ES2932099B2 - Compuestos ligandos del receptor cxcr4 y uso de los mismos - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Compuestos ligandos del receptor CXCR4 y uso de los mismos

La presente invención se refiere a nuevos compuestos que actúan como ligandos del receptor CXCR4, así como a su uso para el tratamiento de enfermedades mediadas por dicho receptor, como son el cáncer, infección por VIH o la artritis reumatoide.

La presente invención se encuadra, por tanto, en el campo de la medicina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El receptor CXCR4 es una proteína que se encuentra en la membrana celular y que interviene en el desarrollo de ciertas enfermedades. En particular, el receptor CXCR4 se une a la citoquina CXCL12, cuyos niveles elevados están asociados a inflamaciones difícilmente tratables y a la metástasis tumoral. Por otra parte, el virus VIH, causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), necesita unirse al receptor CXCR4 para infectar la célula (Choi WT, Yang Y, Xu Y, An J. Targeting chemokine receptor CXCR4 for treatment of HIV-1 infection, tumor progression, and metastasis. Curr Top Med Chem. 2014;14(13):1574-89). Este receptor CXCR4 también está implicado en enfermedades autoinmunes, como la esclerosis múltiple (Eva M. García-Cuesta et al. The Role of the CXCL12/CXCR4/ACKR3 Axis in Autoimmune Diseases. Front Endocrino! (Lausanne) 2019; 10: 585) estando involucrado en procesos de remielinización (Kevin S. Carvajal et al. XCR4 Signaling Regulates Remyelination by Endogenous Oligodendrocyte Progenitor Cells in a Viral Model of Demyelination. Glia. 2011 Dec; 59(12): 1813-1821).

En el estado de la técnica se conocen algunos compuestos que actúan sobre el receptor CXCR4, tales como los divulgados en el documento ES2370986 (B1) en el que se reivindica su uso para el tratamiento del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA).

El documento US2014303170 (A1) describe compuestos que modulan la actividad de CXCR4 y que pueden usarse para el tratamiento de enfermedades en las que dicho receptor está involucrado, como es el caso del cáncer.

A fin de proporcionar nuevas terapias útiles para el tratamiento de enfermedades mediadas por el receptor CXCR4, la presente invención propone nuevos compuestos que actúan como ligandos del mismo de manera que inhiben su actividad; de esta forma los compuestos de la invención pueden utilizarse para el tratamiento y/o prevención de enfermedades en las que el receptor CXCR4 desempeña un papel importante.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores de la presente invención han demostrado que los compuestos aquí descritos se unen al receptor CXCR4 (son ligandos del receptor CXCR4), de manera que inhiben su actividad en el desarrollo de enfermedades mediadas por el mismo, como son el cáncer, la infección por VIH o la artritis reumatoide.

Así, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I):

una sal farmacéuticamente aceptable, un isómero o un solvato del mismo, donde

R¹ es H y R² es un grupo arilo o un alquilo C¹-C⁴

o bien

R¹ y R² forman un heterociclo de 4 a 6 eslabones con el N al que están unidos y donde dicho heterociclo comprende uno o varios heteroátomos, siendo todos ellos N.

El término "arilo" se refiere a un grupo de hidrocarburos aromáticos con un solo anillo (monocíclico) o múltiples anillos (bicíclico o policíclico), que pueden estar fusionados o unidos covalentemente. Ejemplos son: fenilo, naftilo, difenilo, indenilo, fenantrilo o antracilo.

Cuando R² es arilo, éste está preferiblemente sustituido por un heterociclo conteniendo al menos un nitrógeno o por un amino -NRaRb, donde Ra y Rb son cada uno independientemente un grupo alquilo C¹-C⁴, o bien, Ra y Rb forman con el N un heterociclo.

De acuerdo a la presente invención, cuando se indica que “un grupo está sustituido” significa que al menos uno de los H de ese grupo está sustituido por un grupo distinto a H.

El término "alquilo C¹-C⁴” se refiere, en la presente invención, a radicales de cadenas hidrocarbonadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 4 átomos de carbono y que se unen al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, propilo, etilo, metilo, isopropilo, butilo, etc. Estos radicales alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por un heterociclo conteniendo al menos un nitrógeno o por un amino -NRaRb, donde Ra y Rb son cada uno independientemente un grupo alquilo C¹-C⁴ , o bien, Ra y Rb forman con el N un heterociclo.

En la presente invención, el término "heterociclo" se refiere a cadenas hidrocarbonadas cíclicas que tienen de 4 a 6 eslabones, preferiblemente 6, y que se unen al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, en las que al menos un átomo de carbono de la cadena principal ha sido sustituido por O, N ó S. Pueden estar saturados o insaturados, aunque preferiblemente están saturados.

En una realización preferida, R¹ es H y R² es un grupo fenilo.

En una realización más preferida, R¹ es H y R² es un grupo fenilo sustituido por un heterociclo de 4 a 6 eslabones, más preferiblemente por un heterociclo que comprende un átomo de O y uno de N y seis eslabones.

En otra realización preferida, R¹ es H y R² es un grupo fenilo sustituido por un grupo NR’R’’. R' y R'' son cada uno independientemente un grupo alquilo C¹-C⁴, o bien, R’ y R’’ forman con el N un heterociclo de 4 a 6 eslabones, preferiblemente un heterociclo de seis eslabones y que contiene además un átomo de oxígeno.

En otra realización preferida, R¹ es H y R² es alquilo C¹-C⁴ ; más preferiblemente R² es alquilo C¹-C⁴ sustituido por un heterociclo de 4 a 6 eslabones, más preferiblemente por un heterociclo que comprende un átomo de O y uno de N y seis eslabones.

En una realización más preferida, R¹ es H y R² es etilo; más preferiblemente, R² es etilo sustituido por un heterociclo de 4 a 6 eslabones, más preferiblemente por un heterociclo que comprende un átomo de O y uno de N y seis eslabones.

En otra realización preferida, R¹ y R² forman un heterociclo, preferiblemente saturado, de seis eslabones con el N, donde dicho heterociclo comprende uno o dos átomos de N.

En otra realización preferida, R¹ y R² forman un heterociclo de 4 a 6 eslabones con el N donde dicho heterociclo, comprendiendo 1 o 2 átomos de N, está sustituido por un arilo, preferiblemente fenilo. Dicho arilo está preferiblemente sustituido por uno o más grupos seleccionados de NO² , CF³ o combinaciones de los mismos.

En otra realización preferida, R¹ y R² forman un heterociclo de 6 eslabones con el N donde dicho heterociclo, comprendiendo 1 o 2 átomos de N, está sustituido por un grupo -COOR’’’, siendo R’’’ un alquilo C¹-C⁴ , preferiblemente etilo.

De manera preferida, la invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) seleccionado de los siguientes:

Los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más nitrógenos básicos y, por lo tanto, podrían formar sales con ácidos, tanto orgánicos como inorgánicos. Ejemplos de tales sales incluyen: sales con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico; y sales con ácidos orgánicos tales como ácido metanosulfónico, ácido trifluorometano sulfónico, ácido etanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido fumárico, ácido oxálico , ácido acético, ácido maleico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido malónico, ácido glicólico, ácido succínico y ácido propiónico, entre otros. Algunos compuestos de la presente invención pueden contener uno o más protones ácidos y, por lo tanto, también pueden formar sales con bases. Ejemplos de tales sales incluyen: sales con cationes inorgánicos tales como sodio, potasio, calcio, magnesio, litio, aluminio, zinc, etc; y sales formadas con aminas farmacéuticamente aceptables tales como amoniaco, alquilaminas, hidroxialquilaminas, lisina, arginina, N-metilglucamina, procaína y similares.

No hay limitación sobre el tipo de sal que puede usarse, pero siempre y cuando se use para fines terapéuticos, tendrán que ser farmacéuticamente aceptables. Se entiende por sales farmacéuticamente aceptables aquellas sales que, según criterios médicos, son adecuadas para uso en contacto con tejidos de humanos u otros mamíferos sin causar indebida toxicidad, irritación, respuesta alérgica o similares. Las sales farmacéuticamente aceptables son ampliamente conocidas por los expertos en el tema.

Las sales de un compuesto de fórmula (I) se pueden obtener durante el aislamiento final y purificación de los compuestos de la invención o pueden prepararse por tratamiento de un compuesto de fórmula (I) con una cantidad suficiente del ácido o base deseado para dar la sal de una manera convencional. Las sales de los compuestos de fórmula (I) pueden a su vez ser transformados en otras sales de compuestos de fórmula (I) por intercambio iónico por un ion resina de intercambio.

Los compuestos de fórmula (I) y sus sales pueden diferir en ciertas propiedades físicas, pero son equivalentes a los efectos de la invención. Todas las sales de los compuestos de fórmula (I) están incluidos dentro del alcance de la invención.

Los compuestos de la presente invención pueden formar complejos con disolventes en los que se hacen reaccionar o con los cuales precipitan o cristalizan. Estos complejos son conocidos como solvatos. En este documento, el término solvato se refiere a un complejo de estequiometría variable formado por un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo (soluto) y un solvente. Ejemplos de disolventes incluyen disolventes farmacéuticamente aceptables como agua, etanol y similares. Un complejo con agua se conoce como hidrato. Los solvatos de los compuestos de la invención (o sus sales), incluidos los hidratos, están englobados dentro del alcance de la invención.

Debe entenderse que la presente invención abarca todos los isómeros de los compuestos de fórmula (I), es decir, todas las formas geométricas, tautoméricas y ópticas, y sus mezclas (por ejemplo, mezclas racémicas). Cuando hay más centros quirales en los compuestos de fórmula (I), la presente invención incluye, dentro de su alcance, todas los posibles diastereómeros, incluidas sus mezclas. Las diferentes formas isoméricas pueden ser separadas o resueltas entre ellas utilizando métodos convencionales o se puede obtener cualquier isómero utilizando métodos sintéticos convencionales o por medio de síntesis estereoespecífica, estereoselectiva o asimétrica.

Los compuestos de fórmula (I) pueden existir en diferentes formas físicas, es decir, en formas amorfas y cristalinas. Además, los compuestos de la presente invención pueden tener la capacidad de cristalizar a partir de más de una forma, una característica que se conoce como polimorfismo. Los polimorfos pueden diferenciarse por diversas propiedades físicas bien conocidas por los expertos en la técnica, tales como difractogramas de rayos X, puntos de fusión o solubilidad. Todas las formas físicas de los compuestos de fórmula (I), incluidas todas sus formas polimórficas ("polimorfos") se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

A menos que se indique lo contrario, los compuestos de la invención también incluyen compuestos que solo difieren en la presencia de uno o más átomos enriquecidos isotópicamente. Por ejemplo, compuestos que tienen dicha estructura, excepto la sustitución de un hidrógeno por un deuterio o tritio, o la sustitución de un carbono por un carbono enriquecido en 13C o 14C o un nitrógeno enriquecido en 15N, están dentro del alcance de esta invención.

Un segundo aspecto de la invención, se refiere al procedimiento de preparación de los compuestos de fórmula (I) de la presente invención. El procedimiento comprende la reacción del ácido 4-((4-(4-(hidroximetil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metil)benzoico (II) con una amina R¹-NH-R² (III), (R¹ y R² como se han definido anteriormente) en dimetilformamida (DMF) como disolvente y en presencia de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) e hidrocloruro de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDCHCl) a temperatura ambiente (entre 18 y 25°C), tal y como se muestra en el siguiente esquema:

En una realización preferida, la reacción se lleva a cabo durante un tiempo entre 24 y 72h, más preferiblemente durante 48h.

En una realización preferida, se utiliza un mol del ácido 4-((4-(4-(hidroximetil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metil)benzoico (II) por mol de amina R¹-NH-R² (III).

En una realización preferida, se utiliza el doble de moles de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) que del ácido 4-((4-(4-(hidroximetil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metil)benzoico (II).

En una realización preferida, se utilizan 1,2 moles de EDCHCL por cada mol de ácido 4-((4-(4-(hidroximetil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metil)benzoico (II) utilizado.

El compuesto de fórmula (II) se prepara por reacción del ácido 4-(azidometil)benzoico y (4-etinilfenil)metanol en relación molar 1:1, en presencia de sulfato de cobre pentahidratado y ascorbato de sodio a temperatura ambiente (entre 18 y 25°C).

En una realización preferida, la reacción tiene lugar durante 24 h.

El disolvente de reacción es preferiblemente DMF.

Preferiblemente, la cantidad de sulfato de cobre pentahidratado es 0,1mol % con respecto a los moles de ácido 4-(azidometil)benzoico o (4-etinilfenil)metanol y los moles de ascorbato de sodio son el doble que los de sulfato de cobre pentahidratado.

La síntesis del compuesto (II) se representa en el siguiente esquema:

Otro aspecto de la invención se refiere al compuesto de fórmula (I), una sal farmacéuticamente aceptable, un isómero o un solvato del mismo, para su uso como medicamento.

La presente invención también se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I), una sal farmacéuticamente aceptable, un isómero o un solvato del mismo para la fabricación de un medicamento.

Otro aspecto de la invención se refiere al compuesto de fórmula (I), una sal farmacéuticamente aceptable, un isómero o un solvato del mismo para uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades mediadas por el receptor CXCR4, preferiblemente seleccionadas del grupo que comprende cáncer, la infección por VIH y la artritis reumatoide.

La presente invención también se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I), una sal farmacéuticamente aceptable, un isómero o un solvato del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades mediadas por el receptor CXCR4, preferiblemente seleccionadas del grupo que comprende cáncer, la infección por VIH y la artritis reumatoide.

En una realización preferida, la enfermedad es cáncer y, más preferiblemente, la metástasis tumoral.

En otra realización preferida, la enfermedad es la infección causada por VIH y, más preferiblemente, el SIDA.

En una realización preferida, el compuesto de fórmula (I), una sal farmacéuticamente aceptable, un isómero o un solvato del mismo, se administra por vía digestiva o enteral, parenteral, respiratoria, tópica o transdérmica. Preferiblemente la administración es digestiva o enteral, más preferiblemente oral.

La dosis y la frecuencia de las dosis variarán según la naturaleza y la gravedad de la enfermedad a tratar, la edad, el estado general y el peso del paciente, así como el compuesto particular administrado y la vía de administración, entre otros factores.

La expresión “tratamiento o prevención” tal y como se usa aquí, a menos que se indique lo contrario, significa revertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir el trastorno o afección al que se aplica en tales términos, uno o más síntomas de tal trastorno o afección.

Para su aplicación terapéutica, los compuestos de fórmula (I), los isómeros, sales o solvatos de los mismos, estarán en una farmacéuticamente aceptable o sustancialmente forma pura, es decir, con un grado de pureza farmacéuticamente aceptable, excluyendo aditivos farmacéuticos habituales, como diluyentes y vehículos, sin incluir material considerado tóxico a dosis normales. Los niveles de pureza para el ingrediente activo son preferiblemente mayores que 50%, más preferiblemente, mayores que 70%, más preferiblemente, superior al 90%. En una realización preferida, son más del 95% de los compuestos de fórmula (I) o de sus sales, solvatos o isómeros.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) junto con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La composición debe comprender la cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de fórmula (I) a administrar y dependerá, entre otros factores, del individuo que vaya a ser tratado, de la severidad de la enfermedad que padezca dicho individuo, de la forma de administración elegida, etc.

La expresión “excipientes, adyuvantes y/o vehículos” se refiere a entidades moleculares o sustancias con las que se administra el ingrediente activo. Tales excipientes, adyuvantes o vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como aguas y aceites, incluyendo aquellas de petróleo o de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares, excipientes, disgregantes, agentes humectantes o diluyentes

Otro aspecto de la invención se refiere a la composición farmacéutica definida en el anterior aspecto de la invención para su uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades mediadas por el receptor CXCR4, preferiblemente seleccionadas del grupo que comprende cáncer, la infección por VIH y la artritis reumatoide.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para el tratamiento y/o prevención de enfermedades mediadas por el receptor CXCR4 en un sujeto, preferiblemente seleccionadas del grupo que comprende cáncer, la infección por VIH y la artritis reumatoide, que comprende la administración a dicho sujeto de la cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I), como se ha definido anteriormente.

Un último aspecto de la invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I) para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades mediadas por el receptor CXCR4, preferiblemente seleccionadas del grupo que comprende cáncer, la infección por VIH y la artritis reumatoide.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.

Ejemplo 1: Síntesis y caracterización de compuestos de la presente invención.

1.1. Síntesis de ácido 4-((4-(4-(hidroximetil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metil)benzoico (II).

Se adiciona en un matraz de fondo redondo ácido 4-(azidometil)benzoico (265 mg, 1,5 mmol, Chiralix) y (4-etinilfenil)metanol (198 mg, 1,5 mmol, Sigma Aldrich), A continuación, se disuelven en 8 mL de DMF (Sigma Aldrich) y se añaden sucesivamente sulfato de cobre pentahidratado (37,5 mg, 0,15 mmol, Sigma Aldrich) y ascorbato de sodio (59,5 mg, 0,3 mmol, Sigma Aldrich). La mezcla resultante se deja agitando a temperatura ambiente (18-25°C) durante 24 horas. A continuación, se adiciona H²O (30 ml) y se agita durante 0,5 h. Se filtra el sólido blanco resultante, se lava con agua y se seca a vacío, obteniéndose el ácido triazolilbenzoico como un sólido blanco (69 % de rendimiento). Pf: 232 - 234 °C.

1H NMR (300 MHz, DMSO-da) 58,65 (s, 1H), 7,98 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,83 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,46 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,40 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 5,76 (s, 2H), 4,54 (s, 2H), 13C NMR (75 MHz, DMSO) 5 166,93, 146,73, 142,31, 140,65, 129,78, 129,01, 127,90, 126,89, 124,94, 121,51, 62,64, 52,58,

La síntesis del triazolbenzoico (II) se describe en el siguiente esquema:

1.2. Síntesis de compuestos de fórmula (I)

Sobre una disolución de ácido 4-((4-(4-(hidroximetil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metil)benzoico (II, 123 mg, 0,4 mmol) en 4 mL de DMF (Sigma Aldrich) se añade DMAP (97 mg, 0,8 mmol, Sigma Aldrich) y EDCHCl (92 mg, 0,48 mmol, Sigma Aldrich) y se agita durante 15 min a temperatura ambiente. Posteriormente se adiciona la amina correspondiente (III, 0,4 mmol) y se agita a temperatura ambiente (18-25°C) durante 48 h. A continuación, se adiciona H²O (10 ml) y se extrae con DCM (25 mL x 3). La fase orgánica se seca sobre MgSO⁴ , se filtra y se evapora a presión reducida. El crudo obtenido se purifica mediante cromatografía en columna eluyendo con la mezcla de disolventes DCM - MeOH (desde 99:1 hasta 90:10).

La síntesis de los compuestos se representa en el esquema siguiente:

Compuesto 1: 4-((4-(4-(Hidroximetil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metil)-N-(4-morfolinofenil)benzamida

Se utilizó 4-morfolinofenilamina (71 mg, 0,4 mmol, Sigma Aldrich), obteniéndose tras la purificación en columna el correspondiente triazol como un sólido blanco (44% de rendimiento). Pf: 250 - 252 °C.

1H NMR (300 MHz, DMSO-da) 510,08 (s, 1H), 8,65 (s, 1H), 7,95 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,82 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,62 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,48 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,39 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 6,93 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 5,74 (s, 2H), 5,23 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 4,53 (d, J = 5,7 Hz, 2H), 3,73 (dd, J = 6,0, 3,5 Hz, 4H), 3,06 (t, J = 4,8 Hz, 4H),13C NMR (75 MHz, DMSO) 5164,85, 147,90, 147,09, 142,68, 139,45, 135,29, 131,55, 129,38, 128,39, 128,19, 127,27, 125,29, 121,81, 115,56, 66,46, 62,99, 52,99, 49,18.

HRMS (ESI+) m/z Calc. 437,1563 [C²⁷H²⁷N⁵O³ + H] . Encontrada: 437,1576 [M+H]+,

Compuesto 2: (4-((4-(4-(Hidroximetil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metil)fenil)(4-(2-nitro-4-(trifluorometil)fenil) piperazin-1-il)metanona

Se utilizó (2-nitro-4-(trifluorometil)fenil)piperazina (110 mg, 0,4 mmol, Sigma Aldrich), obteniéndose tras la purificación en columna el correspondiente triazol como un sólido amarillo (37% de rendimiento). Pf: 184 - 186 °C.

1H NMR (300 MHz, DMSO-da) 58,65 (s, 1H), 8,19 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 7,89 (dd, J = 8,9, 2,3 Hz, 1H), 7,81 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,53 - 7,35 (m, 7H), 5,71 (s, 2H), 5,23 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 4,52 (d, J = 5,4 Hz, 2H), 3,73 (s, 2H), 3,48 (s, 2H), 3,21 (s, 4H), 13C NMR (75 MHz, DMSO) 5 169,12, 147,70, 147,08, 142,67, 140,04, 137,84, 135,74, 130,59, 130,54, 129,38, 128,27, 128,00, 127,25, 125,65, 125,29, 124,12, 124,07, 122,06, 121,92, 121,82, 120,57, 120,12, 62,99, 62,87, 52,97, 50,33, 47,01.

HRMS (ESI+) m/z Calc. 437,1563 [C²⁸H²⁵FN⁶O⁴ + H] . Encontrada: 437,1576 [M+H]+.

Compuesto 3: 4-(4-((4-(4-(Hidroximetil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metil)benzoil) piperidina-1-carboxilato de etilo

Se utilizó piperadina-4-carboxilato de etilo (63 mg, 0,4 mmol, Sigma Aldrich), obteniéndose tras la purificación en columna el correspondiente triazol como un sólido blanco (30% de rendimiento), Pf: 119 - 121 °C,

1H NMR (300 MHz, Methanol-ck) 58,40 (s, 1H), 7,89 - 7,74 (m, 2H), 7,56 - 7,31 (m, 6H), 5,73

(s, 2H), 4,66 (s, 2H), 4,48 (d, J = 13,2 Hz, 1H), 4,16 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,69 (d, J = 13,0 Hz, 1H), 3,24 - 2,96 (m, 2H), 2,78 - 2,52 (m, 1H), 2,15 - 1,52 (m, 4H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 13C NMR (75 MHz, MeOD) 5 175,82, 171,87, 149,21, 143,15, 138,81, 137,25, 130,56, 129,43, 128,59, 128,56, 126,71, 122,39, 64,88, 61,79, 54,58, 42,65, 41,96, 29,67, 28,96, 14,51. HRMS (ESI+) m/z Calc. 437,1563 [C²⁵H²⁸N⁴O⁴ + H] . Encontrada: 437,1576 [M+H]+.

Compuesto 4: (4-((4-(4-(hidroximetil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metil)fenil)(4-fenilpiperazin-1-il) metanona

Se utilizó 4-fenilpiperazina (65 mg, 0,4 mmol, Sigma Aldrich), obteniéndose tras la purificación en columna el correspondiente triazol como un sólido blanco (38% de rendimiento). Pf: 159 -161 °C.

1H NMR (300 MHz, DMSO-da) 58,66 (s, 1H), 7,82 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,56 - 7,31 (m, 7H), 7.22 (dd, J = 8,5, 7,1 Hz, 2H), 6,94 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 6,81 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 5,71 (s, 2H), 5.23 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 4,52 (d, J = 5,6 Hz, 2H), 3,74 (s, 2H), 3,44 (s, 2H), 3,15 (d, J = 19,3 Hz, 4H), 13C NMR (75 MHz, DMSO) 5168,90, 151,08, 147,09, 142,68, 137,74, 135,96, 129,38, 129,34, 128,28, 127,89, 127,26, 125,29, 121,84, 119,75, 116,27, 62,99, 52,98, 48,86, 47,18. HRMS (ESI+) m/z Calc. 437,1563 [C²⁷H²⁷N⁵O² + H] . Encontrada: 437,1576 [M+H]+.

Compuesto 5: 4-((4-(4-(hidroximetil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metil)-N-(2-morfolinoetil) benzamida

Se utilizó 2-morfolinoetanamina (53 μL, 0,4 mmol, Sigma Aldrich), obteniéndose tras la purificación en columna el correspondiente triazol como un sólido blanco (31% de rendimiento). Pf: 159 - 161 °C.

1H NMR (300 MHz, DMSO-da) 58,62 (s, 1H), 8,43 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 7,85 - 7,75 (m, 4H), 7,45 - 7,35 (m, 4H), 5,70 (s, 2H), 5,23 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 4,52 (d, J = 5,3 Hz, 2H), 3,56 (t, J = 4,6 Hz, 4H), 3,37 (d, J = 6,9 Hz, 2H), 2,47 - 2,37 (m, 6H),13C NMR (75 MHz, DMSO) 5166,00, 147,06, 142,67, 139,21, 134,70, 129,37, 128,14, 127,98, 127,26, 125,28, 121,79, 66,53, 62,98, 57,67, 53,63, 52,96, 36,91.

HRMS (ESI+) m/z Calc. 437,1563 [C²³H²⁷N⁵O³ + H] . Encontrada: 437,1576 [M+H]+.

Ejemplo 2: Medida de la migración celular en insertos permeables (Transwells)

Se empleó la línea celular Jurkat (American Type Culture Collection (ATCC), CRL-10915), linfocitos T humanos que expresan el receptor CXCR4. Las células [ (3 x 105 células en 0,1 ml de medio RPMI 1640 con 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA) y 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)piperazin-1-iletanosulfónico (HEPES)] se colocaron en el pocillo superior de cámaras de transmigración de 24 pocillos sin recubrimiento (Transwell de 5 ^M de tamaño de poro, Costar, Cambridge, MA). En el pocillo inferior se añadió CXCL12 (20 nM) en 0,6 ml de RPMI con 0,1% de BSA y 10 mM de HEPES. Cuando fue necesario, las células fueron tratadas con dimetilsulfoxido (DMSO, control) o los compuestos a analizar (30 min, 37°C, 5% CO²) antes de añadirlas al pocillo superior de la cámara de migración. Las placas se incubaron (120 min, 37°C, 5% CO²) y las células que migraron a la cámara inferior se contaron en un citómetro de flujo. La migración celular se expresa como el porcentaje de células migradas con respecto al número total de células añadidas al pocillo superior.

Ejemplo 3: Determinación de la movilización de calcio inducida por CXCL12

Las células Jurkat y los linfocitos T primarios CD4+ naive (procedentes del Centro de Transfusiones de la Comunidad Autónoma de Madrid) fueron resuspendidos en RPMI 1640 con 10% de suero de ternera fetal (FCS) (2 x 106 células/ml) e incubados con la sonda fluorescente Fluo-3AM (Invitrogen, Molecular Probes; 0,28 ^g/^l en DMSO, 16 ^l/106 células; 30 min, 37°C). Cuando fue necesario, las células fueron tratadas con DMSO (control), o los compuestos a analizar (1h, 37°C, 5% CO²) antes de marcarlas con la sonda Fluo-3-AM. Las células se lavaron, se resuspendieron en RPMI con 2 mM de CaCh y se mantuvieron a 4°C hasta su activación. El flujo de Ca2+ en respuesta a diferentes concentraciones de CXCL12 (10-50 nM, 37°C) se midió a 525 nm en un citómetro de flujo EPICS XL (Beckman Coulter).

Los datos, analizados con FlowJo 8.2 (Intel), se expresan como porcentaje de la señal máxima (100%).

Ejemplo 4: Efecto sobre el tamaño de los clusters promovidos por CXCL12 (MSI) y la movilidad de los receptores (D1/4) en la membrana celular, medidos por análisis TIRF

Los experimentos se realizaron utilizando un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) (Leica AM TIRF invertido) equipado con una cámara EM-CCD (Andor DU 885-CS0-#10-VP), un objetivo de inmersión en aceite 100x (HCX PL APO 100x/1,46 NA) y un láser de diodo de 488 nm. El microscopio estaba equipado con unidades de incubación y control de temperatura; los experimentos se realizaron a 37°C con un 5% de CO². Se utilizaron células Jurkat (ATCC) transfectadas en el laboratorio con el receptor CXCR4 acoplado a la proteína fluorescente monomérica Ac-GFP, Se adquirieron secuencias de imágenes de partículas individuales (500 fotogramas) a una potencia de láser del 49% con una frecuencia de fotogramas de 10 Hz (100 ms/fotograma). La profundidad de penetración del campo evanescente fue de 90 nm.

Las partículas se detectaron y rastrearon utilizando algoritmos previamente descritos (U-Track2; Jaqaman et al., Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods 2008, 5, 695-702.) implementados en MATLAB. Las posiciones e intensidades de los píxeles de las partículas se calcularon detectando los máximos de intensidad locales significativos que dependen del contraste de la imagen y del ruido en las imágenes.

Para determinar el coeficiente de difusión mínimo detectable en las condiciones experimentales, se utilizaron tanto proteínas monoméricas AcGFP purificadas e inmovilizadas en cubreobjetos de vidrio como células Jurkat CD4+ (cedidas por el Dr, J, Alcamí (Centro Nacional de Microbiología, Inst Salud Carlos III, Madrid, Spain) fijadas y electroporadas con CXCR4-AcGFP (JKCD4). Las células se sembraron en cubreobjetos de vidrio (30 min) y se fijaron con PFA al 4% (20 min). Como el 95% de la proteína monomérica AcGFP inmóvil o de las células JKCD4 fijadas mostraron un coeficiente de difusión de 0,0015 p,m2.s-1, este valor se fijó como umbral para discriminar entre trayectorias inmóviles y móviles.

Para clasificar el tipo de movimiento exhibido por las trayectorias individuales, se utilizó el espectro de escala de momentos (MSS) (Ewers et al., Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci U S A 2005, 102, 15110-15115). Según este análisis, las trayectorias de más de 50 fotogramas podían clasificarse como confinadas, brownianas o dirigidas, en función del valor de su primer momento. Las trayectorias con un primer momento entre el 2,5% y el 97,5% de la distribución obtenida de las simulaciones se consideraron brownianas. Por el contrario, las trayectorias cuyo valor del primer momento era inferior al 2,5% (superior al 97,5%) de la distribución obtenida en las simulaciones se clasificaron como confinadas (dirigidas).

La estimación de la estequiometría de las partículas a partir de la intensidad de las trayectorias individuales se determinó mediante rutinas adicionales en MATLAB (Sorzano et al. Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. 2019 Apr 9;(146)). El valor de la intensidad de cada partícula viene dado por la diferencia entre la intensidad de la partícula y el fondo en cada fotograma. El número total de receptores/partículas se estimó finalmente dividiendo la intensidad media de las partículas por la intensidad de las partículas procedentes de moléculas individuales de AcGFP. Para identificar inequívocamente la intensidad emitida por una AcGFP individual, se utilizaron como calibración células Jurkat CD4+ electroporadas con la CD86-AcGFP monomérica. Se realizaron experimentos SPT con CD86-AcGFP y se analizaron los datos de forma similar a la descrita anteriormente. La distribución de las intensidades de las partículas monoméricas se analizó mediante un ajuste gaussiano que arrojó un valor medio de 1336 ± 156 u.a. Este valor se utilizó entonces como referencia de monómero para estimar el tamaño de las partículas de CXCR4-AcGFP. Todos los experimentos TIRF se repitieron independientemente al menos tres veces, con un mínimo de 8-25 células en cada experimento.

Tabla 1. Resultados biológicos para los compuestos de la invención

Todos los datos corresponden al efecto de una concentración 50 mM del compuesto en las condiciones descritas en los ejemplos 2, 3 y 4.

1 Porcentaje de inhibición de la migración en transwell inducida tras la estimulación con CXCL12 2 Viabilidad celular tras el tratamiento durante 4h con los compuestos seleccionados, analizada en ensayos de incorporación de yoduro de propidio.

3 Porcentaje de inhibición de la movilización de calcio inducida tras la estimulación con CXCL12 4 Número de veces que aumenta el tamaño de los clusters de CXCR4 (msi) en la membrana celular tras la estimulación con CXCL12

5 Número de veces que disminuye en movilidad de CXCR4 (D1/4) en la membrana celular tras la estimulación con CXCL12

n.d. Pendiente de realizar/no determinado

Conclusiones

A la vista de los resultados de la tabla, puede concluirse que estos compuestos inhiben la migración inducida por CXCL12, con respuesta funcional en algún modelo celular y por tanto pueden ser candidatos a fármacos donde el eje CXCR4/CXCL12 esté involucrado.

Al inhibir la migración celular estos compuestos son candidatos a bloquear el movimiento de células tumorales y por lo tanto a frenar el desarrollo de metástasis que se generan durante los procesos tumorales.

El bloqueo del CXCR4 se ha demostrado efectivo para impedir la infección del VIH-1 de células diana. La inhibición de la función mediada por CXCR4 que inducen estos compuestos les sitúa como candidatos de interés para el bloqueo de la interacción entre el VIH-1 y el receptor CXCR4 presente en la superficie celular y por tanto para impedir la infección.

El eje CXCR4/CXCL12 se ha demostrado de gran importancia para el desarrollo de artritis reumatoide, promoviendo el movimiento celular y la acumulación de células que causan la enfermedad. El bloqueo del movimiento celular utilizando los compuestos aquí descritos tiene un gran potencial para disminuir los síntomas causados por esta enfermedad.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Compuesto de fórmula (I):

una sal farmacéuticamente aceptable, un isómero o un solvato del mismo, donde

R¹ es H y R² es un grupo arilo o un alquilo C¹-C⁴ ,

o bien,

R¹ y R² forman un heterociclo de 4 a 6 eslabones con el N al que están unidos y donde dicho heterociclo comprende uno o varios heteroátomos, siendo todos ellos N.

2. Compuesto, según reivindicación 1, donde R¹ es H y R² es un grupo fenilo.

3. Compuesto, según reivindicación 1 o 2, donde R¹ es H y R² es un grupo fenilo sustituido por un heterociclo de 4 a 6 eslabones.

4. Compuesto, según reivindicación 1, donde R¹ es H y R² es etilo.

5. Compuesto, según reivindicación 4, donde R¹ es H y R² es etilo sustituido por un heterociclo de 4 a 6 eslabones.

6. Compuesto, según reivindicación 1, donde R¹ y R² forman un heterociclo de seis eslabones con el N, donde dicho heterociclo comprende uno o dos átomos de N.

7. Compuesto, según reivindicación 6, donde el heterociclo está sustituido por un grupo arilo.

8. Compuesto de acuerdo a la reivindicación 1, en el que el compuesto se selecciona de:

9. Procedimiento para la preparación de un compuesto de formula (I) como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la reacción del ácido 4-((4-(4-(hidroximetil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metil)benzoico (II) con una amina R¹-NH-R² (III), en dimetilformamida (DMF) como disolvente y en presencia de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) e hidrocloruro de N-(3-dimetilaminopropil)-W'-etilcarbodiimida (EDCHCl) a temperatura entre 18 y 25° C, de acuerdo al siguiente esquema:

siendo Ri y R² como se han definido en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

10. Procedimiento, según reivindicación 9, donde se utiliza un mol del ácido 4-((4-(4-(hidroximetil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metil)benzoico (II) por mol de amina R¹-NH-R² (III).

11. Procedimiento, según reivindicación 9 o 10, donde se utiliza el doble de moles de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) que del ácido 4-((4-(4-(hidroximetil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metil)benzoico (II) y/o se utilizan 1,2 moles de EDCHCL por cada mol de ácido 4-((4-(4-(hidroximetil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metil)benzoico (II) utilizado.

12. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde la reacción se lleva a cabo durante 48h.

13. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, donde el compuesto de fórmula (II) se prepara por reacción del ácido 4-(azidometil)benzoico y (4-etinilfenil)metanol en relación molar 1:1 en presencia de sulfato de cobre pentahidratado y ascorbato de sodio a temperatura entre 18 y 25°C.

14. Procedimiento, según reivindicación 13, donde la cantidad de sulfato de cobre pentahidratado es 0,1mol % con respecto a los moles de ácido 4-(azidometil)benzoico o (4-etinilfenil)metanol y los moles de ascorbato de sodio son el doble que los de sulfato de cobre pentahidratado.

15. Compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso como medicamento.

16. Compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades mediadas por el receptor CXCR4 seleccionadas del grupo que comprende cáncer, la infección por VIH y la artritis reumatoide.

17. Compuesto para uso, según reivindicación 16, donde la enfermedad es la metástasis tumoral.

18. Compuesto para uso, según reivindicación 16, donde la enfermedad es el SIDA.

19. Composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

20. Composición farmacéutica según la reivindicación 19 para su uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades mediadas por el receptor CXCR4 seleccionadas del grupo que comprende cáncer, la infección por VIH y la artritis reumatoide.