ES2930623T3 - Proteína quimérica - Google Patents

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Abstract

La presente invención proporciona una proteína quimérica que tiene la fórmula: Casp-Ht1-Ht2 en la que Casp es un dominio de caspasa; Ht1 es un primer dominio de heterodimerización; y Ht2 es un segundo dominio de heterodimerización y en el que, en presencia de un inductor químico de dimerización (CID), un par idéntico de proteínas quiméricas interactúa de tal manera que Ht1 de una proteína quimérica se heterodimeriza con Ht2 de la otra proteína quimérica, provocando la homodimerización de los dos dominios de caspasa. La invención también proporciona una célula que comprende tal proteína y su uso en terapia celular adoptiva. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Proteína quimérica
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una proteína quimérica útil en la terapia celular adoptiva (ACT por sus siglas en inglés). La proteína quimérica puede actuar como un gen suicida que permite eliminar las células que expresan la proteína quimérica. La presente invención también proporciona un ácido nucleico que codifica dicha proteína quimérica, una célula que comprende dicho ácido nucleico y usos terapéuticos del mismo.
Antecedentes de la invención
Terapia Celular Adoptiva
La inmunoterapia adoptiva es un enfoque terapéutico establecido y en evolución. En el contexto del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (HSCT por sus siglas en inglés), las infusiones de linfocitos de donadores (DLI por sus siglas en inglés) se administran con frecuencia para tratar la recaída de neoplasias malignas hematológicas. Los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL por sus siglas en inglés) son eficaces en el tratamiento del melanoma metastásico. La ingeniería genética de las células T aumenta en gran medida el alcance y la potencia de la terapia con células T: La transferencia de receptores de células T permite la orientación de antígenos de cáncer intracelular, mientras que los receptores de antígenos quiméricos (CAR por sus siglas en inglés) permiten la orientación de antígenos específicos de linaje o cáncer de superficie. Se han observado respuestas clínicas con ambos enfoques y se están realizando numerosos ensayos adicionales.
Pueden ocurrir eventos adversos agudos después de la inmunoterapia adoptiva. La enfermedad de injerto contra huésped (GvHD por sus siglas en inglés) es una complicación frecuente y grave de la DLI. La administración de células T diseñadas también ha resultado en toxicidad. Por ejemplo, se ha informado toxicidad fuera del tumor en el objetivo en estudios de transferencia de receptores de células T nativas contra antígenos de melanoma; Las células T redirigidas al antígeno anhidrasa carbónica IX (CAIX) del carcinoma de células renales produjeron una hepatotoxicidad inesperada. Se han informado síndromes de activación inmunitaria después de la terapia con CD19 CAR. Finalmente, la mutagénesis insercional inducida por vectores da como resultado un riesgo teórico de trastornos linfoproliferativos. La incidencia y gravedad de estas toxicidades es impredecible. Además, a diferencia de una proteína terapéutica o moléculas pequeñas cuyos eventos adversos generalmente disminuyen con la vida media de la terapia, las células T se injertan y replican, resultando potencialmente en una toxicidad creciente y fulminante.
Genes suicidas
Un gen suicida es un mecanismo codificado genéticamente que permite la destrucción selectiva de células transferidas adoptivamente, como las células T, frente a una toxicidad inaceptable. Se han probado dos genes suicidas en estudios clínicos: La timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-TK por sus siglas en inglés) y la caspasa 9 inducible (iCasp9).
El gen de la timidina cinasa derivada de l del virus del herpes simple (HSV-TK) se ha utilizado como un interruptor suicida in vivo en las infusiones de células T de donantes para tratar la neoplasia maligna recurrente y la linfoproliferación del virus de Epstein Barr (EBV por sus siglas en inglés) después del trasplante de células madre hematopoyéticas. Sin embargo, la destrucción de las células T que causan la enfermedad de injerto contra huésped fue incompleta, y el uso de ganciclovir (o análogos) como profármaco para activar HSV-TK impide la administración de ganciclovir como fármaco antiviral para las infecciones por citomegalovirus. Además, las respuestas inmunitarias dirigidas por HSV-TK han resultado en la eliminación de células transducidas por HSV-TK, incluso en pacientes con trasplante de médula ósea y virus de la inmunodeficiencia humana inmunosuprimidos, lo que compromete la persistencia y, por lo tanto, la eficacia de las células T infundidas.
El mecanismo de activación detrás de Caspasa 9 se explotó en la molécula iCasp9 original. Todo lo que se necesita para que Caspasa 9 se active es superar la barrera energética para que Caspasa 9 se homodimerice. El homodímero sufre un cambio conformacional y el dominio proteolítico de uno de un par de dímeros se vuelve activo. Fisiológicamente, esto ocurre mediante la unión del dominio CARD de Caspasa 9 a APAF-1. En iCasp9, el dominio APAF-1 se reemplaza con un FKBP12 modificado que ha sido mutado para unirse selectivamente a un inductor químico de dimerización (CID por sus siglas en inglés). La presencia del CID da como resultado homodimerización y activación. iCasp9 se basa en una caspasa 9 humana modificada fusionada con una proteína de unión a FK506 humana (FKBP) (Straathof et al (2005) Blood 105:4247-4254). Permite la dimerización condicional en presencia de una molécula pequeña CID, conocida como AP1903. AP1903 es un fármaco experimental y se considera biológicamente inerte ya que no interactúa con FKBP12 de tipo salvaje. Sin embargo, la experiencia clínica con este agente se limita a un número muy pequeño de pacientes (Di Stasi, A. et al. (2011) N. Engl. J. Med. 365, 1673-1683; y luliucci, J. D. et al. (2001) J. Clin. Pharmacol. 41, 870-879). AP1903 también es una molécula polar relativamente grande y es poco probable que cruce la barrera hematoencefálica.
En un enfoque alternativo, las caspasas ejecutoras pueden ser activadas por moléculas pequeñas utilizando una estrategia compleja que implica la introducción de sitios de proteólisis del virus del grabado del tabaco (TeV por sus siglas en inglés) en Caspasa 3 o 6 o 7 y la coexpresión con una proteasa TEV dividida que se recombina en la presencia de rapamicina (Morgan et al (2014) Methods Enzymol. 544: 179-213). Esta es una estrategia insatisfactoria para un interruptor suicida clínicamente útil por varias razones: en primer lugar, se requieren tres proteínas separadas que son muy complejas: la caspasa modificada y los dos componentes de la proteasa dividida TeV, respectivamente; en segundo lugar, los componentes de TeV son xenogénicos y probablemente inmunogénicos; finalmente, esta estrategia solo activa moléculas de caspasas sensibles a proteasas que están corriente abajo y son menos sensibles que las caspasas apicales.
Se ha descrito un gen suicida basado en la activación CID de FAS (Amara et al (1999) Hum. Gene Ther. 10, 2651-2655). Esto también depende de este CID para la activación, y dado que no activa directamente la cascada de apoptosis, es posible escapar (a través de la resistencia FAS).
Un sistema de homodimerización basado en un fármaco estándar que reemplace la necesidad de un CID experimental sería una alternativa atractiva. Sin embargo, no se dispone de productos farmacéuticos de molécula pequeña homodimerizantes.
Se han propuesto otros genes suicidas, por ejemplo, el CD20 de longitud completa cuando se expresa en una célula T puede hacer que las células T sean susceptibles a la lisis por el anticuerpo terapéutico anti-CD20 Rituximab (Introna, M. et al. (2000) Hum. Gene Ther. 11, 611-620). También se han descrito otros genes suicidas sobre este tema del reconocimiento de anticuerpos, por ejemplo: RQR8 hace que las células T sean susceptibles a CD20 pero es más compacto que la molécula CD20 de longitud completa (Philip, B. et al. (2014) Blood doi:10.1182/blood-2014-01-545020); una versión truncada de EGFR (huEGFRt) hace que las células sean susceptibles a la lisis por mAb anti-EGFR (Wang, X. et al. (2011) Blood 118, 1255-1263); y una etiqueta de epítopo myc expresada en una superficie celular deja a las células susceptibles a la lisis con un anticuerpo anti-myc (Kieback et al (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 623­ 628). Una limitación importante de estos enfoques dependientes de anticuerpos es su dependencia de la biodisponibilidad de un anticuerpo terapéutico en concentraciones locales altas para actuar. Se sabe, por ejemplo, que los anticuerpos líticos no son particularmente efectivos contra enfermedades voluminosas y una limitación de los genes suicidas basados en anticuerpos es que las células que residen donde no se alcanzan altas concentraciones de anticuerpos escaparían. Además, en determinadas situaciones: por ejemplo, un síndrome de activación de macrófagos grave o una tormenta de citocinas inducida por células T con CAR; la activación inmunitaria adicional inducida por un anticuerpo monoclonal puede ser perjudicial para la situación clínica que se intenta tratar con la activación del gen suicida.
El documento US 2004/040047 describe interruptores de muerte artificial (ADS por sus siglas en inglés) basados en la dimerización inducida químicamente de cisteína proteasas, caspasa -1 (ICE) y caspasa-3 (YAMA).
Fegan et al. (Chem Rev. 2010, 110; 3315-3336) describe el ensamblaje de proteínas bajo el control de señales químicas de moléculas pequeñas y el refinamiento de herramientas CID sintéticas.
Por lo tanto, existe la necesidad de un gen suicida alternativo que no esté asociado con las desventajas mencionadas anteriormente.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1 - Dibujos que muestran diferentes enfoques de RapCasp9. (a) Constructo doble donde dos moléculas se expresan por separado. Cada molécula tiene el dominio catalítico de Casp9 fusionado con FKBP12 o FRB respectivamente. (b) Constructo única donde FKBP12 y FRB se fusionan directamente y luego se fusionan con el dominio catalítico de Casp9 mediante un conector flexible. La autoheterodimerización no debería ser posible en esta orientación. (c) Constructo única donde el dominio catalítico de Caspasa 9 está flanqueado por FRB y FKBP12. En este caso, puede producirse una autoheterodimerización, por lo que no se espera que esta iteración funcione bien. (d) Constructo doble donde el dominio catalítico de Caspasa 9 se fusiona con FKBP12 y se coexpresa una proteína pequeña separada que es una fusión de dos copias de FRB.
Figura 2 - Demostración de que es posible activar Caspasa 9 con un heterodimerizador. Las células T se transdujeron solo con eGFP (Figura 2a), o se cotransdujeron con FKBP12-dCasp9 (coexpresando eGFP) y FRB-dCasp9 (coexpresando eBFP2) (Figura 2b). Las células T se transdujeron intencionalmente solo parcialmente para que las células T no transducidas actuaran como controles internos. A continuación, las células T se expusieron a concentraciones decrecientes de Rapamicina. Después de 48 horas, las células se tiñeron con Anexina-V y 7AAd y se analizaron mediante citometría de flujo observando la proporción de células vivas que expresaban proteínas fluorescentes. Las células T que expresan tanto eGFP como eBFP2 se eliminaron de forma muy eficaz incluso en presencia de la concentración más baja de Rapamicina.
Figura 3 - Función de las variantes de RapCasp9. Las células T se transdujeron con (a) eGFP solo; (b) doble transducido con FKBP12-Casp9 y FRB-Casp9 coexpresado con eGFP y eBFP2 respectivamente; (c) transducido con FRB-FKBP12-Casp9 y (d) transducido con FRB-Casp9-FKBP12 y (e) FBP12-Casp9-2A-FRB-FRBw. Sólo se transdujo una proporción de células, las células negativas actuaron como un control negativo interno. Las células T se expusieron durante 48 horas a Rapamicina 2,5 nM. A continuación, las células T se tiñeron con Anexina-V y 7AAD y se analizaron mediante citometría de flujo. eGFP frente a eBFP2 se muestra en células vivas según lo determinado por tinción con Anexina-V y 7AAD.
Figura 4 - Rapamicina y rapálogos. A) Rapamicina; B) C-20-metillirlrapamicina (MaRap); C) C16(S)-Butilsulfonamidorapamicina (C16-BS-Rap); D) C16-(S)-3-mehilindolrapamicina (C16-iRap); y E) C16-(S)-7-metilindolrapamicina (AP21976/C16-AiRap).
Figura 5 - Resumen de los constructos probadas en el Ejemplo 3.
Figura 6 - Resumen de la estrategia de activación del Ejemplo 3.
Figuras 7, 8 y 9 - Estudio que muestra la destrucción de células Jurkat transfectadas con los constructos que se muestran en la Figura 5 después de la incubación con varias concentraciones de rapamicina.
Figura 10 - Gráfico para resumir los datos FACS mostrados en las Figuras 7, 8 y 9.
Figura 11 - Gráfico que compara la destrucción de células Jurkat en presencia de rapamicina frente a temsirolimus.
Breve descripción de la invención
Los presentes inventores han desarrollado un nuevo gen suicida, que se dimeriza en presencia de un inductor químico de dimerización (CID por sus siglas en inglés) tal como rapamicina o un análogo de rapamicina.
La rapamicina y los análogos de la rapamicina inducen la heterodimerización al generar una interfaz entre el dominio FRB de mTOR y FKBP12. Esta asociación da como resultado que FKBP12 bloquee el acceso al sitio activo de mTOR e inhiba su función. Si bien mTOR es una proteína muy grande, se conoce y se puede usar el segmento pequeño preciso de mTOR requerido para la interacción con la Rapamicina.
Los presentes inventores han demostrado que es posible utilizar la heterodimerización mediada por rapamicina para inducir la homodimerización de una caspasa. En particular, han demostrado sorprendentemente que es posible crear una molécula multidominio, que incluye (i) el dominio FRB de mTOR; (ii) FKBP12; y (iii) una caspasa, y usar heterodimerización entre el dominio FRB de una copia de la molécula y el dominio FKB12 de otra copia de la molécula para provocar la homodimerización de los dominios de caspasa.
Así, en un primer aspecto de la invención, la presente invención proporciona una proteína quimérica soluble que tiene la fórmula:
Ht1-Ht2-Casp
donde
Casp es un dominio de caspasa;
Ht1 es un primer dominio de heterodimerización; y Ht2 es un segundo dominio de heterodimerización y donde, en presencia de un inductor químico de dimerización (CID), un par idéntico de las proteínas quiméricas solubles interactúa de tal manera que Ht1 de una proteína quimérica soluble se heterodimeriza con Ht2 de la otra proteína quimérica soluble, provocando la homodimerización de los dos dominios de caspasa, donde un dominio de heterodimerización comprende una proteína de unión a FK506 (FKBP) y el otro dominio de heterodimerización comprende un dominio FRB de mTOR, y donde el CID es rapamicina o un análogo de rapamicina.
La configuración es tal que Ht1 no se heterodimerize a cualquier extensión significativa con Ht2 dentro de la misma proteína quimérica.
El dominio de caspasa puede comprender una caspasa iniciadora seleccionada del siguiente grupo: caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-10, o una caspasa ejecutora seleccionada de caspasa-3 y caspasa-7.
En la presente invención, donde un dominio de heterodimerización comprende una proteína de unión a FK506 (FKBP) y el otro dominio de heterodimerización comprende un dominio FRB de mTOR y el CID es rapamicina o un derivado de la misma, entonces, se pueden usar las concentraciones de menos de 5 nm, por ejemplo 1-3 nm o aproximadamente 1 nm para provocar la homodimerización de los dos dominios de caspasa.
La proteína quimérica puede comprender un dominio de caspasa fusionado con FKBP12 y la proteína de interfaz puede ser una fusión de dos o más dominios FRB. Estos dos o más dominios FRB actúan como una interfaz, uniendo dos dominios FKBP12-Casp.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína quimérica soluble según el primer aspecto de la invención.
El ácido nucleico puede estar en forma de un constructo de ácido nucleico, que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, el constructo puede comprender una o más secuencias de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención y una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de células T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR).
Ht1 puede comprender una proteína de unión a FK506 (FKBP) y Ht2 puede comprender un dominio FRB de mTOR. El constructo de ácido nucleico también puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de células T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR).
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico o un constructo de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención.
El vector que también puede comprender un nucleótido de interés, como una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor de antígeno quimérico o un receptor de células T, de modo que cuando el vector se utiliza para transducir una célula diana, la célula diana coexpresa una proteína quimérica soluble según el primer aspecto de la invención y un receptor de antígeno quimérico o receptor de células T.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una célula que expresa una proteína quimérica soluble según el primer aspecto de la invención.
La célula puede comprender una secuencia o constructo de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención. La célula puede ser, por ejemplo, una célula madre hematopoyética, un linfocito o una célula T.
También se proporciona un método para fabricar una célula según el cuarto aspecto de la invención que comprende el paso de transducir o transfectar una célula ex vivo con un vector según el tercer aspecto de la invención.
También se proporciona un método para eliminar una célula según el cuarto aspecto de la invención, que comprende el paso de exponer las células a un inductor químico de dimerización (CID) in vitro, donde el CID es rapamicina o un análogo de rapamicina.
También se proporciona una célula según la presente invención para usarse en un método para tratar una enfermedad en un sujeto.
El método puede comprender los siguientes pasos:
(i) transducir o transfectar una muestra de células aisladas de un sujeto con un vector según el tercer aspecto de la invención, y
(ii) administrar las células transducidas/transfectadas a un paciente.
El método puede ser para tratar el cáncer.
En el presente documento se describe un método para prevenir y/o tratar una reacción inmunitaria patológica en un sujeto provocada por la administración de una célula según el cuarto aspecto de la invención al sujeto, que comprende el paso de administrar rapamicina o un análogo de rapamicina al sujeto.
La reacción inmunitaria patológica puede seleccionarse del siguiente grupo: enfermedad de injerto contra huésped; toxicidad en el objetivo, fuera del tumor; síndrome de activación inmune; y trastornos linfoproliferativos.
El método para tratar una enfermedad en un sujeto puede comprender los siguientes pasos:
(i) administrar una célula según el cuarto aspecto de la invención al sujeto;
(ii) monitorear al sujeto para el desarrollo de una reacción inmunitaria patológica; y
(iii) administrar rapamicina o un análogo de rapamicina al sujeto si el sujeto muestra signos de desarrollar o haber desarrollado una reacción inmunitaria patológica.
También se proporciona una célula según la presente invención para usarse en un método para tratar una enfermedad en un sujeto, donde el método implica el trasplante de células madre hematopoyéticas, la infusión de linfocitos o la transferencia celular adoptiva.
La rapamicina es un fármaco estándar con propiedades bien conocidas, excelente biodisponibilidad y volumen de distribución y que está ampliamente disponible. La rapamicina tampoco agrava la afección que se está tratando; de hecho, como es un inmunosupresor, es probable que tenga un efecto beneficioso sobre la toxicidad no deseada, así como sobre la función del gen suicida.
Descripción detallada
Proteína quimérica
La presente invención se refiere a una proteína quimérica soluble que actúa como gen suicida. Las células que expresan la proteína quimérica pueden eliminarse in vivo o in vitro mediante la administración de un inductor químico de la dimerización (CID) el cual es rapamicina o un análogo de rapamicina.
La proteína quimérica soluble tiene la fórmula:
Ht1-Ht2-Casp
en el cual
Casp es un dominio de caspasa;
Ht1 es un primer dominio de heterodimerización; y Ht2 es un segundo dominio de heterodimerización
y donde, en presencia de un inductor químico de dimerización (CID), un par idéntico de las proteínas quiméricas solubles interactúa de tal manera que Ht1 de una proteína quimérica soluble se heterodimeriza con Ht2 de la otra proteína quimérica soluble, provocando la homodimerización de los dos dominios de caspasa, donde un dominio de heterodimerización comprende una proteína de unión a FK506 (FKBP) y el otro dominio de heterodimerización comprende un dominio FRB de mTOR, y donde el CID es rapamicina o un análogo de rapamicina.
La proteína quimérica puede tener la fórmula:
Ht1-Ht2-L-Casp
en el que Casp, Ht1 y Ht2 son como se definen anteriormente y L es un enlazador opcional.
La configuración debe ser tal que Ht1 no se heterodimerice significativamente con Ht2 dentro de la misma molécula de proteína quimérica, pero cuando dos proteínas quiméricas se juntan en presencia de un inductor químico de dimerización (CID), Ht1 de una proteína quimérica se heterodimeriza con Ht2 de la otra proteína quimérica, lo que provoca la homodimerización de los dos dominios de caspasa.
La configuración es tal que Ht1 no se heterodimerize a cualquier extensión significativa con Ht2 dentro de la misma proteína quimérica. Por ejemplo, en una célula que expresa una proteína quimérica según esta realización del primer aspecto de la invención, la presencia del CID debería causar una mayor proporción de dimerización entre dos proteínas quiméricas que de heterodimerización dentro de la misma proteína quimérica. La cantidad de proteínas quiméricas que están heterodimerizadas dentro de la misma molécula en una célula o población celular, o en solución, puede ser inferior al 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % de la cantidad de proteínas quiméricas que se heteromerizan con una molécula de proteína quimérica separada, en presencia del CID.
La proteína quimérica puede comprender la secuencia que se muestra como SEQ ID No. 1.
SEQ ID No. 1 (FRB-FKBP12-L3-dCasp9)
< ----------------------------------------------------- FRB-----------------------------------------------------------------------------MASRILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGR
---------------- FRB------------------ X L 1 - X — FKBP12------DLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKLEYSGGGSLEGVQVETISPGDGR
----------------- FKBP12------------------------------------TFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAK
LTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGGSGGGGSGGGGSGVDGFGDVGA
----------------------- dCasp9------------------------------LESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMV
----------------------- dCasp9------------------------------EVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVE
----------------------- dCasp9------------------------------KIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQE
----------------------- dCasp9------------------------------GLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQ
------------- dCasp9--------------- > SLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSAS
En la secuencia anterior, “FKBP12” se refiere a la secuencia de FKBP12; “dCasp9” se refiere al dominio catalítico de Casp9; “L1” es un enlazador de una repetición; “FMD-2A” es un péptido ERAV similar a la fiebre aftosa 2A; “FRB” es el dominio FRB de mTOR; “L3” es un enlazador de dos repeticiones; y “FRBw” es FRB oscilante de codón
En el presente documento se describe un sistema de genes suicidas de “dos moléculas”, en el que el CID es rapamicina o un análogo de rapamicina.
Por lo tanto, en el presente documento se describe i) una proteína quimérica que comprende un dominio de caspasa y un dominio de heterodimerización que comprende una proteína de unión a FK506 (FKBP12); y ii) una proteína quimérica que comprende un dominio de caspasa y un dominio de heterodimerización que comprende un dominio FRB de mTOR. Cuando una célula, como una célula T, expresa ambas proteínas quiméricas, la presencia de rapamicina o un análogo de rapamicina hace que el dominio que comprende FKBP o i) se heterodimerice con el dominio que comprende FRB o ii), provocando así la homodimerización de los dominios de caspasa de i) y ii).
En el presente documento, la proteína quimérica descrita en este documento puede comprender la secuencia que se muestra como SEQ ID No. 2 o 3.
SEQ ID No. 2 (FKBP12-dCasp9)
<------------------ FKBP12----------------------------------MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIR
------------------------- FKBP12---------------- X L 1 —X ----GWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGF
---------------------- dCasp9-------------------------------GDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSS
---------------------- dCaSp9-------------------------------LHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGC
---------------------- dCaSp9-------------------------------PVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDA
---------------------- dCasp9-------------------------------TPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSY STFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAH
---------------------- dCasp9----------- >
SEDLQSLLL RVANAVSVKGIY KQMPGC FNFLRKKL FFKTSAS SEQ ID No. 3 (FRB-dCasp9)
-M-A-S-R-I-L-WFHREBM-W-H-E-G-L-E-E-A-S-R-L-Y-F-G-E-R-N-V-K-G-M-F-E-V-L-E-P-LH>AMMERGPQTLKETSFNQAYGR
--------------------- FRB--------------X L 1 - X ----dCasp9---DLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKLEYSGGGSGVDGFGDVGALESLR
---------------------- dCasp9-------------------------------GNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGD
---------------------- dCasp9-------------------------------LTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNI
---------------------- dCasp9-------------------------------FNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTF
---------------------- dCaSp9-------------------------------DQLDAISSLPTPSDIFVSY STFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLR
------------ dCasp9----------- >
VANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSAS
En el presente documento se describe un enfoque alternativo de “dos moléculas”, con una huella más pequeña. Aquí, Ht1 se fusiona con caspasa, y se coexpresa una segunda molécula que comprende la fusión Ht2-Ht2. En presencia de CID, Ht2-Ht2 reúne dos moléculas Ht1-Casp. En la práctica, esto se puede implementar coexpresando FKBP12-Casp9 con FRB-FRB y activándolo con rapamicina. Convenientemente, estos componentes se pueden coexpresar con un péptido similar a la fiebre aftosa 2A. La segunda secuencia que codifica Ht2 (por ejemplo, FRB) puede oscilar en los codones para evitar la recombinación.
SEQ ID No. 4 (FKBP12-dCasp9-2A-FRB-FRBw)
< -------------- FKBP12----------------------------------MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIR
------------------------- FKBP12---------------- XL 1 —><----GWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGF
---------------------- dCasp9-------------------------------GDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSS
---------------------- dCasp9-------------------------------LHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGC
---------------------- dCasp9-------------------------------PVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDA
---------------------- dCasp9-------------------------------TPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSY STFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAH
----------- dCaSp9---------------------- ><----FMD-2A-------SEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSASQCTNYALLKLAGDVESNP
- X ------------------- FRB----------------------------------GPGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRG
WEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGGSGGGGS
< ------------------------- FRBw----------------------------MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIR
---------------------- FRBw-----------------------> GWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLES
En la secuencia anterior: “FKBP12” se refiere a FKBP12; “dCasp9” es el dominio catalítico de Casp9; “L1” es un enlazador de una repetición; “FMD-2A” es un péptido ERAV similar a la fiebre aftosa 2A; “FRB” es el dominio FRB de mTOR; “L2” es un enlazador de dos repeticiones; y “FRBw” es FRB oscilante de codón.
Caspasa
Las caspasas, o proteasas cisteína-aspártico o proteasas dirigidas por aspartato dependientes de cisteína son una familia de proteasas cisteína que desempeñan funciones esenciales en la apoptosis.
Se han identificado doce caspasas en humanos. Hay dos tipos de caspasas apoptóticas: caspasas iniciadoras y caspasas ejecutoras. Las caspasas iniciadoras, como la caspasa-2, la caspasa-8, la caspasa-9 y la caspasa-10, escinden las proformas inactivas de las caspasas efectoras, activándolas así. Las caspasas ejecutoras, como la caspasa-3, la caspasa-6 y la caspasa-7, luego escinden otros sustratos proteicos dentro de la célula para desencadenar el proceso apoptótico. El dominio de caspasa de la proteína quimérica del primer aspecto de la presente invención puede comprender una caspasa iniciadora seleccionada de caspasa-2; caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-10; o una caspasa ejecutora seleccionada de caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7.
En particular, el dominio de caspasa de la proteína quimérica del primer aspecto de la presente invención puede comprender caspasa-9. La caspasa 9 es la caspasa iniciadora clave, por lo que su activación es un desencadenador muy sensible para la inducción de la apoptosis. Además, la homodimerización es todo lo que se requiere para la activación, en lugar de la homodimerización y escisión proteolítica.
La caspasa-9 de longitud completa tiene la secuencia que se muestra como SEQ ID No. 5.
SEQ ID No. 5 (Caspasa-9)
1 MDEADRRLLR RCRLRLVEEL QVDQLWDALL SSELFRPHMI EDIQRAGSGS RRDQARQLII
61 DLETRGSQAL PLFISCLEDT GQDMLASFLR TNRQAAKLSK PTLENLTPVV LRPEIRKPEV
121 LRPETPRPVD IGSGGFGDVG ALESLRGNAD LAYILSMEPC GHCLIINNVN FCRESGLRTR
181 TGSNIDCEKL RRRFSSPHFM VEVKGDLTAK KMVLALLELA QQDHGALDCC VVVILSHGCQ
241 ASHLQFPGAV YGTDGCPVSV EKIVNIFNGT SCPSLGGKPK LFFIQACGGE QKDHGFEVAS
301 TSPEDESPGS NPEPDATPFQ EGLRTFDQLD AISSLPTPSD IFVSYSTFPG FVSWRDPKSG
361 SWYVETLDDI FEQWAHSEDL QSLLLRVANA VSVKGIYKQM PGCFNFLRKK LFFKTS
Caspasa-9 se puede truncar, por ejemplo, para eliminar el dominio de reclutamiento de caspasas. Caspasa-9 truncada se muestra como SEQ ID No. 6
SEQ ID No. 6 (caspasa-9 truncada, careciendo el dominio CARD)
GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLR
RRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFP
GAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPE
DESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGS
WYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS
La proteína quimérica del primer aspecto de la invención puede comprender SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 6 o un fragmento o una variante de la misma que conserva la capacidad de homodimerizarse y así desencadenar la apoptosis.
Una secuencia variante de caspasa-9 puede tener al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID No. 5 o 6.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias polipeptídicas puede determinarse fácilmente mediante programas como BLAST, que está disponible gratuitamente en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.
In vivo, la proteasa caspasa 9 es el participante central en una vía de múltiples componentes conocida como apoptosoma, que controla la eliminación de células durante la embriogénesis y las respuestas fisiológicas que desencadenan la muerte celular, así como agresiones celulares letales como la radiación ionizante o los fármacos quimioterapéuticos. La función de la caspasa 9 es generar las formas activas de las caspasas 3 y 7 por proteólisis limitada y así transmitir la señal apoptótica a la fase de ejecución. Sin embargo, la caspasa 9 es inusual entre sus parientes cercanos porque la proteólisis entre la subunidad grande y la pequeña no convierte el zimógeno latente en la forma catalítica. De hecho, es la homodimerización lo que se requiere para la activación.
Dominios de heterodimerización
Los macrólidos rapamicina y FK506 actúan induciendo la heterodimerización de proteínas celulares. Cada fármaco se une con gran afinidad a la proteína FKBP12, creando un complejo fármaco-proteína que posteriormente se une e inactiva mTOR/FRAP y calcineurina, respectivamente. El dominio de unión a FKBP-rapamicina (FRB) de mTOR se ha definido y aplicado como un resto de proteína de 89 aminoácidos aislado que se puede fusionar con una proteína de interés. La rapamicina puede entonces inducir la aproximación de fusiones de FRB a FKBP12 o proteínas fusionadas con FKBP 12.
En el contexto de la presente invención uno de los dominios de heterodimerización (Ht1 o Ht2) comprende FRB, o una variante del mismo y el otro dominio de heterodimerización (Ht2 o Ht1) comprende FKBP12 o una variante del mismo.
La rapamicina tiene varias propiedades de un dimerizador ideal: tiene una alta afinidad (KD<1 nM) por FRB cuando se une a FKBP12 y es altamente específica por el dominio FRB de mTOR. La rapamicina es un inmunosupresor terapéutico eficaz con un perfil farmacocinético y farmacodinámico favorable en mamíferos. Los análogos farmacológicos de la rapamicina con diferentes propiedades farmacocinéticas y dinámicas como Everolimus, Temsirolimus y Deforolimus (Benjamin et al, Nature Reviews, Drug Discovery, 2011) también pueden usarse según el entorno clínico.
Para evitar la unión de rapamicina y la inactivación de mTOR endógeno, se puede modificar la superficie de rapamicina que entra en contacto con FRB. La mutación compensatoria del dominio FRB para formar una superficie que acomoda la rapamicina “golpeada” restaura las interacciones de dimerización solo con el mutante FRB y no con la proteína mTOR endógena.
Bayle et al. (Chem Bio; 2006; 13; 99-107) describe varios análogos de rapamicina, o “rapálogos” y sus correspondientes dominios de unión a FRB modificados. Por ejemplo, Bayle et al. (2006) describe los rapálogos: C-20-metiNirlrapamicina (MaRap), C16(S)-Butilsulfonamidorapamicina (C16-BS-Rap) y C16-(S)-7-metilindolrapamicina (AP21976/C16-AiRap), como se muestra en la Figura 3, en combinación con los respectivos dominios de unión complementarios para cada uno. Otras rapamicinas/rapálogos incluyen sirolimus y tacrolimus.
Los dominios de heterodimerización de la proteína quimérica pueden ser o comprender una de las secuencias que se muestran como SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 11, o un fragmento del mismo.
SEQ ID No 7 - dominio FKBP12 MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQE VIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE SEQ ID No 8 - segmento FRB de tipo salvaje de mTOR MASRILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFN QAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISKLES SEQ ID No 9 - FRB con sustitución de T a L en 2098 que permite la unión a AP21967 MASRILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFN QAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKLES SEQ ID No 10 - segmento FRB de mTOR con sustitución de T a H en 2098 y a W en F en el residuo 2101 del mTOR completo que se une a rapamicina con afinidad reducida al tipo salvaje MASRILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFN QAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLHQAFDLYYHVFRRISKLES SEQ ID No 11 - segmento FRB de mTOR con sustitución de K a P en el residuo 2095 de mTOR completo que se une a rapamicina con afinidad reducida MASRILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFN QAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVPDLTQAWDLYYHVFRRISKLES
Las secuencias variantes pueden tener al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID No. 7 a 11, siempre que las secuencias proporcionen un sistema de dimerización efectivo. Es decir, siempre que las secuencias faciliten la colocalización suficiente de las dos proteínas quiméricas para permitir la homodimerización de los dos dominios de caspasa.
El dominio FRB de “tipo salvaje” que se muestra como SEQ ID No. 8 comprende los aminoácidos 2025-2114 de mTOR humano. Usando el sistema de numeración de aminoácidos de mTOR humano, la secuencia FRB de la proteína quimérica de la invención puede comprender una sustitución de aminoácido en una o más de las siguientes posiciones: 2095, 2098, 2101.
La variante FRB utilizada en la proteína quimérica de la invención puede comprender uno de los siguientes aminoácidos en las posiciones 2095, 2098 y 2101:
2095: K, P, T o A
2098: T, L, H o F
2101: W o F
Bayle et al (como anteriormente) describen las siguientes variantes de FRB, anotadas según los aminoácidos en las posiciones 2095, 2098 y 2101 (ver Tabla 1): KTW, PLF, KLW, PLW, TLW, ALW, PTF, ATF, TTF, KLF, PLF, TLF, ALF, KTF, KHF, KFF, KLF. Estas variantes son capaces de unirse a rapamicina y rapálogos en diversos grados, como se muestra en la Tabla 1 y la Figura 5A de Bayle et al. La proteína quimérica de la invención puede comprender una de estas variantes de FRB.
Enlazador
Puede incluirse un enlazador para separar espacialmente el dominio de caspasa y el dominio(s) de heterodimerización.
En la presente invención, la proteína quimérica comprende dos dominios de heterodimerización que se mantienen en una configuración tal que no pueden heterodimerizarse entre sí en presencia del CID en una sola molécula, pero Ht1 en una molécula puede heterodimerizarse con Ht2 en otra molécula quimérica que tiene los mismos dominios de heterodimerización (Figura 1B). En un diseño donde Ht1 y Ht2 flanquean el dominio Caspasa (Ht1-Casp-Ht2), la activación fue inferior a los diseños donde Ht1 y Ht2 estaban unidos, lo que indica la importancia de prevenir la unión no productiva de Ht1 y Ht2 de una sola molécula a un solo CID.
En esta realización, el enlazador (L1) debería proporcionar suficiente flexibilidad para que los dominios catalíticos puedan homodimerizarse, pero no tanta flexibilidad como para que no se supere la barrera energética a la homodimerización (Figura 1). Por ejemplo, el enlazador puede tener menos de 15, menos de 10 o entre 5-15 o 5-10 aminoácidos de longitud.
Como se describe en el presente documento, una proteína quimérica puede comprender un solo dominio de heterodimerización, el cual es capaz de heterodimerización con un dominio de heterodimerización complementario en una segunda proteína quimérica en presencia de un CID.
En una configuración alternativa descrita aquí como referencia, los dos dominios de heterodimerización se pueden proporcionar en una sola molécula con un enlazador largo (L2), proporcionando un constructo que tiene la fórmula:
Ht1-Casp1-L2-Ht2-Casp2
Los dominios HT y Casp pueden estar en cualquier orden a cada lado del enlazador.
Descrito en este documento, el enlazador L2 puede conferir suficiente flexibilidad para que el primer dominio de heterodimerización pueda heterodimerizarse con el segundo dominio de heterodimerización; y para que el dominio caspasa en la parte de la molécula correspondiente a la 'primera proteína quimérica' pueda homodimerizarse con el dominio caspasa en la parte de la molécula correspondiente a la 'segunda proteína quimérica'.
Descrito en el presente documento, Casp se fusiona con un único dominio de heterodimerización, pero con una segunda molécula que es una fusión de dos o más copias del otro dominio de heterodimerización. Las dos moléculas pueden coexpresarse. En este caso, la segunda molécula actúa como una interfaz que une dos o más dominios Casp en presencia de CID. En este caso, las dos o más copias de los dominios de heterodimerización deben fusionarse de tal manera que permitan la aproximación de los dominios Casp9 lo suficiente como para activarlos.
La proteína de interfaz descrita en el presente documento puede ser multimérica y comprender más de dos dominios Ht2. Por ejemplo, es posible combinar una pluralidad de dominios Ht2 en una sola proteína de interfaz utilizando un enlazador multimerizante tal como un dominio de bobina en espiral.
Descrita en el presente documento, la proteína de interfaz puede tener la fórmula Ht2-L2-Ht2, o Ht2 - L2 en la que L2 es un dominio de bobina en espiral.
Una bobina en espiral es un motivo estructural en el cual de dos a siete hélices alfa se envuelven juntas como los hilos de una cuerda. La estructura de los dominios de bobina en espiral es bien conocida en la técnica. Por ejemplo, como describen Lupas & Gruber (Advances in Protein Chemistry; 2007; 70; 37-38).
Las bobinas en espiral generalmente contienen un patrón repetido, hxxhcxc, de residuos de aminoácidos hidrofóbicos (h) y cargados (c), denominados repetición de la heptada. Las posiciones en la repetición de la heptada suelen etiquetarse como abcdefg, donde a y d son las posiciones hidrofóbicas, a menudo ocupadas por isoleucina, leucina o valina. Doblar una secuencia con este patrón repetitivo en una estructura secundaria alfa-helicoidal hace que los residuos hidrofóbicos se presenten como una 'raya' que se enrolla suavemente alrededor de la hélice a la izquierda, formando una estructura anfipática. La forma más favorable para que dos de estas hélices se organicen a sí mismas en el citoplasma es envolviendo las hebras hidrofóbicas entre sí intercaladas entre los aminoácidos hidrofílicos. Por lo tanto, es el entierro de superficies hidrofóbicas lo que proporciona la fuerza impulsora termodinámica para la oligomerización. El empaquetamiento en una interfaz de bobina en espiral es excepcionalmente estrecho, con un contacto de van der Waals casi completo entre las cadenas laterales de los residuos a y d.
Los ejemplos de proteínas que contienen un dominio de bobina en espiral incluyen, pero no se limitan a, proteína motora de quinesina, antígeno delta de la hepatitis D, proteína central sRNP de caja C/D de arqueas, proteína de matriz oligomérica de cartílago (COMP por sus siglas en inglés), proteína A de unión a manosa, proteína 1 rica en serina de bobina en espiral, factor de liberación de polipéptido 2, SNAP-25, SNARE, represor Lac o apolipoproteína E.
Inductor químico de dimerización (cid)
El inductor químico de dimerización (CID) para usarse en la presente invención es rapamicina o un análogo de rapamicina que induce la heterodimerización entre Ht1 y Ht2 en moléculas quiméricas separadas que tienen los mismos dominios Ht1 y Ht2.
El CID es rapamicina o un análogo de rapamicina (“rapálogos”) que tienen propiedades farmacodinámicas o farmacocinéticas mejoradas o diferentes a las de la rapamicina pero tienen el mismo amplio mecanismo de acción. El CID puede ser una rapamicina alterada con especificidad diseñada para FKBP12 o FRB complementarios, por ejemplo, como se muestra en la Figura 4. Bayle et al (2006, como anteriormente) describe varios rapálogos funcionalizados en C16 y/o C20.
Los ejemplos de tales rapálogos en la primera categoría incluyen Sirolimus, Everolimus, Temsirolimus y Deforolimus. Los ejemplos de rapálogos en la segunda categoría incluyen C-20-metillirlrapamicina (MaRap); C16(S)-butilsulfonamidorapamicina (C16-BS-Rap); C16-(S)-3-mehilindolrapamicina (C16-iRap); y C16-(S)-7-metilindolrapamicina (AP21976/C16-AiRap).
La homodimerización de los dominios de caspasa en presencia de CID puede dar como resultado una activación de caspasa que es 2, 5, 10, 50, 100, 1.000 o 10.000 veces mayor que la actividad de caspasa que se produce en ausencia de CID.
La rapamicina es un potente agente inmunosupresor. Los análogos de rapamicina (rapálogos) son de uso clínico diario. Los rapálogos modernos tienen una excelente biodisponibilidad y volúmenes de distribución. Aunque son agentes inmunosupresores potentes, una dosis corta (para activar un gen suicida) debería tener efectos secundarios mínimos. Además, a diferencia de la administración de un mAb, los efectos farmacológicos de la rapamicina y los análogos pueden ser ventajosos en escenarios clínicos donde los genes suicidas requieren activación, como la toxicidad fuera del tumor o los síndromes de hiperactivación inmunitaria.
Secuencia de ácidos nucleicos
El segundo aspecto de la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína quimérica según la invención.
Como se usa en el presente documento, se pretende que los términos “polinucleótido”, “nucleótido” y “ácido nucleico” sean sinónimos entre sí.
Un experto en la materia entenderá que numerosos polinucleótidos y ácidos nucleicos diferentes pueden codificar el mismo polipéptido como resultado de la degeneración del código genético. Además, debe entenderse que el experto en la materia puede, usando técnicas rutinarias, hacer sustituciones de nucleótidos que no afecten la secuencia polipeptídica codificada por los polinucleótidos descritos aquí para reflejar el uso de codones de cualquier organismo huésped particular en el que los polipéptidos deben expresarse.
Los ácidos nucleicos según el segundo aspecto de la invención pueden comprender ADN o ARN. Pueden ser monocatenarios o bicatenarios. También pueden ser polinucleótidos que incluyen dentro de ellos nucleótidos sintéticos o modificados. En la técnica se conocen varios tipos diferentes de modificación de los oligonucleótidos. Estos incluyen esqueletos de metilfosfonato y fosforotioato, adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los fines del uso descrito en el presente documento, debe entenderse que los polinucleótidos pueden modificarse mediante cualquier método disponible en la técnica. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo con el fin de mejorar la actividad in vivo o vida útil de los polinucleótidos de la invención.
Los términos “variante”, “homólogo” o “derivado” en relación con una secuencia de nucleótidos incluyen cualquier sustitución, variación, modificación, reemplazo, eliminación o adición de uno (o más) ácidos nucleicos de o a la secuencia.
En la presente invención se proporciona un ácido nucleico que codifica una proteína quimérica que tiene la fórmula:
Ht1-Ht2-L-Casp
donde
Ht1 es un primer dominio de heterodimerización; y Ht2 es un segundo dominio de heterodimerización. L es un enlazador opcional;
Casp es un dominio de caspasa;
La secuencia de ácido nucleico puede codificar la secuencia de proteína quimérica mostrada como SEQ ID No. 1 o una variante de la misma.
Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos puede comprender la secuencia que se muestra como SEQ ID No. 12
SEQ ID No. 12 (FRB-FKBP12-L3-Casp9)
ATGGCTTCTAGAATCCTCTGGCATGAGATGTGGCATGAAGGCCTGGAAGAGGCATCTCGT TTGTACTTTGGGGAAAGGAACGTGAAAGGCATGTTTGAGGTGCTGGAGCCCTTGCATGCT ATGATGGAACGGGGCCCCCAGACTCTGAAGGAAACATCCTTTAATCAGGCCTATGGTCGA GATTTAATGGAGGCCCAAGAGTGGTGCAGGAAGTACATGAAATCAGGGAATGTCAAGGAC CTCCTCCAAGCCTGGGACCTCTATTATCATGTGTTCCGACGAATCTCAAAGCTCGAGTAT AGCGGCGGCGGCAGCCTGGAGGGCGTGCAGGTGGAGACCATCAGCCCAGGCGACGGCAGA ACCTTCCCCAAGAGAGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTATACCGGCATGCTGGAGGACGGC AAGAAGTTCGACAGCAGCCGCGACCGCAATAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGCAAGCAG GAGGTGATCAGAGGCTGGGAGGAGGGCGTGGCCCAGATGAGCGTGGGCCAGAGAGCCAAG CTGACCATCAGCCCCGACTACGCCTATGGCGCCACCGGCCACCCCGGCATCATCCCACCC CACGCCACCCTGGTGTTTGATGTGGAGCTGCTGAAGCTGGAGTCCGGCGGAGGCGGGTCT GGAGGAGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGGTCAGGCGTGGATGGCTTCGGCGACGTGGGAGCC CTGGAGAGCCTGAGAGGCAACGCCGATCTGGCCTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGC CACTGCCTGATCATCAACAACGTGAACTTCTGCCGGGAGAGCGGCCTGCGGACCCGGACC GGCAGCAACATCGACTGCGAGAAGCTGAGGAGGCGCTTCTCCTCCCTGCACTTTATGGTG GAGGTGAAAGGCGATCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCCCAG
CAGGACCACGGAGCCCTGGATTGCTGTGTGGTGGTGATCCTGTCCCACGGCTGCCAGGCC AGCCACCTGCAGTTCCCCGGAGCCGTGTACGGCACCGACGGCTGTCCCGTGTCCGTGGAG AAGATCGTGAACATCTTCAACGGCACCTCCTGCCCCTCCCTGGGCGGCAAGCCCAAGCTG TTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGCGAGCAGAAGGACCACGGCTTTGAGGTGGCCAGCACC TCCCCCGAGGACGAGAGCCCAGGCAGCAACCCCGAGCCCGACGCCACCCCCTTCCAGGAG GGCCTGCGCACCTTCGACCAGCTGGACGCCATCAGCAGCCTGCCCACCCCCAGCGACATC TTCGTGAGCTACAGCACCTTTCCCGGCTTCGTGAGCTGGCGCGATCCCAAGTCCGGCTCT TGGTATGTGGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCATAGCGAGGACCTGCAG AGCCTGCTGCTGCGCGTGGCCAATGCCGTGAGCGTGAAGGGCATCTACAAGCAGATGCCA GGCTGCTTCAACTTCCTGCGGAAGAAGCTGTTCTTCAAGACCAGCGCCTCCTGA
También se describe aquí una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína quimérica que tiene la fórmula: Ht1-L-Casp donde Ht1 es un dominio de heterodimerización. L es un enlazador opcional; y
Casp es un dominio de caspasa;
En el presente documento se describe una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de proteína quimérica que se muestra como SEQ ID No. 2 o 3 o una variante de la misma.
Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos puede comprender la secuencia que se muestra como SEQ ID No. 13 o 14
SEQ ID No. 13 (FKBP12-L3-dCasp9)
ATGCTGGAGGGCGTGCAGGTGGAGACCATCAGCCCAGGCGACGGCAGAACCTTCCCCAAG AGAGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTATACCGGCATGCTGGAGGACGGCAAGAAGTTCGAC AGCAGCCGCGACCGCAATAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGCAAGCAGGAGGTGATCAGA GGCTGGGAGGAGGGCGTGGCCCAGATGAGCGTGGGCCAGAGAGCCAAGCTGACCATCAGC CCCGACTACGCCTATGGCGCCACCGGCCACCCCGGCATCATCCCACCCCACGCCACCCTG GTGTTTGATGTGGAGCTGCTGAAGCTGGAGTCCGGAGGCGGCTCCGGCGTGGATGGCTTC GGCGACGTGGGAGCCCTGGAGAGCCTGAGAGGCAACGCCGATCTGGCCTACATCCTGAGC ATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTGATCATCAACAACGTGAACTTCTGCCGGGAGAGCGGC CTGCGGACCCGGACCGGCAGCAACATCGACTGCGAGAAGCTGAGGAGGCGCTTCTCCTCC CTGCACTTTATGGTGGAGGTGAAAGGCGATCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTG CTGGAGCTGGCCCAGCAGGACCACGGAGCCCTGGATTGCTGTGTGGTGGTGATCCTGTCC CACGGCTGCCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCCGGAGCCGTGTACGGCACCGACGGCTGT CCCGTGTCCGTGGAGAAGATCGTGAACATCTTCAACGGCACCTCCTGCCCCTCCCTGGGC GGCAAGCCCAAGCTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGCGAGCAGAAGGACCACGGCTTT GAGGTGGCCAGCACCTCCCCCGAGGACGAGAGCCCAGGCAGCAACCCCGAGCCCGACGCC ACCCCCTTCCAGGAGGGCCTGCGCACCTTCGACCAGCTGGACGCCATCAGCAGCCTGCCC ACCCCCAGCGACATCTTCGTGAGCTACAGCACCTTTCCCGGCTTCGTGAGCTGGCGCGAT CCCAAGTCCGGCTCTTGGTATGTGGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCAT AGCGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGCGTGGCCAATGCCGTGAGCGTGAAGGGCATC TACAAGCAGATGCCAGGCTGCTTCAACTTCCTGCGGAAGAAGCTGTTCTTCAAGACCAGC GCCTCCTGA SEQ ID No. 14. (FRB-dCasp9) ATGGCTTCTAGAATCCTCTGGCATGAGATGTGGCATGAAGGCCTGGAAGAGGCATCTCGT TTGTACTTTGGGGAAAGGAACGTGAAAGGCATGTTTGAGGTGCTGGAGCCCTTGCATGCT ATGATGGAACGGGGCCCCCAGACTCTGAAGGAAACATCCTTTAATCAGGCCTATGGTCGA GATTTAATGGAGGCCCAAGAGTGGTGCAGGAAGTACATGAAATCAGGGAATGTCAAGGAC CTCCTCCAAGCCTGGGACCTCTATTATCATGTGTTCCGACGAATCTCAAAGCTCGAGTAT AGCGGCGGCGGCAGCGGCGTGGATGGCTTCGGCGACGTGGGAGCCCTGGAGAGCCTGAGA GGCAACGCCGATCTGGCCTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTGATCATC AACAACGTGAACTTCTGCCGGGAGAGCGGCCTGCGGACCCGGACCGGCAGCAACATCGAC TGCGAGAAGCTGAGGAGGCGCTTCTCCTCCCTGCACTTTATGGTGGAGGTGAAAGGCGAT CTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCCCAGCAGGACCACGGAGCC CTGGATTGCTGTGTGGTGGTGATCCTGTCCCACGGCTGCCAGGCCAGCCACCTGCAGTTC CCCGGAGCCGTGTACGGCACCGACGGCTGTCCCGTGTCCGTGGAGAAGATCGTGAACATC TTCAACGGCACCTCCTGCCCCTCCCTGGGCGGCAAGCCCAAGCTGTTCTTTATCCAGGCC TGTGGCGGCGAGCAGAAGGACCACGGCTTTGAGGTGGCCAGCACCTCCCCCGAGGACGAG AGCCCAGGCAGCAACCCCGAGCCCGACGCCACCCCCTTCCAGGAGGGCCTGCGCACCTTC GACCAGCTGGACGCCATCAGCAGCCTGCCCACCCCCAGCGACATCTTCGTGAGCTACAGC ACCTTTCCCGGCTTCGTGAGCTGGCGCGATCCCAAGTCCGGCTCTTGGTATGTGGAGACC CTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCATAGCGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGC GTGGCCAATGCCGTGAGCGTGAAGGGCATCTACAAGCAGATGCCAGGCTGCTTCAACTTC CTGCGGAAGAAGCTGTTCTTCAAGACCAGCGCCTCCTGA
Aquí, las secuencias de ácido nucleico pueden describirse en forma de un constructo que codifica ambas proteínas quiméricas.
El constructo descrito en este documento puede codificar una poliproteína que tiene la fórmula:
Ht1 -L2-Casp-coexpr-Ht2-L2-Casp
donde
Ht1 es un primer dominio de heterodimerización;
L1 y L2 son enlazadores opcionales que pueden ser iguales o diferentes;
Coexpr es una secuencia que permite la coexpresión de las dos proteínas: Ht1-L1-Casp y Ht2-L2-Casp; Ht2 es un segundo dominio de heterodimerización; y
Casp es un dominio de caspasa.
Cuando hay secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias iguales o similares, como los dos dominios de caspasa, una de las secuencias puede oscilar en el codón para evitar la recombinación homóloga.
Descrito en este documento, se describe una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia con la siguiente fórmula:
Ht1 -Casp-coexpr-Ht2-Ht2
donde
Casp es un dominio de caspasa;
Ht1 es un primer dominio de heterodimerización;
Coexpr es una secuencia que permite la coexpresión de las proteínas Ht1-Casp y Ht2-Ht2, como un sitio de escisión; y Ht2 es un segundo dominio de heterodimerización, que se heterodimeriza con Ht1 en presencia de un inductor químico de dimerización (CID).
En la secuencia que codifica la segunda proteína, Ht2-Ht2, una de las secuencias que codifican Ht2 puede tener codón oscilante, para evitar la recombinación homóloga.
El constructo de ácido nucleico descrito en este documento puede tener la secuencia que se muestra como SEQ ID No.
15.
SEQ ID No. 15 (FKBP12-Casp9-2A-FRB-FRBw) ATGCTGGAGGGCGTGCAGGTGGAGACCATCAGCCCAGGCGACGGCAGAACCTTCCCCAAG AGAGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTATACCGGCATGCTGGAGGACGGCAAGAAGTTCGAC AGCAGCCGCGACCGCAATAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGCAAGCAGGAGGTGATCAGA GGCTGGGAGGAGGGCGTGGCCCAGATGAGCGTGGGCCAGAGAGCCAAGCTGACCATCAGC CCCGACTACGCCTATGGCGCCACCGGCCACCCCGGCATCATCCCACCCCACGCCACCCTG GTGTTTGATGTGGAGCTGCTGAAGCTGGAGTCCGGAGGCGGCTCCGGCGTGGATGGCTTC GGCGACGTGGGAGCCCTGGAGAGCCTGAGAGGCAACGCCGATCTGGCCTACATCCTGAGC ATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTGATCATCAACAACGTGAACTTCTGCCGGGAGAGCGGC CTGCGGACCCGGACCGGCAGCAACATCGACTGCGAGAAGCTGAGGAGGCGCTTCTCCTCC CTGCACTTTATGGTGGAGGTGAAAGGCGATCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTG CTGGAGCTGGCCCAGCAGGACCACGGAGCCCTGGATTGCTGTGTGGTGGTGATCCTGTCC CACGGCTGCCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCCGGAGCCGTGTACGGCACCGACGGCTGT CCCGTGTCCGTGGAGAAGATCGTGAACATCTTCAACGGCACCTCCTGCCCCTCCCTGGGC GGCAAGCCCAAGCTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGCGAGCAGAAGGACCACGGCTTT GAGGTGGCCAGCACCTCCCCCGAGGACGAGAGCCCAGGCAGCAACCCCGAGCCCGACGCC ACCCCCTTCCAGGAGGGCCTGCGCACCTTCGACCAGCTGGACGCCATCAGCAGCCTGCCC ACCCCCAGCGACATCTTCGTGAGCTACAGCACCTTTCCCGGCTTCGTGAGCTGGCGCGAT CCCAAGTCCGGCTCTTGGTATGTGGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCAT AGCGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGCGTGGCCAATGCCGTGAGCGTGAAGGGCATC TACAAGCAGATGCCAGGCTGCTTCAACTTCCTGCGGAAGAAGCTGTTCTTCAAGACCAGC GCCTCCCAGTGCACCAATTATGCTTTGCTTAAGCTGGCAGGCGATGTGGAATCAAACCCG GGTCCTGGGGTACAGGTGGAGACCATCTCTCCTGGCGACGGGAGAACATTTCCTAAAAGG GGCCAAACATGCGTGGTTCACTATACCGGTATGCTGGAGGATGGCAAAAAAGTAGACTCC AGCCGGGATAGAAACAAACCCTTTAAGTTCATGCTGGGTAAGCAGGAAGTTATACGGGGC TGGGAAGAGGGAGTAGCTCAGATGTCTGTGGGCCAGAGGGCCAAGCTGACCATCTCACCG GACTACGCCTACGGCGCTACCGGCCACCCTGGCATTATACCACCCCATGCAACTCTCGTC TTCGATGTTGAGTTGCTCAAACTGGAATCAGGCGGAGGCGGGTCTGGAGGAGGCGGCAGC ATGCTGGAGGGCGTGCAGGTGGAGACCATCAGCCCAGGCGACGGCAGAACCTTCCCCAAG AGAGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTATACCGGCATGCTGGAGGACGGCAAGAAGTTCGAC AGCAGCCGCGACCGCAATAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGCAAGCAGGAGGTGATCAGA GGCTGGGAGGAGGGCGTGGCCCAGATGAGCGTGGGCCAGAGAGCCAAGCTGACCATCAGC CCCGACTACGCCTATGGCGCCACCGGCCACCCCGGCATCATCCCACCCCACGCCACCCTG GTGTTTGATGTGGAGCTGCTGAAGCTGGAGTCCTGA
Las secuencias de ácido nucleico con un alto grado de similitud, como la secuencia(s) de caspasa o las secuencias de FRB, pueden ser un codón oscilante para evitar la recombinación.
Constructo de ácido nucleico
En el presente documento se describe un constructo de ácido nucleico que comprende:
i) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína quimérica que comprende un dominio de caspasa y un dominio de heterodimerización que comprende una proteína de unión a FK506 (FKBP); y
ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína quimérica que comprende un dominio de caspasa y un dominio de heterodimerización que comprende un dominio FRB de mTOR.
La invención también proporciona un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una o más proteína(s) quimérica soluble de la invención y otra secuencia de ácido nucleico de interés (NOI por sus siglas en inglés). El NOI puede, por ejemplo, codificar un receptor de células T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR).
Las secuencias de ácidos nucleicos pueden estar unidas por una secuencia que permita la coexpresión de las dos o más secuencias de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el constructo puede comprender un promotor interno, una secuencia de entrada de ribosoma interna (IRES por sus siglas en inglés) o una secuencia que codifica un sitio de escisión. El sitio de escisión puede autoescindirse, de modo que cuando se produce el polipéptido, se escinde inmediatamente en las proteínas discretas sin necesidad de ninguna actividad de escisión externa.
Se conocen varios sitios de autoescisión, incluido el péptido autoescindible 2a del virus de la fiebre aftosa (FMDV), que tiene la secuencia que se muestra como SEQ ID No. 16 o 17:
SEQ ID No. 16
RAEGRGSLLTCGDVEENPGP
o
SEQ ID No 17
QCTNYALLKLAGDVESNPGP
La secuencia de coexpresión puede ser una secuencia de entrada de ribosoma interna (IRES). La secuencia de coexpresión puede ser un promotor interno.
Receptor de células T (TCR)
El receptor de células T o TCR es una molécula que se encuentra en la superficie de las células T, que es responsable de reconocer los antígenos unidos a las moléculas del complejo con mayor histocompatibilidad (MHC por sus siglas en inglés). La unión entre TCR y antígeno es de afinidad relativamente baja y degenerada: muchos TCR reconocen el mismo antígeno y muchos antígenos son reconocidos por el mismo TCR.
El TCR está compuesto por dos cadenas proteicas diferentes, es decir, es un heterodímero. En el 95 % de las células T, esto consiste en una cadena alfa (a) y beta (p), mientras que en el 5 % de las células T consiste en cadenas gamma y delta (y/5). Esta proporción cambia durante la ontogenia y en estados de enfermedad.
Cuando el TCR interactúa con el péptido antigénico y el MHC (péptido/MHC), el linfocito T se activa a través de una serie de eventos bioquímicos mediados por enzimas asociadas, correceptores, moléculas adaptadoras especializadas y factores de transcripción activados o liberados.
El constructo o vector de ácido nucleico de la presente invención puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena TCR a, una cadena TCR p, una cadena TCR y o una cadena TCR 5. Puede, por ejemplo, comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena TCR a y una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena TCR p; o una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena TCR y o una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena TCR 5. Las dos secuencias de ácido nucleico pueden estar unidas por una secuencia que permita la coexpresión de las dos cadenas de TCR, tal como un promotor interno, una secuencia IRES o un sitio de escisión tal como un sitio de autoescisión.
Receptores de antígenos quiméricos (CAR)
La secuencia de ácido nucleico de interés (NOI) puede codificar un receptor de antígeno quimérico (CAR).
Los CAR clásicos son proteínas transmembrana quiméricas de tipo I que conectan un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular (aglutinante) a un dominio de señalización intracelular (endodominio). El aglutinante suele ser un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal (mAb), pero puede basarse en otros formatos que comprenden un sitio de unión a antígeno, como un ligando. Puede ser necesario un dominio espaciador para aislar el aglutinante de la membrana y permitirle una orientación adecuada. Un dominio espaciador común usado es el Fc de IgG1. Los espaciadores más compactos pueden ser suficientes, por ejemplo, el tallo de CD8a e incluso solo la bisagra de IgG1, dependiendo del antígeno. Un dominio transmembrana ancla la proteína en la membrana celular y conecta el espaciador al endodominio que puede comprender o asociarse con un dominio de señalización intracelular.
Los primeros diseños de CAR tenían dominios de señalización intracelular derivados de las partes intracelulares de ya sea la cadena y de Fc5R1 o CD35. En consecuencia, estos receptores de primera generación transmitieron la señal inmunológica 1, que fue suficiente para desencadenar la eliminación de células T de células diana afines, pero no pudo activar completamente la célula T para proliferar y sobrevivir. Para superar esta limitación, se han construido dominios de señalización compuestos: la fusión de la parte intracelular de una molécula coestimuladora de células T con la de CD35 da como resultado receptores de segunda generación que pueden transmitir una señal activadora y coestimuladora simultáneamente después del reconocimiento del antígeno. El dominio coestimulador más utilizado es el de CD28. Esto proporciona la señal coestimuladora más potente, es decir, la señal inmunológica 2, que desencadena la proliferación de células T. También se han descrito algunos receptores que incluyen endodominios de la familia de receptores TNF, como los estrechamente relacionados OX40 y 41BB que transmiten señales de supervivencia. Ahora se han descrito CAR de tercera generación aún más potentes que tienen dominios de señalización intracelular capaces de transmitir señales de activación, proliferación y supervivencia.
Los ácidos nucleicos que codifican CAR pueden transferirse a células T usando, por ejemplo, vectores retrovirales. De esta manera, se puede generar una gran cantidad de células T específicas de antígeno para la transferencia de células adoptivas. Cuando el CAR se une al antígeno diana, esto da como resultado la transmisión de una señal de activación a la célula T en la que se expresa. Por lo tanto, CAR dirige la especificidad y la citotoxicidad de la célula T hacia las células que expresan el antígeno diana.
Vector
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico o un constructo de ácido nucleico de la invención.
La presente invención también proporciona un vector que comprende una o más secuencia(s) de ácido nucleico o constructo(s) de ácido nucleico de la invención y, opcionalmente, una o más secuencias de ácidos nucleicos de interés adicionales (NOI). Dicho vector se puede usar para introducir la secuencia(s) de ácido nucleico o el constructo(s) de ácido nucleico en una célula huésped para que exprese una o más proteína(s) quimérica según el primer aspecto de la invención y, opcionalmente, una o más de otras proteínas de interés (POI por sus siglas en inglés).
El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido o un vector viral, tal como un vector retroviral o un vector lentiviral, o un vector basado en transposones o ARNm sintético.
El vector puede ser capaz de transfectar o transducir una célula T.
Los NOI pueden, por ejemplo, codificar un receptor de antígeno quimérico o un receptor de células T, de modo que cuando el vector se usa para transducir una célula diana, la célula diana coexpresa una proteína quimérica y un receptor de antígeno quimérico o un receptor de células T.
Célula
La presente invención también se refiere a una célula que comprende una proteína quimérica según el primer aspecto de la invención.
La célula expresa una proteína quimérica que tiene los dos dominios de heterodimerización, según el primer aspecto de la presente invención.
También se describe aquí una célula que expresa dos proteínas quiméricas; una que comprende un dominio de caspasa y un dominio de heterodimerización que comprende una proteína de unión a FK506 (FKBP); y una que comprende un dominio de caspasa y un dominio de heterodimerización que comprende un dominio FRB de mTOR.
También se describe una célula que expresa dos proteínas:
Ht1-Casp y Ht2-Ht2 en los que Htl-Casp es una proteína quimérica que comprende un dominio de caspasa (Casp) y un primer dominio de heterodimerización (Ht1); y Ht2-Ht2 es una proteína de interfaz que comprende dos segundos dominios de heterodimerización (Ht2) de manera que, en presencia de un inductor químico de dimerización (CID), un par de proteínas quiméricas Ht1-Casp9 interactúan de tal manera que Ht1 de cada proteína quimérica se heterodimeriza con un dominio Ht2 de la proteína de interfaz, lo que provoca la homodimerización de los dos dominios de caspasa (consulte la Figura 1d).
La célula puede ser, por ejemplo, una célula inmunitaria tal como una célula T o una célula asesina natural (NK por sus siglas en inglés).
La célula puede ser una célula madre tal como una célula madre hematopoyética.
Las Células T o linfocitos T, los cuales son un tipo de linfocito que desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros linfocitos, como las células B y las células asesinas naturales (células NK), por la presencia de un receptor de células T (TCR) en la superficie celular. Hay varios tipos de células T, como se resume a continuación.
Las células T colaboradoras (células TH) ayudan a otros glóbulos blancos en los procesos inmunológicos, incluida la maduración de las células B en células plasmáticas y células B de memoria, y la activación de las células T citotóxicas y los macrófagos. Las células TH expresan CD4 en su superficie. Las células TH se activan cuando las moléculas MHC de clase II les presentan antígenos peptídicos en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC por sus siglas en inglés). Estas células pueden diferenciarse en uno de varios subtipos, incluidos TH1, TH2, TH3, TH17, Th9 o TFH, que secretan diferentes citocinas para facilitar diferentes tipos de respuestas inmunitarias.
Las células T citolíticas (células TC o CTL) destruyen células infectadas por virus y células tumorales, y también están implicadas en el rechazo de trasplantes. Las CTL expresan el CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus dianas al unirse al antígeno asociado con MHC de clase I, que está presente en la superficie de todas las células nucleadas. A través de la IL-10, la adenosina y otras moléculas secretadas por las células T reguladoras, las células CD8+ pueden inactivarse hasta un estado anérgico, lo que previene enfermedades autoinmunes como la encefalomielitis autoinmune experimental.
Las células T de memoria son un subconjunto de células T específicas de antígeno que persisten a largo plazo después de que se ha resuelto una infección. Se expanden rápidamente a un gran número de células T efectoras al volver a exponerse a su antígeno afín, proporcionando así al sistema inmunitario “memoria” contra infecciones pasadas. Las células T de memoria comprenden tres subtipos: células T de memoria central (células TCM) y dos tipos de células T de memoria efectoras (células TEM y células t Em RA). Las células de memoria pueden ser CD4+ o CD8+. Las células T de memoria normalmente expresan la proteína de superficie celular CD45RO.
Las células T reguladoras (células Treg), anteriormente conocidas como células T supresoras, son cruciales para el mantenimiento de la tolerancia inmunológica. Su función principal es cerrar la inmunidad mediada por células T hacia el final de una reacción inmunitaria y suprimir las células T autorreactivas que escaparon del proceso de selección negativa en el timo.
Se han descrito dos clases principales de células Treg CD4+: células Treg de origen natural y células Treg adaptativas.
Las células Treg de origen natural (también conocidas como células Treg CD4+CD25+FoxP3+) surgen en el timo y se han relacionado con interacciones entre las células T en desarrollo con células dendríticas mieloides (CD11c+) y plasmocitoides (CD123+) que se han activado con TSLP. Las células Treg de origen natural se pueden distinguir de otras células T por la presencia de una molécula intracelular llamada FoxP3. Las mutaciones del gen FOXP3 pueden prevenir el desarrollo de células T reguladoras, causando la enfermedad autoinmune fatal IPEX.
Las células Treg adaptativas (también conocidas como células Tr1 o células Th3) pueden originarse durante una respuesta inmunitaria normal.
Las células asesinas naturales (o células NK) son un tipo de células citolíticas que forman parte del sistema inmunitario innato. Las células NK proporcionan respuestas rápidas a las señales innatas de las células infectadas por virus de manera independiente del MHC
Las células NK (pertenecientes al grupo de las células linfoides innatas) se definen como linfocitos granulares grandes (LGL por sus siglas en inglés) y constituyen el tercer tipo de células diferenciadas del progenitor linfoide común que genera los linfocitos B y T. Se sabe que las células NK se diferencian y maduran en la médula ósea, los ganglios linfáticos, el bazo, las amígdalas y el timo, donde luego ingresan a la circulación.
Las células madre son células indiferenciadas que pueden diferenciarse en células especializadas. En los mamíferos, existen dos tipos generales de células madre: las células madre embrionarias, que se aíslan de la masa celular interna de los blastocistos, y las células madre adultas, que se encuentran en diversos tejidos. En los organismos adultos, las células madre y las células progenitoras actúan como un sistema de reparación del cuerpo, reponiendo los tejidos adultos. En un embrión en desarrollo, las células madre pueden diferenciarse en todas las células especializadas: ectodermo, endodermo y mesodermo (ver células madre pluripotentes inducidas), pero también pueden mantener la renovación normal de los órganos regenerativos, como la sangre, la piel o los tejidos intestinales.
Hay tres fuentes accesibles conocidas de células madre adultas autólogas en humanos:
1. médula ósea, la cual requiere extracción por recolección, es decir, perforación en el hueso.
2. Tejido adiposo, que requiere extracción mediante liposucción.
3. Sangre, la cual requiere extracción mediante aféresis, donde se extrae sangre del donante y se pasa a través de una máquina que extrae las células madre y devuelve otras porciones de la sangre al donante.
Las células madre adultas se utilizan con frecuencia en terapias médicas, por ejemplo, en el trasplante de médula ósea. Las células madre ahora se pueden cultivar y transformar (diferenciar) artificialmente en tipos de células especializadas con características consistentes con las células de varios tejidos, como los músculos o los nervios. Las líneas de células embrionarias y las células madre embrionarias autólogas generadas a través de la transferencia o desdiferenciación nuclear de células somáticas también se pueden utilizar para generar tipos de células especializadas para la terapia celular.
Las células madre hematopoyéticas (HSC por sus siglas en inglés) son las células sanguíneas que dan lugar a todas las demás células sanguíneas y se derivan del mesodermo. Están ubicados en la médula ósea roja, la cual está contenida en el núcleo de la mayoría de los huesos.
Dan lugar a linajes mieloides (monocitos y macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrocitos, megacariocitos/plaquetas, células dendríticas) y linfoides (células T, células B, células NK). El tejido hematopoyético contiene células con capacidades de regeneración a corto y largo plazo y progenitores comprometidos multipotentes, oligopotentes y unipotentes.
Las HSC son una población heterogénea. Existen tres clases de células madre, que se distinguen por su proporción de progenie linfoide a mieloide (L/M) en la sangre. Las HSC con sesgo mieloide (My-bi) tienen una proporción L/M baja (entre 0 y 3), mientras que las HSC con sesgo linfoide (Ly-bi) muestran una proporción grande (>10). La tercera categoría consiste en el HSC balanceado (Bala), cuya relación L/M está entre 3 y 10. Solo las HSC equilibradas y con sesgo mieloide tienen propiedades duraderas de autorrenovación.
Las células que expresan proteínas quiméricas de la invención pueden ser cualquiera de los tipos de células mencionados anteriormente.
Pueden crearse células T o NK ex-vivo que expresen una o más proteínas quiméricas según el primer aspecto de la invención ya sea de la sangre periférica del propio paciente (primera parte), o en el contexto de un trasplante de células madre hematopoyéticas de sangre periférica de un donador (segunda parte), o sangre periférica de un donador no conectado (tercera parte).
Alternativamente, las células T o NK que expresan una o más proteínas quiméricas según el primer aspecto de la invención pueden derivar de diferenciación ex-vivo de células progenitoras inducibles o células progenitoras embrionarias para células T. Alternativamente, se puede usar una línea de células T inmortalizadas que conserva su función lítica y podría actuar como agente terapéutico.
En todas estas realizaciones, las células que expresan proteína(s) quimérica(s) se generan introduciendo ADN o ARN que codifica para la proteína quimérica, o cada una de ellas, y opcionalmente un NOI mediante transducción con un vector viral o transfección con ADN o ARN.
La célula de la invención puede ser una célula T o NK ex-vivo de un sujeto. La célula T o NK puede ser de una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC por sus siglas en inglés). Las células T o NK pueden activarse y/o expandirse antes de ser transducidas con ácido nucleico que codifica una o más proteínas quiméricas según el primer aspecto de la invención, por ejemplo, mediante tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti-CD3.
La célula T o NK de la invención puede fabricarse mediante:
(i) aislamiento de una muestra que contiene células T o NK de un sujeto u otras fuentes enumeradas anteriormente; y (ii) transducción o transfección de las células T o NK con una o más secuencias de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención.
En el presente documento se describe un kit que comprende una célula T o NK que comprende una o más proteínas quiméricas según el primer aspecto de la invención y un CID.
Composición farmacéutica
En el presente documento se describe una composición farmacéutica que contiene una pluralidad de células según el cuarto aspecto de la invención. La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Tal formulación puede, por ejemplo, estar en una forma adecuada para infusión intravenosa.
Métodos
La invención también proporciona un método para fabricar una célula según el cuarto aspecto de la invención que comprende el paso de transducir o transfectar una célula ex vivo con un vector según el tercer aspecto de la invención.
El vector puede ser, por ejemplo, un vector retroviral o lentiviral.
La invención también proporciona un método para eliminar una célula de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, que comprende el paso de exponer las células a la rapamicina CID o un análogo de rapamicina, in vitro. La eliminación de la célula puede ser causada por la apoptosis inducida por la activación de la caspasa, después de la homodimerización inducida por CID de los dominios de la caspasa.
El CID se puede administrar en forma de una composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Tal formulación puede, por ejemplo, estar en una forma adecuada para infusión intravenosa.
En el presente documento se describe un método para prevenir y/o tratar una reacción inmunitaria patológica en un sujeto provocada por la administración de una célula según el cuarto aspecto de la invención al sujeto, que comprende el paso de administrar un CID, tal como rapamicina o un análogo de rapamicina al sujeto.
La reacción inmunitaria patológica puede seleccionarse del siguiente grupo: enfermedad de injerto contra huésped; toxicidad en el objetivo, fuera del tumor; síndrome de activación inmune; y trastornos linfoproliferativos.
En el presente documento se describe un método para tratar o prevenir una enfermedad en un sujeto, que comprende el paso de administrar una célula según el cuarto aspecto de la invención al sujeto. La célula puede estar en forma de una composición farmacéutica como se define anteriormente.
El método puede comprender los siguientes pasos:
(i) transducir o transfectar una muestra de células aisladas de un sujeto con un vector según el tercer aspecto de la invención, y
(ii) administrar las células transducidas/transfectadas a un paciente.
Un método para tratar una enfermedad se relaciona con el uso terapéutico de las células de la presente invención. En este documento, las células pueden administrarse a un sujeto que tiene una enfermedad o afección existente para disminuir, reducir o mejorar al menos un síntoma asociado con la enfermedad y/o para ralentizar, reducir o bloquear la progresión de la enfermedad.
El método para prevenir una enfermedad se relaciona con el uso profiláctico de las células inmunitarias de la presente invención. En este documento, dichas células pueden administrarse a un sujeto que aún no ha contraído la enfermedad y/o que no muestra ningún síntoma de la enfermedad para prevenir o alterar la causa de la enfermedad o para reducir o prevenir el desarrollo de al menos un síntoma asociado con la enfermedad. El sujeto puede tener una predisposición a, o se piensa que está en riesgo de desarrollar, la enfermedad.
Los métodos para tratar una enfermedad descritos en este documento pueden implicar el seguimiento de la progresión de la enfermedad y el seguimiento de cualquier actividad tóxica y el ajuste de la dosis de CID administrada al sujeto para proporcionar niveles aceptables de progresión de la enfermedad y actividad tóxica.
Supervisar la progresión de la enfermedad significa evaluar los síntomas asociados con la enfermedad a lo largo del tiempo para determinar si se están reduciendo/mejorando o aumentando/empeorando.
Las actividades tóxicas se relacionan con los efectos adversos provocados por las células de la invención después de su administración a un sujeto. Las actividades tóxicas pueden incluir, por ejemplo, toxicidad inmunológica, toxicidad biliar y síndrome de dificultad respiratoria.
En particular, se describe aquí un método para tratar una enfermedad en un sujeto, que comprende los siguientes pasos:
(i) administrar una célula según el cuarto aspecto de la invención al sujeto;
(ii) monitorear al sujeto para el desarrollo de una reacción inmunitaria patológica; y
(iii) administrar rapamicina o un análogo de rapamicina al sujeto si el sujeto muestra signos de desarrollar o haber desarrollado una reacción inmunitaria patológica.
La presente invención proporciona una célula de la presente invención para usar en el tratamiento de una enfermedad.
La célula puede, por ejemplo, ser utilizada en el trasplante de células madre hematopoyéticas, la infusión de linfocitos o la transferencia adoptiva de células.
En el presente documento se describe el uso de una célula de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.
En el presente documento se describe un agente CID capaz de inducir la dimerización de una proteína quimérica según el primer aspecto de la invención para usarse en el tratamiento y/o prevención de una actividad tóxica.
En el presente documento se describe un agente CID para usarse en la activación de un par de dominios de caspasa de proteínas quiméricas según el primer aspecto de la invención en una célula.
La enfermedad a tratar y/o prevenir con las células de la presente invención puede ser una infección, tal como una infección viral.
Los métodos descritos en este documento también pueden ser para el control de respuestas inmunes patogénicas, por ejemplo, en enfermedades autoinmunes, alergias y rechazo de injerto contra huésped.
Cuando las células de la invención expresan un TCR o CAR, pueden ser útiles para el tratamiento de una enfermedad cancerosa, como cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de riñón (células renales), leucemia, cáncer de pulmón, melanoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de tiroides.
Las células que expresan TCR/CAR de la presente invención pueden ser capaces de destruir células diana, tales como células cancerosas.
En el presente documento se describe rapamicina o un análogo de rapamicina para usarse en la prevención o el tratamiento de una reacción inmunitaria patológica provocada por la administración de una célula según el cuarto aspecto de la invención a un sujeto.
Las células de la presente invención se pueden usar en cualquier terapia celular en la que se administren a un paciente células modificadas o no modificadas. Un ejemplo de terapia celular es la transferencia adoptiva de células T después del trasplante de células madre CD34+. La administración de células T después de la transferencia de células madre ayuda a acelerar la reconstitución de un sistema inmunitario en el paciente receptor. Cuando no se dispone de un donador compatible relacionado o no relacionado, o la enfermedad es demasiado agresiva para una búsqueda extensa de donador, el uso de un donador familiar haploidéntico HLA puede ser efectivo. Dichos donadores pueden ser padres, hermanos o familiares de segundo grado. Estas infusiones pueden mejorar la recuperación inmunitaria y, por lo tanto, reducir las infecciones virales y eliminar las células leucémicas recurrentes. Sin embargo, la coexistencia de células T alorreactivas en un injerto de células madre de un donador puede causar la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD por sus siglas en inglés) en la cual las células del donador reaccionan contra el receptor, lo que puede dañar progresivamente la piel, el intestino, el hígado y otros órganos del paciente receptor.
Otros ejemplos de terapias celulares incluyen el uso de células nativas o células diseñadas genéticamente para expresar un gen heterólogo. Estos tratamientos se usan para muchos trastornos, incluidos los trastornos de la sangre, pero estas terapias pueden tener efectos secundarios negativos. En otro método, las células progenitoras inmaduras que pueden diferenciarse en muchos tipos de células maduras, tales como, por ejemplo, células del estroma mesenquimatoso, pueden usarse para tratar trastornos reemplazando la función de las células enfermas. La presente invención proporciona un mecanismo rápido y eficaz para eliminar los posibles efectos negativos de las células del donador utilizadas en la terapia celular.
En el presente documento se describe un método para reducir el efecto de la enfermedad de injerto contra huésped en un paciente humano después de un trasplante de células T de un donador, que comprende transfectar o transducir células T de un donador humano en un cultivo celular de un donador con un vector según la presente invención; administrar las células T transducidas o transfectadas del donador al paciente; detectar posteriormente la presencia o ausencia de enfermedad de injerto contra huésped en el paciente; y administrar un inductor químico de dimerización (CID) a un paciente en el que se detecta la presencia de enfermedad de injerto contra huésped. Las células T pueden no estar agotadas.
En el presente documento se describe un método de trasplante de células madre, que comprende administrar un trasplante de células madre haploidénticas a un paciente humano; y administrar células T de donador haploidéntico al paciente, donde las células T se transfectan o transducen en un cultivo celular de donador haploidéntico con un vector según la invención.
Las células pueden ser células T de donador humano no aloempobrecidas en un cultivo celular de donador.
En el presente documento se describe un método de trasplante de células madre, que comprende administrar un trasplante de células madre haploidénticas a un paciente humano; y administrar células T de donadores haploidénticos no aloempobrecidas al paciente, donde las células T se transfectan o transducen en un cultivo celular de donador haploidéntico con el vector según la invención.
El trasplante de células madre haploidénticas puede ser un trasplante de células madre haploidénticas CD34+. Las células T del donador humano pueden ser haploidénticas a las células T del paciente. El paciente puede tener cualquier enfermedad o trastorno que pueda aliviarse mediante un trasplante de células madre. El paciente puede tener cáncer, como un tumor sólido o cáncer de la sangre o de la médula ósea. El paciente puede tener una enfermedad de la sangre o de la médula ósea. El paciente puede tener anemia de células falciformes o leucodistrofia metacromática.
El cultivo celular del donador se puede preparar a partir de una muestra de médula ósea o de sangre periférica. El cultivo celular del donador se puede preparar a partir de células mononucleares de sangre periférica del donador. En algunas realizaciones, las células T del donador se asignan del cultivo celular del donador antes de la transfección o transducción. Las células T transducidas o transfectadas pueden cultivarse en presencia de IL-2 antes de la administración al paciente.
La invención se describirá ahora adicionalmente por medio de Ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Producción de células T que expresan proteínas quiméricas
Las células T se transdujeron con los diferentes constructos. Para rapCasp9 de dos moléculas (Figura 1a), las células T se transdujeron con dos vectores: uno que codifica FKBP12-Casp9 coexpresado con la proteína verde fluorescente eGFP por medio de una secuencia de entrada de ribosoma interna, y el otro que codifica para FRB -Casp9 coexpresado con la proteína fluorescente azul eBFP2. Para la molécula rapCasp9 (Figura 1 b), las células T se transdujeron con solo un vector que codifica el rapCasp9 respectivo que se coexpresa con eGFP. Un constructo que proporcionó FKB12-Casp9 y FRB-FRBw se codificó en un casete tri-cistrónico en el que FKBP12-Casp9 y FRB-FRBw se coexpresaron usando un péptido similar a FMD-2A y eGFP se coexpresó con un IREs . Las células T se transdujeron intencionalmente solo parcialmente, por lo que dentro del cultivo celular una proporción de células permaneció sin transducir para actuar como un control negativo interno. Como control adicional, las células T se transdujeron con un vector que codifica para eGFP solo para excluir los efectos no específicos de la rapamicina en las células transducidas.
Ejemplo 2 - Prueba de eliminación de células que expresan proteínas quiméricas con rapamicina
Las células T se expusieron a diferentes concentraciones de rapamicina y se incubaron durante 48 horas. Después de esto, las células T se tiñeron con anexina-V y 7AAD y se analizaron mediante citometría de flujo. Seleccionando las células vivas e interrogando a la población de células que expresan proteínas fluorescentes, se pudo medir claramente la supervivencia de las poblaciones transducidas y no transducidas. El enfoque dual FRB-Casp9 y FKBP12-Casp9 resultó en la eliminación efectiva de solo células doblemente positivas como se esperaba. El constructo FKBP12-FRB-Casp9 dio como resultado la eliminación efectiva de células positivas individuales. El constructo FKBP12-Casp9-FRB dio como resultado una eliminación mínima. FKBP12-Casp9/FRB-FRBw resultó en la eliminación efectiva de células positivas individuales. El control no resultó en una deleción específica (Figuras 2 y 3).
Ejemplo 3 - Prueba de un conjunto ampliado de constructos
Los constructos que se muestran en la Figura 5 los generamos y transducimos en células Jurkat. Las células transducidas se mezclaron con células no transducidas (NT) para tener tanto un constructo positivo como células negativas dentro de la población. Se añadió rapamicina a una concentración de 0, 1, 10, 100 y 1000 nM y las células se incubaron durante 24 h. Después de la recolección, las células se tiñeron con PI y anexina V y se analizaron mediante FACS. Los resultados se muestran en las Figuras 6 a 9 y se resumen en la Figura 10.
El constructo que tiene una configuración como se define según la invención, a saber, MP20244, se desempeñó muy bien en este ensayo, proporcionando una destrucción muy eficaz de las células transfectadas a todas las concentraciones de rapamicina por encima de 1 nM inclusive.
El par de constructos que tenían una configuración definida según MP20206 y MP20207 también se funcionaron muy bien, proporcionando una destrucción muy eficaz de las células transfectadas a todas las concentraciones de rapamicina por encima de 1 nM inclusive.
El constructo que tiene una configuración como se define según MP20265, también se desempeñó bien, provocando cierta destrucción con rapamicina 1 nM y una destrucción eficaz con concentraciones de rapamicina de 10 nM y superiores.
Los constructos que tenían una configuración como se define según MP20263, MP20264 y MP21067 se comportaron

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína quimérica soluble que tiene la fórmula:
Ht1-Ht2-Casp
donde
Casp es un dominio de caspasa;
Ht1 es un primer dominio de heterodimerización; y Ht2 es un segundo dominio de heterodimerización
y donde, en presencia de un inductor químico de dimerización (CID), un par idéntico de proteínas quiméricas solubles interactúa de tal manera que Ht1 de una proteína quimérica soluble se heterodimeriza con Ht2 de la otra proteína quimérica soluble, provocando la homodimerización de los dos dominios de caspasa
donde un dominio de heterodimerización comprende una proteína de unión a FK506 (FKBP) y el otro dominio de heterodimerización comprende un dominio FRB de mTOR,
y donde el CID es rapamicina o un análogo de rapamicina.
2. Una proteína quimérica soluble según la reivindicación 1, donde Ht1 no se heterodimeriza con Ht2 dentro de la misma proteína quimérica.
3. Una proteína quimérica soluble según la reivindicación 1 ó 2, donde el dominio de caspasa comprende una caspasa iniciadora seleccionada del siguiente grupo: caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-10.
4. Una proteína quimérica soluble según la reivindicación 1 ó 2, donde el dominio de caspasa comprende una caspasa ejecutora seleccionada entre caspasa-3 y caspasa-7.
5. Una proteína quimérica soluble según la reivindicación 1, donde Ht1 comprende FRB y Ht2 comprende FKBP.
6. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína quimérica soluble según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
7. Un constructo de ácido nucleico que comprende una o más secuencias de ácido nucleico según la reivindicación 6 y una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de células T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR).
8. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 6.
9. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 6 que también comprende un nucleótido de interés.
10. Un vector según la reivindicación 9, donde el nucleótido de interés codifica un receptor de antígeno quimérico o un receptor de células T, de modo que cuando el vector se usa para transducir una célula diana, la célula diana coexpresa una proteína quimérica soluble según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un receptor de antígeno quimérico o receptor de células T.
11. Una célula que expresa una proteína quimérica soluble según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
12. Una célula según la reivindicación 11 que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 6.
13. Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, que es una célula madre hematopoyética, un linfocito o una célula T.
14. Un método para fabricar una célula según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que comprende el paso de transducir o transfectar una célula ex-vivo con un vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.
15. Un método para eliminar una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que comprende el paso de exponer las células a un inductor químico de dimerización (CID) in vitro donde el CID es rapamicina o un análogo de rapamicina.
16. Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 para usarse en un método para tratar una enfermedad en un sujeto.
17. Una célula para usarse según la reivindicación 16, donde el método comprende los siguientes pasos:
(i) transducir o transfectar una muestra de células aisladas de un sujeto con un vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, y
(ii) administrar las células transducidas/transfectadas a un paciente.
18. Una célula para usarse según la reivindicación 16 ó 17, donde el método es para tratar el cáncer.
19. Una célula para usarse según la reivindicación 16 a 18, donde el método comprende los siguientes pasos:
(i) administrar al sujeto una célula según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13;
(ii) monitorear al sujeto para el desarrollo de una reacción inmunitaria patológica; y
(iii) administrar rapamicina o un análogo de rapamicina al sujeto si el sujeto muestra signos de desarrollar o haber desarrollado una reacción inmunitaria patológica.
20. Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 para usarse en un método para tratar una enfermedad en un sujeto, donde el método implica el trasplante de células madre hematopoyéticas, la infusión de linfocitos o la transferencia adoptiva de células.
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