ES2926807T3 - Parapoxvirus para el acondicionamiento y tratamiento de infecciones por coronavirus - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al tratamiento de infecciones por coronavirus ya la preparación de sujetos para dicha infección mediante la administración de un parapoxvirus. Este tratamiento es para ayudar al sistema inmunitario a combatir el virus y, por lo tanto, prevenir y mejorar los síntomas de la enfermedad por coronavirus. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Parapoxvirus para el acondicionamiento y tratamiento de infecciones por coronavirus

Campo de la invención

La presente invención se refiere al tratamiento de infecciones por coronavirus y para preparar sujetos para tal infección mediante la administración Parapoxvirus ovis. Este tratamiento es para ayudar al sistema inmunitario en el combate del virus, y mediante ello prevenir y aliviar los síntomas de una enfermedad por coronavirus.

Antecedentes de la invención

Los coronavirus son virus de ARN monocatenario positivo envueltos, causantes de enfermedades en mamíferos y aves. En humanos provocan infecciones respiratorias, incluyendo el resfriado común, aunque algunos virus tales como los coronavirus del SARS y el MERS pueden ser letales. Periódicamente surgen nuevos coronavirus en distintas partes del mundo. El SARS-CoV (coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave) se produjo en el año 2002 y causó 916 muertes durante la epidemia, con una tasa de mortalidad de aproximadamente un 12%. El MERS-CoV (síndrome respiratorio de Oriente Medio) surgido en 2012, con 543 muertes comunicadas y una tasa de mortalidad de aproximadamente un 39%.

Recientemente, surgió en Wuhan, China, un brote de un coronavirus denominado SARS-CoV-2, y desde entonces se ha diseminado por todo el mundo. La enfermedad causada por el SARS-CoV-2, COVID-19 (enfermedad causada por coronavirus de 2019) fue declarada como pandemia por la OMS el 11 de marzo de 2020. La gravedad del COVID-19 varía de asintomática o leve a grave, y un porcentaje significativo de los pacientes que presentan una infección clínicamente evidente desarrolla una enfermedad grave. La tasa de letalidad varía según el país, y se piensa que está entre el 2 y el 3%, pero la verdadera tasa de mortalidad es incierta dado que se desconoce el número de casos totales. Aunque el SARS-CoV-2 aparentemente tiene una tasa de mortalidad más baja que el SARS-CoV o el MERS-CoV, parece ser más infeccioso y se ha podido diseminar por el mundo, con aproximadamente 3,66 millones de casos y 257.000 muertes confirmadas a 6 de mayo de 2020, y posiblemente muchas más sin confirmar. El conocimiento acerca de la COVID-19 es incompleto y está en constante evolución.

Las epidemias recurrentes de coronavirus demuestran que estos virus continúan siendo una amenaza para el mundo, ya que surgen de forma espontánea, se diseminan con facilidad y pueden tener consecuencias graves en la vida humana, incluyendo no solo problemas de salud, sino también un drástico impacto social y económico. Por ello, hay una gran necesidad médica para la prevención y tratamiento. Sin embargo, dado que se sabe que los coronavirus mutan y se recombinan con frecuencia, presentan un desafío continuo para el control de enfermedades. Hasta el momento no se cuenta con vacunas ni fármacos antivirales para la prevención o el tratamiento de las infecciones por coronavirus en humanos. En el mundo se están probando un gran número de antivirales para un efecto sobre coronavirus, y varios candidatos prometedores han fracasado.

Inesperadamente, los inventores descubrieron que Parapoxvirus ovis (PPVO) era útil para la preparación de sujetos para y el tratamiento de infecciones por coronavirus. PPV^o causa infecciones dérmicas agudas en cabras y ovejas, y aunque no causa enfermedades graves en humanos, induce una compleja respuesta inmunitaria innata y adaptativa, y trata infecciones con ciertos virus específicos tal como el VHB (documento WO 2019/048640 A1). Sin embargo, la respuesta inmunitaria inducida por PPVO es compleja, y no necesariamente útil para el tratamiento de infecciones virales en general. Por ello, no se podría haber esperado que PPVO tuviera utilidad en la preparación de sujetos para y el tratamiento de infecciones por coronavirus.

Compendio de la invención

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un agente de Parapoxvirus ovis (PPVO) para su uso en (i) la preparación de un sujeto para una infección por coronavirus o (ii) el tratamiento de una infección por coronavirus en un sujeto. En un segundo aspecto, la invención se refiere a una composición o un kit que comprende un agente de Parapoxvirus ovis (PPVO) y un agente de coronavirus. En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica o un kit que comprende un agente de Parapoxvirus ovis (PPVO) para uso médico según la invención, en donde la composición farmacéutica o el kit comprende un agente PPVO y preferentemente un medicamento adicional.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Estimulación de actividad antiviral inducida por un parapoxvirus inactivado (iPPVO) contra SARS-CoV-2 que fue mejorada por enfoques combinatorios. Se estimularon cultivos de sangre completa con iPPVO /-5 pg/ml ConA. Cuando no se agregó ConA, se agregó PBS en su lugar. Como controles, se utilizaron un vehículo de iPPVO /- ConA o PBS /- ConA, respectivamente. Se ensayó ConA 5 pl/ml como coestímulo. Los cultivos se incubaron durante 3 días y se recogieron los sobrenadantes. Los sobrenadantes se transfirieron a células Vero-eGFP, que 2-4 horas después se infectaron con SARS-CoV-2 para determinar la actividad antiviral de las muestras de sobrenadante respectivas, y se las incubó durante 5 días. La fluorescencia de eGFP como una medida para células vivas se analizó utilizando el sofware ImageJ. La media del control de células al que no se le agregó virus sirvió como control positivo (Media de CC) y se fijó al 100 % (ver línea punteada superior). Las células infectadas con SARS-CoV2, pero sin tratar mostraron el mayor nivel posible de destrucción de células vivas, y sirvió de control negativo expresado como la media del control con virus (Media de VC). La actividad antiviral de las muestras se calcuó en relación al control positivo de media CC y se expresó en %.

Figura 2: iPPVO D1701 e iPPVO NZ2 estimulan la actividad antiviral contra SARS-CoV-2. Se estimularon cultivos de sangre completa con iPPVO. El vehículo de iPPVO sirvió como control negativo. iPPVO D1701 sirvió como control positivo. Los cultivos se incubaron durante 3 días y se recogieron los sobrenadantes. Los sobrenadantes se transfirieron a células Vero-eGFP, que 2-4 horas después se infectaron con SARS-CoV-2 para determinar la actividad antiviral de cada muestra de sobrenadante respectiva, y se las incubó durante 5 días. La fluorescencia de eGFP como medida de células vivas que habían sido protegidas contra SARS-CoV-2 debido a la actividad antiviral de las citoquinas en el respectivo sobrenadante se midió utilizando el software ImageJ. La actividad antiviral del control positivo se fijó en el 100 % (ver línea punteada superior). La actividad antiviral de las muestras se calculó en relación al control positivo y se expresó en %. La línea punteada inferior marca el valor del control negativo.

Descripción detallada de la invención

Antes de describir en detalle la presente invención, debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos en la presente memoria, pudiendo estos variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es para el fin de describir formas de realización particulares solo, y sin pretender limitar el ámbito de la presente invención, que estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido por cualquier experto en la materia.

Preferentemente, los términos utilizados en la presente memoria se definen según lo descrito en “A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. y Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland).

A continuación, se describirán los elementos de la presente invención. Estos elementos se enumeran con formas de realización específicas; sin embargo, se debe entender que estas pueden ser combinadas de cualquier forma y en cualquier cantidad para crear formas de realización adicionales. No se debe interpretar que los ejemplos y formas de realización preferidas diversamente descritas limitan la presente invención a solo las formas de realización explícitamente descritas. Esta descripción debe ser entendida de forma que apoya y abarca las formas de realización, que combinan las formas de realización descritas explícitamente con cualquier número de los elementos divulgados y/o preferidos. Asimismo, cualquier permutación y combinación de cualesquiera de los elementos aquí descritos deben ser considerados divulgados por la descripción de la presente solicitud, a menos que el contexto indique lo contrario.

A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera otra cosa, el término “comprender” y sus variantes, tales como “comprende” y “comprendiendo”, deben ser entendidos de modo tal que incluyen un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas especificados, pero no excluye ningún otro entero o etapa o grupo de enteros o etapas. En formas de realización preferidas, “comprender” puede significar “consistir en”. Tal como se utilizan en esta especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” incluyen sus referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un agente de Parapoxvirus ovis (PPVO) para el uso en (i) la preparación de un sujeto para una infección por coronavirus o (ii) el tratamiento de una infección por coronavirus en un sujeto.

Agente de Parapoxvirus

El parapoxvirus es Parapoxvirus ovis (PPVO). Este incluye cualquier cepa de PPVO, preferentemente cualquier cepa de la especie PPVO según la clasificación del Comité Internacional de Taxonomía de Virus (International Committee on Viruses Taxonomy o ICTV). Las cepas ejemplificativas son: NZ2, NZ7, NZ10, D1701, OV/20, OV/7, OV/C2, OV/mi-90, OV-Torino, SAo O, Bo29, orf11, la cepa Greek orf 155, y la cepa Greek orf 176. Las cepas preferidas son la NZ2 y la D1701, especialmente la NZ2.

En una forma de realización preferida, el agente PPVO es:

(a) el propio PPVO o un fragmento del mismo, o

(b) un agente que comprende la información genética que codifica (a).

En una forma de realización más preferida, es

(i) un virión de PPVO vivo,

(ii) un virión de PPVO inactivado

(iii) un fragmento de (i) o (ii),

(iv) un ácido nucleico que codifica cualquiera de (i) a (iii),

(v) un vector que comprende el ácido nucleico de (iv), o

(vi) una célula que comprende el ácido nucleico de (iv) o el vector de (v)

El virión de PPVO vivo puede estar atenuado o no. Los viriones de PPVO atenuados son conocidos en la técnica, por ejemplo, viriones sin un gen de virulencia tales como vegf-e y/o gif. El fragmento puede ser reconocido por el sistema inmunitario, y preferentemente estimula una respuesta inmunitaria (es decir, es un antígeno y preferentemente un inmunógeno) y puede ser cualquier fragmento, aunque preferentemente es un fragmento que se une a un receptor de reconocimiento de patrones humanos (PRR), por ejemplo, TLR9. En una forma de realización, el fragmento de PPVO es una proteína de PPVO.

Los fragmentos ejemplares son (secuencia codificante ejemplar (posiciones de los nucleótidos de SEQ ID NO: 3 que representan la cepa Nz2) en paréntesis antes del fragmento): (3 a 539) ORF L1, (781 a 449) ORF L2r, (1933 a 1664) ORF L3r, (3269 a 2790) ORF L4r, (2799 a 3851) ORF L5, (2962 a 3753) ORF L6, (3784 a 3122) ORF L7r, (4341 a 4129) ORF L8r, (4904 a 4428) ORF 1ar, (6517 a 4970) ORF 1r, (8042 a 6684) ORF 2r, (9989 a 8070) ORF 3r, (11195 a 10062) ORF 4r, (11493 a 11227) ORF 5r, (11802 a 12038) ORF 6, (12358 a 12080) ORF 7r, (13980 a 12364) ORF 8r, (14826 a 14053) ORF 9ar, (15080 a 15394) ORF 10, (16838 a 15423) ORF 11r, (19021 a 16847) ORF 12r, (19704 a 19156) ORF 13r, (20314 a 19736) ORF 14r, (20401 a 22101) ORF 15, (22125 a 22940) ORF 6, (23003 a 23866) ORF 17, (26908 a 23873) ORF 18r, (26926 a 27213) ORF 19, (27626 a 27216) ORF 20r, (29754 a 27616) ORF 21 r, (32217 a 29800) ORF 22r, (33380 a 32418) ORF 23r, (33602 a 33393 ORF 24r, (34466 a 33612) ORF 25r, (34735 a 34502) ORF 26r, (35905 a 34739) ORF 27r, (37194 a 35905) ORF 28r, (37200 a 39248) ORF 29; 41037 a 39229) ORF 30r, (41374 a 42066) ORF 31, (42336 a 41731) ORF 32r, (42407 a 41997) ORF 33r, (42410 a 43765) ORF 34, (43770 a 43958) ORF 35, (43980 a 44534) ORF 36, (45727 a 44537) ORF 37r, (45760 a 46557) ORF 38, (46567 a 47568) ORF 39, (47572 a 48303) ORF 40, (48352 a 48621) ORF 41, (49887 a 48634) ORF 42r, (49917 a 50793) ORF 43, (50719 a 51102) ORF 44, (51059 a 51511) ORF 44a, (51584 a 52591) ORF 45, (52509 a 53066) ORF 46, (53523 a 53023) ORF 47r, (53607 a 57473) ORF 48, (58070 a 57528) ORF 49r, (57700 a 58662) ORF 50, (59674 a 58673) ORF 51 r, (62089 a 59678) ORF 52r, (62198 a 62881) ORF 53, (62909 a 63862) ORF 55, (63858 a 64271) ORF 56, (64309 a 66831) ORF 57, (67266 a 66799) ORF 58r, (67803 a 67273) ORF 58ar, (67915 a 68607) ORF 59, (68624 a 70984) ORF 60, (70994 a 72898) ORF 61, (72938 a 73507) ORF 62, (73540 a 74211) ORF 63, (76120 a 74207) ORF 64r, (76749 a 76186) ORF 65r, (77698 a 76799) ORF 66r, (79343 a 77709) ORF 67r, (79816 a 79367) ORF 68r, (80529 a 79858) ORF 69r, (80774 a 80529 ORF 70r, (82815 a 80788) ORF 71r, (83835 a 82834) ORF 72r, (83874 a 85583) ORF 73, (85535 a 84402) ORF 74r, (88096 a 85574) ORF 75r, (87759 a 88667) ORF 76, (88920 a 88642) ORF 77r, (91652 a 88938) ORF 78r, (91667 a 92674) ORF 79, (93466 a 92681) ORF 80r, (93761 a 93486) ORF 81r, (94060 a 93788) ORF 82r, (94238 a 94080) ORF 83r, (94508 a 94242) ORF 84r, (95571 a 94498) ORF 85r, (96187 a 95600) ORF 86r, (96202 a 97665) ORF 87, (97915 a 97643) ORF 88r, (98251 a 99537) ORF 89, (99537 a 99974) ORF 90, (100001 a 101140) ORF 91, (101168 a 104650 ORF 92, (106354 a 104795) ORF 93r, (107947 a 106400) ORF 94r, (108256 a 107990) ORF 95r, (108719 a 108300) ORF 96r, (109679 a 108738) ORF 97r, (109861 a 109682) ORF 98r, (110830 a 10033) ORF 99r, (110208 a 110417) ORF 100, (110469 a 110651) ORF 100a, (110915 a 111397) ORF 101, (111419 a 111913 ORF 102, (111949 a 112485) ORF 103, (112593 a 113450) ORF 104, (113323 a 112967) ORF I05r, (113526 a 114152) ORF 106, (114199- to 115236) ORF 107, (115353 a 115787 ORF 108, (115859 o 116551) ORF 109, (116729 a 117523) ORF 110, (117572 a 117114) ORF 111r, (117423 a 118085) ORF 12, (118968 a 118375) ORF 114r, (118508 a 119119) ORF' 115, (119588 a 120202) ORF 116, (120314 a 21231) ORF 117, (121380 a 123920) ORF 118, (121288 a 122256) ORF 119, (122350 a 123924) ORF 120, (123962 a 125566) ORF 121, (125193 a 124591) ORF 122r, (125689 a 123935 ORF 123r, (123839 a 123297) ORF 123ar, (125652 a 126170) ORF 124, (126121 a 125699) ORF 125r, (126279 a 127769) ORF 126, (127851 a 128408) ORF 127, (128520 a 130076) ORF 128, (130105 a 131700) ORF 129, (131790 a 133283) ORF 130, (133246 a 133920) ORF 131, (133972 a 134370) ORF 132, (134418 a 134693) ORF 133a, (134402 a 134992) ORF R1, (134853 a 134419) ORF R2r, (135628 a 135897) ORF R3, (136780 a 137112) ORF R4, y (137558 a 137022) ORF R5r. El grupo de fragmentos incluye homólogos de los fragmentos ejemplares enumerados anteriormente, es decir fragmentos homólogos de otro PPVO (por ejemplo, especies o cepas como las antes descritas). También incluye variantes funcionales de los fragmentos ejemplares enumerados anteriormente (la función es como se define para los fragmentos en general anteriormente). Por lo tanto, el grupo de fragmentos incluye variantes con una identidad de secuencia de al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o preferentemente el 99% respecto a aquellos fragmentos codificados por las secuencias codificantes ejemplares de SEQ ID NO: 3 que se enumeran anteriormente.

El virión de PPVO inactivado puede ser obtenido mediante cualquier método adecuado para la inactivación de los virus envueltos conocido en la técnica, por ejemplo, por inactivación física (por ejemplo por la exposición al calor, específicamente pasteurización, o la luz UV) o por inactivación química (por ejemplo por la exposición a pH bajo, a un detergente o a un agente de inactivación como etilenimina, etilenimina binaria, formaldehído, glutaraldehído, 2,2'-ditiodipiridina o beta-propiolactona). En una forma de realización preferida, el virión de PPVO inactivado es un virión inactivado con etilenimina o etilenimina binaria, preferentemente un virión inactivado con etilenimina binaria.

El agente de PPVO puede comprender información genética (ADN o ARN) que codifica un antígeno heterólogo (es decir, no de parapoxvirus) y/o un inmunomodulador, o alternativamente puede no comprender información genética que codifica un antígeno heterólogo y/o un inmunomodulador. En una forma de realización, no comprende información genética que codifica un antígeno heterólogo, pero opcionalmente comprende información genética que codifica un inmunomodulador.

En una forma de realización preferida, el agente de PPVO es un PPVO de tipo salvaje. Preferentemente es un virión de PPVO, y más preferentemente un virión de PPVO inactivado (iPPVO).

Modos de uso

El agente de PPVO puede usarse solo o en combinación con una pauta de tratamiento adicional para (i) la preparación de un sujeto para una infección por coronavirus o (ii) el tratamiento de una infección por coronavirus en un sujeto.

En una forma de realización preferida, tanto la preparación como el tratamiento, la pauta de tratamiento adicional puede comprender la administración de un agente de coronavirus.

Específicamente para la preparación, la pauta de tratamiento adicional puede comprender la administración de un agente inmunoestimulador adicional (tal como un adyuvante, un agonista de TLR, un PRR, por ejemplo, un PRR citosólico tal como los receptores tipo RIG-I incluyendo RIG-I, MDA5 y LGP2, o un mitógeno, en particular un mitógeno o activador de células T como fitohemaglutinina (PHA), concanavalina (Con) A, aglutinina de germen de trigo (WGA), un mitógeno de hierba carmín (PWM), una lectina o un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo) o un mitógeno o activador de células B tal como PWM, un lipopolisacárido (LPS), un anticuerpo anti-CD40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-(receptor de antígeno de células B) o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El agente inmunoestimulador preferentemente fomenta un estado antiviral en las células. Específicamente para el tratamiento, la pauta de tratamiento puede comprender la administración de uno o más medicamentos adicionales y/o una o más terapias adicionales (tratamientos sin medicamentos/fármacos) adecuado/as para el tratamiento de un sujeto infectado con coronavirus, o que padece una enfermedad causada por coronavirus. Preferentemente, el uno o más medicamentos adicionales se seleccionan del grupo que consiste en un agente inmunoestimulador adicional (como se ejemplifica arriba), un antiviral, un antibiótico, un adyuvante, un glucocorticoide, un fármaco antihipertensivo (por ejemplo, un inhibidor de la ECA), un fármaco hipoglucemico, un fármaco antichoque, y un fármaco adecuado para el tratamiento de uno o más síntomas de la enfermedad por coronavirus y/o para acompañar la una o más terapias adicionales (por ejemplo, un analgésico, un sedante, un medicamento contra la fiebre, un medicamento antiinflamatorio como IL-10, un medicamento para la tos o un inmunosupresor). Preferentemente, la una o más terapias adicioanles se seleccionan del grupo que consiste en oxigenoterapia y soporte extracorpóreo de órganos (ECOS). La oxigenoterapia puede ser pasiva (es decir, dependiente de la respiración del sujeto) o activa (es decir, administrando oxígeno a los pulmones sin depender de la respiración del sujeto). Las terapias pasivas son oxigenoterapia no presurizada y oxigenoterapia presurizada. Las terapias activas son ventilación mecánica y oxigenación por membrana extracorpórea (ECMO, también una forma específica de ECOS). Los ejemplos de ECOS incluyen ECMO, terapia de reemplazo renal continua (CRRT), hemofiltración (HF) y hemoperfusión (HP), por ejemplo, para eliminar las citoquinas inflamatorias y asistencia al ventrículo izquierdo.

Los ejemplos específicos de medicamentos adicionales para la preparación y tratamiento son: Ivermectina, inhibidores de TMPRSS2 (por ejemplo, cloruro de amonio, mesilato de camostat inhibidor de serina proteasa) opcionalmente junto con un inhibidor de CatB/L (por ejemplo, E-64d), Favipiravir, Pimodivir, Baloxavir opcionalmente junto con Marboxil, bloqueantes de IL-6 (por ejemplo, sarilumab, tocilizumab), Sarilumab, Zitivekumab, lopinavir opcionalmente junto con ritonavir, cloroquina, hidroxicloroquina, Remdesivir, a-cetoamidas (por ejemplo ciclopentilmetilo, ciclohexilmetilo o acetoamida 13b), Talidomida, Maraviroc, Tenofovir opcionalmente junto con Disoproxil, Dolutegravir, Nelfinavir, Raltegravir, Tipranavir e Interferones de tipo I (IFN-I, específicamente FN-p1). Los ejemplos preferidos son Remdesivir y Talidomida.

El agente de PPVO se puede administrar por cualquier vía, incluidas, pero sin limitarse a, la vía intravenosa, intramuscular, oral, parenteral, tópica, intradérmica o subcutánea. En una forma de realización específica, se puede administrar directamente a las vías respiratorias, preferentemente a las vías respiratorias inferiores, más preferentemente a los pulmones (administración pulmonar). Como tal, se lo puede administrar como un aerosol y/o mediante inhalación.

La dosis del agente de PPVO (o de cualquiera de los agentes descritos en el presente documento, incluyendo un agente inmunoestimulador adicional, un medicamento y un agente de coronavirus adicional) es una dosis farmacéuticamente efectiva determinada por un experto en la materia. Por ejemplo, en el caso de que el agente sea un virión (vivo o inactivado), puede estar entre 106 a 1010 partículas. La dosis se puede administrar una vez o más de una vez, por ejemplo, durante un período de < 12 semanas, < 6 semanas, < 4 semanas, < 2 semanas, o < 1 semana.

Coronavirus

El coronavirus es, en una forma de realización preferida, un alfa-coronavirus o un beta-coronavirus. Más preferentemente, es un coronavirus respiratorio, es decir, un coronavirus causante de una enfermedad respiratoria.

HCoV-229E y CoV-NL63 son ejemplos de alfa-coronavirus y SARS-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-HKU1, y HCoV-OC43 son ejemplos de beta-coronavirus. Se prefiere que el coronavirus sea un coronavirus de SARS o MERS, en donde preferentemente el coronavirus del SARS es de la especie “coronavirus relacionado con el síndrome respiratorio agudo grave" clasificado por el Comité Internacional de Taxonomía de Virus (International Committee on Viruses Taxonomy o ICTV). En la forma de realización más preferida, es SARS-CoV-2.

El experto en la materia sabe que los coronavirus mutan, y que nuevas cepas de SARS-CoV-2 son aisladas diariamente; a 6 de abril de 2020, se han aislado 462 cepas. En consecuencia, en términos de la definición de secuencia, un virus preferido de la invención tiene un genoma que comprende o consiste en una secuencia según SEQ ID NO: 1 (cepa original del brote del año 2019 del “ aislado Wuhan-Hu-1 de coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave de tipo 2”, secuencia de referencia NCBI NC_045512.2, versión del 30 de marzo, 2020) o una variante del mismo con una identidad de secuencia de al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o preferentemente al menos el 99%. Alternativamente o además, un virus preferido de la invención tiene un genoma que comprende o consiste en una secuencia según SEQ ID NO: 2 (una secuencia de consenso de SARS-CoV-2 de 153 estructuras de genoma) o una variante del mismo con una identidad de secuencia al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o preferentemente al menos el 99%. Se prefiere que la variante esté clasificada como cepa SARS-CoV-2 según el Comité Internacional de Taxonomía de Virus (International Committee on Viruses Taxonomy o ICTV).

Agente de coronavirus

Un agente de coronavirus es generalmente un agente adecuado para el tratamiento de una infección por coronavirus. Puede ser (a) el coronavirus mismo o un fragmento del mismo que es reconocido por el sistema inmunológico y preferentemente estimula una respuesta inmunitaria (es decir, un antígeno y preferentemente un inmunógeno), (b) un agente que comprende información genética que codifica (a), o (c) un agente que interfiere con la infección por coronavirus de una célula o con la replicación del coronavirus dentro de una célula (en un ámbito terapéutico: al ser administrado en una cantidad eficaz a un sujeto infectado con coronavirus, es capaz de interferir con una infección por coronavirus de una célula o con la replicación del coronavirus dentro de una célula). El agente de coronavirus preferentemente se selecciona de un grupo que consiste en

(i) un coronavirus inactivado,

(ii) un fragmento antigénico, preferentemente inmunogénico, de coronavirus (es decir la proteína de la espícula o un fragmento de la misma),

(iii) un ácido nucleico que codifica (i) o (ii),

(iv) un vector que comprende el ácido nucleico de (iii),

(v) una célula que comprende el ácido nucleico de (iii) o el vector de (iv),

(vi) un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un coronavirus o un fragmento del mismo, preferentemente la envuelta,

(vii) un análogo de nucleótido/nucleósido, preferentemente específico para coronavirus,

(viii) una molécula de ARNi específica para coronavirus,

(ix) una molécula pequeña, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a un sitio de interacción proteína-proteína (PPI) entre una proteína de coronavirus y una proteína del sujeto, y

(x) plasma sanguíneo de un sujeto que se ha recuperado de una infección por coronavirus, preferentemente de una enfermedad por coronavirus.

Un coronavirus puede inactivarse como se describe anteriormente para PPVO.

El PPI de (ix) es preferentemente una interacción entre una proteína de SARS-CoV-2 o un homólogo de la misma de otro coronavirus y una proteína del sujeto (ID de proteína de Uniprot de cada proteína objeto es <nombre enumerado a continuacion>_HUMANO) se selecciona de entre:

- SARS-CoV2 E y AP3B1, BRD4, BRD2, CWC27, ZCH18 o CTL2;

- SARS-CoV2 M y MPPB, YIF1A, AT1B1, ACADM, ETFA, STOM, VKGC, VATA, PSMD8, REEP5, MPPA, ANO6, PREP, ZNT9, FAKD5, ZNT7, GCP3, COQ8B, SAAL1, REEP6, INT4, ODC, GCP2, SYTM, RTN4, FA8A1, AASS, AKP8L, AAR2 o BZW2

- SARS-CoV2 N y U3IP2, PABP1, CSK22, CSK2B, G3BP1, PABP4, LARP1, FA98A, SNIP1, RENT1, MOV10, G3BP2, DDX21, RBM28 o RL36;

- SARS-CoV2 Espícula y ACE2, GOGA7 o ZDHC5;

- SARS-CoV2 nsp1 y DPOLA, PRI1, PRI2, DPOA2, GT251 o PKP2;

- SARS-CoV2 nsp10 y AP2A2, ALR, ERGI1, AP2M1 o GRPE1;

- SARS-CoV2 nsp11 y TBCA;

- SARS-CoV2 nsp12 y SBNO1, BCKD, AKAP8, MYCB2, SLU7, RIPK1, UBP2L, TYSD1, PDZ11, PRC2B, UBAP2, ZN318, CRTC3, UBP54, Z3H7A, LAR4B, RBM41, HTF4, PPIL3 o PKHA5;

- SARS-CoV2 nsp13 y TBKB1, CTRO, HSBP1, PCNT, FR1OP, KAP2, KAPCA, KAP3, RADI, CENPF, TLE1, TLE3, TLE5, GOGA3, GOGA2, GOGB1, GRAP1, CE350, MYOME, CP135, CEP68, CNTRL, RB6I2, GCC2, CLIP4, NIN, CE112, MIPO1, UBP13, GCC1, JKIP1, CK5P2, AKAP9, GORS1, FYCO1, CA050, CP250, TBK1, HOOK1 o NINL; - SARS-CoV2 nsp14 y AGAL, IMDH2 o SIR5;

- SARS-CoV2 nsp15 NTF2, ARF6 o RNF41;

- SARS-CoV2 nsp2 y S27A2, IF4E2, NCPR, GDS1, WASC4, FKB15 o GGYF2;

- SARS-CoV2 nsp4 y IDE, TIM10, ALG11, PO210, TIM29, DJC11, T10B o TIM9;

- SARS-CoV2 nsp5 y HDAC2;

- SARS-CoV2 nsp5_C145A y GPX1 o TRM1;

- SARS-CoV2 nsp6 y ATP5L, VAS1, SGMR1 o AT133;

- SARS-CoV2 nsp7 y ADAS, CYB5B, ACSL3, NB5R3, RALA, COMT, RAB5C, RAB7A, RAB8A, RAB2A, RAB10, RAB14, RHOA, RAB1A, GBB1, GBG5, LMAN2, MOGS, TOIP1, MARC1, QSOX2, HS2ST, NDUF2, SCPDL, SCRB1, NAT14, DCAKD, F162A, TIM14, SELS, PGES2 o RAB18;

- SARS-CoV2 nsp8 y MPP10, SRP72, ATE1, NSD2, SRP19, SRP54, RT25, DDX10, LARP7, MEPCE, NGDN, EXOS8, SYNM, NOL10, CCD86, SPCS, EXOS5, EXOS3, AATF, HECD1, RT02, RT05, EXOS2 o RT27;

- SARS-CoV2 nsp9 y T2FB, FBN1, FBN2, NU214, NUP62, DCAF7, IF4H, NUP54, MIB1, NEK9, ZN503, NUP88, NUP58, MAT2B o FBLN5;

- SARS-CoV2 orf10 y PPT1, CUL2, MA7D1, THTPA, ZY11B, TIM8B, RBX1, ELOC o ELOB;

- SARS-CoV2 orf3a y HMOX1, TRI59, AR6P6, VPS39, CLCC1, VPS11, SUN2 o ALG5;

- SARS-CoV2 orf3b y STML2;

- SARS-CoV2 orf6 y NUP98, RAE1L o MTCH1;

- SARS-CoV2 orf7a y HEAT3 o MDN1;

- SARS-CoV2 orf8 y PLOD2, TOR1A, STC2, TPA, ITB1, CISD3, CO6A1, PVR, DNMT1, LYOX, PCSK6, INHBE, NPC2, MFGM, OS9, NPTX1, PLGT2, PLGT3, ERO1B, PLD3, FXRD2, CHSS2, PUSL1, EMC1, GGH, ERLEC, I17RA, NGLY1, H6ST2, SDF2, NEUR1, GDF15, TM2D3, ERP44, EDEM3, SIL1, OFUT1, SMOC1, PKHF2, FXL12, UGGG2, CHPF2, ATS1, HYOU1, FKBP7, ADAM9 o FKB10;

- SARS-CoV2 orf9b y NHRF1, CHM2A, CSDE1, TOM70, MARK3, MARK2, DPH5, DCTP1, MARK1, PTBP2 o BAG5; y

- SARS-CoV2 orf9c y UBXN8, GPAA1, WFS1, MRP1, PAR2, SCAP, D19L1, SGMR2, ZNT6, TAPT1, ERMP1, NLRX1, RETR3, PIGO, FACR2, ECSIT, ALG8, TM39B, GHITM, ACAD9, NFIP2, BCS1, CIA30, TMED5, NDUB9 o PIGS.

Se puede generar un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo unido a un sitio PPI mediante métodos de rutina. Por ejemplo, se pueden generar anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos a una de las proteínas que interaccionan y analizar su interferencia con la interacción.

La molécula pequeña de (ix) preferentemente se selecciona de un grupo que consiste en Loratadina, daunorrubicina, midostaurina, ponatinib, silmitasertib, ácido valproico, haloperidol, metformina, migalastat, S-verapamilo, indometacina, ruxolitinib, ácido micofenólico, entacapona, ribavirina, E-52862, Merimepodib, RVX-208, XL413, AC-55541, Apicidina, AZ3451, AZ8838, Bafilomicina A1, CCT 365623, GB110, H-89, JQ1, PB28, PD-144418, RS-PPCC, TMCB, UCPH-101, ZINC1775962367, ZINC4326719, ZINC4511851, ZINC95559591, 4E2RCat, ABBV-744, Camostat, Captopril, CB5083, Cloranfenicol, Cloroquina, Compuesto 10 inhibidor de PI4K-IIIp (Rutaganira, FU et al., J. Med. Chem. 59, 1830-1839 (2016)), Compuesto 2 inhibidor de ciclofilina (Mackman, RL et al., J. Med. Chem. 61, 9473-9499 (2018)), CPI-0610, Dabrafenib, DBeQ, dBET6, IHVR-19029, Linezolid, Lisinopril, Minoxidil, ML240, MZ1, Nafamostat, Pevonedistat, PS3061, Rapamicina (Sirolimus), Sanglifehrin A, Sapanisertib (INK128 / MlN128), FK-506 (Tacrolimus), Ternatin 4 (DA3), Tigeciclina, Tomivosertib (eFT-508), Verdinexor, WDB002, Azacitidina, Selinexor, y Zotatifin (eFT226).

Infección/enfermedad por coronavirus

Una infección por coronavirus se define por la entrada de un coronavirus en al menos una célula del sujeto, y su replicación en al menos una célula. Preferentemente, la infección es una infección de las vías respiratorias, incluyendo las vías respiratorias superiores (nariz y conductos nasales, senos paranasales, faringe y la parte de la laringe por encima de las cuerdas vocales) y las vías respiratorias inferiores (parte de la laringe debajo de las cuerdas vocales, la tráquea, los bronquios, los bronquiolos y los pulmones, incluyendo los bronquiolos respiratorios, los conductos alveolares, los sacos alveolares y los alvéolos). Más preferentemente, es una infección de las vías respiratorias inferiores, lo más preferentemente de los pulmones (incluyendo uno o más de bronquiolos respiratorios, conductos alveolares, sacos alveolares y alvéolos). La infección además puede caracterizarse inmunológicamente por la presencia de al menos un factor inmunológico específico para el antígeno de coronavirus, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en células B, células T auxiliares foliculares (células T^fh), células T CD4+ activadas y células T CD8+ (particularmente también CD38+HLA-DR+), anticuerpos IgM, y anticuerpos IgG. Alternativamente o además, puede caracterizarse inmunológicamente por un perfil de citoquinas específico para coronavirus, preferentemente en sangre o en el sitio de la infección como se especificó anteriormente (lo más preferiblemente en los pulmones). Estos perfiles pueden ser determinados por un experto en la materia sin mayor dificultad, por ejemplo, tomando una muestra de tejido, por ejemplo, del pulmón, infectándola con el coronavirus y determinando la expresión de citoquinas. Los ejemplos de perfiles de citoquinas específicos para coronavirus son: (a) para SARS-CoV: aumento de uno o más, y preferentemente de todos de IFN-I (por ejemplo. IFN-p), IFN-II (IFN-y), IFN-III (IFN-A1, IFN-A2, y IFN-A3), IL-1beta, IL-6, IL-12, IL-8, MCP-1, MIP-1alfa, RANTES, CXCL1, CXCL2, CXCL5, y CXCL9, y preferentemente sin aumento de CXCL10; y (b) para SARS-CoV-2: aumento de uno o más, y preferentemente de todos de IL-6, MCP-1, CXCL1, CXCL5, y/o CXLC10, y preferentemente sin aumento de alguno de IFN y/o de alguno o todos de IL-1beta, IL-12, IL-8, MIP-1alfa, RANTES, CXCL2, y CXCL9.

El sujeto preferido es humano. Aunque conforme al conocimiento de los inventores el coronavirus infecta a todos los humanos por igual, existen factores de riesgo para contraer una infección por coronavirus:

(i) Presencia reciente o viajar (dentro del período de incubación, es decir, en los últimos 27, 24, o 19 días, preferentemente 14 (CDC, NHC) o 10 (OMS) días) a una zona con una propagación en curso de la infección por coronavirus. Preferentemente la zona es un “área afectada” determinada por la OMS. “Reciente” puede significar dentro del período de incubación del coronavirus, preferentemente en los últimos 27, 24 o preferentemente 19 días, más preferentemente 14 días o más preferentemente 10 días.

(ii) Contacto con una persona infectada con coronavirus, en particular una persona que presenta uno o más síntomas de la enfermedad por coronavirus. “Contacto” puede significar exposición a las gotitas respiratorias de la persona (por ejemplo, dentro del rango de difusión de las gotitas respiratorias en el aire, o en contacto con superficies tocadas por la persona o por las gotitas respiratorias).

(iii) Ejercer una profesión de riesgo elevado, que habitualmente requiera contacto con el público general (contacto se define como anteriormente) de forma regular (por ejemplo, al menos diariamente o al menos semanalmente), por ejemplo, ser un profesional de la salud, particularmente de un hospital, ser un cuidador (por ejemplo, para niños o ancianos) o trabajador minorista (por ejemplo, en un supermercado o farmacia).

Una infección por coronavirus puede causar o no síntomas de la enfermedad por coronavirus en un sujeto. Los términos “infección por coronavirus” y “enfermedad por coronavirus” se distinguen en la presente memoria por la presencia de al menos un síntoma de la enfermedad por coronavirus. Cuando la infección no está acompañada por al menos un síntoma de la enfermedad por coronavirus, esta (o el sujeto) es asintomática (incluye preasintomática). El término “enfermedad por coronavirus” como se usa en la presente memoria requiere la presencia de una infección por coronavirus y al menos un síntoma de la enfermedad por coronavirus (también denominada en la presente memoria como “infección sintomática”).

Los síntomas de coronavirus incluyen tos seca, fiebre (>37,8 °C), rinitis y/o congestión nasal, fatiga, dificultad para respirar, neumonía, fallo orgánico (por ejemplo, cardíaco, pulmonar, hepático y/o renal), picazón en la garganta, dolor de cabeza, dolor en las articulaciones, nausea, diarrea, temblores, linfopenia, pérdida del olfato y/o pérdida del gusto. Preferentemente, la enfermedad por coronavirus se caracteriza por la presencia de dos o más, tres o más, cuatro o más síntomas, preferentemente incluyendo uno o dos más de tos seca, fiebre (>37,8 °C), dificultad para respirar, pérdida del olfato y/o pérdida del gusto.

La enfermedad por coronavirus es preferentemente una enfermedad respiratoria (por ejemplo, SARS o MERS), más preferentemente Covid-19. La enfermedad por coronavirus puede tomar un curso leve (no grave) o grave. Un curso leve se caracteriza por la presencia de uno o más síntomas leves (es decir no de síntomas graves) de la enfermedad por coronavirus. Los síntomas leves se seleccionan del grupo que consiste en tos seca, fiebre leve (>37,8 °C a <40 °C), rinitis y/o congestión nasal, fatiga, picazón en la garganta, dolor de cabeza, dolor en las articulaciones, nausea, diarrea, temblores, linfopenia, pérdida del olfato y pérdida del gusto. Los síntomas graves se seleccionan del grupo que consiste en dificultad para respirar, en particular síndrome de dificultad respiratoria aguda, neumonía, fallo orgánico (por ejemplo, cardíaco, pulmonar, hepático y/o renal), y fiebre alta (>40 °C). Un curso grave se caracteriza clínicamente por uno o más de (i) la presencia de uno o más síntomas graves de la enfermedad por coronavirus, (ii) necesidad de hospitalización, en particular necesidad de admisión en una unidad de cuidados intensivos (UCI) y/o necesidad de terapia de oxigeno (como se la definió anteriormente), en particular para un respirador (también denominado ventilador), y/o (iii) la muerte del sujeto. La necesidad de hospitalización se caracteriza por uno o más de: evidencia clínica o radiológica de neumonía, síndrome de dificultad respiratoria aguda, y/o la presencia de dos o más síntomas incluyendo al menos fiebre y tos persistente (con o sin esputo), en particular tos persistente (por ejemplo, de al menos 3 días). La necesidad de admisión en UCI se caracteriza por neumonía grave y/o una o más complicaciones graves. La neumonía grave se caracteriza por taquipnea (edad menor a 2 meses: 60 o más respiraciones por minuto; edad de 2 a 11 meses: 50 o más respiraciones por minuto, edad de 1 a 5 años: 40 o más respiraciones por minuto, edad > 5 años: 30 o más respiraciones por minuto), dificultad respiratoria y/u oxigenación inadecuada (por ejemplo, SpO² del 93% o menos en adultos, y del 90% o menos en niños). Complicaciones graves son complicaciones que son letales si no son tratadas e incluyen, por ejemplo, choque séptico, síndrome de dificultad respiratoria aguda y fallo orgánico. Alternativamente o además, un curso grave se puede caracterizar inmunológicamente, por ejemplo, por la presencia o el desarrollo de una tormenta de citoquinas, en particular en los pulmones. Una tormenta de citoquinas por coronavirus se caracteriza por hiperinflamación, preferentemente por un aumento (frente a un sujeto infectado pero asintomático, preferentemente tal como sucede después del período de incubación, o el promedio o la media de una pluralidad de tales sujetos) de uno o más de IL-2, IL-7, TNF-alfa, MIP-1alfa, MCP-1, G-CSF y/o CXCL10, en donde el incremento se puede caracterizar como excesivo y/o incontrolado. En particular, una tormenta de citoquinas es una tormenta de citoquinas de Covid-19. Asimismo, una tormenta de citoquinas se da preferentemente en las vías respiratorias como se definió anteriormente para la infección (incluyendo las partes preferidas de las mismas).

Aunque la enfermedad por coronavirus puede tomar un curso grave en cualquier sujeto sin importar su edad o afecciones preexistentes, existen sin embargo factores de riesgo de tener un curso grave de la enfermedad por coronavirus, incluyendo:

(i) edad, por ejemplo, al menos 40, 50, 60, 70, o 80 años, aumentando el riesgo con la edad,

(ii) género masculino

(iii) fumar, y

(iv) padecer una o más comorbilidades, preferentemente seleccionadas del grupo que consiste en enfermedades cardiovasculares, diabetes, enfermedades respiratorias (en particular crónicas), hipertensión, SIDA, cáncer, enfermedades hepáticas, enfermedades renales y enfermedades pulmonares. Una comorbilidad particular como riesgo es una enfermedad respiratoria.

Preparación de un sujeto

La preparación de un sujeto quiere decir preparar un sujeto para una infección por coronavirus, que se aborda mediante la inmunomodulación resultante en el uso médico de la invención. También se puede llamar “tratamiento preparatorio”, “tratamiento profiláctico” o, respecto a la enfermedad resultante de la invención, “tratamiento preventivo” o “tratamiento de prevención”. No tiene necesariamente el propósito de prevenir una infección por coronavirus. Como tal, el sujeto todavía no ha sido infectado por coronavirus.

En consecuencia, la preparación puede tener uno o más efectos inmunológicos o (preferentemente y) puede tener uno o más efectos clínicos, ambos una vez que el sujeto es infectado. Estos efectos inmunológicos preferentemente se seleccionan del grupo que consiste en

(I-i) incremento del número de uno o más de los factores inmunológicos específicos para el antígeno de coronavirus (como se definió anteriormente) en el sujeto o en una parte del sujeto,

(I-ii) inhibir (es decir, reducir o parar) la replicación del coronavirus en el sujeto o en una parte del sujeto,

(I-iii) reducción de la carga de coronavirus en el sujeto o en una parte del sujeto, y

(I-iv) prevención o alivio de perfil de citoquinas o una tormenta de citoquinas (tal como se definió anteriormente) específica para coronavirus en el sujeto o en una parte del sujeto.

En este caso, la parte del sujeto es preferentemente las vías respiratorias (superiores o preferentemente las inferiores, más preferentemente los pulmones). Se prefiere (I-ii) sobre (I-i), y (I-iii) sobre (I-ii). Además, (I-ii) puede implicar (I-i), y (I-iii) puede implicar (I-i) y/o (I-ii). (I-iv) es generalmente deseado.

Los efectos clínicos son preferentemente seleccionados del grupo que consiste en

(C-i) reducción de la contagiosidad,

(C-ii) retraso del comienzo de la enfermedad por coronavirus,

(C-iii) reducción del grado de uno o más síntomas futuros de la enfermedad por coronavirus, preferentemente de uno o más síntomas futuros graves de la enfermedad por coronavirus,

(C-iv) prevención de uno o más síntomas de la enfermedad por coronavirus, preferentemente uno o más síntomas graves de la enfermedad por coronavirus,

(C-v) prevención de un curso grave de enfermedad por coronavirus, y

(C-vi) prevención de la enfermedad por coronavirus.

En ese caso, se prefiere (C-ii) sobre (C-i), (C-iii) sobre (C-ii), (C-iv) sobre (C-iii), (C-v) sobre (C-iv), y (C-vi) sobre (C-v).

Síntomas futuros son síntomas que aún no están presentes, pero pueden aparecer o aparecerán. En consecuencia, la reducción del grado de los síntomas futuros se refiere al tratamiento profiláctico de los síntomas.

Según esto, el agente de PPVO puede ser para el uso en uno o más de (I-i) a (I-iv) y/o uno o más de (C-i) a (C-vi) en un sujeto todavía no infectado por coronavirus. En otras palabras, al ser administrado en una cantidad eficaz, el agente de PPVO es capaz de lograr uno o más de (I-i) a (I-iv) y/o uno o más de (C-i) a (C-vi).

En una forma de realización preferida, el sujeto que se va a preparar se caracteriza por uno o más factores de riesgo para contraer una infección por coronavirus y/o por uno o más factores de riesgo para tener un curso grave de enfermedad por coronavirus.

En otra forma de realización, el sujeto que se va a preparar se selecciona por un método según el correspondiente aspecto adicional de la invención descrito a continuación.

Tratamiento de un sujeto

El tratamiento de una infección por coronavirus (es decir, de un sujeto infectado) no necesariamente tiene el propósito de tratar o prevenir una enfermedad por coronavirus, aunque se prefiere que lo haga. Como tal, el tratamiento puede ser de una infección asintomática (es decir, de un sujeto infectado que no presenta síntomas) o de una enfermedad por coronavirus (es decir, de un sujeto infectado que presenta uno o más síntomas).

El tratamiento puede tener uno o más efectos inmunológicos o (preferentemente y) puede tener uno o más efectos clínicos. Estos efectos inmunológicos son preferentemente como los definidos anteriormente para la preparación, ya sea para una infección asintomática o para la enfermedad. Los efectos clínicos para una infección asintomática preferentemente se seleccionadn del grupo que consiste en (C-i) a (C-vi) como fueron definidos anteriormente para la preparación. Los efectos clínicos para una infección sintomática (es decir, una enfermedad por coronavirus) preferentemente se seleccionan del grupo que consiste en

(C-i), (C-vi), ambos como se definieron anteriormente para la preparación,

(C-vii) el alivio de uno o más (o idealmente todos los) síntomas de la enfermedad por coronavirus,

(C-viii) prevención, uno o más (o idealmente todos los) síntomas adicionales de la enfermedad por coronavirus, y (C-ix) el alivio de, y preferentemente la prevención, de un curso grave de la enfermedad por coronavirus.

En ese caso, “síntomas adicionales” son aquellos que todavía no caracterizan la infección sintomática.

Según esto, el agente de PPVO se puede utilizar en uno o más de (I-i) a (I-iv) y/o uno o más de (C-i) a (C-ix) en un sujeto infectado por coronavirus. En otras palabras, al ser administrado en una dosis eficaz, el agente de PPVO es capaz de lograr uno o más de (I-i) a (I-iv) y/o uno o más de (C-i) a (C-ix). En una forma de realización preferida, el agente de PPVO es para uso en la prevención o tratamiento de la enfermedad por coronavirus.

Como se indicó anteriormente, el sujeto que se va a tratar puede ser asintomático. Alternativamente, el sujeto que se va a tratar puede padecer una enfermedad por coronavirus. El sujeto que padece una enfermedad por coronavirus puede no presentar síntomas graves, por ejemplo, puede presentar únicamente uno o más síntomas leves. En otra forma de realización, puede padecer un curso grave de la enfermedad por coronavirus (a excepción de (iii), muerte; preferentemente (i) uno o más síntomas graves). En una forma de realización preferida, el sujeto que se va a tratar (por ejemplo, cualquiera de los sujetos mencionados anteriormente, excepto aquellos que ya padecen un curso grave de la enfermedad por coronavirus) se caracteriza por uno o más factores de riesgo para padecer un curso grave de la enfermedad por coronavirus.

En otra forma de realización preferida, el sujeto se caracteriza por al menos una de:

(i) no presentar una tormenta de citoquinas en los pulmones, y preferentemente ninguna tormenta de citoquinas, (ii) edad hasta 75, 70 o preferentemente 65 años, o más preferentemente de 18 a 65 años de edad, y/o

(iii) HScore de 169 o menor, preferentemente 150 o menor, 130 o menor, o 110 o menor,

Preferentemente, el sujeto se caracteriza por (ii) y/o (iii), (ii) y HScore de 169 o menor, o (iii) y edad de 18 a 65 años.

HScore genera una probabilidad para la presencia de una linfohistoicitosis hemofagocítica secundaria (sHLH), un síndrome hiperinflamatorio con un perfil de tormenta de citoquinas similar al de la enfermedad por coronavirus (Pehta et al., The Lancet Vol 39528 de marzo, 2020). Un HScore mayor de 169 es 93% sensible y 86% específico para sHLH. HScore se calcula utilizando los siguientes criterios: temperatura (<38,4 °C: 0 puntos, 38,4-39,4 °C: 33 puntos, >39,4 °C: 49 puntos), organomegalia (no: 0 puntos, hepatomegalia o esplenomegalia: 23 puntos, hepatomegalia y esplenomegalia: 38 puntos), número of citopenias* (un linaje; 0 puntos, dos linajes: 24 puntos, tres linajes: 34 puntos), triglicéridos (<1,5 mmol/l: 0 puntos, 1,5-4,0 mmol/l: 44 puntos, >4,0 mmol/l: 64 puntos), fibrinógeno (>2,5 g/l: 0 puntos, <2,5 g/l: 30 puntos), ferritina (<2000 ng/ml: 0 puntos, 2000-60000 ng/ml: 35 puntos, >6000 ng/ml: 50 puntos), aspartato aminotransferasa en suero (<30 IU/l: 0 puntos, >30 lU/l: 19 puntos), hemofagocitosis en aspirado de médula ósea (no: 0 puntos, sí: 35 puntos), e inmunosupresión conocida! (no: 0 puntos, yes: 18 puntos). *Definida ya sea como concentración de hemoglobina de 9,2 g/dl o inferior (<5,71 mmol/l), un conteo de glóbulos blancos en sangre de 5000 glóbulos blancos en sangre por mm3 o inferior, o conteo de plaquetas de 110000 plaquetas por mm3 o inferior, o todos estos criterios a la vez. fpositivo para VIH o que recibe terapia inmunosupresora a largo plazo (por ejemplo, uno o más de glucocorticoides, ciclosporina y/o azatioprina).

En otra forma de realización, el sujeto que se va a tratar se selecciona por un método según el correspondiente aspecto adicional de la invención descrito a continuación.

Uso médico adicional

En un aspecto de usos médicos adicionales, la invención se refiere a un agente de PPVO para su uso como medicamento que fomenta un estado antiviral (preferentemente anticoronaviral) en las células de un sujeto (i) que padece una infección por coronavirus o (ii) caracterizado por uno o más factores de riesgo de contraer una infección por coronavirus y/o por uno o más factores de riesgo de padecer un curso grave de la enfermedad por coronavirus.

En una forma de realización, el uno o más factores de riesgo para contraer una infección por coronavirus se seleccionan de (i) y (ii) como se definió anteriormente.

En otra forma de realización, el o más factores de riesgo de tener un curso grave de enfermedad por coronavirus comprenden al menos (ii) y (iii), o (ii) y (iv) como se definió anteriormente, o comprende al menos una comorbilidad seleccionada de enfermedad respiratoria (en particular crónica) y enfermedad pulmonar. Además, el sujeto tiene preferentemente al menos 60, al menos 70, o más preferentemente al menos 80 años de edad.

La frase “fomentar un estado antiviral en las células” se refiere al fomento de la transcripción de genes celulares antivirales que codifican las proteínas de defensa del huésped, por ejemplo fomentado por IFN-a y/o p. Preferentemente inhibe (es decir, previene o al menos reduce) la replicación del virus en la célula y/o induce apoptosis (para prevenir la replicación adicional del virus en la célula), y más preferentemente reduce la cantidad de viriones infecciosos liberados por una célula infectada en comparación a una célula en la que el estado antiviral no haya sido fomentado por el medicamento. De este modo, evita o al menos reduce la propagación del virus. “Fomentar” incluye una inducción (por ejemplo, para las células que aún no están en estado antiviral) y un refuerzo (es decir, un potenciamiento) (por ejemplo, para las células ya en estado antiviral). Aunque sin limitarse a ello, el primer caso se prefiere para un sujeto que (todavía) no presenta una infección por coronavirus, por ejemplo, caracterizado por uno o más factores de riesgo como los especificados anteriormente y el segundo caso se prefiere para un sujeto que padece una infección por coronavirus.

Métodos de tratamiento

Además se divulgan los siguiente métodos, que se deben interpretar como referencias a los agentes y composiciones de la invención para uso en un método de preparar un sujeto para infección o tratar una infección:

Un método de administración de un agente de PPVO a un sujeto (i) que presenta una infección por coronavirus o (ii) caracterizado por uno o más factores de riesgo de contraer una infección por coronavirus y/o por uno o más factores de riesgo para padecer un curso grave de la enfermedad por coronavirus.

Un método de fomentar un estado antiviral (preferentemente anticoronaviral) en las células en un sujeto (i) que presenta una infección por coronavirus o (ii) caracterizado por uno o más factores de riesgo para contraer una infección por coronavirus y/o por uno o más factores de riesgo para padecer un curso grave de la enfermedad por coronavirus; el método comprende la administración de un agente de PPVO al sujeto.

Un método para (i) la preparación de un sujeto para una infección por coronavirus o (ii) el tratamiento de una infección por coronavirus en un sujeto; el método comprende la administración de un PPVO al sujeto.

Un método para el tratamiento de la enfermedad por coronavirus en un sujeto que comprende la administración de un agente de PPVO al sujeto.

La definiciones y formas de realización descritas a continuación, en particular bajo el título “definiciones y formas de realización adicionales de la invención” aplican para el primer aspecto de la invención.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a una composición o a un kit que comprende un agente de PPVO y un agente de coronavirus.

En una forma de realización preferida, la composición o kit asimismo comprende uno o más diluyentes, soportes, y/o conservantes farmacéuticamente aceptables; y/o es una composición farmacéutica o kit. Los diluyentes, soportes, y/o conservantes farmacéuticamente aceptables se describen a continuación y pueden además de los mismos incluir un medio (por ejemplo, acuoso) adecuado para el mantenimiento estructural de un parapoxvirus, en particular un parapoxvirus inactivado, o un liofilizado de este medio. Específicamente, la composición o kit puede tener cualquiera de los usos médicos de la invención descritos en la presente memoria.

La composición puede ser formulada para cualquier vía de administración como se define anteriormente. Asimismo, puede ser formulada para su administración simultánea o de forma separada con el agente de PPVO y el agente de coronavirus.

En una forma de realización preferida, el kit comprende una composición del segundo aspecto.

En otra forma de realización, el kit comprende un prospecto con las instrucciones de uso del agente de PPVO y el agente de coronavirus, o de la composición del segundo aspecto, preferentemente según el uso médico descrito en la presente memoria.

Las definiciones dadas y las formas de realización descritas respecto al primer aspecto también aplican para el segundo aspecto, en caso de ser aplicables. Asimismo, las definiciones y las formas de realización descritas a continuación, en particular bajo el título 'Definiciones y formas de realización adicionales de la invención' aplican para la composición o kit del segundo aspecto.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica o kit para cualquiera de los usos médicos de la invención descritos en la presente memoria, en los que la composición farmacéutica o kit comprende un agente de PPVO y preferentemente un medicamento adicional. La composición farmacéutica por lo general comprende uno o más diluyentes, soportes, y/o conservantes farmacéuticamente aceptables.

En una forma de realización preferida, el kit comprende una composición del tercer aspecto.

En otra forma de realización, el kit comprende un prospecto con las instrucciones de uso del agente de PPVO y otro medicamento, o de la composición del tercer aspecto, preferentemente según un uso médico descrito en la presente memoria.

Las definiciones dadas y las formas de realización descritas respecto al primer y segundo aspecto (por ejemplo, formulación) también aplican para el tercer aspecto, en caso de ser aplicables. Asimismo, las definiciones y formas de realización descritas a continuación, en particular bajo el título 'Definiciones y otras formas de realización de la invención' aplican para la composición o kit del tercer aspecto.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método de selección de un sujeto para cualquiera de los usos médicos de la invención descritos en la presente memoria, en donde el método comprende las siguientes etapas: (i) determinación de la presencia o ausencia de una tormenta de citoquinas en el sujeto, y (ii) selección del sujeto en caso de no presentar una tormenta de citoquinas.

En una forma de realización, la etapa (i) comprende la determinación del HScore del sujeto, y la etapa (ii) comprende la selección del sujeto si el HScore es 169 o menor.

En otra forma de realización, la etapa (i) comprende la detección de uno o más signos de hiperinflamación en una muestra biológica del sujeto, y la etapa (ii) comprende la selección del sujeto si no se detecta ningún signo de hiperinflamación. Hiperinflamación en este caso es un incremento, por ejemplo, excesivo y/o incontrolado, (frente a un sujeto infectado pero asintomático, preferentemente después del período de incubación, o el promedio o la media de una pluralidad de tales sujetos) de uno o más de IL-2, IL-7, TNF-alfa, MIP-1alfa, MCP-1, G-CSF y/o CXCL10; o de uno o más de IL-6, ferritina, recuento de plaquetas y/o velocidad de sedimentación globular (VSG). La muestra biológica preferentemente se selecciona del grupo que consiste en muestra de sangre o muestra derivada de sangre (por ejemplo, plasma o suero), esputo, saliva, y una muestra derivada del pulmón (por ejemplo, por broncoscopía que incluye lavado bronquial, lavado alveolar bronquial, cepillado bronquial y abrasión bronquial).

El método del cuarto aspecto es preferentemente un método ex vivo.

Las definiciones dadas y las formas de realización descritas respecto al primer, segundo y tercer aspecto también aplican para el cuarto aspecto, en caso de ser aplicables. Asimismo, las definiciones y formas de realización descritas a continuación, en particular bajo el título 'Definiciones y otras formas de realización de la invención' aplican para el método del cuarto aspecto.

Definiciones y formas de realización adicionales de la invención

La especificación usa una variedad de términos y frases, que tienen ciertos significados definidos a continuación. Los significados preferidos deben ser interpretados como formas de realización preferidas de los aspectos de la invención descritos en la presente memoria. Como tal, estos y también las otras formas de realización descritas a continuación, se pueden combinar con cualquier forma de realización de los aspectos de la invención y en particular con cualquier forma de realización preferida de los aspectos de la invención descritos anteriormente.

El término "identidad" o "idéntico" en referencia a las secuencias polinucleótidas se refiere al número de residuos en las dos secuencias que son idénticos si se alinean para obtener la máxima correspondencia. Específicamente, el porcentaje de identidad de secuencia de dos secuencias es el número de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas dividido por el largo de la secuencia más corta y multiplicado por 100. Las herramientas de alineamiento que pueden ser utilizadas para alinear dos secuencias son conocidas por el experto en la materia y pueden, por ejemplo, ser obtenidas en Internet, por ejemplo, Needle (EMBOS^s ) (https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/), MUSCLE (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/), MAFFT (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ mafft/) o WATER (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/ emboss_water/). El alineamiento de dos secuencias se puede llevar a cabo utilizando una configuración de los parámetros predeterminada, por ejemplo para Needle preferentemente MATRIX: BLOSUM62, Gap Open: 10,0, Gap Extend: 0,5, para MAFFT preferentemente: Matrix: Blosum62, Gap Open 1,53, Gap Extend 0,123, para polinucleótidos en WATER preferentemente: MATRIX: ADNFULL, Gap Open: 10,0, Gap Extend 0,5 y para polipéptidos en WATER preferentemente MATRIX: BLOSUM62, Gap Open: 10,0, Gap Extend: 0,5. El experto en la materia entiende que puede ser necesario introducir huecos en una de las secuencias para alinearlas satisfactoriamente. El "mejor alineamiento de secuencia" se define como el alineamiento que produce el mayor número de residuos alineados idénticos con el menor número de huecos posible. Preferentemente, es un alineamiento global que incluye todos los residuos de todas las secuencias en el alineamiento.

El término “variante” generalmente se refiere a una versión modificada del polinucleótido, por ejemplo, una mutación, por lo que uno o más nucleótidos del polinucleótido pueden estar mutados. Generalmente, la variante es funcional, es decir, por ejemplo, en el caso de un virus, que el virus es capaz de infectar a la célula huésped. La funcionalidad generalmente es la descrita para el polinucleótido al que pertenece la variante. Una “mutación” puede ser una sustitución, deleción y/o inserción de nucleótido (“y” puede aplicar en caso de haber más de una mutación). Preferentemente, es una sustitución.

El término “antígeno” se refiere a cualquier sustancia, por ejemplo, una proteína o un péptido, capaz de unirse a un anticuerpo, a un receptor de células B y/o a un receptor de células T. Un antígeno comprende al menos un epítopo que preferentemente comprende al menos 8 aminoácidos y más preferentemente comprende entre 8 y 17 aminoácidos. El epítopo puede ser un epítopo de células T y/o de células B. Un epítopo de células T es un epítopo que se puede presentar en la superficie de una célula presentadora de antígeno, donde está unido a una molécula de MHC. En humanos, las células presentadoras de antígenos profesionales se especializan en presentar péptidos MHC de clase II, mientras que la mayor parte de las células somáticas nucleadas presentan péptidos MHC de clase I. Los epítopos de células T presentados por moléculas MHC de clase I típicamente son péptidos de entre 8 y 11 aminoácidos de longitud, mientras que las moléculas MHC de clase II presentan péptidos más largos, por ejemplo, de 13-17 aminoácidos de longitud. Un etítopo de células B es un epítopo que es reconocido por las células B como una estructura tridimensional en la superficie de los antígenos nativos. Los epítopos se pueden predecir con herramientas in silico, por ejemplo, la herramienta de predicción de células B o T en línea del IEDb Analysis Resource.

El término “ inmunógeno” se refiere a un antígeno capaz de inducir una respuesta inmunitaria.

“Receptor de reconocimiento de patrones” o “PRR”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un sensor huésped codificado por una línea germinal que detecta un patrón molecular asociado a patógenos (PAMP) que es específico para un patógeno y/o un patrón molecular asociado a daños (DAMP) que es específico para los componentes de una célula huésped que son liberados cuando la célula sufre daños o muere. Un PRR puede ser un PRR unido a la membrana (PRR de superficie celular) o un PRR citosólico.

Un “adyuvante” es una sustancia que acelera, prolonga y/o amplifica la calidad y/o la potencia de una respuesta inmunitaria a un antígeno/inmunógeno, en comparación a la administración del antígeno solo, reduciendo así la cantidad de antígeno/inmunógeno necesaria y/o la frecuencia de inyección necesaria para generar una respuesta inmunitaria adecuada al antígeno/inmunógeno de interés. Los ejemplos de adyuvantes que se pueden utilizar en el contexto de la composición según la presente invención son: precipitados gelatinosos de hidróxido de aluminio (alumbre); AlPO4; alhidrogel; productos bacterianos de la membrana externa de bacterias Gram-negativas, en particular monofosforil lípido A (MPLA), lipopolisacáridos (LPS), muramil dipéptidos y derivados de los mismos; adyuvante incompleto de Freund; liposomas, en particular liposomas neutros, liposomas que contienen la composición y opcionalmente citoquinas; copolímeros en bloque no iónicos; adyuvante ISCOMATRIX (Drane et al., 2007); ADN sin metilar que comprende dinucleótidos CpG (motivo CpG), en particular CpG ODN con un esqueleto de fosforotioato (PTO) (CpG PtO ODN) o un esqueleto fosfodiéster (pO) (CpG PO Od N); derivados sintéticos de lipopéptidos, en particular Pam3Cys; lipoarabinomanano; peptidoglucano; zimosano; proteínas de choque térmico (HSP), en particular HSP 70; ARNbc y derivados sintéticos del mismo, en particular Poli I:C; péptidos policatiónicos, en particular poli-L-arginina; taxol; fibronectina; flagelina; imidazoquinolina; citoquinas con actividad adyuvante, en particular GM-CSF, interleuquina-(IL-)2, IL-6, IL-7, IL-18, interferones tipo I y II, en particular IFN-y, TNF-a; 25-dihidroxivitamina D3 (calcitriol); y oligopéptidos sintéticos, en particular péptidos presentados por MHC-II. Pueden utilizarse como adyuvantes polímeros en bloque no iónicos que contienen polioxietileno (POE) y polioxipropileno (POP), tales como copolímeros en bloque POE-POP-POE (Newman et al., 1998). Este tipo de adyuvante es particularmente útil para composiciones que contienen ácidos nucleicos como principio activo.

El término “recombinante” se refiere en particular a un virus que está modificado para comprender en su genoma una secuencia de polinucleótidos heteróloga.

El término “inmunomodulador” se refiere a un fármaco utilizado para regular o normalizar el sistema inmunitario induciendo, aumentando, suprimiendo y/o debilitando una respuesta inmunitaria en un sujeto (“y” significa que algunas partes del sistema inmunitario son selectivamente inducidas o aumentadas y otras son selectivamente suprimidas o debilitadas). Los ejemplos son citoquinas, los agonistas no citoquina o antagonistas de los receptores de citoquina (por ejemplo, anticuerpos o compuestos pequeños), anticuerpos o compuestos pequeños que se unen a (preferentemente neutralizando) citoquinas, y receptores de citoquina solubles (por ejemplo, para atrapar citoquinas). No incluye un antígeno.

El término “vector” incluye cualquier vector conocido por el experto en la materia, incluidos vectores plásmidos, vectores cósmidos, vectores fagos como el fago lambda, vectores virales como vectores de adenovirus (Ad), vectores de virus adenoasociados (AAV), vectores de alfavirus (por ejemplo, virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), virus sindbis (SIN), virus del bosque de semliki (SFV), y quimeras VEE-SIN), vectores del virus del herpes, vectores del virus del sarampión, vectores del virus de la viruela (por ejemplo, virus vaccinia, virus vaccinia modificado Ankara (MVA), NYVAC (derivado de la cepa Copenhague de vaccinia), y vectores de viruela aviar: viruela del canario (ALVAC) y vectores de viruela aviar (FPV)), y vectores del virus de la estomatitis vesicular, o partículas similares a virus. Como se usa en el presente documento, el término “partícula similar a virus” o "VLP" se refiere a una cubierta viral vacía, no replicante. Las VLP generalmente están compuestas de una o más proteínas virales, tales como, pero sin limitarse a, esas proteínas referidas como proteínas de la cápside, cubierta, coraza y/o envuelta. Estas contienen proteínas virales funcionales responsables de la penetración de la célula por parte del virus, asegurando su entrada eficiente. Los métodos para producir VLP particulares son conocidos en la técnica.

El término “mitógeno” se refiere a un agente, por ejemplo, un péptido o una proteína que induce que una célula inicie la división. El término “activador celular” se refiere a un agente, por ejemplo, un péptido o una proteína que se une a y se entrecruza con receptores celulares, por ejemplo, receptores de células T o células B.

El término “análogo de nucleósido” se refiere a un nucleósido que contiene un análogo de ácido nucleico y un azúcar. El término “análogo de nucleótido” se refiere a un nucleótido que contiene un análogo de ácido nucleico, un azúcar y un grupo fosfato con de 1 a 3 fosfatos. El término “análogo de ácido nucleico” se refiere a un compuesto estructuralmente similar al ARN y ADN en que tiene uno o más de esqueleto fosfato, azúcar pentosa y/o la nucleobase alterada de modo que posee propiedades de apareamiento de bases y/o apilamiento de bases diferente. Los ejemplos incluyen el ácido péptidonucleico (APN), morfolino y el ácido nucleico bloqueado (ANB), así como el ácido glicólico nucleico (AGN) y el ácido treosa nucleico (ATN).

El término “molécula de ARNi” se refiere a una molécula capaz de neutralizar moléculas de ARNm en forma específica para la secuencia diana. Los ejemplos incluyen ARNbc, miARN y ARNpi.

Las formas farmacéuticas preferidas particulares para la administración de los agentes según la invención son formas adecuadas para uso inyectable, e incluyen soluciones o dispersiones estériles acuosas y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Generalmente, tales soluciones o dispersiones incluyen un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, soluciones acuosas tamponada de agua, por ejemplo, tampones biocompatibles, etanol, poliol, tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, mezclas adecuadas de los mismos, tensioactivos o aceites vegetales. Se pueden obtener soluciones de infusión o inyección mediante cualquier técnica reconocida en el campo, incluidas, pero sin limitarse a, el agregado de conservantes tales como agentes antibacterianos o fungicidas, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico o tiomersal. Además, se pueden incorporar agentes isotónicos, tales como azúcares o sales, en particular cloruro de sodio, en soluciones de infusión o inyección.

Los diluyentes preferidos de la presente invención son agua, tampones fisiológicos aceptables, soluciones salinas tamponadas fisiológicas aceptables o soluciones salinas. Los excipientes que pueden utilizarse con las distintas formas del fármaco según la invención se pueden elegir de la siguiente lista no limitante:

a) aglutinantes tales como lactosa, manitol, sorbitol cristalino, fosfatos dibásicos, fosfatos de calcio, azúcares, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares,

b) lubricantes como estearato de magnesio, talco, estearato de calcio, estearato de zinc, ácido esteárico, aceite vegetal hidrogenado, leucina, glicéridos y estearil fumaratos de sodio,

c) disgregantes tales como almidones, croscaramelosa, metilcelulosa sódica, agar, bentonita, ácido algínico, carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

El término “soporte farmacéuticamente aceptable” se refiere a cualquier sustancia que mejore la selectividad, efectividad y/o seguridad de la administración del fármaco. Tales soportes se pueden usar para controlar la liberación de un fármaco en la circulación sistémica. Esto se puede lograr ya sea mediante la liberación lenta del fármaco durante un período largo de tiempo (típicamente por difusión) o liberacion desencadenada en la diana del fármaco por algún estímulo, tal como cambios en el pH, la aplicación de calor, y la activación por luz. Los soportes también pueden ser utilizados para mejorar las propiedades farmacocinéticas, específicamente la biodisponibilidad, de muchos fármacos de baja solubilidad en agua y/o permeabilidad de la membrana. Se han estudiado y desarrollado una amplia gama de sistemas portadores para fármacos. Los ejemplos incluyen liposomas, micelas poliméricas, microesferas, nanopartículas, nanofibras, conjugados proteína-fármaco, eritrocitos, virosomas y dendrímeros. Se pueden usar diferentes métodos para adherir el fármaco al soporte, incluyendo adsorción, integración en la estructura general, encapsulación y enlace covalente.

La invención se describe mediante los siguientes ejemplos que deben ser interpretados únicamente como ilustrativos y no limitantes del ámbito de la invención.

Ejemplo 1

Objetivo

Probar la actividad antiviral de los viriones de parapoxvirus inactivado orf (iPPVO) contra el coronavirus. Los viriones de PPVO estimulan el brazo innato, así como el adaptativo de la respuesta inmunitaria.

Abordaje

En sangre completa, las CPA (células presentadoras de antígeno) incorporan el virión de iPPVO, lo que desencadena su activación y la liberación de citoquinas. Esto a su vez activa las células T así como las células NK, que también empiezan a proliferar y a liberar citoquinas. Después de 3 días de incubación las células se centrifugan y se recoge sobrenadante que contiene factores solubles como citoquinas. Se ensaya la actividad de estos sobrenadantes sobre el coronavirus.

Sustancias de prueba

- iPPVO de la cepa de D1701 (disponible de Pfizer); 230 unidades de IFN reconstituidas en 2 ml agua

- vehículo de iPPVO (tampón sólo de PPVO, es decir sin virus), control negativo

- PBS, control negativo

- Concavalina (Con) A, coestímulo, solución madre 1 mg/ml PBS = 10X (utilizado en un pocillo a 5 pg/ml)

Materiales adicionales

- Sangre completa de un donante sano: 9 ml de sangre completa recien recogida en un Sarstedt Monovette, Li-Heparina

- Medio para la incubación de la sangre completa: RPMI (500 ml) suplementado con GlutaMAX™ al 1% y 0,25 ml de Heparina Sódica (5000 U)

- Células del ensayo de coronavirus: células VeroE6-EGFP propagadas en un medio de cultivo preparado suplementando DMEM con SFT al 10% v/v inactivado por calor y 5 ml de bicarbonato de sodio al 7,5%, y cultivadas en una botella T150 y divididas 1/4 dos veces por semana. Se agregó Pen-strep directamente a la botella T150 en una dilución 1/100.

- Medio de ensayo de coronavirus: se preparó suplementando DMEM con STF al 2% v/v inactivado por calor y 5 ml de bicarbonato de sodio al 7,5%.

Preparación de las muestras

Por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo: 120 pl de medio celular para la incubación de sangre completa 20 pl ConA o PBS 20 pl iPPVO, vehículo de iPPVO o PBS 40 pl sangre completa.

Se incubó la placa a 37 °C, CO² al 5 % durante 72 hrs y luego se centrifugó durante 5 min a 230 g. El sobrenadante se dividió en alícuotas en placas nuevas de 96 pocillos (se mantuvo la distribución de las placas). Las placas de muestras se congelaron a -80 °C hasta su uso posterior.

Ensayo de coronavirus

Dilución de las muestras (sustancia de prueba como se preparó anteriormente): se agregaron 100 pl de medio de ensayo a los pocillos de una placa Greiner Bio One 655090 y se retiraron nuevamente de los pocillos 15 pl (excepto de los pocillos para control del ensayo: control con virus (VC) que controla la replicación del virus y su efecto en las células, y control de células (CC) para controlar la viabilidad celular sin virus). Se agregaron 15 pl de los pocillos de la placa de muestra a los pocillos a los que se les habían retirado 15 pl de medio.

Preparación de la suspensión de células: se lavó un cultivo confluente (monocapa) de VeroE6-EGFP en una botella T150 con DPBS y se agregaron 10 ml de tripsina al 0,25% tripsina/EDTA. Se incubó la botella durante 1 minuto a temperatura ambiente, y se retiró la tripsina/EDTA dejando 2 ml. Se incubó después la botella durante 15 minutos a 37 °C. Después de la incubación, se resuspendieron las células en 10 ml de medio de ensayo, se pasaron por un filtro celular (FALCON CAT NO 352350) y se contaron utilizando un Coulter (se contaron 3 muestras de 10 pl en 10 ml). Se resuspendieron después 3000 células en 50 pl de medio de ensayo y se sembraron 50 pl de la suspensión de células en cada pocillo de la Placa Greiner.

Ensayo: se incubaron durante la noche (37 °C/CO² al 5%) las placas con la suspensión de células preparada tal como se detalló anteriormente, después de lo cual se agregó a todos los pocillos (excepto a los pocillos de control de células) SARS-CoV-2 (cepa BetaCoV/Belgium/GHB-03021/2020, título solución madre 4,8 x 10⁷ TCID⁵⁰/ml) en una dilución final de 1/200,0000 en 200 pl/pocillo (3000 células/pocillo, resultando en una MOI de 0,016 TCID⁵⁰/célula). Se incubaron las placas a 37 °C/CO² al 5% durante 5 días, después de lo cual se midió la señal de GFP utilizando fluorescencia en el pocillo completo, HCI (High Content Imaging) y el software ImageJ. Una expresión de EGFP reducida es un marcador para la actividad citopática inducida por el virus. Véase también Ivens et al. (Journal of Virological Methods 129, 2005, 56-63).

Resultados

La figura 1 muestra los resultados. Las células no infectadas con coronavirus (Media de CC) eran viables y expresaron eGFP. Las células infectadas con coronavirus (Media de VC) murieron y no se detectó expresión de eGFP. Los resultados para PBS y para el vehículo de iPPVO solos fueron similares a la media de VC, es decir, como se esperaba, PBS y el vehículo de iPPVO solos no tuvieron ningún efecto sobre la viabilidad celular, es decir contra el coronavirus. Asimismo ConA 5 pg/ml sola (en PBS) no retuvo expresión de eGFP, y tampoco afectó la expresión de eGFP cuando se administró junto con el vehículo de iPPVO, como se muestra por la comparación con ConA administrada sola en PBS. iPPVO D1701 administrado solo (en PBS) también tuvo un claro efecto positivo sobre la viabilidad celular, y la expresión de eGFP aumentó aún más cuando iPPVO D1701 se usó en combinación con ConA 5 pg/ml (que por sí misma no mostró efecto sobre la expresión de eGFP a esta concentración). Por consiguiente, iPPVO y ConA actúan de forma sinérgica.

Estos resultados muestran la eficacia del parapoxvirus en fomentar un estado antiviral en las células, que es protector e inhibe la propagación y la replicación del coronavirus y de esta forma la infección de células adicionales. Este efecto se puede mejorar añadiendo un agente inmunoestimulador tal como ConA, que actúa de forma sinérgica, es decir, se mejora la eficacia del iPPVO en un enfoque combinatorio.

Ejemplo 2

Objetivo

Determinar si la prueba de principio del ejemplo 1 aplica a parapoxvirus en general mediante el ensayo de la actividad antiviral de otra cepa de parapoxvirus contra el coronavirus.

Abordaje

Ver Ejemplo 1.

Sustancias de prueba

- iPPVO de la cepa NZ2 (inactivado químicamente con etilenimina binaria, BEI), designación interna AIC649, 1x109 viriones liofilizados reconstituidos en 1 ml agua

- iPPVO de la cepa D1701, ver Ejemplo 1

- vehículo de iPPVO, control negativo, ver Ejemplo 1

Materiales adicionales, preparación de las muestras, ensayo de coronavirus

Ver el Ejemplo 1. Se utilizaron iPPVO y el vehículo de iPPVO solos. iPPVO D1701, que mostró un incremento en la viabilidad celular en el Ejemplo 1, se utilizó como control positivo en el Ejemplo 2.

Resultados

La figura 2 muestra los resultados. iPPVO D1701, que en el Ejemplo 1 demostró ser efectivo, fue utilizado como control positivo y como el 100% de referencia. Ambas cepas de PPV^o D1701 y NZ2 son activas contra el coronavirus, como se muestra por la comparación con el control negativo. En consecuencia, el fomento de un estado antiviral en las células que es efectivo contra el coronavirus es un distintivo de parapoxvirus en general y no únicamente de la cepa ensayada en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3

Objetivo

Investigar la programación de la adición del parapoxvirus, específicamente, determinar cómo se modula la actividad antiviral del parapoxvirus mostrada en los Ejemplos 1 y 2 al agregar los sobrenadantes a las células del ensayo de coronavirus en momentos distintos.

Abordaje

Ver Ejemplos 1 y 2, pero agregando los sobrenadantes de las muestras a las células del ensayo en distintos momentos (antes o después de infectar con SARS-CoV-2 las células VeroE6-EGFP).

Sustancias de prueba

- iPPVO de la cepa NZ2, ver Ejemplo 2

- iPPVO de la cepa D1701, ver Ejemplo 1

- vehículo de iPPVO, control negativo, ver Ejemplo 1

- ConA, ver Ejemplo 1

Materiales adicionales, preparación de las muestras, ensayo de coronavirus

Ver Ejemplos 1 y 2. Se incubó sangre completa con iPPVO o el vehículo de iPPVO (solo o en combinación con ConA). Se generaron sobrenadantes y se agregaron en distintos momentos antes o después de infectar las células VeroE6-EGFP con el coronavirus (S^a R^s -C^oV-2).

Ejemplo 4

Objetivo

Ensayar enfoques combinatorios adicionales, específicamente, confirmar que la potencia de la actividad antiviral del parapoxvirus mostrada en los Ejemplos 1, 2, y 3 puede ser aumentada en enfoques combinatorios utilizando compañeros de combinación adicionales, por ejemplo, un agente inmunoestimulador o un antiviral como los descritos en la presente memoria. Esto incluye estudiar el tiempo de agregado del parapoxvirus y de compañeros de combinación (parapoxvirus a las muestras de sangre y compañeros de combinación a muestras de sangre o directamente a las células del ensayo de coronavirus), es decir, relativos el uno al otro, y también el momento de añadir el coronavirus respecto al parapoxvirus y compañero de combinación. También incluye ensayar la influencia de las concentraciones de parapoxvirus y compañero de combinación.

Abordaje

Ver Ejemplos 1, 2, y 3, pero añadiendo en distintos momentos los sobrenadantes (de sangre tratada con el parapoxvirus y/o compañero de combinación, al mismo tiempo o en distintos momentos) de la placa de muestra a las células del ensayo de coronavirus (antes o después de infectar las células VeroE6-EGFP con SARS-CoV-2), y añadiendo el compañero de combinación a diferentes tiempos (en caso de no haberlo agregado a la muestra de sangre) a las células del ensayo de coronavirus (antes o después de añadir el sobrenadante y/o añadir SARS-CoV-2).

Sustancias de prueba

- iPPVO de la cepa NZ2, ver Ejemplo 2

- iPPVO de la cepa D1701, ver Ejemplo 1

- vehículo de iPPVO, control negativo, ver Ejemplo 1

- ConA, ver Ejemplo 1 (compañero de combinación control)

- Talidomida (compañero de combinación)

- Remdesivir (compañero de combinación)

Materiales adicionales, preparación de las muestras, ensayo de coronavirus

Ver Ejemplos 1 y 2. Se incubó sangre completa con iPPVO o con un vehículo de iPPVO (solo o en combinación con uno o más compañeros de combinación). Se agregaron los sobrenadantes en diferentes momentos, antes o después de infectar las células VeroE6-EGFP con el coronavirus (SARS-CoV-2). Se agregaron uno o más compañeros de combinación que no habían sido utilizados en la incubación de las muestras de sangre a las células VeroE6-EGFP en diferentes momentos (antes que el sobrenadante y el coronavirus, después de ambos o entre ambos). Se utilizaron diferentes concentraciones de los compañeros de combinación.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un agente de Parapoxvirus ovis (PPVO) para su uso en (i) preparar un sujeto para una infección por coronavirus o (ii) tratar una infección por coronavirus en un sujeto.

2. El agente de PPVO para uso según la reivindicación 1, en donde el agente de PPVO es:

(a) el PPVO mismo o un fragmento del mismo, o

(b) un agente que comprende información genética que codifica (a).

3. El agente de PPVO de la reivindicación 2, en donde el agente de PPVO es un virión de PPVO inactivado.

4. El agente de PPVO para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el coronavirus es un coronavirus del SARS.

5. El agente de PPVO para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el coronavirus es SARS-CoV-2 o una variante del mismo con al menos el 80% de identidad de secuencia respecto a SEQ ID NO: 1 o 2.

6. El agente de PPVO para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el sujeto que se va a preparar se caracteriza por uno o más factores de riesgo para contraer una infección por coronavirus y/o por uno o más factores de riesgo para padecer un curso grave de una enfermedad por coronavirus.

7. El agente de PPVO para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el sujeto que se va a tratar es asintomático.

8. El agente de PPVO para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el sujeto que se va a tratar padece enfermedad por coronavirus, preferentemente Covid-19.

9. El agente de PPVO para su uso según la reivindicación 8, en donde el sujeto no tiene síntomas graves, o tiene un curso grave de una enfermedad por coronavirus.

10. El agente de PPVO para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el uso comprende la administración de una pauta de tratamiento adicional para (i) o (ii).

11. El agente de PPVO para uso según la reivindicación 10, en donde la pauta de tratamiento adicional para (i) comprende la administración de un agente de coronavirus y/o un agente inmunoestimulador, y la pauta de tratamiento adicional para (ii) comprende la administración de un agente de coronavirus, uno o más medicamentos adicionales y/o uno o más tratamientos no farmacológicos adicionales.

12. El agente de PPVO para uso según la reivindicación 11, en donde

- el agente de coronavirus se selecciona del grupo que consiste en:

(i) un coronavirus inactivado

(ii) un fragmento antigénico, preferiblemente inmunógeno de un coronavirus,

(iii) un ácido nucleico que codifica (i) o (ii),

(iv) un vector que comprende el ácido nucleico de (iii),

(v) una célula que comprende el ácido nucleico de (iii) o el vector de (iv),

(vi) un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un coronavirus o un fragmento del mismo, preferiblemente la envuelta,

(vii) un análogo de nucleótido/nucleósido, preferiblemente específico de coronavirus,

(viii) una molécula de ARNi específica de coronavirus,

(ix) una molécula pequeña, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une al un sitio de interacción proteína-proteína (PPI) entre una proteína de coronavirus y una proteína del sujeto, y

(x) plasma sanguíneo de un sujeto que se ha recuperado de una infección por coranavirus, preferiblemente de enfermedad por coranavirus;

- el medicamento adicional se selecciona del grupo que consiste en un agente inmunoestimulador, un antiviral, un antibiótico, un adyuvante, un glucocorticoide, un fármaco antihipertensivo, un fármaco hipoglucémico, un fármaco antichoque, y un fármaco adecuado para el tratamiento de uno o más síntomas de la enfermedad por coronavirus; y/o

- la una o más terapias adicionales se seleccionan preferentemente del grupo que consiste en terapia de oxígeno y soporte extracorpóreo de órganos (ECOS).

13. El agente de PPVO para uso según la reivindicación 12, en donde la molécula pequeña se selecciona del grupo que consiste en Loratadina, daunorrubicina, midostaurina, ponatinib, silmitasertib, ácido valproico, haloperidol, metformina, migalastat, S-verapamilo, indometacina, ruxolitinib, ácido micofenólico, entacapona, ribavirina, E-52862, Merimepodib, RVX-208, XL413, AC-55541, Apicidina, AZ3451, AZ8838, Bafilomicina A1, CCT 365623, GB110, H-89, JQ1, PB28, PD-144418, RS-PPCC, TMCB, UCPH-101, ZINC1775962367, ZINC4326719, ZINC4511851, ZINC95559591, 4E2RCat, ABBV-744, Camostat, Captopril, CB5083, Cloranfenicol, Cloroquina, Compuesto 10 inhibidor de PI4K-IMp, Compuesto 2 inhibidor de ciclofilina, CPI-0610, Dabrafenib, DBeQ, dBET6, IHVR-19029, Linezolid, Lisinopril, Minoxidil, ML240, MZ1, Nafamostat, Pevonedistat, PS3061, Rapamicina (Sirolimus), Sanglifehrina A, Sapanisertib (INK128/MlN128), FK-506 (Tacrolimus), Ternatina 4 (DA3), Tigeciclina, Tomivosertib (eFT-508), Verdinexor, WDB002, Azacitidina, Selinexor, y Zotatifin (eFT226).

14. Una composición o un kit que comprende un agente de PPVO, preferentemente como se define en la reivindicación 2 o 3, y un agente de coronavirus, preferentemente como se define en la reivindicación 12.

15. Una composición farmacéutica o kit para uso en (i) preparar un sujeto para una infección por coronavirus o (ii) tratar una infección por coronavirus en un sujeto, en donde la composición farmacéutica o kit comprende un agente de PPVO, preferentemente como se define en la reivindicación 2 o 3, y preferentemente un medicamento adicional, más preferentemente como se define en la reivindicación 12.