BRPI0618420A2

BRPI0618420A2 - sistema de alta impedáncia para geração de um campo elétrico e método de uso.

Info

Publication number: BRPI0618420A2
Application number: BRPI0618420-0A
Authority: BR
Inventors: Wayne May; Ruben A Peter
Original assignee: May Ruben Technologies Inc
Priority date: 2005-11-02
Filing date: 2006-10-31
Publication date: 2012-10-30
Also published as: WO2007056027A1; UA95262C2; JP2009515168A; US20070095648A1; US20110139608A1; NZ603542A; RU2408006C2; US8221596B2; JP5607304B2; US8226811B2; RU2008121962A; CA2628407A1; KR101361498B1; AU2006311979B2; CA2628407C; EP1952133B1; EP1952133A4; EP1952133A1; AU2006311979A1; KR20080080518A

Abstract

SISTEMA DE ALTA IMPEDáNCIA PARA GERAçãO DE CAMPOS ELéTRICOS E MéTODO DE USO. Divulga-se um sistema e método para geração de campos elétricos variáveis e invariáveis com o tempo (campos E) para várias aplicações. A geração do campo E utiliza materiais dielétricos de alta impedância, com o acúmulo de três propriedades importantes do material: alta permissividade (e), alta resistividade de volume (p) e alto estresse máximo permitido para o campo E (o) e geometrias físicas que tiram vantagem da maneira como os campos E são dividios ou distribuidos em redes de capacitores em série. O campo E gerado pode atuar sobre o material em questão, incluindo gases, líquidos ou sólidos, estando o material estacionário ou em movimento. O método permite a formação de um campo E de dada intensidade no material em questão com uma voltagem aplicada significativamente baixa oa ou, ao contrário, um campo E de intensidade significativamente alta com uma dada voltagem aplicada oa. O método evita a corrente de condução elétrica através do material em questão, reduzindo assim significativamente a corrente de condução elétrica, o consumo de energia, o aquecimento óhmico, além de eliminar reações eletroquímicas nas interfaces eletrodo/fluido. Pode-se, também, aplicar energia acústica.

Description

SISTEMA DE ALTA IMPEDÂNCIA PARA GERAÇÃO DE CAMPOS ELÉTRICOS E

MÉTODO DE USO

CAMPO DA INVENÇÃO

As formas de execução da presente invenção se relacionam a um sistema para a aplicação de potencial de voltagem de tempo variável, voltagem de tempo invariável ou voltagem pulsante em uma rede de capacitores em série, para definir ou de alguma outra forma gerar campos elétricos uniformes ou não uniformes que, por sua vez, são usados por numerosas aplicações. Mais particularmente, as formas de execução empregam materiais dielétricos com propriedades elétricas específicas, arranjadas ou de alguma forma configuradas para formarem redes de capacitores em série que dividem ou distribuem de alguma forma o potencial aplicado entre eletrodos opostos, resultando em uma concentração do campo elétrico em (ou de alguma forma através de) um material objeto deste requerimento. HISTÓRICO

Campos elétricos estáticos, pulsados e com variação no tempo, com ou

sem um componente de campo magnético, considerado fraco ou intenso para uma aplicação específica, são usados por vários setores, em uma ampla gama de aplicações. Em algumas aplicações existentes, nas quais as voltagens aplicadas, variáveis com o tempo, são usadas com as formas de execução da presente invenç-ão, os portadores de carga podem se mover com relação à estrutura do laboratório, de forma que um componente campo magnético B acompanha o campo elétrico E; contudo, para as formas de execução da presente invenção, apenas o campo E é pertinente. Os exemplos de aplicações de campo E incluem, entre outros:

* eletroforese: os tipos capilar e em gel empregam uma corrente elétrica através do meio em suspensão, carga resistiva, definindo assim um campo elétrico usado para separar, diferenciar e fracionar DNA, proteínas e outras moléculas;

* eletroporação (também conhecida como eletropermeabilização): campos elétricos intensos, geralmente pulsados com várias formas de onda e taxas de pulsação, são usados para causar a quebra dielétrica de membranas celulares vivas, afetando assim a poração e/ou permeabilização reversível ou irreversível para fins de transfecção, pasteurização ou esterilização; e

* fracionamento do fluxo do campo elétrico (FFF, também conhecido como EFFF, μ- EFF, CyEFF, entre outros): emprega um campo elétrico ortogonal um fluxo de fluido de modo a separar, fracionar e diferenciar moléculas grandes e/ou partículas pequenas de um líquido.

De forma geral, um processo ou efeito disparado, suportado ou facilitado pela ação de um campo E pode ser acelerado ou de certa forma aprimorado pelo aumento da intensidade do campo para uma determinada voltagem aplicada ou, de modo contrário, pela redução da voltagem aplicada para uma determinada intensidade de campo. Isto se deve à relação entre as propriedades de permissividade, resistividade de volume e estresse máximo permitido no campo do material, e aos efeitos destes parâmetros sobre os elementos diacríticos de intensidade de campo, quebra dielétrica, geometria de campo, fluxo de corrente e consumo de energia do circuito. Aplicações sob influência ou ação direta de um campo E são geralmente limitadas pelos efeitos indesejáveis de aquecimento ôhmico, eletroquímica (transferência de carga faradáica), blindagem de campo pela formação de dupla camada eletrolítica, polarização de eletrodo e consumo de energia.

A corrente elétrica é um fator Iimitante para a intensidade aplicada ao campo em dispositivos de eletroforética, eletroporação e fracíonamento de fluxo de campo, devido a aquecimento ôhmico do meio de trabalho (geralmente um líquido ou gel, para tais aplicações) e a eletroquímica indesejada na(s) interface(s) meio/eletrodo (transferência de carga faradaica). Tem havido grande esforço nas últimas duas décadas, por exemplo, para aplicar o processo de eletroporação clínica (usado principalmente para transfecção de células biológicas vivas) à pasteurização isotérmica comercial (comumente conhecida como pasteurização não-térmica por campo elétrico pulsado, ou PEF). A eletroporação reversível é não-letal e obtida pelo controle cuidadoso da intensidade e do tempo de exposição do campo aplicado, enquanto que a eletroporação irreversível é marcada pela morte celular, inativação metabólica ou apoptose. Devido à baixa impedância natural de sistemas PEF, onde eletrodos condutores nus são acoplados diretamente ao fluido em tratamento, as formas de onda de voltagem pulsada têm sido empregadas como meio para reduzir a energia média, o aquecimento ôhmico e a eletroquímica indesejável na interface fluido/eletrodo. O mesmo se aplica a métodos e dispositivos de eletroforese e fracíonamento de fluxo de campo elétrico (EFFF). Embora um aumento na intensidade do campo aumentasse a eficiência e/ou a taxa do processo, aumentar a voltagem aplicada como forma de aumentar a intensidade do campo resulta em uma corrente elétrica excessiva e no aquecimento ôhmico associado a ela, em reações eletroquímicas indesejáveis e nas outras reações indesejáveis acima mencionadas. No caso do EFFF, tem havido esforços recentes para reduzir a altura do canal de fluido usando-se microusinagem e técnicas microeletrônicas, reduzindo assim, efetivamente, a dimensão do campo entre os eletrodos e aumentando a intensidade do campo ao mesmo tempo que se reduz o fluxo da corrente elétrica. Como o aumento da intensidade do campo E também requer um aumento na voltagem aplicada e/ou uma redução na distância entre os eletrodos, a quebra dielétrica do meio de trabalho, seja gás, líquido ou sólido, é um fator Iimitante adicional em todas as aplicações.

Embora o revestimento ou a justaposição de materiais dielétricos comuns entre eletrodos eletricamente condutores tradicionais e o meio em tratamento permita a aplicação de uma voltagem maior, implicando em uma intensidade maior do campo Ε, o efeito é compensado por uma queda de voltagem muito maior pelo material dielétrico em uso, reduzindo assim o campo E no meio em tratamento. Isto ocorre por causa da maneira como as quedas de voltagem, e portanto o campo E1 é dividida ou de alguma forma distribuída em redes de capacitores em série.

Seria vantajoso desenvolver um sistema para geração de um campo E que reduza significativamente ou elimine completamente os efeitos indesejáveis dos sistemas e métodos anteriores. RESUMO

Uma forma de execução da presente invenção devidamente inclui um sistema de alta impedância para geração de um campo elétrico, sendo composta por: um par de eletrodos de material dielétrico, em que cada eletrodo tem pelo menos uma superfície revestida com material condutor, e no qua! este material dielétrico forma uma barreira, separando o revestimento condutor do fluido sob tratamento em questão; um caminho ou espaço fluido formado entre o par de eletrodos, de forma que o material condutor esteja em uma superfície do eletrodo sem contato com o fluido no caminho ou espaço; uma fonte de voltagem variável no tempo, invariável no tempo ou pulsante aplicada nos eletrodos; e um invólucro contendo o dito par de eletrodos, configurado para manter um fluido estático ou tratados por veículo, B aos animais tratados por composto 150, Dl indica ra- tos diabéticos, e C indica controles combinados pela idade não diabéticos;

Figura 5 é um gráfico que ilustra o efeito do Composto 150 em Alodinia Tátil em ratos Diabéticos após 1, 5 e 10 tratamentos;

Figura 6 é um gráfico que ilustra o efeito do Composto 157 em Alodinia Tátil em ratos Diabéticos antes do tratamento, e após 1, 13 e 14 tratamentos diários;

Figura 7 é um gráfico que ilustra o efeito do Composto 158 em Alodinia Tátil em ratos Diabéticos antes do tratamento, e após 1, 13 e 14 tratamentos diários;

Figura 8 é um gráfico que ilustra o efeito do composto 155 em alodinia tátil em ratos diabéticos 6 horas após uma única administração sub- cutânea;

Figura 9 é um gráfico que ilustra o efeito do composto 157 em alodinia tátil em ratos diabéticos 6 horas após administração subcutânea;

Figura 10 é um gráfico que ilustra o efeito do composto 157 em alodinia tátil em ratos diabéticos 6 horas após administração oral;

Figura 11 é um gráfico que ilustra o efeito do composto 154 em alodinia tátil em ratos diabéticos 6 horas após administração subcutânea;

Figura 12 é um gráfico que ilustra o efeito do composto 158 em alodinia tátil em ratos diabéticos 6 horas após administração subcutânea;

Figura 13 ilustra o efeito do composto 160 em alodinia tátil em ratos diabéticos 6 horas após administração subcutânea;

Figura 14 é um gráfico que ilustra o efeito do composto 157 em alodinia tátil em ratos diabéticos 6 horas após a 5ã administração oral do fármaco, dado oralmente uma vez diariamente durante cinco dias consecuti- vos;

Figura 15 é um gráfico ilustrando o efeito do composto 158 em alodinia tátil em ratos diabéticos 6 horas após a 5ã administração oral do fármaco, dado oralmente uma vez diariamente durante cinco dias consecuti- vos;

Figura 16 é um gráfico que ilustra o efeito do composto 150 em geometria cilíndrica;

A Fig. 3 ilustra três seções dielétricas arranjadas de maneira a formar uma rede de capacitores em série;

A Fig. 4 ilustra um circuito equivalente à geometria dielétrica da Fig. 3";

A Fig. 5 ilustra duas placas de cerâmica de titanato revestidas em um dos lados com um filme fino de prata metálica, formando uma superfície de eletrodo condutor em cada uma;

A Fig. 6 ilustra uma perspectiva dos eletrodos da Fig. 5 fixados a uma haste de suporte de policarbonato, com um espaço formando um caminho para o fluido;

A Fig. 7 ilustra uma vista superior dos eletrodos da Fig. 6;

A Fig. 8 ilustra uma haste de suporte oposta fixada ao outro lado do arranjo ilustrado nas Figs. 6 e 7;

A Fig. 9 ilustra uma configuração de um dispositivo de campo E de alta impedância da presente invenção;

A Fig. 10 ilustra um diagrama de circuito equivalente para a geometria de placa paralela das Figs. 6 e 7;

As Figs. 11 e 12 ilustram uma configuração-exemplo de sistema, de acordo com as formas de execução da presente invenção; e

A Fig. 13 ilustra um diagrama de circuito equivalente para a configuração ilustrada nas Figs. 11 e 12.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Para a finalidade de promover e entender os princípios de acordo com as formas de execução da presente invenção, serão feitas referências às formas de execução ilustradas nos desenhos, com linguagem específica para deserevê-las. Entretanto, fica entendido que não se pretende, assim, uma limitação ao escopo da invenção. Nenhuma alteração ou futuras modificações à característica inventiva aqui ilustrada, e nenhuma aplicação adicional dos princípios da invenção da maneira aqui ilustrada, que normalmente ocorreriam a um especialista na arte relevante e de posse desta revelação, devem ser consideradas dentro do escopo da invenção reivindicada.

Embora as formas de execução da presente invenção tenham muitas aplicações, será descrita aqui uma forma de execução voltada à eletroporação de células biológicas. O termo eletroporação, às vezes eletropermeabilização em literatura acadêmica e de patentes, é amplamente usado para denotar os fenômenos associados à ação de um campo elétrico sobre a membrana de uma célula viva. A eletroporação de células suspensas em um eletrólito fluido é importante no contexto de biologia celular, engenharia genética, terapia com medicamentos, assim como de processos biotecnológicos como pasteurização e esterilização. Dependendo da intensidade do campo, do tempo de exposição e das formas de onda, os campos elétricos afetados podem causar a formação reversível ou irreversível de poros, assim como outros defeitos estruturais nas membranas lípídicas, incluindo as membranas de células (somáticas) de bactérias, fungos, esporos, vírus e mamíferos. No caso da eletroporação reversível, o fenômeno é marcado por um aumento temporário na permeabilidade à difusão da membrana que tem sido usado há décadas para a transfecção de DNA1 medicamentos, corantes, proteínas, peptídeos e outras moléculas. Quando o campo elétrico afetado induz uma voltagem transmembrana crítica (φ0 » 1 V para muitos tipos de bactérias) por um período suficiente, a formação de poros e de outros defeitos da membrana se torna irreversível, causando a morte da célula e/ou a inativação metabólíca permanente, ou seja, pasteurização ou esterilização. Os dispositivos e métodos de eletroporação para uso clínico e laboratorial existem há décadas, e podem ser imediatamente adquiridos para transfecção, pasteurização e esterilização de lotes de pequeno volume (normalmente 1 pl a 100 ml). O trabalho de adaptação destes métodos clínicos e laboratoriais para aplicações comerciais que exigem taxa de escoamento alta no lugar de lotes de pequeno volume tem sido grande, nas últimas duas décadas. Muitos dispositivos e métodos têm sido propostos, implementados e patenteados; contudo, o estado da técnica atual e anterior têm em comum o uso de eletrodos eletricamente condutores de baixa impedância, acoplados diretamente ao fluido em tratamento. Isso torna o circuito para tais dispositivos equivalente a uma rede de resistências no estado de equilíbrio, acompanhado pelos requisitos paramétricos de corrente de condução elétrica, aquecimento ôhmico, transferência de carga da interface, formação de dupla camada, reações eletroquímicas e consumo excessivo de energia. Esses parâmetros de carga resistiva são responsáveis pelo uso universal de formas de onda pulsadas empregadas em dispositivos tradicionais de eletroporação. O uso de formas de onda pulsadas (algumas vezes denominadas PEF), sejam estas unipolares, bipolares ou de outras formas, e independente dos tempos de aumento e redução, aplica-se à redução dos efeitos indesejados de redes resistivas de baixa impedância supracitados, comuns à estado da técnica atual e anterior neste campo. No caso das tentativas de adaptação dessas técnicas a aplicações comerciais de pasteurização, o aquecimento ôhmico, as reações eletroquímicas indesejáveis e o consumo excessivo de energia têm sido particularmente problemáticos.

As formas de execução da presente invenção, denominada "Eletroporação de alta impedância" pelos inventores (doravante, HIE), reduz muitos dos efeitos indesejáveis enquanto prova ser tão ou mais eficiente que os sistemas e métodos anteriores para aplicações em lote e em taxa de escoamento alta e contínua.

As Figs. 1 e 2 ilustram uma configuração dielétrica paralela 100 e uma configuração dielétrica cilíndrica 150, respectivamente, que podem ser usadas para facilitar as formas de execução do método da presente invenção. Cada configuração apresenta um material dielétrico 105, 155, revestimento condutor elétrico 110, 160 e material 115, 165 em teste ou influência do campo E.

Para elementos capacitores que formam redes seriais, usados para facilitar as formas de execução da presente invenção, conservou-se o deslocamento de carga e o gradiente de potencial (queda de voltagem), juntamente com o campo elétrico, é distribuído proporcionalmente à permissividade de cada material antes do repouso da carga para cada seção de material da rede. A Fig. 3 considera três seções dielétricas 170, 175 e 180 arranjadas de maneira a formar uma rede de capacitores em série 125. São identificados os campos E 130, 135 através de cada uma. A Fig. 4 ilustra um diagrama de circuito 140 representando a rede 125 da Fig. .3.

Considerando o arranjo ilustrado na Fig. 3, se a permissividade das seções Cj 170 e Cj 180 for significativamente maior que Ci175, durante a resposta temporária de um pulso (função de passo), o potencial e o campo E através de C, 170 e C, 180 serão muito pequenos, em comparação com o potencial e o campo E através da seção Ci .175. Esta relação concentra efetivamente o gradiente de potencial total disponível para o desenvolvimento do campo na seção central (Ci 175, neste exemplo). A mesma relação se aplica a redes compostas por 2, 4 ou várias geometrias de seçãodielétrica. Como resultado, um estresse de campo muito maior pode ser afetado através do material em teste ou tratamento que com os métodos e dispositivos do estado da técnica atual e anterior. Além disso, o uso de eletrodos dielétricos com alta resistividade de volume limita o fluxo de corrente elétrica, o aquecimento ôhmico e o consumo de energia, assim como elimina reações eletroquímicas indesejáveis nas interfaces do eletrodo.

Os inventores, no presente documento, demonstram a eficiência das formas de execução da presente invenção através de experimentação confidencial. A descrição a seguir descreve a experiência, incluindo o sistema e a metodologia utilizados. Contudo, as pessoas com experiência entenderão que o escopo da presente invenção não esta limitado aos sistemas e/ou metodologia experimentais utilizados.

Com relação à Fig. 5, são apresentados dois eletrodos dielétricos 200 de alta impedância, fabricados com cerâmica de titanato de chumbo-magnésio- chumbo. Outros materiais, como compostos particulados/epóxi de alta permissividade ou materiais de propriedades semelhantes também podem ser usados. Duas placas de cerâmica de titanato 200 foram revestidas em um dos lados com um filme fino de prata metálica, formando uma superfície condutora 210. Em uma forma de execução, os eletrodos mediam 10 mm de espessura por 10 mm de profundidade por 100 mm de largura, e a cerâmica dielétrica possuía as seguintespropriedades elétricas de material:

* permissividade elétrica: 5,3e"08 [Fm"1] (constante dielétrica relativa εΓ = 6.000);

* resistividade de volume: »<formula>formula see original document page 11</formula> * estresse de campo máximo permitido:<formula>formula see original document page 11</formula> Conforme ilustrado nas Figs. 6 e 7, os eletrodos 200 foram fixados a uma haste de suporte de policarbonato 220, com um espaço formando um canal 230 medindo 1 mm de profundidade por 10 mm de largura por 100 mm de comprimento, formando um caminho ou espaço de fluido com volume de 1000 mm3 ou 1 ml. Uma porta 225 para fluido permite a entrada ou saída do fluido em questão. Como a força de atração transmitida pelo campo entre os eletrodos 200 é impressionante quando o sistema está carregado, as hastes de suporte 220 são oferecidas como alivio para a pressão estrutural dos eletrodos de cerâmica 200. Observe-se que os eletrodos .200 são arranjados de maneira a formarem uma rede de capacitores em série acoplados ao líquido em teste sendo tratado. A seta direcional A da Fig. 7 indica a direção do campo E gerado. A Fig. 8 traz uma haste de suporte oposta 250 completando um caminho de fluido à prova de líquidos. Na Fig. 9, por sua vez, os eletrodos 200 e os suportes de haste 220 são acomodados em um invólucro 260 (um cano de PVC de 1-1/4", por exemplo), que foi preenchido com epóxi dielétrico de alta voltagem 265. Os cabos de alta voltagem positivo e negativo 270, 275, respectivamente, e as conexões para tubulação de fluido 280, 285 são também fixados para formar o dispositivo HIE final 300 (denominado abatis pelos inventores deste documento)1.

Uma suspensão líquido/bactérias em tratamento passou pelo caminho de fluido por tubos de transporte conectados à conexão do tubo de entrada 280 e à conexão do tubo de saída 285, conforme ilustrado. Os fios de alta voltagem positivo e negativo 290 e 295, respectivamente (ilustrados na Fig. 11) foram passados através dos guias de cabo positivo e negativo 270 e 275 e posicionados em contato direto com a superfície condutora de prata 210 de cada eletrodo 200, formando uma conexão elétrica para carga do sistema. A Fig. 10 ilustra um diagrama de circuito equivalente 310, com a respectiva legenda, para esta geometria de placas paralelas.

As Figs. 11 e 12 trazem uma configuração completa de sistema 350. Por motivos de segurança, o dispositivo HIE 300 foi montado em um anteparo dielétrico de alta voltagem (folha de plástico policarbonato de 1/4", por exemplo) e ligado a uma fonte de alimentação de 120 kVcc 310. Um primeiro béquer de 600 ml de fluido, 320, foi montado verticalmente acima do dispositivo HIE 300 de forma que, por meio da gravidade, o líquido inoculado escoa para a entrada de fluido 280 e através do dispositivo HIE 300. Um segundo béquer de 600 ml, 325, foi posicionado em um nível abaixo do dispositivo HIE 300, no qual o líquido tratado escoa a partir da saída de fluido 285. A Fig. 13 traz um diagrama de circuito equivalente 360 para a fonte de alimentação 310 e o dispositivo HIE 300.

Antes da operação do sistema com um líquido de teste inoculado com bactérias, o dispositivo HIE 300 foi preenchido com caldo de soja tríptico estéril e suas propriedades elétricas foram medidas. A tabela 1 apresenta os valores previstos e medidos: Tabela 1

<table>table see original document page 13</column></row><table> Onde:

<table>table see original document page 13</column></row><table> <table>table see original document page 14</column></row><table>

Durante um pulso de 1 ps, o campo E máximo através do líquido em teste foi da ordem de 8,5e+07 Vm"1, que eqüivale a 850 kV/cm, representando um formidável campo elétrico. A corrente elétrica através do dispositivo HIE 300, contudo, ficou na ordem de 4,5e-07 amperes, representando uma corrente extremamente baixa dado o intenso campo elétrico gerado (esta figura não inclui a corrente de deslocamento temporário). Os valores medidos representam uma média de três (3) testes separados. A fonte de alimentação foi desligada e o dispositivo HIE .300 foi completamente descarregado entre cada medição.

O sistema 350 para o teste de eletroporação foi operado a uma voltagem aplicada (φ3) de 10 kV. O campo elétrico E1 apresentado ao líquido inoculado em tratamento, nesta voltagem, foi de 7,82e+06 Vm-1, ou aproximadamente 78 kV/cm. Na escala física das bactérias E. Coli, este campo corresponde a 7,82 Vµm-1 e é suficiente para atingir o potencial transmembrana crítico (φc ≈1 volt, por exemplo) geralmente citado como limite para a eletroporação da membrana. A corrente de condução elétrica (Ia) através do dispositivo HIE 300 durante o teste foi de aproximadamente 4,6e-08 A (0,046 microamperes). O consumo médio de energia Pavg apenas no dispositivo HIE 300, não incluindo perdas no cabo e das fontes de energia, foi da ordem de 4,6e-04 W (460 microwatts). Como o volume de líquido tratado era de 600 ml e o tempo total para fluxo total foi de aproximadamente 480 segundos, a dissipação total de energia Ut ficou na ordem de .2,2e-01 J (221 milijoules), colocando o consumo específico de energia Us em 1,75e- .03 kJ/Riog (1,75 joules/litro-redução logarítmica).

O tempo de exposição cumulativo (tx) foi de -800 ms, em média, contra a taxa de escoamento do tempo total do processo de mais de 480 segundos. A carga bacteriana do líquido em teste foi reduzida em 38% (fração de morte em termos de ufc/ml), correspondendo a uma redução logarítmica de aproximadamente -0,21 Iogio- A fração de morte declarada é uma média de sete amostras interceptadas, tomadas a intervalos iguais durante o período de teste. Embora uma redução logarítmica de 0,21 não seja significativa para fins de pasteurização comercial, é significativa para demonstrar a eficiência das formas de execução da presente invenção, quando aplicadas a eletroporação de células vivas. Não houve tentativa de detecção ou medição da extensão da eletroporação reversível (ou seja, um aumento temporário na permeabilidade da membrana), mas dada a grande fração de morte, os efeitos da eletropermeabilização na fração sobrevivente co- habitante são imutáveis.

Uma pesquisa na literatura comercial acadêmica e de patentes, cobrindo o escopo de dispositivos de eletroporação, métodos e teoria expôs uma variedade de voltagens aplicadas, intensidades de campo, formas de onda, freqüências de pulsação, perfis de aumento/redução, geometrias e esquemas de fluxo de fluido. Todo o estado da técnica atual e anterior empregam eletrodos eletricamente condutores de baixa impedância acoplados diretamente ao líquido em tratamento, tornando o circuito equivalente uma carga predominantemente resistiva na condição de estado de equilíbrio (existem elementos de capacitância e indutância em todas as redes de resistência, mas estes elementos de circuito não são pertinentes a este exame). Isto se aplica a sistemas clínicos, laboratoriais e comerciais. Contudo, as formas de execução da presente invenção compreendem uma rede de capacitores em série. A tabela a seguir apresenta uma visão geral dos parâmetros elétricos críticos para dispositivos e sistemas de eletroporação operacionais pesquisados (a variação de alguns valores é grande, mas ainda assim instrutiva):

Tabela 2

<table>table see original document page 16</column></row><table>

Onde:

<table>table see original document page 16</column></row><table>

Os dados coletados a partir do estudo incluem tanto os efeitos de eletroporação reversível (permeabilízaçãõ temporária) quanto irreversível (morte), vários tipos de bactérias diferentes, além de sistemas com geometrias de caminho de fluido coaxiais (cilíndricas) e paralelas, assim como ambos os tipos de lote e esquemas de fluxo contínuo. Contudo, a energia específica Us necessária para o dispositivo ou método afetar a fração morta obtida raramente foi citada (ultima coluna da Tabela 2). A pesquisa conduzida pelos inventores, geralmente exigindo cálculos extramurais para os relatórios em estudo, revelou a magnitude do consumo de energia com relação a fração morta como bem alta, conforme demonstrado. Por outro lado, o dispositivo de eletroporação HIE 300 fabricado para a demonstração rápida consumiu uma energia específica (Us) da ordem de 1,75e-03 kJ/IR|0g, 4 ordens de magnitude menor que a energia específica (Us) mais baixa relatada e 6 ordens de magnitude menor que a energia específica (Us) mais alta relatada. Este baixo consumo de energia por litro por redução logarítmica, devido à alta impedância das formas de execução da presente invenção, contribui para resolver completamente os problemas de eletroquímica fluido/eletrodo e de aquecimento ôhmico apresentados pelo estado da técnica atual e anterior neste campo.

As pessoas capacitadas na área reconhecerão que mesmo que tenha sido usada uma voltagem CC invariável no tempo (pulso de onda quadrada) para carregar (energizar) o dispositivo HlE 300 na demonstração rápida, pode-se também usar uma voltagem aplicada variável com o tempo (CA). Além disso, embora tenha- se usado uma geometria paralela de placas para geometria de capacitores em série, outras geometrias, como a coaxial (capacitância em série cilíndrica) são igualmente aplicáveis.

Além da aplicação da geração de campo de alta impedância à eletroporação de células biológicas, os inventores encontraram uma ação concordante entre a aplicação da energia acústica e a eletroporação. A energia acústica pode ser aplicada através de qualquer meio desejado. A energia acústica pode ser aplicada, por exemplo, 1) por ação de um transdutor piezoelétrico ligado ao dispositivo HIE 300 de tal forma e em tal configuração que transmita a energia acústica ao fluido no caminho 230 ou no espaço concorrente com o pulso ou pulsos do campo elétrico aplicado, concatenado entre estes e/ou conseqüente a estes; ou 2) por ação de uma resposta piezoelétrica do eletrodo dielétrico 200 em si, em que o material escolhido como material de barreira possua propriedades dielétricas adequadas e seja também um material piezoelétrico. Neste caso, a energia acústica é transmitida ao fluido em tratamento ou teste concomitantemente (em espaço e tempo) com a aplicação do potencial aplicado. Neste caso, a energia acústica possui a mesma duração e intervalo de pulso que o campo aplicado. Também é possível que ambos os meios de aplicação da energia acústica possam ser empregados em um único sistema. Ou seja, o eletrodo dielétrico formado por um material piezoelétrico atua para transmitir o campo elétrico e a energia acústica para o fluido em tratamento simultaneamente, enquanto um transdutor eletroacústico ou mecanoacústico dedicado é posicionado e configurado para transmitir energia acústica ao fluido em tratamento de forma concorrente, concatenada e/ou conseqüente ao campo aplicado.

A aplicação de uma onda acústica pulsada longitudinal frente a uma célula biológica, durante ou imediatamente após ser eletroporada, apresenta uma pressão de radiação periódica à membrana celular. Como a eletroporação faz com que poros abertos se desenvolvam através da membrana celular, a ação da pressão de radiação, apresentada como força perpendicular ao eixo polar da membrana da célula, faz com que a célula se deforme. Dada a inércia da massa da célula e a viscosidade do sobrenadante, a célula se achata no pólo sob a influência da força de radiação. Como a membrana celular se achata no pólo (o eixo polar sendo paralelo ao vetor da força de radiação), o ângulo incidente entre o vetor de radiação e as porções da membrana radiais ao eixo polar diminui progressivamente, ou seja, se torna mais perpendicular ao vetor da força, avançando assim o processo de achatamento. Este processo de achatamento continua até que a força de radiação seja superada pela força inercial contrária e pela força de viscosidade em ação e que a célula comece a se mover. Durante o período de achatamento, contudo, ocorre uma ou ambas de duas coisas relativas à geometria celular: 1) o volume interno da célula diminui ou 2) área da membrana aumenta (por estiramento). A força resultante da pressão de radiação acústica longitudinal plano-onda normal é um fenômeno de estado de equilíbrio, assim a ação de achatamento somente ocorre uma vez, após o que a forma da célula tende a se recuperar, e então toda a célula tende a se mover com a frente da célula. Se a energia acústica for pulsada, no entanto, a ação de achatamento/recuperação segue na freqüência do pulso, contanto que a freqüência do pulso se apresente a uma freqüência menor que o tempo de relaxamento para recuperação da forma mecânica da célula. Como a deformação aumenta e diminui periodicamente o volume interno da célula, o resultado é uma ação de "bombeamento". A ação de bombeamento faz com que o fluido citoplásmico seja bombeado para fora da célula, além do fluido extracelular (sobrenadante) ser bombeado para dentro da célula. A ação serve para acelerar paralisia celular, levando à morte e/ou inativação metabólica do organismo, aumentando assim a eficiência e/ou a fração morta para uma dada intensidade de campo elétrico e um dado período de exposição ao campo.

Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhes com relação a várias formas de execução, existem variações e modificações adicionais dentro do escopo e do espírito da presente invenção, conforme descritas e definidas nas reivindicações abaixo.

Claims

1. "SISTEMA DE ALTA IMPEDÂNCIA PARA GERAÇÃO DE UWI CAWIPO ELÉTRICO", caracterizado por ser composto de: um par de eletrodos de material dielétrico, em que cada eletrodo possui pelo menos uma superfície revestida com material eletricamente condutor, e no qual o dito material dielétrico forma uma barreira que separa o revestimento condutor do fluido em tratamento; um caminho ou área de espaço para o fluido, formado entre o par de eletrodos de tal forma que o material condutor esteja em uma superfície do eletrodo sem contato com o fluido em questão no caminho ou espaço; uma fonte de voltagem variável com o tempo, invariável com o tempo ou pulsante, aplicada entre os eletrodos, e um invólucro contendo o dito par de eletrodos, sendo configurado para manter um fluido estático ou dinâmico em questão no dito caminho ou espaço.

2. "SISTEWIA DE ALTA IWIPEDÂNCIA PARA GERAÇÃO DE UWI CAWIPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo material dielétrico possuir coletivamente uma permissividade estática maior que 8,8e-11 Fm"1 a < 1,0 kHz, uma resistividade de volume maior que 1.0E+04 Qcm e um estresse de campo elétrico máximo permitido maior que 1,0 kVmm-1.

3. "SISTEWIA DE ALTA IWIPEDÂNCIA PARA GERAÇÃO DE UWI CAWIPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos eletrodos serem alongados, com seção transversal quadrada e dispostos em paralelo.

4. "SISTEWIA DE ALTA IWIPEDÂNCIA PARA GERAÇÃO DE UWI CAWIPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo caminho ou espaço para o fluido está entre os eletrodos.

5. "SISTEWIA DE ALTA IWIPEDÂNCIA PARA GERAÇÃO DE UWI CAWIPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos eletrodos serem tubos alongados com diâmetros diferentes.

6. "SISTEMA DE ALTA IMPEDÂNCIA PARA GERAÇÃO DE UM CAMPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelos eletrodos serem dispostos em geometria coaxial com o eletrodo de menor diâmetro posicionado no eletrodo de maior diâmetro, formando um caminho ou espaço anelar para o fluido entre eles.

7. "SISTEMA DE ALTA IMPEDÂNCIA PARA GERAÇÃO DE UM CAMPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela superfície externa do eletrodo de diâmetro maior e a superfície interna do eletrodo de diâmetro menor são revestidas com material condutor de eletricidade.

8. 'SISTEMA DE ALTA IMPEDÂNCIA PARA GERAÇÃO DE UM CAMPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo material da barreira dielétrica ser uma cerâmica de alta permissividade, composto de partícula/epóxi ou outro material dielétrico adequado.

9. "SISTEMA DE ALTA IMPEDÂNCIA PARA GERAÇÃO DE UM CAMPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fluido em teste ou tratamento ser uma fase sólida, liquida ou gasosa.

10. "SISTEMA DE ALTA IMPEDÂNCIA PARA GERAÇÃO DE UM CAMPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por incluir meios para a aplicação de energia acústica pulsada ao fluido em questão.

11. "SISTEMA DE ALTA IMPEDÂNCIA PARA GERAÇÃO DE UM CAMPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por incluir também um transdutor eletroacústico ou mecanoacústico operável para aplicação de energia acústica ao fluido em questão.

12. "SISTEMA DE ALTA IMPEDÂNCIA PARA GERAÇÃO DE UM CAMPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos eletrodos serem fabricados de material piezoelétrico operável para aplicação de energia acústica ao fluido em questão.

13. "SISTEMA DE ALTA IMPEDÃNCIA PARA GERAÇÃO DE UM CAMPO ELÉTRICO", caracterizado por ser composto de: um par de eletrodos material dielétrico, no qual cada eletrodo possui pelo menos uma superfície revestida com material eletricamente condutor; tal material dielétrico forma uma barreira, separando o revestimento condutor do fluido em teste ou tratamento, possuindo uma permissividade maior que 8,8e-11 Fm"1 a < 1,0 kHz, uma resistividade de volume maior que 1.0E+04 Qcm e um estresse de campo elétrico máximo permitido maior que 1,0 kVmm"1; um caminho ou espaço para o fluido, formado entre o par de eletrodos de tal forma que o material condutor esteja em uma superfície do eletrodo sem contato com o fluido em questão no caminho ou espaço; uma fonte de voltagem variável com o tempo, invariável com o tempo ou pulsada, aplicada nos eletrodos, em que o material dielétrico é disposto em geometria paralela ou coaxial formando uma rede de capacitores em série com o fluido em teste ou tratamento, concentrando ou intensificando o campo elétrico apresentado ao dito fluido, e um invólucro contendo o dito par de eletrodos, sendo configurado para manter um fluido estático ou dinâmico em questão no dito caminho ou espaço.

14. "SISTEMA DE ALTA IMPEDÃNCIA PARA GERAÇÃO DE UM CAMPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo material da barreira dielétricaJsolar o fluido do revestimento condutor de eletricidade, impedindo substancialmente a corrente faradaica e a eletroquímica nas interfaces fluido/eletrodo.

15. "SISTEMA DE ALTA IMPEDÃNCIA PARA GERAÇÃO DE UM CAMPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo material da barreira dielétrica isolar o fluido do revestimento condutor de eletricidade, impedindo substancialmente a corrente de condução eletrônica e iônica através do sistema e seu aquecimento ôhmico.

16. "SISTEMA DE ALTA IMPEDÂNCIA PARA GERAÇÃO DE UIVI CAMPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por ser composto de um dispositivo para aplicação de energia acústica pulsada ao fluido sob tratamento ou teste do campo elétrico em questão, sendo tal energia acústica aplicada em tempo ou espaço concorrentes e/ou concatenados no tempo ou espaço e/ou conseqüentes em tempo ou espaço com a aplicação do campo elétrico.

17. "SISTEMA DE ALTA IMPEDÂNCIA PARA GERAÇÃO DE UM CAMPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por incluir também um transdutor eietroacústico ou mecanoacústico operável para aplicação de energia acústica ao fluido em questão.

18. "SISTEMA DE ALTA IMPEDÂNCIA PARA GERAÇÃO DE UM CAMPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos eletrodos serem fabricados de matéria! piezoelétrico operável para aplicação de energia acústica ao fluido em questão.

19. "MÉTODO DE APLICAÇÃO DE UM CAMPO ELÉTRICO A UM FLUIDO EM QUESTÃO", caracterizado por ser composto de: formação de um caminho ou espaço para o fluido entre um par de eletrodos, em que os eletrodos são compostos por material dielétrico e no qual cada eletrodo possui pelo menos uma superfície revestida com material eletricamente condutor, e no qual o dito material dielétrico forma uma barreira que separa o revestimento condutor do fluido em tratamento ou teste, sendo o dito matéria! condutor posicionado em uma superfície do eletrodo sem contato com o fluido em questão no caminho ou espaço; acomodação dos ditos eletrodos de forma que o fluido em questão seja mantido em estado estático ou dinâmico dentro do dito caminho ou espaço; aplicação de uma fonte de voltagem variável com o tempo, invariável com o tempo ou pulsada a cada superfície dos eletrodos revestidos com o material condutor, criando assim um campo elétrico ao longo e através do fluido no caminho ou espaço, e entrada do fluido no caminho ou espaço, de forma que o dito fluido seja exposto ao campo elétrico e, assim, tratado ou testado.

20. "MÉTODO DE APLICAÇÃO DE UM CAMPO ELÉTRICO A UM FLUIDO EM QUESTÃO", de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por incluir ainda a seleção de um material dielétrico com permissividade maior que 8,8e-11 Fm-1 a < 1,0 kHz, resistividade de volume maior que 1.0E+0 Qcm e um estresse de campo elétrico máximo permitido maior que 0,0 kVmm-1, isolando eletricamente o fluido em questão e, assim, impedindo substancialmente a corrente faradaica, a corrente de condução elétrica e a eletroquímica na interface fluido/eletrodo, assim como o aquecimento ôhmico através do material em teste ou tratamento.

21. "MÉTODO DE APLICAÇÃO DE UM CAMPO ELÉTRICO A UM FLUIDO EM QUESTÃO", de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por incluir ainda dois eletrodos dielétricos formando um caminho ou espaço para fluido entre dois eletrodos alongados paralelos, no qual os eletrodos possuem seção transversal quadrada ou retangular, e no qual a dita geometria paralela do eletrodo forma uma rede de capacitores em série com o. fluido em questão, aumentando ou concentrando assim o campo elétrico através do fluido em questão.

22. "MÉTODO DE APLICAÇÃO DE UM CAMPO ELÉTRICO A UM FLUIDO EM QUESTÃO", de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por incluir ainda dois eletrodos dielétricos formando um caminho ou espaço para fluido entre dois eletrodos tubulares dispostos de forma coaxial, e no qual a dita geometria coaxial do eletrodo forma uma rede de capacitores em série com o fluido em questão, aumentando ou concentrando assim o campo elétrico através do material em teste ou tratamento.

23. "MÉTODO DE APLICAÇÃO DE UM CAMPO ELÉTRICO A UM FLUIDO EM QUESTÃO", de acordo com a reivindicação 19, caracterizado ainda por um fluido em teste ou tratamento que é uma fase sólida, líquida ou gasosa.

24. "MÉTODO DE APLICAÇÃO DE UM CAMPO ELÉTRICO A UM FLUIDO EM QUESTÃO", de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por incluir ainda a aplicação de energia acústica ao fluido em tratamento òu teste de forma concorrente, concatenada e/ou conseqüente à aplicação do campo elétrico.

25. "MÉTODO DE ALTA IMPEDÂNCIA PARA EXPOSIÇÃO DE UM FLUIDO EM QUESTÃO A UM CAMPO ELÉTRICO", caracterizado por ser composto de: formação de um caminho ou espaço para o fluido entre um par de eletrodos, em que ! os eletrodos são compostos por material dielétrico e no qual cada eletrodo possui pelo menos uma superfície revestida com material eletricamente condutor, e no qual o dito material dielétrico forma uma barreira que separa o revestimento condutor do fluido em tratamento ou teste, sendo o dito material condutor posicionado em uma superfície do eletrodo sem contato com o fluido em questão no caminho ou espaço; acomodação dos ditos eletrodos de forma que um fluido em questão seja mantido em estado estático ou dinâmico dentro do dito caminho ou espaço; aplicação de uma fonte de voltagem variável com o tempo, invariável com o tempo ou pulsada nos eletrodos, em que o material dielétrico é disposto em geometria paralela ou coaxial formando uma rede de capacitores em série com o fluido em teste ou tratamento, concentrando ou intensificando o campo elétrico apresentado ao dito fluido, e entrada do fluido no caminho ou espaço, de forma que o dito fluido seja exposto ao campo elétrico.

26. "MÉTODO DE ALTA IMPEDÂNCIA PARA EXPOSIÇÃO DE UM FLUIDO EM QUESTÃO A UM CAMPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por incluir ainda o material dielétrico que isola o fluido do revestimento condutor de eletricidade, impedindo substancialmente a corrente faradaica, a corrente de condução elétrica e a eletroquímica nas interfaces fluido/eletrodo.

27. MÉTODO DE ALTA IMPEDÂNCIA PARA EXPOSIÇÃO DE UM FLUIDO EM QUESTÃO A UM CAMPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por incluir ainda uma cerâmica de alta permissividade, composto de partícula/epóxi ou outro material adequado como material dielétrico.

28. "MÉTODO DE ALTA IMPEDÂNCIA PARA EXPOSIÇÃO DE UM FLUIDO EM QUESTÃO A UM CAMPO ELÉTRICO", de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por incluir ainda a aplicação de energia acústica ao fluido, sendo a dita energia acústica aplicada de forma concorrente, concatenada e/ou conseqüente à aplicação do campo elétrico.