ES2938749T3 - Terapia contra el cáncer - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a un adenovirus oncolítico modificado; una composición farmacéutica que comprende la misma; y un método para tratar el cáncer usando el mismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Terapia contra el cáncer
Campo de la invención
La invención se refiere a un adenovirus oncolítico modificado; una composición farmacéutica que comprende el mismo; y su uso en un método para tratar el cáncer.
Antecedentes de la invención
La percepción del papel de los virus oncolíticos en el tratamiento del cáncer ha cambiado radicalmente durante la última década, ya que la inmunoterapia y la estimulación del propio sistema inmunitario del paciente para dirigirlo hacia el cáncer y atacarlo, ha ganado popularidad. A principios de siglo, los virus oncolíticos se percibían como agentes activos en el tratamiento del cáncer, que actuaban únicamente a través de su capacidad inherente para lisar las células tumorales a través de la oncólisis. Recientemente, su uso como vacunas contra el cáncer ha ganado interés, y su capacidad para liberar antígenos tumorales de las células cancerosas tras la oncólisis, para activar el sistema inmunitario, se reconoce como una característica importante en el diseño de la inmunoterapia definitiva contra el cáncer.
Los adenovirus son virus altamente inmunógenos que a menudo se usan como vectores en diversos enfoques de vacunas contra enfermedades infecciosas. Es importante destacar que tienen una capacidad excepcional para sensibilizar y reforzar las respuestas inmunitarias. Además, es probable que la presencia de un adenovirus oncolítico dentro de un tumor y la muerte celular inmunógena que provoca, den forma al microambiente tumoral hostil hacia un estado más susceptible para que se produzca una inmunidad antitumoral clínicamente relevante, al provocar la expresión de inmunomoduladores de tipo TH1, tales como el IFNgamma. Sin embargo, la capacidad inmunógena de los adenovirus oncolíticos es un arma de doble filo; la inmunidad antiviral a menudo es tan intensa que anula la respuesta inmunitaria, mucho más débil, provocada contra los autoantígenos expresados por el tumor.
Las vacunas de péptidos han sido un concepto atractivo en la inmunoterapia contra el cáncer, pero la eficacia clínica de los enfoques de vacunas de péptidos tradicionales se reconoce, generalmente, como pobre. Las vacunas contra el cáncer suministran antígenos del cáncer en combinación con un adyuvante que debería proporcionar las señales inflamatorias necesarias para montar una respuesta inmunitaria antitumoral. Sin embargo, la tolerancia central y periférica, así como también el proceso de inmunoedición tras la progresión del tumor, típicamente resultan en una pérdida de reactividad de los linfocitos T que se observa in vitro al elegir los péptidos candidatos para las vacunas de péptidos. Los adyuvantes de las vacunas actuales simplemente no son lo suficientemente potentes para romper la tolerancia en el tumor inmunosuprimido, incluso si el tumor expresa los antígenos elegidos. Además, muchos enfoques de vacunas de péptidos se basan en péptidos cortos que coinciden con las secuencias mínimas exactas de los epítopos de linfocitos T CD8+ que se unen al MHC de clase I. A pesar de los resultados alentadores en modelos tumorales preclínicos, se ha demostrado que los péptidos cortos provocan tolerancia periférica sistémica en los pacientes, lo que se postula que es el resultado de la presentación de los péptidos por parte de APC no profesionales o CD inmaduras que carecen de importantes señales coestimuladoras.
La invención actual combina los dos enfoques de vacunas anteriores de una manera que aprovecha lo mejor de ambos. Una entidad física que combina un adenovirus oncolítico y antígenos del cáncer resuelve el problema de a) la diana, intensamente fuerte, específica del virus y la falta de una diana amplia específica del tumor para las células inmunitarias, b) el problema de un adyuvante débil y c) el problema de la tolerancia central provocada por las vacunas de péptidos cortos. Por tanto, la invención se refiere al adenovirus de replicación condicional recubierto con péptido (PeptiCRAd), que es una forma innovadora y única de combinar dos enfoques de inmunoterapia contra el cáncer clínicamente probados: un adenovirus oncolítico y una vacuna de péptidos. PeptiCRAd usa virus inmunógenos como portadores activos de péptidos específicos de tumores para dirigir el sistema inmunitario específicamente hacia las células cancerosas y destruirlas. Además, a diferencia de las vacunas virales oncolíticas que codifican genéticamente antígenos tumorales, el recubrimiento de un adenovirus con un péptido inmunógeno hace que la tecnología PeptiCRAd sea altamente adaptable para todos los tipos de cáncer; el mismo virus portador puede usarse para tratar todos los tipos de cáncer y la adaptación se produce simplemente mediante el recubrimiento del virus con diferentes péptidos extendidos con polilisina. Esta tecnología única utiliza la notable capacidad inmunógena del adenovirus y dirige, simultáneamente, la respuesta de los linfocitos T CD8+ al tejido tumoral.
Declaraciones de la Invención
De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un adenovirus modificado que comprende: al menos uno de los siguientes polipéptidos unidos de forma covalente o no covalente a la cápside viral sin haber sido codificado genéticamente por dicho vector adenoviral
i) VFGIELMEVDPIGHLYIFAT [SEQ ID NO:1] MAGE-A3161-180;
ii) YLAMPFATPMEAELARRSLA [SEQ ID NO:2] NY-ESO-1 91-110;
Ni) un polipéptido que es al menos 90 % idéntico al mismo; y en donde además dicho virus incluye un(os) transgén(es) que codifica(n) CD40L y/o OX40L..
En una modalidad preferida de la invención dicho adenovirus es capaz de replicarse y tener actividad lítica en las células diana.
Aún con mayor preferencia, dicho polipéptido de la parte iii) tiene una identidad del 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % con el polipéptido de las partes i) o ii).
Ventajosamente, dichos polipéptidos pueden estimular una respuesta inmunitaria específica del péptido en un sujeto y, aún más ventajosamente, porque dichos polipéptidos no han sido codificados genéticamente por dicho vector adenoviral, sino que se han unido a la cápside de forma covalente o no covalente, esta unión puede ejecutarse de forma rápida y eficiente, es decir, sin tener que esperar a que tenga lugar la replicación viral en una célula huésped. Típicamente, para facilitar la unión de al menos uno o dos o tres polipéptidos, dicho(s) polipéptido(s) se extiende(n) con polilisina mediante el uso de al menos 4, idealmente, 5, 6, 7, 8, o 9 lisinas. Lo más típico es que se usen 6 o 9 lisinas y se unen, con la máxima preferencia, al extremo amino del polipéptido.
En consecuencia, los péptidos para la unión al adenovirus son:
KKKK(KKKKK)-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT [SEQ ID NO: 7]; y/o
KKKK(KKKKK)-YLAMPFATPMEAELARRSLA[SEQ ID NO: 8]; alternativamente:
KKKKKK-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT [SEQ ID NO:4]; y/o
KKKKKK-YLAMPFATPMEAELARRSLA [SEQ ID NO:5].
En otra modalidad preferida adicional de la invención, dicho adenovirus puede ser de cualquier tipo y especie de adenovirus, por ejemplo, sin limitarse al adenovirus humano, pero el más típico es el adenovirus humano. Lo más favorable es que los adenovirus son capaces de replicarse y destruir las células cancerosas mientras desvían la respuesta inmunitaria antiviral contra el tumor, por tanto, el adenovirus modificado es competente en cuanto a la replicación y es oncolítico.
El adenovirus usado en la presente invención puede hacerse específico de un tumor con respecto a la replicación, por ejemplo, el vector adenoviral puede comprender modificaciones en los genes E1, E3, E4 y/o L3, tales como la inserción de promotores específicos del tumor, eliminación de genes y la inserción de transgenes.
Idealmente, el adenovirus es oncolítico, es decir, capaz de infectar y destruir las células cancerosas mediante la replicación selectiva en células tumorales frente a las células normales.
La estructura principal del adenovirus o vector puede ser de cualquier serotipo. En una modalidad de la invención, el serotipo de la estructura principal del adenovirus se selecciona del serotipo 3 o 5
Como se usa en la presente descripción, "estructura principal del ácido nucleico del adenovirus serotipo 5 (Ad5)" se refiere al genoma del Ad5 y "estructura principal del ácido nucleico del adenovirus serotipo 3 (Ad3)" se refiere al genoma del Ad3.
Además, el virus puede ser quimérico, por ejemplo, los vectores Ad5/3, Ad3/5 o Ad5/35. Como ejemplo, el "vector Ad5/3" se refiere a un virus quimérico que tiene partes de los vectores Ad5 y Ad3.
La "cápside" del adenovirus se refiere a la cubierta proteica del virus. La cápside consiste de varias subunidades estructurales oligoméricas llamadas protómeros, hechas de proteínas.
Con la máxima preferencia, dicho adenovirus es del serotipo 5 que se selecciona porque es óptimo para sensibilizar y reforzar una respuesta de linfocitos T; desencadena la respuesta de linfocitos T CD8+ necesaria para destruir los tumores; cualquier inmunidad preexistente contra los virus oncolíticos puede mejorar la eficacia del tratamiento intratumoral y tiene un buen historial de seguridad clínica.
En aún otra modalidad preferida adicional de la invención, dicho adenovirus se modifica adicionalmente para incluir una cualquiera o más de las siguientes características, que incluyen cualquiera y todas sus combinaciones.
Una sustitución quimérica de Ad5/3, es decir, reemplazar la región de la perilla de la fibra adenoviral de serotipo 5 con la de una región de la perilla del adenovirus de serotipo 3; esto pesto permite que el virus eluda el receptor coxsackie-adenovirus (CAR), receptor nativo del Ad5, y use, en su lugar, el receptor nativo desmogleína 2 (DSG2) del Ad3 para la internalización. La DSG2 está presente en abundancia en las células cancerosas. La infección por adenovirus comienza con el reconocimiento de los receptores de la célula huésped por medio de proteínas especializadas en la superficie viral, es decir, la proteína de la fibra del adenovirus y, en particular, el dominio globular carboxilo terminal de la proteína de la fibra del adenovirus, denominado dominio de perilla carboxilo
terminal. En consecuencia, la referencia en la presente descripción a una perilla de una proteína de la fibra del adenovirus es una referencia al dominio globular carboxilo terminal de la proteína de la fibra del adenovirus.
Una eliminación del gen E1A, en donde la eliminación es de los nucleótidos que codifican los aminoácidos 122-129 (LTCHEACF); esta eliminación es una medida de seguridad ya que la proteína E1A viral, o del vector, no puede unirse a una molécula de retinoblastoma (Rb) y liberar el factor de transcripción E2F de Rb para la transcripción del gen viral. Por tanto, el adenovirus depende de la presencia de E2F libre en una célula huésped y puede replicar su genoma en células normales en división o en células cancerosas, donde el E2F libre esté disponible constantemente. Por tanto, la modificación es relativamente protectora de las células que no se dividen y se dirige contra las células en división o cancerosas.
Eliminación parcial del gen E3 que, dado el papel inmunosupresor de este producto génico, mejora la capacidad inmunógena. Idealmente, el gen 14,7K se elimina parcial o totalmente.
En la invención, el transgén codifica dos transgenes, en donde uno de dichos genes conduce a la activación del sistema inmunitario innato y el otro conduce a la activación del sistema inmunitario adaptativo. CD40L para activar el sistema inmunitario innato mediante el uso de las APC para impulsar las respuestas de linfocitos T CD8+ y OX40L para activar el sistema inmunitario adaptativo al aumentar la expansión clonal, la supervivencia de los linfocitos T CD8+ y la formación de un gran grupo de linfocitos T de memoria. Un transgén se puede colocar, por ejemplo, en una región E3 parcial o totalmente eliminada, ya sea bajo el promotor E3 o bajo un promotor exógeno, o en una región E1 parcial o totalmente eliminada, ya sea bajo el promotor E1 o bajo un promotor exógeno o en una región L3 parcial o totalmente eliminada bajo el promotor L3 o bajo un promotor exógeno.
Con la máxima preferencia, OX40L, idealmente OX40L humano, se sitúa en la región E3B, en reemplazo a la eliminación del gen 14,7K.
También con la máxima preferencia, CD40L, idealmente CD40L humano, se inserta en la región tardía del virus, específicamente en la región tardía 3 (L3), idealmente, aguas abajo del gen 23K.
En una modalidad preferida, ambos transgenes se insertan en dicho virus, es decir, OX40L y CD40L. En la alternativa, el ADN que codifica OX40L y CD40L puede unirse e insertarse como una molécula de fusión mediante el uso de técnicas de ingeniería genética conocidas, tales como el uso de un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) o, con mayor preferencia, a través del uso de un péptido 2A de autoescisión que tiene la ventaja de ser de pequeño tamaño y tener una alta eficiencia de escisión entre genes aguas arriba y aguas abajo del péptido 2A. Típicamente, el CD40L se inserta inmediatamente aguas abajo del OX40L, pero es posible hacer funcionar la invención con la configuración inversa.
El virus utilizado en la presente invención también puede comprender otras modificaciones además de las descritas anteriormente. Opcionalmente pueden usarse componentes o modificaciones adicionales, pero no son obligatorios para la presente invención.
De lo anterior se deduce que el adenovirus de la invención se ha diseñado para estimular una respuesta inmunitaria contra el cáncer y, específicamente, en un ambiente tumoral donde, típicamente, el sistema inmunitario se ve comprometido por los mecanismos de evasión empleados por las células cancerosas.
Sorprendentemente, nuestros datos indican que la adición de los transgenes inmunoestimuladores, OX40L humano y CD40L humano, en el locus 14,7K no compromete la eficacia oncolítica de los virus de la presente invención, en comparación con el virus de estructura principal Ad5/3D24 o un virus con un transgén inmunoestimulador, por ejemplo, GM-CSF humano, en reemplazo de los genes gp19 K/7,1K eliminados. Esto es sorprendente porque los transgenes pueden afectar profundamente a la replicación del virus debido al tamaño del transgén y los efectos directos del transgén en las células infectadas. Además, la eliminación del gen 14,7K no se ha estudiado tanto como la eliminación de los genes gp19 K/7,1K y, por tanto, podría tener consecuencias inesperadas para la maquinaria replicativa del virus, especialmente en el contexto de la incorporación de transgenes en el sitio de eliminación de 14,7K.
También mostramos que el virus de la presente solicitud es capaz de producir transgenes humanos funcionales a partir del locus del gen 14,7K. Esto fue inesperado porque usamos, algo inusual, un casete de transcripción con un sitio de procesamiento viral 2A entre los dos transgenes.
Además, mostramos que el virus de la presente invención es capaz de promover una respuesta inmunitaria específica de MAGE-A3 y NYESO-1.
En consecuencia, la invención se extiende a una composición farmacéutica que comprende al menos un adenovirus modificado de la invención y un portador adecuado. En una modalidad preferida de la invención, dicha composición farmacéutica se formula para la inyección intratumoral, intramuscular, intraarterial, intravenosa, intrapleural, intravesicular, intracavitaria o peritoneal, o para administración oral.
Además, o aún alternativamente, la invención se refiere a al menos un adenovirus o composición de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento del cáncer.
Además, en la presente descripción se describe el uso de al menos un adenovirus de acuerdo con la invención en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer. En vista de que los tumores han desarrollado diversos mecanismos inmunosupresores para contrarrestar las células inmunitarias del cuerpo, la terapia también se practica en combinación con el uso de una molécula de punto de control. Las vías de puntos de control mejor caracterizadas son la proteína 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) y la vía de la proteína 1 de muerte celular programada (PD-1/PD-L1). Por tanto, el adenovirus de la invención puede utilizarse en combinación con moduladores de puntos de control tales como moléculas anti-PD1, anti-PD-L1 o anti-CTLA-4 para contrarrestar el ambiente tumoral inmunosupresor y provocar una fuerte respuesta antiinmunitaria.
El adenovirus o vector modificado actúa como un adyuvante activo porque proporciona las señales de peligro necesarias para una respuesta inmunitaria óptima contra un péptido diana, pero también, en el caso de un adenovirus o vector que se replique, conserva su capacidad para lisar las células cancerosas que infecta y replica su genoma allí. La destrucción oncolítica de células es inmunógena por naturaleza, lo que provoca cambios en el microambiente tumoral que, probablemente, fortalezcan la respuesta inmunitaria a los péptidos/tumor. Por lo tanto, el uso de nuestro adenovirus modificado: que físicamente forma un complejo con péptidos largos (20 aminoácidos sin la cola de polilisina) resulta en una respuesta inmunitaria antitumoral superior en comparación con las vacunas de péptidos o las vacunas oncolíticas por sí solas.
Con la máxima preferencia, el cáncer al que se hace referencia en la presente descripción incluye uno o más de los siguientes tipos de cáncer: cáncer de nasofaringe, cáncer sinovial, carcinoma hepatocelular, cáncer renal, cáncer de tejidos conectivos, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de intestino, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer colorrectal, cáncer de cerebro, cáncer de garganta, cáncer oral, cáncer de hígado, cáncer de huesos, cáncer de páncreas, coriocarcinoma, gastrinoma, feocromocitoma, prolactinoma, leucemia/linfoma de linfocitos T, neuroma, enfermedad de von Hippel-Lindau, síndrome de Zollinger-Ellison, cáncer de la glándula suprarrenal, cáncer anal, cáncer de las vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de uréter, oligodendroglioma, neuroblastoma, meningioma, tumor de la médula espinal, osteocondroma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, cáncer de sitio primario desconocido, tumor carcinoide, tumor carcinoide gastrointestinal, fibrosarcoma, cáncer de mama, enfermedad de Paget, cáncer de cuello uterino, cáncer, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, cáncer de cabeza, cáncer de ojo, cáncer de cuello, cáncer de riñón, tumor de Wilms, cáncer de hígado, sarcoma de Kaposi, cáncer de próstata, cáncer testicular, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de piel, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer pancréatico endocrino, glucagonoma, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de hipófisis, sarcoma de tejidos blandos, retinoblastoma, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer trofoblástico, mola hidatiforme, cáncer de útero, cáncer de endometrio, cáncer de vagina, cáncer de vulva, neuroma acústico, micosis fungoides, insulinoma, síndrome carcinoide, somatostatinoma, cáncer de encías, cáncer de corazón, cáncer de labios, cáncer de meninges, cáncer de boca, cáncer de nervios, cáncer de paladar, cáncer de glándula parótida, cáncer de peritoneo, cáncer de faringe, cáncer de pleura, cáncer de glándula salival, cáncer de lengua y cáncer de amígdalas.
En las reivindicaciones que siguen y en la descripción anterior de la invención, excepto cuando el contexto lo requiera de cualquier otra manera debido al lenguaje expreso o la implicación necesaria, la palabra “comprende” o variaciones tales como "comprende", o "que comprende" se usa en un sentido inclusivo, es decir, para especificar la presencia de las características indicadas pero no para excluir la presencia o la adición de características adicionales en diversas modalidades de la invención.
A través de toda la descripción y las reivindicaciones de esta descripción, el singular abarca el plural, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera. En particular, cuando se usa el artículo indefinido, se entiende que la descripción contempla la pluralidad, así como también los singulares, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera.
Una modalidad de la presente invención ahora se describirá a manera de ejemplo solo con referencia a las siguientes figuras, en donde:
La Figura 1 muestra una representación esquemática de un adenovirus modificado según la invención. Específicamente, un adenovirus Ad5 se modifica para incluir una proteína de la perilla de serotipo 3, es decir, perilla de Ad3 y, a través del uso de colas de polilisina, al menos uno e idealmente los dos o tres polipéptidos de la invención se unen a la cápside viral. Estos polipéptidos no forman parte del genoma viral, sino que se unen de forma covalente o no covalente a la cápside. Denominada en la presente descripción como PeptiCRAd-1, esta innovación aprovecha, por tanto, todas las ramas principales del sistema inmunitario, para atacar el cáncer. La Figura 2 muestra los dos péptidos seleccionados. Ellos no se unen directamente a las moléculas del MHC de clase I, sino que requieren que las APC procesen el antígeno para presentarse. Por lo tanto, los péptidos no pueden unirse a las moléculas del MHC de clase I en las APC no profesionales y, por lo tanto, no provocan la activación transitoria y la subsiguiente anergia de los linfocitos T CD8+. Solo las APC profesionales activadas
(que pueden recibir coestimulación adicional a partir del CD40L codificado por el virus, cuando esté presente en el adenovirus modificado adicionalmente) pueden presentar estos péptidos a los linfocitos T, lo que conduce a una activación y proliferación robustas de los linfocitos T CD8+ específicos del péptido (la coestimulación adicional y la respuesta mejorada de los linfocitos T de memoria se proporcionan a partir del OX40L codificado por el virus, cuando esté presente en el adenovirus modificado adicionalmente).
La Figura 3 muestra que una cola de polilisina en el extremo N de los péptidos de la Figura 2 no cambia las propiedades inmunológicas de los péptidos en comparación con los péptidos no modificados, usados clínicamente, con capacidad de activación inmunitaria conocida en pacientes con cáncer.
La Figura 4 muestra el diámetro hidrodinámico promedio de ambos complejos péptido-virus NY-ESO-1 en agua y sal fisiológica con diferentes concentraciones del péptido.
La Figura 5 muestra la frecuencia de linfocitos T en tumores tratados y contralaterales no tratados cuando se tratan con virus modificado recubierto con los péptidos NYESO-1 y MAGE-A3 de acuerdo con la invención que comprende una cápside 5/3 que contiene virus que expresan OX40L y CD40L (PeptiCRAd-1) o el mismo virus sin el recubrimiento con el péptido NYESO-1 y MAGE-A3 (VALO-C1) o el péptido solo. El número de linfocitos T CD3+ (A), linfocitos T CD4+ (B) y linfocitos T CD8+ (C) se representa como células por gramo de tejido tumoral en cada grupo de tratamiento. Los tratamientos resultaron en frecuencias de linfocitos T más altas en todos los grupos en comparación con el tratamiento de control. Los números más altos se observaron en los tumores tratados con VALO-C1 o PeptiCRAd.
La Figura 6 muestra la frecuencia de todas las células inmunitarias (células CD45+) en tumores tratados y contralaterales no tratados cuando se tratan con PeptiCRAd-1 o el mismo virus sin el recubrimiento con el péptido (VALO-C1) o con el péptido solo. Las frecuencias fueron similares en todos los grupos, con un número algo más bajo en los animales tratados con el control.
La Figura 7 muestra que los tratamientos con PeptiCRAd y VALO-C1 disminuyen el porcentaje de linfocitos T reguladores de todos los TIL en los tumores tratados.
La Figura 8 muestra el porcentaje de linfocitos T CD8+ específicos de NY-ESO-1-(A) y de MAGE-A3 (B) en el hematoma cuando se trata con PeptiCRAd-1 o el mismo virus sin el recubrimiento con el péptido (VALO-C1) o el péptido solo. El porcentaje se calcula a partir de todos los linfocitos T CD8+ por 1 ml de sangre. El tratamiento con PeptiCRAd resultó en el porcentaje más alto de linfocitos T CD8+ específicos de NY-ESO-I, y tanto el tratamiento con VALO-C1 como con PeptiCRAd resultó en un porcentaje más alto de linfocitos específicos de MAGE-A3 en comparación con los animales tratados con el péptido o con el control.
La Figura 9 muestra el porcentaje de linfocitos T CD8+ específicos de NY-ESO-1- o de MAGE-A3 en tumores tratados o contralaterales no tratados, cuando se tratan con PeptiCRAd-1 o el mismo virus sin el recubrimiento con el péptido (VALO-C1) o el péptido solo. El porcentaje se calcula a partir de todos los linfocitos T CD8+ por gramo de tejido tumoral. VALO-C1 y PeptiCRAd son igualmente efectivos en el reclutamiento de TIL CD8+ específicos del péptido, a los tumores.
La Figura 10 muestra que PeptiCRAd recubierto con las proteínas NY-ESO-1 y MAGE-A3 es capaz de detener el crecimiento tumoral en un modelo de melanoma de ratón humanizado incluso si el tratamiento comienza en tumores grandes y bien establecidos. Diseño experimental: Se implantaron 2*10® células SK-MEL-2 por vía subcutánea (un tumor por animal) en el flanco de ratones inmunodeficientes NOD/Shi-scid/IL-2Rynull el día 1. El día 13, se inyectaron 5*10® PBMC se por vía intravenosa. El día 16, se inyectaron 5*104 células dendríticas plasmocitoides y mieloides por vía intratumoral. Los tratamientos intratumorales con PeptiCRAd a dosis de 1*109 VP se administraron los días 1®, 17, 18 (sensibilización) y el día 25 (refuerzo). La primera dosis de PeptiCRad se administró inmediatamente después de la inyección de las CD. Se siguió el crecimiento del tumor. Los animales se sacrificaron en el día 32. PeptiCRAd = Ad5/3-D24-OX40L-CD40L, un adenovirus oncolítico con una eliminación de 24 pb en E1A, una cápside quimérica 5/3 y transgenes CD40L y OX40L expresados a partir del locus 14,7K, recubierto con los péptidos NY-ESO-1 y MAGE-A3; OX40L PeptiCRAd = Ad5/3-D24-OX40L, un adenovirus oncolítico con una eliminación de 24 pb en E1A, una cápside quimérica 5/3 y un transgén OX40L expresado a partir del locus 14,7K, recubierto con los péptidos NY-ESO-1 y MAGE-A3.
La Figura 11 muestra que OX40L-PeptiCRAd aumentó el número de linfocitos T CD8+ específicos de MAGE-A3 en sangre periférica en comparación con los animales tratados con el control. Dos animales tratados con PeptiCRAd también mostraron un aumento en el número de linfocitos T CD8+ específicos de MAGE-A3 en la sangre. Los linfocitos T anti-MAGE-A3 se evaluaron mediante citometría de flujo (análisis de pentámero) al final del estudio de crecimiento tumoral mencionado anteriormente el día 32.
Figura 12 A) Tres respuestas SPR separadas durante la preparación del AdV diluido en agua estéril e inmovilización en el sensor de APTES mediante el uso de agua estéril como tampón de corrida. C = ~1,93*1011 VP/ml. B) Respuestas SPR con 3 recubrimientos con péptidos diferentes:
®
PEP1455 = KKKKKKVFGIELMEVDPIGHLYIFAT (SEQ ID NO: 4); PEP1456 = KKKKKKKKK-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT (SEQ ID NO: 7); PEP1508 = KKKKKKYLAMPFATPMEAELARRSLA (SEQ ID NO: 5). Se permitió que las soluciones madre (5 mg/ml en agua estéril) con concentraciones crecientes interactuaran con las partículas de AdV inmovilizadas. Se usó agua estéril como tampón de corrida. Las flechas indican los puntos de tiempo de la inyección de la muestra de péptido con la concentración correspondiente y las estrellas indican el punto de tiempo en el que comienza el enjuague con el tampón de corrida. Los valores Amáx y Amín marcados en la figura corresponden a las respuestas SPR usadas para calcular el número de péptidos que interactúan por partícula viral para cada situación (péptido presente en 100 pM en solución, Amáx, y sin péptido presente en solución, (Amín)
Figura 13 respuestas SPR cuando se permitió que concentraciones crecientes de muestras de recubrimientos con péptidos PEP1455, PEP1456 y PEP1508 diluidas en tampón A195 interactuaran con las partículas de AdV inmovilizadas. Las flechas indican el punto de tiempo de la inyección de la muestra de péptido con la concentración correspondiente y las estrellas indican el punto de tiempo en el que comienza el enjuague con el tampón de corrida (medio A195). Los valores Amáx y Amín marcados en la figura corresponden a las respuestas de SPR usadas para calcular el número de péptidos que interactúan por partícula viral en cada situación (péptido presente en 100 pM en solución, Amáx y sin péptido presente en solución, Amín). Los subíndices "mín, med" y "máx, med" se refieren al valor de la mediana de dos mediciones separadas calculadas a partir de las mediciones correspondientes.
Materiales y métodos
Péptidos:
Los péptidos se seleccionaron con contraión acetato, que es una forma de sal adecuada para pacientes humanos. Los péptidos se fabricaron por PepScan.
Los péptidos específicos destinados al uso clínico en PeptiCRAd son de:
- Proteína MAGE-A3 (aminoácidos 161-180, secuencia KKKKKK(KKK)-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT), péptidos de 20 unidades con una cola de 6 (SEQ ID NO: 4) o 9 (SEQ ID NO: 7) lisinas que se extiende desde el extremo amino
- Proteína NY-ESO-1 (aminoácidos 91-110, secuencia KKKKKK(KKK)-YLAMPFATPMEAELARRSLA), péptidos de 20 unidades con una cola de 6 (SEQ ID NO: 5) o 9 (SEQ ID NO: 8) lisinas que se extiende desde el extremo amino
- Proteína NY-ESO-1 (aminoácidos 81-100, secuencia KKKKKK(KKK)-RGPESRLLEFYLAMPFATPM), péptidos de 20 unidades con una cola de 6 (SEQ ID NO: 6) o 9 (SEQ ID NO: 9) lisinas que se extiende desde el extremo amino
Adenovirus usado en las preparaciones de PeptiCRAd:
Adenovirus delta 24, virus de serotipo 5 con una perilla modificada del adenovirus de serotipo 3 (AdV 5/3). Este virus modelo no es exactamente el virus destinado al uso clínico, pero tiene una cápside viral idéntica. La diferencia entre el virus modelo y el virus clínico es que el virus clínico incluirá, idealmente, insertos genéticos que codifican para CD40L y OX40L, que no contribuyen a la cápside viral ni a los atributos estudiados en la presente descripción. Formación del complejo PeptiCRAd:
Los péptidos individuales se diluyeron en agua o solución salina al 0,5 % para alcanzar una concentración de reserva del péptido de 5 pg/pl. La reserva de virus, en tampón A195 (1,45E+12 VP/ml), se diluyó en agua para alcanzar una concentración de 1E+9 VP/pl. El complejo virus - péptido se preparó al mezclar 1 o 3 pl de dilución de virus (equivalente a 1E+9 o 3E+9 VP) con un volumen variable de péptido(s) para alcanzar una relación diana de péptido a virus.
(PeptiCRAd, péptidos individuales); dos alícuotas individuales de virus se recubrieron por separado con péptidos únicos. Estos dos PeptiCRAd separados recubiertos con un péptido único (complejo NY-ESO-1 y complejo MAGE-A3) se combinan luego inmediatamente antes de la inyección en el tumor. Los virus recubiertos por separado también pueden administrarse como inyecciones separadas. Alternativamente, los péptidos NY-ESO-1 y MAGE-A3 se mezclan primero y esta mezcla de péptidos se usa luego para la formación del complejo PeptiCRAd.
Mediciones del zetasizer para el tamaño y la carga del complejo:
Las mediciones del zetasizer se realizaron inmediatamente después de la formación del complejo, 15 minutos después de mezclar los componentes o después de dejar que el complejo permaneciera a temperatura ambiente (TA) durante aproximadamente 1,5 horas. Primero se diluyeron los complejos virus-péptido mediante la adición de 700 |jl de agua a las muestras y luego se transfirieron a la cubeta de medición. Se midió el diámetro hidrodinámico (nm) seguido de la medición del potencial zeta (mV). Estos parámetros se midieron tres veces y se registraron el tamaño promedio y el potencial zeta.
Potencia inmunológica de los péptidos PeptiCRAd-1:
Se estimularon previamente linfocitos T CD8+ de pacientes con melanoma con actividades conocidas de linfocitos T NY-ESO-1 y MAGE-A3 con péptidos no modificados (SEQ ID NO: 2 NY-ESO-1 91-110: YLAMPFATPMEAELARRSLA o SEQ ID NO: 1 MAGE-A3 161-180: VFGIELMEVDPIGHLYIFAT). El reconocimiento de los péptidos extendidos con polilisina (SEQ ID NO: 5 NY-ESO-1 91-110: KKKKKKYLAMPFATPMEAELARRSLA o SEQ ID NO: 4 MAGE-A3161-180: KKKKKKVFGIELMEVDPIGHLYIFAT) se estudió mediante el método estándar de ELISPOT IFN-gamma. En los experimentos se usó el siguiente protocolo de ELISPOT: Los linfocitos T CD4+/CD8+ purificados, con una columna de separación celular MACS® (Miltenyi Biotech, Lund, Suecia), se sensibilizaron previamente con PBMC autólogas irradiadas estimuladas con péptidos (10 jg/ml) empobrecidas en linfocitos T CD4+ y CD8+ (25000 células/pocillo). Los linfocitos T CD4+/CD8+ sensibilizados previamente se probaron los días 10-12 en el ensayo ELISPOT IFNy para el reconocimiento de células presentadoras de antígeno autólogas estimuladas con péptidos (1 jg/ml) (linfocitos B o CD transformados con EBV). Después de 16 horas de incubación (37 °C), se evaluó el número de linfocitos T específicos de antígeno productores de citocinas, mediante el uso de AID EliSpot Reader Classic ELR 07 (Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Alemania).
Inmunización in vivo
Se humanizaron ratones inmunodeficientes NOD/Shi-scid/IL-2Rynull mediante el uso de células madre hematopoyéticas (CD34+, HLA-B35+) aisladas de sangre de cordón umbilical humano. Se implantaron por vía subcutánea tumores de melanoma humano A375 (2 x 106 células por 100 jl) y los animales se aleatorizaron en grupos en base a la tasa de humanización y el tamaño del tumor. Los animales se trataron con PeptiCRAd-1 o con el mismo virus sin el recubrimiento con el péptido (VALO-C1) (dosis de virus 1 x 108 para ambos grupos; también se probó una dosis de 1 x 107, inferior a la óptima, para PeptiCRAd). Las vacunas de péptidos (0,12 o 30 jg ) se administraron por vía intradérmica con Poli-IC como adyuvante.
Los tratamientos comenzaron 25 días después de la aleatorización (D0) con una dosis en bolo de ciclofosfamida (1 mg/ratón iv). Los tratamientos se administraron por vía intratumoral (control, virus y PeptiCRAd) o por vía intradérmica (control de péptido) los días 1, 2, 3 y 12. Los tumores secundarios se implantaron en el flanco contralateral dos días después del tercer tratamiento (día 5). No se administraron tratamientos para tumores secundarios.
Se analizaron las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y los linfocitos CD8+ infiltrantes de tumor (TIL) para determinar los linfocitos T CD8+ específicos de NY-eSo -1 YLAMPFATPMEAELARRSLA SEQ ID NO: 2 y MAGE-A3 VFGIELMEVDPIGHLYIFAT SeQ ID NO: 1, mediante citometría de flujo con análisis con Dextramer. Se evaluaron diferentes subconjuntos de células inmunitarias entre PBMC y TIL. El análisis de citometría de flujo se realizó en el citómetro de flujo Attune NxT (Life Technologies).
Inmunización del modelo de ratón de PBMC
A 35 ratones inmunodeficientes NOD-Prkdcem26Cd52/IL-2Ry em26Cd22/NjuCrl (NCG) de ocho semanas de edad se les injertaron 2,106células tumorales SKMEL-2 (HLA-B35+) en el flanco derecho (Día 0). El día 13, se inyectaron por vía intravenosa 5x106 células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) HLA-B35+ de dos donantes diferentes. Los tratamientos intratumorales con NYESO-1 (s Eq ID NO: 2) y MAGE-A3 (SEQ ID NO: 1) -que forman complejos con la cápside 5/3 y que contienen virus que expresan OX40L ("OX40L PeptiCRAd") o con NYESO-1 (SeQ iD NO: NO: 2) y MAGE-A3 (SEQ ID NO: 1) - que forman complejos con la cápside 5/3 que contiene virus que expresan OX40L y CD40L ("PeptiCRAd") - se iniciaron el día 16 con una dosis de virus de 1x109 VP que forman complejos con cada péptido. Simultáneamente con el primer tratamiento con PeptiCRAd, se inyectaron por vía intratumoral 50000 células dendríticas plasmacitoides y mieloides autólogas. Los días 17, 18 (sensibilización con el primer tratamiento) y 25 (refuerzo), los tumores se trataron con inyecciones intratumorales de PeptiCRAd sin adición de células dendríticas. El esquema de tratamiento se presenta en la Figura 10. Se siguió el crecimiento del tumor. Los animales se sacrificaron en el día 32. OX40L-PeptiCRAd y PeptiCRad contienen una eliminación de 24 pb en E1A, una región gp19k/7,1K eliminada, un transgén OX40L humano expresado a partir del locus 14,7K y una fibra quimérica 5/3.
Formación de complejos virus-péptidos
La inmovilización de las partículas virales y las interacciones entre los recubrimientos con péptidos y las partículas virales inmovilizadas en las superficies del sensor de sílice funcionalizado con APTES se midieron con un
instrumento de resonancia de plasmón de superficie multiparamétrica (SPR) equipado con un canal de flujo de polidimetilsiloxano (PDMS) de 2 canales y un montaje de muestreador automático de placa de 96 pocillos (MP-SPR 220A). Los recubrimientos con péptidos fueron los siguientes: PEP1455 = KKKKKK-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT (SEQ ID NO: 4); PEP1456 = KKKKKKKKK-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT (SEQ ID NO: 7); PEP1508 = KKKKKK-YLAMPFATPMEAELARRSLA (SEQ ID NO: 5). La temperatura, la velocidad de flujo y la longitud de onda del láser usadas para todas las mediciones de SPR fueron 20 °C, 20 pl/min y 680 nm, respectivamente.
Para las mediciones en agua, un adenovirus con una fibra quimérica 5/3 (~1,93x1011 VP/ml) diluido en agua estéril se inmovilizó durante 12 min en el sensor de APTES y se hicieron mediciones por triplicado para cada muestra. También se usó agua estéril como tampón de corrida. Para las mediciones en tampón A195, el adenovirus se diluyó primero en PBS y se inmovilizó durante 12 min en el sensor de APTES. Después de la inmovilización, se reemplazó el PBS por A195 como tampón de corrida y las mediciones se hicieron por triplicado.
Para las mediciones en agua estéril, se prepararon soluciones madre de péptidos al disolver 5 mg de péptido en 1 ml de agua (5 mg/ml), lo que resultó en las concentraciones correspondientes de 1,65 mM para 6K-MAGE-A3 (PEP1455), 1,46 mM para 9K- MAGE-A3 (PEP1456) y 1,66 mM para 6K-NYESO (PEP1508). Las muestras de péptidos se inyectaron secuencialmente en concentraciones crecientes durante 6 minutos, seguido de un período de enjuague de 8 minutos con el tampón de corrida entre cada concentración de la muestra. Las concentraciones de péptido usadas fueron 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 y 100 pM.
Para las mediciones en tampón A195, se prepararon soluciones madre de péptidos al disolver 340 pg de los péptidos correspondientes en medios A195 para formar soluciones de muestra a 100 pM, que luego se usaron como reserva para preparar soluciones de muestra de péptidos con concentraciones más bajas. Las muestras de péptidos se inyectaron secuencialmente en concentraciones crecientes durante 10 minutos, seguido de un período de enjuague de 15 minutos con el tampón de corrida entre cada concentración de la muestra. Las concentraciones de péptido usadas fueron 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 y 100 pM.
Los cálculos para estimar el número de péptidos unidos por partícula viral se basaron en la utilización de cálculos geométricos del número estimado de partículas virales inmovilizadas en la superficie del sensor SPR y el número máximo de péptidos adsorbidos determinado por las mediciones de SPR.
Resultados y discusión
Efecto de la carga neta del péptido en la formación de complejos
El péptido MAGE-A3 tiene una carga neta de -3, 9 sin una cola de lisina. Los tres aminoácidos ácidos que generan las cargas negativas se ubican cerca del extremo amino (aminoácidos 5, 8 y 10). Investigamos si la carga neta negativa del péptido debe compensarse con una cola de lisina positiva más larga (9 en lugar de 6 lisinas) para lograr la unión apropiada de los péptidos en la superficie del virus. El efecto de la longitud de la cola de lisina sobre la formación del complejo y la estabilidad del complejo se evaluó mediante la determinación del potencial zeta y el tamaño promedio del complejo de las muestras de virus recubiertas con péptido que contenían 1E+9 partículas virales que forman complejos con 20 o 40 pg de cualquiera de los péptidos. Las mediciones del zetasizer se realizaron inmediatamente después de la formación del complejo, 15 minutos después de mezclar los componentes y después de dejar que el complejo permaneciera a temperatura ambiente (TA) durante aproximadamente 1,5 horas. Los resultados se presentan en la tabla 1.
Los resultados de tamaño y potencial zeta muestran que los complejos con el péptido MAGE-A3 se forman independientemente de la longitud de la cola de lisina, lo que sugiere que los aminoácidos cargados negativamente, al menos en la posición específica de la cadena peptídica, no comprometen la formación de complejos. La cola de lisina más larga dio complejos con un tamaño aproximadamente un 10 % más grande y un potencial zeta un poco más bajo que el péptido correspondiente con la cola de lisina más corta. En base al tamaño de los complejos de muestras recién preparadas y después de mantener las muestras durante 1,5 horas a TA, los complejos con cualquiera de las colas de lisina eran estables. En complejos recién preparados, el tamaño no se vio afectado por la cantidad de péptido usado en la formación del complejo, pero en las muestras mantenidas durante 1,5 horas, los resultados son un poco incoherentes. En conclusión, se decidió usar péptidos con una cola de seis lisinas en estudios subsiguientes con el zetasizer.
Efecto de la relación péptido 6K-MAGE-A3 a virus sobre el tamaño y el potencial zeta de los complejos
Se prepararon relaciones de péptido a partículas virales de 15, 30, 45 y 60 pg de péptido por 3E+9 partículas virales para evaluar el efecto de la relación en la formación y estabilidad del complejo (complejos recién preparados frente a complejos mantenidos a TA durante 2 horas) en base a la determinación del tamaño y el potencial zeta de los complejos.
Los resultados de la tabla 2 muestran una tendencia a que, cuanto más baja es la relación de péptido a virus dentro del intervalo probado, más pequeño es el tamaño del complejo, lo que sugiere que podría determinarse una relación
óptima que resulte en complejos de péptido-virus compuestos por un único virus o compuestos por pequeños agregados formados por un par de virus. Los complejos también fueron bastante estables al menos durante dos horas con un potencial zeta de alrededor de 30 mV.
Se intentó determinar la relación óptima de péptido a virus con el péptido 6K-MAGE-A3 como se indica en la tabla 3. Los resultados del tamaño del complejo sugieren que tan solo 1 - 5 |jg de péptido 6K-MAGE-A3 por 3E+9 partículas virales que equivalgan a un intervalo de relación molar de 6,6E+4 a 3,3E+5 resultan en un complejo estable. Pero con una relación más baja, los complejos tienden a agregarse.
Efecto del recubrimiento del virus con el péptido 6K-MAGE-A3 sobre la infectividad
La capacidad del virus que forma complejos para infectar células tumorales es un aspecto importante del mecanismo de acción de PeptiCRAd. Es por eso que se evaluó el efecto del recubrimiento con péptidos sobre la infectividad del virus mediante la preparación de complejos con diferentes relaciones de péptido a virus y mediante la determinación de la infectividad del complejo en células A549 en base a un ensayo inmunocitoquímico (ICC). Los resultados de la tabla 4 muestran que al usar una relación de péptido a virus relevante de aproximadamente 1 jg, se conserva el 62 % de la infectividad de la muestra que solo contiene virus, lo que sugiere que el recubrimiento del virus no afecta radicalmente la infectividad.
Estabilidad de 6K-MAGE-A3-PeptiCRAd a diferentes temperaturas
Para evaluar la estabilidad de 6K-MAGE-A3-PeptiCRAd a diferentes temperaturas, se prepararon complejos al mezclar 15 o 30 jg de péptido 6K-MAGE-A3 por 3E+9 VP y almacenar las muestras en diferentes condiciones. La estabilidad se probó mediante el zetasizer a partir de muestras almacenadas a TA, 5, -20, -80 °C durante 18-20 horas. Los resultados se presentan en la tabla 5. El diámetro hidrodinámico promedio se mantuvo bastante estable durante el almacenamiento a diferentes temperaturas y osciló entre 165 nm y 276 nm, lo que sugiere que no se produjo una agregación considerable a ninguna de las temperaturas probadas. El potencial zeta estuvo por encima del nivel de 30 mV en cada muestra, lo que indica una buena estabilidad. El tamaño de partícula más pequeño se obtuvo después del almacenamiento a -20 °C, pero también el almacenamiento a 4 °C pareció ser favorable para evitar la agregación.
Efecto de la relación del péptido 6K-NY-ESO-1 (p81-100) a virus sobre el tamaño y el potencial zeta de complejos preparados en agua
Otro péptido clínicamente interesante, el péptido NY-ESO-1, se estudió en términos de atributos de formación de complejos, tamaño y potencial zeta, determinados por mediciones del zetasizer. Los resultados se presentan en la tabla 6 a. Con respecto al tamaño del complejo, este péptido en particular parecía seguir una curva similar a una onda sinusoidal, que comenzaba desde un tamaño de complejo más pequeño en una relación pequeña de péptido a virus, después un aumento en el tamaño del complejo a medida que la relación aumenta y alcanza un máximo local en 1 jg de péptido, después de lo cual el tamaño del complejo comienza a disminuir hasta 60 jg, donde el tamaño del complejo alcanza un mínimo de 180 nm. Con respecto a la estabilidad del complejo, los resultados del potencial zeta sugieren que una relación de péptido a virus más alta, es favorable en comparación con 6K-MAGE-A3. El péptido NY-ESO-1 tiene una carga nativa de - 1 con dos aminoácidos negativos y dos positivos cerca del extremo amino (los ácidos en las posiciones 4 y 9 y el básico en las posiciones 1 y 6 de la secuencia peptídica). El resto de la secuencia de NY-ESO-1 es bastante hidrófoba, como también es el caso del péptido MAGE-A3.
Efecto de la relación del péptido 6K-NY-ESO-1 (p91-110) a virus sobre el tamaño y el potencial zeta de complejos preparados en agua
El péptido 6K-NY-ESO-1 (p91-110) también se estudió en términos de atributos de formación de complejos, tamaño y potencial zeta, determinados por mediciones del zetasizer. Los resultados se presentan en la tabla 6 b. Con respecto al tamaño del complejo, el intervalo de péptidos de 0,5 a 1 jg resulta en un complejo agregado solo moderadamente, lo que sugiere que la relación óptima con este péptido se encuentra entre 1 y 5 jg por 3E+9 VP. Los valores de potencial zeta correspondientes se mantienen cerca de cero, lo que sugiere que la estabilidad del complejo podría no ser óptima, con tendencia a la agregación.
El péptido NY-ESO-1 (p91-110) tiene una carga nativa de - 1 con dos aminoácidos negativos y dos positivos cerca del extremo carboxilo (los ácidos en la posición 11 y 13 y los básicos en la posición 16 y 17 de la secuencia peptídica). El resto de la secuencia de NY-ESO-1 es bastante hidrófoba. La ubicación de las cargas positivas cerca del extremo C podría permitir también la unión del extremo C a la superficie del virus.
PeptiCRAd recubierto con los péptidos 6K-MAGE-A3- y 6K-NY-ESO-1
Ambos péptidos clínicamente interesantes, péptidos NY-ESO-1- y MAGE-A3, se estudiaron como mezclas en términos de atributos de formación de complejos en base a las mediciones del zetasizer. Los complejos se prepararon tanto en agua como en NaCl fisiológico (0,9 %). Los resultados se muestran en la tabla 7 a y b. El
tamaño promedio del complejo preparado al mezclar cantidades iguales de cada péptido con el virus fue más grande que el tamaño promedio de un complejo preparado con el péptido 6K-MAGE-A3 solo y más pequeño que el tamaño de un complejo preparado con el péptido 6K-NY-ESO-1 (p81-100) solo. El tamaño promedio de menos de 300 nm sugiere que solo se produjo una agregación moderada durante la formación del complejo. El complejo podría prepararse tanto en agua como en NaCl al 0,9 %, con tamaños del complejo comparables.
El tamaño promedio de un complejo preparado al mezclar cantidades iguales de los péptidos 6K-MAGE-A3 y 6K-NY-ESO-1 (p91-110) con el virus, fue más grande que el tamaño promedio de un complejo preparado con los péptidos 6K-MAGE-A3 y 6K-NY-ESO-1 (p81-100). En agua, la diferencia del tamaño promedio de los complejos fue de alrededor de 1,8 veces, pero se redujo a 1,3 veces en NaCl fisiológico. El tamaño promedio de 400 - 500 nm sugiere que solo se produjo una agregación moderada durante la formación del complejo.
Efecto de la relación del péptido NY-ESO-1 a virus sobre el tamaño y el potencial zeta de complejos preparados en NaCl fisiológico.
Debido a que los resultados de tamaño del zetasizer de los complejos formados con el péptido NY-ESO-1 (p81 -100) en agua sugirieron un comportamiento similar al de una función seno, en función de la concentración del péptido, nosotros estudiamos si la etapa de formación del complejo en una solución salina fisiológica evitaría posibles interacciones inespecíficas. Los resultados se presentan en la tabla 8a. Los resultados muestran que el tamaño del complejo en función de una concentración creciente del péptido, siguió una tendencia bastante similar a la del complejo preparado en agua. El tamaño del complejo fue más grande pero, de todos modos, bastante consistente con la relación de péptido a virus en el intervalo de 5 |jg a 60 |jg. Los resultados sugieren que podría encontrarse una relación óptima de péptido a virus en el intervalo de 1 a 5 jg por 3E+9 VP.
Los resultados de tamaño promedio del zetasizer de los complejos formados con el péptido NY-ESO-1 (p91 - 110) en agua sugirieron un aumento de la agregación con relaciones de péptido a virus más altas que 1 jg, lo que resultó en un tamaño del complejo más grande que 3000 nm. Estudiamos si la etapa de formación del complejo en solución salina fisiológica evitaría la agregación. Los resultados se presentan en la tabla 8 b y muestran que el tamaño del complejo en función de una concentración creciente del péptido fue bastante constante dentro de un intervalo de 200 - 400 nm. Por tanto, el NaCl fisiológico en la fase líquida durante la formación del complejo podría evitar la agregación de manera bastante radical, como puede observarse en la figura 1 que presenta datos de los complejos péptido NY-ESO-1-virus en agua y sal fisiológica. Con relaciones de péptido a virus relevantes de 1-5 jg por 3E+9 VP, el tamaño del complejo permaneció dentro de 217-245 nm.
Potencia inmunológica de los péptidos PeptiCRAd-1
Los péptidos NY-ESO-1 y MAGE-A3 extendidos con polilisina desencadenan la producción de IFN-gamma en linfocitos T CD8+ específicos de antígeno derivados de pacientes con cáncer, tras la estimulación in vitro, tan efectivamente como los péptidos no modificados (Figura 3), lo que indica que la modificación con polilisina no afecta la función.
PeptiCRAd promueve una respuesta inmunitaria específica del péptido en un modelo de ratón humanizado Todos los tratamientos activos (péptido solo, virus sin recubrimiento con péptido [VALO-C1] y virus con recubrimiento con los péptidos NY-ESO-1 y MAGE-A3 [PeptiCRAd]) aumentaron el número de células inmunitarias en los tumores primarios en comparación con los animales tratados con el control. Los animales tratados con VALO-C1 y PeptiCRAd-1 mostraron más linfocitos T (CD3, CD4, CD8) en los tumores primarios en comparación con la vacuna de péptidos o los animales tratados con el control, después del tratamiento, mientras que el número total de células inmunitarias infiltrantes (CD45) fue similar en todos los grupos (Figuras 5 y 6, respectivamente).
Además, el número de linfocitos T reguladores (CD3+/CD4+/FoxP3+) fue más pequeño en los tumores primarios tratados con VALO-C1 y PeptiCRAd-1 en comparación con los tumores primarios de los animales tratados con la vacuna de péptidos o con el control (Figura 7). Esto sugiere que el adenovirus inmunógeno administrado por vía intratumoral (ya sea el virus desnudo VALO-C1 o PeptiCRAd-1) modula el microambiente tumoral al reducir la inmunosupresión local.
A diferencia de los animales tratados con VALO-C1, los animales tratados con PeptiCRAd-1 mostraron más linfocitos T CD4+ y CD8+ en los tumores secundarios no tratados que en los tumores primarios tratados, lo que sugiere que el direccionamiento hacia el tumor a través del recubrimiento del virus con péptidos fue de vital importancia para la inducción de un efecto en tumores distantes no tratados (Tabla 9). Además, los animales tratados con PeptiCRAd-1 tenían más linfocitos T CD8+ específicos de NYESO en la sangre después de la sensibilización (media= 4,3 % del total de linfocitos CD8+) en comparación con los animales tratados con la OV (media= 0,6 %) o los tratados con la vacuna de péptidos (media= 0,6 %) (Figura 8). La frecuencia de TIL CD8+ específicos de MAGE en animales tratados con PeptiCRAd y VALOC1 - en tumores tratados y no tratados - fue más alta que la frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos de MAGE en animales tratados con péptidos (Figura 9). Curiosamente, se observó una
frecuencia más alta de linfocitos T CD8+ específicos de MAGE en tumores tratados con VALOC1 y PeptiCRAd en comparación con los linfocitos T CD8+ específicos de NYESO-1, mientras que en la sangre ocurrió lo contrario. PeptiCRAd promueve una respuesta inmunitaria específica del péptido en un modelo de ratón de PBMC
Los tratamientos con PeptiCRAd que forma complejos con NY-ESO-1 y MAGE-A3 resultaron en la detención del crecimiento tumoral en un modelo de melanoma de ratón humanizado, incluso cuando el tratamiento comenzó en tumores grandes y bien establecidos (Figura 10). Los ratones tratados con OX40L-PeptiCRAd mostraron significativamente más linfocitos T CD8+ específicos de MAGE-A3 entre todos los linfocitos T CD8+ de las PBMC que los ratones tratados con el control, lo que indica que el tratamiento con PeptiCRAd fue capaz de promover una respuesta específica del péptido en ratones humanizados (Figura 11).
Un adenovirus con una cápside quimérica 5/3 puede formar complejos con los péptidos NY-ESO-I y MAGE-A3 en condiciones óptimas de formación de complejos
Las interacciones entre el recubrimiento con péptidos y las partículas de adenovirus (AdV) se estudiaron mediante el uso de la técnica de resonancia de plasmón de superficie (SPR). Los objetivos principales fueron 1) determinar la dinámica de unión de los péptidos NY-ESO-1 y MAGE-A3 con los virus en diferentes medios (agua estéril y medio A195, un medio de uso común para las preparaciones de virus), 2) estimar cuántas moléculas de péptido pueden unirse a una partícula viral en cada medio y 3) evaluar la estabilidad de los complejos péptido-virus. Los recubrimientos con péptidos fueron los siguientes: PEP1455 = KKKKKKVFGIELMEVDPIGHLYIFAT (SEQ ID NO: 4); PEP1456 = KKKKKKKKK-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT (SEQ ID NO: 7); PEP1508 = KKKKKKYLAMPFATPMEAELARRSLA (SEQ ID NO: 5).
La respuesta SPR para las partículas de AdV en agua estéril es de -0,7°, lo que corresponde a un 50 % de virus que cubren el área de detección (1,4° corresponde a una cobertura del 100 %) (Tabla 10), lo que da un estimado de que 5x107 partículas virales se adsorben dentro del área de detección. Cuando las partículas de AdV se corrieron en tampón A195, la respuesta SPR fue de -1,2°, lo que corresponde a una cobertura del 86 % de la superficie de detección (Figura 12). Estos resultados dan un estimado de 8,6x107 partículas virales adsorbidas dentro del área de detección. Estos resultados pueden indicar que la estructura de los virus se conserva mejor en tampón A195 que en agua estéril, o que el tampón A195 facilita la adsorción de virus a la superficie de APTES.
Los péptidos 1455 y 1508 parecen adsorberse mejor en las partículas virales inmovilizadas en agua estéril que en los medios A195 (Figuras 12B y 13). Lo contrario ocurre para el péptido 1456, que se adsorbe en las partículas virales inmovilizadas significativamente mejor en el tampón A195 que en agua. El número de péptidos adsorbidos por virus se calcula en la Tabla 10.
En base a los resultados, PEP1455 no fue completamente soluble en el tampón A195 y parece que PEP1456 es una modificación más potencial en términos de solubilidad y eficiencia de recubrimiento, a juzgar por la relación de péptido a virus en el tampón A195. Los resultados indican que los complejos de péptido-virus pueden prepararse mediante el uso de una construcción de adenovirus con una cápside quimérica 5/3 y péptidos de 6/9K en un ambiente con el tampón apropiado. Los complejos son bastante estables sin el ambiente de péptidos libre como muestran los resultados de SPR. Además, la relación de péptido a partícula viral es un factor específico de la secuencia peptídica y también depende de la presencia de condiciones óptimas para la formación del complejo. Resumen
Con los tres péptidos probados, uno 6K-MAGE-A3 y dos 6K-NY-ESO-1, el tamaño del complejo parece depender de la relación de péptido a virus y parece ser una propiedad específica del péptido que debe determinarse para cada péptido y cada combinación de péptidos y virus. La agregación y las posibles interacciones inespecíficas durante la formación del complejo pueden evitarse hasta cierto punto mediante la preparación del complejo en solución salina fisiológica en lugar de agua, en el caso de 6K-NY-ESO-1 (p91-110), pero con 6K-NY-ESO-1 (p81-100) este no fue el caso, lo que sugiere un comportamiento específico del péptido.
La formación del complejo con el péptido 6K-MAGE-A3 no deterioró significativamente la infectividad del virus, se mantuvo un 62 % de infectividad cuando se usó una relación relevante de péptido a virus.
En base a los resultados de estabilidad del complejo MAGE-A3, las condiciones de almacenamiento óptimas para el complejo parecen ser 4 °C o -20 °C.
PeptiCRAd con el recubrimiento con péptido(s) es superior al adenovirus oncolítico desnudo (VALO-C1) o a la vacunación con péptidos estándar para desencadenar respuestas sistémicas de linfocitos T CD8+ dirigidas al tumor y la infiltración de TIL CD8+ en tumores distantes no tratados. Los datos sugieren que PeptiCRAd mejora la especificidad de direccionamiento al tumor de un virus oncolítico estándar.
Tabla 1. Diámetro promedio y potencial zeta de los complejos péptido-virus preparados mediante la mezcla de virus y péptido en proporciones de 1E+9 partículas virales con 20 o 40 |jg de péptidos MAGE-A3 con colas de 6 o 9 lisinas.
Tabla 2. Diámetro hidrodinámico promedio y potencial zeta de los complejos péptido-virus medidos inmediatamente o después de 2 horas desde la preparación mediante la mezcla de 3E+9 partículas virales con diferentes cantidades de péptido 6K-MAGE-A3 como se indica en la tabla.
Tabla 3. Resultados de diámetro hidrodinámico promedio y potencial zeta de complejos péptido-virus preparados mediante la mezcla de 3E+9 partículas virales con diferentes cantidades de péptido 6K-MAGE-A3.
Tabla 4. Infectividad de los complejos PeptiCRAd preparados mediante el uso de diferentes relaciones de péptido MAGE-A3 a virus (3E+9 vp).
Tabla 5. Resultados de diámetro hidrodinámico promedio y potencial zeta de complejos péptido-virus preparados mediante la mezcla de 3E+9 partículas virales con 15 jg o 30 jg de péptido 6K-MAGE-A3 después de mantenerlos a diferentes temperaturas durante 18-20 horas.
Tabla 6a. Diámetro hidrodinámico promedio y potencial zeta de complejos péptido-virus preparados mediante la mezcla de 3E+9 partículas virales con diferentes cantidades de péptido 6K-NY-ESO-1 (p81-100).
Tabla 6b. Diámetro hidrodinámico promedio y potencial zeta de complejos péptido-virus preparados mediante la mezcla de 3E+9 partículas virales con diferentes cantidades de péptido 6K-NY-ESO-1 (p91-110).
Tabla 7a. Diámetro hidrodinámico promedio y potencial zeta de complejos péptido-virus preparados mediante la mezcla de 3E+9 partículas virales con 1 |jg de péptido 6K-NY-ESO-1 (p81 -100) y péptido MAGE-A3 en agua o en NaCl fisiológico (0,9 %).
Tabla 7b. Diámetro hidrodinámico promedio y potencial zeta de complejos péptido-virus preparados mediante la mezcla de 3E+9 partículas virales con 1 jg de péptido 6K-NY-ESO-1 (p91 - 1l0) y péptido 6K-MAGE-A3 en agua o en NaCl fisiológico (0,9 %).
Tabla 8a. Diámetro hidrodinámico promedio y potencial zeta de complejos péptido-virus preparados mediante la mezcla de 3E+9 partículas virales con diferentes cantidades de péptido 6K-NY-ESO-1 (p81 -100) en NaCl fisiológico
(0,9%).
Tabla 8b. Diámetro hidrodinámico promedio y potencial zeta de complejos péptido-virus preparados mediante la mezcla de 3E+9 partículas virales con diferentes cantidades de péptido 6K-NY-ESO-1 (p91-110) en NaCl fisiológico
(0,9%).
Tabla 9. Los animales tratados con PeptiCRAd mostraron más linfocitos T CD8+ y T CD4+ en los tumores distantes no tratados que, en los tumores primarios tratados, lo que sugiere que el tratamiento con PeptiCRAd permite una presentación de antígenos más eficiente y la subsiguiente localización de los linfocitos T en tumores distantes en comparación con la OV. Los resultados se representan como la relación del número de linfocitos infiltrantes de tumor en tumores no tratados frente a tumores tratados ± SEM.
Claims (18)
- REIVINDICACIONESi. Un adenovirus modificado que comprende:al menos uno de los siguientes polipéptidos unidos de forma covalente o no covalente a la cápside viral sin haber sido codificado genéticamente por dicho vector adenovirali) VFGIELMEVDPIGHLYIFAT [SEQ ID NO: 1];ii) YLAMPFATPMEAELARRSLA [SEQ ID NO:2]; oiii) un polipéptido que es al menos un 90 % idéntico al mismo; yen donde además, dicho virus incluye un(os) transgén(es) que codifica(n) CD40L y/u OX40L.
- 2. El adenovirus modificado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido se extiende con polilisina mediante el uso de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 lisinas.
- 3. El adenovirus modificado de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dichas lisinas se unen al extremo amino del polipéptido.
- 4. El adenovirus modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho polipéptido esKKKKKK(KKK)-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT) [SEQ ID NO:7]; y/oKKKKKK(KKK)-YLAMPFATPMEAELARRSLA[SEQ ID NO:8]; alternativamente:KKKKKK-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT [SEQ ID NO:4]; y/oKKKKKK-YLAMPFATPMEAELARRSLA [SEQ ID NO:5].
- 5. El adenovirus modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho adenovirus es un adenovirus humano.
- 6. El adenovirus modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho adenovirus comprende modificaciones en los genes E1 y/o E3 y/o E4 y/o L3 que incluyen la inserción de promotores específicos de tumores, la eliminación de al menos un gen y la inserción de al menos un transgén.
- 7. El adenovirus modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho adenovirus es del serotipo 5.
- 8. El adenovirus modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho adenovirus se modifica adicionalmente para incluir una sustitución quimérica Ad5/3, es decir, reemplazar la región de la perilla de la fibra adenoviral de serotipo 5 con la de una región de la perilla del adenovirus de serotipo 3.
- 9. El adenovirus modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho adenovirus se modifica adicionalmente para incluir una eliminación del gen E1A, en donde la eliminación es de al menos los nucleótidos que codifican los aminoácidos 122-129.
- 10. El adenovirus modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho adenovirus se modifica adicionalmente para incluir la eliminación parcial o completa del gen 14,7k.
- 11. El adenovirus modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichos transgenes son humanos.
- 12. El adenovirus modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho OX40L, se sitúa en la región E3B, en reemplazo a una eliminación del gen 14,7K.
- 13. El adenovirus modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha molécula de CD40L se inserta inmediatamente aguas abajo de OX40L mediante el uso de un sitio de procesamiento 2A.
- 14. El adenovirus modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la relación de péptido a virus está en el intervalo de 1 a 5 |jg por 3E+9 partículas virales.
- 15. Una composición farmacéutica que comprende al menos un adenovirus modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -14 en combinación con un portador adecuado.
- 16. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15, en donde dicha composición se formula para la inyección intratumoral, intramuscular, intraarterial, intravenosa, intrapleural, intravesicular, intracavitaria o peritoneal, o para una administración oral.
- 17. Un adenovirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 o la composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15-16 para su uso en el tratamiento del cáncer.
- 18. El adenovirus o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde dicho cáncer incluye uno cualquiera o más de los siguientes tipos de cáncer:cáncer de nasofaringe, cáncer sinovial, carcinoma hepatocelular, cáncer renal, cáncer de tejido conjuntivo, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de intestino, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer colorrectal, cáncer de cerebro, cáncer de garganta, cáncer oral, cáncer de hígado, cáncer de huesos, cáncer de páncreas, coriocarcinoma, gastrinoma, feocromocitoma, prolactinoma, leucemia/linfoma de linfocitos T, neuroma, enfermedad de von Hippel-Lindau, síndrome de Zollinger-Ellison, cáncer de la glándula suprarrenal, cáncer anal, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de uréter, oligodendroglioma, neuroblastoma, meningioma, tumor de la médula espinal, cáncer de huesos, osteocondroma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, cáncer de sitio primario desconocido, tumor carcinoide, tumor carcinoide gastrointestinal, fibrosarcoma, cáncer de mama, enfermedad de Paget, cáncer de cuello uterino, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, cáncer de cabeza, cáncer de ojo, cáncer de cuello, cáncer de riñón, tumor de Wilms, cáncer de hígado, sarcoma de Kaposi, cáncer de próstata, cáncer testicular, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de piel, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer pancreático endocrino, glucagonoma, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de hipófisis, sarcoma de tejidos blandos, retinoblastoma, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer trofoblástico, mola hidatiforme, cáncer de útero, cáncer de endometrio, cáncer de vagina, cáncer de vulva, neuroma acústico, micosis fungoides, insulinoma, síndrome carcinoide, somatostatinoma, cáncer de encías, cáncer de corazón, cáncer de labios, cáncer de meninges, cáncer de boca, cáncer de nervios, cáncer de paladar, cáncer de glándula parótida, cáncer de peritoneo, cáncer de faringe, cáncer de pleura, cáncer de glándulas salivales, cáncer de lengua y cáncer de amígdalas.
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