ES2940790T3 - Inhibidores de ADAMTS4 o ADAMTS5 para su uso en la prevención o el tratamiento de la remodelación cardíaca y la insuficiencia cardíaca crónica - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un inhibidor de una proteoglicanasa ADAMTS para usar en el tratamiento o la prevención de la remodelación cardíaca o para el uso en el tratamiento o la prevención de la insuficiencia cardíaca en un sujeto. En particular, la presente invención proporciona un inhibidor de ADAMTS4 o ADAMTS5 para usar en el tratamiento o la prevención de la remodelación cardíaca o insuficiencia cardíaca crónica en un sujeto con remodelación cardíaca o insuficiencia cardíaca crónica, o con una afección que puede conducir a remodelación cardíaca y/o insuficiencia cardíaca crónica. También se proporciona un método para tratar o prevenir la remodelación cardíaca o tratar o prevenir la insuficiencia cardíaca, método que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de una proteoglicanasa ADAMTS. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de ADAMTS4 o ADAMTS5 para su uso en la prevención o el tratamiento de la remodelación cardíaca y la insuficiencia cardíaca crónica

La presente invención se refiere en general a enfermedades cardíacas. Más particularmente, la invención se refiere al tratamiento o prevención de la remodelación cardíaca o al tratamiento o prevención de la insuficiencia cardíaca crónica. La invención implica la inhibición de determinadas proteasas/enzimas. La insuficiencia cardíaca crónica afecta a una gran cantidad de personas en todo el mundo, contando entre 5-6 millones de pacientes en los Estados Unidos. La insuficiencia cardíaca crónica afecta principalmente a los ancianos, ilustrada por una incidencia cercana a 10 de 1000 en la población mayor de 65 años. A pesar de las estrategias de tratamiento actuales, el pronóstico sigue siendo precario, con una mortalidad a cinco años de ~ 50 % en pacientes con diagnóstico de insuficiencia cardíaca crónica. De este modo, las estrategias de tratamiento novedosas y eficaces están altamente justificadas.

La insuficiencia cardíaca es un síndrome clínico definido por síntomas y signos típicos que resultan de cualquier anomalía estructural o funcional del corazón; donde las anomalías pueden afectar la capacidad de llenar o expulsar sangre, y/o provocar que no se suministre suficiente oxígeno para cumplir con los requisitos de los tejidos metabolizadores, a pesar de las presiones de llenado normales, o solo a expensas de presiones de llenado aumentadas (Guías de la ESC para el diagnóstico y el tratamiento de la insuficiencia cardíaca aguda y crónica. McMurray JJ et al. European Heart Journal 2012, 14(8):803-69; 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure, Yanzy CW et al. Circulation 2013, 128, e240-e327). La remodelación cardíaca generalmente precede a los signos clínicos de insuficiencia cardíaca y se define como "the molecular, cellular and interstitial changes, manifested clinically as changes in size, shape and function of the heart resulting from cardiac load or injury" (Cohn JN et al. JACC 2000. 35(3):569-82). La asociación entre de remodelación cardíaca y desarrollo posterior de insuficiencia cardíaca manifiesta se enfatiza en las directrices de la American Heart Association, que definen cuatro etapas de insuficiencia cardíaca (2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Corazón Failure, Yanzy CW et al. Circulation 2013. 128. e240-e327, supra; Hunt SA et al. 2009. 119(14):e391-479). Las dos primeras etapas (A y B) incluyen a pacientes asintomáticos con factores de riesgo que predisponen al desarrollo de insuficiencia cardíaca. Los pacientes con signos de remodelación cardíaca, tal como hipertrofia y/o deterioro de la función cardíaca, se designan para el estadio B, mientras que los pacientes sin signos de remodelado se definen en el estadio A. Los dos últimos estadios (C y D) incluyen pacientes sintomáticos, donde el estadio C incluye a pacientes con síntomas actuales o pasados de insuficiencia cardíaca asociados con una enfermedad cardíaca estructural subyacente, y el estadio D incluye pacientes con insuficiencia cardíaca refractaria que requieren estrategias de tratamiento avanzadas.

La remodelación cardíaca y la insuficiencia cardíaca crónica son el resultado de trastornos que provocan un aumento persistente de la carga de trabajo cardíaca, por ejemplo, pérdida de miocardio viable después de un infarto de miocardio o sobrecarga de presión por estenosis aórtica. Las causas comunes de insuficiencia cardíaca crónica y remodelación cardíaca incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de las arterias coronarias, hipertensión, cardiomiopatías, enfermedades de las válvulas, trastornos pulmonares y defectos cardíacos congénitos. Tratamiento médico que inhibe las respuestas desadaptativas a la carga/sobrecarga cardíaca (por ejemplo, tratamiento introducido antes del desarrollo de remodelación cardíaca e insuficiencia cardíaca crónica (en los estadios A y B de insuficiencia cardíaca AHA, respectivamente), o tratamiento introducido durante el desarrollo o progresión de remodelación cardíaca e insuficiencia cardíaca crónica (en los estadios C y D de insuficiencia cardíaca de la AHA)) puede prevenir el desarrollo o la progresión de la remodelación cardíaca y/o la insuficiencia cardíaca, o al menos reducir la morbilidad y mortalidad de la insuficiencia cardíaca crónica. La terapia actual del estado de la técnica para la insuficiencia cardíaca crónica incluye inhibidores de la activación neurohormonal desadaptativa, tales como inhibidores del sistema p-adrenérgico y renina-angiotensina-aldosterona (RAA). Sin embargo, estas terapias médicas inhiben insuficientemente la remodelación cardíaca y el desarrollo de insuficiencia cardíaca crónica.

Lo que se necesita en la técnica son terapias alternativas o complementarias, preferiblemente con efectos mejorados o efectos complementarios a la terapia convencional actual, que inhiban el desarrollo de remodelación cardíaca y/o la insuficiencia cardíaca crónica (por ejemplo, en pacientes en riesgo), particularmente aquellos que no actúan sobre el sistema neurohormonal.

La presente invención aborda esta necesidad y se basa en una evaluación de los proteoglicanos versican y agrecán y sus enzimas ADAMTS degradantes (proteoglicanasas ADAMTS) durante la remodelación cardíaca y el desarrollo de insuficiencia cardíaca crónica, y el sorprendente hallazgo de que la inhibición de una enzima versicanasa ADAMTS/agrecanasa (una enzima que puede escindir los proteoglicanos versican y agrecán) conduce a una función cardíaca mejorada en modelos animales apropiados (modelo de rata con banda aórtica y modelo de rata con insuficiencia cardíaca postinfarto).

Las proteoglicanasas ADAMTS se han estudiado previamente en la aterosclerosis y la fase aguda del infarto de miocardio (Zha et al. Biomed Pharmacother 2010, 64(3): 160-164). El pentosano polisulfato (PPS) se ha probado en un modelo de isquemia/reperfusión aguda, demostrando la capacidad de reducir el tamaño del infarto cuando se administra durante la reperfusión (Tanhehco et al. J Cardiovasc Pharm 1999, 34(1), 153-161). El tratamiento cardioprotector administrado durante o inmediatamente después de la revascularización (por ejemplo, Tanhehco et al. supra) tiene como objetivo contrarrestar la lesión por isquemia/reperfusión y reducir el tamaño del infarto, donde los enfoques probados incluyen postacondicionamiento, acondicionamiento remoto, ciclosporina y agentes antiplaquetarios (revisado en Kloner et al. Circulation Research 2013, 113, 451-463). Sin embargo, las proteoglicanasas ADAMTS no se han estudiado previamente en el contexto de insuficiencia cardíaca crónica y remodelación cardíaca. El potencial de reducir la remodelación cardíaca y el desarrollo de disfunción cardíaca en el contexto de estrés cardíaco persistente coloca la inhibición de ADAMTS y el PPS entre las terapias que tienen como objetivo reducir las respuestas desadaptativas a la sobrecarga o lesión, sin afectar la sobrecarga o lesión per se. La cardioprotección durante la reperfusión se considera fundamentalmente diferente de la terapia antirremodelante administrada en la fase crónica después del infarto de miocardio, en términos de mecanismos subyacentes, dianas terapéuticas, tiempo de administración e indicaciones.

El documento WO98/25597 informa que los inhibidores de metaloproteinasas de matriz son útiles para prevenir o tratar la insuficiencia cardíaca y la dilatación ventricular en mamíferos.

El documento US2007/0155737 A1 se refiere a inhibidores de metaloproteasas heterobicíclicos.

El documento WO2011/088418 A2 informa sobre composiciones de pentosano polisulfato (PPS) oral para el tratamiento de enfermedades tales como diabetes, inflamación y aterosclerosis.

El documento US2006/0004066 A1 se refiere a un método de tratamiento de enfermedades asociadas a ADAMTS-5, en particular osteoartritis.

Las realizaciones de la presente invención se describen en las reivindicaciones.

En un aspecto, la presente invención proporciona un inhibidor de ADAMTS4 para su uso en el tratamiento o prevención de la remodelación ventricular derecha o la insuficiencia cardíaca crónica en un sujeto con remodelación ventricular derecha o con insuficiencia cardíaca crónica, en el que dicho inhibidor de ADAMTS4 no es marimastat. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de ADAMTS4 para su uso en el tratamiento o prevención de la remodelación ventricular derecha o la insuficiencia cardíaca crónica en un sujeto con remodelación ventricular derecha o con insuficiencia cardíaca crónica en el que dicho inhibidor de ADAMTS4 no es marimastat.

La invención también proporciona un kit que comprende uno o más inhibidores de ADAMTS4 o una formulación que comprende dicho inhibidor para su uso en el tratamiento o prevención de la remodelación ventricular izquierda o insuficiencia cardiaca crónica en un sujeto con remodelación ventricular izquierda o con insuficiencia cardiaca crónica en el que dicho inhibidor de ADAMTS4 no es marimastat.

Una proteoglicanasa es una enzima que puede escindir proteoglicanos (por ejemplo, versican, agrecán o sindecan). La proteoglicanasa ADAMTS que se va a inhibir de acuerdo con la presente invención es ADAMTS4

Versican y agrecán son grandes proteoglicanos hidrofílicos ubicados en la matriz extracelular, que modifican la estructura, el volumen y la hidratación de un tejido (Kenagy et al. J. Histochem. Cytochem. 2005, 53:131-140). El versican y agrecán que son los sustratos de las enzimas versicanasa y agrecanasa (es decir, el versican y agrecán que son escindidos enzimáticamente por la versicanasa y agrecanasa, respectivamente) se encuentran preferiblemente en la matriz extracelular (ECM) del corazón, más preferiblemente en la ECM del miocardio. Versican puede existir en varias isoformas (isoformas V0, V1, V2 y V3) (revisado en Wight, Current Opinion in Cell Biology 2002. 14 (5):617-23). Preferiblemente, el versican que es el tema de la versicanasa es la ¡soforma V0. Otros proteoglicanos que son sustratos de las proteoglicanasas ADAMTS también se localizan preferiblemente en la matriz extracelular (ECM) del corazón, más preferiblemente en la ECM del miocardio. Otros proteoglicanos que son sustratos de las proteoglicanasas ADAMTS son preferiblemente proteoglicanos expresados en la superficie celular de las células localizadas en el miocardio.

Versican y agrecán se escinden mediante enzimas ADAMTS (una desintegrina y metaloproteasa con motivos de trombospondina); una familia de metaloproteasas que cuenta con 19 miembros. ADAMTS1, -4, -5, -8, -9, -15, -16, -18 y -20 tienen actividad conocida de versicanasa y/o agrecanasa, mientras que los sustratos de otras enzimas ADAMTS, incluyendo ADAMTS6, -10, - 12, -17 y -19, aún no se han determinado (Shiomi et al. Pathology International 2010. 60(7):477-96).

La enzima ADAMTS (proteoglicanasa ADAMTS) a inhibir de acuerdo con la presente invención es ADAMTS4. Se sabe que ADAMTS1, -4, -5 y -20 y ADAMTS4 tienen actividad versicanasa. Se sabe que ADAMTS1, -4, -5, -8, -9, -15, -16, -18 y -20 tienen actividad agrecanasa (Shiomi et al. supra).

En algunas realizaciones, preferiblemente el inhibidor inhibe tanto ADAMTS4 como ADAMTS5.

Cualquier inhibidor de ADAMTS4 se puede usar de acuerdo con la presente invención, con la excepción de que, de acuerdo con la presente invención, el inhibidor de ADAMTS4 no es marimastat. Las moléculas inhibidoras pueden actuar al nivel de ácido nucleico, por ejemplo, pueden reducir la expresión de un gen de ADAMTS4, por lo que, por ejemplo, dan como resultado niveles reducidos de ARNm de ADAMTS4. Preferiblemente, la reducción es una reducción significativa, más preferiblemente una reducción estadísticamente significativa, preferiblemente con un valor de probabilidad de < 0,05. En algunas realizaciones, las moléculas inhibidoras logran una reducción de al menos l0 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos el 90 % o el 100 % de los niveles de ARNm de ADAMTS4. En algunas realizaciones, se logra una reducción aproximada del 80 % en los niveles de ARNm de ADAMTS4.

Las moléculas inhibidoras pueden actuar como alternativa, o, además, al nivel de la proteína e inhibir la actividad funcional de la enzima ADAMTS4. La inhibición de ADAMTS4 a nivel proteico puede ser, por ejemplo, reduciendo el nivel (y/o alterando modificaciones postraduccionales) de la proteína ADAMTS4 reduciendo así la actividad funcional, y/o inhibiendo directamente (reduciendo) la actividad funcional de la enzima ADAMTS4, por ejemplo, uniéndose a la enzima ADAMTS4 como un inhibidor del sitio activo o como un inhibidor de exorreceptor de manera que se reduce la actividad de la versicanasa o agrecanasa. Preferiblemente, la reducción en el nivel o actividad funcional de la ADAMTS4 es una reducción significativa, más preferiblemente una reducción estadísticamente significativa, preferiblemente con un valor de probabilidad de <0,05. En algunas realizaciones, las moléculas inhibidoras logran una reducción de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos el 90 %, o el 100 % en el nivel de actividad funcional de la ADAMTS4.

En algunas realizaciones, una reducción en la actividad funcional de una ADAMTS4 se caracteriza por un aumento en la cantidad (es decir, niveles) de versican de longitud completa y/o una disminución en la cantidad (es decir, niveles) de productos de escisión de versican (por ejemplo, una disminución en la cantidad de productos de escisión de versican que presentan el neoepítopo DPEEAE, tal como el fragmento de verisican p150 DpEEAE o el fragmento de versican p70 (70 kDa) DPEEAE). En algunas realizaciones, una reducción en la actividad funcional de una ADAMTS4 se caracteriza por un aumento en la cantidad (es decir, niveles) de agrecán de longitud completa y/o una disminución en la cantidad (es decir, niveles) de productos de escisión de agrecán (por ejemplo, una disminución en la cantidad de productos de escisión de agrecán que presentan el neoepítopo ARG). En todas estas realizaciones, preferiblemente el aumento y/o la disminución es significativo, más preferiblemente estadísticamente significativo, preferiblemente con un valor de probabilidad < 0,05. En algunas realizaciones, la reducción en la cantidad de productos de escisión de agrecán o versican (por ejemplo, el fragmento de verisican p150 DPEEAE) es de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o 100 %. En algunas realizaciones, se logra una reducción de aproximadamente el 50 % de los productos de escisión de agrecán o versican (por ejemplo, el fragmento de verisican p150 DPEEAE).

Las referencias a "reducir", "que reduce", "reducción", "disminuir" o "aumentar" en las discusiones anteriores de expresión y actividad funcional significan en comparación con la ausencia del inhibidor.

Se pueden describir en la técnica inhibidores de versicanasa ADAMTS o inhibidores de agrecanasa ADAMTS apropiados. Alternativamente, los inhibidores apropiados pueden ser detectados e identificados fácilmente por un experto en la técnica usando ensayos que son rutinarios en la técnica. A modo de ejemplo, dicho método para identificar un inhibidor de versicanasa o agrecanasa puede comprender: (1) poner en contacto una preparación con un agente de prueba (es decir, un inhibidor de versicanasa o agrecanasa candidato), en el que la preparación comprende (i) una enzima versicanasa ADAMTS o una agrecanasa ADAMTS, o al menos un fragmento biológicamente activo de la misma y opcionalmente un sustrato versican o agrecán; o (ii) un polinucleótido que comprende al menos una parte de una secuencia genética que regula la expresión de una enzima versicanasa ADAMTS o de una ADAMS agrecanasa (por ejemplo, un promotor y/o un potenciador de un gen versicanasa ADAMTS o de un gen agrecanasa ADAMTS), que está operativamente ligado a un gen indicador; y (2) detectar un cambio en el nivel y/o la actividad funcional de la enzima versicanasa ADAMTS o agrecanasa ADAMTS, o el nivel de expresión del gen indicador. Dicho nivel y/o actividad funcional se puede comparar con un nivel normal o de referencia y/o actividad funcional en ausencia del agente de prueba. Una reducción en el nivel y/o la actividad de versicanasa ADAMTS o agrecanasa ADAMTS (según la evaluación, por ejemplo, analizando una reducción en la cantidad de productos de escisión de versican, por ejemplo, una reducción en la cantidad de productos de escisión de versican que presentan el neoepítopo DPEEAE tal como el fragmento DPEEAE p150 versican, o analizar una reducción en la cantidad de fragmentos de escisión de agrecán, por ejemplo, una reducción en la cantidad de productos de escisión de agrecán que muestran el neoepítopo ARG), o una reducción en el nivel de expresión del gen indicador indicaría que, según sea apropiado, el agente de prueba es un inhibidor de versicanasa ADAMTS o de agrecanasa ADAMTS.

Los niveles de ARNm de una versicanasa ADAMTS o una agrecanasa ADAMTS en una célula o tejido (por ejemplo, una célula cardíaca o tejido de miocardio) después de ponerse en contacto con un agente de prueba también se pueden controlar usando técnicas estándar en la técnica (por ejemplo, qRT-PCR). Una disminución en un nivel de ARNm de versicanasa ADAMTS indicaría que el agente de prueba es un inhibidor de versicanasa ADAMTS. La sección de ejemplos experimentales de la presente solicitud ejemplifica dicho enfoque. Una disminución en un nivel de ARNm de agrecanasa ADAMTS indicaría que el agente de prueba es un inhibidor de agrecanasa ADAMTS. Un ejemplo de un método para evaluar la actividad funcional de una enzima versicanasa ADAMTS (la enzima versicanasa ADAMTS4) después del contacto con un agente de prueba se proporciona en la sección de ejemplos experimentales de la presente solicitud.

Los expertos en la técnica también conocen otros ensayos apropiados para identificar inhibidores de versicanasa y también se pueden usar para identificar inhibidores apropiados para su uso de acuerdo con la presente invención. Los ensayos apropiados se describen en Deng et al. (J. Med. Chem. 2012, 55(16):7061-7079), De Savi et al. (Bioorg. & Med. Chem. Let, 2011, 21: (5):1376-1381) and Lauer-Fields et al. (Anal. Biochem. 2008. 373(1):43-51.) Los ensayos de cribado descritos en este documento se pueden realizar en formatos convencionales o de alto rendimiento.

Las fuentes de agentes potenciales que se van a cribar incluyen fuentes naturales, tales como extractos celulares, y fuentes sintéticas tales como bibliotecas de compuestos químicos o bibliotecas biológicas tales como bibliotecas de anticuerpos o péptidos.

En algunas realizaciones la presente invención, el inhibidor de ADAMTS4 o agrecanasa ADAMTS es pentosano polisulfato (PPS) (por ejemplo, pentosano polisulfato de sodio). Preferiblemente, el pentosano polisulfato es un inhibidor de una versicanasa ADAMTS (es decir, preferiblemente el pentosano polisulfato inhibe la actividad de la versicanasa). El pentosano polisulfato es un producto disponible comercialmente, por ejemplo, de Interfarm AS (Noruega). El pentosano polisulfato es descrito por Troeberg et al. (FASEB J. 2008 Oct;22(10):3515-24). El pentosano polisulfato ya se usa para tratar la cistitis intersticial en humanos (Elmiron®) y la artritis en animales (Cartrophen Vet®). También pueden utilizarse análogos funcionales de pentosano polisulfato de acuerdo con la invención.

En otras realizaciones, los siguientes compuestos, que también se definen en la tabla 1 de De Savi, et al. ((2011). Bioorg Med Chem Lett. 21:1376-1381) se pueden usar como inhibidores de acuerdo con la presente invención. La síntesis de estos compuestos también se describe en De Savi, et al. ((2011). Bioorg Med Chem Lett. 21:1376-1381).

Comp. R ADAM-TS4 IC^{50 a} (nM)

1 H 1,4

2 H 1

3 Me 7,3

4 Me 3.5

En otras realizaciones, los siguientes compuestos, que también se definen en la tabla 2 de De Savi, et al. ((2011). Bioorg Med Chem Lett. 21:1376-1381) se pueden usar como inhibidores de acuerdo con la presente invención. La síntesis de estos compuestos también se describe en De Savi, et al. ((2011). Bioorg Med Chem Lett. 21:1376-1381).

Comp. A B ADAM-TS4 IC50 (nM)

4 O C 3.5

5 C N 3.8

6 C C 1,1

En otras realizaciones, los siguientes compuestos, que también se definen en la tabla 3 de De Savi, et al. ((2011). Bioorg Med Chem Lett. 21:1376-1381) se pueden usar como inhibidores de acuerdo con la presente invención. La síntesis de estos compuestos también se describe en De Savi, et al. ((2011). Bioorg Med Chem Lett. 21:1376-1381).

^{Comp. R} ADAM-TS4 IC50a (nM) 8a 2-Cloro-4-(trifluorometil)fenilo 0,48

8b 4-Cloro-2-metil-fenilo 0,36

8c 2-Bromo-4-fluoro-fenilo 0,48

8d 2-Cloro-5-fluoro-fenilo 2,8

8e 4-Fluoro-2-(trifluorometil)fenilo 0,52

8f 3,5-Dimetilisoxazol-4-ilo 0,69

8g 4-Fluoro-2-metil-fenilo 0,18

8h 2-Metil-4-(trifluorometil)fenilo 0,49

8i 2-Ciclopropil-4-(trifluorometil)fenilo 0,94

8j 2,5-Dimetilfenilo 0,48

8k 2,5-Dimetil-4-piridilo 0,43

81 2,5-Dimetil-3-piridilo 1,9

8m 3,5-Dimetilisotiazol-4-ilo 0,26

8n 4,6-Dimetil-3-piridilo 0,68

8o 3-Cloro-5-(trifluorometil)-2-piridilo 4,2

8p 3-Metil-5-(trifluorometil)-2-piridilo 2,1

8q 2-Cloro-4-metilsulfonil-fenilo 0,57

8r 2,5-Dimetilpirazol-3-ilo 5,4

En otras realizaciones, los siguientes compuestos, que también se definen en la figura 1 y la tabla 1 de De Savi, et al. ((2011). Bioorg Med Chem Lett. 21:3301-3306) se pueden usar como inhibidores de acuerdo con la presente invención. De estos compuestos, se prefieren los compuestos 13a, 13b, 13c, 13d, 13f, 13g, 13i, 13j, 131, 13m y 13n. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la invención se puede usar el compuesto 13n y en algunas realizaciones se prefiere el compuesto 13n. La síntesis de estos compuestos también se describe en De Savi, et al. ((2011). Bioorg Med Chem Lett. 21:3301-3306).

Comp. R ADAM-TS4 IC50, nM

13a 4-Cloro-2-metil-fenilo 2,7

13b 2-Cidopropil-4-metilsulfonil-fenilo 1,4

13c 2-Metil-4-metilsulfonil-fenilo 5,8

13d 4-Metil-3-piridilo 110

13e Fenilo 470

13f 2-Metilfenilo 5,6

13g 3-Metil-2-piridilo 100

(continuación)

Comp. R ADAM-TS4 IC50, nM

13h 2-Metil-3-piridilo 400

13i 4,6-Dimetil-3-piridilo 130

13j 3,5-Dimetilisotiazol-4-ilo 13

13k 2,5-Dimetil-3-piridilo 380

13i 2,5-Dimetil-4-piridilo 18

13m 4-Fluoro-2-metil-fenilo 4,5

13n 3,S-Dimetilisoxazol-4-ilo 26

En otras realizaciones, los siguientes compuestos, que también se definen en la tabla 2 de De Savi, et al. ((2011). Bioorg Med Chem Lett. 21:3301-3306) se pueden usar como inhibidores de acuerdo con la presente invención. La síntesis de estos compuestos también se describe en De Savi, et al. ((2011). Bioorg Med Chem Lett. 21:3301-3306).

_{Comp. R} ^{A D A M -T S 4 ICso.J}

nM

14g 16

^{14h 24}

141 9.7

^14j

¹⁹

^14k O ⁵²

¹⁴¹ 6 ²⁰

En otras realizaciones, los siguientes compuestos, que también se definen en la tabla 3 de De Savi, et al. ((2011). Bioorg Med Chem Lett. 21:3301-3306) se pueden usar como inhibidores de acuerdo con la presente invención. La síntesis de estos compuestos también se describe en De Savi, et al. ((2011). Bioorg Med Chem Lett. 21:3301-3306).

_______________________________________

15a 4-Fluoro-2-metilfenilo 1,9

15b 2-Metilfenilo 4,1

(continuación)

Comp. R ADAM-TS4 IC50,

nM

15c 4-Cloro-2-metilfenilo 1,2

15d 4-Fluoro-2-(trifluorometil)fenilo 8,7

15e 2-Metil-4-(trifluorometil) 1,2

En otras realizaciones, los siguientes compuestos, que también se definen en la tabla 1 (compuestos 7b-7d), tabla 2 (compuestos 8a-8e), tabla 3 (compuestos 9a-9d), tabla 5 (compuestos 11a-11e), tabla 6 (compuestos 12a-12c y 12g-12i) y tabla 7 (compuestos 13a-13e) de Shiozaki, et al. ((2011). J Med Chem. 54:2839-2863) se pueden usar como inhibidores de acuerdo con la presente invención. Se prefiere particularmente el compuesto 13b. La síntesis de estos compuestos también se describe en Shiozaki, et al. ((2011). J Med Chem. 54:2839-2863).

en la ue R es uno de los si uientes:

En algunas realizaciones, el grupo R preferido es:

En otras realizaciones, los siguientes compuestos, que también se definen en la tabla 4 (compuestos 10c-10f) de Shiozaki, et al. ((2011). J Med Chem. 54:2839-2863) se pueden usar como inhibidores de acuerdo con la presente invención. La síntesis de estos compuestos también se describe en Shiozaki, et al. ((2011). J Med Chem. 54:2839-2863).

en la que R es uno de los siguientes:

En otras realizaciones, el siguiente compuesto, que también se define en la tabla 3 (compuesto 22) de Shiozaki, et al. ((2009). Bioorg Med Chem Lett. 19:6213-6217) se puede usar como inhibidor de acuerdo con la presente invención. La síntesis de este compuesto también se describe en Shiozaki, et al. ((2009). Bioorg Med Chem Lett.

19:6213-6217).

En otras realizaciones, los siguientes compuestos, que también se definen en la tabla 1 de Shiozaki, et al. ((2009). Bioorg Med Chem Lett. 19:6213-6217) se pueden usar como inhibidores de acuerdo con la presente invención. De estos compuestos, se prefieren los compuestos 1, 3 y 4. La síntesis de estos compuestos también se describe en Shiozaki, et al. ((2009). Bioorg Med Chem Lett. 19:6213-6217).

Comp. Configuración

R % de inhibición a 0,3 ^p M Agg-2 IC⁵⁰ (|ⁱ M)

En otras realizaciones, los siguientes compuestos, que también se definen en la tabla 2 de Shiozaki, et al. ((2009). Bioorg Med Chem Lett. 19:6213-6217) se pueden usar como inhibidores de acuerdo con la presente invención. De estos compuestos, se prefieren los compuestos 5, 6, 8 y 9. La síntesis de estos compuestos también se describe en Shiozaki, et al. ((2009). Bioorg Med Chem Lett. 19:6213-6217).

En otras realizaciones, los siguientes compuestos, que también se definen en la tabla 3 de Shiozaki, et al. ((2009). Bioorg Med Chem Lett. 19:6213-6217) se pueden usar como inhibidores de acuerdo con la presente invención. De estos compuestos, se prefieren los compuestos 18, 19, 20, 21 y 22. Se prefiere particularmente el compuesto 22. La síntesis de estos compuestos también se describe en Shiozaki, et al. ((2009). Bioorg Med Chem Lett. 19:6213-6217).

no motilado 2-metilado cis-3-metilado trans-3-metilado

Comp. R Metilación ADAMTS-5 IC50 (pM) ciclo ro ano ____________

4

aCompuesto racémico

En otras realizaciones, los siguientes compuestos, que también se definen en la tabla 1 de of Yao et al. ((2001). J Med Chem 44:3347-3350) se pueden usar como inhibidores de acuerdo con la presente invención. De estos compuestos, se prefieren los compuestos 7, 8 y 11. La síntesis de estos compuestos también se describe en Yao et al. ((2001). J Med Chem 44:3347-3350).

^{Comp. R} IC50 (nM)a agrecanasa

1 368

2 332

3 4-OH-Bn 182

4 1-butilo 1700

5 13333

6 1309

7 4-OMe-Bn 16,4

8 3-OH-Bn 64

9 3-OMe-Bn 3139

10 1,3-benzodioxol-5-ilmetilo 790

11 12

En otras realizaciones, los siguientes compuestos, que también se definen en la tabla 1 de Yao, et al. ((2002). Bioorg Med Chem Lett. 12:101-104) se pueden usar como inhibidores de acuerdo con la presente invención. La síntesis de estos compuestos también se describe en Yao, et al. ((2002). Bioorg Med Chem Lett. 12:101-104).

C°mp. R IC50 (nM)a,b Agrecanasa

1 64

2a H 9,8

2b 2-Me 11,6

2c 2-Cl 32

2d 2-MeO 3,4

2e 239

2f 2-'BuNHSO2 75

(continuación)

^{Comp. R} IC50 (nM)a,b Agrecanasa

2g 2-HOCH2 144

2h 3-Me 11,5

2i 3-/-Pr 216

2j 1,5

2k 3-MeO 3,7

21 3-F 2,0

2m 3-NO2 5,5

2n 3-MeSO2NH 1,5

En otras realizaciones, los siguientes compuestos, que también se definen en la figura 2 de Deng, et al. ((2012). J.Med.Chem, 55(16):7061-79) se pueden usar como inhibidores de acuerdo con la presente invención. La síntesis de estos compuestos también se describe en Deng, et al. ((2012). J.Med.Chem, 55(16):7061-79).

En otras realizaciones, los siguientes compuestos, que también se definen en la tabla 1 de Deng, et al. ((2012). J.Med.Chem, 55(16):7061-79) se pueden usar como inhibidores de acuerdo con la presente invención. De estos compuestos, se prefieren los compuestos 7, 12a, 12b, 12c, 13a, 13c, 13e, 13g, 13h y 13i. La síntesis de estos compuestos también se describe en Deng, et al. ((2012). J.Med.Chem, 55(16):7061-79).

En otras realizaciones, los siguientes compuestos, que también se definen en la tabla 2 de Deng, et al. ((2012). J.Med.Chem, 55(16):7061-79) se pueden usar como inhibidores de acuerdo con la presente invención. De estos compuestos, se prefieren los compuestos 14a, 14d, 15d y 15f. La síntesis de estos compuestos también se describe en Deng, et al. ((2012). J.Med.Chem, 55(16):7061-79).

En otras realizaciones, los siguientes compuestos, que también se definen en la tabla 4 de Deng, et al. ((2012). J.Med.Chem, 55(16):7061-79) se pueden usar como inhibidores de acuerdo con la presente invención. De estos compuestos, se prefieren los compuestos 14a, 19c y 19d. La síntesis de estos compuestos también se describe en Deng, et al. ((2012). J.Med.Chem, 55(16):7061-79).

En algunas realizaciones, de los compuestos de Deng, et al. ((2012). J.Med.Chem, 55(16):7061-79) establecido anteriormente, los compuestos 7, 8, 9, 13e, 13g y 15f son compuestos preferidos para su uso como inhibidores de acuerdo con la presente invención. En algunas realizaciones, se prefiere particularmente el compuesto 13e.

En algunas realizaciones de la presente invención, el compuesto AGG-523 (Chockalingam et al. Osteoarthritis Cartilage 2011. 19(3):315-23) se puede usar como inhibidor de acuerdo con la presente invención. AGG-523 es un compuesto de Pfizer. AGG-523 es un inhibidor selectivo de unión de zinc, no hidroxamato, reversible de ADAMTS4 y ADAMTS5 que fue desarrollado por diseño basado en estructura (Publicación de la Patente de los Estados Unidos No. 2007/0043066).

De acuerdo con la presente invención, los compuestos definidos anteriormente se pueden usar como inhibidores de proteoglicanasas ADAMTS (es decir, los compuestos inhiben la actividad de escisión de proteoglicanos).

En algunas realizaciones, los compuestos definidos anteriormente son inhibidores de versicanasa ADAMTS (es decir, los compuestos inhiben la actividad de la versicanasa).

En algunas realizaciones, los compuestos definidos anteriormente son inhibidores de agrecanasas ADAMTS (es decir, los compuestos inhiben la actividad de la agrecanasa).

En algunas realizaciones, el inhibidor de versicanasa y/o agrecanasa usado de acuerdo con la presente invención se selecciona del grupo que consiste en pentosano polisulfato (por ejemplo, pentosano polisulfato de sodio), los compuestos definidos por las fórmulas estructurales anteriores y AGG-523.

En realizaciones preferidas de la presente invención, el inhibidor de una enzima versicanasa ADAMTS como se definió anteriormente es pentosano polisulfato (PPS). De acuerdo con la presente invención, la versicanasa ADAMTS es ADAMTS4.

También se pueden emplear análogos funcionales de los inhibidores anteriores.

Otros inhibidores de versicanasa ADAMTS o inhibidores de agrecanasa ADAMTS que se pueden usar de acuerdo con la presente invención incluyen moléculas de ADN o ARN antisentido, moléculas de íaRn , ribozimas, moléculas de ARNhc, moléculas de ARNip, moléculas de miARN y similares que se dirigen contra un gen (o una transcripción de un gen) que codifica ADAMTS4. El gen de ADAMTS4 (o transcrito) es una enzima versicanasa/agrecanasa para la inhibición por tales moléculas inhibidoras basadas en ácidos nucleicos. Una vez que se ha seleccionado una diana de versicanasa o agrecanasa para la inhibición (por ejemplo, ADAMTS4), es rutinario en la técnica diseñar y sintetizar tales moléculas inhibidoras en base al ácido nucleico, en base a la secuencia de ácido nucleico de la diana del inhibidor. Las secuencias de ácido nucleico de versicanasas ADAMTS y agrecanasas ADAMTS son conocidas en la técnica.

Otros inhibidores de ADAMTS4 que se pueden usar de acuerdo con la presente invención son anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a agrecanasa ADAMTS4. Es bien conocido en la técnica que tras la unión de un anticuerpo a su proteína (antígeno) diana, se puede inhibir la función de esa proteína diana. De acuerdo con la presente invención se puede usar un anticuerpo inhibidor contra la enzima versicanasa/agrecanasa ADAMTS4. Una vez que se ha seleccionado una enzima versicanasa ADAMTS o agrecanasa ADAMTS, se pueden usar técnicas estándar en la técnica (por ejemplo, expresión de fagos) para generar anticuerpos contra esa enzima y se pueden realizar pruebas de rutina para identificar posteriormente anticuerpos con actividad inhibidora.

Los inhibidores basados en ácido nucleico y los inhibidores de anticuerpos descritos anteriormente preferiblemente logran una reducción significativa en el nivel o actividad funcional de ADAMTS4, más preferiblemente una reducción estadísticamente significativa, preferiblemente con un valor de probabilidad < 0,05. En algunas realizaciones, las moléculas inhibidoras logran una reducción de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos el 90 %, o el 100 % en el nivel de actividad funcional de ADAMTS4.

En algunas realizaciones de la invención, se prefieren los inhibidores selectivos de ADAMTS (por ejemplo, selectivos de ADAMTS4). En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de ADAMTS inhibe una o más (por ejemplo, dos o más) enzimas ADAMTS (por ejemplo, inhibe ADAMTS4 y ADAMTS5).

En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo es un inhibidor con mayor actividad (potencia) para las proteoglicanasas ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS4 y/o ADAMTS5) que para otras enzimas u otras clases de enzimas. En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo es un inhibidor con mayor actividad (potencia) para las proteoglicanasas ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS4 y/o ADAMTS5) que para las metaloproteinasas de matriz (MMP).

De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones no se prefieren inhibidores de amplio espectro tales como aquellos que inhiben otras clases de enzimas o proteasas (por ejemplo, metaloproteinasas de matriz, MMP). Por tanto, en ciertas realizaciones preferidas, un inhibidor de MMP de amplio espectro, u otro inhibidor de amplio espectro, no se usa como inhibidor de acuerdo con la presente invención. De acuerdo con la presente invención, el inhibidor de ADAMTS4 no es el inhibidor de MMP de amplio espectro marimastat.

En algunas realizaciones, preferiblemente los inhibidores tienen mayor actividad (potencia) hacia las proteoglicanasas ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS4 o ADAMTS5) que hacia las metaloproteinasas de matriz (MMP). En algunas realizaciones preferidas, un inhibidor (por ejemplo, inhibidor selectivo) tiene al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 200 veces, al menos 500 veces, o al menos 1000 veces mayor actividad (potencia) (por ejemplo, 5-50 veces, 10-30 veces o 5 a 1000 veces mayor) hacia las proteoglicanasas ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS4 o ADAMTS5) que hacia otras enzimas u otras clases de enzimas (por ejemplo, MMP).

En algunas realizaciones, no se emplean inhibidores que tienen mayor actividad (potencia) hacia otras enzimas u otras clases de enzimas (por ejemplo, MMP) que hacia las proteoglicanasas ADAMTS. A modo de ejemplo, en algunas realizaciones, no son preferidos los inhibidores que tienen al menos 5 veces (por ejemplo, 5-50 veces o 5­ 1000 veces), al menos 7 veces, al menos 10 veces (por ejemplo, 10-30 veces), al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 200 veces, al menos 500 veces o al menos 1000 veces mayor potencia hacia otras enzimas u otras clases de enzimas (por ejemplo, MMP) que frente a proteoglicanasas ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS4 o ADAMTS5).

En algunas realizaciones, preferiblemente una mayor actividad (potencia) significa una actividad significativamente mayor (potencia), más preferiblemente una mayor actividad (potencia) estadísticamente significativa, preferiblemente con un valor de probabilidad de <0,05.

Las actividades inhibidoras (potencia) se pueden evaluar (y opcionalmente cuantificar) por cualquier medio conveniente en la técnica y el experto conoce los ensayos apropiados. Por ejemplo, la actividad (potencia) se puede evaluar (y opcionalmente cuantificar) determinando la IC⁵⁰ o Kⁱ (constante inhibidora) de un inhibidor dado para su diana. De este modo, la actividad inhibidora (potencia) de un inhibidor se puede juzgar por sus valores de 1C⁵⁰ o Kⁱ. Las actividades relativas (potencias) de dos o más inhibidores se pueden establecer comparando los valores de IC⁵⁰ o Kⁱ de dichos inhibidores entre sí.

Sin desear estar ligado a ninguna teoría, se cree que las enzimas ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS4) son un objetivo más prometedor para la inhibición que las MMP porque, a diferencia de muchas MMP, las enzimas ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS4) tienen menos sustratos y escinden los proteoglicanos (especialmente versican, agrecán y sindecan-4) sin efectos de colagenasa.

Como se ha señalado anteriormente, la presente invención proporciona los inhibidores descritos anteriormente para su uso en el tratamiento o la prevención de la remodelación cardíaca (específicamente remodelación ventricular izquierda) o la insuficiencia cardíaca crónica en un sujeto con remodelación cardíaca (específicamente remodelación ventricular izquierda) o con insuficiencia cardíaca crónica. Por ejemplo, la presente invención proporciona uno o más de los compuestos específicos descritos anteriormente (por ejemplo, PPS) para su uso en el tratamiento o prevención de la remodelación cardiaca (específicamente remodelación ventricular izquierda) o insuficiencia cardiaca crónica en un sujeto con remodelación cardiaca (específicamente remodelación ventricular izquierda) o con insuficiencia cardiaca crónica.

La presente invención proporciona un inhibidor de ADAMTS4 para su uso en el tratamiento o prevención de la remodelación cardíaca (específicamente remodelación ventricular izquierda) o la insuficiencia cardíaca crónica en un sujeto con remodelación cardíaca (específicamente remodelación ventricular izquierda) o con insuficiencia cardíaca crónica.

De acuerdo con la presente invención, la prevención de la remodelación cardíaca (específicamente remodelación ventricular izquierda) o la insuficiencia cardíaca crónica se realiza en un sujeto con remodelación cardíaca (específicamente remodelación ventricular izquierda) o con insuficiencia cardíaca crónica.

La remodelación cardíaca es un término de la técnica y se refiere a cambios moleculares, celulares e intersticiales en el corazón, que se manifiestan clínicamente como cambios en el tamaño, forma y función del corazón como resultado de una carga o lesión cardíaca (Cohn JN et al. JACC 2000. 35(3):569-82).

De acuerdo con la presente invención, la remodelación cardíaca es remodelación ventricular izquierda.

La remodelación cardíaca que se va a tratar o prevenir de acuerdo con la presente invención es una remodelación cardíaca patológica (por ejemplo, anormal o aberrante).

Los tipos de remodelación cardíaca apropiados para el tratamiento o la prevención de acuerdo con la presente invención incluyen hipertrofia miocárdica (hipertrofia concéntrica y excéntrica) y dilatación ventricular.

Las afecciones que pueden conducir a (o causar) remodelación cardíaca y/o insuficiencia cardíaca crónica son afecciones que causan un aumento de la carga cardíaca o lesiones y, por lo tanto, para los sujetos (es decir, pacientes) que tienen (o se sospecha que tienen) tales afecciones, el tratamiento o la prevención de la remodelación cardíaca y/o la insuficiencia cardíaca crónica de acuerdo con la presente invención sería beneficiosa. Dicho de otra manera, la terapia antirremodelación, o la reducción de la remodelación cardíaca, o la terapia que inhibe el desarrollo de insuficiencia cardíaca crónica, sería beneficiosa en tales sujetos.

Las afecciones que pueden conducir a remodelación cardíaca y/o a insuficiencia cardíaca crónica incluyen cardiomiopatías, enfermedad y disfunción de las válvulas cardíacas, incluidas enfermedades de la válvula aórtica (AV) (tales como insuficiencia de la válvula aórtica, regurgitación de la válvula aórtica y estenosis aórtica (estenosis AV)), hipertensión, hipertensión pulmonar, enfermedad cardíaca congénita y enfermedad de las arterias coronarias, infarto de miocardio y arritmias. Para evitar dudas, aunque las afecciones enumeradas en este párrafo, incluido el infarto de miocardio, son afecciones que pueden conducir a remodelación cardíaca y/o a insuficiencia cardíaca crónica, estas afecciones no son en sí mismas ejemplos de remodelación cardíaca. La lesión isquémica aguda y la lesión por reperfusión tampoco son un ejemplo de remodelación cardíaca. Sin embargo, como tales afecciones pueden conducir a (causar) remodelación cardíaca y/o insuficiencia cardíaca crónica, los sujetos que tienen, o se sospecha que tienen, una o más de estas afecciones son sujetos preferidos para el tratamiento (o para los usos preventivos) de acuerdo con la presente invención. Son particularmente preferidos los sujetos que tienen, o se sospecha que tienen, enfermedades de las válvulas. Otros sujetos particularmente preferidos son sujetos que tienen, o se sospecha que tienen, hipertensión o enfermedades de las válvulas. Otros sujetos particularmente preferidos son sujetos que tienen, o se sospecha que tienen, estenosis de la válvula aórtica. Otros sujetos particularmente preferidos son aquellos que tienen, o se sospecha que tienen, enfermedad de las arterias coronarias y/o infarto de miocardio. También se prefieren los sujetos que han sufrido un infarto de miocardio. Dicho de otra forma, también se prefieren los sujetos en fase crónica tras un infarto de miocardio. El infarto agudo de miocardio no se trata (ni se previene) de acuerdo con la presente invención.

Los sujetos con signos de remodelación ventricular izquierda (por ejemplo, hipertrofia miocárdica, dilatación ventricular) o con insuficiencia cardíaca manifiesta, incluso cuando no se puede detectar la etiología subyacente, también son apropiados para el tratamiento de acuerdo con la presente invención para prevenir una remodelación ventricular izquierda adicional o tratar la remodelación ventricular izquierda existente o la reducción de la remodelación ventricular izquierda serían beneficiosas en estos sujetos.

En algunas realizaciones, los sujetos con factores de riesgo de desarrollo de remodelación ventricular izquierda y de insuficiencia cardíaca (por ejemplo, sujetos con aquellas afecciones que pueden conducir a remodelación cardíaca y/o a insuficiencia cardíaca crónica descritas en este documento) también son apropiados para el tratamiento (incluidos los usos preventivos) en de acuerdo con la presente invención.

En algunas realizaciones, un sujeto no tiene lesión isquémica aguda y/o lesión por reperfusión.

La remodelación cardíaca puede conducir a insuficiencia cardíaca crónica. Dado que la insuficiencia cardíaca crónica puede ser causada por (es decir, el resultado de) remodelación cardíaca, la insuficiencia cardíaca crónica es una enfermedad preferida que se va a tratar o prevenir de acuerdo con la presente invención.

La insuficiencia cardíaca es un término de la técnica y se refiere a un síndrome clínico definido por síntomas y signos típicos que resultan de cualquier anomalía estructural o funcional del corazón; donde las anomalías pueden afectar la capacidad de llenar o expulsar sangre, y/o provocar que no se suministre suficiente oxígeno para cumplir con los requisitos de los tejidos metabolizadores, a pesar de las presiones de llenado normales, o solo a expensas de presiones de llenado aumentadas (ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure. McMurray JJ et al. European Heart Journal 2012, 14(8):803-69; 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure, Yanzy CW et al. Circulation 2013, 128, e240-e327).

De acuerdo con la presente invención la insuficiencia cardíaca adecuada para el tratamiento o la prevención es la insuficiencia cardíaca crónica. La insuficiencia cardíaca crónica incluye insuficiencia cardíaca congestiva, disfunción sistólica o contráctil (por ejemplo, insuficiencia cardíaca sistólica) o insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida, e insuficiencia cardíaca en estadio A-D (A, B, C, D) según the American Heart Association staging. La insuficiencia cardíaca crónica también incluye insuficiencia cardíaca diastólica o la insuficiencia cardíaca con fracción de eyección conservada.

Las definiciones anteriores de insuficiencia cardíaca también se usan a menudo en la técnica para definir "insuficiencia cardíaca crónica". Para evitar dudas, la "insuficiencia cardíaca crónica" no incluye la insuficiencia cardíaca "aguda". La insuficiencia cardíaca aguda se puede definir como un cambio gradual o rápido en los signos y síntomas de la insuficiencia cardíaca que resulta en la necesidad de una terapia urgente, tal como inotrópicos, e incluye edema pulmonar y shock cardiogénico (Gheorghiade et al, Circulation 2005, 112(25):3958-68).

De acuerdo con la presente invención, los inhibidores de ADAMTS4 no tratan ni previenen la remodelación cardíaca al tratar o prevenir una o más afecciones que pueden conducir a la remodelación cardíaca (por ejemplo, la fase aguda del infarto de miocardio), pero más bien tienen un efecto (por ejemplo, un efecto directo) como fármacos para reducir, tratar o prevenir la remodelación cardíaca y/o la propia insuficiencia cardíaca crónica. De este modo, los inhibidores de acuerdo con la presente invención actúan para reducir o prevenir alteraciones en la composición y/o estructura de la matriz extracelular (por ejemplo, reduciendo la escisión de versican o agrecán). De este modo, la presente invención es útil para el tratamiento o la prevención de los estadios/fases crónicas de enfermedades o afecciones. De este modo, la presente invención es útil para el tratamiento o prevención de la remodelación cardíaca o la insuficiencia cardíaca después de los estadios/fases agudas de enfermedades o afecciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los inhibidores de ADAMTS4 actúan para reducir la remodelación cardíaca y/o la insuficiencia cardíaca en la fase/estadio crónico de una enfermedad o afección, por ejemplo, en la fase crónica después de un infarto de miocardio. Los inhibidores de ADAMTS4 se pueden administrar de este modo a sujetos en la fase crónica de una enfermedad o afección o después de la fase aguda de una enfermedad o afección, por ejemplo, en la fase crónica después de un infarto de miocardio. En la técnica, "crónico" se refiere generalmente a una duración prolongada, por lo general con síntomas tratados estables. Por el contrario, "agudo" por lo general significa un inicio rápido. Los inhibidores de ADAMTS4 también se pueden administrar a sujetos con insuficiencia cardíaca en los estadios A, B, C o D (preferiblemente en los estadios A, B o C) según the American Heart Association staging. En algunas realizaciones, se inicia el tratamiento (incluidos los usos preventivos) con un inhibidor de ADAMTS4 (se inicia la administración del inhibidor) al menos 2 días después de la lesión cardíaca, por ejemplo, al menos 2 días después del infarto de miocardio. En algunas realizaciones, el tratamiento (incluidos los usos preventivos) se inicia al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 14 días o al menos 28 días después de la lesión cardíaca (por ejemplo, después de un infarto de miocardio). Por ejemplo, el tratamiento (incluidos los usos preventivos) se puede iniciar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 días después de una lesión cardíaca (por ejemplo, después de un infarto de miocardio). En algunas realizaciones, el tratamiento (incluidos los usos preventivos) se inicia 5-15 días después de la lesión cardíaca (por ejemplo, después de un infarto de miocardio), por ejemplo, 8-10 días después de la lesión cardíaca (por ejemplo, después de un infarto de miocardio).

En algunas realizaciones, los tiempos discutidos en el párrafo anterior están en relación con el tiempo de aparición/iniciación del infarto de miocardio. En algunas realizaciones, los tiempos discutidos en el párrafo anterior están en relación con el tiempo a partir del cual se estabilizó el infarto de miocardio (por ejemplo, el tiempo desde el cual el infarto ya no aumenta de tamaño).

De este modo, en algunas realizaciones, si un sujeto ha sufrido un infarto de miocardio, el tratamiento (incluidos los usos preventivos) con un inhibidor de ADAMTS4 se puede iniciar en uno de los puntos de tiempo establecidos anteriormente. En algunas realizaciones, si un sujeto ha sufrido un infarto de miocardio, el tratamiento (incluidos los usos preventivos) con un inhibidor de ADAMTS4 se puede iniciar en la fase crónica después de un infarto de miocardio (y no mientras el sujeto está sufriendo de infarto del miocardio).

En algunas realizaciones, en sujetos que han sufrido un infarto de miocardio, se inicia el tratamiento (incluidos los usos preventivos) con un inhibidor de ADAMTS4 (se inicia la administración del inhibidor) después de la cicatrización completa y el adelgazamiento de la zona de infarto. De este modo, en algunas realizaciones, el tamaño del infarto no se ve afectado por los tratamientos (incluidos los usos preventivos) de la invención.

De este modo, si un sujeto ha sufrido un infarto de miocardio, el tratamiento (incluidos los usos preventivos) con un inhibidor de ADAMTS4 se puede iniciar después de la cicatrización completa y el adelgazamiento del área del infarto. De este modo, en algunas realizaciones, si un sujeto ha sufrido un infarto de miocardio, el tamaño del infarto no se ve afectado por los tratamientos (incluidos los usos preventivos) de la invención.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un inhibidor de ADAMTS4 para su uso en el tratamiento o prevención de la insuficiencia cardíaca crónica en un sujeto.

En realizaciones particularmente preferidas, el inhibidor es pentosano polisulfato (PPS), la versicanasa ADAMTS es la enzima ADAMTS4 y la enfermedad que se va a tratar o prevenir es la insuficiencia cardíaca crónica.

Visto alternativamente, la invención proporciona un inhibidor de ADAMTS4 para su uso en la reducción de la remodelación ventricular izquierda. Preferiblemente, la reducción es una reducción clínicamente significativa.

Los tratamientos (o terapias preventivas) de acuerdo con la presente invención pueden implicar la coadministración con otro agente que se usa en el tratamiento o prevención de enfermedades cardíacas, por ejemplo, otro agente antiremodelante u otro agente para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca. En una realización, el agente adicional para la coadministración es un inhibidor de los sistemas simpático o RAA (renina-angiotensina-aldosterona). En una realización, el agente adicional para la coadministración es un antagonista del receptor p-adrenérgico o inhibidor del sistema RAA.

Los sujetos de acuerdo con la presente invención serán preferiblemente humanos, pero también se contemplan tratamientos veterinarios (por ejemplo, para vacas, ovejas, cerdos, perros, gatos, caballos). Los sujetos de acuerdo con la presente invención son sujetos que tienen remodelación ventricular izquierda o insuficiencia cardíaca crónica. Los inhibidores para su uso en la presente invención se pueden incluir en formulaciones. Tales formulaciones pueden ser para uso farmacéutico o veterinario. Los diluyentes, excipientes y portadores apropiados para su uso en tales formulaciones son conocidos por los expertos.

Las composiciones (formulaciones) se pueden presentar, por ejemplo, en una forma apropiada para administración oral, nasal, parenteral, intravenosa, tópica o rectal, preferiblemente en una forma apropiada para administración oral. Los compuestos activos (inhibidores) definidos en este documento se pueden presentar en las formas de administración farmacológica convencionales, tales como comprimidos, comprimidos recubiertos, pulverizadores nasales, soluciones, emulsiones, liposomas, polvos, cápsulas o formas de liberación sostenida. Se pueden emplear excipientes farmacéuticos convencionales, así como los métodos habituales de producción para la preparación de estas formas.

Las soluciones de inyección se pueden producir, por ejemplo, de manera convencional, tal como mediante la adición de agentes de conservación, tales como p-hidroxibenzoatos, o estabilizantes, tales como EDTA. A continuación, las soluciones se introducen en viales o ampollas para inyección.

Los pulverizadores nasales se pueden formular de manera similar en solución acuosa y envasados en recipientes de pulverización, ya sea con un propulsor de aerosol o provistos de medios para la compresión manual.

Las composiciones farmacéuticas (formulaciones) se pueden administrar por vía parenteral. La administración parenteral se puede realizar mediante inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa en forma de pluma. Alternativamente, la administración parenteral se puede realizar mediante una bomba de infusión. Otra opción es una composición que puede ser un polvo o un líquido para la administración del compuesto activo en forma de pulverizador nasal o pulmonar. Como otra opción más, el compuesto activo también se puede administrar por vía transdérmica, por ejemplo, de un parche, opcionalmente un parche iontoforético, o transmucosalmente, por ejemplo, por vía bucal. Preferiblemente, el compuesto activo se administra por vía oral.

Las dosificaciones pueden variar en base a parámetros tales como la edad, el peso y el sexo del sujeto. Se pueden establecer fácilmente las dosificaciones apropiadas. A modo de ejemplo, se puede usar una dosificación de aproximadamente 300 mg/día p.o. (por ejemplo, para PPS). Se pueden preparar fácilmente unidades de dosificación apropiadas.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente ingredientes activos adicionales como se describió anteriormente en el contexto de regímenes de coadministración.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona kits que comprenden uno o más de los inhibidores de ADAMTS4, o formulaciones como se definieron anteriormente para su uso según la invención, en el que dicho inhibidor no es marimastat. Los kits pueden comprender componentes adicionales. Cada componente se puede proporcionar en un compartimento o recipiente separado. Cuando sea conveniente y práctico, se podrían proporcionar mezclas de componentes. Los componentes se pueden proporcionar en seco, por ejemplo, en forma cristalizados, secados por congelación o liofilizados, o en solución, por lo general tales composiciones líquidas serán acuosas y reguladas con un agente regulador estándar tal como T ris, HEPES, etc.

Los kits también se pueden proporcionar con instrucciones para uso del kit de acuerdo con la invención o con instrucciones sobre cómo pueden obtenerse tales instrucciones.

La invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes con referencia a los siguientes dibujos en los que:

Figura 1. Niveles elevados de ARNm de ADAMTS1, -4 y-8 en ratas con insuficiencia cardíaca después de la banda aórtica. Expresión de ARNm miocárdico de versicanasas y agrecanasas ADAMTS en ratas con (n=6) y sin insuficiencia cardíaca (n=10) seis semanas después AB, normalizado al gen de referencia de la proteína ribosómica L4 (RPL4) y relativo a la simulación (n=9). Los diagramas de caja muestran la mediana (línea horizontal), amplitud intercuartilo (caja), 1,5x amplitud intercuartilo o intervalo máximo/mínimo (bigotes) y valores extremo (o) (> 1,5x amplitud intercuartilo). * p <0,05. HF, insuficiencia cardíaca; HT, hipertrofia; AB, banda aórtica.

Figura 2. Niveles elevados de ARNm de versican y agrecán en ratas después de la banda aórtica. Expresión de ARNm miocárdico de versican y agrecán en ratas con (n=6) y sin insuficiencia cardíaca (n=10) seis semanas después de la banda aórtica, normalizada a la proteína L4 ribosomal (RPL4) del gen de referencia y relativa a la simulación (n=9). Los diagramas de caja muestran la mediana (línea horizontal), amplitud intercuartilo (caja), 1,5x amplitud intercuartilo o intervalo máximo/mínimo (bigotes) y valores extremo (o) (> 1,5x amplitud intercuartilo). *p < 0,05. HF, insuficiencia cardíaca; HT, hipertrofia; AB, banda aórtica.

Figura 3. Niveles de ARNm de TIMP-3, HAS y MT4-MMP en ratas después de banda aórtica Expresión de ARNm miocárdico de TIMP-3, HAS y MT4-MMP en ratas con (n=6) y sin insuficiencia cardíaca (n=10) seis semanas después de AB, normalizada a la proteína L4 ribosomal (RPL4) del gen de referencia y relativa a la simulación (n=9). Los diagramas de caja muestran la mediana (línea horizontal), amplitud intercuartilo (caja), 1,5x amplitud intercuartilo o intervalo máximo/mínimo (bigotes) y valores extremo (o) (>1,5x amplitud intercuartilo). * p <0,05. HF, insuficiencia cardíaca; HT, hipertrofia; HAS, ácido hialurónico sintasa; MT, tipo membrana; AB, banda aórtica.

Figura 4. La expresión de ARNm de ADAMTS4 y versican en fibroblastos cardíacos y cardiomiocitos es inducida por mediadores inflamatorios. Expresión de ARNm en NFB y NCM de ADAMTS1 (A, D), ADAMTS4 (B, E) y versican (C, F) después de la estimulación con LPS (n=6), IL-1 p (n=7), TNF-a (n=10 (NCM)/6 (NFB)), separados y combinados (n=7 (Nc M)/4 (NFB)). Las células no tratadas sirvieron como control (n=15 (Nc M)/18 (n Fb )). Los diagramas de caja muestran la mediana (línea horizontal), amplitud intercuartilo (caja), 1,5x amplitud intercuartilo o intervalo máximo/mínimo (bigotes) y valores extremo (o) (> 1,5x amplitud intercuartilo). * p <0,05, en comparación con el control. NFB, fibroblastos neonatales; NCM, cardiomiocitos neonatales.

Figura 5. Disminución del nivel de ARNm de ADAMTS4 después del tratamiento con PPS. Expresión de ARNm miocárdico de ADAMTS4 en ratas tratadas con PPS (n=10) y vehículo (n=7) seis semanas después de AB, y ratas operadas simuladamente tratadas con PPS (n=3) normalizada a la proteína L4 ribosomal (RPL4) del gen de referencia y relativa a la simulación tratada con vehículo (n=3). Los diagramas de caja muestran la mediana (línea horizontal), amplitud intercuartilo (caja), 1,5x amplitud intercuartilo o intervalo máximo/mínimo (bigotes) y valores extremo (o) (> 1,5x amplitud intercuartilo). * p < 0,05. HF, insuficiencia cardíaca; AB, banda aórtica.

Figura 6. Fragmentos de versican y proteína de longitud completa en ratas AB tratadas con PPS. Nivel de fragmento de versican p150 DPEEAE en Ec M soluble en NaCl (A), fragmento de versican p70 DPEEAE en ECM soluble en G (B) y versican de longitud completa en ECM soluble en G (C), en ratas AB tratadas con PPS o vehículo. Los diagramas de caja muestran la mediana (línea horizontal), amplitud intercuartilo (caja), 1,5x amplitud intercuartilo o intervalo máximo/mínimo (bigotes) y valores extremo (o) (> 1,5x amplitud intercuartilo). * p <0,05. HF, insuficiencia cardíaca; AB, banda aórtica, PPS, pentosano polisulfato, G, guanidina.

Figura 7. Niveles de ARNm después del tratamiento con pentosano polisulfato en ratas después de la banda aórtica. Expresión de ARNm miocárdico de ADAMTS1, -5, -8 (A), versican, agrecán (B), HAS-1, -2, TIMP-3 y MT4- MMP (C) en ratas tratadas con PPS (n=9 o 10) o vehículo (n=7 o 9) seis semanas después de AB, y ratas operadas simuladamente tratadas con PPS (n=3 o 4) normalizadas a la proteína L4 ribosomal (RPL4) del gen de referencia y relativa a la simulación tratada con vehículo (n=3). Las barras representan los niveles medios y las barras de error el percentil 75. * p <0,05. AB, banda aórtica; HF, insuficiencia cardíaca, HA, ácido hialurónico;

Figura 8. Función sistólica mejorada después del tratamiento con PPS en ratas AB. Acortamiento fraccional (A), diámetro del ventrículo izquierdo en sístole (B) y peso pulmonar (C) en ratas simuladas y con banda aórtica tratadas con pentosano polisulfato o vehículo. AB, banda aórtica. * p < 0,05.

Figura 9. Aumento de la expresión de ARNm de ADAMTS y proteoglicanos después de un infarto de miocardio Niveles de ARNm de ADAMTS y proteoglicanos en ratas simuladas tratadas con vehículo (n=6) y ratas MI tratadas con vehículo (n=15). Los diagramas de caja muestran la mediana (línea horizontal), amplitud intercuartilo (caja), 1,5x amplitud intercuartilo o intervalo máximo/mínimo (bigotes) y valores extremo (> 1,5x amplitud intercuartilo).

MI, infarto de miocardio.

Figura 10. Niveles reducidos de ADAMTS4, fragmentos de versican inducidos por ADAMTS, ADAMTS5 y MT4-MMP después del tratamiento con PPS

Niveles de proteína de fragmentos de versican DPEEAE y ADAMTS4 de 68 kDa en forma simulada tratada con vehículo (n=4), ratas MI tratadas con vehículo en el estrato 3 (n=3) y 4 (n=3), y ratas MI tratadas con PPS en el estrato 3 (n=4) y 4 (n=3). Niveles de ARNm de ADAMTS5 y MT4-m Mp en la simulación tratada con vehículo (n=6), ratas MI tratadas con vehículo (n=15) y ratas MI tratadas con PPS (n=15). Los diagramas de caja muestran la mediana (línea horizontal), amplitud intercuartilo (caja), 1,5x amplitud intercuartilo o intervalo máximo/mínimo (bigotes) y valores extremo (> 1,5x amplitud intercuartilo). MI, infarto de miocardio; PPS, pentosano polisulfato. Figura 11. Reducción del desarrollo de insuficiencia cardíaca en ratas tratadas con PPS con grandes infartos de miocardio

Peso del pulmón y diámetro de la aurícula izquierda en la simulación tratada con vehículo (n=6), la simulación tratada con PPS (n=6), ratas MI tratadas con vehículo en el estrato 1 (n=4), 2 (n=7), 3 (n=5) y 4 (n=4), y ratas MI tratadas con PPS en el estrato 1 (n=4), 2 (n=7), 3 (n=6) y 4 (n=5). Los diagramas de caja muestran la mediana (línea horizontal), amplitud intercuartilo (caja), 1,5x amplitud intercuartilo o intervalo máximo/mínimo (bigotes) y valores extremo (> 1,5x amplitud intercuartilo).

MI, infarto de miocardio; PPS, pentosano polisulfato.

Ejemplo 1

Introducción

Se planteó la hipótesis de que las alteraciones en la actividad de versicanasa y agrecanasa de las proteasas ADAMTS (una desintegrina y metaloproteasa con motivos de trombospondina) en la matriz extracelular (ECM) contribuyen al desarrollo de insuficiencia cardíaca, representando de este modo un objetivo terapéutico potencial en la insuficiencia cardíaca. En la primera parte del estudio, se examinaron los niveles miocárdicos de versican, agrecán y sus proteasas ADAMTS de escisión en ratas expuestas a bandas aórticas (AB), divididas en dos grupos con hipertrofia (ABHT) o insuficiencia cardíaca (ABHF), mientras que versican y las proteasas ADAMTS seleccionadas se analizaron adicionalmente en cardiomiocitos neonatales (NCM) y fibroblastos cardíacos (NFB) después del tratamiento con mediadores inflamatorios. En base a los hallazgos iniciales, se identificó un objetivo prometedor entre las proteasas ADAMTS y, en la segunda parte del estudio, se evalúo en ratas AB el efecto de la inhibición in vivo de este objetivo mediante el tratamiento con pentosano polisulfato (PPS) en función cardíaca, nivel de expresión de versican y fragmentación.

Métodos

Modelo de rata con banda aórtica

Los procedimientos experimentales se ajustaron a the European Convention for the Protection of Vertébrate Animáis Used for Experimental y Other Scientific Purposes, y los protocolos fueron aprobados por the Norwegian Council for Animal Research. Las ratas Wistar macho que pesaban 160-170 g se sometieron a AB, en esencia como se describió anteriormente (Lunde et al. Physiol Genomics 2011. 44(2):162-72). En resumen, se disecó la aorta ascendente libre a través de una hemitoracotomía derecha y se ligó (seda 3-0) contra un alambre de acero. Las ratas operadas simuladamente (simuladas) se sometieron al mismo procedimiento quirúrgico con una sutura suelta alrededor de la aorta. En todos los procedimientos quirúrgicos realizados, se usó una mezcla de 67 % de N²O, 28 % de O² e isoflurano al 4 % en una cámara de anestesia para la sedación preoperatoria. Para mantener la anestesia peroperatoriamente, se administró una mezcla de 69 % de N²O, 29 % de O² y 2 % de isoflurano mediante el tubo endotraqueal y los animales se ventilaron con un respirador (Zoovent, Triumph Technical Services, Milton Keynes, Reino Unido). Se administró buprenorfina como analgesia posoperatoria después de la AB.

Fenotipado animal y muestreo de tejidos

Se evaluó la función cardíaca in vivo usando el sistema Vevo2100 (Visualsonics Inc, Canadá) como se describió previamente (Sjaastad et al. J Appl Physiol 2000; 89:1445-54). A partir de entonces, se extirpó el corazón con anestesia profunda, se lavó con solución salina y se secó para eliminar la sangre de las cámaras cardíacas. Las cámaras del corazón se separaron mediante disección rápida, antes de congelarse rápidamente en nitrógeno líquido y almacenarse a -70 °C hasta su posterior análisis. Para las ratas AB que no recibieron tratamiento con PpS o vehículo, la selección en grupos de insuficiencia cardíaca (ABHF) o hipertrofia (ABHT) se basó en análisis ecocardiográfico y post mórtem, de la siguiente manera: Los criterios de inclusión para el grupo ABHF fueron aumento de peso pulmonar (> 2,5 g), aumento del diámetro de la pared posterior en diástole (PWDd) (> 2,0 mm) y aumento del diámetro de la aurícula izquierda (> 5,0 mm), mientras que los criterios de inclusión en el grupo ABHT fueron aumento de PWDd (> 2,0 mm), aumento de peso del ventrículo izquierdo (> 0,75 g) y peso pulmonar conservado (<2,0 g).

Aislamiento de cardiomiocitos y fibroblastos neonatales

Se aislaron NCM y NFB de rata primarios de ratas Wistar de 1-3 días (Taconic, Skensved, Dinamarca) como se describió anteriormente (Strand Me et al. FEBS Journal 2013. 280(10):2228-47). En resumen, se extrajeron los corazones y se disecó y digirió el ventrículo izquierdo usando colagenasa, y la suspensión celular se transfirió a matraces de cultivo sin revestir permitiendo que NFB se adhiriera, mientras que los NCM se transfirieron a placas de cultivo recubiertas de gelatina (Corning International, Corning, NY) en medio de placa. [Medio Eagles modificado de Dulbecco (Sigma) suplementado con penicilina/estreptomicina (Sigma), NaHCO 44 mmol l-1, medio 199 (Sigma), NaHCO326 mmol M, suero de caballo (14-703E, Bio-Whittaker, Walkersville, ML) y suero de ternero fetal (14-701E, Bio-Whittaker)]. Las células se mantuvieron en medio sin suero (medio de placa sin suero) 24 horas antes del tratamiento con mediadores inflamatorios.

A partir de entonces, NCM y NFB se trataron con 10 ng/ml de IL-1 p (501-RL-010, R&D Systems, Minneapolis, MN) y 50 ng/ml de TNF -a (PMC3014, BioSource International, Camarillo, CA) por separado y combinado, y 1000 ng/ml de LPS (201, List laboratories, Campbell, CA) durante 24 h.

Inhibición in vivo de ADAMTS4

Tres días después de AB, las ratas se estratificaron por el gradiente sobre la estenosis para asegurar un grado similar de estrés cardíaco. Se asignaron al azar dos y dos ratas estratificadas para recibir 6 mg/kg del polisacárido sulfatado pentosano polisulfato de sodio (PPS) (Interfarm AS, Noruega) o vehículo (NaCl al 0,9 %) inyectado por vía subcutánea cada tres días. Las ratas se observaron a diario y no se observaron efectos secundarios, incluida hemorragia. Seis semanas después de la operación AB o simulada, las ratas fueron examinadas mediante ecocardiografía y análisis post mortem, realizado por investigadores experimentados (IS, JMA) cegados al grupo de tratamiento.

Aislamiento de ARN, transcripción inversa y PCR cuantitativa en tiempo real

Los niveles de ARNm de ADAMTS1, -4, -5 y -20 que poseen actividad de versicanasa y/o agrecanasa, ADAMTS8, -9, -15, -16 y -18 que poseen actividad de agrecanasa, y ADAMTS6 (para los cuales el sustrato aún no se ha determinado) (Shiomi et al. Pathology International 2010. 60(7):477-96) se cuantificaron en el ventrículo izquierdo de rata mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT), y ADAMTS demostrando niveles de ARNm alterados después de AB, también se cuantificaron después del tratamiento con PPS. Además, se midieron los niveles de ARNm de proteínas que se sabe que modulan la actividad de ADAMTS o la función de versican; inhibidor tisular de metaloproteasa (TIMP)-3, ácido hialurónico (HA) sintasa 1 y 2, y tipo membrana (MT)4-MMP, mientras que los niveles de ARNm de ADAMTS 1, -4 y versican se cuantificaron en NFB y NCM.

Se aisló ARN total del ventrículo izquierdo en ratas AB, cardiomiocitos de rata neonatal y fibroblastos (mini kit RNeasy, Qiagen, Valencia, CA). Se evaluó la calidad de todas las muestras de ARN y se aceptaron números de integridad de ARN (RIN) > 7,5 (Agilent Bioanalyzer, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE. UU.) y una proporción 280/260> 2 (espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific) Las reacciones de transcripción inversa se realizaron con el kit de síntesis de ADNc iScript Select (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Los ensayos TaqMan prediseñados (Applied Biosystems, Foster City, CA) se usaron en la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) para determinar la expresión génica de ADAMTS1 (Rn01646120_g1), ADAMTS4 (Rn02103282_s1), ADAMTS5 (Rn01458486_m1), ADAMTS6 (Rn01489864_m1), ADAMTS8 (Rn01524921_m1), ADAMTS9 (Rn01425216_m1), ADAMTS15 (Rn01524703_m1), ADAMTS16 (Rn01537448_m1), ADAMTS18 (Rn01426916_m1), ADAMTS20 (Rn01407540_m1), versican (Rn01493755_m1), agrecán (Rn00573424_m1), HAS-1 (Rn01455687_g1), HAS-2 (Rn00565774_m1), TIMP-3 (Rn00441826_m1) y MT4- MMP (Mm00449292_m1). Para la normalización se usó proteína ribosomal L4 (RPL4) del gen de referencia (Rn008211091_g1). Los resultados se detectaron en un sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7900 (Applied Biosystems, CA).

Aislamiento fraccional de proteínas del ventrículo izquierdo de rata

Se extrajeron proteínas del miocardio de rata como se describió previamente (Didangelos et al. J Biol Chem 2012.

287(23):19341-5). En resumen, las proteínas se separaron en tres fracciones; proteínas extracelulares solubles en NaCl (NaCl-ECM) y proteínas extracelulares solubles en guanidina (G-ECM), que contienen el fluido y el compartimento de la matriz de la ECM respectivamente, además de proteínas celulares y unidas a células que se pueden disolver en SDS (muestras de SDS) (Figura 6D). Se desglicosilaron NaCl-ECM y G-ECM para eliminar las cadenas GAG usando una muestra de 4 mU/NaCl y una muestra de 12 mU/G de condroitinasa ABC (de Proteus vulgaris, G3667, Sigma-Aldrich, MO) y una muestra de 5 mU/NaCl y una muestra de 15 mU/G de queratanasa (endo-p-galactosidasa de Bacteroides fragilis, G6920, Sigma-Aldrich), como se describió previamente (Didangelos A et al. supra).

Inmunotransferencia

Las concentraciones de proteínas se midieron usando el kit de ensayo de proteínas Micro BCA (Pierce/Thermo Scientific, IL). El agente regulador de muestra se mezcló con 5-25 |ig (muestras G) o 30 |ig (muestras de NaCl y SDS) del lisado de proteína, se desnaturalizó a 96 °C, durante 10 minutos y se analizó en geles de 1,5 mm con gradiente de Bis-Tris al 4-12 % (Nupage, Invitrogen, CA), con agente regulador de análisis MOPS SDS hasta que el marcador de proteína de 37 kDa alcanzó la parte inferior del gel. Todos los extractos de proteínas se cargaron ciegos al grupo.

Se realizó SDS-PAGE e inmunotransferencia como se describe en el protocolo Criterion BioRad, usando membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Suecia). Las transferencias se desarrollaron usando el sistema de detección de transferencia Western ECL Plus (GE Healthcare) y se visualizaron en el Las-4000 mini de Fujifilm (Japón). Antes de volver a realizar el sondeo, la extracción se realizó con el agente regulador de extracción Restore Western Blot (21059, Thermo Scientific, IL).

Dado que dos de las fracciones de proteína contenían proteínas extracelulares, se eligió la tinción de Coomassie de las transferencias para controlar la carga igual. Se observó una carga igual para las muestras de fracción de proteína de SDS y NaCl. Para las fracciones de G, la tinción de Coomassie reveló signos de una carga desigual potencial y, por lo tanto, los niveles de proteína en las muestras G se normalizaron a la banda de 65 kDa en la correspondiente transferencia teñida de Coomassie.

Anticuerpos

Las membranas se bloquearon en leche en polvo desnatada al 5 % (170-6404, BioRad) durante la noche. A partir de entonces, las transferencias se incubaron con anticuerpos primarios y secundarios diluidos en BSA al 5 % durante una hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios usados fueron contra ADAMTS4 (PA1-1750, Thermo Pierce Scientific, IL), versican de longitud completa (sc-25831, Santa Cruz Biotechnology, CA) y fragmentos de versican que muestran el neoepítopo DPEEAE (ab19345, Abcam, Cambrigde, Reino Unido) resultante de la escisión de ADAMTS por ADAMTS1/4 (Sandy JD et al. J Biol Chem 2001. 276(16):13372-8; Didangelos A et al. supra), y se cuantificaron por ImageJ.

Análisis estadístico

Los datos se informan como media±SEM o mediana (amplitud intercuartilo) para variables continuas dependiendo de la distribución. Para los niveles de ARNm, los datos se normalizan a RPL4 y control. Para los niveles de proteína, los datos se normalizan para control. Las comparaciones entre grupos se investigaron con la prueba t de Student o la prueba de Mann-Whitney para variables continuas dependiendo de la distribución. Se usó la corrección de Dunn para múltiples comparaciones de datos de cultivos celulares. Se consideraron significativos los valores de p (bilaterales) < 0,05.

Resultados

Los niveles de ARNm miocárdico de las versicanasas ADAMTS aumentan en ratas AB

Se midieron los ADAMTS con actividad conocida de versicanasa y agrecanasa en los ventrículos izquierdos de ratas AB (Figura 1). El nivel de ARNm de ADAMTS1 fue ~ 1,7 veces mayor en ABHF (1,74 (1,51-1,99)) que en ambos ABHT (0,95 (0,77-1,01), p <0,01) y simulación (1,00 (0,80-1,30), p <0,01). Además, la expresión de ARNm de ADAMTS4 fue mayor en Ab HT (1,66 (1,44-4,02)) que en la simulación (1,00 (0,95-1,11), p=0,01), mientras que la elevación más pronunciada se encontró en ABHF demostrando niveles ~ 9 veces más altos que la simulación (8,75 (3.97-38,21), p <0,01) y niveles 5 veces más altos a ABHT (p <0,01). Para ADAMTS20, la expresión de ARNm fue 1,7 veces más alta en A^b HT (1,68 (1,53-2,21)) que tanto en la simulación (1,00 (0,83-1,33), p <0,01) como en ABHF (1,00 (0,90-1,45), p <0,01). Por el contrario, la expresión de ARNm de la expresión de ARNm de ADAMTS5 fue menor en ABHT (0,79 (0,70-0,91) que en la simulación (1,00 (0,89-1,14), p=0,02), con una disminución aún mayor en ratas ABHF (0,63 (0,56- 0,82), ABHF frente a la simulación p=0,03, ABHF frente a ABHT p=0,05).

Además, se cuantificaron las expresiones de ARNm de ADAMTS8, -9, -15, -16 y -18, con propiedades de escisión de agrecán conocidas, en ratas AB. En comparación con la simulación (1,00 (0,66-1,53)), el nivel de ADAMTS8 aumentó en ~ 6 y 10 veces en ABHT (5,67 (4,17-6-91), p <0,01) y ABHF (10,22 (7,00-19,36), p <0,01), respectivamente, donde el nivel en ABHF también fue significativamente más alto que ABHT (p=0,02). Para ADAMTS 15 se observó una tendencia a niveles más altos de ARNm en ABHT (1,28 (1,08-1,51)) que en la simulación (1,00 (0,84-1,16), p=0,06), mientras que no se midieron diferencias significativas en el grupo ABHF (1,26 (0,94-1,44), ABHF frente a la simulación p=0,24, ABHF frente a ABHT p=0,66). Por el contrario, los niveles de ARNm de ADAmTs 9 y -18 no se alteraron después de AB (ADAMTS9: simulación 1,00 (0,82-1,14), ABHT 0,95 (0,81-1,12), ABHF 0,97 (0,73-1,65); ADAMTS18: simulación 1,00 (0,68-1,45), ABHT 0,91 (0,50-1,08), ABHF 0,59 (0,54-1,04)). En cuanto a ADAMTS5, la expresión de ARNm de ^a D^a MTS16 fue menor en ABHF (0,58 (0,45-0,86)) que en la simulación (1,00 (0,69-1,31), p=0,05) y ABHT (1,08 (0,84-1,37), p=0,02), sin embargo, los niveles de ABHT no difirieron de los niveles de la simulación (p=0,51) (Figura 1). Para ADAMTS6, para el que aún no se ha determinado el sustrato, los niveles disminuyeron después del desarrollo de la insuficiencia cardíaca, con un nivel más bajo en ABHF (0,58 (0,45-0,86)) que ambos en la simulación (1,00 (0,69-1,31), p=0,05) y ABHT (1,08 (0,84-1,37), p=0,02), sin embargo, los niveles de ABHT no difirieron de los niveles de la simulación (p=0,51). Las características iniciales de las ratas AB se dan en la tabla 1.

El nivel de ARNm miocárdico de versican y agrecán aumenta en ratas AB

Los niveles de ARNm de versican y agrecán aumentaron después de AB (Figura 2). En comparación con los niveles de versican en la simulación (1,00 (0,92-1,55), un aumento de 1,5 veces en ABHT (1,52 (1,26-2,31), p=0,03) y un aumento de 3.5 veces en ABHF (3.46 (3.11-4,58), p<0,01). De manera similar, el nivel de agrecán aumentó 4 veces en ABHT (3.91 (2,57-6,39), p <0,01) y 6 veces en A^b HF (5,78 (4,65-14,38), p <0,01) en comparación con los niveles de la simulación (1,00 (0,57-1,30). Sin embargo, no se observó ningún aumento incremental en los niveles de ARNm de agrecán después de la transición al fallo (ABHT vs ABHF: p=0,28).

El nivel de ARNm miocárdico de las proteínas que modulan la actividad de ADAMTS o la función de versican no se alteró en ratas AB

Los niveles de ARNm miocárdico de TIMP-3, el inhibidor endógeno de ADAMTS4 (Hashimoto et al. FEBS Letter 2001. 494(3):192-5), fueron similares en los tres grupos AB (la simulación 1,00 (0,92-1,07), CH 1,18 (0,97-1,27), HF 0,97 (0,87-1,19)) (Figura 3A). El nivel de ARNm de MT4-MMP, que activa ADAMTS4 (Gao et al. J Biol Chem 2004.

279(11):10042-51), fue más alto en ABHT (0,89 (0,67-1,42)) que en ABHF (1,69 (1,21) -2,29), p=0,05), y una tendencia a niveles más altos en ABHF que en la simulación (1,00 (0,85-1,22), p=0,06), mientras que los niveles de MT4-MMP no difirieron entre ABHT y simulación (p=0,72) (Figura 3B). Se observó un aumento de ~3 y ~5 veces en HAS-1 en ABHT (2,56 (1,66-3.18), p <0,01) y a Bh F (4,55 (3.98-9,11), p <0,01), respectivamente, en comparación con la simulación (1,00 (0,75-1,18), con un aumento significativo también entre ABHT y ABHF (p <0,01). El nivel de ARNm de HAS-2 fue más alto en ABHF (1,76 (1,37-2,82), p=0,01) que en la simulación (1,00 (0,66-1,33)), mientras que los niveles en ABHT no fueron significativamente diferentes ni de la simulación (p=0,06) ni de la ABHF (p=0,10) (Figura 3C).

Los niveles de ARNm de ADAMTS4 y versican fueron inducidos por mediadores proinflamatorios en células cardíacas

La expresión de ARNm de ADAMTS1 fue menor en fibroblastos cardíacos estimulados durante 24 horas con LPS (0,52 (0,45-0,58), p <0,05), TNF-a solo (0,71 (0,60-0,85), p <0,05) y en combinación con IL-1 p (0,71 (0,69-0,73), p <0,05), que en el control (1,00 (0,96-1,12) (Figura 4A). También los cardiomiocitos estimulados con TNF-a (0,56 (0,52-0,60)) mostraron niveles más bajos de ADAMTS1 que las células de control (1,00 (1,00-1,08), p <0,05) (Figura 4^d ). Los niveles de ARNm de ADAMTS4, por otro lado, fueron ~9 y 6 veces más altos en LPS-(8,55 (8,08-9,62), p <0,05) y células estimuladas con IL-1 p (6,25 (4,21-7,65), p <0,05) respectivamente, que en los controles (1,00 (0,92­ 1,08)). Sin embargo, el aumento más alto en el nivel de fibroblastos de ADAMTS4 fue observado después de la estimulación sinérgica tanto con TNF-a como con IL-1 p (16,42 (15,41-17,63), p <0,05), donde la expresión de ARNm era ~16 veces más alta que en células no estimuladas (Figura 4B). En cardiomiocitos, solo la combinación de IL-1 p y TNF-a indujo un aumento del nivel de ADAMTS4 (2,98 (2,33-4,17) en comparación con el control (1,00 (0,97-1,10), p <0,05) (Figura 4E).

Curiosamente, también aumentó la expresión de ARNm de versican después de la estimulación con mediadores inflamatorios. En fibroblastos cardíacos, el nivel de versican aumentó en respuesta a LPS (3.31 (2,25-3.99), p <0,05), IL-1 p sola (2,28 (1,67-3.34), p <0,05) y en combinación con TNF-a (5,06 (5,00-5,21), p <0,05) en comparación con el control (2,28 (1,67-3.34)) (Figura 4C). En cardiomiocitos, IL-1 p sola (3.47 (3.34-3.71), p <0,05) y combinada con TNF-a (7,04 (6,67-7,75), p <0,05), indujo la síntesis de versican (control 1,01 (0,93- 1,02)) (Figura 4F).

El tratamiento con PPS redujo los niveles de ARNm de ADAMTS4

Las versicanasas ADAMTS1 y -4 se regularon positivamente en ABHF. Se consideró que ADAMTS4 era una diana apropiada debido al aumento considerable de ratas ABHT y ABHF, y al aumento inducido por inflamación en las células cardíacas. El PPS tiene efectos inhibidores conocidos de ADAMTS4 (Troeberg et al. FASEB J. 2008.

22(10):3515-24; Takizawa et al. FEBS Letter 2008. 582(19):2945-9) y de este modo fue elegido como inhibidor de ADAMTS4 en ratas AB.

Los niveles de ARNm de ADAMTS4 se redujeron en ratas AB tratadas con PPS (1,29 (1,00-6,45)) en comparación con ratas AB tratadas con vehículo (6,03 (3.79-12,76), p=0,03) (Figura 5). Los niveles de ARNm de ADAMTS1, -5, -8, versican, agrecán, HAS-1, HAS-2, TIMP-3 y MT4-MMP no se vieron afectados por el tratamiento con PPS (Figura 7). En las fracciones de proteína, el nivel de ADAMTS4 no se alteró después del tratamiento con PPS (datos no mostrados).

El tratamiento con PPS inhibió la escisión del versican miocárdico en ratas AB

Las proteínas se separaron en tres fracciones para analizar la presencia de productos de degradación del versican; proteínas extracelulares solubles en NaCl (NaCl-ECM) y proteínas extracelulares solubles en guanidina (G-ECM), que contienen el compartimento de líquido y matriz de ECM respectivamente, además de proteínas celulares y ligadas a células que se pueden disolver en SDS (muestras de SDS) (Figura 6D).

La presencia de productos de degradación del versican se examinó mediante inmunotransferencia usando un anticuerpo que detecta el neoepítopo DPEAAE mostrado después de la escisión por ADAMTS1/4, donde los fragmentos de 150 y 70 kDa resultan de la escisión de la isoforma V0 y VI, respectivamente (Figura 6E) (Sandy et al. supra, Didangelos et al. supra).

En NaCl-ECM, se observó una cantidad más alta de p150 versican en AB tratada con vehículo (2,14 (1,34-3.55)) que en la simulación tratada con vehículo (1,06 (0,73-1,30), p=0,04). Después del tratamiento con PPS, los niveles de p150 versican en NaCl-ECM se redujeron a la mitad (1,08 (0,69-1,63)) en comparación con las ratas AB tratadas con vehículo (p=0,05) (Figura 6A).

En G-ECM, el nivel de fragmento de versican p70 fue menor en AB tratada con vehículo (0,67 (0,52-0,94)) que en la simulación tratada con vehículo (1,02 (0,96-1,29), p=0,03), permaneciendo significativo después de la normalización a Coomassie (p=0,02). El tratamiento con PPS redujo este fragmento en la simulación tratada con PPS (0,34 (0,28­ 0,61)) en comparación con la simulación tratada con vehículo (1,02 (0,96-1,29), p=0,01) (Figura 6B), aunque esta diferencia no siguió siendo significativa después de normalización a Coomassie (p=0,20). Además, se midió un nivel más alto de versican de longitud completa (p400) en ratas AB tratadas con PPS (1,17 (0,77-6,85)) en comparación con ratas AB tratadas con vehículo (0,47 (0,41-0,92), p=0,03), permaneciendo significativo después de la normalización a Coomassie (0,02) (Figura 6C).

Función cardíaca mejorada en ratas con bandas aórticas tratadas con pentosano polisulfato

Las ratas AB tratadas con PPS demostraron una función contráctil mejorada en comparación con las ratas tratadas con vehículo (Tabla 2 y Figura 8). En resumen, se observó un 23 % más de acortamiento fraccional en ratas AB tratadas con PPS en comparación con las tratadas con vehículo. Adicionalmente, el diámetro del ventrículo izquierdo en la sístole en ratas AB tratadas con PPS constituía sólo tres cuartos del diámetro observado en ratas AB tratadas con vehículo, y se observó una tendencia hacia un peso pulmonar más bajo en ratas AB tratadas con PPS.

Discusión

En este estudio, se ha encontrado que la inhibición de ADAMTS4 mejora la función sistólica en respuesta a la sobrecarga de presión. Los hallazgos sugieren que este efecto beneficioso de PPS está mediado por una reducción en la actividad de versicanasa ADAMTS4. Esta conclusión se basa en los siguientes hallazgos principales: 1) aumento de los niveles de ARNm de ADAMTS4 y degradación de versican alterada inducida por ADAMTS durante el desarrollo de insuficiencia cardíaca, 2) aumento de ADAMTS4 y versican inducido por inflamación en las células cardíacas, y 3) mejora del rendimiento contráctil, simultáneamente con las indicaciones de la actividad de versicanasa ADAMTS4 reducida, en ratas AB que recibieron el inhibidor de ADAMTS4 PPS. En resumen, estos hallazgos arrojan luz sobre un mecanismo novedoso para el desarrollo de la insuficiencia cardíaca y una nueva terapia prometedora para la insuficiencia cardíaca.

Actividad ADAMTS mejorada durante el desarrollo de insuficiencia cardíaca

Este estudio demuestra varias indicaciones de una actividad acelerada de las versicanasas y agrecanasas de ADAMTS durante el desarrollo de la insuficiencia cardíaca. Primero, en el miocardio de ratas Ab , se observó un aumento en la síntesis de ARNm de ADAMTS 1-, -4 y -8, concurrente con un aumento en la enzima activadora de ADAMTS4 MT4-MMP. Además, la síntesis de ARNm de versican y agrecán se aceleró, proporcionando sustrato para una mayor degradación mediada por ADAMTS. Curiosamente, la síntesis de ADAM^tS4 y versican en las células cardíacas fue inducida por TNF-a e IL-1 p, citocinas que se encuentran en niveles mejorados en el miocardio defectuoso (Torre-Amione et al. Circulation 1996. 93(4):704-11; Shioi et al. Circ Res 199781(5):664-71), sugiriendo de este modo que la inflamación es el desencadenante de la degradación del versican mediada por ADAMTS durante la sobrecarga de presión.

La noción de actividad de versicanasa acelerada inducida por ADAMTS en respuesta a la sobrecarga de presión fue apoyada por una mayor cantidad de fragmentos de versican p150 DPEEAE que resultan de la escisión inducida por ADAMTS. En ratas AB, la cantidad de este fragmento proteolítico versican se duplicó en el NaCl-ECM, que contiene líquido intersticial soluble en solución salina. Curiosamente, el conocimiento sobre la estructura de ADAMTS4 proporciona pistas sobre dónde se encuentra la enzima dentro del ECM. ADAMTS4 es a saber, la única enzima de esta familia que carece de una cola repetida de trombospondina, una característica estructural que se sabe que une la enzima a Da MTS a otros componentes de ECM (Apte et al. J Biol Chem 2009284(46):31493-7). Por lo tanto, se podría esperar que ADAMTS4 se localizara en la ECM soluble en NaCl fácilmente soluble, lo que brinda más apoyo a que la acumulación de fragmentos de versican p150 es un resultado de la actividad acelerada de ADAMTS4. El pentosano polisulfato redujo la actividad de versicanasa ADAMTS4

El tratamiento con PPS de ratas AB contrarrestó varias de las alteraciones en niveles de ADAMTS4 y fragmentos de versican observados en las ratas AB tratadas con vehículo. Estudios previos han demostrado que PPS inhibe la actividad agrecanasa de ADAMTS4 y -5 (Troeberg et al. supra) sin afectar la expresión génica de la proteasa (Takizawa et al. supra). Sin embargo, en el presente estudio se observaron niveles reducidos de ARNm de ADAMTS4 después del tratamiento con PPS, mientras que los niveles de proteína permanecieron sin cambios. Simultáneamente, el nivel de ARNm del inhibidor endógeno TIMP-3 no se vio afectado por el tratamiento con PPS. Una regulación a la baja de los fragmentos de versicanasa p150 DPEEAE en NaCl-ECM después del tratamiento con PPS de ratas AB respalda además que se logró la inhibición de la actividad de versicanasa ADAMTS4 por PPS. El tratamiento con PPS mejoró la función contráctil en ratas AB

El tratamiento con PPS de ratas AB ralentizó el desarrollo de la disfunción sistólica, deteniendo la fase crítica de transición al fallo. El presente estudio indica que el efecto beneficioso de la inhibición de ADAMTS4 se relaciona con la reducción observada en los fragmentos de versican p150 después del tratamiento con PPS.

Sin desear estar ligado a ninguna teoría, los presentes hallazgos sugieren que una actividad versicanasa acelerada de ADAMTS4 conduce a una acumulación de fragmentos versican hidrófilos, aumentando el contenido de agua en la ECM soluble en NaCl. El edema miocárdico es una característica del corazón defectuoso (Brooks et al. Genomics 2010 95(2):84-92), que se sugiere que está asociado con disfunción sistólica (Abdel-Aty et al. Int J Cardiol 2009.

132(2):291-3; Laine et al. Circ Res 1991. 68(6):1713-1; Davis et al. J Appl Physiol 1995. 78(1):132-7). Durante los ciclos repetitivos de contracción y relajación, el movimiento de mayores cantidades de líquido intersticial viscoso podría comprometer las contracciones eficientes (Dongaonkar et al. Cardiovasc Res 201087(2):331-9). El exceso de contenido de agua intersticial también puede conducir a una disminución en el suministro de oxígeno, por ejemplo, alterando la estructura del tejido y aumentando la distancia entre las células. De este modo, contrarrestar la acumulación de fragmentos de versican en el líquido intersticial puede inhibir el desarrollo de disfunción sistólica. Implicaciones clínicas

En vista del presente estudio, las enzimas ADAMTS, en particular ADAMTS4, representan una diana terapéutica novedosa y prometedora en pacientes con remodelación cardíaca o insuficiencia cardíaca, pacientes con sospecha de remodelación cardíaca o insuficiencia cardíaca, o pacientes con riesgo de desarrollar remodelación cardíaca o insuficiencia cardíaca. El PPS tiene la aprobación de la FDA y se usa en el tratamiento de la cistitis intersticial y la osteoartritis en medicina veterinaria. El PPS se tolera bien y, además de un leve efecto anticoagulante, el PPS ejerce pocos efectos secundarios. De este modo, el PPS (y otros inhibidores de las proteoglicanasas ADAMTS) es prometedor como un nuevo agente terapéutico para la remodelación cardíaca y/o en la insuficiencia cardíaca.

Tabla 1. Análisis ecocardiográficos y pesos de órganos en ratas AB

(continuación)

AB, banda aórtica; HT, hipertrofia; HF, insuficiencia cardíaca; IVSd, dimensión telediastólica del tabique interventricular; LVDd, diámetro del ventrículo izquierdo al final de la diástole; LVD, diámetro del ventrículo izquierdo al final de la sístole; FS, acortamiento fraccionado; PWd, dimensión de la pared posterior; LAD: diámetro de la aurícula izquierda; LVOT, tracto de salida del ventrículo izquierdo; CO, gasto cardíaco; VTI, integral de velocidadtiempo; RVOT, tracto de salida del ventrículo derecho; *p < 0,05 frente a la simulación, fp <0,05 frente a ABHT.

Tabla 2. Análisis ecocardiográficos y pesos de órganos en ratas con banda aórtica tratadas con PPS

wt, peso; LV, ventrículo izquierdo; RV, ventrículo derecho; IVSd, espesor del tabique interventricular en la diástole; LVDd, diámetro del ventrículo izquierdo en la diástole; LVD, diámetro del ventrículo izquierdo en la sístole; PWd: espesor de la pared posterior en la diástole; LAD: diámetro de la aurícula izquierda; dec, desaceleración; LVOT, tracto de salida del ventrículo izquierdo; HR, frecuencia cardíaca; RVOT, tracto de salida del ventrículo derecho. Ejemplo 2

Material y métodos

Declaración de Ética

Los procedimientos experimentales se ajustaron a European Convention for the Protection of Vertébrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. Los protocolos fueron aprobados por the Norwegian Council for Animal Research antes del comienzo del estudio. Todos los procedimientos quirúrgicos fueron realizados con anestesia completa por un investigador experimentado.

Modelo animal

Ratas Wistar macho que pesaban 160-170 gramos (aproximadamente 7 semanas de edad) (Taconic, Skensved Dinamarca) se sometieron a MI (infarto de miocardio) mediante ligadura de la arteria coronaria izquierda como se describió anteriormente (Sjaastad I, et al. J Appl Physiol 2000 October;89(4):1445-54.). En todos los procedimientos quirúrgicos realizados, se usó una mezcla de 67 % de N²O, 28 % de O² e isoflurano al 4 % en una cámara de anestesia para la sedación preoperatoria. Para mantener la anestesia peroperatoria, se administró una mezcla de 69 % de N²O, 29 % de O² y 2 % de isoflurano mediante el tubo endotraqueal y los animales se ventilaron con un respirador (Zoovent, Triumph Technical Services, Milton Keynes, Reino Unido). Se administró buprenorfina (0,2 mg/kg) como analgesia posoperatoria después de un MI. Las ratas se alojaron en jaulas (una o dos ratas en cada jaula) con ropa de cama Bee Kay (Scanbur BK, Nittedal, Noruega) en un 55 % de humedad en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, con pellas de comida (RM1, 801151, Scanbur BK) y agua ad libitum.

Fenotipado animal y administración de PPS en modelo de rata con infarto de miocardio

En el día 0 a 3 (mediana 2) después de la cirugía, el tamaño del infarto se cuantificó mediante ecocardiografía usando el sistema Vevo2100 (Visualsonics Inc, Canadá) y las imágenes por resonancia magnética (MRi) usando un imán de calibre horizontal de 9,4 T/210 mm/ASR. (Agilent Technologies, Inc., Estados Unidos). Inicialmente, se realizó una ecocardiografía para seleccionar infartos de moderados a grandes que oscilaban aproximadamente entre el 40 y el 50 %. A partir de entonces, los tamaños de los infartos se midieron exactamente mediante análisis de MRi de gadolinio de realce tardío (Bohl S., et al. American Journal of Physiology, 2009; 296 (4): H1200-H1208) y se estratificaron en infartos pequeños (estrato 1: <43 %, estrato 2: 43-48 %) y grandes infartos (estrato 3: 48-53 %, estrato 4: > 53 %). Las ratas en cada estrato de MI y grupo de simulación se asignaron al azar para recibir tratamiento de intervención o control. El grupo de intervención fue tratado con 6 mg/kg de PPS sódico (Interfarm AS, Noruega), mientras que el grupo de control recibió vehículo (NaCl al 0,9 %), ambos inyectados por vía subcutánea cada tres días a partir del día 8-10 posoperatorio. Las ratas se observaron diariamente y no se observaron efectos secundarios, incluida hemorragia.

Después de recibir el tratamiento con PPS o vehículo durante 51 a 56 días (media de 55 días), las ratas se sacrificaron después del examen por investigadores experimentados cegados al grupo de tratamiento. La función cardíaca in vivo se evaluó como se describió previamente con ecocardiografía (Sjaastad I, et al., J Appl Physiol octubre de 2000;89(4):1445-54) y MRi (Espe E, Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance 2013;15(1):82). A partir de entonces, se extirparon el corazón y el pulmón bajo anestesia profunda, se lavaron con solución salina y se secaron para eliminar la sangre de las cámaras cardíacas. Las cámaras del corazón se separaron mediante disección rápida, antes de dividir los ventrículos izquierdos en tejido infartado y viable. Los pulmones y el tejido cardíaco se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -70 °C hasta los análisis de ARN y proteínas.

Aislamiento de ARN, transcripción inversa y qRT-PCR

Los niveles de ARNm de las versicanasas ADAMTS ADAMTS1, -4, -5, -8 y -20 (Shiomi T, et al. Pathology International 2010;60(7):477-96), versican, agrecán, sindecan-4, metaloproteasa inhibidora de tejido (TIMP)-3, y de tipo membrana (MT)4-MMP, se cuantificaron en el ventrículo izquierdo de rata mediante qRT-PCR, como se describió previamente en el ejemplo 1.

Aislamiento fraccional de proteínas, inmunotransferencia y anticuerpos

Se extrajeron lisados de proteínas fraccionales de miocardio de ratas que se habían sometido a MI tratadas con PPS o vehículo como se describió previamente en el ejemplo 1 y Didangelos et al. (Journal of Biological Chemistry 2012 June 1;287(23):19341-5). Las concentraciones de proteína se midieron mediante transferencia Western como se describió previamente en el ejemplo 1. El anticuerpo primario usado fue un fragmento de versican que presenta el neoepítopo DPEEAE resultante de la escisión por ADAMTS 1/4 (Sandy JD et al., Journal of Biological Chemistry 2001 April 20;276(16):13372-8) (ab19345, Abcam, Cambridge, Reino Unido) y ADAMTS4 (PAI-175, Thermo Scientific, IL), y el anticuerpo secundario usado fue IgG-HRP anti-conejo de cabra (4030-05, Southern Biotech, AL), diluida en caseína al 1 % (versican DPEEAE y anticuerpo secundario) o leche en polvo desnatada al 5 % (170-6404, BioRad) (ADAMTS4). Las membranas se bloquearon en caseína al 1 % durante una hora a temperatura ambiente, se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpo primario y durante una hora a temperatura ambiente con anticuerpo secundario.

Análisis estadístico

Dependiendo de la distribución, los datos se informan como media±SEM o mediana (amplitud intercuartilo) y comparaciones entre los grupos investigados con la prueba t de Student o la prueba de Mann-Whitney. Los valores de p (bilaterales) < 0,05 se consideraron significativos. Los datos se normalizan a RPL4 y la simulación tratada con vehículo (ARNm) o simulación tratada con vehículo (proteína).

Resultados y discusión

El infarto de miocardio provocó la remodelación cardíaca e insuficiencia cardíaca

Las ratas MI tratadas con vehículo incluidas en el estudio tenían un corazón remodelado y un fenotipo defectuoso pronunciado, como se muestra por ecocardiografía, MRi y mediciones de necropsia (Tabla 3). Se encontró un mayor peso del corazón y diámetro del ventrículo izquierdo en la diástole (diámetro telediastólico por MRi y diámetro del ventrículo izquierdo en la diástole por ecocardiografía) en ratas con MI tratadas con vehículo que, en las simulaciones tratadas con vehículo, lo que demuestra hipertrofia y dilatación del ventrículo izquierdo, respectivamente (Tabla 3). Las comparaciones adicionales de simulaciones tratadas con vehículo con ratas MI tratadas con vehículo revelaron un aumento en el diámetro de la aurícula izquierda, el peso del ventrículo derecho y el peso del pulmón, lo que confirma el fenotipo de insuficiencia cardíaca de las ratas MI tratadas con vehículo.

Cambios inducidos por infarto de miocardio en ADAMTS

Después de MI, la síntesis de ARNm de las proteoglicanasas ADAMTS1, -4 y -8 aumentó, acompañada de niveles elevados de sus sustratos versican, agrecán y sindecan-4 (Figura 9). De manera similar, los niveles de proteína de la forma activa de ADAMTS4 y los fragmentos de versican DPEEAE específicos para la escisión inducida por ADAMTS, aumentaron después de MI (Figura 10), lo que respalda que la actividad mejorada de la proteoglicanasa ADAMTS tiene lugar durante la remodelación cardíaca. Curiosamente, la expresión de ARNm de MT4-MMP, que activa ADAMTS4, también aumentó después de MI (Figura 10), lo que sugiere que la regulación de MT4-MMP es una etapa reguladora en la modulación de la actividad de ADAMTS4. Estos datos se corresponden bien con nuestros hallazgos previos en ratas con bandas aórticas tratadas con PPS (Ejemplo 1), y demuestran que la regulación de la actividad de la proteoglicanasa ADAMTS se aplica al desarrollo de insuficiencia cardíaca en general, independientemente de la etiología subyacente.

Función cardíaca mejorada en ratas MI tratadas con PPS

En ratas con infartos grandes, el tratamiento con PPS condujo a una reducción sustancial de los parámetros de insuficiencia cardíaca, incluida una reducción de 1/3 en el peso pulmonar y una reducción del 10 % en el diámetro de la aurícula izquierda (Tabla 4 y Figura 11). La inhibición del desarrollo de insuficiencia cardíaca después del tratamiento con PPS se vio reforzada por una mejora en la integral de tiempo de velocidad y la velocidad sistólica máxima después del tratamiento con PPS. Además, las ratas tratadas con PPS con infartos grandes tuvieron una reducción de ~ 25 % en el peso del corazón en comparación con las ratas tratadas con el vehículo correspondiente, lo que respalda además un efecto beneficioso sobre la remodelación cardíaca.

Previamente, se ha demostrado un efecto cardioprotector de reducir el tamaño del infarto de PPS durante la isquemia/reperfusión aguda (Tanhehco EJ, et al. Journal of Cardiovascular Pharmacology 1999;34(1):153-61). Sin embargo, en nuestro estudio el tratamiento se inició tras la cicatrización completa y el adelgazamiento de la zona del infarto, sin posibilidad de afectar el tamaño del infarto. De este modo, el efecto beneficioso del tratamiento con PPS en nuestro estudio se logra al ralentizar la remodelación cardíaca y el desarrollo de insuficiencia cardíaca que se produce en respuesta a un tamaño del infarto sin cambios.

El tratamiento con PPS redujo los niveles miocárdicos de ADAMTS4 y -5

Curiosamente, los niveles de proteína ADAMTS4 activa, los niveles de ARNm de ADAMTS5 y los fragmentos de versican DPEEAE, todos disminuyeron en respuesta al tratamiento con PPS en ratas MI (Figura 10), lo que demuestra que PPS inhibe de hecho la actividad de versicanasa ADAMTS. Además, los niveles de ARNm de MT4-MMP, una enzima que activa ADAMTS4, también disminuyeron después del tratamiento con PPS, lo que indica que la regulación de esta enzima contribuye al efecto inhibidor de ADAMTS4 ejercido por PPS. El inhibidor endógeno de ADAMTS4, TIMP-3, no cambió en respuesta al tratamiento con PPS, por lo que el equilibrio entre ADAMTS4 y su inhibidor sugiere una mayor actividad. En resumen, este hallazgo indica claramente que el tratamiento con PPS en ratas MI reduce la remodelación cardíaca y el desarrollo de insuficiencia cardíaca mediante la inhibición de la actividad de proteoglicanasa ADAMTS, especialmente la actividad de versicanasa ejercida por ADAMTS4.

Tabla 3. Características de cada estrato de MI tratado con vehículo en comparación con la simulación tratada con vehículo

RV, ventrículo derecho; EDV, volumen telediastólico; LVDd, diámetro del ventrículo izquierdo en la diástole; LAD, diámetro de la aurícula izquierda, VTI, integral de tiempo de velocidad; velocidad sist. máx, velocidad sistólica máxima; NA, no aplicable

Tabla 4. Ecocardiográficos, MRi y pesos de órganos después del tratamiento con PPS en ratas con grandes infartos de miocardio

RV, ventrículo derecho; EDV, volumen telediastólico; LVDd, diámetro del ventrículo izquierdo en la diástole; LAD; diámetro de la aurícula izquierda; VTI, integral de tiempo de velocidad; velocidad sist. máx., velocidad sistólica máxima; NA, no aplicable; veh, vehículo

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor de ADAMTS4 para su uso en el tratamiento o prevención de la remodelación ventricular izquierda o la insuficiencia cardíaca crónica en un sujeto con remodelación ventricular izquierda o con insuficiencia cardíaca crónica, en el que dicho inhibidor de ADAMTS4 no es marimastat.

2. El inhibidor de ADAMTS4 para su uso en el tratamiento o prevención de la remodelación ventricular izquierda o la insuficiencia cardíaca crónica según la reivindicación 1, en el que dicho inhibidor reduce la actividad funcional de ADAMTS4, disminuyendo de este modo la cantidad de productos de escisión de versican y/o disminuyendo la cantidad de productos de escisión de agrecán.

3. El inhibidor de ADAMTS4 para su uso en el tratamiento o prevención de la remodelación ventricular izquierda o la insuficiencia cardíaca crónica según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho inhibidor es un inhibidor selectivo.

4. El inhibidor de ADAMTS4 para su uso en el tratamiento o prevención de la remodelación ventricular izquierda o la insuficiencia cardiaca crónica según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho inhibidor es pentosano

5. El inhibidor de ADAMTS4 para su uso en el tratamiento o prevención de la remodelación ventricular izquierda o la insuficiencia cardiaca crónica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho sujeto se encuentra en la fase crónica de una enfermedad o afección, preferiblemente dicho sujeto se encuentra en la fase crónica después de un infarto de miocardio.

6. El inhibidor de ADAMTS4 para su uso en el tratamiento o prevención de la remodelación ventricular izquierda o la insuficiencia cardíaca crónica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que si un sujeto ha sufrido un infarto de miocardio, dicho tratamiento o prevención se inicia al menos dos días después del infarto del miocardio.

7. El inhibidor de ADAMTS4 para su uso en el tratamiento o prevención de la remodelación ventricular izquierda o la insuficiencia cardíaca crónica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que si un sujeto ha sufrido un infarto de miocardio dicho tratamiento o prevención se inicia después de la cicatrización completa y el adelgazamiento de la zona de infarto.

8. El inhibidor de ADAMTS4 para su uso en el tratamiento o prevención de la remodelación cardíaca o la insuficiencia cardíaca crónica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho sujeto tiene factores de riesgo de desarrollo de remodelación ventricular izquierda o de insuficiencia cardiaca.

9. El inhibidor de ADAMTS4 para su uso en el tratamiento o prevención de la remodelación ventricular izquierda o la insuficiencia cardiaca crónica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho sujeto tiene signos de remodelación ventricular izquierda.

10. El inhibidor de ADAMTS4 para su uso en el tratamiento o prevención de la remodelación ventricular izquierda o la insuficiencia cardiaca crónica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho sujeto además se caracteriza por tener, o se sospecha que tiene, una afección seleccionada del grupo que consiste en cardiomiopatías, enfermedad y disfunción de las válvulas cardíacas, incluidas las enfermedades de la válvula aórtica (tales como insuficiencia de la válvula aórtica, regurgitación de la válvula aórtica y estenosis aórtica), hipertensión, hipertensión pulmonar, enfermedad cardíaca congénita, arritmias y enfermedad de las arterias coronarias, o en el que dicho sujeto ha sufrido un infarto de miocardio, preferiblemente dicho sujeto además se caracteriza por tener estenosis aórtica o dicho sujeto ha sufrido un infarto de miocardio.

11. El inhibidor de ADAMTS4 para su uso en el tratamiento o prevención de la remodelación ventricular izquierda según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en las que se trata o previene la insuficiencia cardíaca.

12. Una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de ADAMTS4 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el tratamiento o prevención de la remodelación ventricular izquierda o la insuficiencia cardíaca crónica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Un kit que comprende uno o más inhibidores de ADAMTS4 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una formulación que comprende dicho inhibidor para su uso en el tratamiento o prevención de la remodelación ventricular izquierda o la insuficiencia cardíaca crónica en un sujeto con remodelación ventricular izquierda o con insuficiencia cardíaca crónica, preferiblemente dicho inhibidor o dicho sujeto es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11.