moleculares y las concentraciones de vitamina B12 y mAb, el material coloreado tenía aproximadamente una molécula de vitamina B12 en 47 moléculas de mAb. La vitamina B12 tiene tres picos de absorción principales cerca de 360, 420 y 550 nm. El escaneo espectral reveló que el lote de color rosa tenía una mayor absorción que el lote incoloro más allá de 320 nm (Figuras 1A y 1B, líneas rojas frente a líneas moradas).
Se ha propuesto que la reducción del enlace disulfuro y la generación de grupos sulfhidrilo libres está asociada con la aparición del color rosa (Derfus GE et.al. MAbs 2014, 6(3):679-688). El contenido de sulfhidrilo libre del lote de color rosa de mAb B tenía niveles de sulfhidrilo libre más altos que el lote incoloro (Tabla 1). Por otro lado, algunos lotes (N = 4 para mAb A y N = 2 para mAb B) con alto nivel de contenido de sulfhidrilo libre no tenía color rosa en el fármaco. Por ejemplo, El lote 2 de mAb A contenía un nivel más alto de grupos sulfhidrilo libres que el del lote 1, pero ambos lotes eran incoloros y tenían niveles similares de vitamina B12 (Tabla 2). Estos resultados indican que los grupos sulfhidrilo libres son necesarios pero solos no son suficientes para generar un producto de color rosa.
Tabla 2. Unión de vitamina B12 tioles libres de mAb A
La vitamina B12 es un cofactor esencial para el cultivo de células de mamíferos. CN-Cbl, la forma más estable de la vitamina B12, es la única fuente usada en el proceso de cultivo celular. Se ha informado que la luz puede convertir CN-Cbl en HO-Cbl, que es altamente reactivo con mAb (Prentice KM et.al.: MAbs 2013, 5(6):974-981). Para demostrar la necesidad tanto de tioles libres de proteínas como de HO-Cbl reactivo para generar color rosa en el fármaco, se estableció un panel de ensayos incubando CN-Cbl o HO-Cbl con mAb A con niveles bajos (Lote 1) o altos (Lote 2) de contenido de sulfhidrilo libre. Las isoformas de vitamina B12 y el mAb se mezclaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 día en la oscuridad. Después de la incubación, a continuación, la vitamina B 12 libre se eliminó por filtración. La cantidad de vitamina B12 retenida (Tabla 2) indicó que (1) el HO-Cbl es mucho más activo que el CN-Cbl para formar complejos con el mismo lote de mAb, (2) que el fármaco con un nivel más alto de grupos sulfhidrilo libres era más reactivo que el fármaco con el nivel más bajo de grupos sulfhidrilo libres, y (3) la mayor incorporación de vitamina B12 ocurrió en presencia de HO-Cbl y el fármaco con un alto nivel de grupo sulfhidrilo libre, y dio como resultado un aumento de más de 100 veces en la vitamina B12. La diferencia de color proveniente de la cantidad de vitamina B12 en cada muestra era evidente a simple vista (Figura 2a).
Los grupos sulfhidrilo libres provienen de enlaces disulfuro reducidos en las proteínas. El fármaco del lote 2 mAb A tenía un promedio de 3,1 grupos sulfhidrilo libres por molécula de proteína (Tabla 2) y se redujeron más del 95 % de las moléculas de anticuerpo (Figuras 2b y 2c). Se añadió peróxido de hidrógeno (0,1 % v/v) al material del Lote 2 y la mayoría (86,6 %) de las especies de bajo peso molecular (BPM) se convirtieron en monómero de anticuerpo (Figuras 2b y 2c). El material reoxidado tenía un nivel de sulfhidrilo libre más bajo (medido después del tratamiento con H2O2 y antes de la incubación con HO-Cbl) y una reactividad más baja hacia HO-Cbl. Estos resultados demuestran que la generación del color rosa es una reacción de segundo orden cuya tasa depende de las concentraciones de ambos reactivos, concretamente, grupos sulfhidrilo libres y HO-Cbl.
La vitamina B 12 se une covalentemente al anticuerpo. La bibliografía anterior no proporciona evidencia experimental de la naturaleza de la unión de vitamina B12, aunque se sugirió una naturaleza no covalente (Derfus et al., 2014). La supuesta asociación no covalente requeriría la complementariedad estructural y de carga del anticuerpo con la vitamina B12, por lo tanto, la alteración de la estructura de la proteína nativa liberaría la vitamina B12 unida. Se usaron dos métodos de desnaturalización, tratamientos térmicos y SDS. El calentamiento a 85 °C durante 20 minutos provocó que el material de color rosa mAb B se desnaturalizara y precipitara. El sobrenadante, que contenía poca proteína, tenía sólo aproximadamente un 3,5 % del total de vitamina B12 de la solución proteica de partida (Tabla 1). SDS desnaturaliza las proteínas uniéndose a la cadena principal peptídica y manteniendo la proteína desnaturalizada solubilizada en solución. El ensayo de vitamina B12 indicó que la mayoría, si no toda, la vitamina B12 todavía estaba asociada con la proteína desnaturalizada (Tabla 1). El cambio de movilidad del material coloreado se detectó en una electroforesis capilar no reducida-SDS (CE-SDS). Tanto el fármaco mAb A como el complejo mAb A-vitamina B12 coloreado tenían múltiples bandas en CESDS no reducido debido a la reducción de disulfuro. Además de los picos que se superpusieron con los picos correspondientes en el material inicial, el material coloreado tenía picos adicionales que se desplazaban hacia el lado de mayor peso molecular y el cambio era más evidente en los picos de bajo peso molecular, tales como cadenas ligeras y pesadas individuales (Figura 2d). Esta observación puede explicarse fácilmente como la adición de moléculas de vitamina B12 a mAb. En conjunto, estos resultados demuestran que la vitamina B12 se asocia con proteínas desnaturalizadas y comigra con proteínas en condiciones desnaturalizadas. Por lo tanto, es improbable que la interacción entre la vitamina B12 y mAb sea de naturaleza no covalente.
Tanto CN-Cbl como HO-Cbl se observaron en la digestión de tripsina mediante análisis LC/MS/MS. Las masas moleculares teóricas para CN-Cbl y HO-Cbl son de 1254,567 y 1345,567 Da respectivamente. El ion predominante observado para CN-Cbl es el ion de doble carga en m/z 678,293, correspondiente a CN-Cbl con una adición de dos protones. Sin embargo, el ion más predominante observado para HO-Cbl es el ion doblemente cargado en m/z 664,789 correspondiente a B12-OH con el ligando OH saliendo del compuesto de coordinación y agregando un protón. Los espectros MS/MS de las especies m/z 664,789 de HO-Cbl y m/z 678,293 de CN-Cbl se muestran en las Figuras 4A y 4B, respectivamente. Hay muchos iones de fragmentos comunes de los dos espectros MS/MS, incluidos los valores m/z de 147,09, 359,10, 456,72, 912,44 y 1124,45. El m/z 997,48 y 1209,49 en los espectros MS/MS de CN-Cbl se origina a partir de la especie con m/z 912,44 y 1124,45, sin perder el grupo CoCN.
Se encontraron enlaces covalentes coordinados entre la cobalamina y la IgG a través de la coordinación con varios residuos de cisteína mediante análisis LC/MS/MS del digerido tríptico. Hay cinco residuos de cisteína en cada cadena ligera y once en cada cadena pesada. Sin embargo, se ha observado que solo cinco de ellos (L-C214, H-C134, H-C321, H-367, H-C425) forman complejos de coordinación con cobalamina por MS, como se enumera en la Table 3.
L-C214 se encuentra en el extremo C de la cadena ligera y es el único residuo de cisteína de la cadena ligera que participa en la formación coordinada de enlaces covalentes.
Esto se demuestra por las masas observadas para el complejo péptido C-terminal L-ig-Cbl (1635,646 Da) y el complejo péptido L18-19 digerido incompleto-Cbl (2139,894 Da), con una precisión de masa de 2 ppm. Estos complejos coordinados también fueron confirmados por el análisis MS/MS. Los espectros MS/MS de estos dos complejos péptido-Cbl son muy similares, consistiendo principalmente en fragmentos de la cobalamina. La mayoría de los fragmentos de MS/MS se pueden identificar comparándolos con espectros de MS/MS de m/z 664,789 de especies de HO-Cbl. Como se muestra en las Figuras 4A y 4B, m/z 147,09, 359,10, 486,24 son exactamente iguales que en los espectros MS/MS de HO-Cbl. Adicionalmente, las especies con m/z 971,47 y 1.183,48 consisten en las mismas estructuras con m/z 912,44 y 1.124,45, más un cobalto (masa atómica 58,93 Da).
De forma similar, se han identificado cuatro cisteínas en la cadena pesada para formar enlaces coordinados con la cobalamina. H-C134 es la contraparte del enlace disulfuro con L-C214 en la región FAB. Los otros tres residuos de cisteína H-C321, HC-C367 y H-C425 son las tres cisteínas C-terminales en la región Fc de la cadena pesada. Asimismo, HC-C367 y H-C425 son puentes disulfuro emparejados en la IgG4 nativa.
Conversión de luz de CN-Cbl a HO-Cbl y control del proceso de productos de color rosa. Como se ha analizado anteriormente, la reacción de color rosa es una reacción de segundo orden que depende de las concentraciones de molécula de anticuerpo reducida y HO-Cbl. Por lo tanto, se requieren estrategias de control del proceso para evitar la reducción de la molécula de anticuerpo y/o la generación de HO-Cbl. El control de la reducción del producto de anticuerpo es un proceso muy complicado que podría implicar el rediseño de anticuerpos (Peters S.J. et.al. J. Biol. Chem. 2012, 287(29):24525-24533; Aalberse R.C. et.al, 2002), composición del medio de cultivo (Trexler-Schmidt M. et.al. Biotechnol Bioeng 2010, 106(3):452-461), parámetros del proceso (Mun M. et.al. Biotechnol Bioeng 2015, 112(4):734-742) y tratamiento de la recolección (Trexler-Schmidt M. et.al, 2010). Controlar la cantidad del HO-Cbl evitando que la exposición a la luz visible sea una estrategia alternativa. Sin embargo, estas opciones pueden causar inconvenientes de operación y pueden ser específicas de la línea celular.
Abordamos este problema mediante la identificación de las longitudes de onda que causan la conversión CN-Cbl y establecimos una estrategia de control eliminando las longitudes de onda dañinas de las fuentes de luz. La vitamina B12 tiene absorción de tanto luz visible como UVA (Figura 1). El medio de cultivo mAb A recién preparado se expuso bajo (1) luz de laboratorio normal que proviene de tubos de luz fluorescente blanca con una intensidad de 500-1.000 lux, o (2) luz visible intensificada proporcionada por una bombilla de luz fluorescente CFL, o (3 ) luz UVA intensificada centrada en 360 nm. El CN-Cbl y el HO-Cbl se separaron y cuantificaron por RP-UPLC (Figura 4B). Los resultados muestran que era la luz visible, no la luz UVA, la que causó principalmente que CN-Cbl se convirtiera en HO-Cbl (Tabla 4). La tasa de conversión fue una función de la iluminación general (intensidad x tiempo) tanto de la luz de laboratorio normal como de la luz visible de alta intensidad.
Tabla 4. La luz visible no la luz UVA es res onsable de la conversión de CN-Cbl
A continuación, investigamos el rango de longitudes de onda visibles (o colores) que pueden causar la conversión de CN-Cbl en función de la energía. Se usaron filtros de color seleccionados para generar luz con límites de longitud de onda específicos para aislar ciertas regiones del espectro de luz (Figura 4A). Como se muestra en la Table 5 , el grado de conversión de CN-Cbl en función del tiempo de exposición a luz de diferentes colores. Ya que el vidrio de policarbonato puede bloquear la mayor parte de la luz UVA mientras es transparente a la luz visible, no se pudo evitar la conversión de CN-Cbl. La exposición a la luz roja cuya longitud de onda es superior a 600 nm tuvo la tasa más lenta de conversión de CN-Cbl (Figura 4d). Por el contrario, tanto la luz verde (Figura 4e) como la luz azul tienen tasas mucho más altas de conversión CN-Cbl. CN-Cbl tiene picos de absorción a 420 nm y regiones de 500 a 550 nm que se superponen con los espectros de luz azul y verde usados en este estudio. Estos resultados proporcionan evidencia sólida para respaldar nuestra visión de que la luz de diferentes colores tiene un impacto diferente en la conversión de CN-Cbl y solo las longitudes de onda superiores a <600 nm pueden causar la conversión de CN-Cbl.
Tabla 5. Im acto de la luz de color sobre la conversión de CN-Cbl
continuación
Uso de la luz de color rojo en el entorno de fabricación como estrategia de control del color rosa. El uso de luz roja en lugar de luz de fluorescencia blanca normal se ensayó en un entorno de laboratorio. El mAb A reducido (producto del Lote 2 en la Tabla 2) se añadió al medio de cultivo a una concentración de mAb A similar a la del cultivo celular real en el momento de la recolección. Los medios de cultivo habían sido previamente expuestos a luz blanca, luz roja o verde (1,2 millones de lux hora). Después de la incubación durante la noche (20 horas) en la oscuridad, el mAb se purificó mediante una columna de proteína A y se midió la vitamina B12 unida por ensayo ELISA. Como se muestra en la Table 6 , había más unión de vitamina B12 en el medio expuesto a la luz blanca y verde que en el medio expuesto a la luz roja y el control oscuro. Estos resultados indican que la luz roja, en efecto, puede proteger a CN-Cbl de la conversión.
Tabla 6. Un fármaco mAb A introducido en CB ex uesto a luz de varios colores
Ejemplo 2
Uso de peróxido de hidrógeno para evitar la reducción de enlaces disulfuro de anticuerpos durante el proceso de fabricación
Soluciones madre de proteína
En este estudio se usaron dos moléculas de IgG4 (1 y 2) y dos moléculas de IgG1 (3 y 4). Las moléculas de IgG4 tenían una sola mutación puntual de serina a prolina en el motivo de la región bisagra CPSC de la IgG4 original para parecerse a la estructura de enlace disulfuro entre cadenas de IgG1 CPPC (Liu H. et.al. MAbs. 2012;4:17-23, Aalberse R.C. et.al.Immunology 2002;105:9-19). Todos los mAb se produjeron en cultivo de células CHO con viabilidades celulares que oscilaban entre el 50 y el 90 %. El volumen clarificado (CB) generalmente se generó con filtración profunda a menos que se especifique lo contrario, en cuyo caso se generó por centrifugación. El cultivo celular de mAb 1 en algunos casos se trató con pH bajo más sulfato de dextrano antes de la filtración profunda. La purificación posterior se logró mediante cromatografía de proteína A, las etapas cromatográficas de pulido adicionales y una etapa final de ultrafiltración/diafiltración en un tampón basado en azúcar de histidina. Las concentraciones de proteína se determinaron por absorción a 280 nm (A280) por un espectrómetro Dropsense-96 (Trinean NV, 9050 Gante, Bélgica).
Ensayo de contenido de sulfhidrilo libre (tiol)
El método usó ácido 2,2'-dinitro-5,5'-ditiobenzoico (DTNB) con una ligera modificación de la bibliografía (Arner E.S. et.al. Methods Enzymol. 1999;300:226-239. Resumiendo, se mezcló una muestra de 10 ml de volumen clarificado o fármaco (DS) con 15 ml de tampón TE (Tris-HCl 50 mM, EDTA 20 mM, pH 7,6) en una placa de 96 pocillos. Se mezcló recién solución de DTNB (5 mg/ml en etanol; Sigma-Aldrich, D8130) con guanidina-HCl 8 M en Tris 0,2 M (pH 8) en una relación de volumen de 1:9 antes de su uso. Se añadieron 100 ml de la solución de DTNB/guanidina a cada pocillo y se mezclaron. Se ensayaron muestras duplicadas. Se midió la absorción espectral a 412 nm y se usó un valor de coeficiente de extinción molar de 13.600 M'1 cirr1 para el cálculo del contenido de tiol libre.
Ensayos de indicadores redox
Se disolvió 2, 6-diclorofenolindofenol (D2932, Spectrum Chemical MFG Corp, Gardena, CA) en agua para preparar una solución madre fresca al 1 %. La forma oxidada de 2, 6-diclorofenolindofenol era azul a pH neutro y se volvió
incolora cuando se redujo. En pH ácido, la forma oxidada de 2, 6-diclorofenolindofenol era púrpura y cambió a incolora cuando se redujo. Para determinar el rango de color de DCPIP para muestras reducidas y no reducidas, se mezcló el 100 % del lisado celular mAb 2 con un volumen clarificado normal producido por centrifugación para generar una serie de diluciones al 0, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 y 70 % de lisado celular. El contenido de tiol libre de cada dilución se midió inmediatamente y se representó en una gráfica en función de la dilución (Figura 6D). Se añadió DCPIP (10 ml) a las diluciones de lisado celular en serie (1 ml a temperatura ambiente) para determinar qué dilución mostró un cambio de color mediante inspección visual en una duración de unos pocos segundos a minutos.
Calibrador no reducido y reducido
El sistema LabChip GXII Touch HT (PerkinElmer) se usó para el análisis de pureza de mAb en condiciones reductoras (R_Calibrador) y no reductoras (NR_Calibrador) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. NR_Calibrador fue la herramienta más conveniente, de alto rendimiento para separar y cuantificar los fragmentos de anticuerpos, incluyendo 2 cadenas pesadas 1 ligera (HHL), una cadena pesada una ligera (HL), cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC). Se usó cromatografía de exclusión por tamaño para hacer un seguimiento del mAb intacto y especies de alto peso molecular (APM).
Medición espectrométrica de masas de oxidación de anticuerpos para mAb
Las muestras de mAbs 2 y 3 se redujeron por ditiotreitol, alquilado por yodoacetamida y digerido con tripsina. El digerido tríptico se separó cromatográficamente usando un sistema de UPLC Waters ACQUITY (Milford, MA, EE. UU.) antes de analizarlo con un espectrómetro de masas Thermo Scientific Orbitrap Q-EXACTIVETM PLUS (Bremen, Alemania). Se usó una columna Waters Acquity BEH C18 (1,7 mm, 2,1 y 150 mm) para la separación (a 40 °C). Se usó un gradiente lineal del 2 % al 80 % de fase móvil B durante 110 minutos para eluir los péptidos (fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua; fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo) a un caudal de 0,2 ml/min.
El espectrómetro de masas Q Exactive Plus se operó en modo dependiente de los datos para cambiar entre la adquisición de MS y MS/MS. Los iones se generaron utilizando un caudal de gas envolvente de 40, un caudal de gas auxiliar de 10, una tensión de pulverización de 3 kV, una temperatura capilar de 275 °C y un nivel de RF S-Lens de 60. La resolución se fijó en 70.000 (objetivo de AGC 3e6) y 17.500 (objetivo de AGC 1e5) para barridos de sondeo y eventos de MS/MS, respectivamente. Se usó la duración de exclusión dinámica de 10 s con un solo recuento repetido. La cuantificación relativa se logró dividiendo las áreas de los picos de los péptidos oxidados por la suma de los péptidos nativos y los péptidos oxidados en los cromatogramas de iones seleccionados de los barridos de sondeo.
Peróxido de hidrógeno y otros tratamientos con peróxido
Se diluyó recién una solución madre al 30 % de peróxido de hidrógeno (Sigma-Aldrich cat. 216763, densidad de 1,11 g/ml) con agua al 3 % de solución madre (v/v, igual a 980 mM) antes de su uso. La solución madre al 3 % se añadió al cultivo celular o CB a concentraciones finales de 0,1 a 20 mM según se desee. Para probar el efecto del peróxido de hidrógeno en la reducción del disulfuro de anticuerpos, se agregó solución madre de peróxido de hidrógeno al CB a concentraciones finales de 0, 0,1, 0,33, 1, 3, 5, 10 o 20 mM.
También se ensayaron dos productos químicos inorgánicos que contenían peróxido de hidrógeno, percarbonato de sodio (Sigma-Aldrich, Cat. 371432, 2Na2CO3 3 H2O2) y perborato de sodio (Sigma-Aldrich, Cat. 372862, NaBO3 H2O). Tanto el percarbonato de sodio como el perborato de sodio se someten a hidrólisis al entrar en contacto con el agua, produciendo peróxido de hidrógeno y carbonato o borato, respectivamente.
Modelo a pequeña escala de la reducción de enlaces disulfuro
Se llenó una botella de 500 ml con una tapa aspirada (FlexBioSys, Cat FXB-500M-0005) con 300 ml de volumen clarificado. Como alternativa, una bolsa BioProcess de 50 ml (ThermoFisher, Cat SH30658.11) se llenó con 30 ml de volumen clarificado. El envase se conectó a una línea de suministro de gas nitrógeno puro y se lavó con gas nitrógeno (≤ 34.473,8 Pa (≤ 5 psi)) a temperatura ambiente durante 1 a 2 horas y, a continuación, se mantuvo encerrado en condiciones sin aire durante 1 día. Después de la espera, la muestra se analizó mediante el ensayo de tiol libre inmediatamente o se mezcló con yodoacetamida (concentración final 20 mM) antes de ser analizada por NR_Calibrador.
Para generar el peor de los casos para la reducción de enlaces disulfuro de anticuerpos, el 100% de la alteración celular se indujo artificialmente mediante alteración mecánica. El cultivo celular se centrifugó (500 g durante 20 min), el sedimento celular se resuspendió en 1/10 del volumen original en tampón RIPA (ThermoFisher, Cat. 8990. Tris 25 mM, NaCl 150 mM, SDS al 0,1 %, desoxicolato sódico al 1 %, NP-40 al 1 %, pH 7,6) y lisado a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación, a continuación, se enfrió en hielo y se pasó a través de un homogeneizador de tejidos a alta velocidad durante 3 min. Se asumió que estas etapas lograron la lisis celular total. A continuación, el material lisado se volvió a añadir al sobrenadante centrifugado. Este lisado celular se introdujo en bolsas de 50 ml con o sin peróxido de hidrógeno, a continuación, se lavó con gas nitrógeno y se mantuvo en condiciones sin aire a temperatura ambiente durante 1 día como se ha descrito anteriormente. Después de la incubación, el lisado celular se
centrifugó dos veces a 3.000 g durante 60 minutos a 4 °C, se pasó por un filtro de 0,2 mieras y se analizó como se ha descrito anteriormente.
Tratamiento con peróxido de hidrógeno y su efecto sobre los atributos de calidad del producto
Para el mAb 4, el fluido de cultivo celular de biorreactores a escala de laboratorio se usó para los siguientes dos experimentos. En el primer experimento, el volumen clarificado se generó mediante centrifugación y filtración usando un filtro de 0,2 micras. El volumen clarificado resultante se (a) almacenó a 4 °C durante 4 días como control o (b) se combinó con peróxido de hidrógeno hasta una concentración final de 10 mM de peróxido y se almacenó a 4 °C durante 4 días. En el segundo experimento, se agregó peróxido de hidrógeno al fluido de cultivo celular (con células), incubado a temperatura ambiente durante 1 hora antes de la centrifugación. El volumen clarificado resultante se (a) almacenó a 4 °C durante 4 días como control o (b) se colocó a temperatura ambiente el tercer día y se lavó con gas nitrógeno, y se mantuvo a temperatura ambiente durante otro día.
Todas las muestras resultantes se procesaron a través de cromatografía de proteína A seguida de etapas de inactivación viral a pH bajo y neutralización usando condiciones de punto central del proceso. Los atributos de calidad del producto se evaluaron mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento de exclusión por tamaño para analizar los niveles de anticuerpos intactos y agregados, mediante enfoque isoeléctrico capilar con imágenes para la distribución de variantes de carga, y mediante calibrador en condiciones reducidas y no reducidas para la pureza. Las impurezas del proceso se estimaron mediante ELISA para las proteínas de la célula hospedadora y mediante qPCR para el ADN residual.
Para el mAb 2, se añadió peróxido de hidrógeno al volumen clarificado a una concentración final de 0, 3, 5 y 10 mM, a continuación, se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 día bajo lavado con gas nitrógeno. Las muestras resultantes se procesaron mediante cromatografía de proteína A de alto rendimiento antes del análisis.
Reducción de enlaces disulfuro durante la fabricación
La reducción de mAbs se ha observado en el proceso de desarrollo de varias moléculas de anticuerpos IgG1 e IgG4, ya sea en el volumen clarificado (CB) o en el eluido de proteína A (PAE).
Al igual que con otros grupos, observamos la acumulación de tiol libre total en el volumen clarificado durante la recolección y la recuperación primaria (WO 2015/085003, Ruaudel J., et al. BMC Proceedings 2015;9(9):24). La diferencia en las concentraciones de tiol libre entre muestras de volumen clarificado de mAb 1 que mostró reducción de disulfuro frente a muestras que no lo hicieron fue significativa (Figura 5A). En el caso de mAb 1, cuando el nivel de tiol libre en el volumen clarificado fue inferior a 100 mM, hubo bajo riesgo de generación de bajo peso molecular; un nivel de tiol libre de 100-200 mM planteaba un riesgo potencial; y el nivel de tiol libre por encima de 200 mM era un alto riesgo de generación de bajo peso molecular. Vale la pena señalar que el reactivo de Ellman (ácido 2,2'-dinitro-5,5'-ditiobenzoico; DTNB) reacciona con grupos sulfhidrilo de moléculas pequeñas que contienen sulfhidrilo, como el glutatión reducido, cisteína y ácido lipoico, además de los grupos sulfhidrilo libres en las proteínas. Por tanto, el nivel de referencia del nivel de tiol libre depende de las líneas celulares, la composición del medio de cultivo (pequeñas moléculas que contienen sulfhidrilo) y la viabilidad celular. Sin embargo, cuando se produjo la reducción de los enlaces disulfuro, el nivel de tiol libre tendía a ser mucho más alto que la línea de base.
El nivel de tiol libre en un volumen clarificado es muy dinámico y pertenece a las composiciones y el proceso de manipulación. Además de la exposición al aire, otros factores tales como la temperatura de almacenamiento y el pH también contribuyen a la dinámica. El ajuste del pH del volumen clarificado de mAb 1 de 7 a 4,8, seguido de la eliminación de las células por filtración profunda condujo a una pequeña disminución en el nivel de tiol libre y el porcentaje de bajo peso molecular que se observó (Figuras 5B y 5C). Cuando la recolección de células se trató con una combinación de pH 4,8 y sulfato de dextrano (0,05 g/l y mezclado durante 60 minutos seguido de centrifugación y filtración), el nivel de tiol libre se redujo significativamente, consistente con la observación de que la floculación elimina las proteínas de la célula hospedadora, incluyendo Trx/TrxR y Glu/GR y también puede eliminar algunas moléculas pequeñas que contienen sulfhidrilo. El nivel de tiol libre también varió con la temperatura. La incubación del volumen clarificado de control a 37 °C durante 75 min provocó una caída del 60 % del contenido de tiol libre. Sin embargo, si se agregaba 1 mM de NADPH, un componente necesario para las reacciones TrxR y GR, a las soluciones antes de la incubación a 37 °C, se observó un aumento del nivel de tiol libre en el control y el CB ajustado por pH (Figura 5A). Estos cambios dinámicos indican que debe hacerse un seguimiento del nivel de tiol libre en las etapas previas y posteriores a la recolección para poder pronosticar mejor el riesgo de generación de bajo peso molecular.
Uso de indicadores redox para predecir la reducción de enlaces disulfuro
Puesto que la reducción del enlace disulfuro es una reacción redox, es posible utilizar indicadores redox como una forma simple, rápida y robusta de reemplazar la prueba DTNB y pronosticar el riesgo potencial de formación de bajo peso molecular durante la recolección y la recuperación. Un indicador redox experimenta un cambio de color definitivo a un potencial de electrodo específico de manera similar a como los indicadores de pH experimentan un cambio de color a un pH específico. Para encontrar el indicador redox apropiado, se ensayó una variedad de indicadores redox
disponibles en el mercado y se identificaron varios como los mejores candidatos potenciales que se pueden usar en el proceso de fabricación de productos biológicos.
Un ejemplo de indicador redox es el 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP, Figura 6A). Su color cambió en el fármaco purificado mAb 2 , que tenía un alto porcentaje de bajo peso molecular (Figura 6B), y su color puede cambiar total o parcialmente o nada en el volumen clarificado con nivel alto, medio y bajo de tioles libres, respectivamente (Figura 6C). Para determinar el rango de cambio de color DCPIP, la solución madre de DCPIP se añadió a una dilución en serie de lisados celulares de mAb 2 con concentraciones conocidas de tiol libre (Figura 6D). DCPIP experimentó un cambio de color en CB de mAb 2 con un 3-5 % de lisado celular y concentraciones de tiol libre en un intervalo de 80 100 mM. Por lo tanto, cuando una muestra de volumen clarificado tuvo una concentración de tiol libre superior a 100 mM, el DCPIP cambió de color y esta característica convierte al DCPIP en un método rápido y fácil de usar para pronosticar el riesgo de reducción de enlaces disulfuro durante la fabricación.
Se diseñó un estudio para examinar si el cambio de color en DCPIP se correlacionaba con los niveles de tiol libre y podía predecir correctamente la generación de bajo peso molecular (Figura 6E). El volumen clarificado mAb 3 se generó mediante filtración profunda con aire o con gas nitrógeno lavando el tren de filtración antes del procesamiento. El lavado con gas nitrógeno se usó para generar una condición "sin aire" en la que no había oxígeno expuesto al fluido durante el proceso de recolección. El volumen clarificado resultante se dividió en alícuotas en recipientes pequeños con un 0, 20, 50 y 100% de volumen del espacio de cabeza con superposición de aire al volumen líquido y se incubaron a 4 °C, 24 °C y 37 °C durante un día. Como se muestra en la Tabla 7, la presencia de aire durante la recolección y la recuperación fue fundamental para evitar la generación de bajo peso molecular. En este caso, el volumen clarificado inicial tenía una concentración de tiol libre más baja (51 mM) en comparación con la condición sin aire (207 mM) y el nivel de oxígeno disuelto (OD) fue suficiente (>37 %) para suprimir la generación de bajo peso molecular incluso durante las condiciones de mantenimiento del porcentaje de superposición de aire y a diferentes temperaturas.
Por el contrario, el % de superposición de aire durante el mantenimiento se volvió importante para el volumen clarificado generado en la condición sin aire. El peor de los casos fue una recolección sin aire y un mantenimiento sin aire, donde el monómero mAb intacto disminuyó del 96,5 % al 81,6 %. Además, cuando la superposición de aire fue del 20 % o más, no se produjo reducción de disulfuro. La temperatura de incubación tuvo un efecto diferente sobre la concentración de tiol libre. Las concentraciones más altas de tiol libre y la reducción máxima ocurrieron a un mantenimiento a 24 °C. La cantidad de tiol libre después de mantenerse a 4 °C fue cercana a la cantidad antes del mantenimiento. Se supuso que el mantenimiento a 37 °C era la temperatura óptima para la actividad enzimática de TrxR y GR. Sin embargo, causó universalmente una disminución en las cantidades de tiol libre en todas las condiciones, y los datos fueron consistentes con los resultados de mAbl como se muestra en la Figura 5.
Tabla 7. Concentraciones de tiol libre y cambio de color de DCPIP en el volumen clarificado de mAb 3 generado y mantenido en diversas condiciones con y sin aire.
(continuación)
Al final del estudio de mantenimiento durante 1 día, cada muestra se mezcló con solución madre de DCPIP. El cambio de color se evaluó por observación visual (Figura 6F). La Tabla 7 mostró que la secuencia de cambio de color tenía una fuerte correlación con las concentraciones de tiol libre; cuanto mayor fue la concentración de tiol libre, más rápido se produjo el cambio de color de DCPIP. Todas las muestras que se recolectaron en condiciones aireadas no mostraron ningún cambio de color.
De manera similar también se probaron indicadores redox adicionales con diferentes potenciales de reducción estándar, se encontró que la tionina y el azul de metileno cambiaron de color a niveles de tiol libre de 600-800 y >1.000 mM (datos no mostrados), respectivamente. Estos tintes se pueden juntar para formar una escalera de indicadores para pronosticar rápidamente el nivel de riesgo durante la fabricación.
Un modelo a escala reducida para recapitular la reducción de enlaces disulfuro durante la recolección y la recuperación primaria
Una gran cantidad de evidencia sugiere que la reducción del enlace disulfuro está correlacionada con la lisis celular durante la operación de recolección y con el volumen clarificado que se mantiene en recipientes cerrados (por ejemplo, bolsas desechables) sin una cantidad suficiente de aire a temperatura ambiente a lo largo del tiempo (Mun M. et. Alabama. Biotechnol Bioeng 2015;112:734-742). En consecuencia, se desarrolló un modelo a pequeña escala para imitar este fenómeno llenando una pequeña cantidad de volumen clarificado (10 a 300 ml) en un recipiente sellable y generando condiciones sin aire mediante el lavado con gas nitrógeno y manteniendo a temperatura ambiente seguido de análisis NR_Calibrador para bajo peso molecular (Figura 7).
Puesto que el volumen clarificado de la operación de fabricación puede variar de un lote a otro en términos de daño celular y tiempo de retención en varias etapas desde antes de la recolección hasta después de la recolección, el contenido de bajo peso molecular puede variar en un amplio intervalo desde un pequeño porcentaje hasta casi el 100 %. Para simular los estudios a pequeña escala, se generó el peor de los escenarios (descrito en materiales y métodos anteriormente) en el que el lisado celular de las células CHO se mezcló con el sobrenadante del volumen original del cultivo celular para simular el 100 % de la lisis celular y dio como resultado la generación de bajo peso molecular incluso en presencia de aire (Figura 8A), llenado en un recipiente sellable, se lavó con gas de nitrógeno y se incubó a temperatura ambiente durante 1 día. En estas condiciones, todas las moléculas de anticuerpo mAb 2 intactas en el volumen clarificado se fragmentaron por completo (Figuras 8B y 9B). El contenido de tiol libre en el 100 % del volumen clarificado por lisis celular se midió de 1 a 3 mM, que era al menos 10 veces superior al del funcionamiento normal.
El peróxido de hidrógeno puede inhibir la reducción de los enlaces disulfuro
Una forma de controlar la reducción de los enlaces disulfuro en los mAb es eliminar el potencial reductor contenido en el volumen clarificado antes de que se reduzcan los mAb. Se ensayó el uso de H2O2 para este fin. Como se muestra en la Figura 7 , el volumen clarificado de mAb 2 control generó aproximadamente un 20 % de bajo peso molecular después de mantenerse en condiciones sin aire a temperatura ambiente durante 1 día (Figura 7C). Se agregó peróxido de hidrógeno al mismo volumen clarificado en concentraciones de 0,33, 1 y 3 mM antes del mantenimiento sin aire. Los resultados mostraron que el peróxido de hidrógeno 3 mM (aproximadamente el 0,01 %) puede impedir por completo la generación del bajo peso molecular (Figuras 7E, 7G y 71). Estos resultados indican que el peróxido de hidrógeno impide eficazmente la reducción de enlaces disulfuro.
Para determinar la concentración mínima de H2O2 necesaria para inhibir la generación de bajo peso molecular en el peor de los casos, se usó el modelo de cultivo de células lisadas al 100 % descrito anteriormente. En este estudio, el cultivo de células lisadas al 100 % se mantuvo en condiciones sin aire en presencia de 0, 5 o 10 mM de H2O2. Después de 1 día de mantenimiento, permanecieron las moléculas de anticuerpo mAb2 intactas y las especies de bajo peso molecular estaban dominadas por cadenas ligeras y pesadas con una fracción menor de medio mero, lo que sugiere que la reducción fue casi completa en comparación con la muestra de control que se expuso al aire (Figuras 9A y 9B). La adición de 5 mM y 10 mM de H2O2 puede parcialmente (Figura 8C) y completamente (Figura 8D) inhibir la generación de bajo peso molecular, respectivamente. Estos resultados de NR_Calibrador de CB sin purificar se resumieron en la Figura 8E. Después de la purificación de la Proteína A, las muestras con H2O20, 5 y 10 mM tenían un 0, 10,1 y 98,3 % de monómero de anticuerpo puro, respectivamente, de los resultados de NR_Calibrador (Figura 8F). La muestra que se expuso al aire tenía un 83 % de monómero de anticuerpo puro. Estos resultados confirman que H2O2 10 mM puede impedir eficazmente la reducción de mAb en el peor de los casos del procesamiento del volumen clarificado.
Hay muchos compuestos que contienen peróxido, inorgánicos u orgánicos, que pueden ser sustituidos por peróxido de hidrógeno. Se ensayaron dos formas inorgánicas, percarbonato de sodio y perborato de sodio, como un sustituto del peróxido de hidrógeno. Los resultados muestran que ambos peróxidos pueden suprimir eficazmente la reducción de los enlaces disulfuro de una manera dependiente de la concentración (Figura 9).
Tratamiento con peróxido de hidrógeno y oxidación de moléculas de anticuerpos
Una de las principales preocupaciones del uso de peróxido de hidrógeno es su potencial para oxidar los mAbs. Los residuos de metionina son más susceptibles a la oxidación con peróxido de hidrógeno. (Luo Q., et al. J. Biol. Chem.
2011;286:25134-25144, Stracke J., et al. MAbs. 2014;6:1229-1242). Se analizaron los mAbs 2 y 3 (pertenecientes a las subclases IgG4 e IgG1, respectivamente) por espectrometría de masas para la oxidación de metionina después de varios tratamientos con peróxido de hidrógeno. Para ambas moléculas, después de la adición de H2O2 (1 mM a 10 mM) e incubación a temperatura ambiente durante 1 día, se observó un pequeño aumento en la oxidación que dependía de la concentración de H2O2 en el mismo lote de muestras que estaban bajo los tratamientos de peróxido de hidrógeno descritos (Tablas 8 y 9). Sin embargo, los cambios de oxidación inducidos por H2O2 fueron insignificantes para ambos mAbs 2 y 3, ya que el mapeo de péptidos trípticos y el método LC-MS/MS tienen una variación del 1 %.
Estos resultados indican que, bajo concentraciones óptimas de peróxido, la oxidación de mAb mediada por peróxido de hidrógeno u otros peróxidos no muestra un aumento significativo y puede controlarse el nivel de oxidación.
Tabla 8. Oxidación de residuos de metionina de mAb 2 después del tratamiento con peróxido de hidrógeno Condiciones de mAb 2 % de Oxidación
Efectos del tratamiento con peróxido de hidrógeno en los atributos de calidad del producto
Además de la oxidación, los efectos potenciales del peróxido de hidrógeno en otros atributos de calidad del fármaco y el proceso de purificación posterior también se evaluaron en un estudio a escala de laboratorio. El diseño experimental incluyó tanto mAb 2 (una IgG4) como mAb 4 (una IgG1). Para el mAb 4, el peróxido de hidrógeno se agregó al fluido de cultivo celular previamente a la recolección y el volumen clarificado posteriormente a la recolección (sin células). Después de varios tratamientos con peróxido de hidrógeno, el volumen clarificado resultante se procesó a través de cromatografía de Proteína A, seguido de las etapas de inactivación viral y neutralización de pH bajo usando condiciones puntuales del proceso central antes del análisis. Los resultados analíticos de mAb 4, mostrados en la Table 10, indicó que no hubo cambios notables en todos los atributos que se ensayaron entre las muestras tratadas con peróxido de hidrógeno y las no tratadas. Las impurezas del proceso (proteínas de la célula hospedadora y ADN residual) también fueron comparables con el control y aceptables dentro del intervalo del proceso (datos no mostrados). También se obtuvieron resultados similares para mAb 2 que se trató con H2O2 0, 3, 5 y 10 mM a temperatura ambiente durante 1 día (Tabla 10).
Por lo tanto, estos resultados indican que los tratamientos con peróxido de hidrógeno (hasta 10 mM) no tienen cambios notables en todos los atributos que se ensayaron en muestras tratadas con peróxido de hidrógeno antes y después de la eliminación de células.
Claims (8)
1. Un método para impedir la reducción de enlaces disulfuro de anticuerpos, que comprende añadir peróxido de hidrógeno al volumen clarificado en la recolección.
2. Un método para inhibir la unión de la vitamina B12 a anticuerpos durante la fabricación de cultivos celulares, que comprende
a) impedir la reducción de los enlaces disulfuro de anticuerpos añadiendo peróxido de hidrógeno al volumen clarificado en la recolección, y
b) inhibir la conversión de cianocobalamina (CN-Cbl) en el medio a hidroxocobalamina (HO-Cbl) evitando la exposición del medio de cultivo celular a la luz visible durante uno o más momentos seleccionados de la preparación del medio, almacenamiento del medio, producción de anticuerpos y recolección de anticuerpos.
3. El método de la reivindicación 2, en donde CN-Cbl se expone solo a luz roja (> 600 nm) durante la preparación del medio, el almacenamiento del medio y, opcionalmente, durante la producción de anticuerpos y la recolección de anticuerpos.
4. El método de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se selecciona entre anticuerpo monoclonal (mAb), anticuerpo humano (HuMAb), anticuerpo humanizado y anticuerpo quimérico.
5. Un proceso de cultivo celular para la producción de anticuerpos, que comprende:
a) cultivar células que producen el anticuerpo de interés,
b) recolectar el anticuerpo de interés del cultivo celular, y
c) añadir peróxido de hidrógeno al volumen clarificado en la recolección.
6. El proceso de cultivo celular de la reivindicación 5, en donde el proceso comprende además preparar y almacenar los medios de cultivo celular en condiciones de luz roja (>600 nm).
7. El proceso de cultivo celular de la reivindicación 5 o de la reivindicación 6, en donde el proceso comprende además cultivar células que producen el anticuerpo de interés y recolectar el anticuerpo de interés del cultivo celular en condiciones de luz roja (>600 nm).
8. El uso de peróxido de hidrógeno en la recolección para inhibir la formación del color rosa durante la fabricación de anticuerpos.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762503615P | 2017-05-09 | 2017-05-09 | |
| PCT/US2018/031542 WO2018208743A1 (en) | 2017-05-09 | 2018-05-08 | Method of controlling the formation of pink color during antibody manufacturing |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2951287T3 true ES2951287T3 (es) | 2023-10-19 |
Family
ID=62751522
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES18734651T Active ES2951287T3 (es) | 2017-05-09 | 2018-05-08 | Método para controlar la formación del color rosa durante la fabricación de anticuerpos |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230103511A1 (es) |
| EP (1) | EP3621989B1 (es) |
| JP (2) | JP7453788B2 (es) |
| KR (1) | KR102664829B1 (es) |
| CN (1) | CN110831964A (es) |
| ES (1) | ES2951287T3 (es) |
| WO (1) | WO2018208743A1 (es) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR112022012467A2 (pt) | 2020-01-31 | 2022-09-06 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Método para produção de composição contendo polipeptídeo com coloração suprimida |
| US20240092870A1 (en) * | 2022-09-15 | 2024-03-21 | Sanofi | Methods of determining protein reduction susceptability |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2689458B2 (ja) * | 1988-02-09 | 1997-12-10 | 武田薬品工業株式会社 | 粒状ないし粉末状のビタミンｂ▲下１▼▲下２▼類含有組成物 |
| JP2734709B2 (ja) * | 1990-01-05 | 1998-04-02 | 東レ株式会社 | インクジェット染色用布帛およびそれを用いてなるインクジェット染色法 |
| SE525083C2 (sv) * | 2003-04-23 | 2004-11-23 | Kemira Kemi Ab | Sätt att behandla rötslam |
| AU2005310305A1 (en) * | 2004-10-22 | 2006-06-08 | Amgen Inc. | Methods for refolding polypeptides |
| CA2671702A1 (en) * | 2005-12-05 | 2007-06-14 | Lifeline Cell Technology | Cell culture medium container assembly |
| KR20190140090A (ko) * | 2007-07-09 | 2019-12-18 | 제넨테크, 인크. | 폴리펩티드의 재조합 생산 동안의 디술피드 결합 환원의 방지 |
| KR20160088930A (ko) | 2013-12-04 | 2016-07-26 | 이뮤노젠 아이엔씨 | 항체 생산용 조성물 및 항체 생성 방법 |
-
2018
- 2018-05-08 JP JP2019561819A patent/JP7453788B2/ja active Active
- 2018-05-08 WO PCT/US2018/031542 patent/WO2018208743A1/en unknown
- 2018-05-08 EP EP18734651.5A patent/EP3621989B1/en active Active
- 2018-05-08 US US16/612,175 patent/US20230103511A1/en active Pending
- 2018-05-08 CN CN201880031241.9A patent/CN110831964A/zh active Pending
- 2018-05-08 KR KR1020197035852A patent/KR102664829B1/ko active IP Right Grant
- 2018-05-08 ES ES18734651T patent/ES2951287T3/es active Active
-
2023
- 2023-09-08 JP JP2023145991A patent/JP2023182593A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2020519265A (ja) | 2020-07-02 |
| CN110831964A (zh) | 2020-02-21 |
| KR20200004355A (ko) | 2020-01-13 |
| EP3621989B1 (en) | 2023-06-28 |
| KR102664829B1 (ko) | 2024-05-09 |
| JP2023182593A (ja) | 2023-12-26 |
| WO2018208743A9 (en) | 2019-12-05 |
| WO2018208743A1 (en) | 2018-11-15 |
| US20230103511A1 (en) | 2023-04-06 |
| EP3621989A1 (en) | 2020-03-18 |
| JP7453788B2 (ja) | 2024-03-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Schildknecht et al. | Oxidative and nitrative alpha‐synuclein modifications and proteostatic stress: implications for disease mechanisms and interventions in synucleinopathies | |
| ES2951287T3 (es) | Método para controlar la formación del color rosa durante la fabricación de anticuerpos | |
| Roberts et al. | Oral treatment with CuII (atsm) increases mutant SOD1 in vivo but protects motor neurons and improves the phenotype of a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis | |
| Swainsbury et al. | Engineering of B800 bacteriochlorophyll binding site specificity in the Rhodobacter sphaeroides LH2 antenna | |
| ES2388219T3 (es) | Purificación mejorada de colagenasas a partir de un cultivo líquido de Clostridium histolyticum | |
| Roy et al. | A spectroscopic study of the interaction of the antioxidant naringin with bovine serum albumin | |
| Schwab et al. | Sequence proximity between Cu (II) and Cu (I) binding sites of human copper transporter 1 model peptides defines reactivity with ascorbate and O2 | |
| Wagner et al. | Determination of size variants by CE-SDS for approved therapeutic antibodies: Key implications of subclasses and light chain specificities | |
| Strittmatter et al. | Radical formation on a conserved tyrosine residue is crucial for DyP activity | |
| Heathcote et al. | Type I photosynthetic reaction centres: structure and function | |
| Kusumoto et al. | Preparation of a photoactive reaction center complex containing photo-reducible Fe-S centers and photooxidizable cytochrome c from the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum | |
| Zia et al. | Deciphering the binding of dutasteride with human alpha-2-macroglobulin: Molecular docking and calorimetric approach | |
| Du et al. | Mechanisms of color formation in drug substance and mitigation strategies for the manufacture and storage of therapeutic proteins produced using mammalian cell culture | |
| Halabi et al. | Light-deactivated fluorescent probes (FLASH-Off) for multiplexed imaging | |
| Pourgonabadi et al. | Investigating the antagonistic action between aspirin and tamoxifen with HSA: identification of binding sites in binary and ternary drug-protein systems by spectroscopic and molecular modeling approaches | |
| Mogensen et al. | Photoinduced bleaching in an efficient singlet oxygen photosensitizing protein: Identifying a culprit in the flavin-binding LOV-based protein SOPP3 | |
| Zhang et al. | Constructing a far-red to near-infrared fluorescent probe for highly specific detection of cysteine and its bioimaging applications in living cells and zebrafish | |
| Na et al. | Latent fluorescence probe for in vivo imaging of glutathione | |
| JP2021046419A (ja) | 薬剤の少なくとも１つのトリスルフィド結合を含むタンパク質中のチオール部分へのコンジュゲーション方法 | |
| Grotjohann et al. | In VitroPhotoinactivation of Catalase Isoforms from Cotyledons of Sunflower (Helianthus annuusL.) | |
| Muslinkina et al. | Structural factors enabling successful GFP-like proteins with alanine as the third chromophore-forming residue | |
| ES2690745T3 (es) | Evaluación de la viabilidad de embriones cultivados in vitro a partir del medio de cultivo | |
| Rak et al. | Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of monoprenylated Rab7 GTPase in complex with Rab escort protein 1 | |
| Fairclough et al. | Site-directed mutagenesis of PsaA: M684 in Chlamydomonas reinhardtii | |
| Woznicka-Misaila et al. | Cell-free production, purification and characterization of human mitochondrial ADP/ATP carriers |