ES2935301T3 - Nuevos vectores virales recombinantes adenoasociados que restringen la transducción fuera del objetivo en el hígado y usos de los mismos - Google Patents

Nuevos vectores virales recombinantes adenoasociados que restringen la transducción fuera del objetivo en el hígado y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Se describen composiciones y métodos relacionados con nuevos vectores de virus adenoasociados que comprenden dos casetes de expresión, en los que el primer casete comprende un elemento regulador y un transgén unido operativamente a un promotor; y en el que el segundo casete comprende un promotor específico del hígado ligado operativamente a un microARN que se dirige al elemento regulador en el primer casete de expresión. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevos vectores virales recombinantes adenoasociados que restringen la transducción fuera del objetivo en el hígado y usos de los mismos
1. Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional estadounidense con n.° de serie 62/476,290, presentada el 24 de marzo de 2017. Esta invención se realizó con apoyo gubernamental de conformidad con CA163640 y CA166590 otorgado por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de la Salud. El gobierno tiene determinados derechos con respecto a la invención.
1. Antecedentes
2. El tejido adiposo es un órgano multifuncional que modula la homeostasis metabólica de todo el cuerpo. La manipulación genética de la línea germinal basada en técnicas transgénicas se utiliza a menudo para estudios experimentales de tejido adiposo. Pero algunas investigaciones y aplicaciones terapéuticas requieren manipulación adiposa con administración de genes a cierta edad. En este sentido, los vectores virales se convierten en un vehículo de administración alternativo atractivo, en particular, los vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) porque pueden transducir tanto tejidos en división como posmitóticos con baja inmunogenicidad y expresión transgénica de larga duración sin estimular la respuesta inmune mediada por células. Los rAAV han ganado más atención por sus exitosas aplicaciones en ensayos clínicos. Además, los rAAV se aplican ampliamente en la investigación básica para la administración de genes en múltiples tejidos, incluidos el hígado, el corazón, el músculo esquelético, el cerebro y los ojos. Sin embargo, las aplicaciones de los rAAV para dirigirse al tejido adiposo se han visto limitadas debido a la baja eficiencia de transducción de los serotipos de AAV naturales.
3. Se emplean modificaciones de la cápside o del casete de expresión para mejorar la eficacia de la administración de genes y el tropismo transgénico con administración local o sistemática. Por ejemplo, la selección de serotipos naturales más eficientes más el uso de un promotor específico del tejido adiposo o una secuencia dirigida a micro-ARN permite la transducción específica del tejido adiposo, pero requiere una dosis alta para lograr efectos terapéuticos. Además, la expresión de terapias recombinantes en tejidos fuera del objetivo puede tener efectos nocivos. Lo que se necesita son nuevos vectores virales de alta eficiencia de transducción que puedan evitar efectos nocivos fuera del objetivo.
II. Compendio
4. Se describen métodos y composiciones relacionados con nuevos vectores virales recombinantes adenoasociados. La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
5. En un aspecto descrito en el presente documento, hay un vector de virus adenoasociado (AAV) modificado por ingeniería genética de serotipo Rec2 que comprende dos casetes de expresión; en donde el primer casete comprende un elemento regulador y un transgén unido operativamente a un promotor; y en donde el segundo casete comprende un primer promotor específico de tejido ligado operativamente a un elemento silenciador de ARN que se dirige al elemento regulador en el primer casete de expresión. En un aspecto, la expresión del segundo casete restringe la transducción fuera del objetivo del transgén en el primer tejido.
6. También se describen AAV modificados genéticamente de cualquier aspecto anterior, en los que el elemento regulador del primer casete es una secuencia de elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE).
7. También se describen AAV modificados genéticamente de cualquier aspecto anterior, en donde el transgén del primer casete es un gen de leptina o un gen de IL-15.
8. También se describen AAV modificados genéticamente de cualquier aspecto anterior, en donde el promotor específico de tejido del segundo casete es un promotor específico de hígado.
9. En un aspecto, aquí se describen AAV modificados por ingeniería genética de cualquier aspecto anterior para su uso en métodos de tratamiento de diabetes, obesidad, síndrome metabólico, cáncer o lipodistrofia en un sujeto, que comprende administrar al sujeto el vector viral adenoasociado de cualquier aspecto anterior.10
10. En un aspecto, se describen AAV modificados por ingeniería genética de cualquier aspecto anterior para usar en el direccionamiento de un tratamiento basado en ácido nucleico al tejido adiposo visceral en un sujeto que comprende administrar al sujeto un vector de virus adenoasociado (AAV) modificado por ingeniería genética de cualquier aspecto anterior por vía intraperitoneal.
III. Breve descripción de los dibujos
11. Las figuras adjuntas, que se incorporan a el presente documento descriptiva y forman parte de esta, ilustran varias modalidades y, junto con la descripción, ilustran las composiciones y métodos descritos.
12. Las Figuras 1A, 1B y 1C muestran que la administración IP del vector Rec2 transduce múltiples depósitos de grasa visceral. (A) Imágenes representativas de bioluminiscencia in vivo de luciferasa 2 semanas después de la inyección IP del vector de Rec2-luciferasa (2 * 1010 vg por ratón). (B) Contenido de GFP en lisados de tejidos de ratones que recibieron Rec2-GFP (1 * 1010 vg por ratón) 2 semanas después de la inyección IP. (C) Inmunohistoquímica de GFP en ratones que recibieron Rec2-GFP (1 * 1010 vg por ratón). Barra de escala = 100 |jm.
13. Las Figuras 2A, 2B, 2C y 2D muestran que la administración IP del vector AS/Rec2 de casete dual transduce selectivamente la grasa visceral mientras restringe la expresión del transgén fuera del objetivo en el hígado. (A) Esquema de los vectores AAV. El vector restringido al hígado contiene dos casetes de expresión, uno para expresar el transgén bajo el promotor CBA no selectivo, el otro para expresar un microARN dirigido a WPRE impulsado por el promotor de albúmina (Alb) específico del hígado, evitando así la expresión del transgén en el hígado. (B) Contenido de GFP en lisados de tejidos de ratones que recibieron inyección IP de AS/Rec2-GFP a las dosis indicadas de un experimento 2 semanas después de la inyección IP. (C) Contenido de GFP en lisados de tejidos en otro experimento de respuesta a la dosis 2 semanas después de la inyección IP. Los datos son medias ± SEM. n=3-4 por grupo. GFP indetectable en intestino delgado, intestino grueso, bazo, riñón, testículo, grasa parda o grasa subcutánea. (D) Número de copias genómicas del vector viral en tejidos seleccionados 2 semanas después de la administración IP de AS/Rec2-GFP (4 * 1010 vg por ratón).
14. Las Figuras 3A, 3B, 3C, 3D, 3E y 3F muestran que la administración IP del vector AS/Rec2-leptina rescata el fenotipo deficiente en leptina de ratones ob/ob. (A) Peso corporal. (B) Ganancia de peso. (C) Imagen representativa 9 semanas después de la inyección de AAV. (D) Ingesta acumulativa de alimentos. (E) Temperatura rectal. En el punto de tiempo de 4 semanas, la temperatura corporal se midió después de 6 h de ayuno. (F) Análisis de EchoMRI de la composición corporal 4 semanas después de la inyección de AAV. Los datos son medias ± SEM. n=6 por grupo. *** P < 0.001.
15. Las Figuras 4A, 4B, 4C, 4D, 4E y 4F muestran que el tratamiento con AS/Rec2-leptina corrige la intolerancia a la glucosa y la alteración del equilibrio energético en ratones ob/ob. (A) Nivel de leptina en suero 4 semanas después de la inyección de AAV. Leptina indetectable en ratones ob/ob tratados con AS/Rec2-GFP (B) Prueba de tolerancia a la glucosa 4 semanas después de la inyección de AAV.***P < 0.001 ratones ob/ob tratados con AS/Rec2-leptina y ratones WT en comparación con ratones ob/ob tratados con AS/Rec2-GFP. A los 0 min y 60 min, los niveles de glucosa en ratones ob/ob tratados con AS/Rec2-leptina fueron significativamente más bajos que los ratones WT (P< 0.05).(C) Peso corporal en la prueba de tolerancia a la glucosa. (D) Alimentos acumulativos. (E) Consumo de oxígeno. P < 0.01 (F) Actividad física medida por CLAMS 5 semanas después de la inyección de AAV, P < 0.05. Zona sombreada: fase de oscuridad. Los datos son medias ± SEM. n=6 AS/Rec2-GFP, n=6 AS/Rec2-leptina, n=6-8 WT emparejados por edad.
16. Las Figuras 5A, 5B, 5C y 5D muestran que el tratamiento con AS/Rec2-leptina revierte la obesidad, la hiperinsulinemia y la esteatosis hepática en ratones ob/ob. (A) Peso relativo del tejido en el momento del sacrificio 9 semanas después de la inyección de AAV. (B) Nivel de insulina en suero en el momento del sacrificio. (C) Tinción con Oil Red O de los hígados. Barra de escala: 50 jm . (D) Contenido de GFP en lisados de tejidos de ratones ob/ob individuales que recibieron AS/Rec2-GFP.
IV. Descripción detallada
17. Antes de divulgar y describir los presentes compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos, se debe comprender que estos no se limitan a métodos específicos de síntesis, o métodos específicos de biotecnología recombinante a menos que se indique lo contrario, ni a reactivos en particular, salvo que se indique lo contrario, dado que estos pueden variar obviamente. También se debe entender que la terminología usada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones concretas y no pretende ser limitante.
A. Definiciones
18. Como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/una" y "el/la", incluyen referentes plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a «un vehículo» incluye mezclas de uno o más Vehículo, dos o más Vehículo, y similares.
19. Los intervalos se pueden expresar en el presente documento como desde “aproximadamente” un valor particular y/o hasta “aproximadamente” otro valor particular. Cuando se expresa tal intervalo, otra realización incluye desde el valor concreto y/o hasta el otro valor concreto. De forma similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del “aproximadamente” precedente, se entenderá que el valor concreto forma otra realización. También se comprenderá que los extremos de cada uno de los intervalos son relevantes, tanto en relación con el otro extremo como independientemente del otro extremo. También se entenderá que hay una cantidad de valores descritos en el presente documento y que cada valor también se describe en el presente documento como “aproximadamente” ese valor en particular, además del valor en sí mismo. Por ejemplo, si se describe el valor “10”, entonces también se describe “aproximadamente 10”. También se entiende que cuando se describe que un valor es "menor o igual que" el valor, también se describen "mayor o igual que el valor" y los posibles rangos entre valores, tal como lo entiende apropiadamente el experto en la materia. Por ejemplo, si se describe el valor "10", también se describe "menor o igual a 10" así como "mayor o igual a 10". También se entiende que a lo largo de la solicitud, los datos se proporcionan en varios formatos diferentes, y que estos datos representan puntos finales y puntos de inicio, y rangos para cualquier combinación de los puntos de datos. Por ejemplo, si se describe un punto de datos particular "10" y un punto de datos particular 15, se entiende que mayor que, mayor o igual que, menor que, menor o igual que e igual a 10 y 15 se consideran descritos, así como entre 10 y 15. También se debe comprender que también se describe cada unidad entre dos unidades en particular. Por ejemplo, si se describen 10 y 15, entonces 11, 12, 13, y 14 también se describen.
20. En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que la siguen se hará referencia a varios términos cuyos significados se deben definir:
21. “Opcional” u “opcionalmente” significan que el evento o circunstancia descritos a continuación puede ocurrir o no, y que la descripción incluye casos en los que dicho evento o circunstancia ocurre y casos en los que no.
22. A lo largo del presente documento solicitud se hace referencia a diversas publicaciones. Las descripciones de estas publicaciones describen el estado de la técnica.
B. Composiciones
23. Se describen los componentes que se utilizarán para preparar las composiciones descritas, así como las propias composiciones que se utilizarán dentro de los métodos descritos en el presente documento. En el presente documento se describen estos y otros materiales y se comprende que cuando se describen combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales, si bien pueden no incluirse explícitamente una referencia específica de cada una de las numerosas combinaciones y permutaciones individuales y colectivas de estos compuestos, cada una se encuentra específicamente contemplada y descrita en el presente documento. Por ejemplo, si se describe y plantea un vector viral adenoasociado particular y se indican diversas modificaciones que se pueden realizar en varias moléculas que incluyen al vector viral adenoasociado, quedan contempladas de forma específica todas y cada una de las combinaciones y permutaciones del vector viral adenoasociado y las modificaciones que sean posibles, salvo que se indique específicamente lo contrario. Por lo tanto, si se describe una clase de moléculas A, B y C, al igual que una clase de moléculas D, E y F y se describe un ejemplo de una molécula de combinación, A-D, entonces incluso si no se menciona cada una individualmente, cada una está individual y colectivamente contemplada para dar a entender que las combinaciones A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E y C-F se consideran descritas. Del mismo modo, también se describe cualquier subconjunto o combinación de estos. Por ende, por ejemplo, el subgrupo de A-E, B-F, y C-E se consideraría descrito. Este concepto se aplica a todos los aspectos del presente documento solicitud lo que incluye, de modo no taxativo, las etapas en los métodos para realizar y usar las composiciones de la invención. Por lo tanto, si hay una variedad de etapas adicionales que se pueden realizar, se entiende que cada una de estas etapas adicionales se pueden realizar con cualquier realización específica o combinación de realizaciones de los métodos descritos.
24. La obesidad y la distribución de la grasa corporal son factores de riesgo importantes para la diabetes tipo II, la lipodistrofia y otros síndromes metabólicos. El tejido adiposo visceral (VAT) juega papeles distintivos en la homeostasis y la alteración metabólica. El tipo de obesidad caracterizado por un aumento del VAT está fuertemente asociado con resultados metabólicos adversos, mientras que se cree que la acumulación de grasa subcutánea tiene efectos neutrales o incluso beneficiosos sobre el metabolismo. Esto se relaciona con las diferencias funcionales intrínsecas de los adipocitos en diferentes depósitos, incluida la sensibilidad a la insulina, la captación de glucosa, la tasa de lipólisis y la secreción de adipocinas y citocinas. Por lo tanto, una herramienta de administración de genes dirigida a la grasa visceral tiene un gran potencial para aplicaciones en investigación básica y terapia génica.
25. Hay una serie de composiciones y métodos que se pueden usar para administrar ácidos nucleicos a las células, ya sea in vitro o in vivo. Estos métodos y composiciones se pueden dividir en gran medida en dos clases: sistemas de administración basados en virus y sistemas de administración no basados en virus. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden administrarse a través de varios sistemas de administración directa, tal como electroporación, lipofección, precipitación con fosfato de calcio, plásmidos, vectores virales, ácidos nucleicos virales, ácidos nucleicos de fagos, fagos, cósmidos o mediante la transferencia de material genético en células o vehículo tales como liposomas catiónicos.
26. Como se usa aquí, los vectores plasmídicos o virales son agentes que transportan un ácido nucleico de interés, tal como la leptina o la IL-15, al interior de la célula sin degradación e incluyen un promotor que produce la expresión del gen en las células a las que se administra. Los vectores virales son, por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, virus vaccinia, virus de la poliomielitis, virus del SIDA, virus trófico neuronal, Sindbis y otros virus de ARN, incluyendo estos virus la cadena principal del VIH. También se prefieren las familias virales que comparten las propiedades de estos virus que los hacen adecuados para su uso como vectores. Los retrovirus incluyen el virus de la leucemia murina de Moloney, MMLV y retrovirus que expresan las propiedades deseables de MMLV como vector. Los vectores retrovirales son capaces de transportar una carga útil genética mayor, es decir, un transgén o un gen marcador, que otros vectores virales y, por esta razón, son un vector de uso común. Sin embargo, no son tan útiles en células que no proliferan. Los vectores de adenovirus son relativamente estables y fáciles de trabajar, tienen títulos altos, se pueden administrar en formulación de aerosol y pueden transfectar células que no se dividen. Los vectores virales de la viruela son grandes y tienen varios sitios para insertar genes, son termoestables y se pueden almacenar a temperatura ambiente.
27. Los vectores virales pueden tener mayores capacidades de transacción (capacidad para introducir genes) que los métodos químicos o físicos para introducir genes en las células. Normalmente, los vectores virales contienen genes tempranos no estructurales, genes tardíos estructurales, un transcrito de ARN polimerasa III, repeticiones terminales invertidas necesarias para la replicación y encapsidación, y promotores para controlar la transcripción y replicación del genoma viral. Cuando se diseñan como vectores, los virus suelen tener uno o más de los primeros genes eliminados y se inserta un gen o un casete de gen/promotor en el genoma viral en lugar del a Dn viral extraído. Las construcciones de este tipo pueden transportar hasta aproximadamente 8 kb de material genético extraño. Las funciones necesarias de los genes tempranos eliminados típicamente son suministradas por líneas celulares que han sido manipuladas para expresar los productos génicos de los genes tempranos en trans.
28. Otro tipo de vector viral se basa en un virus adenoasociado (AAV). Este parvovirus defectuoso es un vector preferido porque puede infectar muchos tipos de células y no es patógeno para los seres humanos. Los vectores de tipo a Av pueden transportar aproximadamente 4 a 5 kb y se sabe que el AAV de tipo silvestre se inserta de manera estable en el cromosoma 19. Se prefieren los vectores que contienen esta propiedad de integración específica del sitio. Una realización especialmente preferida de este tipo de vector es el vector P4.1 C producido por Avigen, San Francisco, CA, que puede contener el gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple, HSV-tk, y/o un gen marcador, tal como el gen que codifica la proteína verde fluorescente, GFP.
29. En otro tipo de virus AAV, el AAV contiene un par de repeticiones terminales invertidas (ITR) que flanquean al menos un casete que contiene un promotor que dirige la expresión específica de la célula unido operativamente a un gen heterólogo. Heterólogo en este contexto se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos o gen que no sea nativo del parvovirus AAV o B19.
30. Por lo general, las regiones codificantes de AAV y B19 se han eliminado, lo que da como resultado un vector seguro y no citotóxico. Las ITR de AAV, o modificaciones de las mismas, confieren infectividad e integración específica del sitio, pero no citotoxicidad, y el promotor dirige la expresión específica de la célula. La Patente de Estados Unidos N° 6,261,834 se incorpora aquí como referencia para material relacionado con el vector AAV.
31. En el presente documento se describe un nuevo vector Rec2 de serotipo híbrido modificado que conduce a una alta transducción de tejido adiposo superior a los serotipos naturales (AAV1 y AAV8) y otros serotipos modificados (Rec1, Rec3, Rec4) cuando los vectores se inyectan directamente en las bolsas de grasa en una dosis de 1 a 2 órdenes más baja que los estudios informados previamente. Curiosamente, la vía de administración influye sustancialmente en el tropismo y la eficacia del vector Rec2. La administración intravenosa del vector Rec2 transduce principalmente el hígado a dosis que oscilan entre 2 * 109 y 2 * 1010 vg por ratón. Por el contrario, la administración oral del vector Rec2 conduce a la transducción preferencial de grasa parda con ausencia de transducción en el tracto gastrointestinal a dosis inferiores a 2 * 1010 vg por ratón. Para mejorar la administración de genes a VAT, primero se determinó si el vector Rec2, a través de la administración IP, un procedimiento simple y menos invasivo, podría transducir VAT de manera eficiente. En consecuencia, en un aspecto, en el presente documento se describen métodos para dirigir un tratamiento basado en ácido nucleico al tejido adiposo visceral en un sujeto que comprende administrar al sujeto cualquiera de los vectores de virus adenoasociados (AAV) modificados descritos en el presente documento (por ejemplo, el vector Rec2 descrito). Por ejemplo, en el presente documento se describen métodos para dirigir un tratamiento basado en ácido nucleico al tejido adiposo visceral en un sujeto que comprende administrar al sujeto un vector de virus adenoasociado (AAV) modificado que comprende dos casetes de expresión; en donde el primer casete comprende un elemento regulador y un transgén de leptina o un transgén de IL-15 unido operativamente a un promotor; y en donde el vector AAv se administra por vía intraperitoneal.
32. Para evitar la expresión del transgén en un tejido no objetivo, tal como el hígado, se generó un nuevo plásmido de expresión de AAV que contenía dos casetes de expresión: uno que comprendía el transgén (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica la leptina o IL-15) y el otro casete usó el promotor específico del hígado (por ejemplo, el promotor de albúmina) para impulsar un elemento silenciador de ARN específico (tal como, por ejemplo, microARN) dirigido a un elemento regulador (tal como, por ejemplo, WPRE) secuencia que solo existe en el casete de expresión del transgén.
33. Los genes insertados en virus y retrovirus suelen contener promotores, y/o potenciadores para ayudar a controlar la expresión del producto génico deseado (por ejemplo, un promotor de p-actina de pollo (CBA)). Un promotor es generalmente una secuencia o secuencias de a Dn que funcionan cuando se encuentran en una ubicación relativamente fija con respecto al sitio de inicio de la transcripción. Un promotor contiene elementos centrales necesarios para la interacción básica de la ARN polimerasa y los factores de transcripción, y puede contener elementos secuencia arriba y elementos de respuesta.
34. Los promotores preferidos que controlan la transcripción de vectores en células huésped de mamífero pueden obtenerse de varias fuentes, por ejemplo, los genomas de virus tales como: polioma, virus simio 40 (SV40), adenovirus, retrovirus, virus de la hepatitis B y más preferiblemente citomegalovirus, o de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, un promotor de p-actina, tal como, por ejemplo, el promotor de p-actina de pollo. Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40 (Fiers et al., Nature, 273:113 (1978)). El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindlII E (Greenway, P.J. et al., Gene 18:355-360 (1982)). Por supuesto, los promotores de la célula huésped o especies relacionadas también son útiles en el presente documento. Por lo tanto, en un aspecto, en el presente documento se describen vectores de virus adenoasociados (AAV) modificados que comprenden dos casetes de expresión; en donde el primer casete comprende un elemento regulador y un transgén unido operativamente a un promotor (tal como, por ejemplo, el promotor de p-actina de pollo); y en donde el segundo casete comprende un promotor de albúmina específico del hígado y un microARN que se dirige al elemento regulador en el primer casete de expresión.
35. El potenciador generalmente se refiere a una secuencia de ADN que funciona a una distancia no fija del sitio de inicio de la transcripción y puede ser 5' (Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78:993 (1981)) o 3' (Lusky, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3:1108 (1983)) a la unidad de transcripción. Además, los potenciadores pueden estar dentro de un intrón (Banerji, J.L. et al., Cell 33:729 (1983)) así como dentro de la propia secuencia de codificación (Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio 4:1293 (1984)). Suelen tener entre 10 y 3O0 pb de longitud y funcionan en cis. Los potenciadores funcionan para aumentar la transcripción de los promotores cercanos. Los potenciadores también suelen contener elementos de respuesta que median en la regulación de la transcripción. Los promotores también pueden contener elementos de respuesta que median en la regulación de la transcripción. Los potenciadores a menudo determinan la regulación de la expresión de un gen. Actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, -fetoproteína e insulina), normalmente se usará un potenciador de un virus de células eucariotas para expresión general. Los ejemplos preferidos son el potenciador de SV40 en la parte posterior del origen de replicación (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en la parte posterior del origen de replicación y potenciadores de adenovirus.
36. El promotor y/o el potenciador pueden activarse específicamente ya sea por la luz o por eventos químicos específicos que desencadenan su función. Los sistemas pueden ser regulados por reactivos como tetraciclina y dexametasona. También hay formas de mejorar la expresión génica del vector viral mediante la exposición a la radiación, tal como la radiación gamma o los fármacos quimioterapéuticos alquilantes.
37. En ciertas realizaciones, el promotor y/o región potenciadora puede actuar como un promotor constitutivo y/o potenciador para maximizar la expresión de la región de la unidad de transcripción a transcribir. En ciertas construcciones, el promotor y/o la región potenciadora se activan en todos los tipos de células eucariotas, incluso si sólo se expresan en un tipo particular de célula en un momento particular. Un promotor preferido de este tipo es el promotor de CMV (650 bases). Otros promotores preferidos son los promotores de SV40, citomegalovirus (promotor de longitud completa) y vector retroviral lTr .
38. Se ha demostrado que todos los elementos reguladores específicos se pueden clonar y usar para construir vectores de expresión que se expresan selectivamente en tipos de células específicas, tal como las células de melanoma. El promotor de la proteína acética fibrilar glial (GFAP) se ha utilizado para expresar selectivamente genes en células de origen glial. En otro aspecto, un promotor específico del hígado tal como el promotor de la albúmina, el promotor de la globina fijadora de tiroxina, el promotor de la fosfoenolpiruvatocarboxiquinasa (PEPCK), el promotor de la tirosina aminotransgerasa (TAT) o el promotor de la alfa 1 -antitripsina humana (hAAT) puede usarse para impulsar la expresión solo en el hígado. Mediante el uso, en el segundo casete de los vectores AAV modificados descritos en el presente documento, se pueden usar promotores específicos de tejidos unidos operativamente al elemento silenciador de ARN, la expresión de un elemento silenciador de ARN (tal como, por ejemplo, microARN) que dirige al elemento regulador en el primer casete para limitar la transducción fuera del objetivo del transgén (por ejemplo, leptina y/o IL-15). Por ejemplo, en el presente documento se describen vectores de virus adenoasociados (a Av ) modificados que comprenden dos casetes de expresión; en donde el primer casete comprende un elemento regulador y un transgén (tal como, por ejemplo, leptina y/o IL-15) unido operativamente a un promotor (tal como, por ejemplo, CBA); y en donde el segundo casete comprende un promotor específico de tejido, por ejemplo, un promotor específico de hígado (tal como, por ejemplo, albúmina o hAAT) y un elemento silenciador de ARN (tal como, por ejemplo, microARN) que se dirige al elemento regulador en el primer casete de expresión. Se entiende y se contempla en el presente documento que el promotor específico de tejido, tal como el promotor específico de hígado en el segundo casete, está unido operativamente al elemento de silenciamiento de ARN de tal manera que la transcripción del elemento de silenciamiento de ARN solo ocurre cuando se encuentra en el tejido apropiado para el promotor específico de tejido. Por lo tanto, tal como se indicó anteriormente, el AAV modificado descrito puede restringir la transducción fuera del objetivo de un transgén en el hígado. Por lo tanto, en un aspecto, aquí se describen métodos para expresar un transgén en el VAT mientras se restringe la transducción fuera del objetivo del transgén en el hígado que comprende administrar al sujeto vectores de virus adenoasociados (AAV) modificados que comprenden dos casetes de expresión; en donde el primer casete comprende un elemento regulador y un transgén (tal como, por ejemplo, leptina y/o IL-15) unido operativamente a un promotor (tal como, por ejemplo, CBA); y en donde el segundo casete comprende un promotor específico del hígado (tal como, por ejemplo, albúmina o hAAT) y un elemento silenciador de ARN (tal como, por ejemplo, microARN) que se dirige al elemento regulador en el primer casete de expresión; y en donde el elemento silenciador de ARN está unido operativamente al promotor específico del hígado.
39. Los vectores de expresión usados en células huésped eucarióticas (células de levadura, hongo, insecto, planta, animal, humana o nucleadas) también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción que pueden afectar la expresión del ARNm. Estas regiones se transcriben como segmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica la proteína del factor tisular. Las regiones 3' no traducidas también incluyen sitios de terminación de la transcripción. Se prefiere que la unidad de transcripción también contenga una región de poliadenilación. Un beneficio de esta región es que aumenta la probabilidad de que la unidad transcrita sea procesada y transportada como ARNm. La identificación y uso de señales de poliadenilación en construcciones de expresión está bien establecida. Se prefiere que se utilicen señales de poliadenilación homólogas en las construcciones transgénicas. En ciertas unidades de transcripción, la región de poliadenilación se deriva de la señal de poliadenilación temprana de SV40 y consta de unas 400 bases. También se prefiere que las unidades transcritas contengan otras secuencias estándar solas o en combinación con las secuencias anteriores para mejorar la expresión o la estabilidad de la construcción.
40. Los vectores virales pueden incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto marcador. Este producto marcador se utiliza para determinar si el gen se ha administrado a la célula y, una vez administrado, se está expresando. Los genes marcadores preferidos son el gen lacZ de E. Coli, que codifica la p-galactosidasa, y la proteína verde fluorescente.
41. En algunas realizaciones, el marcador puede ser un marcador seleccionable. Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son dihidrofolato reductasa (DHFR), timidina quinasa, neomicina, análogo de neomicina G418, hidromicina y puromicina. Cuando dichos marcadores seleccionables se transfieren con éxito a una célula huésped de mamífero, la célula huésped de mamífero transformada puede sobrevivir si se somete a presión selectiva. Hay dos categorías distintas ampliamente utilizadas de regímenes selectivos. La primera categoría se basa en el metabolismo de una célula y el uso de una línea celular mutante que carece de la capacidad de crecer independientemente de un medio complementado. Dos ejemplos son: células CHO DHFR- y células LTK- de ratón. Estas células carecen de la capacidad de crecer sin la adición de nutrientes tales como la timidina o la hipoxantina. Debido a que estas células carecen de ciertos genes necesarios para una ruta completa de síntesis de nucleótidos, no pueden sobrevivir a menos que los nucleótidos faltantes se proporcionen en un medio complementado. Una alternativa para complementar los medios es introducir un gen DHFR o TK intacto en células que carecen de los genes respectivos, alterando así sus requisitos de crecimiento. Las células individuales que no se transformaron con el gen DHFR o TK no serán capaces de sobrevivir en medios no complementados.
42. La segunda categoría es la selección dominante, que se refiere a un esquema de selección utilizado en cualquier tipo de célula y no requiere el uso de una línea celular mutante. Estos esquemas suelen utilizar un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que tienen un gen nuevo expresarían una proteína que transmite resistencia a los fármacos y sobrevivirían a la selección. Los ejemplos de dicha selección dominante utilizan los fármacos neomicina, (Southern P. y Berg, P., J. Molec, Appl. Genet.
1: 327 (1982)), ácido micofenólico, (Mulligan, R.C, y Berg, P. Science 209: 1422 (1980)) o higromicina, (Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985)). Los tres ejemplos emplean genes bacterianos bajo control eucariótico para transmitir resistencia al fármaco apropiado G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) o higromicina, respectivamente. Otros incluyen el análogo de neomicina G418 y la puramicina.
43. En un aspecto, los vectores AAV descritos también pueden comprender un elemento regulador (tal como, por ejemplo, el elemento regulador postranscripcional de la marmota (WPRE)) que no se encontraría en el huésped de forma endógena y solo estaría presente en el primer casete. El elemento regulador puede vincularse operativamente al promotor y/o transgén en el primer casete de tal manera que la interrupción del elemento regulador (por ejemplo, mediante el uso de un microARN, ARNp, ARNi, ARNip, y/o ARNpi) desactiva la expresión del transgén. En un aspecto, la interrupción del elemento regulador puede ser a través de un elemento silenciador de ARN (tal como, por ejemplo, microARN, ARNp, ARNi, ARNip, y/o ARNpi) que es específico para el elemento regulador. Al unir dicho elemento silenciador de ARN a un promotor específico de tejido, se puede evitar que se produzca la expresión del transgén en tejidos en los que la expresión del transgén sería perjudicial. Por lo tanto, en un aspecto, en el presente documento se describen vectores de virus adenoasociados (AAV) modificados que comprenden dos casetes de expresión; en donde el primer casete comprende un elemento regulador (tal como, por ejemplo, WPRE) y un transgén (tal como, por ejemplo, leptina y/o IL-15) unidos operativamente a un promotor (tal como, por ejemplo, el promotor de p-actina de pollo); y en donde el segundo casete comprende un promotor específico del hígado (tal como, por ejemplo, el promotor de albúmina) y un elemento silenciador de ARN (tal como, por ejemplo, microARN) que se dirige al elemento regulador en el primer casete de expresión (ver Figura 2A); en donde el elemento silenciador de ARN está unido operativamente al promotor específico del hígado.
Vehículo farmacéutico/Administración de productos farmacéuticos
44. Como se describió anteriormente, las composiciones también se pueden administrar in vivo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por «farmacéuticamente aceptable» se entiende un material que no es biológicamente o de otro modo no deseable, es decir, el material se administra a un sujeto, junto con el ácido nucleico o vector, sin provocar efectos biológicos no deseados o interactuar de forma perjudicial con los otros componentes de la composición farmacéutica en la que se encuentra incluido. El vehículo se seleccionaría naturalmente para minimizar cualquier degradación del ingrediente activo y para minimizar cualquier efecto secundario adverso en el sujeto, tal como sería bien conocido por un experto en la técnica.
45. Las composiciones se pueden administrar por vía oral, parenteral (p. ej., intravenosa), por inyección intramuscular, por inyección intraperitoneal, transdérmica, extracorpórea, tópica o similar, incluida la administración intranasal tópica o la administración por inhalación. Como se usa en el presente documento, "administración intranasal tópica" significa la administración de las composiciones en la nariz y las fosas nasales a través de una o ambas fosas nasales y puede comprender la administración mediante un mecanismo de atomización o mecanismo de gotitas, o mediante aerosolización del ácido nucleico o vector. La administración de las composiciones farmacéuticas mediante inhalante puede ser a través de la nariz o la boca mediante la administración por un mecanismo de goteo o por atomizador, por ejemplo, en la forma de un aerosol. La administración también puede ser directamente a cualquier área del sistema respiratorio (p. ej., pulmones) mediante intubación. La cantidad exacta necesaria variará de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, edad, peso y condición general del sujeto, la gravedad del trastorno alérgico que se está tratando, el ácido nucleico o vector particular usado, su modo de administración y similares. Por lo tanto, no es posible especificar una cantidad exacta para cada composición. Sin embargo, un experto normal en la técnica puede determinar una cantidad apropiada usando solo experimentación de rutina dadas las enseñanzas de este documento.
46. La administración parenteral de la composición, si se usa, generalmente se caracteriza por inyección. Los inyectables pueden prepararse en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Un enfoque revisado más recientemente para la administración parenteral implica el uso de un sistema de liberación lenta o de liberación sostenida de modo que se mantenga una dosificación constante. Véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. N° 3,610,795.
47. Los materiales pueden estar en solución, suspensión (por ejemplo, incorporados en micropartículas, liposomas o células). Estos pueden estar dirigidos a un tipo de célula particular a través de anticuerpos, receptores o ligandos de receptores. Las siguientes referencias son ejemplos del uso de esta tecnología para dirigir proteínas específicas al tejido tumoral (Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother, 35:421-425, (1992); Pietersz y McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); y Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)). Vehículos tales como "Stealth" y otros liposomas conjugados con anticuerpos (incluido el fármaco dirigido a carcinoma de colon mediado por lípidos), el direccionamiento de ADN mediado por receptores a través de ligandos específicos de células, el direccionamiento de linfocitos dirigidos a tumores y el direccionamiento retroviral terapéutico altamente específico de células de glioma murino in vivo. Las siguientes referencias son ejemplos del uso de esta tecnología para dirigir proteínas específicas al tejido tumoral (Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); y Litzinger y Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)). En general, los receptores están implicados en vías de endocitosis, ya sea constitutiva o inducida por ligando. Estos receptores se agrupan en pozos recubiertos de clatrina, ingresan a la célula a través de vesículas recubiertas de clatrina, pasan a través de un endosoma acidificado en el que se clasifican los receptores y luego se reciclan a la superficie celular, se almacenan intracelularmente o se degradan en los lisosomas. Las vías de internalización cumplen una variedad de funciones, tal como la absorción de nutrientes, la eliminación de proteínas activadas, la eliminación de macromoléculas, la entrada oportunista de virus y toxinas, la disociación y degradación del ligando y la regulación a nivel del receptor. Muchos receptores siguen más de una vía intracelular, según el tipo de célula, la concentración del receptor, el tipo de ligando, la valencia del ligando y la concentración del ligando. Se han revisado los mecanismos moleculares y celulares de la endocitosis mediada por receptores (Brown y Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).
a) Vehículos farmacéuticamente aceptables
48. Las composiciones, incluidos los anticuerpos, se pueden usar terapéuticamente en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
49. Los vehículos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R, Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995. Típicamente, se usa una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable en la formulación para hacer que la formulación sea isotónica. Los ejemplos del vehículo farmacéuticamente aceptable incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la solución es preferentemente de 5 a 8, y más preferentemente de 7 a aproximadamente 7.5. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices se encuentran en forma de elementos moldeados, por ejemplo, películas, liposomas o micropartículas. Será evidente para los expertos en la técnica que ciertos vehículos pueden preferirse más dependiendo, por ejemplo de la vía de administración y la concentración de la composición que se administre.
50. Los vehículos farmacéuticos son conocidos por los expertos en la materia. Normalmente, estos serían vehículos estándar para la administración de fármacos a seres humanos, incluidas soluciones tales como agua estéril, solución salina y soluciones tamponadas a pH fisiológico. Las composiciones se pueden administrar por vía intramuscular o subcutánea. Otros compuestos se administrarán de acuerdo con los procedimientos estándar utilizados por los expertos en la técnica.
51. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir vehículos, espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes tensioactivos y similares, además de la molécula elegida. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir uno o más ingredientes activos tales como agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, anestésicos y similares.
52. Las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad de formas en función de si se desea un tratamiento local o sistémico y según el área a ser tratada. La administración puede ser tópica (incluyendo oftálmica, vaginal, rectal, intranasal), oral, por inhalación o parenteral, por ejemplo, por goteo intravenoso, inyección subcutánea, intraperitoneal o intramuscular. Los anticuerpos descritos pueden administrarse por vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavitaria o transdérmica.
53. Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. El propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como el aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo son ejemplos de solventes no acuosos. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, lo que incluye medios salinos y amortiguados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, cloruro de sodio y dextrosa, solución láctica de Ringer o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de líquidos y nutrientes y reponedores de electrolitos, tales como los que se basan en la dextrosa de Ringer y similares. También se pueden encontrar presentes conservantes y otros aditivos tales tal como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, y gases inertes y similares.
54. Las formulaciones para administración tópica pueden incluir ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, atomizadores, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y similares.
55. Las composiciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, bolsitas o comprimidos. Pueden ser deseables espesantes, saborizantes, diluyentes, emulsionantes, auxiliares de dispersión o aglutinantes.
56. Algunas de las composiciones pueden administrarse potencialmente como una sal de adición de ácido o base farmacéuticamente aceptable, formada por reacción con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociánico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico y ácidos orgánicos tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico y ácido fumárico, o por reacción con una base inorgánica tal como hidróxido de sodio , hidróxido de amonio, hidróxido de potasio y bases orgánicas tales como mono, di, trialquilo y arilaminas y etanolaminas sustituidas.
b) Usos terapéuticos
57. Las dosis y programas efectivos para administrar las composiciones pueden determinarse empíricamente, y la realización de tales determinaciones está dentro del conocimiento de la técnica. Los intervalos de dosis para la administración de las composiciones son lo suficientemente grandes como para producir el efecto deseado en el que se ven afectados los síntomas del trastorno. La dosificación no debería ser tan grande como para provocar efectos secundarios adversos, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilácticas y similares. Generalmente, la dosificación variará según la edad, la condición, el sexo, y grado de la enfermedad en el paciente, la vía de administración o si se incluyen otros fármacos en el régimen, y puede ser determinada por un experto en la técnica. La dosificación puede ser ajustada por el médico en caso de cualquier contraindicación. La dosificación puede variar, y puede administrarse en una o más administraciones de dosis diariamente, durante uno o varios días. En la bibliografía hay una orientación con respecto a las dosificaciones adecuadas para clases determinadas de productos farmacéuticos. Por ejemplo, se puede encontrar orientación para seleccionar las dosis apropiadas de anticuerpos en la bibliografía sobre usos terapéuticos de anticuerpos, p. ej., Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 y pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, Nueva York (1977) pp. 365-389. Una dosificación diaria típica puede variar de alrededor de 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, en función de los factores anteriores.
C. Métodos para tratar la obesidad, la diabetes, la lipodistrofia o los síndromes metabólicos
58. Los vectores AAV descritos pueden usarse para la interrupción, restauración y modificación de genes dirigidos en cualquier animal que pueda sufrir estos eventos. La modificación de genes y la interrupción de genes se refieren a los métodos, técnicas y composiciones que rodean la eliminación, integración o alteración selectivas de un gen o tramo de cromosoma en un animal. En general, una célula se transforma con un vector que está diseñado para recombinarse homólogamente con una región de un cromosoma particular contenido dentro de la célula, como por ejemplo, se describe en este documento. Este evento de recombinación homóloga puede producir un cromosoma que tiene ADN exógeno introducido, por ejemplo, en marco, con el ADN circundante. Este tipo de protocolo permite que se introduzcan mutaciones muy específicas en el genoma contenido dentro de la célula.
59. En un aspecto, se entiende que los vectores descritos pueden usarse para rescatar deficiencias de expresión del gen/proteína que conducen a una enfermedad. En un aspecto, los vectores AAV descritos en el presente documento se pueden usar para tratar la obesidad, la diabetes, la lipodistrofia (tal como, por ejemplo, la lipodistrofia generalizada congénita (también conocida como síndrome de Beradinelli-Seip), la lipodistrofia parcial familiar, la lipodistrofia parcial adquirida (también conocida como síndrome de Barraquer-Simons), lipodistrofia generalizada adquirida, lipodistrofia abdominal centrífuga, lipoatrofia anular, lipodistrofia localizada y lipodistrofia asociada al VlH) o síndromes metabólicos.
60. Se entiende además y se contempla en el presente documento que la activación de los progenitores de células NK y las células NK residentes en el tejido adiposo puede facilitar el tratamiento de un cáncer ya que las células Nk atacarán el cáncer. La activación de los progenitores de NK y las células NK en el tejido adiposo puede lograrse proporcionando IL-15 a las células NK. Los vectores AAV modificados descritos en el presente documento que son específicos de tejido pueden proporcionar esta IL-15. Por lo tanto, en un aspecto, los vectores AAV descritos en este documento pueden usarse para tratar un cáncer (tal como, por ejemplo, linfoma, linfoma de células B, linfoma de células T, micosis fungoide, enfermedad de Hodgkin, leucemia mieloide, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer del sistema nervioso, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cánceres de pulmón tales como cáncer de pulmón de células pequeñas y cáncer de pulmón de células no pequeñas, neuroblastoma/glioblastoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de piel, cáncer de hígado, melanoma, carcinomas de células escamosas de boca, garganta, laringe y pulmón, cáncer de colon, cáncer de cuello uterino, carcinoma de cuello uterino, cáncer de mama y cáncer epitelial, cáncer renal, cáncer genitourinario, cáncer pulmonar, carcinoma esofágico, carcinoma de cabeza y cuello, cáncer de intestino grueso, cánceres hematopoyéticos; cáncer testicular; cáncer de colon, y/o cáncer de recto) en un sujeto mediante la administración de un vector AAV que codifica IL-15 descrito en este documento. En consecuencia, en un aspecto, en el presente documento se describen sistemas para usar en métodos para tratar la obesidad, diabetes, cáncer, lipodistrofia, y/o síndromes metabólicos en un sujeto que comprende administrar al sujeto un vector de virus adenoasociado (AAV) modificado que comprende dos casetes de expresión; en donde el primer casete comprende un elemento regulador (tal como, por ejemplo, WPRE) y un transgén de leptina y/o transgén de IL-15 unido operativamente a un promotor (tal como el promotor CBA); y en donde el segundo casete comprende un promotor específico de hígado (tal como el promotor de albúmina) y un elemento silenciador de ARN (tal como, por ejemplo, microARN) que se dirige al elemento regulador en el primer casete de expresión; en donde el elemento silenciador de ARN está unido operativamente al promotor específico del hígado.
61. También se describen en este documento métodos para dirigir un tratamiento basado en ácido nucleico al tejido adiposo visceral en un sujeto que comprende administrar al sujeto un vector de virus adenoasociado (AAV) modificado que comprende dos casetes de expresión; en donde el primer casete comprende un elemento regulador y un transgén de leptina unido operativamente a un promotor; y en donde el segundo casete comprende un promotor específico del hígado (tal como, por ejemplo, albúmina) y un elemento silenciador de ARN (tal como, por ejemplo, microARN) que se dirige al elemento regulador en el primer casete de expresión; en donde el elemento silenciador de ARN está unido operativamente al promotor específico del hígado; y en donde el vector AAV se administra por vía intraperitoneal.
D. Ejemplos
62. Los siguientes ejemplos se establecen para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo se realizan y evalúan los compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos reivindicados en el presente documento, y se pretenden que sean simplemente ejemplos y no limitantes de la invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben contemplar algunos errores y desviaciones. Salvo que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, la temperatura está en °C o es temperatura ambiente y la presión es igual o cercana a la presión atmosférica.
1. Ejemplo 1: Transducción eficiente de VAT a través de la administración IP del vector Rec2
63. Para mejorar la administración de genes a VAT, primero se determinó si el vector Rec2, a través de la administración IP, un procedimiento simple y menos invasivo, podría transducir VAT de manera eficiente. El vector Rec2 que porta el gen indicador de luciferasa impulsado por el potenciador de CMV y el promotor de pactina de pollo (CBA) se inyectó IP a ratones macho Balb/c a la dosis de 2 * 1010 vg por ratón que es similar a las dosis usadas previamente en inyección IV, administración oral o inyección directa en la almohadilla de grasa. Dos semanas después de la administración de Rec2, los ratones se sometieron a una medición de bioluminiscencia in vivo y se observó una fuerte actividad de luciferasa principalmente en el abdomen (Figura 1A). Para confirmar la eficacia del vector Rec2 a través de la administración IP, se generaron vectores Rec2 para administrar otro gen informador GFP y se probaron tres dosis (5 * 108, 2 * 109, 1 * 1010 vg por ratón). Dos semanas después de la inyección de Rec2, se recogieron los tejidos y se midió la fluorescencia de GFP en lisados de tejidos frescos. Rec2-GFP a la dosis de 1 * 1010 vg por ratón dio como resultado una expresión robusta de GFP en todos los depósitos de grasa visceral examinados, incluidos el epidídimo (eWAT), mesentérico (mWAT) y retroperitoneal (rWAT) (Figura 1B). La fluorescencia de GFP también se detectó en el hígado pero no en el intestino (Figura 1B). La inmunohistoquímica confirmó la expresión transgénica en VAT e hígado (Figura 1C).
2. Ejemplo 2: Transducción preferencial de VAT utilizando un vector Rec2 de casete dual que restringe la expresión transgénica fuera del objetivo en el hígado
64. Para evitar la expresión del transgén en el hígado, se generó un nuevo plásmido de expresión de AAV que contenía dos casetes de expresión: uno usaba el promotor CBA para impulsar el transgén y el otro usaba el promotor de albúmina específico del hígado para impulsar un microARN específico dirigido a la secuencia del elemento regulador postranscripcional de la marmota (WPRE) que solo existe en el casete de expresión del transgén (Figura 2A). WPRE mejora la expresión del transgén y se incorpora en todos los plásmidos de expresión de AAV. El microARN dirigido a WPRE (miR-WPRE) eliminó la expresión transgénica más de 90% in vitro medido por RT-PCR cuantitativa y ELISA. La eficacia de este vector de casetes duales (llamado AS/Rec2) fue evaluado por inyección IP de AS/Rec2-GFP a ratones de tipo silvestre. La incorporación del casete restrictivo del hígado disminuyó severamente la expresión transgénica en el hígado a la dosis más alta de 2 * 1010 vg por ratón (Figura 2B). A una dosis más baja de 1 * 1010 vg por ratón, la fluorescencia de GFP fue indetectable en el hígado, mientras que la fluorescencia de GFP sustancial se mantuvo en eWAT (Figura 2B). Para caracterizar mejor el vector AS/Rec2, se realizó un experimento de dosis-respuesta con cuatro dosis: 1 * 1010, 2 * 1010, 3 * 1010 y 4 * 1010 vg por ratón. En todo el rango de dosis, la expresión del transgén hepático se suprimió severamente a pesar de que se detectó una gran cantidad de ADN del vector viral en el hígado (Figura 2C, D), lo que confirma la eficacia del vector de casete dual. La fluorescencia de GFP fue indetectable en intestino delgado, intestino grueso, bazo, riñón, testículo, grasa parda o grasa subcutánea.
3. Ejemplo 3: Terapia molecular de la deficiencia congénita de leptina mediante la administración IP del vector AS/Rec2-leptina
65. Para investigar el potencial terapéutico del vector AS/Rec2, se generó el vector AS/Rec2-leptina para tratar ratones modelo ob/ob de obesidad con deficiencia de leptina con AS/Rec2-GFP como control. Ratones ob/ob macho, de 6 semanas de edad, se agruparon aleatoriamente para recibir una inyección IP de AS/Rec2-leptina o AS/Rec2-GFP, 4x1010 vg por ratón. Los ratones ob/ob a las 6 semanas de edad eran obesos en comparación con los ratones de tipo silvestre (WT) de la misma edad. Los ratones ob/ob tratados con AS/Rec2-GFP continuaron ganando peso rápidamente y se volvieron obesos mórbidos (Figura 3A, B, C). Por el contrario, el tratamiento con AS/Rec2-leptina evitó por completo el aumento de peso y normalizó el peso corporal cerca de los ratones WT de la misma edad 4 semanas después de la inyección de AS/Rec2-leptina (Figura 3A-C, Figura 4C). La pérdida de peso fue estable y sostenida a lo largo de las 9 semanas de duración del estudio. Se observó una fuerte caída en la ingesta de alimentos en ratones tratados con AS/Rec2-leptina tan pronto como 1 semana después de la administración de AAV y la reversión de la hiperfagia de ratones ob/ob se mantuvo de manera similar a la pérdida de peso (Figura 3D). El tratamiento con AS/Rec2-leptina también corrigió la temperatura corporal anormalmente baja de ratones ob/ob y termogénesis alterada en respuesta al ayuno (Figura 3E). Cuatro semanas después de la administración de Rec2, se determinó la composición corporal usando EchoMRI. La adiposidad se redujo en un 65% mientras que la masa magra se incrementó en un 75% en ratones tratados con AS/Rec2-leptina en comparación con ratones con GFP (Figura 3F). El nivel de leptina en suero se midió usando ELISA 4 semanas después de la administración de AAV. El tratamiento con AS/Rec2-leptina dio como resultado un nivel de leptina circulante ligeramente más bajo que el de los ratones WT de la misma edad sin significación estadística (Figura 4A), mientras que la leptina fue indetectable en los ratones ob/ob tratados con GFP. El tratamiento con AS/Rec2-leptina rescató por completo el control glucémico alterado de ratones ob/ob (Figura 4B). De hecho, el nivel de glucosa en sangre en ratones ob/ob tratados con AS/Rec2-leptina fue incluso más bajo que en ratones WT en algunos momentos de la prueba de tolerancia a la glucosa (Figura 4B). La calorimetría indirecta se realizó 5 semanas después de la administración de Rec2. Los ratones tratados con AS/Rec2-leptina mostraron un mayor consumo de oxígeno y actividad locomotora tanto en las fases oscuras como claras (Figura 4E, F) en consonancia con un gasto energético elevado. Por el contrario, la ingesta de alimentos fue menor en ratones tratados con AS/Rec2-leptina (Figura 4D) similares a los hallazgos en la jaula de albergue (Figura 3D).
66. En el sacrificio 9 semanas después de la inyección de AAV, eWAT de ratones tratados con AS/Rec2-leptina se redujo en un 82.5% en comparación con los ratones tratados con GFP cuando se calibraron al peso corporal (Figura 5A). La masa hepática también disminuyó (Figura 5A) y la esteatosis hepática se revirtió por completo mediante el tratamiento con AS/Rec2-leptina (Figura 5C). Además, el tratamiento con AS/Rec2-leptina corrigió completamente la hiperinsulinemia de ratones ob/ob (Figura 5B). La expresión transgénica en depósitos de grasa visceral se confirmó en ratones AS/Rec2-GFP mientras que se detectó fluorescencia mínima de GFP en los hígados (Figura 5D).
4. Ejemplo 4: Discusión
67. Es un desafío adaptar las técnicas tradicionales para modular selectivamente las funciones adiposas in vivo para aplicaciones experimentales y terapéuticas. Unos pocos grupos se han dirigido al tejido adiposo con serotipos de AAV naturales mediante inyección directa en depósitos de grasa con un éxito limitado. Un serotipo Rec2 híbrido modificado muestra una transducción superior tanto de BAT como de WAT subcutáneo (SAT) en comparación con AAVI o AAV8. La inyección directa del vector Rec2 a una dosis moderada (1 * 109 a 1 * 1010 vg por depósito de grasa) es suficiente para modular la función del depósito de grasa objetivo (BAT o SAT) y da como resultado cambios metabólicos sistémicos. El vector Rec2 es eficiente tanto para aplicaciones de sobreexpresión como de eliminación. Sin embargo, hasta la fecha, escasos estudios informan la administración sistémica de AAV para transducir múltiples depósitos adiposos. Un estudio informa que la administración intravenosa del vector AAV8 transduce tejidos adiposos, hígado y otros tejidos. Sustitución del promotor de CMV por potenciador/promotor de adiponectina humana aumenta la especificidad para el tejido adiposo, mientras que la expresión transgénica no se suprime en el hígado. La incorporación de la secuencia objetivo de miR-122 (miR-122T) en la UTR 3' del vector AAV puede eliminar la expresión del transgén hepático, pero a menudo a expensas de una menor expresión del transgén en el tejido adiposo. Además, la dosis de 1 * 1012 vg por ratón utilizada en este estudio es aproximadamente 100 veces mayor que la dosis de inyección de grasa directa del vector Rec2. En este trabajo, se diseñó un nuevo plásmido de expresión de AAV de casete dual y se combinó esta estrategia de restricción hepática con el serotipo adipotrófico Rec2 y la administración IP para lograr, por primera vez, la transducción selectiva de múltiples depósitos de grasa visceral. Más alentador es la dosis baja para la administración IP de este nuevo sistema de vector AAV que es equivalente a la inyección de grasa directa y 2 órdenes más baja que la administración IV informada del sistema de orientación adiposa basado en AAV8.
68. Para mejorar la transducción preferencial de tejido, particularmente cuando se usa la administración sistémica, miR-122T se usa a menudo para suprimir la expresión transgénica fuera del objetivo en el hígado porque miR-122 es muy abundante en el hígado. Sin embargo, este enfoque puede causar toxicidades, porque miR-122T exógeno dentro de un hepatocito altamente expresado puede competir con miR-122T endógeno por miR-122. Y se han informado toxicidades hepáticas que incluyen esteatosis hepática, hepatitis o carcinoma hepatocelular en ratones con eliminación de miR-122. Aunque este riesgo es muy bajo, un enfoque alternativo para eliminar el riesgo mejora la seguridad de las aplicaciones clínicas. Se usó un promotor de albúmina específico del hígado para impulsar un microARN dirigido a WPRE que solo existía en el mismo vector AAV que albergaba el transgén y, por lo tanto, no interfiere con ningún gen o microARN endógeno. El miR-WPRE fue muy eficaz para eliminar la expresión del transgén incluso cuando estaba impulsado por un fuerte promotor de CBA y, en combinación con una dosis adecuada, se logró suficiente expresión del transgén en VAT mientras que se logró una mínima expresión hepática.
69. Una característica interesante del serotipo Rec2 es que su tropismo tisular está influenciado por la vía de administración. La administración oral conduce a la transducción preferencial del BAT interescapular distal con una transducción mínima del estómago o el intestino. La inyección intravenosa da como resultado la transducción principalmente en el hígado. La inyección IP de Rec2 transdujo robustamente VAT mientras que se observó una mínima expresión transgénica en SAT o BAT. Esta característica permite la modulación preferencial de VAT, los depósitos de grasa estrechamente asociados con el riesgo de síndromes metabólicos y enfermedades del corazón. Además, la administración IP del vector Rec2 permite la manipulación genética de mWAT a la que, de otro modo, sería difícil acceder incluso a través de enfoques quirúrgicos invasivos.
70. La obesidad tiene un componente genético sustancial. Las deficiencias congénitas de leptina en humanos causan obesidad severa, hiperfagia e hiperinsulinemia. La terapia de reemplazo de leptina es necesaria en pacientes con mutaciones Lep homocigotas o deficiencia de leptina adquirida derivada de lipodistrofia congénita o adquirida. El tratamiento con leptina recombinante mediante inyección subcutánea produce efectos de corta duración, por lo que requiere dosis repetitivas. Y el aumento suprafisiológico en el nivel de leptina circulante después de una inyección regular está asociado con efectos secundarios graves. Se han intentado terapias génicas con vectores AAV en los ratones ob/ob, un modelo animal que recapitula mejor las deficiencias congénitas de leptina humana. La transferencia del gen de leptina intramuscular mediada por AAV (1 * 1011 vg por inyección) alivia la obesidad y la diabetes. Hasta la fecha, solo se informa de un estudio de terapia génica para reintroducir el gen de la leptina en su tejido nativo. La inyección intravenosa del vector dirigido a tejido adiposo basado en AAV2/8 a ratones ob/ob a la dosis de 1 * 1012 vg por ratón, da como resultado un nivel máximo de leptina aproximadamente 7% del nivel de leptina circulante en los ratones WT de la misma edad y atenúa parcialmente los síndromes metabólicos. En cambio, en el mismo modelo de ratón ob/ob, la inyección IP del nuevo vector Rec2 dirigido al tejido adiposo a razón de 4 * 1010 vg por ratón, 25 veces menor que la dosis informada, normalizó el nivel de leptina cerca a la del ratón WT de la misma edad (Figura 4A). Además, el tratamiento con AS/Rec2-leptina revirtió por completo la hiperinsulinemia y el deterioro de la tolerancia a la glucosa, y corrigió de manera sólida otros síntomas metabólicos, incluidos la obesidad, la hiperfagia, el bajo gasto de energía, la termogénesis alterada y la baja actividad física mucho más cerca de los animales WT de la misma edad, lo que indica avances en comparación con la eficacia limitada con los sistemas de AAV anteriormente informados.
71. Tanto los estudios en animales como en humanos han demostrado que restaurar el nivel de leptina circulante al 10 % de los niveles normales es suficiente para aliviar los síndromes metabólicos asociados con la deficiencia congénita de leptina. Por lo tanto, es probable que la dosis de AS/Rec-leptina podría reducirse aún más a 1 * 1010 vg por ratón, una dosis basada en la masa corporal cercana a la dosis de 1 * 1012 vg por kg de alipogen tiparvovec (Glybeta) que ha demostrado ser segura y eficaz en pacientes. Además, los estudios clínicos de deficiencias genéticas en factor VIII, factor IX de hemofilia y lipoproteína lipasa (LPL) han demostrado que la terapia génica de AAV que produce correcciones muy pequeñas de los niveles fisiológicos (5 a 10% de los niveles normales) es capaz de revertir profundamente los cambios fisiológicos aberrantes, incluido el primer fármaco de terapia génica aprobado en Europa. El tejido adiposo es un órgano secretor y los adipocitos maduros están diferenciados terminalmente y no se dividen y, por lo tanto, son un objetivo atractivo para los vectores de expresión génica que no se integran, tal como el AAV. La alta eficiencia del nuevo vector AAV dirigido al tejido adiposo indica aplicaciones potencialmente más amplias, por ejemplo, reemplazar un gen defectuoso en los tejidos adiposos, inducir cambios fenotípicos adiposos para lograr beneficios sistémicos o producir proteínas terapéuticas para enfermedades no asociadas con la disfunción adiposa.
72. En resumen, los datos demuestran, por primera vez, que la administración IP de un nuevo vector AAV transduce selectivamente los depósitos de grasa visceral con una expresión transgénica mínima fuera del objetivo en el hígado. Una administración de AS/Rec2-leptina a una dosis mucho más baja que el informe anterior conduce a una reversión sostenida y casi completa de las anomalías metabólicas en un modelo de ratón que representa una enfermedad genética humana, la deficiencia congénita de leptina.
5. Ejemplo 5: Materiales y Métodos
(1) Ratones
73. Se adquirieron ratones C57/BL6 de tipo silvestre, de 8 a 12 semanas de edad, de Charles River (Spencerville, OH). Se adquirieron ratones ob/ob en un fondo de C57/BL6 de Jackson Laboratories (Bar Harbor, m E). Todos los ratones se alojaron en una habitación con temperatura controlada (22-23 °C) con un ciclo de 12 h de luz - 12 h de oscuridad, y se mantuvieron con una dieta estándar para roedores (comida para roedores 7912, Teklad) con libre acceso a alimentos y agua. En todos los estudios se utilizaron ratones macho. Todo uso de animales fue aprobado por, y de acuerdo con, el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Estatal de Ohio.
(2) Construcción y empaquetamiento de vectores AAV
74. El plásmido rAAV contiene un casete de expresión vectorial que consiste en el potenciador de CMV y el promotor de p-actina de pollo (CBA), el elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE) y la poli-A de la hormona de crecimiento bovina (bGH) flanqueada por repeticiones terminales invertidas de AAV2. Se insertaron transgenes, por ejemplo, GFP, luciferasa, en los múltiples sitios de clonación entre el promotor CBA y la secuencia de WPRE. Los vectores Rec2 se empaquetaron y purificaron.
(3) WPRE dirigido a microARN.
75. Se clonaron dos secuencias dirigidas en la secuencia WPRE en el vector de expresión e ARNi Block-iT PoMI miR ARNi (pcDNA6.2-Gw/miR, Invitrogen). La eficacia de eliminación se determinó cotransfectando células HEK293 con un plásmido de expresión de AAV estándar que contenía BDNF como transgén. En experimentos in vitro, ambas construcciones de miR inhibieron la expresión de BDNF en al menos un 90%, confirmado por qRT-PCR y ELISA BDNF (Promega). El miR-WPRE (secuencia de miR maduro: CTATGTGGACGCTGCTTTA) (SEQ ID NO: 1) se eligió para la construcción del plásmido de casete dual.
(4) Construcción y empaquetamiento del vector específico de tejido adiposo de casete dual
76. Para construir un plásmido de expresión específico de tejido adiposo de casete dual, la región proximal del promotor de albúmina de ratón (-317 a 18, el sitio de protección se designa como 1) se generó usando pALB-GFP como plantilla con XbaI y BamHI flanqueando a cada lado. pALB-GFP es un obsequio de Snorri Thorgeirsson (plásmido Addgene #55759). La longitud del promotor de albúmina específico del hígado se basa en un fragmento A de 400 pb del gen de la albúmina de rata inmediato a las secuencias flanqueantes 5' que abarcan los -390 a 10 pb que conducen a la expresión del gen informador solo en líneas celulares que expresan la albúmina de rata. Esta secuencia de 400 pb se considera como un promotor altamente específico de células. Elegimos la secuencia del promotor de albúmina de ratón en función de la homología entre los genes de albúmina de ratón y rata. El ADNc de leptina de ratón se amplificó a partir de ADNc de tejido adiposo de ratón, se secuenció y luego se subclonó en los múltiples sitios de clonación entre el promotor c Ba y WPRE. El casete que contenía miR-WPRE impulsado por el promotor de albúmina luego se clonó en el plásmido de expresión de AAV que contenía transgenes (leptina o GFP) para generar plásmidos de casete dual (Fig. 2). Los vectores del serotipo Rec2 se empaquetaron como se describió anteriormente.
(5) Administración del vector Rec2
77. Los vectores Rec2 se administraron a ratones mediante inyección intraperitoneal en 150 pl de tampón de dilución de AAV. Para los experimentos con ratones de tipo silvestre, se usaron dosis que oscilaban entre 5 * 109 a 4 * 1010 vg por ratón. Para el experimento con ratones ob/ob, se inyectó IP el vector AS/Rec2-leptina a una dosis de 4 * 1010 vg por ratón.
(6) Imágenes de luciferasa
78. La formación de imágenes de luciferasa se llevó a cabo dos semanas después de la administración de Rec2-luciferasa mediante administración IP (2 * 1010 vg por ratón). Los pelos sobre el abdomen fueron removidos parcialmente. La sal de potasio de D-luciferina (Gold Biotechnology, Inc.) se inyectó por vía intraperitoneal en cada ratón a una dosis de 150 pg/g de peso corporal. Después de diez minutos, los ratones se anestesiaron en una cámara de isoflurano y luego se colocaron en una cámara de exploración cálida y hermética a la luz. Las imágenes de bioluminiscencia se generaron usando IVIS Lumina II, Caliper (instalaciones centrales para obtención de imágenes de animales pequeños de la Universidad Estatal de Ohio) y se presentaron por la unidad de radiación de fotones/segundo/cm2/sr, que es el número de fotones por segundo que salen de un centímetro cuadrado de tejido y se irradian en un ángulo sólido de un estereorradián (sr).
(7) Medición del contenido de GFP
79. Se diseccionaron las almohadillas de grasa. Se midió el contenido de GFP. En resumen, los tejidos se homogeneizaron en tampón RIPA enfriado con hielo (Tris-HCl 25 mM, pH 7.6, NaCl 150 mM, NP-40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 1 %, SDS al 0.1 %) complementado con un cóctel de inhibidores de proteinasa, seguido de una breve sonicación. A continuación, la mezcla se centrifugó a 13,000 rpm durante 15 min a 4 °C. Se recogió el sobrenadante. La fluorescencia de GFP en 100 pl de sobrenadante se midió con un microlector (Texas Instrument) usando una longitud de onda de excitación de 488 nm y corte de longitud de onda de emisión de 515 nm/525 nm. El contenido de GFP se representó como lecturas después de restar la autofluorescencia del tejido correspondiente sin GFP y se corrigió por el contenido de proteína en las muestras.
(8) Experimento con ratones ob/ob
80. Se asignaron aleatoriamente ratones ob/ob de seis semanas de edad para recibir AS/Rec2-leptina o AS/Rec2-GFP (4 * 1010 vg por ratón, IP). El peso corporal y la ingesta de alimentos se controlaron semanalmente durante un período de 9 semanas.
(9) Análisis de tolerancia a glucosa
81. Cuatro semanas después de la administración IP de los vectores Rec2, se inyectó IP a los ratones una solución de glucosa (1 mg de glucosa por g de peso corporal) después del ayuno nocturno. Se extrajo sangre de la cola en varios momentos y se midieron las concentraciones de glucosa en sangre con un medidor de glucosa portátil (Bayer Contour Next).
(10) Medición de temperatura rectal
82. Se usó una sonda de temperatura (Physitemp, modelo BAT-12) cubierta con lubricante (vaselina blanca) para medir la temperatura rectal de ratones ob/ob en varios puntos de tiempo después de la administración IP de vectores Rec2.
(11) Estudios metabólicos
83. Cinco semanas después de la administración IP de vectores Rec2, se sometieron ratones ob/ob a calorimetría indirecta utilizando el sistema de control de animales de laboratorio Oxymax (Columbus Instruments). Cada ratón se habituó al instrumento durante 24 h y se controlaron los parámetros fisiológicos y de comportamiento durante 48 h (actividad, consumo de alimentos y agua, rendimiento metabólico y temperatura). El consumo de oxígeno, la producción de dióxido de carbono y la producción de metano se normalizaron al peso corporal y se corrigieron a un valor de masa efectiva según el software del fabricante. (12) Composición corporal por EchoMRI
84. Se utilizó EchoMRI para medir la composición corporal de las masas grasa, magra, agua libre y agua total en ratones vivos sin anestesia. Las imágenes de EchoMRI se realizaron con el analizador EchoMRI en el Small Animal Imaging Core of The Dorothy M. Davis Heart & Lung Research Institute, Universidad Estatal de Ohio. (13) Histología e inmunohistoquímica
85. Los tejidos hepáticos se congelaron en OCT y se crioseccionaron a 8 pm. Los lípidos en el hígado se tiñeron en secciones congeladas con una solución Oil Red O (Sigma). Los tejidos adiposos se fijaron en formalina al 10 %, luego se incluyeron en parafina y se seccionaron a 5 pm en las instalaciones centrales del OSU Comprehensive Cancer Center. Las secciones incluidas en parafina se sometieron a recuperación de antígeno basada en citrato seguida de incubación con anticuerpo contra GFP (Abcam, Cambridge). Las secciones se visualizaron con 3,3-diaminobencidina (DAB) y se contrastaron con hematoxilina.
(14) Parámetros metabólicos
86. La leptina en suero se midió utilizando un sistema de desarrollo DuoSet ELISA (R & D Systems). La insulina en suero se determinó con ELISA de insulina de ratón (ALPCO).
(15) Medición del número de copias del vector viral
87. El ADN total de los tejidos se aisló utilizando el kit de Tejido y Sangre DNeasy (Qiagen). El fragmento de WPRE se amplificó para determinar el número de copias de la partícula viral. Se utilizaron 50 ng de ADN de cada muestra para la PCR en tiempo real. El fragmento genómico nucleico de ratón del gen GAPDH se usó como control para el ADN genético de ratón. La curva estándar para el número de copias se generó a partir de un ADN plasmídico conocido. Los vectores virales se aislaron y purificaron de la sangre utilizando el kit de ácido nucleico viral de alta pureza (Roche).
(16) Análisis estadístico
88. Los datos se expresan como la media ± SEM. El software JMP se utilizó para analizar lo siguiente: análisis de varianza bidireccional para el peso corporal, la ingesta de alimentos y la tolerancia a la glucosa; Prueba t de Student para datos de adiposidad, temperatura corporal y biomarcadores en suero.
E. Referencias
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un sistema para administrar un transgén al tejido adiposo visceral que comprende un vector de virus adenoasociado (AAV) modificado por el serotipo híbrido Rec2 que comprende dos casetes de expresión; en donde el primer casete comprende un elemento regulador y un transgén unido operativamente a un promotor; y en donde el segundo casete comprende un promotor específico de tejido unido operativamente a un elemento silenciador de ARN que se dirige al elemento regulador en el primer casete de expresión.
2. El sistema de la reivindicación 1, en donde el elemento regulador del primer casete es una secuencia del elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE)
3. El sistema de la reivindicación 1 o 2, en donde el transgén del primer casete es un gen de leptina.
4. El sistema de la reivindicación 1 o 2, en donde el transgén del primer casete es un gen de IL-15.
5. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el elemento silenciador de ARN es un microARN.
6. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el promotor específico de tejido del segundo casete es un promotor específico de hígado.
7. El sistema de la reivindicación 6, en donde el promotor específico del hígado es un promotor de albúmina, un promotor de globina fijadora de tiroxina, un promotor de fosfoenolpiruvatocarboxiquinasa (PEPCK), un promotor de tirosina aminotransgerasa (TAT) o un promotor de alfa 1 -antitripsina humana (hAAT).
8. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para uso en terapia.
9. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones anteriores para uso en un método para tratar la diabetes, la obesidad, el síndrome metabólico o la lipodistrofia en un sujeto; en donde el primer casete comprende un elemento regulador y un transgén de leptina unido operativamente a un promotor; y en donde el segundo casete comprende un promotor específico del hígado ligado operativamente a un microARN que se dirige al elemento regulador en el primer casete de expresión.
10. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para uso en un método para tratar el cáncer en un sujeto; en donde el primer casete comprende un elemento regulador y un transgén de IL-15 unido operativamente a un promotor; y en donde el segundo casete comprende un promotor específico del hígado unido operativamente a un microARN que se dirige al elemento regulador en el primer casete de expresión.
11. El sistema de la reivindicación 9 o 10, en donde el elemento regulador del primer casete es una secuencia del elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE).
12. El sistema según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde el vector AAV se administra por vía intraperitoneal.
13. El sistema de una de las reivindicaciones 9 a 12, en donde el promotor específico del hígado es un promotor de albúmina, un promotor de globina de unión a tiroxina, un promotor de fosfoenolpiruvatocarboxiquinasa (PEPCK), un promotor de tirosina aminotransgerasa (TAT) o un promotor de alfa 1 -antitripsina humana (hAAT).
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