ES2913759T3 - Método y dispositivo para controlar el nivel de llenado en una cámara - Google Patents
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Abstract
Método para controlar el nivel de llenado de una suspensión de células, derivados celulares, orgánulos, partículas subcelulares y/o vesículas dentro de al menos una cámara de un dispositivo para aplicar un campo eléctrico a la suspensión, comprendiendo dicho dispositivo al menos un primer y un segundo electrodo, al menos un puerto de entrada dispuesto en un extremo de la cámara, y al menos un puerto de salida dispuesto en el extremo opuesto de la cámara, en donde el primer electrodo está dispuesto dentro de la cámara en el puerto de entrada y el segundo electrodo está dispuesto dentro de la cámara en el puerto de salida, y en donde la cámara comprende, además, al menos un electrodo de puesta a tierra, comprendiendo dicho método: a) iniciar un procedimiento de llenado en el que la suspensión se carga en la cámara a través del puerto de entrada; b) medir la resistencia eléctrica dentro de la cámara durante el procedimiento de llenado en varios momentos; e c) iniciar una rutina de terminación que comprende terminar el procedimiento de llenado, en donde la rutina de terminación se inicia dependiendo de al menos un cambio de la resistencia eléctrica, caracterizado por que la resistencia eléctrica se mide entre el segundo electrodo y el electrodo de puesta a tierra, en donde el procedimiento de llenado se termina si se cumplen las condiciones de terminación, comprendiendo dichas condiciones de terminación: - una primera pendiente de un cambio de la resistencia supera un primer umbral predeterminado, y - una segunda pendiente de un cambio de la resistencia alcanza un segundo umbral predeterminado, en donde el segundo umbral representa una pendiente que es inferior a la pendiente representada por el primer umbral.
Description
DESCRIPCIÓN
Método y dispositivo para controlar el nivel de llenado en una cámara
Antecedentes de la invención
La invención se refiere a un método para controlar el nivel de llenado de una suspensión de células, derivados celulares, orgánulos, partículas subcelulares y/o vesículas dentro de al menos una cámara de un dispositivo para aplicar un campo eléctrico a la suspensión. La invención también se refiere a un dispositivo para aplicar un campo eléctrico a una suspensión de células, derivados de células, orgánulos, partículas subcelulares y/o vesículas dentro de al menos una cámara, que comprende al menos un primer y un segundo electrodo, al menos un puerto de entrada dispuesto en un extremo de la cámara, y al menos un puerto de salida dispuesto en el extremo opuesto de la cámara, en donde el primer electrodo está dispuesto dentro de la cámara en el puerto de entrada y el segundo electrodo está dispuesto dentro de la cámara en el puerto de salida, y en donde la cámara comprende, además, al menos un electrodo de puesta a tierra.
La introducción de moléculas biológicamente activas, por ejemplo, ADN, ARN o proteínas, en células vivas, derivados celulares, orgánulos, partículas subcelulares y/o vesículas puede, por ejemplo, servir para examinar las funciones biológicas de estas moléculas y es, además, una condición previa esencial para el éxito del uso terapéutico de estas moléculas, por ejemplo, en terapia génica. Un método preferido para introducir moléculas externas en las células es la denominada electroporación, que, a diferencia de los métodos químicos, limita los cambios no deseados en la estructura y función de la célula diana. En la electroporación, las moléculas externas se introducen en las células a partir de una solución acuosa, preferiblemente una solución tampón específicamente adaptada a las células, o un medio de cultivo celular, a través de un flujo de corriente corto, es decir, el pulso de un condensador de descarga que vuelve la membrana celular transitoriamente permeable a las moléculas externas. Los "poros" temporales que se forman en la membrana celular permiten que las moléculas biológicamente activas lleguen primero al citoplasma en el que ya pueden realizar su función o ejercer alguna acción terapéutica a examinar, y luego, en determinadas condiciones, llegar también al núcleo celular como se requiere, por ejemplo, en aplicaciones de terapia génica. Debido a una aplicación corta de un campo eléctrico fuerte, es decir, un pulso corto con una alta densidad de corriente, también se pueden fusionar células, derivados de células, orgánulos, partículas subcelulares y/o vesículas. En esta llamada electrofusión, las células se ponen, por ejemplo, inicialmente en estrecho contacto con la membrana mediante un campo eléctrico alterno no homogéneo. La aplicación subsiguiente de un pulso de campo eléctrico conduce a la interacción entre las partes de la membrana, lo que finalmente da como resultado la fusión. Dispositivos comparables a los que se usan para la electroporación también se pueden usar para la electrofusión.
Durante la electroporación de células, se genera una cierta cantidad de residuos y espuma dentro de la cámara de reacción. Cuando la suspensión celular procesada se extrae de la cámara de reacción, por ejemplo, empujando con aire o dejando que la gravedad drene la cámara, estos residuos y espuma permanecen dentro de la cámara y reducen el volumen de llenado para una nueva suspensión celular que se va a rellenar en esta cámara para otro ciclo de electroporación. Es decir, el volumen de la cámara puede variar y, por lo tanto, hacer que el volumen necesario para el siguiente llenado sea casi impredecible. Para evitar el sobrellenado de la cámara con material precioso que no se procesaría de esta manera es importante, por lo tanto, limitar dinámicamente en consecuencia la cantidad que se rellena en la cámara. Sin embargo, el llenado de menor volumen de forma preventiva para evitar el sobrellenado está provocando un llenado insuficiente que favorece la generación de descargas de arco en la interfase aire-líquido. Las descargas de arco generan calor y altas corrientes que pueden dañar las interfaces y los componentes eléctricos, pero también dañan el material biológico dentro de la cámara de reacción. Además, el usuario final del sistema está insertando la tubería con una tensión indefinida en la tubería, lo que da como resultado un diámetro interior desconocido. Si se utilizan bombas peristálticas, esto genera nuevamente una incertidumbre en el volumen procesado por rotación de la bomba. Por lo tanto, se debe lograr un llenado exacto para un buen rendimiento de electroporación reproductiva.
El documento de patente europea EP 3 138 920 B1 describe un método para la electroporación de células y un dispositivo desechable para la electroporación. El dispositivo incluye un departamento de fluido para recibir una suspensión de células y un fluido que comprende un compuesto para ser transferido a las células. El dispositivo incluye, además, un primer y un segundo electrodo así como los correspondientes electrodos de puesta a tierra. Los fluidos se introducen en el compartimento de fluido hasta un nivel de llenado predefinido, en donde el nivel de llenado se determina midiendo la capacitancia entre el primer y el segundo electrodo o la resistencia eléctrica entre los electrodos de puesta a tierra. El llenado continúa, por ejemplo, hasta que se alcanza la capacidad máxima entre los electrodos. Después de la electroporación, la suspensión de células procesadas se elimina del departamento de fluido. Al controlar el nivel de llenado del compartimiento de fluido, el dispositivo puede funcionar en un modo semicontinuo. Además, para tratar volúmenes mayores de la suspensión celular, se puede repetir el proceso de llenado, electroporación y limpieza.
El documento de patente de EE.UU. US 2014/0220665 A1 describe un aparato para mezclar células y material exógeno para entregar el material exógeno a las células usando electroporación. El aparato incluye una cámara que se puede usar para electroporar el contenido de la cámara después de mezclar. Las suspensiones de células que pueden estar contaminadas con enzimas degradantes se almacenan por separado de los líquidos a base de agua que
contienen el material exógeno. El contacto de los dos líquidos a base de agua (suspensión celular y material exógeno) se produce primero dentro de la cámara. La cámara tiene dos o más puertos de entrada para permitir la entrada separada de líquidos a base de agua. Otros dos puertos son puertos de ventilación y salida. El interior de la cámara permite el flujo de todos los líquidos a base de agua por el mismo lado de la cámara y las esquinas curvas para redirigir la dirección del flujo y mezclar suavemente los líquidos a base de agua. La cámara también incluye electrodos como paredes de la cámara para la electroporación del contenido de la cámara.
Sin embargo, si se tienen que realizar múltiples ciclos de electroporación, sigue siendo un inconveniente de los dispositivos y métodos de la técnica anterior que no se puede garantizar el llenado exacto de la cámara de electroporación para todos los ciclos.
Compendio de la invención
Es un objeto de la invención proporcionar un método y un dispositivo para controlar el nivel de llenado de una suspensión de células, derivados de células, orgánulos, partículas subcelulares y/o vesículas dentro de al menos una cámara de un dispositivo para aplicar un campo eléctrico a la suspensión, con los que se puede evitar el sobrellenado de la cámara, incluso si se realizan múltiples ciclos de electroporación, y se puede lograr un llenado exacto, incluso en un entorno de volumen de cámara impredecible, para garantizar un buen rendimiento de electroporación reproductiva para todos los ciclos .
El objeto se logra mediante un método para controlar el nivel de llenado de una suspensión de células, derivados de células, orgánulos, partículas subcelulares y/o vesículas dentro de al menos una cámara de un dispositivo para aplicar un campo eléctrico a la suspensión, en donde el dispositivo comprende al menos un primer y un segundo electrodo, al menos un puerto de entrada dispuesto en un extremo de la cámara y al menos un puerto de salida dispuesto en el extremo opuesto de la cámara, en donde el primer electrodo está dispuesto dentro de la cámara en el puerto de entrada y el segundo electrodo está dispuesto dentro de la cámara en el puerto de salida, y en donde la cámara comprende, además, al menos un (contra)electrodo de puesta a tierra, comprendiendo este método:
a) Iniciar un procedimiento de llenado en donde la suspensión se carga en la cámara a través del puerto de entrada;
b) Medir la resistencia eléctrica dentro de la cámara durante el procedimiento de llenado en varios momentos; e
c) Iniciar una rutina de terminación que comprende terminar el procedimiento de llenado, en donde la rutina de terminación se inicia dependiendo de al menos un cambio de la resistencia eléctrica entre el segundo electrodo y el electrodo de puesta a tierra,
midiéndose la resistencia eléctrica entre el segundo electrodo y el electrodo de puesta a tierra, en donde el procedimiento de llenado finaliza si se cumplen las condiciones de terminación, comprendiendo dichas condiciones de terminación:
- una primera pendiente de un cambio de la resistencia supera un primer umbral predeterminado, y
- una segunda pendiente de un cambio de la resistencia alcanza un segundo umbral predeterminado, en donde el segundo umbral representa una pendiente que es inferior a la pendiente representada por el primer umbral.
Es decir, según la invención, la cantidad de suspensión que llena la cámara se limita dinámicamente en el curso de varios ciclos de electroporación determinando al menos un cambio de la resistencia eléctrica en el puerto de salida. Para ello, la resistencia entre el segundo electrodo y el electrodo de puesta a tierra, por ejemplo, entre el electrodo dispuesto junto al puerto de salida y su contraelectrodo, se mide durante el proceso de llenado de cada ciclo en varios momentos. Una vez que se detecta un cambio de resistencia, se inicia la rutina de terminación y, opcionalmente, después de una rutina de terminación diferida, finalmente se termina el procedimiento de llenado. Según la invención, la cantidad de suspensión que llena la cámara se limita dinámicamente determinando los alcances de los cambios de la resistencia eléctrica. Es decir, si la pendiente del cambio de resistencia disminuye, se inicia la rutina de terminación y, opcionalmente después de una rutina de terminación diferida, finalmente se termina el procedimiento de llenado. En consecuencia, una vez que se determina que la pendiente del cambio de resistencia supera un determinado umbral preestablecido (primer umbral), el sistema de control del dispositivo espera a que la pendiente vuelva a disminuir hasta alcanzar otro determinado umbral preestablecido (segundo umbral). Como resultado, se puede evitar el sobrellenado de la cámara, incluso si el volumen de llenado de la cámara se reduce continuamente en el transcurso de múltiples ciclos de electroporación. De este modo se asegura el llenado exacto de la cámara durante cada ciclo de electroporación, de manera que se puede garantizar un mejor rendimiento de la electroporación reproductiva. Otra ventaja del método según la invención es que se puede evitar de manera efectiva un desperdicio de material biológico precioso y costoso.
En una realización ventajosa de la invención, la rutina de terminación se inicia cuando la resistencia eléctrica ha alcanzado un valor predeterminado. En los casos en los que los desechos, los residuos y las burbujas puedan provocar la activación del algoritmo de la rutina de finalización demasiado pronto, se puede introducir un umbral determinado empíricamente para diferenciar entre los efectos de la muestra real y de los residuos. En esta realización, la rutina de finalización sólo se inicia después de que se alcance un valor de resistencia predeterminado y/o la resistencia haya
caído por debajo de este valor. Por ejemplo, una vez que la resistencia cae por debajo de cierto límite (valor predeterminado), el sistema de control del dispositivo activa el inicio de la rutina de terminación.
En otra realización ventajosa de la invención, las condiciones de terminación comprenden, además, que una tercera pendiente de un cambio de la resistencia, que se determina después de la segunda pendiente, es igual o se encuentra por debajo del segundo umbral. En consecuencia, el procedimiento de llenado sólo finaliza si se alcanza o no se alcanza el segundo umbral durante al menos dos medidas consecutivas para reducir las imprecisiones causadas por variaciones de medición.
En otra realización ventajosa de la invención, la rutina de terminación comprende una terminación diferida después de que se haya determinado que se cumplen las condiciones de terminación, en donde el procedimiento de llenado continúa antes de la terminación final basándose en al menos un parámetro preestablecido. Mediante esta medida, las variaciones determinadas empíricamente en la correlación de la resistencia y el nivel de llenado pueden compensarse de manera efectiva. Es decir, el procedimiento de llenado continúa hasta que se compensan las desviaciones de la cantidad de llenado perfecta, que aumentan constantemente de llenado a llenado.
Por ejemplo, el parámetro preestablecido puede comprender varios pasos realizados por una bomba peristáltica. Sin embargo, cualquier bomba (tales como bombas de infusión o jeringa) que sea capaz de controlar con precisión la cantidad de líquido procesado puede usarse en el método según la invención. El número de pasos de una bomba peristáltica (motor paso a paso) se puede calcular, por ejemplo, mediante la ecuación N_objetivo = (N_p N_sts) / 2 P, donde N_objetivo es el número calculado de pasos necesarios para completar el procedimiento de llenado, N_p es el número de pasos realizados durante el procedimiento de llenado previo, N_sts es el número de pasos objetivo de detección estándar actual y P es un número de pasos determinado empíricamente. La expresión "pasos objetivo de detección estándar actual" como se usa en esta memoria se refiere al número objetivo de pasos (que se correlacionan con las rotaciones de la bomba y, por lo tanto, con el volumen) calculados independientemente sólo a partir de la información del ciclo de llenado actual. Esta cantidad de pasos y la cantidad de pasos del ciclo previo, luego, se promedian/suavizan debido a las variaciones naturales causadas por la muestra.
Si se establece que todavía hay una desviación de la cantidad de llenado perfecta, este problema se puede abordar agregando más pasos (N) de la bomba peristáltica al llenado. En consecuencia, el número de pasos de una bomba peristáltica se puede calcular, por ejemplo, mediante la ecuación N_objetivo = ((N_ahora S - R) N_p) / 2 P - N, donde N_objetivo es el número calculado de pasos necesarios para completar el procedimiento de llenado, N_ahora es el número actual de pasos, S es un número preestablecido (determinado empíricamente) de pasos, R es un número preestablecido de pasos que se correlaciona con la energía de un pulso de voltaje eléctrico, N_p es el número de pasos realizados durante el procedimiento de llenado previo, P es un número de pasos determinado empíricamente, y N es el número de (todos los previos) procedimientos de llenado (ciclos) multiplicado por 20. El término "actual" como se usa en esta memoria se refiere al número real de pasos de bomba realizados hasta ahora durante un llenado en curso cuando se cumplen todos los criterios de llenado para este llenado y el sistema de control del dispositivo sólo tiene que calcular/predecir los pasos restantes necesarios para un llenado correcto.
En otra realización ventajosa de la invención, se inicia un procedimiento de entrega inicial antes de que comience el procedimiento de llenado, comprendiendo dicho procedimiento de entrega mezclar la suspensión de células, derivados celulares, orgánulos, partículas subcelulares y/o vesículas con un sustrato o sonda en un punto de mezclado aguas arriba del puerto de entrada, y cargar la mezcla o la suspensión a través del puerto de entrada en la cámara hasta que se detecta una caída de resistencia en el primer electrodo, en donde la resistencia eléctrica se mide dentro de la cámara entre el primer electrodo y electrodo de puesta a tierra durante el procedimiento de entrega inicial en varios momentos. Es decir, en este proceso de "cebado" se mide la resistencia entre el primer electrodo y el electrodo de puesta a tierra, por ejemplo, entre el electrodo dispuesto junto al puerto de entrada y su contraelectrodo. Si la resistencia eléctrica infinita de una cámara de electroporación vacía desciende a un valor inferior, se indica de forma fiable que el líquido (suspensión/mezcla) ha llegado al electrodo más cercano al puerto de entrada. Mezclar la suspensión con la sonda aguas arriba del puerto de entrada y medir la resistencia en el puerto de entrada asegura que la suspensión esté perfectamente preparada para la electroporación antes de que se introduzca en la cámara para que sea independiente de la longitud del tubo, las propiedades ópticas de la suspensión celular y para evitar medidas más complejas, tales como métodos capacitivos, durante el proceso de cebado. En particular, el (los) electrodo(s) en el puerto de entrada de la cámara de reacción se usan para detectar cambios eléctricos basados en líquido dentro de la cámara para determinar cuándo una primera porción del líquido ha llegado a la cámara de reacción.
En esta realización, la caída de resistencia detectada en el primer electrodo puede comprender una disminución de la resistencia eléctrica en el rango de 5 a 15 Ohmios, preferiblemente alrededor de 10 Ohmios. En consecuencia, el umbral de resistencia para la detección de líquido basada en la resistencia de la suspensión celular en el puerto de entrada debe ser, por ejemplo, aproximadamente 10 Ohmios por debajo del valor de medida de resistencia inicial al comienzo del cebado. Tan pronto como la resistencia medida en el primer electrodo caiga en estos 10 Ohmios, la suspensión se considerará detectada.
Para garantizar la mezcla completa de la suspensión con el sustrato o la sonda, el procedimiento de entrega inicial comprende, además, detener la carga de la suspensión en la cámara cuando se detecta la caída de la resistencia y luego retraer la suspensión al punto de mezcla donde se mezcla la suspensión con el sustrato o la sonda antes de
iniciar el procedimiento de llenado. Con esta medida se asegura que la suspensión se mezcle perfectamente con el sustrato o sonda antes de que entre en la cámara para la electroporación.
El procedimiento de entrega inicial, si lo hay, sólo se realiza una vez antes de que comience el primer procedimiento de llenado.
Para realizar la electroporación, el campo eléctrico se aplica a la suspensión dentro de la cámara suministrando al menos un pulso de voltaje a través de al menos un electrodo después de terminar el procedimiento de llenado. El llenado de la cámara con la suspensión y el suministro subsiguiente de al menos un pulso de voltaje pueden repetirse durante un número de ciclos predefinido. En consecuencia, a diferencia de un proceso por lotes, se pueden tratar grandes volúmenes de la suspensión mediante la electroporación repetida continuamente de partes alícuotas de la suspensión en una especie de proceso semicontinuo.
El objeto se cumple, además, con un dispositivo para aplicar un campo eléctrico a una suspensión de células, derivados de células, orgánulos, partículas subcelulares y/o vesículas dentro de al menos una cámara, que comprende al menos un primer y un segundo electrodo, al menos un puerto de entrada dispuesto en un extremo de la cámara, y al menos un puerto de salida dispuesto en el extremo opuesto de la cámara, en donde el primer electrodo está dispuesto dentro de la cámara en el puerto de entrada y el segundo electrodo está dispuesto dentro de la cámara en el puerto de salida, y en donde la cámara comprende, además, al menos un (contra) electrodo de puesta a tierra. Según la invención, al menos el segundo electrodo es un primer electrodo sensor para medir la resistencia eléctrica dentro de la cámara entre el segundo electrodo y el electrodo de puesta a tierra. Controlando la resistencia eléctrica en el puerto de salida, se puede evitar el sobrellenado de la cámara, incluso si el volumen de llenado de la cámara se reduce continuamente en el transcurso de múltiples ciclos de electroporación. De este modo se asegura el llenado exacto de la cámara durante cada ciclo de electroporación, de manera que se puede garantizar un mejor rendimiento de la electroporación reproductiva. Otra ventaja del dispositivo de acuerdo con la invención es que se puede evitar de manera efectiva un desperdicio de material biológico precioso y costoso.
En una realización ventajosa del dispositivo según la invención, el primer electrodo es un segundo electrodo sensor para medir la resistencia eléctrica dentro de la cámara entre el primer electrodo y el (contra) electrodo de puesta a tierra. Controlando la resistencia eléctrica en el primer electrodo, se puede indicar de manera fiable que el líquido (suspensión) ha llegado al electrodo más cercano al puerto de entrada. En particular, el (los) electrodo(s) en el puerto de entrada de la cámara de reacción se usan para detectar cambios eléctricos basados en líquido dentro de la cámara para determinar cuándo una primera porción del líquido ha llegado a la cámara de reacción.
La invención se describe adicionalmente, a modo de ejemplo, en detalle con referencia a las figuras.
Breve descripción de las figuras.
La Figura 1 muestra un diagrama de flujo que representa procedimiento ejemplar de manipulación de suspensión del método según la invención.
La Figura 2 muestra un diagrama de flujo que representa una secuencia ejemplar del procedimiento de entrega inicial ("cebado") del método según la invención.
La Figura 3 muestra un diagrama de flujo que representa un ejemplo de realización del método según la invención que incluye un procedimiento de llenado y una rutina de terminación.
La Figura 4 muestra un diagrama que representa un curso ejemplar de la resistencia eléctrica durante un procedimiento de llenado medido por un electrodo en el puerto de salida de un dispositivo según la invención.
el eje X muestra el número de medidas realizadas (intervalo: alrededor de 33 pasos de una bomba de motor paso a paso);
el eje Y muestra la resistencia eléctrica medida [Ohmios].
La Figura 5 muestra una vista en perspectiva del lado exterior de un ejemplo de realización de un dispositivo según la invención.
La Figura 6 muestra una vista en planta del lado interior de un componente del dispositivo según la Figura 5.
La Figura 1 muestra una vista en planta del lado interior de otro componente del dispositivo según la Figura 5.
Descripción de realizaciones ejemplares y preferidas de la invención
La Figura 1 muestra una vista general de una realización de todo el proceso de manipulación de suspensión según la invención. Primero, se inicia un procedimiento de entrega inicial ("cebado") antes de que la cámara se llene con la suspensión. El procedimiento de entrega inicial comprende mezclar la suspensión con un sustrato/sonda en un punto de mezcla aguas arriba del puerto de entrada y cargar la mezcla a través del puerto de entrada en la cámara. Este procedimiento de entrega sólo se realiza una vez antes de que se inicie el primer procedimiento de llenado. El
procedimiento de entrega inicial se describe con más detalle con referencia a la Figura 2. Si el cebado no ha tenido éxito, el proceso de manipulación de la suspensión finaliza. Si el cebado ha tenido éxito, se inicia el procedimiento de llenado. El procedimiento de llenado comprende cargar la mezcla de suspensión/sonda en la cámara y controlar el nivel de llenado hasta alcanzar el nivel de llenado óptimo. El procedimiento de llenado se describe con más detalle con referencia a la Figura 3. Después de esto, la electroporación se realiza aplicando uno o más pulsos de voltaje a la mezcla ("pulsación"). Después de la pulsación, y si aún no se ha alcanzado el número preestablecido de ciclos, la cámara se limpia y la segunda (siguiente) parte alícuota de la mezcla se introduce en la cámara para la electroporación. El proceso de llenado y pulsación se puede repetir varias veces, es decir, durante un número preestablecido de ciclos. Si se alcanza el número preestablecido de ciclos, o si la resistencia eléctrica medida entre dos electrodos dentro de la cámara está fuera de rango durante dos mediciones consecutivas ("Error2"), la cámara se limpia y el proceso de manipulación de la suspensión finalmente finaliza.
La Figura 2 muestra una secuencia ejemplar del procedimiento de entrega inicial ("cebado"). Para ser independientes de la longitud del tubo, las propiedades ópticas de la suspensión y para evitar medidas más complejas, tales como los métodos capacitivos, durante el procedimiento de entrega inicial, los electrodos de la cámara de reacción se utilizan para observar cambios eléctricos basados en líquido dentro de la cámara para determinar cuándo la primera fracción de la suspensión ha llegado a la cámara de reacción. Con este fin, el procedimiento de entrega inicial ("cebado") se inicia poniendo en marcha una primera bomba (la "bomba superior" como se le hace referencia en la Figura 2, siendo la primera bomba una bomba peristáltica de motor paso a paso en este ejemplo) que bombea una suspensión de células, derivados de células, orgánulos, partículas subcelulares y/o vesículas desde un primer depósito hasta un punto de mezcla y luego hasta un puerto de entrada de la cámara de reacción. La medida de la resistencia eléctrica en el primer electrodo de la cámara (el "segmento (electrodo) más bajo" como se le hace referencia en la Figura 2) se inicia cuando se ha realizado un número predeterminado de pasos de la primera bomba. Por ejemplo, el bombeo puede comenzar con 1000 pasos antes de iniciar la medida de la resistencia. Esto es para ser inmune a las pequeñas fracciones de líquido que se mueven y afectan a la resistencia desde el principio (véase la Figura 4, "caída de resistencia inicial "). Si la resistencia medida en el primer electrodo cae por debajo de un umbral predeterminado dentro de un período de tiempo de espera preestablecido (por ejemplo, 60 segundos), se detiene la primera bomba ("superior"). Por ejemplo, el valor del umbral de resistencia puede estar alrededor de 10 Ohmios por debajo del valor de resistencia medido inicialmente al comienzo del cebado. Tan pronto como la resistencia medida en el primer electrodo caiga 10 Ohmios, la suspensión se considerará detectada. Es decir, en este proceso de "cebado" se mide la resistencia cerca del puerto de entrada entre el primer electrodo y un electrodo de puesta a tierra. Si la resistencia eléctrica infinita de la cámara de electroporación vacía cae por debajo del umbral predeterminado, se puede indicar de forma fiable que la suspensión ha llegado al electrodo más cercano al puerto de entrada.
Si la primera bomba se detiene debido a la detección de una caída de resistencia suficiente y no se selecciona alimentación de sustrato/sonda por separado, el procedimiento de entrega inicial finaliza y se inicia el procedimiento de llenado (véase la Figura 3). Sin embargo, si no se detecta una caída de resistencia en el primer electrodo, la primera bomba ("superior") también se detiene en este caso y la rutina finaliza con una indicación de error. Si la primera bomba se detiene debido a la detección de una caída de resistencia suficiente y se establece una alimentación de sustrato/sonda por separado, la suspensión se retrae al punto de mezcla invirtiendo la dirección de funcionamiento de la primera bomba. En el punto de mezcla, la suspensión se mezcla con el sustrato o la sonda. Para ello, se pone en marcha una segunda bomba (la "bomba inferior" como se le hace referencia en la Figura 2, siendo la segunda bomba una bomba peristáltica de motor paso a paso en este ejemplo) para bombear el sustrato o la sonda desde un segundo depósito hasta el punto de mezcla Mezclar la suspensión con la sonda aguas arriba del puerto de entrada y medir la resistencia al entrar la mezcla en la cámara asegura que la suspensión esté perfectamente preparada para la electroporación antes de introducirla en la cámara. De este modo, se puede evitar una mezcla incompleta debido a la variación de la longitud del tubo y las diferentes propiedades ópticas de la suspensión. Preferiblemente, al menos un sensor óptico está dispuesto aguas arriba del punto de mezcla en el tubo que conecta el segundo depósito con el punto de mezcla para detectar el líquido que comprende el sustrato o la sonda. Si no se detecta ópticamente ningún líquido dentro de un período de tiempo de espera preestablecido, la segunda bomba "inferior" se detiene y la rutina finaliza con una indicación de error. Pero si se detecta el líquido que comprende el sustrato/sonda, la segunda bomba "inferior" también se detiene y el tubo que conecta el punto de mezcla con el puerto de entrada se llena entonces con la mezcla mediante ambas bombas funcionando simultáneamente hasta que llega al puerto de entrada (la "entrada de cartucho" como se le hace referencia en la Figura 2). El procedimiento de entrega inicial finaliza entonces y se inicia el procedimiento de llenado (véase la Figura 3).
La Figura 3 muestra una realización ejemplar del procedimiento de llenado y la rutina de terminación según la invención, mientras que la Figura 4 muestra una característica de resistencia típica durante el procedimiento de llenado. Según la invención, el llenado de la cámara de reacción se controla monitorizando la característica de resistencia eléctrica en la cámara en el puerto de salida (segundo electrodo). Al comenzar el procedimiento de llenado, al menos una bomba (por ejemplo, la primera bomba ("superior") y/o la segunda bomba ("inferior") según la Figura 2) bombea un cierto volumen de la suspensión/mezcla a la cámara. Por ejemplo, si se utiliza una bomba peristáltica (motor paso a paso), la bomba se ajusta a un número predeterminado de pasos del motor (N_p). Para el primer llenado (ciclo), N_p se establece en un valor por defecto y para todos los demás llenados (ciclos), N_p se establece en un valor predeterminado basado en los valores de los llenados previos.
Durante todo el proceso de llenado, el valor de resistencia del segundo electrodo en el puerto de salida de la cámara de reacción se mide continuamente. Una vez que la resistencia cae por debajo de un valor predeterminado (límite "umbral T1"), se inicia la rutina de terminación. Si el sistema determina que una primera pendiente del cambio de resistencia supera un primer umbral predeterminado (T2), el sistema espera a que la pendiente vuelva a disminuir hasta que una segunda pendiente del cambio de resistencia alcance un segundo umbral predeterminado (T3) durante al menos dos medidas consecutivas. Si se cumplen estos criterios, entonces la bomba (que se encuentra en N_ahora pasos) sigue girando durante otra cantidad fija de pasos (S). Dado que el efecto de la reducción de volumen también se ve afectado por la energía del pulso de voltaje entregado, esto entra en la corrección de la bomba reduciendo el número de pasos objetivo por R.
Extensos experimentos han demostrado que las variaciones en la correlación de la resistencia y el nivel de llenado pueden reducirse lo suficiente ajustando los pasos de la bomba objetivo para el llenado actual (si no es el primer ciclo de llenado) a:
(Número de pasos de llenado previo “N_p” pasos objetivo de detección estándar actual) / 2 un valor fijo (P)
Estos experimentos todavía han mostrado una desviación de la cantidad de llenado perfecta que aumenta constantemente de llenado a llenado. Esto se afronta agregando más pasos N al llenado que son un producto de un valor constante y el ciclo de llenado actual:
N_objetivo = ((N_ahora S - R)+N_p)/2 P - N
Después de que se hayan realizado estos pasos de bomba adicionales, se termina el llenado de la cámara. Además, el número de pasos de bomba no puede ser superior a los pasos del llenado anterior (si no es el primer ciclo de llenado). En consecuencia, si se alcanza un número máximo preestablecido de pasos de bomba (N_max), se termina el llenado de la cámara.
T1 puede establecerse, por ejemplo, en 500 Ohm;
T2 puede configurarse, por ejemplo, en 50 Ohm/400 pasos de bomba (específico del sistema);
T3 puede establecerse, por ejemplo, en 20 Ohm;
S puede establecerse, por ejemplo, en 850;
R se establece en un número de pasos que se correlacionan con la energía del pulso de voltaje;
P es un valor determinado empíricamente (por ejemplo, 200);
N se establece en el número de ciclos de llenado, por ejemplo, multiplicado por 20;
N_ahora es el número de pasos actual;
N_p es el número de pasos combinado previo (primera bomba segunda bomba);
N_objetivo es el número de pasos objetivo (primera bomba segunda bomba combinadas) para completar el llenado actual.
La Figura 5 muestra el lado exterior de una realización ejemplar de un dispositivo 1 según la invención y las Figuras 6 y 7 muestran, cada una, el lado interior de un componente del dispositivo 1 de acuerdo con la Figura 5. El dispositivo 1 comprende los miembros de base 2, 30, representando cada miembro de base 2, 30 un componente del dispositivo 1 que se ensambla a partir de dos componentes (miembros de base 2 y 30) que son unidos entre sí. En su lado exterior, los miembros de base 2, 30 están provistos cada uno de conectores 31 para conectar conducciones a los puertos 7, 8, 10, 11 de una cámara de reacción curva 6. Uno o más depósitos para la suspensión/sonda a procesar y uno o más contenedores para la suspensión procesada se pueden conectar a los conectores 31 a través de conductos adecuados. La suspensión se puede cargar y descargar de la cámara 6 por medio de un elemento de bombeo, por ejemplo, una bomba de vacío o una bomba peristáltica o similar, que se puede conectar al circuito de suspensión entre el (los) depósito(s)/contenedor(es) y los conectores 31. Para hacer compatible el dispositivo 1 con las conducciones y los sistemas de bombeo comunes, los conectores 31 pueden ser conectores Luer slip o Luer lock.
El miembro de base 30 comprende, además, una multitud de áreas conductoras 32 para proporcionar conexión eléctrica a los electrodos 4, 5 en la cámara 6. Las áreas conductoras 32 pueden comprender un polímero eléctricamente conductor, en particular un polímero dopado con material eléctricamente conductor o un polímero intrínsecamente conductor. Las áreas conductoras 32 están diseñadas para proporcionar una conexión eléctrica entre los electrodos 4, 5 y al menos un punto de contacto eléctrico 33. En esta realización, las áreas conductoras 32 son agujeros en el miembro de base 30 que están al menos parcialmente llenos con el material eléctricamente conductor. Las áreas conductoras 32 están eléctricamente acopladas con al menos un punto de contacto eléctrico 33 a través de al menos un camino conductor, por ejemplo, pistas de cobre en una capa del miembro de base (no mostradas). El
punto de contacto eléctrico 33 puede entrar en contacto con al menos un contacto eléctrico, para proporcionar una conexión eléctrica directa o indirecta a una fuente de energía y/o generador de pulsos de voltaje.
Cada uno de los miembros de base 2, 30 incluye un rebaje curvo 3 que está provisto de cuatro electrodos 4, 5. Según una realización preferida del dispositivo 1, la cámara 6 puede comprender al menos dos segmentos, comprendiendo cada segmento al menos dos electrodos, en donde el (contra)electrodo de puesta a tierra es un electrodo común de al menos dos segmentos. Es decir, tres de los electrodos son electrodos de segmento 4 mientras que un electrodo es un contraelectrodo 5. El miembro de base 2 representa un componente del dispositivo 1 que está ensamblado a partir de dos componentes que están unidos entre sí, en donde al menos los lados internos de estos componentes están diseñados inversamente. Es decir, el miembro de base 2 y el miembro de base 30 tienen lados interiores invertidos en espejo que están unidos entre sí de manera que los rebajes 3 de los miembros de base 2, 30 forman una cámara 6 para contener una suspensión de células, derivados de células, orgánulos , partículas subcelulares y/o vesículas. En esta cámara 6 se puede aplicar un campo eléctrico a las células, derivados celulares, orgánulos, partículas subcelulares y/o vesículas, por ejemplo, para transferir moléculas biológicamente activas tales como ácidos nucleicos o proteínas a las células, derivados celulares, orgánulos, partículas subcelulares y/o vesículas. Con este fin, los electrodos 4, 5 del miembro de base 2 y los electrodos correspondientes 4, 5 del miembro de base 30 forman pares de electrodos, en donde los electrodos de segmento 4 del miembro de base 2 y el contraelectrodo 5 dispuesto opuesto del miembro de base 30 establecen tres pares de electrodos mientras que el contraelectrodo 5 del elemento base 2 y los tres electrodos de segmento 4 dispuestos opuestos del elemento base 30 también forman tres pares de electrodos. En esta configuración, el contraelectrodo 5 del miembro de base 2 y el contraelectrodo 5 del miembro de base 30 son, cada uno, electrodos comunes de tres segmentos, de modo que la cámara 6 comprende seis segmentos, donde cada segmento está provisto de un electrodo de segmento 4 y un área de un contraelectrodo común 5.
Dos puertos 7, 8 están dispuestos en un extremo 9 de la cámara 6 y dos puertos 10, 11 están dispuestos en el extremo opuesto 12 de la cámara 6. En el extremo "inferior" 12, un puerto de los puertos 10, 11 puede ser usado como puerto de entrada para cargar la cámara 6 y el otro puerto de los puertos 10, 11 puede usarse ya sea como puerto de salida para descargar la cámara 6 o como puerto de salida adicional para vaciar la cámara 6. En el extremo opuesto 9, un puerto de los puertos 7, 8 se pueden usar como puerto de salida para descargar la cámara 6 y el otro puerto de los puertos 7, 8 se puede usar como puerto de salida adicional, ya sea para descargar la cámara 6 o, por ejemplo, para ventilar la cámara 6. En consecuencia, en esta realización ejemplar, cada extremo 9, 12 está provisto de dos puertos 7, 8, 10, 11 a través de los cuales se puede llenar la cámara 6 con la suspensión y/o a través de los cuales se puede purgar la suspensión de la cámara 6. Dependiendo en la dirección del flujo, un extremo de la cámara comprende al menos un puerto de entrada mientras que el extremo opuesto de la cámara comprende al menos un puerto de salida. Por ejemplo, si al menos uno de los puertos 10, 11 se usa como puerto de entrada y al menos uno de los puertos 7, 8 se usa como puerto de salida, el electrodo 4 al lado del puerto de entrada 10, 11 en el extremo 12 es, por definición , un primer electrodo 20 (segundo electrodo sensor) y el electrodo 4 junto al puerto de salida 7, 8 en el extremo 9 es, por definición, un segundo electrodo 21 (primer electrodo sensor). En consecuencia, en esta realización ejemplar, la resistencia eléctrica para controlar el procedimiento de llenado se mide entre el segundo electrodo 21 del elemento de base 30 y el electrodo de conexión a tierra 5 del elemento de base 2. La medición de la resistencia eléctrica para controlar el procedimiento de entrega inicial se mide entre el primer electrodo 20 del miembro de base 2 y el electrodo de puesta a tierra 5 del miembro de base 30.
Claims (14)
1. Método para controlar el nivel de llenado de una suspensión de células, derivados celulares, orgánulos, partículas subcelulares y/o vesículas dentro de al menos una cámara de un dispositivo para aplicar un campo eléctrico a la suspensión, comprendiendo dicho dispositivo al menos un primer y un segundo electrodo, al menos un puerto de entrada dispuesto en un extremo de la cámara, y al menos un puerto de salida dispuesto en el extremo opuesto de la cámara, en donde el primer electrodo está dispuesto dentro de la cámara en el puerto de entrada y el segundo electrodo está dispuesto dentro de la cámara en el puerto de salida, y en donde la cámara comprende, además, al menos un electrodo de puesta a tierra, comprendiendo dicho método:
a) iniciar un procedimiento de llenado en el que la suspensión se carga en la cámara a través del puerto de entrada;
b) medir la resistencia eléctrica dentro de la cámara durante el procedimiento de llenado en varios momentos; e
c) iniciar una rutina de terminación que comprende terminar el procedimiento de llenado, en donde la rutina de terminación se inicia dependiendo de al menos un cambio de la resistencia eléctrica,
caracterizado por que
la resistencia eléctrica se mide entre el segundo electrodo y el electrodo de puesta a tierra, en donde el procedimiento de llenado se termina si se cumplen las condiciones de terminación, comprendiendo dichas condiciones de terminación:
- una primera pendiente de un cambio de la resistencia supera un primer umbral predeterminado, y
- una segunda pendiente de un cambio de la resistencia alcanza un segundo umbral predeterminado, en donde el segundo umbral representa una pendiente que es inferior a la pendiente representada por el primer umbral.
2. Método según la reivindicación 1, en donde la rutina de terminación se inicia cuando la resistencia eléctrica ha alcanzado un valor predeterminado.
3. Método según la reivindicación 1 o 2, en donde las condiciones de terminación comprenden, además, que una tercera pendiente de un cambio de la resistencia, que se determina después de la segunda pendiente, es igual o se encuentra por debajo del segundo umbral.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la rutina de terminación comprende una terminación diferida después de que se haya determinado que se cumplen las condiciones de terminación, en donde el procedimiento de llenado continúa antes de la terminación final basándose en al menos un parámetro preestablecido.
5. Método según la reivindicación 4, en donde el parámetro preestablecido comprende un número de pasos realizados por una bomba peristáltica.
6. Método según la reivindicación 5, en donde el número de pasos se calcula mediante la ecuación N_objetivo = (N_p N_sts)/2 P, en donde N_objetivo es el número calculado de pasos necesarios para completar el procedimiento de llenado, N_p es el número de pasos realizados durante el procedimiento de llenado previo, N_sts es el número de pasos objetivo de detección estándar actual y P es un número de pasos determinado empíricamente.
7. Método según la reivindicación 5, en donde el número de pasos se calcula mediante la ecuación N_objetivo = ((N_ahora S - R) N_p)/2 P - N, en donde N_objetivo es el número calculado de pasos necesarios para completar el procedimiento de llenado, N_ahora es el número actual de pasos, S es un número preestablecido de pasos, R es un número preestablecido de pasos que se correlaciona con la energía de un pulso de voltaje eléctrico, N_p es el número de pasos realizados durante el procedimiento de llenado previo, P es un número de pasos determinado empíricamente y N es el número de procedimientos de llenado multiplicado por 20.
8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde se inicia un procedimiento de entrega inicial antes de que comience el procedimiento de llenado, comprendiendo dicho procedimiento de entrega mezclar la suspensión de células, derivados celulares, orgánulos, partículas subcelulares y/o vesículas con un sustrato o sonda en un punto de mezcla aguas arriba del puerto de entrada y cargar la mezcla o la suspensión a través del puerto de entrada en la cámara hasta que se detecte una caída de resistencia en el primer electrodo, en donde la resistencia eléctrica se mide dentro de la cámara entre el primer electrodo y un electrodo de puesta a tierra durante el procedimiento de entrega inicial en varios momentos.
9. Método según la reivindicación 8, en donde la caída de la resistencia comprende una disminución de la resistencia eléctrica en el rango de 5 a 15 Ohmios, preferiblemente alrededor de 10 Ohmios.
10. Método según la reivindicación 8 o 9, en donde el procedimiento de entrega inicial comprende, además, detener la carga de la suspensión en la cámara cuando se detecta la caída de la resistencia y luego retraer la suspensión
hasta el punto de mezcla donde la suspensión se mezcla con el sustrato o la sonda antes de que se inicie el procedimiento de llenado.
11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde el procedimiento de entrega inicial sólo se realiza una vez antes de que comience el primer procedimiento de llenado.
12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el campo eléctrico se aplica a la suspensión dentro de la cámara suministrando al menos un pulso de voltaje a través de al menos un electrodo después de que se termina el procedimiento de llenado y/o en donde se llena la cámara con la suspensión y, subsiguientemente, el suministro de al menos un pulso de voltaje se repite durante un número predefinido de ciclos.
13. Dispositivo (1) para aplicar un campo eléctrico a una suspensión de células, derivados celulares, orgánulos, partículas subcelulares y/o vesículas dentro de al menos una cámara, que comprende al menos un primer y un segundo electrodo (20, 21), en al menos un puerto de entrada (10, 11) dispuesto en un extremo (12) de la cámara (6), y al menos un puerto de salida (7, 8) dispuesto en el extremo opuesto (9) de la cámara (6), en donde el primer electrodo (20) está dispuesto dentro de la cámara (6) en el puerto de entrada (10, 11) y el segundo electrodo (21) está dispuesto dentro de la cámara (6) en el puerto de salida (7, 8), y en donde la cámara (6) comprende, además, al menos un electrodo de puesta a tierra (5), caracterizado por que al menos el segundo electrodo (21) es un primer electrodo sensor para medir la resistencia eléctrica dentro de la cámara (6) entre el segundo electrodo (21) y el electrodo de puesta a tierra (5).
14. Dispositivo según la reivindicación 13, en donde el primer electrodo (20) es un segundo electrodo sensor para medir la resistencia eléctrica dentro de la cámara (6) entre el primer electrodo (20) y el electrodo de puesta a tierra (5).
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