ES2928200T3 - Sistema y dispositivo para análisis de materia específica en muestras líquidas mediante microscopía óptica - Google Patents

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Abstract

Un casete para usar en la concentración de materia en una suspensión de muestra, el casete que comprende una carcasa que tiene un soporte y un canal de recepción de muestras cerrado, el canal de recepción de muestras cerrado tiene una parte superior y una base conectada por al menos dos paredes; en el que la parte superior está configurada para tener una anchura inferior a la anchura de la base y una profundidad superior a 400 μm. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sistema y dispositivo para análisis de materia específica en muestras líquidas mediante microscopía óptica
Campo de la invención
La invención se refiere a un sistema y dispositivo para análisis cualitativo y cuantitativo de materia particulada dentro de muestras líquidas mediante microscopía óptica. En particular, el sistema y el dispositivo están relacionados con la medición de elementos biológicos, tales como huevos parasitarios, en una muestra biológica, tal como una muestra fecal.
Antecedentes de la invención
Para una amplia gama de propósitos de diagnóstico, en la salud animal y humana y en estudios ambientales, el análisis cualitativo y cuantitativo de partículas en una muestra dada tiene un valor significativo. Cualitativo se refiere a la confirmación de presencia o ausencia de elementos biológicos específicos, mientras que cuantitativo proporciona el número de estos elementos. El método estándar actual usado en laboratorios es la técnica de flotación donde se usa microscopía para detectar, identificar y cuantificar el material biológico particular dentro de la muestra, tal como parásitos en materia fecal, protozoos en agua, y microorganismos en el suelo. Los resultados de muchas de estas pruebas tienen implicaciones ambientales, financieras y médicas importantes. Sin embargo, las pruebas existentes requieren mucha mano de obra, llevan mucho tiempo y requieren operarios especialmente formados en laboratorios adecuadamente equipados.
Pruebas de recuento de huevos en heces (FEC) son una herramienta de diagnóstico valiosa y tienen un rango de aplicación. FEC es la detección de huevos de helmintos u ooquistes parasitarios. Es una técnica de flotación donde una muestra fecal se suspende en una disolución con una densidad relativa más alta que la de los elementos parasitarios en cuestión. Estos últimos flotarán a la superficie después de un cierto retraso de tiempo, mientras que los desechos más pesados se hundirán. Después se usa microscopía para detectar, identificar y cuantificar los huevos y ooquistes dentro de la muestra.
Este examen microscópico de heces animales es importante para permitir el juicio de la necesidad de tratamiento. Proporciona una alternativa al tratamiento de enmascaramiento ciego de animales de producción de alimentos, que es el principal impulsor de la resistencia antihelmíntica en parásitos (la capacidad de un gusano para sobrevivir a un tratamiento farmacológico que de otro modo mataría el parásito en las mismas condiciones). La resistencia parasitaria está creciendo más rápidamente que el desarrollo de nuevos fármacos, y el tratamiento indiscriminado está acelerando el problema. Existe una necesidad urgente de abordar esto. Las FEC son importantes para determinar la necesidad de tratamiento farmacológico antihelmíntico y, si es así, determinar qué fármaco específico sería el más eficaz para el parásito específico. Puede usarse una prueba de reducción de recuento de huevos en heces (FECRT) adicional para determinar la eficacia del fármaco antihelmíntico elegido usado en el tratamiento de animales infectados.
Las pruebas FEC actuales generalmente se llevan a cabo por un laboratorio especializado. Las muestras fecales se someten a prueba para determinar la presencia de elementos parasitarios y los resultados se generan en forma de huevos por gramo de heces (EPG). Esta evaluación implica un número de etapas dependiendo del método usado. Todos los métodos implican la preparación de muestras en las que se homogeneiza una cantidad específica de muestra fecal con un volumen adecuado de disolución de flotación. Las cantidades de muestra y disolución se eligen de modo que, entre otras consideraciones, la FEC final puede determinarse fácilmente multiplicando el número de huevos contados bajo las áreas marcadas por un factor de conversión simple. La muestra en disolución puede filtrarse y centrifugarse después antes de transferirse a un contenedor especial tal como el portaobjetos McMaster más comúnmente usado o el dispositivo mini-FLOTAC®. El dispositivo FLOTAC® implica esperar 10 minutos o similar y luego rotar un disco superior con respecto a las cámaras de flotación, antes de insertar el dispositivo en el microscopio. Este proceso de rotación se llama “traslación”, ya que traslada la superficie superior del contenido de cámara de flotación a un área de visión muy superficial para su análisis bajo el microscopio.
Otras técnicas de flotación centrífuga pueden evaluar volúmenes más grandes con alta sensibilidad centrifugando la muestra. Sin embargo, no se usan regularmente en laboratorios debido al requerimiento de una centrífuga y al tiempo necesario para ejecutar la técnica, lo cual es prohibitivo en costes para FEC rutinaria de bajo coste.
Un enfoque alternativo para el análisis de FEC implica el aparato FECPAKG2 que incluye un dispositivo de captura de imágenes que va a usarse junto con un elemento de soporte de muestras que comprende una base y un saliente que se extiende desde la base (la materia objeto de la patente estadounidense 8.961.907 de SOWERBY). La base incluye una región de contacto donde, en uso, la superficie de una muestra líquida puede entrar en contacto con el saliente. Este dispositivo concentra los huevos en la superficie de la parte sobresaliente del aparato. Esta solución proporciona una captura de imágenes in situ de una muestra fecal que luego se transmite a un laboratorio para su análisis.
Estos dispositivos y métodos para la detección, identificación, y análisis de partículas, muestran una serie de problemas o desventajas.
• La sensibilidad de la prueba es proporcional al volumen examinado. Los 0,3 ml examinados bajo el portaobjetos McMaster dan una sensibilidad de solo 50 huevos por gramo, mientras que los 2 ml examinados bajo el dispositivo mini-FLOTAC® proporcionan una sensibilidad mejorada de 5 huevos por gramo.
• Cuanto mayor sea el volumen examinado, mayor será el área de superficie que es necesario analizar. Bajo el microscopio, el área de superficie visible, o campo de visión (FOV), está limitado en cualquier instante individual. Cuanto mayor sea el aumento, más pequeño será el campo de visión. Esto plantea un obstáculo importante para un examen o exploración eficiente de toda el área de superficie. Tal exploración de toda la superficie lleva mucho tiempo, que se añade al coste del análisis. También plantea un problema para cualquier sistema de reconocimiento automatizado debido al alto número de imágenes individuales requeridas para explorar toda la superficie de manera adecuada y completa.
• Hay restricciones en la relación entre el volumen de la muestra de fluido y el área de superficie. El volumen aumentado y, por lo tanto, la sensibilidad, da como resultado un área de superficie a examinar aumentada. La identificación digital de los objetos de interés puede no ser viable debido al número de imágenes requeridas para cubrir cada campo de visión, lo que evita la identificación in situ por operarios no expertos.
• El diseño mecánico de tales dispositivos existentes no es muy adecuado para su incorporación en un proceso automatizado o para su uso por personal no experto. El dispositivo McMaster está en un sistema abierto y, si no se maneja cuidadosamente conduce a una fuga de muestra. El dispositivo miniFLOTAC® requiere la rotación de la tapa después del período de flotación requerido, que implica la intervención humana durante el proceso y algunos conocimientos y habilidades especializados.
Mientras que el aparato FECPAKG2 aborda el requisito de concentración de la muestra, el sistema también tiene sus inconvenientes.
Concentrando las partículas en un FOV, el aparato puede sobreconcentrar las muestras en cuestión, lo que provoca la superposición de los huevos y los residuos observados en el microscopio. Esto puede conducir a recuentos erróneos significativos, especialmente si el recuento usa software de reconocimiento de imágenes. • La presente aplicación de este aparato es para la captura remota de imágenes de la muestra, pero el análisis de la imagen todavía lo lleva a cabo el personal de laboratorio experto. No hay evidencia de que la imagen sea adecuada para el reconocimiento de objetos automatizado.
• La concentración de partículas en este dispositivo implica una estratificación o acumulación de huevos en un campo de visión, pero esto limitará la capacidad de identificar especies más pequeñas tales como Coccidia, ya que pueden estar ocultos por especies más grandes.
• Como este aparato no está cerrado, existe el riesgo de que una inclinación del recipiente antes de la inserción en el dispositivo pueda conducir a un nivel de menisco más bajo que estará fuera de foco para un dispositivo de captura de imágenes de enfoque fijo.
• El recipiente abierto también puede someterse a evaporación que reduciría el nivel del menisco formado después del período de flotación de 2 a 5 minutos. Esto también podría conducir a una imagen fuera de foco si una cámara o sensor tiene un mecanismo de enfoque fijo.
• Para identificar y contar artículos en o por debajo de 50 |im de la superficie superior del canal de fluido, la óptica del microscopio necesita un gran aumento y resolución, dando como resultado una profundidad de enfoque más pequeña. Esto a su vez hace que sea más difícil lograr un recuento preciso y fiable.
• Este problema de profundidad de enfoque puede reducirse con aumentos más bajos, pero esto a su vez limitaría la identificación potencial de especies más pequeñas.
La solicitud de patente estadounidense 13/387.076 (publicación estadounidense n.° 20120135457A) da a conocer un método para analizar huevos parasitarios u otras partículas en una muestra fecal usando un dispositivo que comprende un elemento de soporte con un saliente. El saliente comprende un extremo distal que está reducido en sección, y que incluye una cavidad de fluido con paredes inclinadas achaflanadas. La luz se transmite a través de la base del saliente. El dispositivo puede usarse con un dispositivo de captura de imágenes/microscopio para determinar la presencia de huevos. Los problemas asociados con este dispositivo son:
1. Mala calidad de imagen que conduce a malos resultados automatizados y pérdida de precisión.
• Debido a diferentes ubicaciones del plano y de la muestra para observaciones, cuando el contenedor que soporta la muestra que va a examinarse está abierto, los objetos aumentados de interés no están confinados al mismo plano. Algunos se elevarán en el menisco mientras que algunos pueden permanecer en disolución. Esto conducirá a diferentes campos de enfoque dentro de la imagen, lo que daría como resultado una pérdida de contraste para el reconocimiento.
• Como este aparato no está cerrado, existe el riesgo de que una inclinación del recipiente antes de la inserción en el dispositivo pueda conducir a un nivel de menisco más bajo que estará fuera de foco para un dispositivo de captura de imágenes de enfoque fijo.
• Este recipiente está abierto y, como tal, puede someterse a evaporación que también reduciría el nivel del menisco formado después del período de flotación de 2 a 5 minutos. Esto también podría conducir a una imagen fuera de foco y a tener especies para observación en diferentes planos.
Concentrando las partículas en un FOV, el aparato puede sobreconcentrar las muestras en cuestión, lo que causa la superposición de los huevos, restos y burbujas de aire disueltas. Esto puede dar como resultado problemas con cualquier software de reconocimiento de imágenes potencial.
• La concentración de partículas en este dispositivo implica una estratificación o acumulación de huevos en un campo de visión, pero esto podría limitar la identificación de especies más pequeñas tales como Coccidia, ya que pueden estar ocultos por grandes especies que los enmascaran.
• Factores de aumento y resolución mayores de un aparato de lente requeridos para especies más pequeñas de tamaño inferior a 50 |im dan como resultado una profundidad de enfoque más pequeña para un dispositivo de captura de imágenes.
2. Sensibilidad de prueba
• La sensibilidad de la prueba es directamente proporcional al volumen de la muestra. Aunque el tamaño del contenedor no está limitado, se ha observado el requisito de centrifugar la muestra para un contenedor que se soporta a una profundidad de 3 mm (para retirar los residuos para los sujetos de interés y mantener la claridad de la imagen bajo microscopía) y esto limitaría el volumen en cada cavidad a un valor muy pequeño. Podrían usarse múltiples cavidades, pero requerirían un movimiento de precisión x y/o y que se sumaría al coste del dispositivo. El documento JP 2006029824 usa un dispositivo que tiene un canal de muestra que no tiene más de 400 |im de profundidad para determinar la presencia de materia en una suspensión de muestra. La profundidad del canal lo hace inadecuado para que sea representativo un volumen suficientemente alto y las observaciones se realizan en la trayectoria de flujo del canal.
El documento JP H02 72860 usa un láser para detectar células en un canal que está adaptado para alojar una muestra de células en disolución.
El documento WO 2015/156738 describe un dispositivo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basado en microfluidos que tiene una pluralidad de pocillos que están dispuestos en un patrón simétrico radial, donde los pocillos se llenan a través de un canal de fluido común. Cuando se produce un producto de interés durante la PCR, el sistema que contiene este dispositivo detecta una señal emitida por el producto generado.
El documento US 2016/339434 describe un dispositivo para enfocar partículas en microcanal usando métodos de elasticidad-inercia. Las partículas se conducen a través de un canal y forman una línea de trayectoria localizada en un fluido viscoelástico en o cerca del centro del canal. Se requieren altos caudales y el material viscoelástico debe tener una viscosidad dinámica que varía con la velocidad de cizallamiento.
El documento EP3020480 describe un dispositivo de cultivo celular para cultivar células en una matriz de hidrogel, donde la matriz se soporta en un canal que separa dos cámaras diseñadas para alojar medios de cultivo celular para alimentar las células de interés.
El documento US 2009/170151 describe una celda de flujo continuo que comprende sustrato que tiene un canal, una entrada y salida y una parte del sustrato que es permeable a la luz para permitir que se detecten partículas dentro del canal. La célula requiere acción capilar para funcionar.
Es un objeto de la presente invención superar al menos uno de los problemas mencionados anteriormente. Sumario de la invención
La invención se refiere a un recipiente diseñado para contener un volumen específico de una muestra líquida (o suspensión de muestra) de una manera que facilita la concentración y la identificación y recuento precisos de la materia objetivo (particulada) que flota a la superficie desde dentro de la muestra. La muestra líquida está contenida en un canal de recepción de muestra cerrado con una sección transversal conformada (ya sea en forma de trapecio o equivalente con una parte superior más estrecha y una base más ancha o rectangular). Las paredes internas del canal de recepción de muestra cerrado pueden recubrirse con un material hidrófobo o hidrófilo para reducir la tensión superficial a lo largo de las paredes laterales del canal para evitar la adhesión de materia particulada. La muestra líquida está formada por una parte de la muestra para observación y una disolución de flotación de mayor densidad que las partículas de interés. Puede aplicarse una vibración durante un corto período de tiempo mientras el proceso de flotación está en curso. Las partículas suspendidas en la muestra líquida flotan a la superficie superior del canal de recepción de muestra cerrado para observación bajo el microscopio.
Para facilitar la exploración de la superficie del canal de recepción de muestra cerrado, es conveniente hacer que la anchura del canal de recepción de muestra cerrado corresponda aproximadamente a la anchura del campo de visión de la óptica de microscopio elegida, de modo que el proceso de exploración implica entonces solo un componente del movimiento relativo entre el canal y la óptica del microscopio. La exploración de toda la superficie consiste entonces en un movimiento relativo incremental, por ejemplo, mover el recipiente para que la óptica del microscopio lo vea, incrementalmente, toda (o casi toda) la superficie superior del canal de recepción de muestra cerrado. Alternativamente, para lograr la exploración, el canal de recepción de muestra cerrado podría permanecer estacionario y la óptica moverse, o cualquier combinación de los dos movimientos, de modo que se logre un movimiento relativo. Por lo tanto, el sistema puede automatizarse y permite al usuario recopilar datos precisos de un número más amplio de muestras mucho más rápidamente y sin habilidades especializadas del operario.
La invención proporciona un recipiente (1, 200, 300) para su uso en la determinación de la presencia de materia en una suspensión de muestra como se expone en las reivindicaciones adjuntas.
En el presente documento se describe un recipiente (1,200, 300) para su uso en la determinación de la presencia de materia en una suspensión de muestra, comprendiendo el recipiente (1, 200, 300) un alojamiento (2) que tiene un soporte (5); un canal (20) de entrada adaptado para recibir la suspensión de muestra; y un canal (6) cerrado de recepción de muestra en comunicación de fluido con el canal (20) de entrada, teniendo el canal (6) cerrado de recepción de muestra una parte superior (7, 208) y una base (5a) conectada por al menos dos paredes (11a, 11b) que forman un eje largo; en el que la parte superior (7, 208) está configurada para tener una anchura igual o menor que una anchura de la base (5a).
Se describe un recipiente (1,200, 300) para su uso en la concentración de materia (particulada) en una suspensión de muestra, comprendiendo el recipiente (1, 200, 300) un alojamiento (2) que tiene un soporte (5) y un canal (6) de recepción de muestra cerrado, teniendo el canal (6) de recepción de muestra cerrado una parte superior (7, 208) y una base (5a) conectada por al menos dos paredes (11a, 11b); en el que la parte superior (7, 208) está configurada para tener una anchura menor que una anchura de la base (5a).
Se describe un recipiente (1, 200, 300) para su uso en la concentración de materia (particulada o suspendida) en una suspensión de muestra, comprendiendo el recipiente (1,200, 300) un alojamiento (2) que tiene un soporte (5) y un canal (6) de recepción de muestra cerrado, teniendo el canal (6) de recepción de muestra cerrado una parte superior (7, 208) y una base (5a) conectada por al menos dos paredes (11a, 11b); en el que la parte superior (7, 208) está configurada para tener una anchura menor que una anchura de la base (5a) y una profundidad mayor de aproximadamente 400 |im.
En un aspecto, la parte superior está configurada para tener una anchura menor que la anchura de la base y una profundidad mayor de aproximadamente 300 |im, pero menos de aproximadamente 3000 |im, cuando se mide desde la parte superior de la plataforma elevada (50), es decir, entre aproximadamente 300 |im y aproximadamente 3000 |im. Preferiblemente, la profundidad está entre aproximadamente 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965 , 970, 975, 980, 985, 990, 995, 1000, 1005, 1010, 1015, 1020, 1025, 1030, 1035, 1040, 1045, 1050, 1055, 1060, 1065, 1070, 1075, 1080, 1085, 1090, 1095, 1100, 1105, 1110, 1115, 1120, 1125, 1130, 1135, 1140, 1145, 1150, 1155, 1160, 1165, 1170, 1175, 1180, 1185, 1190, 1195, 1200, 1205, 1210, 1215, 1220, 1225, 1230, 1235, 1240, 1245, 1250, 1255, 1260, 1265, 1270, 1275, 1280, 1285, 1290, 1295, 1300, 1305, 1310, 1315, 1320, 1325, 1330, 1335, 1340, 1345, 1350, 1355, 1360, 1365, 1370, 1375, 1380, 1385, 1390, 1395, 1400, 1405, 1410, 1415, 1420, 1425, 1430, 1435, 1440, 1445, 1450, 1455, 1460, 1465, 1470, 1475, 1480, 1485, 1490, 1495, 1500, 1505, 1510, 1515, 1520, 1525, 1530, 1535, 1540, 1545, 1550, 1555, 1560, 1565, 1570, 1575, 1580, 1585, 1590, 1595, 1600, 1605, 1610, 1615, 1620, 1625, 1630, 1635, 1640, 1645, 1650, 1655, 1660, 1665, 1670, 1675, 1680, 1685, 1690, 1695, 1700, 1705, 1710, 1715, 1720, 1725, 1730, 1735, 1740, 1745, 1750, 1755, 1760, 1765, 1770, 1775, 1780, 1785, 1790, 1795, 1800, 1805, 1810, 1815, 1820, 1825, 1830, 1835, 1840, 1845, 1850, 1855, 1860, 1865, 1870, 1875, 1880, 1885, 1890, 1895, 1900, 1905, 1910, 1915, 1920, 1925, 1930, 1935, 1940, 1945, 1950, 1955, 1960, 1965, 1970, 1975, 1980, 1985, 1990, 1995, 2000, 2005, 2010, 2015, 2020, 2025, 2030, 2035 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2090, 2095, 2100, 2105, 2110, 2115, 2120, 2125, 2130, 2135, 2140, 2145, 2150, 2155, 2160, 2165, 2170, 2175, 2180, 2185, 2190, 2195, 2200, 2205, 2210, 2215, 2220, 2225, 2230, 2235, 2240, 2245, 2250, 2255, 2260, 2265, 2270, 2275, 2280, 2285, 2290, 2295, 2300, 2305, 2310, 2315, 2320, 2325, 2330, 2335, 2340, 2345, 2350, 2355, 2360, 2365, 2370, 2375, 2380, 2385, 2390, 2395, 2400, 2405, 2410, 2415, 2420, 2425, 2430, 2435, 2440, 2445, 2450, 2455, 2460, 2465, 2470, 2475, 2480, 2485, 2490, 2495, 2500, 2505, 2510, 2515, 2520, 2525, 2530, 2535, 2540, 2545, 2550, 2555, 2560, 2565, 2570, 2575, 2580, 2585, 2590, 2595, 2600, 2605, 2610, 2615, 2620, 2625, 2630, 2635, 2640, 2645, 2650, 2655, 2660, 2665, 2670, 2675, 2680, 2685, 2690, 2695, 2700, 2705, 2710, 2715, 2720, 2725, 2730, 2735, 2740, 2745, 2750, 2755, 2760, 2765, 2770, 2775, 2780, 2785, 2790, 2795, 2800, 2805, 2810, 2815, 2820, 2825, 2830, 2835, 2840, 2845, 2850, 2855, 2860, 2865, 2870, 2875, 2880, 2885, 2890, 2895, 2900, 2905, 2910, 2915, 2920, 2925, 2930, 2935, 2940, 2945, 2950, 2955, 2960,2965, 2970, 2975, 2980, 2985, 2990, 2995 y 3000 |im. En un aspecto, la profundidad es mayor de aproximadamente 350 |im pero menor de aproximadamente 3000 |im; o la profundidad es mayor de aproximadamente 375 |im pero menor de 3000 |im. Según la invención reivindicada, la profundidad es mayor de 400 |im e idealmente menor de aproximadamente 3000 |im, cuando se mide desde la parte superior de la plataforma elevada (50).
En un aspecto, las paredes (11a, 11b) del canal (6) de recepción de muestra cerrado son rectos. Según la invención reivindicada, las paredes (11a, 11b) tienen una pendiente de entre 40° y 90° con respecto a la base (5a).
En un aspecto, la parte superior (7, 208) está configurada para tener una anchura menor que la anchura de la base (5a).
En un aspecto, la base (5a) está formada por el soporte (5) de alojamiento.
Según la presente invención, el canal (6) de recepción de muestra cerrado comprende además una plataforma elevada (50) que se extiende hacia arriba desde la base (5a). La plataforma elevada (50) está separada de la parte superior (7, 208) y ambas de las paredes (11a, 11b). Por eso, se entiende que la plataforma (50) no está conectada a una o ambas de las paredes (11a, 11b) o la parte superior (7, 208), dejando un espacio (un vacío) alrededor de al menos un lado de la plataforma (50) para que lo llene la muestra líquida y las partículas suspendidas se eleven.
En un aspecto, el canal (6) de recepción de muestra cerrado puede tener cualquier forma seleccionada del grupo que comprende recta, curvada, circular, parcialmente circular, elíptica, una serie conectada de dos o más líneas rectas o curvas, o una combinación de las mismas.
En un aspecto, el canal (6) de recepción de muestra cerrado en sección transversal es un trapezoide, un trapezoide isósceles, un triángulo truncado, un rectángulo, un trapezoide isósceles en un rectángulo, una elipse, un arco, es cóncavo o convexo.
Según la invención reivindicada, el recipiente comprende además un orificio (20) de entrada adaptado para recibir la suspensión de muestra y actuar como un conducto para suministrar la muestra al canal de recepción de muestra cerrado.
En un aspecto, el alojamiento (2) comprende además un orificio (14) de liberación de aire en comunicación de fluido con el canal (6) de recepción de muestra cerrado. Idealmente, el orificio de salida (14) es diametralmente opuesto al orificio (20) de entrada. Alternativamente, o ambos, el orificio (14) de liberación de aire es opuesto al orificio (20) de entrada.
En un aspecto, el orificio (20) de entrada es una válvula de retención.
En un aspecto, el alojamiento (2) del recipiente (1) está o bien abierto o bien cerrado.
En un aspecto, el alojamiento (2) del recipiente (1) es una sola pieza.
En un aspecto, el alojamiento (2) del recipiente (1) consiste en una sección inferior (201) configurada para alojar el canal (6) de recepción de muestra cerrado y una sección superior (202) configurada para unirse de manera reversible a y crear un sello con la sección inferior (201). Idealmente, el canal (6) de recepción de muestra cerrado está formado en la sección inferior (201). El canal (6) de recepción de muestra cerrado se forma cuando la sección inferior (201) y la sección superior (202) se combinan y forman un alojamiento (2) sellado cerrado.
En un aspecto, el alojamiento (2) es sustancialmente circular, lineal, un triángulo, un cuadrángulo. Idealmente, cuando el alojamiento (2) es sustancialmente un círculo, el canal (6) de recepción de muestra cerrado es circular. En un aspecto, el alojamiento comprende además un agujero (30) configurado para recibir un accionador (101) conectado a un dispositivo (100) de captura de imágenes.
En un aspecto, el alojamiento (2) es lineal, el canal (6) de recepción de muestra cerrado es lineal y el alojamiento (2) se mueve a lo largo de su eje largo. El alojamiento (2) y el canal (6) de recepción de muestra cerrado pueden ser rectilíneos o curvilíneos.
En un aspecto, el recipiente (1, 200, 300) está configurado para moverse en un plano. Alternativamente, o de manera alternativa, cuando el recipiente (1,200, 300) es estacionario, un dispositivo (100) de captura de imágenes está configurado para moverse en un plano.
En un aspecto, el movimiento dentro del plano puede ser una traslación rectilínea o rotación, o una combinación de las mismas.
En un aspecto, una superficie interna de las paredes (11a, 11b) del canal (6) de recepción de muestra cerrado está recubierta con un material hidrófobo.
En un aspecto, una superficie interna de las paredes (11a, 11b) del canal (6) de recepción de muestra cerrado está recubierta con un material hidrófilo.
En un aspecto, el alojamiento (2) es transparente o translúcido.
En un aspecto, el recipiente (1, 200, 300) es desechable o adecuado para su reutilización.
En un aspecto, la materia es materia suspendida o materia particulada.
Se proporciona, como se establece en las reivindicaciones adjuntas, un método para determinar la presencia de materia particulada en una suspensión de muestra.
El método comprende las etapas de:
preparar la suspensión de muestra;
mezclar minuciosamente la suspensión de muestra en un contenedor;
introducir la suspensión de muestra minuciosamente mezclada en el interior del canal (6) de recepción de muestra cerrado del recipiente (1,200, 300) como se describió anteriormente;
montar el recipiente (1, 200, 300) con la suspensión de muestra mezclada sobre un dispositivo (100) de captura de imágenes que tiene una lente objetivo (102); y
mover el recipiente (1, 200, 300) o dispositivo (100) de imagen óptica en un plano para permitir la determinación de la presencia de materia particulada en la suspensión de muestra, en el que el campo de visión de la lente objetivo (102) corresponde a la anchura de una parte superior (7) del canal (6) de recepción de muestra cerrado. En un aspecto, el dispositivo (100) de captura de imágenes comprende un accionador (101) configurado para acoplarse con el recipiente (1, 200, 300) y mover la lente objetivo (102) o el recipiente (1, 200, 300) en un solo plano.
Se proporciona, establecido en las reivindicaciones adjuntas, un sistema (400) para determinar la presencia de materia particulada en una suspensión de muestra.
El sistema descrito en el presente documento comprende el recipiente (1, 200, 300) como se describe anteriormente y un dispositivo (100) de captura de imágenes configurado para alojar el recipiente (1,200, 300). En un aspecto, el sistema comprende además un ordenador, un dispositivo de almacenamiento interno, un detector (122) y una red inalámbrica para enviar datos para almacenamiento de computación en la nube.
Se proporciona, como se establece en las reivindicaciones adjuntas, un kit para determinar la presencia de materia particulada en una muestra líquida, comprendiendo el kit un recipiente (1, 200, 300) como se describe anteriormente y una disolución de flotación.
En un aspecto, la disolución de flotación se selecciona de una disolución saturada de NaCl con densidad relativa de 1,20, una disolución de azúcar saturada con una densidad relativa de 1,280, una disolución de azúcar de Sheather con una densidad relativa de 1,20, una disolución de sulfato de zinc saturada con una densidad relativa de 1,20, una disolución de nitrato de sodio saturada con una densidad relativa de 1,20, y una disolución de sulfato de magnesio saturada con una densidad relativa de 1,280.
En la memoria descriptiva, debe entenderse que el término “recipiente” significa un cuerpo o alojamiento adaptado para recibir y contener un volumen específico de una muestra líquida. El recipiente está configurado para su uso en un dispositivo de captura de imágenes para el análisis de materia particulada en la muestra líquida. La muestra líquida está contenida en un canal cerrado alojado dentro del recipiente.
En la memoria descriptiva, debe entenderse que el término “muestra líquida” significa una muestra obtenida de una fuente de líquido, por ejemplo, sangre, esputo, heces líquidas, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, líquido sinovial, agua (de una corriente, un río, un mar, un océano), residuos de agua tratados, residuos de agua no tratados, eliminación de residuos biológicos, eliminación de tierra agrícola, o materia sólida tal como suelo o heces sólidas que se suspende en una disolución de flotación adecuada, etc. Cuando se suspende una materia sólida en una disolución de flotación adecuada, la muestra líquida también se conoce generalmente como una “suspensión de muestra”.
En la memoria descriptiva, el término “materia”, en donde se refiere a la muestra líquida que se está sometiendo a prueba o analizando, debe entenderse que significa cualquier materia particulada o suspendida que sea de interés en la muestra líquida y distinguible del líquido en suspensión. Tal materia puede ser huevos u ooquistes de un parásito, esporas fúngicas, polen, semillas, insectos/artefactos microscópicos, fragmentos óseos, minerales, plásticos (por ejemplo, microperlas), u otros artefactos recuperados del cribado de suelos obtenidos de los emplazamientos arqueológicos o para recuperar minerales del suelo y/o agua.
En la memoria descriptiva, el término “dispositivo de captura de imágenes” debe entenderse como un dispositivo capaz de capturar una imagen de la muestra en el recipiente cuando está explorándose, tales como, por ejemplo, un microscopio con una lente de aumento, una matriz de sensores ópticos digitales, una cámara (tal como una cámara analógica o digital réflex de lente única (SLR), una cámara de vídeo, una cámara de cine) capaz de obtener una única imagen o múltiples imágenes y acoplado a un ordenador equipado con software que permite la formación de imágenes completamente automatizada, un dispositivo de cámara dentro de otro dispositivo (tal como un teléfono móvil) con o sin una lente de aumento separada u otro dispositivo de aumento óptico o lente desmontable, o un sistema capaz de transferir la imagen a otro lugar antes de la captura, o capaz de mostrarla en una pantalla antes de la captura. La única imagen digital puede cubrir todo la anchura del canal, pero generalmente solo una parte de su longitud. Por lo tanto, la etapa de capturar la imagen generalmente es seguida por la etapa de movimiento del recipiente o dispositivo óptico, que puede automatizarse. Estas etapas de ciclos de captura/movimiento se repiten hasta que se obtiene una imagen del recipiente completo y está listo para el análisis. El proceso de exploración también puede lograrse manteniendo el recipiente estacionario y moviendo la óptica del microscopio, u opcionalmente una combinación de los dos movimientos. Cualquier método para lograr el movimiento relativo deseado entre el contenedor de muestra y la óptica del microscopio es adecuado para su uso con la invención.
La imagen se proyecta desde la lente directamente sobre el sensor de imagen. La placa de control ordena la captura y el almacenamiento de imágenes en el dispositivo. La imagen puede procesarse parcial o totalmente de manera local en el dispositivo y cargarse en la nube (una red de servidores remotos alojados en Internet para almacenar, gestionar y procesar datos, en lugar de un servidor local o un ordenador personal) o cargarse sin ningún procesamiento previo o con algún procesamiento previo antes de la carga. Este análisis implicará el procesamiento de la imagen para detectar la presencia de partículas específicas de interés contra ciertos criterios y se obtendrá un resultado cualitativo y cuantitativo. Este resultado se almacenará y se reenviará una copia al usuario final.
En la memoria descriptiva, el término “canal de recepción de muestra cerrado” debe entenderse que significa un canal cerrado con una forma particular en sección transversal, con paredes en un ángulo de entre 40° y 90°, preferiblemente entre 40° y menos de 90°, para concentrar la materia particulada flotante en una muestra a medida que se eleva a la superficie superior del canal. Las paredes del canal de recepción de muestra cerrado pueden ser rectas, curvadas, circulares, parcialmente circulares, elípticas.
En la memoria descriptiva, el término “canal de recepción de muestra cerrado de sección transversal trapezoidal” debe entenderse que significa un canal cerrado que tiene una forma de trapezoide en sección transversal, con paredes laterales en un ángulo de entre 40° y menos de 90° para concentrar la materia particulada flotante en una muestra a medida que se eleva a la superficie superior. Debe entenderse que el término canal cerrado de sección transversal “rectangular” significa un canal cerrado que tiene un ángulo de 90° entre la pared lateral y la base. La pendiente (ángulo) de las paredes laterales del canal se beneficia de estar dispuesta lo suficientemente en ángulo para concentrar las partículas en el área de superficie pequeña en la parte superior, pero no tan inclinada para fomentar la adhesión de partículas que se dirigen hacia la parte superior. El canal de recepción de muestra cerrado generalmente está cerrado en la parte superior por, por ejemplo, una tapa transparente, una ventana de superficie superior transparente o un techo transparente a través del cual se captura la imagen. Para facilitar la iluminación desde abajo, la parte inferior del canal de recepción de muestra cerrado, incluyendo cualquier parte elevada del mismo, debe ser al menos translúcida, u opcionalmente transparente, de modo que la luz pueda entrar en el canal de recepción de muestra cerrado desde abajo para alcanzar la tapa transparente/ventana de superficie superior transparente/techo transparente. La profundidad del canal de recepción de muestra cerrado está limitada para facilitar la flotación de partículas diana a través del fluido hasta la superficie superior (residuos y materia extraña en la muestra pueden inhibir el proceso de flotación excesivamente si la profundidad es demasiado grande), para facilitar el desplazamiento de partículas parcialmente flotantes a la superficie superior, para evitar que el exceso de residuos acumulados de las capas inferiores debajo de la superficie superior obstruya la luz y reduzca el contraste en las imágenes capturadas. La longitud del canal de recepción de muestra cerrado se establece entonces de modo que el volumen total del canal de recepción de muestra cerrado (área de sección transversal por longitud) sea suficiente para ser representativo del contenido de muestra. Este eje largo (eje de “longitud”) del canal de recepción de muestra cerrado puede seguir cualquier trayectoria conveniente. Puede ser en una línea recta, en cuyo caso el movimiento relativo del recipiente y la óptica será una traslación lineal. Puede ser ventajoso hacer que la dimensión más larga del canal de recepción de muestra cerrado sea circular, formando una forma de anillo parcial o completo. En una realización del recipiente considerado a continuación, la dimensión larga del canal de recepción de muestra cerrado forma un círculo completo, ubicado cerca del perímetro de un disco, que se mantiene horizontalmente cuando se explora. La óptica del microscopio se mantiene estacionaria por encima del canal de recepción de muestra cerrado dirigido hacia abajo y perpendicular a una superficie sobre la cual se apoya la óptica. De esta manera, el proceso de exploración puede lograrse mediante una simple rotación del disco de modo que la óptica del microscopio explorará todo (o casi todo) el canal de recepción de muestra cerrado a medida que el disco rota a través de la totalidad o la mayoría de 360°. Alternativamente, la óptica puede rotar y explorar todo el canal a medida que el disco rota aproximadamente 360°.
El volumen total del canal de recepción de muestra cerrado debe ser suficiente para contener una muestra líquida representativa que podría incluir partículas suficientes para obtener una medida precisa.
El canal de recepción de muestra cerrado también puede incluir una plataforma que se eleva hacia arriba desde la base del canal. Sin embargo, la plataforma nunca está a ras con las paredes laterales del canal.
En la memoria descriptiva, el término “material hidrófobo” debe entenderse que significa cualquier recubrimiento delgado de polímero u otro material del orden de nanómetros a la capa superficial nanoscópica en las paredes internas del canal del recipiente descrito anteriormente, que inhibe la unión de biomoléculas, proteína, huevos u otro material objetivo suspendido dentro de la disolución de muestra. Ejemplos de material hidrófobo son, pero no se limitan a, polímeros basados en silicio o flúor tales como tetrafluoroetileno, o polidimetilsiloxano (PDMS), alcanos, aceites, nanopartículas funcionalizadas, sílice nanotexturizada, polímero fluorado nanotexturizado, polímeros con nanotextura, etc.
En la memoria descriptiva, el término “material hidrófilo” debe entenderse que significa cualquier recubrimiento delgado de polímero u otro material del orden de nanómetros a la capa superficial nanoscópica en las paredes internas del canal del recipiente descrito anteriormente, que inhibe la unión de biomoléculas, proteína, huevos u otro material objetivo suspendido dentro de la disolución de muestra. Ejemplos de tales materiales hidrófilos son, pero no se limitan a, proteínas, celulosa, éteres de polietilenglicol, poliamidas, amidas poliacrílicas, poliuretanos con segmentos blandos de polietilenglicol éter, polímeros de injerto etoxilados, etc.
En la memoria descriptiva, los términos “canal de salida” u “orificio de liberación de aire”, usándose dichos términos de manera intercambiable, debe entenderse que significan un orificio de salida dispuesto de modo que cuando se introduce una muestra líquida en el interior del canal de recepción de muestra cerrado a través de un orificio de entrada, el orificio de liberación de aire permite que el aire que ocupa previamente el canal de recepción de muestra cerrado escape y se reemplace por el líquido entrante. El orificio de liberación de aire evita que el líquido en el canal de recepción de muestra cerrado escape por un sello de vacío, o en combinación con un orificio de entrada (que puede actuar como una válvula de retención) o una válvula de control. Esta retención ocurrirá a pesar del movimiento posterior del recipiente en el dispositivo óptico.
En la memoria descriptiva, el término “orificio de entrada”, cuando aparece en relación con la recepción de una muestra, debe entenderse que significa un orificio de entrada que normalmente permite que fluido (líquido o gas) fluya a través del mismo en un solo sentido y evita que el fluido fluya de vuelta. Esto evita el flujo de vuelta de fluidos. Cuando se usa en combinación con el orificio de liberación de aire, puede introducirse una muestra líquida en el canal de recepción de muestra cerrado sin el riesgo de que se introduzcan burbujas de aire en el mismo, lo que podría interferir con o perturbar el análisis de la muestra. El orificio de entrada actúa, de alguna manera, como una válvula de retención.
En la memoria descriptiva, el término “un plano” debe entenderse que significa el movimiento del recipiente o dispositivo óptico a lo largo de un plano horizontal del eje, en donde el eje de movimiento puede ser recto, circular, en zigzag, arriba y abajo, pero siempre en un plano horizontal. El movimiento es entonces tal que tanto el canal de muestra cerrado del recipiente como el recipiente en sí mismo permanecen en un plano horizontal, o el dispositivo óptico se mueve en un plano horizontal para explorar el canal. El plano, por lo tanto, es perpendicular a un eje vertical.
En la memoria descriptiva, el término “movimiento a lo largo del eje (largo)” debe entenderse que significa que el recipiente o dispositivo óptico puede moverse de tal manera que el eje del canal de recepción de muestra cerrado se mueve bajo un área de observación fija. Por ejemplo, si el eje del canal de recepción de muestra cerrado forma una línea recta, el movimiento sería rectilíneo. Si el eje del canal de recepción de muestra cerrado forma un círculo, el recipiente podría hacerse rotar alrededor de un eje vertical fijo central, con el área de observación a una distancia del eje fijo igual al radio medio del canal de recepción de muestra cerrado. El recipiente puede mantenerse fijo mientras que el dispositivo óptico se mueve o viceversa.
El recipiente facilita la toma de muestras y la concentración de ooquistes y otros parásitos y materia particulada en una disolución de flotación que se verá directamente debajo de un dispositivo de captura de imágenes, tal como un microscopio o dispositivo de captura de imágenes, y es simple de usar sin necesidad de formación o habilidades de laboratorio. Este sistema proporciona un método alternativo con reducción de tiempo de bajo coste, sensible y robusto que se utilizará para examinar volúmenes más grandes de muestra. Esto, por lo tanto, aumenta la sensibilidad para determinar la presencia de parásitos y puede usarse por una persona no experta. Otras ventajas incluyen:
• concentración de una capa superficial de muestra para un tiempo de análisis eficiente y reducido;
• no es necesario centrifugar para concentrar la muestra;
• un sistema cerrado permite que el dispositivo se use en secuencia con un dispositivo de adquisición de imágenes para el análisis automatizado de una muestra in situ en lugar de en un laboratorio;
• alto potencial de sensibilidad ya que el volumen de muestra puede ser mayor que los sistemas estándar de referencia actuales McMaster o mini-FLOTAC®;
• toda la superficie de la muestra puede examinarse mediante un movimiento en una dimensión del recipiente en el dispositivo de captura de imágenes o moviendo el dispositivo de captura de imágenes a lo largo del recipiente, como las partículas se concentran en una banda que está diseñada para ser de la anchura de un campo de visión de la lente objetivo del dispositivo;
• el ángulo de las paredes del canal de recepción de muestra cerrado en el recipiente está diseñado para minimizar la adhesión de huevos a las paredes. La adhesión se reduce adicionalmente recubriendo la superficie interna de las paredes de canal de recepción de muestra cerrado con una capa delgada de un producto químico hidrófobo o hidrófilo. La vibración también puede usarse para reducir la fricción estática de cualquier huevo/partícula atrapado;
• concentrando las partículas de parásitos en un área de superficie más pequeña, el sistema es ideal para el reconocimiento digital automatizado de parásitos dentro de una muestra sin perder sensibilidad al reducir el tamaño de muestra. Esto también ahorra tiempo para un usuario, tal como un técnico de laboratorio, operario, ya que solo es necesario examinar una fracción de la superficie en cuanto a la presencia de partículas de parásitos;
• debido a que el área de superficie con respecto a volumen se mantiene a un nivel óptimo, no hay necesidad de centrifugación para aislar suficientemente las partículas de los residuos para la identificación y cuantificación para el análisis final;
• la geometría del canal de recepción de muestra cerrado permanece sin cambios durante todo el proceso del sistema y método descritos en el presente documento;
• el sistema también se ha diseñado para eliminar cualquier necesidad de personal experto o implicación de laboratorio, y solo requiere algunas etapas simples para hacerse funcionar. Esto permite el uso del dispositivo en situaciones remotas, donde se recogen las muestras, con los resultados disponibles en poco tiempo;
• el sistema descrito en el presente documento se ocupa de 2 ml de una disolución de flotación: muestra de disolución de materia fecal 10:1, lo que representa 0,2 g de materia fecal, que da lugar a una sensibilidad de 5 huevos por gramo; y
• la capacidad volumétrica del recipiente puede aumentarse aumentando el diámetro del recipiente. A medida que mejora la conectividad y la transferencia de datos se vuelve menor que un factor limitante para el número de adquisiciones de imágenes, el volumen puede aumentarse para aumentar la sensibilidad de la prueba. Una vez que el recipiente se ha llenado con la disolución de suspensión y se ha colocado en el dispositivo y se ha activado, no se requiere ninguna intervención humana adicional para que se procesen los resultados.
• la plataforma aumenta la capacidad de concentración del canal manteniendo una profundidad limitada directamente debajo del área de visualización mientras aumenta el área de la sección transversal del canal generada a partir de los dos depósitos a cada lado de la plataforma y, por lo tanto, el volumen del recipiente.
Una de las ventajas del recipiente descrito en el presente documento es que no hay partes móviles en el recipiente. Cuando se hace que el sistema sea automático, esto hace que el recipiente sea mucho más simple de diseñar, fabricación, ensamblar y hacer funcionar. Esto reduce los requisitos de potencia y mejora la fiabilidad mecánica y la robustez. Esto reduce todos los costes asociados. En el sistema FLOTAC®, una vez que se rota (“traslada”) la placa superior, cualquier huevo u otras partículas que no hayan alcanzado la superficie de la cámara de flotación durante el tiempo de espera se dejarán atrás permanentemente, reduciendo de ese modo la precisión de ese sistema. En el recipiente propuesto, no existe tal proceso de espumado, por lo que no hay tiempo de corte de flotación hasta que finalmente se capturan las imágenes.
Otra ventaja del recipiente y sistema de la invención es la determinación de si un animal en una manada porta o no una infección parasitaria. La identificación de animales infectados y el nivel de infección ayudará a informar al usuario si un(os) animal(es) debe(n) tratarse o no para prevenir la enfermedad. Por otro lado, si se muestra que animales en la manada están libres de una infección parasitaria, puede informarse al usuario de que existe la posibilidad de que la manada contraiga una infección parasitaria. Los datos recogidos de manadas en una región usando el sistema y recipiente de la invención, también podrían ayudar en el estudio de la epidemiología de parásitos y el seguimiento de la propagación de la enfermedad a través de una región. Los resultados en conjunto de un número de manadas pueden proporcionar tendencias geográficas de la prevalencia e incidencia de infección parasitaria, así como la aparición de fallos de tratamiento. Esta información puede ponerse a disposición de las organizaciones de vigilancia de enfermedades nacionales e internacionales y otras terceras partes al proporcionarles acceso a los datos que generalmente se almacenan en la nube. También puede proporcionar información sobre la resistencia de un parásito particular a un fármaco. Por ejemplo, mediante el uso de pruebas de reducción de recuento de huevos en heces (FECRT) específicas, que mide el recuento de huevos en heces antes del tratamiento, la eficacia de un fármaco específico contra un parásito específico puede evaluarse midiendo el porcentaje de reducción en los recuentos de huevos en heces entre muestras fecales previas y posteriores al tratamiento.
Breve descripción de los dibujos
La invención se entenderá más claramente a partir de la siguiente descripción de una realización de la misma, dada solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
la figura 1A y la figura 1B ilustran vistas en perspectiva de un ejemplo de un recipiente de la invención, donde el recipiente tiene forma de disco, con y sin una cubierta, respectivamente. El recipiente de la figura 1B puede determinarse como que está con y sin una cubierta separada, donde el recipiente en general es transparente y donde la cubierta también es transparente, dando de ese modo la misma vista interna.
La figura 2A ilustra una vista en sección transversal del recipiente de la figura 1, mientras que la figura 2B ilustra una vista en sección transversal del canal de recepción de muestra cerrado de la figura 1 que tiene una plataforma.
La figura 3 ilustra una vista en sección transversal de una realización de un recipiente de la invención donde el recipiente es una sola pieza y el canal de recepción de muestra cerrado incluye además una plataforma.
La figura 4 ilustra un ejemplo de una realización de un recipiente de la invención, donde el recipiente tiene forma cuadrangular o lineal, sin plataforma.
Las figuras 5A y 5B ilustran un dispositivo de captura de imágenes típico para su uso con el recipiente ilustrado en las figuras 1 a 4.
La figura 6 ilustra un sistema de recogida de datos típico usado junto con el sistema de determinación de la invención.
Las figuras 7A-C ilustran una microfotografía típica de un FOV de una muestra fecal ovina preparada como se describe a continuación usando el recipiente descrito en el presente documento y el sistema como se muestra en la figura 5A. La figura 7A ilustra un ooquiste (rodeado) de Nematodirus y las características del interior del ooquiste son claramente visibles. La figura 7B muestra que burbujas de aire (rodeadas) se identifican fácilmente. La figura 7C muestra que los ooquistes más débiles (rodeados) representan Coccidia.
La figura 8 ilustra una vista en sección transversal lateral de un ejemplo de un recipiente de la invención.
La figura 9 ilustra una microfotografía típica de un FOV de huevos de muestras fecales visibles (rodeados) ovinas (figura 9A, 9B), bovinas (figura 9C, 9D) y equinas (figura 9E) en el canal del recipiente de la invención reivindicada y que se capturó utilizando el sistema óptico descrito en la invención. Los tipos de huevos están etiquetados de la siguiente manera; N = Nematodirus; M = Moniezia; C = Coccidia; S = Strongyles. Los huevos de Moniezia y Strongyles no se mostraron en la figura 7.
Descripción detallada de los dibujos
La presente invención describe un sistema que comprende un dispositivo de captura de imágenes con una lente de aumento, un recipiente diseñado para contener un volumen específico de una muestra líquida, software de análisis de imágenes diseñado para reconocer y contar artículos/partículas de interés específicos, y un kit para simplificar el procedimiento para un usuario final.
Con referencia ahora a las figuras, donde la figura 1,la figura 2 y la figura 8 ilustran una realización de un recipiente de la presente invención. Específicamente, la figura 1 ilustra una vista en perspectiva de una realización de un recipiente de la presente invención y se hace referencia en general mediante el número de referencia 1. La figura 2A y la figura 8 ilustran el recipiente 1 de la figura 1 en sección transversal. El recipiente 1 comprende un alojamiento 2 que tiene una pared exterior 3, un agujero 30 configurado para alojar un accionador o árbol de accionamiento de motor y un soporte 5. El alojamiento 2 del recipiente 1 puede ser con o sin una pared exterior 3. El soporte 5 forma una base 5a de un canal 6 de recepción de muestra cerrado, que está situado entre el agujero 30 y la pared exterior 3. El canal 6 de recepción de muestra cerrado comprende paredes 11a, 11b que forman un conducto 12 adaptado para alojar una muestra líquida. El alojamiento 2 comprende además un orificio 20 de entrada en comunicación de fluido con el canal 6 de recepción de muestra cerrado. El orificio 20 de entrada está configurado para recibir la muestra líquida y suministrar la muestra al conducto 12 del canal 6 de recepción de muestra cerrado. En algunas realizaciones, y opuesto al orificio 20 de entrada, puede colocarse en un orificio 14 de liberación de aire (pequeño), que permite que escape aire cuando la muestra líquida está aplicándose al canal 6 de recepción de muestra cerrado a través del orificio 20 de entrada (véase la figura 2A).
Como se muestra en la figura 1, la figura 2 y la figura 8, el canal 6 de recepción de muestra cerrado en sección transversal muestra que las paredes 11a, 11b forman una forma de trapezoide con una parte superior 7 paralela al soporte 5. La parte superior 7 es preferiblemente transparente o translúcida. Las paredes 11a, 11b puede recubrirse en el lado orientado hacia el conducto 12 con un material hidrófobo o hidrófilo. El conducto 12 concentra la materia flotante en la muestra líquida en la parte superior 7. La anchura de la parte superior 7 está determinada por el campo de visión (FOV) de un dispositivo 100 de captura de imágenes (véase la figura 4). Idealmente, la anchura de la parte superior 7 corresponde a la anchura del FOV, de modo que toda la parte superior 7 puede explorarse de manera sucesiva simplemente rotando el recipiente 1 a través de 360° o haciendo rotar un dispositivo de captura de imágenes a través de 360°, sin que se requiera ningún movimiento relativo adicional. Como se muestra en la figura 2B, el canal de recepción de muestra cerrado (opcionalmente) comprende además una plataforma elevada 50 que se extiende hacia arriba desde la base 5a. La plataforma elevada 50 está claramente separada (figura 2B) de una o ambas de las paredes 11a, 11b y la parte superior 7. La ventaja de tener una plataforma elevada 50 es que hay una profundidad más superficial, más pequeña con respecto al canal 6 directamente debajo del área de visualización, pero volúmenes más grandes en los depósitos a cada lado de la plataforma 50, lo que da como resultado un volumen más pequeño de líquido bajo la lente objetivo del microscopio o lector de imágenes. Este volumen más pequeño de líquido reduce la borrosidad causada por la difracción de la luz a través de un líquido. La plataforma elevada 50 permanece libre de, y nunca entra en contacto con, las paredes 11a, 11b y la parte superior 7.
Con referencia ahora a la figura 3, se ilustra una vista en sección transversal de una realización del recipiente de la invención, y se le da el número de referencia 200, en la que a las partes o etapas descritas con referencia a la realización anterior se les asignan los mismos números. El recipiente 200 es un objeto de dos piezas que consiste en una sección inferior 201 y una sección superior 202. La sección inferior 201 comprende una pared exterior 3; un agujero 30 configurado para alojar un accionador o árbol de accionamiento de motor; un soporte 5 con un canal 6 de recepción de muestra cerrado colocado sobre el mismo y entre la pared exterior 3 y el agujero 30. La sección inferior 201 del recipiente 200 puede usarse con o sin una pared exterior 3. El canal 6 de recepción de muestra cerrado en sección transversal muestra las paredes 11a, 11b dispuestas en ángulo de manera que forman una forma de trapezoide. La parte del soporte 5 aislada por las paredes 11a, 11b forma la base 5a del canal 6 de recepción de muestra cerrado. Las paredes 11a, 11b pueden recubrirse en el lado orientado hacia el conducto 12 con un material hidrófobo o hidrófilo.
La sección superior 202 tiene una superficie superior 206 y una superficie inferior 207 y es preferiblemente transparente o translúcida. La sección superior 202 comprende además un orificio 14 de liberación de aire pequeño en comunicación de fluido con el canal 6 de recepción de muestra cerrado. El orificio 14 de liberación de aire pequeño está configurado para permitir que escape aire cuando la muestra líquida está aplicándose al canal 6 de recepción de muestra cerrado a través del orificio 20 de entrada. El orificio 20 de entrada está configurado para recibir la muestra líquida y suministrar la muestra al conducto 12 del canal 6 de recepción de muestra cerrado. La sección superior 202 está configurada para acoplarse reversiblemente con las paredes 11a, 11b del canal 6 de recepción de muestra cerrado. La superficie inferior 207 está configurada para asentarse paralela al soporte 5 y para apoyarse sobre la parte superior de las paredes 11a, 11b del canal 6 de recepción de muestra cerrado, formando una parte superior 208 a través de la cual una lente del dispositivo 100 de captura de imágenes puede detectar materia flotante en el conducto 12. El acoplamiento de la sección superior 202 con las paredes 11a, 11b forman un sello hermético. El conducto 12 concentra materia flotante en la muestra líquida donde la sección superior 202 forma el sello con el canal 6 de recepción de muestra cerrado, es decir, en el área de la parte superior 208.
Con referencia ahora a la figura 4, se ilustra otra realización de un recipiente, que se proporciona con el número de referencia 300, y en la que a las partes o etapas descritas con referencia a la realización anterior se les asignan los mismos números. El recipiente 300 tiene forma lineal o cuadrangular. El recipiente 300 comprende un alojamiento 301 que tiene una pared exterior 3 (opcional), un soporte 5 con un canal 6 de recepción de muestra cerrado colocado sobre el mismo. El canal 6 de recepción de muestra cerrado comprende paredes 11a, 11b que forman un conducto 12 adaptado para alojar una muestra líquida. El canal 6 de recepción de muestra cerrado que se muestra en este caso tiene paredes 11a, 11b dispuestas en ángulo para formar una forma de trapezoide con una parte superior 7 paralela al soporte 5. La parte del soporte 5 aislada por las paredes 11a, 11b forma la base 5a del canal 6 de recepción de muestra cerrado. La parte superior 7 es preferiblemente transparente o translúcida. Las paredes 11a, 11b pueden recubrirse en el lado orientado hacia el conducto 12 con un material hidrófobo o hidrófilo.
El conducto 12 concentra la materia flotante en la muestra líquida en la parte superior 7. La anchura de la parte superior 7 está determinada por el FOV de un dispositivo 100 de captura de imágenes (véase la figura 3). Idealmente, la anchura de la parte superior 7 corresponde a la anchura del FOV, de modo que toda la parte superior 7 puede explorarse de manera sucesiva simplemente moviendo el recipiente 300 o el dispositivo 100 de captura de imágenes en un plano.
Con referencia ahora a la figura 5, se ilustra un dispositivo 100 de captura de imágenes adecuado para su uso con el recipiente 1, 200, 300 descrito anteriormente. En esta figura, un microscopio compuesto típico se ilustra como el dispositivo 100 de captura de imágenes, con una platina 120, una lente objetivo 102 (plano 4x/NA0.1), corregida para distancia focal de 160 mm, y un detector 122 (cámara Raspberry Pi con 8 Mpi). El dispositivo 100 de captura de imágenes comprende un accionador 101 que rota o mueve el recipiente 1,200, 300 a lo largo de un determinado eje, la lente objetivo 102, un sensor (ilustrado como el detector 122), una o más fuentes de iluminación, un ordenador, un dispositivo de transmisión, un alojamiento 124 adecuado, y una fuente de alimentación.
El accionador 101 es un motor eléctrico que hace rotar el recipiente 1,200, o mueve el recipiente 300 a lo largo de un plano, haciendo que el canal 6 de recepción de muestra cerrado pase debajo de la lente objetivo 102 del dispositivo 100 de captura de imágenes. El agujero 30 del recipiente 1, 200, 300 está configurado para alojar el accionador 101, bloqueando el accionador 101 y el recipiente 1, 200, 300 juntos para que roten/se muevan juntos. El bloqueo del accionador 101 y el recipiente 1, 200, 300 puede lograrse mediante los sistemas típicos conocidos en la técnica para montar un recipiente o portaobjetos en una platina de microscopio. Por ejemplo, el bloqueo puede lograrse mediante una fuerza magnética generada entre un imán 110 que está montado en el accionador 101 y un disco magnético 112 que se coloca dentro del recipiente 1, 200, 300. Alternativamente, el bloqueo puede lograrse mediante un receptáculo moldeado en el interior de la base 5 del recipiente 1, 200, 300 que es un ajuste para un árbol acoplado al accionador 101 que bloquea los mismos juntos. El recipiente 1, 200, 300 permanece alineado con respecto al eje central del dispositivo 100, garantizando de ese modo una distancia constante desde la lente objetivo 102 del dispositivo 100 hasta la parte superior 7, 208 del recipiente 1, 200, 300.
El recipiente 1, 200, 300 también mantiene su posición cuadrada con el eje central del dispositivo de captura 100 con respecto a la parte superior 7, 208 del recipiente 1, 200, 300 para mantener la distancia correcta desde la cámara hasta el recipiente. Si es necesario, cualquier desviación de esto puede ser anulada mediante, por ejemplo, ajustes menores de la distancia vertical del recipiente 1,200, 300 con respecto a la lente 102 usando accionadores.
Para usar el recipiente 1, 200, 300 con el dispositivo 100 de captura de imágenes, debe prepararse una muestra líquida. La muestra se prepara mediante un método como se describe en la técnica anterior que es típico para preparar una muestra para análisis y es como sigue. Por ejemplo, Se miden 45 ml de una disolución de flotación (FS) en un cilindro graduado. En primer lugar, se homogeneiza minuciosamente una muestra y se añaden 5 g de la muestra homogeneizada a la disolución de flotación para proporcionar una suspensión de muestra. La relación de dilución de muestra:disolución de flotación se mide en volumen (típicamente una relación de dilución de 1:10). La suspensión de muestra se homogeneiza adicionalmente minuciosamente en el cilindro graduado usando una espátula y se pasa a través de un filtro. Se determinará que el tamaño de poro del filtro es al menos un 5 % mayor que la dimensión más grande en el intervalo de materia específica que se identifica en la prueba. Por ejemplo, si la materia específica que se identifica en la prueba tiene un diámetro de 100 |im, el tamaño de poro del filtro será de 105 |im. A continuación, la muestra se filtra adicionalmente a través de una malla de alambre que tiene un tamaño de poro de, por ejemplo, 212 |im, para retirar cualquier residuo grande restante.
Una parte de la muestra filtrada se obtiene usando una jeringa. La muestra filtrada se mezcla de manera minuciosa y constante mientras se toma la muestra.
Una vez que la muestra se prepara mediante uno de los métodos expuestos anteriormente (o cualquier método adecuado para preparar tales muestras), la muestra se introduce con un retraso mínimo después de la preparación al canal 20 de entrada, con retención máxima de las partículas flotantes de interés, y con aire o gas atrapado mínimo (idealmente cero), especialmente cuando este último está en forma de burbujas microscópicas. La muestra preparada se hace pasar al conducto 12 del canal 6 de recepción de muestra cerrado a través del orificio 20 de entrada usando una jeringa o mecanismo de bombeo similar. Un orificio 14 de liberación de aire pequeño, opuesto al orificio 20 de entrada, permite que el aire en el conducto 12 escape a medida que la muestra líquida entra en el canal 6 de recepción de muestra cerrado (véanse la figura 1B y la figura 2A). El recipiente 1, 200, 300 puede sostenerse, durante la carga de muestra, de modo que el eje central del recipiente 1, 200, 300 es horizontal y paralelo al suelo, con el plano del recipiente 1, 200, 300, por lo tanto, vertical y perpendicular al suelo. El orificio 20 de entrada debe estar directamente debajo del eje central del recipiente 1, 200, 300, y el orificio 14 de liberación de aire en el punto opuesto, directamente por encima del eje central, de modo que las burbujas tenderán naturalmente hacia el orificio 14 de liberación de aire debido a su flotabilidad en la muestra. El llenado del conducto 12 se completa cuando la muestra alcanza este orificio 14 de liberación de aire pequeño. El efecto del orificio 20 de entrada será mantener la muestra dentro, sin tendencia a fugarse al orificio 14 de liberación de aire, que, por lo tanto, puede dejar sin sellarse y abierto.
A continuación, observando la figura 5A, la lente 102 del dispositivo 100 de captura de imágenes está configurada para lograr el FOV máximo con el requisito mínimo de resolución necesario para el análisis automatizado para optimizar el tiempo de procesamiento y el rendimiento. Esto se logra haciendo coincidir la potencia de resolución óptica de la lente 102 con la resolución de píxeles de la cámara, como se indica por la siguiente fórmula:
R = 1,22 X / (NAobj NAcond) = 0,61 X / NA = X/2
Para X = 520 nm (luz verde)
R = 3 |im, la distancia mínima entre los puntos resolubles, en las mismas unidades que lambda especificadas.
NA = 0,1 (Apertura numérica de la lente utilizada)
Este es el nivel de detalle reconocible por la lente objetivo 102 utilizada. El detector 122 debe realizar niveles similares para obtener el mejor sistema. Por lo tanto, debe disminuirse la distancia de trabajo para reducir el aumento y la ganancia con respecto al campo de visión.
El tamaño del campo de visión ahora coincide con la anchura del canal 6 de muestra cerrado en el recipiente 1, 200, 300. Las superficies internas del elemento de soporte de la lente 102 pueden tener un revestimiento de papel de lija o revestimiento de fieltro (o una superficie similar que reduce o inhibe la reflexión de luz) para reducir cualquier reflejo interno, lo que podría distorsionar o reducir la claridad de la imagen en el sensor/detector 122 del dispositivo 100 de captura de imágenes. La columna entre la lente 102 y el sensor/detector 122 en el dispositivo 100 de captura de imágenes tiene un diámetro mínimo para aliviar reflejos internos que pueden causar la aberración de la imagen que se está tomando. El dispositivo 100 de captura de imágenes se ha seleccionado para lograr una disolución de bajo coste mientras se logra una resolución y calidad de imagen adecuadas.
La anchura de la parte superior 7, 208 está determinada por el FOV de la lente objetivo 102 del dispositivo 100 de captura de imágenes con el aumento elegido. Al hacer que la anchura de la parte superior 7, 208 corresponda con la anchura del FOV, toda la superficie del canal cerrado 6 puede explorarse mediante el movimiento del recipiente 1,200, 300 en una dirección o en un solo plano o mediante el movimiento de la lente objetivo 102 en una dirección o en un solo plano.
La figura 6 ilustra, por medio de un diagrama de bloques, un sistema 400 para obtener imágenes de una muestra cargada en el canal 6 de recepción de muestra cerrado del recipiente 1, 200, 300. Las imágenes obtenidas del canal 6 de recepción de muestra cerrado se capturan en secuencia a medida que el accionador 101 mueve el recipiente 1, 200, 300 en un plano solo hasta que se cubra toda el área de superficie del canal 6 de recepción de muestra cerrado o se haya capturado una serie de imágenes representativa suficiente. Alternativamente, el accionador 101 mueve la lente objetivo 102 hasta que se cubra toda el área de superficie del canal 6 de recepción de muestra cerrado o se haya capturado una serie de imágenes representativa suficiente. Estas imágenes se procesan mediante software de análisis de imágenes para establecer la presencia o ausencia de microorganismos específicos u otros elementos de interés. Un ejemplo de esto sería un granjero que lleva a cabo un recuento de huevos de uno o más parásitos específicos presentes en una muestra fecal tomada de animales en una granja. También es posible que el usuario envíe los resultados de cualquier prueba a una base de datos basada en la nube para su almacenamiento y posterior análisis. De esta manera, o por otros métodos, comparando resultados desde diferentes ubicaciones, o desde la misma ubicación a lo largo del tiempo, el crecimiento, puede monitorizarse la propagación o contención de la infección parasitaria. Esta información podría ser muy valiosa a niveles locales, regionales, nacionales e internacionales, por ejemplo, para monitorizar patrones de infestación de ganado. Entidades nacionales, tal como un departamento gubernamental de agricultura, o autoridades regionales, por ejemplo, a nivel europeo, podrían usar esta información para establecer políticas sobre el tratamiento de animales, movimientos de animales, control de enfermedad, práctica veterinaria, etc.
Volviendo ahora a la figura 7, la capacidad de diferenciar entre especies usando un algoritmo de reconocimiento de imágenes será directamente proporcional a la calidad de la imagen capturada y el contraste logrado. El contraste en la figura 7A es suficiente para que el ojo humano diferencie formas basándose en la relación de aspecto, contraste y característica del interior del ooquiste. Las formas esféricas de anillo oscuro marcadas en la figura 7B identifican claramente burbujas de aire. Los ooquistes más tenues marcados en la figura 7C representan Coccidia. La concentración de los elementos de interés (por ejemplo, ooquistes) en el recipiente descrito en el presente documento aumenta la eficiencia de captura con respecto a los dispositivos de la técnica anterior disminuyendo el número de imágenes requeridas para una captura automatizada. Por lo tanto, el recipiente y el sistema de la invención reivindicada proporcionan una clara ventaja de ser capaces de analizar volúmenes más altos aunque adquieren menos imágenes, en un proceso automatizado, donde estas imágenes pueden capturarse a una resolución adecuada para poder ver elementos de interés lo suficientemente claros como para identificarlos.
Volviendo ahora a la figura 9, se ilustra una microfotografía típica de un FOV de huevos de muestras fecales ovinas (figura 9A, 9B), bovinas (figura 9C, 9D) y equinas (figura 9E) visibles (rodeados) en el canal del recipiente de la invención reivindicada y que se capturó utilizando el sistema automatizado de la invención. Los tipos de huevos están etiquetados de la siguiente manera; N = Nematodirus; M = Moniezia; C = Coccidia; S = Strongyles. El recipiente concentra las partículas para su identificación, lo que permite que se automatice el proceso. Como se explicó anteriormente, la concentración de los elementos de interés (por ejemplo, ooquistes) en el recipiente descrito en el presente documento aumenta la eficiencia de captura con respecto a los dispositivos de la técnica anterior disminuyendo el número de imágenes requeridas para una captura automatizada. La calidad de imagen capturada y el contraste logrados al concentrar los elementos de interés usando el sistema automatizado permite al usuario ver los elementos de interés de manera suficientemente clara como para que los usuarios los identifiquen con menos imágenes, lo que proporciona una clara ventaja con respecto a dispositivos de la técnica anterior, que no pueden automatizarse. Esto también demuestra que el recipiente y el sistema de la invención reivindicada pueden usarse para determinar la presencia de materia a partir de muestras a través de diferentes especies.
Materiales y métodos
Se recogieron muestras fecales recientes de ganado infectado de manera natural. Estas se fijaron luego usando una disolución de formol al 10 % (formaldehído al 4 %) y se almacenaron a 4 °C hasta el sometimiento a prueba. Muestras de material compuesto para grupos de animales se combinaron en grupos de 10 individuos y se mezclaron bien (Morgan et al., 2005 (Morgan, E. R., Cavill, L., Curry, G. E., Wood, R. M., Mitchell, E. S. (2005) Effects of aggregation and sample size on composite faecal egg counts in sheep. Veterinary Parasitology. 131:79-87), Rinaldi et al., 2014 (Rinaldi, L., Levecke, B., Bosco, A., Ianniello, D., Pepe, P., Charlier, J., Cringoli, G., Vercruysse, J., 2014. Comparison of individual and pooled faecal samples in sheep for the assessment of gastrointestinal strongyle infection intensity and anthelmintic drug efficacy using McMaster and Mini-FLOTAC. Vet. Parasitol. 205, 216-223)).
Preparación de muestra
La disolución de flotación de cloruro de sodio saturada se prepara en el laboratorio añadiendo NaCl a 11 de H2O calentada (40-50 °C) hasta que no pasa más sal a la disolución (400-500 g). El NaCl se disuelve usando un agitador y la disolución se deja saturar completamente durante la noche. La densidad relativa (S. G.) se comprueba a continuación usando un hidrómetro para una S. G. de 1,2 (Cringoli et al., 2010 (Cringoli G, Rinaldi L, Maurelli M. P & Utzinger J (2010) FLOTAC: new multivalent techniques for qualitative and quantitative copromicroscopic diagnosis of parasites in animals and humans. Nature Protocols: 5 (3): 503-515)).
Se miden 45 ml de la disolución de flotación (FS) en un cilindro graduado. La muestra conservada se homogeneizó bien y se añadieron 5 g a la disolución de flotación, se midió en volumen (relación de dilución 1:10). La suspensión de muestra se homogeniza minuciosamente en el cilindro usando una espátula y se pasa a través de un filtro (colador de té) que tiene un tamaño de poro un 5% más grande que las partículas de interés en la muestra. A continuación, la muestra se filtra adicionalmente a través de una malla de alambre (tamaño de poro de 212 |im) para retirar cualquier residuo grande restante.
Llenado del dispositivo
Se extraen 4 ml de la suspensión de muestra filtrada al interior de una jeringa. Debe tenerse cuidado en este punto para trabajar rápidamente y mezclar la muestra en la jeringa para evitar la flotación de huevos dentro de la jeringa. Esto puede lograrse invirtiendo la jeringa 2-3 veces antes del llenado. Ajustar la jeringa en el interior del orificio de entrada (el agujero de llenado) del recipiente, con el recipiente mantenido verticalmente y el orificio de entrada colocado debajo del eje horizontal. Presionar el émbolo y llenar el canal de recepción de muestra cerrado, permitiendo que el aire escape a través del orificio de liberación de aire en la parte superior. Una vez que el canal de recepción de muestra cerrado está lleno, se retira la jeringa.
Identificación y recuento de huevos
El número de huevos por gramo (EPG) de heces se calcula multiplicando el recuento observado con el factor de dilución y luego se divide por el volumen de la disolución examinada, la unidad predeterminada para informar de FEC es EPG.
Cálculo de huevos por gramo (EPG) para el recipiente y sistema descritos en el presente documento.
1 g de heces en 9 ml de disolución de flotación; (45 ml de disolvente con respecto a 5 ml de soluto) 2,2 ml en recipiente; y factor de multiplicación de 4,55 para calcular el valor de EPG. (1 g de heces en 9 ml de disolución de flotación (dando un volumen total de 10 ml); se examinaron 2,2 ml, por lo tanto, 10 ml/2,2 ml = 4,55).
Cálculo de EPG para el sistema McMaster
1 g de heces en 9 ml de disolución de flotación; 0,3 ml en portaobjetos (dado el estándar de volumen de 0,15 ml en la cámara 1, 0,15 ml en la cámara 2); y factor de multiplicación de 33,33 para calcular el valor de EPG. (1 g de heces en 9 ml (dando un volumen total de 10 ml); se examinaron 0,3 ml de disolución de flotación, por lo tanto, 10 ml/0,3 ml = 33,33)
Cálculo de EPG para mini-Flotac
1 g de heces en 9 ml de disolución de flotación; 2 ml en dispositivo (dado el estándar de 1 ml en la cámara 1, 1 ml en la cámara 2); y factor de multiplicación de 5 para calcular el valor de EPG. (1 g de heces en 9 ml (dando un volumen total de 10 ml), se examinaron 2 ml de disolución de flotación, por lo tanto, 10 ml/2 ml=5).
Resultados
Tabla 1: Gráfico de comparación del volumen examinado frente al área a examinar, y sensibilidad de huevos por gramo (EPG):
Figure imgf000016_0001
El método de McMaster como se describe en la tabla 1 requeriría teóricamente un nivel mínimo de contaminación de 50 EPG de heces para identificar 1 huevo en 0,3 ml, a diferencia del dispositivo y el sistema descritos en el presente documento que requerirían solo un nivel de contaminación de 4 EPG para identificar 1 huevo en 2,2 ml. Por lo tanto, el dispositivo y el sistema descritos en el presente documento son más precisos y es menos probable que produzcan un resultado falso negativo.
El dispositivo y el sistema descritos en el presente documento pueden aumentar fácilmente el volumen que va a examinarse, que está en línea con los 5 ml examinados en el método FLOTAC® descrito en la tabla 1. Sin embargo, el tiempo de proceso automatizado aumentará proporcionalmente y como el sistema FLOTAC® rara vez se usa debido a su largo tiempo de procesamiento, requisitos de centrifugación y naturaleza laboriosa del método. Se sugiere que el volumen examinado en el dispositivo y el sistema descritos en el presente documento debe representar un aumento por encima del nivel más alto del método usado con mayor frecuencia, mientras se mantiene un tiempo de proceso mínimo.
La sensibilidad de la prueba es directamente proporcional al volumen examinado y este volumen determina el número requerido de imágenes a analizar. La concentración propuesta de la materia flotante suspendida en el área de superficie de visualización en relación con el volumen examinado permite que el número de imágenes que van a transmitirse se mantenga al mínimo mientras se mantiene la sensibilidad. A medida que la conectividad a Internet aumenta y mejora, el dispositivo descrito en el presente documento puede optimizarse para aumentar el número de adquisiciones de imágenes y, por lo tanto, aumentar aún más la sensibilidad del dispositivo.
Una comparación de técnicas de examen coprológico entre el sistema mini-FLOTAC®, el sistema McMaster y el sistema descrito en el presente documento se proporcionan en la tabla 2 a continuación. Se analizaron tres muestras fecales ovinas con respecto a la presencia de ooquistes de Coccidia de parásitos GIT, huevos de Nematodirus, Strongyles y Strongoloides.
Figure imgf000017_0001
Estos resultados demuestran que la invención proporciona una estimación precisa del recuento de huevos en heces real en comparación con cualquiera de los sistemas McMaster y Mini-FLOTAC®. La importancia del volumen más alto que se analiza se demuestra por los resultados de McMaster que proporcionan un valor medio sesgado debido al alto factor de extrapolación. En este caso, el factor de multiplicación alto ha dado como resultado una lectura más alta, pero la principal desventaja es que cualquier resultado falso negativo tiene una consecuencia mucho mayor en el análisis general. Esto significa que cuando se encuentra que un volumen de muestra muy pequeño es negativo en cuanto a la presencia de un parásito, ese resultado se extrapola para dar un resultado negativo para la prueba en su conjunto. La distribución de huevos de parásitos dentro de una muestra no es homogénea y, por lo tanto, cuanto mayor sea el tamaño de la muestra, menor es la variabilidad en los resultados y más alta es la sensibilidad.
La disponibilidad de sometimiento a prueba de la muestra inmediatamente en el sitio con el proceso automatizado sugerido también aumentará la precisión de los resultados ya que las muestras, una vez excretadas, se deterioran con el tiempo y debido a la exposición al medio ambiente.
En la memoria descriptiva, los términos “comprender, comprende, comprendido/comprendida y que comprende” o cualquier variación de los mismos y los términos “incluir, incluye, incluido/incluida y que incluye” o cualquier variación de los mismos se consideran totalmente intercambiables y todos deberían tener la interpretación más amplia posible y viceversa.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Recipiente (1, 200, 300) para su uso en concentración de materia en una suspensión de muestra, comprendiendo el recipiente (1, 200, 300) un alojamiento (2) que tiene un soporte (5), un orificio (20) de entrada adaptado para recibir la suspensión de muestra; y un canal (6) de recepción de muestra cerrado en comunicación de fluido con el orificio (20) de entrada, teniendo el canal (6) de recepción de muestra cerrado una parte superior (7) y una base (5a) conectadas por al menos dos paredes (11a, 11b); en el que la parte superior (7) está configurada para tener una anchura menor que una anchura de la base (5a) y el canal (6) de recepción de muestra cerrado está configurado para tener una profundidad mayor que 400 |im; en el que el orificio (20) de entrada está configurado para actuar como un conducto para suministrar la muestra al canal (6) de recepción de muestra cerrado; y en el que las paredes (11a, 11b) del canal (6) de recepción de muestra cerrado tienen una pendiente de entre 40° y menos de 90° con respecto a la base (5a); caracterizado porque el canal (6) de recepción de muestra cerrado comprende además una plataforma elevada (50) que se extiende hacia arriba desde la base (5a); y en el que la plataforma elevada (50) está separada de la parte superior (7, 208) y ambas de las paredes (11a, 11b), y en el que la profundidad del canal (6) de recepción de muestra cerrado se mide desde la parte superior de la plataforma elevada (50).
2. Recipiente (1, 200, 300) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la base (5a) está formada por el soporte (5) de alojamiento.
3. Recipiente (1, 200, 300) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el alojamiento (2) comprende además un orificio (14) de liberación de aire en comunicación de fluido con el canal (6) de recepción de muestra cerrado; y en el que el orificio (14) de liberación de aire es diametralmente opuesto al orificio (20) de entrada o el orificio (14) de liberación de aire es opuesto al orificio (20) de entrada.
4. Recipiente (1, 200, 300) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el orificio (20) de entrada es una válvula de retención.
5. Recipiente (200) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el alojamiento (2) del recipiente (1) consiste en una sección inferior (201) configurada para alojar el canal (6) de recepción de muestra cerrado y una sección superior (202) configurada para unirse de manera reversible a y crear un sello con la sección inferior (201).
6. Recipiente (1, 200, 300) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el alojamiento comprende además un agujero (30) configurado para recibir un accionador (101) conectado a un dispositivo (100) de captura de imágenes.
7. Recipiente (1,200, 300) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el recipiente (1,200, 300) está configurado para moverse en un plano; y en el que el movimiento dentro del plano puede ser opcionalmente una traslación rectilínea o rotación, o una combinación de las mismas.
8. Recipiente (1,200, 300) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una superficie interna de las paredes (11a, 11b) del canal (6) de recepción de muestra cerrado está recubierta con un material hidrófobo o un material hidrófilo.
9. Sistema (400) para concentrar materia particulada en una suspensión de muestra, comprendiendo el sistema el recipiente (1, 200, 300) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un dispositivo (100) de captura de imágenes configurado para alojar el recipiente (1, 200, 300); y en el que el sistema comprende opcionalmente además un ordenador, un dispositivo de almacenamiento interno, un detector (122) y una red inalámbrica para enviar datos para almacenamiento de computación en la nube.
10. Kit para determinar la presencia de materia particulada en una muestra líquida, comprendiendo el kit un recipiente (1,200, 300) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y una disolución de flotación.
11. Kit según la reivindicación 10, en el que la disolución de flotación se selecciona de una disolución saturada de NaCl con densidad relativa de 1,20, una disolución de azúcar saturada con una densidad relativa de 1,280, una disolución de azúcar de Sheather con una densidad relativa de 1,20, una disolución de sulfato de zinc saturada con una densidad relativa de 1,20, una disolución de nitrato de sodio saturada con una densidad relativa de 1,20, y una disolución de sulfato de magnesio saturada con una densidad relativa de 1,280.
12. Método para determinar la presencia de materia particulada en una suspensión de muestra, comprendiendo el método las etapas de:
preparar la suspensión de muestra;
mezclar minuciosamente la suspensión de muestra en un contenedor;
introducir la suspensión de muestra minuciosamente mezclada en el interior del canal (6) de recepción de muestra cerrado del recipiente (1,200, 300) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;
montar el recipiente (1, 200, 300) con la suspensión de muestra mezclada sobre un dispositivo (100) de captura de imágenes que tiene una lente objetivo (102); y
mover el recipiente (1, 200, 300) o dispositivo (100) de imagen óptica en un plano para permitir la determinación de la presencia de materia particulada en la suspensión de muestra, en el que el campo de visión de la lente objetivo (102) corresponde a la anchura de una parte superior (7) del canal (6) de recepción de muestra cerrado.
13. Método según la reivindicación 12, en el que el dispositivo (100) de captura de imágenes comprende un accionador (101) configurado para acoplarse con el recipiente (1, 200, 300) y mover o bien la lente objetivo (102) o bien el recipiente (1, 200, 300) en un solo plano.
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