ES2925857T3 - Ensayo rápido para la concentración total de fenoles y polifenoles en muestras de alimentos líquidos - Google Patents

Abstract

La invención está relacionada con una estimación rápida y fácil de la concentración de fenoles y polifenoles en productos alimenticios líquidos, como jugo de fruta cruda, bebidas que contienen jugo, té verde, té negro, yerba mate, café, vino tinto y cerveza. El método de ensayo se basa en la reacción de Folin-Ciocalteu. También se proporciona el kit de prueba para llevar a cabo dicho método. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Ensayo rápido para la concentración total de fenoles y polifenoles en muestras de alimentos líquidos

Campo de la invención

La invención está relacionada con una estimación rápida y fácil de la concentración de fenoles y polifenoles en productos de alimentos líquidos, tales como jugo de fruta cruda, bebidas que contienen jugo, té verde, té negro, yerba mate, café, vino tinto y cerveza. Debido a su origen biológico, estos líquidos contienen mezclas complejas de numerosos compuestos fenólicos y polifenólicos. El nivel total de fenoles y polifenoles es una característica relevante para el efecto antioxidante de estos líquidos que se cree que brinda beneficios potenciales para la salud. Antecedentes de la invención

Los polifenoles han sido objeto de extensas investigaciones debido a su actividad a favor de la salud. Están presentes en una variedad de frutas, especialmente oscuras, verduras, nueces, semillas, flores, cortezas, bebidas e incluso algunos alimentos elaborados debido a la presencia de ingredientes naturales como componentes. Se ha informado que exhiben efectos anticancerígenos, antiaterogénicos, antiulcerosos, antitrombóticos, antiinflamatorios, inmunomoduladores, antimicrobianos, vasodilatadores y analgésicos. El interés en la investigación de polifenoles de diversas fuentes naturales ha crecido porque los polifenoles pueden usarse como antioxidantes o colorantes en la industria de alimentos y benefician la salud humana de varias maneras. Los efectos beneficiosos de los polifenoles en la salud humana podrían deberse a sus propiedades eliminadoras de radicales libres. Se ha postulado que su alto consumo está relacionado con una menor incidencia de enfermedades cardiovasculares. La búsqueda en Google Scholar de la frase "polifenoles totales" muestra más de 900 publicaciones en los primeros 5 meses de 2017 y más de 2000 en 2016, y para "polifenoles" más de 4000 y 20000 publicaciones en los primeros 5 meses de 2017 y en 2016, respectivamente. En PubMed, en 2017 hubo más de 750 visitas para "polifenoles" en los primeros 5 meses de 2017, y 1837 en 2016.

Hay conferencias organizadas sobre este tema (por ejemplo, "World Congress on Polyphenols Applications"). También existe una base de datos sobre el contenido típico de polifenoles en varios tipos de productos de alimentos ("Phenol-Explorer", http://www.phenol-explorer.eu), y una base de datos del USDA sobre un grupo de polifenoles, específicamente, los flavonoides (USDA Database for the Flavonoid Content of Selected Foods, disponible en: https://www.ars.usda.gov/northeast-area/beltsville-md/beltsville-human-nutrition-research-center/nutrient-datalaboratory/docs/usda-special-interest-databases-on-flavonoids/). En general, cuantos más polifenoles haya en los alimentos, mejor, pero en el caso de algunas afecciones de salud (por ejemplo, cáncer), su cantidad debe controlarse más o menos estrictamente.

Algunos métodos para la cuantificación del contenido total de polifenoles se basan en medidas colorimétricas. Los fenoles totales (o efecto antioxidante) pueden medirse mediante el uso de la reacción de Folin-Ciocalteu. Los resultados se expresan típicamente como equivalentes de ácido gálico (GAE).

El método de Folin-Ciocalteu es ahora la prueba de detección más popular para el contenido de polifenoles (más de 1900 resultados en Google Scholar (sin citas) y 49 en PubMed en los primeros 5 meses de 2017; en cuanto a la base de datos de PubMed, cabe destacar que busca solo a través de títulos y resúmenes de artículos, y este método generalmente se describe en la sección "Materiales y métodos" de las publicaciones). El reactivo contiene complejos de ácido fosfomolíbdico y fosfotúngstico. El método se basa en la transferencia de electrones desde compuestos fenólicos para formar un cromóforo azul constituido por un complejo fosfotungstato/fosfomolibdato donde la absorción máxima (medida en el intervalo de 690-790 nm en ambiente alcalino) depende de la concentración de compuestos fenólicos. La temperatura de reacción se ha usado para reducir el tiempo necesario para alcanzar el máximo color (T = 37 °C). Generalmente, el ácido gálico se usa como compuesto estándar de referencia y los resultados se expresan como equivalentes de ácido gálico. Debe tenerse en cuenta que esta prueba puede sobreestimar la cantidad de polifenoles debido a la interferencia de otras sustancias reductoras como la vitamina C, el ascorbato o los azúcares reductores. Sin embargo, la proporción de estos compuestos a polifenoles suele ser casi constante en un tipo de fruta dado.

El 6 de marzo de 2017, AOAC INTERNATIONAL invitó a los autores y desarrolladores de métodos a presentar métodos relevantes que puedan cumplir con AOAC Standard Method Performance Requirements® (SMPR®) para los métodos para la estimación del contenido fenólico total mediante el uso del ensayo de Folin-Ciocalteu (SMPR 2015.009). Todos los métodos presentados ahora están sujetos a evaluación por parte de un Panel de Revisión de Expertos de la AOAC, que los revisa para determinar su estado potencial como AOAC First Action Official MethodsSM. Cualquier método oficial de análisis resultante aprobado/adoptado puede usarse como un método de referencia. Sin embargo, cualquier método oficial aún requeriría equipamiento de laboratorio y preparación de muestras (al menos dilución de la muestra en caso de análisis de jugo, tal como el jugo de bayas), y por lo tanto sería inadecuado para su uso en condiciones de campo o en el hogar por parte de un usuario final promedio.

Las mediciones de polifenoles vegetales en laboratorios se realizan preferentemente mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), ya que brinda información tanto sobre la composición como sobre la concentración de polifenoles. Sin embargo, la composición de polifenoles en un determinado tipo de fruta no suele variar significativamente, al contrario de su cantidad total. Así, una vez que se ha determinado la composición de polifenoles en un material vegetal determinado con HPLC, también se usan otros métodos como espectrofotometría y titulación para determinar el contenido total de polifenoles. Suelen ser más rápidos y menos costosos que la técnica de HPLC. Sin embargo, la mayoría de estos métodos requieren equipamiento de laboratorio, preparación de reactivos y personal capacitado para su realización.

En el estado de la técnica existen métodos disponibles para un grupo más amplio de usuarios finales, que no requieren ni laboratorio especializado ni habilidades. Uno de estos métodos se basa en una reacción de polifenoles con cromógeno y se usa en el sistema CDR Winelab que comprende pequeños espectrofotómetros con cubetas precargadas. Este sistema puede usarse en bodegas o plantas de procesamiento de frutas, sin embargo, aún requiere al menos una fuente de alimentación y una mesa. Además, aunque no es necesario emplear un técnico de laboratorio experto para usar dicho sistema, su usuario todavía necesita un entrenamiento previo en cuanto al funcionamiento del dispositivo y las pipetas automáticas. Además, para muestras con un alto nivel de polifenoles, >6 g/l (para resultados expresados como equivalentes de ácido gálico, GAE), se requiere una preparación preliminar adicional de las muestras. Por lo tanto, este enfoque no es adecuado para su uso en el campo.

También existen espectrofotómetros portátiles (tales como la línea MiniScan de HunterLab) que podrían usarse para realizar pruebas de polifenoles en el campo, pero requieren la calibración del equipamiento por parte del usuario con un recipiente de reacción usado (no usan cubetas espectrofotométricas estándar), y completar los reactivos para la reacción. Por lo tanto, se necesita un técnico capacitado para usarlos para determinar el contenido de polifenoles.

La solución técnica descrita en la solicitud de patente núm. CN105259169A ("Test paper for detecting tea polyphenol quickly and preparation method of test paper') y en la solicitud de patente núm. CN 101294912 B ("Tea polyphenol detecting test paper, standard colour comparison card and usage thereof') se basa en el método de tartrato ferroso. Esta reacción es prácticamente específica de las catequinas, ya que otros tipos de polifenoles reaccionan a una velocidad mucho menor. Las catequinas son, en general, el principal grupo de polifenoles presentes en el té, porque casi todos los polifenoles del té son catequinas y polímeros de catequinas. Sin embargo, en la fruta las catequinas son solo uno de los grupos polifenoles copresentes. Por lo tanto, las pruebas descritas en estas publicaciones no son apropiadas para la detección y la cuantificación de polifenoles en frutas y productos de frutas, por ejemplo, bayas, porque daría lugar a una subestimación del contenido de polifenoles. Además, la semicuantificación de polifenoles se realiza mediante una comparación visual con una tarjeta de colores estándar, lo que es muy subjetivo ya que la percepción de los colores varía mucho en la población. Además, para las frutas de color oscuro (como las bayas), el color del jugo interfiere con el color de un producto de reacción.

Otra tira de prueba descrita por Dieter Tanzer y Uwe Kraetschmer (publicación núm. EP 1779105 A1 y núm. US 2008/026470) se basó en una prueba en papel mediante el uso del método de Folin-Ciocalteu. Sin embargo, este método es adecuado para la cuantificación de polifenoles en el intervalo de hasta 0,3 g/l (GAE), que está muy por debajo de los valores típicos para un jugo de frutas recién exprimido con alto contenido de polifenoles o vino tinto. Por lo tanto, existe la necesidad de una preparación preliminar adicional de las muestras. De nuevo, la semicuantificación de polifenoles se realiza mediante una comparación visual con una tarjeta de colores estándar y la cuantificación con un equipo de laboratorio (un reflectómetro).

El documento núm. CN 106353312 A describe un método para determinar el contenido de polifenoles en el té mediante el uso de un chip microfluídico. En dicho método se usa un reactivo de Folin-Ciocalteu, sin embargo requiere acceso a un equipo de laboratorio (pipetas automáticas) y habilidades de laboratorio, ya que se requiere el pipeteo de un solo microlitro. Otro inconveniente de este método es que la muestra debe diluirse antes del análisis. Además, este método requiere el uso de ácido gálico estándar, que es inestable en solución. Finalmente, el análisis de color se basa en la comparación visual del color en el campo de reacción de la muestra y de la(s) solución(es) estándar, lo que podría verse afectado por el color de una muestra (por ejemplo, jugo de bayas), o debe realizarse mediante el uso de programas separados para el análisis de color.

Un método para la detección de determinados antioxidantes, que incluyen los polifenoles, que usa nanopartículas de ceria se describe en el documento núm. US 2014/0162368. Este método requiere una serie de diluciones antes del análisis, ya que la cuantificación de antioxidantes se basa en la pendiente de la intensidad del color frente a la función de concentración de la muestra. Por lo tanto, es difícil realizar este método fuera de un laboratorio. Todo el análisis de color debe realizarse de forma externa, ya que no existe un método integrado de análisis de color y no se proporciona ninguna compensación para las diferentes condiciones de luz y propiedades de la cámara.

El documento núm. US 2013/0034908 A1 describe el uso de un reactivo de Folin-Ciocalteu en un dispositivo analítico de papel (PAD) para la detección de impurezas fenólicas en preparaciones farmacéuticas. Sin embargo, esta aplicación describe solo el procedimiento sí/no, y el análisis cuantitativo requeriría la preparación de una curva de calibración por parte del usuario. Por lo tanto, se requerirían habilidades y equipamiento de laboratorio. Aunque en este método podría usarse la cámara de un teléfono inteligente para capturar una imagen, todavía se necesita un dispositivo/programa informático externo que realice un análisis de color.

Por lo tanto, todavía existe la necesidad de un método de detección de polifenoles que permita una estimación rápida del contenido total de polifenoles en una muestra y, al mismo tiempo, sea fácil de usar y no requiera ninguna preparación especial previa.

Resumen de la invención

La invención proporciona un método de prueba de acuerdo con la reivindicación 1 para la determinación de la concentración de fenoles y polifenoles en alimentos líquidos a base de agua (tales como café, bayas, jugos, batidos de frutas o vino) con alta concentración de polifenoles. En el método de la invención, la prueba en papel se usa en combinación con un teléfono inteligente que se usa para la interpretación de los resultados. El papel de prueba se prepara empapando un material absorbente con el reactivo de Folin-Ciocalteu, previamente diluido con agua desionizada o con una solución de goma xantana al 1 %. La dilución del reactivo es de 10 a 20 veces.

El contenido de fenoles y polifenoles en los alimentos líquidos puede detectarse rápidamente al colocar una gota de jugo en el papel de prueba y luego agregar una gota de solución acuosa de carbonato de sodio. Después de un minuto de reacción, los resultados se interpretan mediante una aplicación de teléfono inteligente basada en la imagen registrada por la cámara de un teléfono inteligente. El papel de prueba es adecuado para medir rápidamente el contenido aproximado de polifenoles en productos de alimentos líquidos a base de agua (tales como bayas exprimidas y otras frutas, jugos, batidos de frutas, café, vino). La prueba en papel en combinación con la cámara de un teléfono inteligente y la aplicación móvil tiene las ventajas de un método simple, conveniente y rápido, con bajo costo y fácil implementación.

En otro aspecto, la invención proporciona un kit de prueba de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende papeles de prueba listos para usar, un frasco gotero que contiene una solución acuosa de carbonato de sodio, una tarjeta de colores, pipetas desechables y, opcionalmente, bolsas de plástico útiles para la toma de muestras.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación esquemática del papel de prueba colocado en una tarjeta de colores.

La Figura 2 presenta las curvas de calibración (valor del color frente a GAE) para los colores azul (a) y verde (b) obtenidos en el Ejemplo 1.

La Figura 3 es una fotografía de una muestra del Ejemplo 2 (cereza 1) en un papel de prueba colocado en una tarjeta de colores antes (a) y después (b) de la aplicación de solución de carbonato de sodio.

La Figura 4 es una fotografía de una muestra del Ejemplo 3 (cereza 2) en un papel de prueba colocado en una tarjeta de colores antes (a) y después (b) de la aplicación de solución de carbonato de sodio.

La Figura 5 presenta fotografías de una muestra del Ejemplo 4 (aronia) en un papel de prueba colocado en una tarjeta de colores después de la aplicación de la fotografía original de solución de carbonato de sodio (a) y dividida en canales RGB: rojo (b), verde (c) y azul (d).

La Figura 6 presenta un gráfico de correlación de los resultados obtenidos por el método de la invención y los resultados de las pruebas de laboratorio para diferentes muestras (Ejemplo 5).

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Dentro de esta solicitud de patente, generalmente se entiende que el papel de prueba significa cualquier material absorbente resistente a los ácidos, tales como papel de filtro duro, tela de filtro o tela no tejida, que se impregna con el reactivo de Folin-Ciocalteu diluido o sin diluir.

El reactivo de Folin-Ciocalteu es una mezcla ácida líquida de fosfomolibdato y fosfotungstato. Puede prepararse de acuerdo con la literatura (V. L. Singleton y otros, Methods in Enzymology, 1999, 299, 152-178, consulte página 155). Este reactivo también está fácilmente disponible de proveedores comerciales, por ejemplo, Sigma-Aldrich y P.O.Ch. Dentro de esta solicitud de patente, el término "teléfono inteligente" generalmente se entiende como una computadora personal móvil o una tableta que puede ejecutar componentes de programas informáticos de terceros y está equipada con una cámara digital a color. Se entenderá que a los efectos de la invención el teléfono inteligente puede sustituirse por una cámara independiente y cualquier medio informático capaz de ejecutar una aplicación de análisis de la fotografía tomada por una cámara.

La tarjeta de colores, también conocida como tarjeta de referencia de color, es una tarjeta de plástico o cartón resistente, con áreas de referencias rojas, verdes y azules (RGB) impresas en ella. Las áreas de referencia RGB se usan para la normalización del color durante el análisis del valor del color. Por lo tanto, la lectura del contenido de fenoles y polifenoles no depende, por ejemplo, de las condiciones de iluminación cuando se toma una fotografía de la muestra o de las características de la cámara.

Método de la invención

El método de prueba de la invención cubre un intervalo de 1 a 10 g/l de equivalentes de ácido gálico (GAE), lo que permite la evaluación directa del contenido de fenoles y polifenoles en el jugo en el punto, por ejemplo, en el campo o al hacer una decisión sobre la compra de una materia prima vegetal. Para evitar la comparación visual subjetiva de los colores con una tarjeta de colores estándar, los inventores proponen usar la cámara de un teléfono inteligente. Este dispositivo ahora ampliamente difundido permite la determinación del color de un cromógeno formado sin las interferencias del color de la muestra. Esto es especialmente importante en el caso de la fruta negra, tales como las bayas (por ejemplo, aronias, arándanos y similares), que, al mismo tiempo, son las más ricas en polifenoles. Contrariamente a los enfoques descritos anteriormente, el método de prueba de la invención no requiere ningún equipo adicional, ya que un teléfono inteligente es un dispositivo muy usado. Además, la implementación de la aplicación móvil en la prueba permite tener en cuenta la presencia de compuestos que interfieren, por ejemplo, vitamina C, ascorbato o azúcares reductores, y volver a calcular los datos teniendo en cuenta la relación promedio de polifenoles y compuestos que interfieren. Esto no es posible con el uso de una sola tira reactiva o un fotómetro. Los materiales de alimentos líquidos de los que se tomarán muestras pueden ser pulpa de fruta, jugo de fruta cruda, bebidas que contengan jugo de fruta, té (por ejemplo, té negro y verde), yerba mate, café, vino tinto, cerveza y otros líquidos coloreados que contengan fenoles y polifenoles de origen natural.

Materiales

El reactivo de Folin-Ciocalteu puede prepararse al mezclar, hervir y calentar a reflujo al menos tungstato de sodio, molibdato de sodio, ácido ortofosfórico y ácido clorhídrico con una adición posterior de sulfato de litio y bromo de acuerdo con el procedimiento de la literatura (para más detalles, consulte V. L. Singleton y otros, Methods in Enzymology, 1999, 299, 152-178, página 155).

El reactivo de Folin-Ciocalteu se diluye en una relación de 1:10 a 1:20 en volumen con agua desionizada o con una goma xantana al 1 % en agua desionizada.

El papel de prueba puede prepararse, ya sea en el punto o con anticipación, al impregnar un material absorbente con el reactivo de Folin-Ciocalteu diluido mencionado anteriormente. El papel de prueba también puede prepararse al aplicar una capa líquida del reactivo de Folin-Ciocalteu sin diluir a un material absorbente con una prensa. El papel de prueba puede secarse y almacenarse hasta su uso.

El lado inferior o ambos lados del papel de prueba pueden protegerse con una capa protectora de polímero impermeable, tales como plástico o quitosano. Debe permitirse una ventana para una gota de muestra en la capa protectora del anverso si ambos lados del papel de prueba están protegidos.

La solución alcalina es una solución de 20 % en peso de carbonato de sodio en agua desionizada. Preferentemente, se envasa en un frasco gotero, para ser convenientemente dosificado.

Equipamiento

En general, puede usarse cualquier modelo de teléfono inteligente si puede ejecutar componentes de programas informáticos de terceros y está equipado con una cámara digital a color. En los ejemplos que se especifican a continuación, se usó un Asus Zenfone GO, con sistema operativo Android 5.1.

Medición

El ensayo puede realizarse a temperatura ambiente. En general, se coloca una gota de la muestra en el papel de prueba y una gota de la solución alcalina en el mismo lugar del papel de prueba. La muestra es una muestra líquida, tal como jugo de frutas (por ejemplo, jugo recién exprimido de frutas o comercialmente disponible), productos de frutas (por ejemplo, batidos de frutas), vino, café preparado o té. Es importante que cualquier partícula de fruta presente en el papel de prueba se elimine antes del análisis, ya que las partículas pueden interferir con la interpretación del color.

Después de 1 a 3, 4, 5 o 6 minutos, el papel de prueba se coloca en la tarjeta de colores para que el área de reacción esté al lado de las áreas de color RGB. La Figura 1 presenta una representación esquemática del papel de prueba colocado en una tarjeta de colores. Luego se toma una foto del punto de prueba junto con las áreas RGB y la imagen se analiza mediante el uso de una aplicación de teléfono inteligente dedicada. Este análisis también se denomina en la presente descripción análisis en el esquema RGB. Como resultado se obtiene la concentración aproximada de polifenoles totales.

En lugar de realizar el análisis mediante el uso de la aplicación del teléfono inteligente, la foto puede enviarse para su análisis al dispositivo informático remoto.

Principio de análisis

La ubicación del punto de prueba y las áreas RGB se identifican primero en la foto obtenida. Luego, los colores se convierten al esquema rGb estándar (codificación de color de 8 bits para cada canal de color, intervalo de intensidad de 0 a 255) y se promedia cada canal de color. Durante el análisis, el color se normaliza con respecto a las áreas RGB en la tarjeta de referencia de color. Luego, los colores se comparan con una curva estándar obtenida por calibración mediante el uso de concentraciones conocidas de ácido gálico, y se calcula el equivalente de ácido gálico (GAE, en g/l).

En general, se tiene en cuenta el componente del canal azul, ya que su intensidad se corresponde estrechamente con el complejo de color que es producto de la reacción de Folin-Ciocalteu. Inesperadamente, el color intrínseco del jugo de fruta, que hace que la estimación visual sea prácticamente imposible, no interfiere con el método de análisis descrito anteriormente, si se analiza el componente del canal azul del punto de prueba.

Existen dos tipos de muestras que pueden analizarse por el método de la invención:

1) El primero con colores débiles (que no interfieren con la interpretación del color de una reacción de polifenoles con un reactivo en un papel de prueba); y

2) El segundo con colores fuertes (algunas cerezas, fresas, batidos, etc.), que perturban el análisis y conducen a una sobreestimación de los resultados.

Es por eso que se introduce una etapa adicional de interpretación del color en el método de la invención: el análisis del color de la gota de muestra antes de añadir la solución de carbonato de sodio. Por lo tanto, la imagen de un papel de prueba debe tomarse dos veces: antes y después de añadir la solución de carbonato de sodio. La foto tomada antes de la adición de la solución de carbonato de sodio se somete al análisis de color y se determina el valor del color azul. Si el color natural de la muestra no altera el intervalo de contenido de polifenoles (es decir, el valor obtenido para la primera imagen es 0), el análisis se realiza con respecto a la curva de calibración de color azul y la imagen tomada después de la adición de la solución de carbonato de sodio se analiza con respecto al valor del color azul, en base al cual se determina el contenido de polifenoles en la muestra.

Si la muestra de color natural altera el intervalo de contenido de polifenoles (es decir, el valor obtenido para la primera imagen es >0), el análisis se realiza con respecto a la curva de calibración de color verde. Se analiza la diferencia entre el color verde después de la adición de la solución de carbonato de sodio y el color verde antes de la adición de la solución de carbonato de sodio.

Usos

El método de la invención es útil para la determinación de la concentración de polifenoles y fenoles totales en líquidos acuosos, especialmente para las muestras de alimentos líquidos, que tienen altas concentraciones de polifenoles (1-10 g/l GAE), sin necesidad de dilución de la muestra, e independientemente del color de la muestra. El método inventivo es particularmente adecuado para:

• evaluar el material de la fruta antes de la compra;

• determinar el momento adecuado para la recolección de la fruta;

• seguir el procesamiento de frutas (para tecnólogos de alimentos en plantas de procesamiento de frutas) • verificar la calidad de los productos de frutas caseros o disponibles comercialmente por parte de los consumidores.

Ejemplos

Ejemplo 1 Curvas de calibración

Las curvas de calibración se obtuvieron con base en una solución etanólica de ácido gálico (un compuesto de referencia) con una concentración en el intervalo de 0 a 10 g/l. Para cada concentración del compuesto de referencia se realiza un análisis de color como se describe anteriormente. En resumen, se coloca una gota de solución estándar en el campo de reacción del papel de prueba, es decir, el papel impregnado con el reactivo de Folin-Ciocalteu diluido como se describe anteriormente en la sección "Materiales" de la presente descripción. A continuación, se pone una gota de la solución alcalina (es decir, 20 % en peso de carbonato de sodio en agua desionizada) en el mismo lugar del papel de prueba. El papel de prueba se coloca en una tarjeta de referencia de color y después de 4, 5 y 6 minutos de la reacción se toman las fotografías con un teléfono inteligente y cada una de las imágenes se analiza en el esquema RGB mediante el uso de la aplicación del teléfono inteligente, en donde se normaliza el color de acuerdo con la tarjeta de referencia de color.

Los valores del color azul y verde se registran para cada concentración de compuesto de referencia y los valores promedio se representan frente a la concentración de compuesto de referencia, lo que da como resultado curvas de calibración para el color AZUL y VERDE en RGB. Las curvas de calibración representativas de color azul (a) y verde (b) se presentan en la Figura 2.

Ejemplo 2 Contenido de polifenoles en cereza 1 - muestra de color débil

Se coloca una gota de jugo de cereza en el campo de reacción del papel de prueba como se describe para una solución de compuesto de referencia en el Ejemplo 1. Antes de añadir la solución alcalina, se toma una fotografía de una muestra en el papel de prueba en la tarjeta de referencia de color como se muestra en la Figura 3a. La imagen de muestra se somete a un análisis de color en esquema RGB y se calcula el valor del color azul para la muestra. El valor del color azul obtenido para la imagen indica que el contenido de polifenoles detectado antes de la reacción es igual a 0 (es decir, el valor del color azul no altera el intervalo de contenido de polifenoles). Se coloca una gota de la solución alcalina descrita en el Ejemplo 1 sobre la muestra en el papel de prueba, y se toman las fotografías a los 4, 5 y 6 minutos de la reacción. En la Figura 3b se presenta una imagen ilustrativa de la muestra después de añadir la solución alcalina. Cada una de las imágenes se analiza en esquema RGB mediante el uso de la aplicación del teléfono inteligente y se determina un valor del color azul. En referencia a la curva de calibración de color azul, se determina la cantidad de polifenoles.

La Tabla 1, más abajo, presenta los valores de colores registrados para la muestra antes de aplicar la solución alcalina, así como también para las muestras después de 4, 5 y 6 minutos de iniciada la reacción. En la última columna de la tabla se presenta la cantidad determinada de polifenoles en g GAE/l.

Tabla 1

La misma muestra se analizó mediante el uso de un ensayo espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu y el contenido de polifenoles determinado ascendió a 1,355 g GAE/l. Esto muestra una buena correlación de los resultados obtenidos por el método de la invención con los resultados del ensayo espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu.

Ejemplo 3 Contenido de polifenoles en cereza 2 - muestra de color fuerte

Se coloca una gota de jugo de cereza en el campo de reacción del papel de prueba como se describe en el Ejemplo 2. Antes de añadir la solución alcalina, se toma una fotografía de una muestra en el papel de prueba en la tarjeta de referencia de color como se muestra en la Figura 4a. La imagen de muestra se somete a un análisis de color en esquema RGB y se calcula el valor del color azul para la muestra. El valor del color azul obtenido para la imagen indica que el contenido de polifenoles detectado antes de la reacción es igual a 4 (es decir, el valor del color azul obtenido influiría en la lectura del contenido de polifenoles). El análisis procede como se describe en el Ejemplo 2, es decir, se añade una gota de la solución alcalina y se toman las fotografías a los 4, 5 y 6 minutos de la reacción. Sin embargo, para el análisis del contenido de polifenoles, la aplicación se refiere a la curva de calibración de color verde y también usa las diferencias en los valores del color verde registrados para la muestra antes y después de añadir la solución alcalina.

La Tabla 2, a continuación, presenta los valores de colores registrados para la muestra antes de aplicar la solución alcalina, así como también para las muestras después de 4, 5 y 6 minutos de iniciada la reacción. En la última columna de la tabla se presenta la cantidad determinada de polifenoles en g GAE/l.

Tabla 2

Por tanto, la cantidad de polifenoles en la muestra calculada mediante el método de la invención ascendió a 3. El resultado de un análisis de ensayo espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu para la misma muestra fue de 2,885 g GAE/l, lo que muestra una buena correlación entre los dos métodos.

Ejemplo 4 Contenido de polifenoles en aronia negra

Varias frutas de aronia negra (Aronia melanocarpa) se colocan en una bolsa de plástico y se exprimen para obtener un poco de jugo. Se transfiere una gota del jugo de la bolsa a un papel de prueba, como se describe en los ejemplos anteriores, mediante el uso de una pipeta de plástico de un solo uso (70 gotas por mililitro).

Se coloca una gota de la solución alcalina en el punto marcado por el jugo en el papel de prueba del frasco gotero. Después de 3 minutos, el papel de prueba se coloca en la tarjeta de referencia de color junto a las áreas RGB. Luego se toma una foto a color y la imagen se analiza por la aplicación móvil.

El análisis se ilustra en la Figura 5, donde se presentan la fotografía original (a), así como también la fotografía dividida en canales RGB (b - d). Los datos también se resumen en la Tabla 3 más abajo.

Tabla 3

La aplicación para teléfonos inteligentes vuelve a calcular los resultados del análisis para obtener la concentración de fenoles y polifenoles totales presentes en la muestra (en referencia a las curvas de calibración).

Para esta muestra, se encontró que el contenido total de polifenoles en el jugo de aronia negra era de 7,0 g/l de equivalentes de ácido gálico.

Ejemplo 5 Análisis de otras muestras y correlación de resultados

Como se ha descrito anteriormente, se realizó el análisis correspondiente para muchos productos diferentes. La Tabla 4 más abajo presenta datos para algunas de las muestras obtenidas mediante el uso del método de la invención (prueba SmartBerriese). A modo de comparación, también se presentaron los resultados de un análisis de ensayo espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu para la misma muestra.

Tabla 4

Los resultados obtenidos mediante el uso del método de ensayo de la invención se representaron frente a los resultados obtenidos en el ensayo espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu. La correlación de los resultados se presenta en la Figura 6. El método de la invención, aunque de uso muy simple, muestra una buena correlación con los resultados obtenidos mediante el uso del ensayo espectrofotométrico tradicional. Esto demuestra que el método de la invención puede usarse con éxito para el análisis del contenido de fenoles y polifenoles.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un método de ensayo para el análisis de la concentración total de fenoles y polifenoles en muestras líquidas acuosas, que comprende las etapas de

(a) poner una gota de la muestra sobre el papel de prueba previamente impregnado con el reactivo de Folin-Ciocalteu lo que forma de este modo un punto de prueba;

(b) añadir una gota de una solución alcalina acuosa al punto de prueba en el papel de prueba;

(c) colocar el papel de prueba en la tarjeta de color de referencia con el punto de prueba cerca de las áreas de referencia roja, verde y azul impresas en la tarjeta de color de referencia;

(d) tomar una fotografía en color del punto de prueba en el papel de prueba junto con las áreas roja, verde y azul en la tarjeta de color de referencia;

(e) realizar el análisis de color de la fotografía en el esquema RGB, normalizado en referencia a las áreas roja, verde y azul en la tarjeta de color de referencia, y obtener la medición del valor del color;

(f) evaluar la concentración total de fenoles y polifenoles basada en mediciones de valor del color rojo, verde y azul, preferentemente verde y azul.

2. El método de ensayo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde después de la etapa (a) de colocar una gota de la muestra en el papel de prueba y antes de la etapa (b) de añadir una solución alcalina acuosa al punto de prueba, se realizan las siguientes etapas:

(aa) colocar el papel de prueba en la tarjeta de color de referencia con el punto de prueba cerca de las áreas de referencia roja, verde y azul impresas en la tarjeta de color de referencia;

(ab) tomar una fotografía en color del punto de prueba en el papel de prueba junto con las áreas roja, verde y azul en la tarjeta de color de referencia;

(ac) realizar un análisis de color de la fotografía en el esquema RGB normalizado en referencia a las áreas roja, verde y azul en la tarjeta de color de referencia y determinar el valor del color azul de la muestra, en donde si dicho valor del color azul no interfiere con el intervalo de contenido de polifenoles, dicho contenido de polifenoles se estima en base al valor del color azul, caso contrario se estima en base al valor del color verde obtenido como diferencia de los valores del color verde para las fotografías tomadas en la etapa (ab) y (d).

3. El método de ensayo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el análisis en la etapa (ac) y (e) se lleva a cabo mediante el uso de medios informáticos capaces de ejecutar una aplicación para el análisis de la fotografía en el esquema RGB.

4. El método de ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en donde se toman las fotografías y se llevan a cabo los análisis de color de dichas fotografías mediante el uso del mismo dispositivo.

5. El método de ensayo de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el dispositivo es un teléfono inteligente.

6. El método de ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en donde la muestra se selecciona de jugo de fruta cruda, bebidas que contienen jugo, té verde, té negro, yerba mate, café, vino tinto y cerveza.

7. El método de ensayo de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la muestra es jugo de fruta cruda recién exprimido.

8. El método de ensayo de acuerdo con cualquier reivindicación 1 - 7, en donde la fotografía en la etapa (d) se toma 1 - 7 minutos después de realizar la etapa (b).

9. El método de ensayo de acuerdo con cualquier reivindicación 1 - 8, en donde la solución alcalina acuosa de la etapa (b) es una solución de carbonato de sodio.

10. El método de ensayo de acuerdo con cualquier reivindicación 1 - 9, en donde el papel de prueba se obtiene al impregnar un material absorbente resistente a los ácidos con el reactivo de Folin-Ciocalteu diluido o sin diluir y se seca.

11. El método de ensayo de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el material absorbente resistente a los ácidos se selecciona de un grupo que comprende papel de filtro duro, tela de filtro o tela no tejida.

12. El método de ensayo de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en donde el reactivo de Folin-Ciocalteu se diluye en un intervalo de 10-20 veces con agua desionizada o solución de goma xantana al 1 %.

13. Un kit de prueba para la determinación de la concentración total de fenoles y polifenoles en líquidos acuosos, que comprende:

Uno o más papeles de prueba obtenidos por impregnación de un material absorbente resistente a los ácidos con el reactivo de Folin-Ciocalteu diluido o sin diluir y se seca;

Una o más pipetas desechables;

Solución de carbonato de sodio en agua desionizada, contenida en un frasco gotero;

caracterizado porque además comprende una tarjeta de colores de referencia, con áreas rojas, verdes y azules impresas en la misma.

14. El kit de prueba de acuerdo con la reivindicación 13 que además comprende una o más bolsas de plástico desechables para exprimir el jugo de las frutas.