KR20220024136A - 챔버의 충전 수준을 제어하는 방법 및 디바이스 - Google Patents

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스펜 헤름스마이어
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론차 콜로그네 게엠베하
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Abstract

본 발명은 현탁액에 전기장을 인가하기 위한 디바이스의 적어도 하나의 챔버 내에서 세포, 세포 유도체, 세포소기관, 세포내 입자 및/또는 소수포의 현탁액의 충전 수준을 제어하는 방법 및 디바이스에 관한 것이다. 다수의 전기천공 사이클이 수행되는 경우 챔버의 과충전을 피하고 예측할 수 없는 챔버 체적의 환경에서 정확한 충전을 달성하기 위해, 챔버에 충전된 현탁액의 양은 유출구 포트에서 전기 저항의 적어도 하나의 변화를 결정함으로써 여러 전기천공 사이클의 과정에서 동적으로 제한된다. 각각의 사이클의 충전 절차 동안 여러 시점에 적어도 하나의 전극과 접지 전극 사이의 저항이 측정된다. 저항의 변화가 검출되고 나면, 종료 루틴이 개시되고 충전 절차가 최종적으로 종료된다. 따라서, 챔버의 정확한 충전이 각각의 전기천공 사이클 동안 보장되고, 따라서, 개선된 재현성의 전기천공 성능이 보장될 수 있다.

Description

챔버의 충전 수준을 제어하는 방법 및 디바이스
본 발명은 현탁액에 전기장을 인가하기 위한 디바이스의 적어도 하나의 챔버 내에서 세포, 세포 유도체, 세포소기관, 세포내 입자 및/또는 소수포의 현탁액의 충전 수준을 제어하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 적어도 하나의 챔버 내에서 세포, 세포 유도체, 세포소기관, 세포내 입자 및/또는 소수포의 현탁액에 전기장을 인가하기 위한 디바이스에 관한 것으로, 이는 적어도 제1 전극 및 제2 전극, 챔버의 일 단부에 배치된 적어도 하나의 유입구 포트, 및 챔버의 반대쪽 단부에 배치된 적어도 하나의 유출구 포트를 포함하고, 제1 전극은 유입구 포트에서 챔버 내에 배치되고 제2 전극은 유출구 포트에서 챔버 내에 배치되고, 챔버는 적어도 하나의 접지 전극을 더 포함한다.
생물학적 활성 분자, 예를 들어, DNA, RNA 또는 단백질을 살아있는 세포, 세포 유도체, 세포소기관, 세포내 입자 및/또는 소수포에 도입하는 것은 예를 들어, 이러한 분자의 생물학적 기능을 조사하는 역할을 할 수 있으며, 또한, 예를 들어, 유전자 요법에서 이러한 분자의 치료적 사용의 성공을 위한 필수 전제 조건이다. 세포 내로 외부 분자를 도입하는 바람직한 방법은 화학적 방법과 달리 표적 세포의 구조 및 기능의 바람직하지 않은 변화를 제한하는 소위, 전기천공 (electroporation)이다. 전기천공에서 외부 분자는 수용액, 바람직하게는 세포에 특이적으로 적응된 완충 용액 또는 세포 배양 배지로부터 짧은 전류 유동, 즉, 세포막을 외부 분자에 대해 일시적으로 투과성이 되게 하는 방전 커패시터의 펄스를 통해 세포 내로 도입된다. 세포막에 형성된 일시적인 "공극(pore)"은 생물학적 활성 분자가 이미 그 기능을 수행하거나 검사될 임의의 치료 작용을 발휘할 수 있는 세포질에 먼저 도달한 다음 특정 조건 하에서 예를 들어, 유전자 요법 응용에서 필요로 하는 세포 핵에 또한 도달하게 한다. 강한 전기장, 즉, 높은 전류 밀도를 갖는 짧은 펄스의 짧은 인가로 인해, 세포, 세포 유도체, 세포소기관, 세포내 입자 및/또는 소수포가 또한 융합될 수 있다. 이러한 소위 전기융합에서, 세포는 예를 들어, 처음에 비균일 교번 전기장에 의해 막과 밀접하게 접촉하게 된다. 전기장 펄스의 후속 인가는 멤브레인 부분 사이의 상호 작용을 초래하여 궁극적으로 융합을 초래한다. 전기천공에 사용되는 것과 유사한 디바이스를 전기융합에도 사용할 수 있다.
세포를 전기천공하는 동안 반응 챔버 내부에 소정량의 잔해와 발포체가 생성된다. 예를 들어, 공기를 밀어 넣거나 챔버를 중력 배액함으로써, 처리된 세포 현탁액이 반응 챔버에서 제거될 때, 이 잔해와 발포체가 챔버 내부에 남게 되고 다른 전기천공 사이클을 위해 이 챔버에 충전될 새로운 세포 현탁액의 충전 체적을 감소시킨다. 즉, 챔버 체적이 변할 수 있으며, 따라서, 다음 충전에 필요한 체적을 거의 예측할 수 없게 만든다. 이러한 방식으로 처리되지 않는 귀중한 물질로 챔버를 과충전하는 것을 방지하기 위해서는, 따라서, 챔버에 충전되는 양을 이에 따라 동적으로 제한하는 것이 중요하다. 그러나, 과충전을 방지하기 위해 예방적으로 더 적은 체적을 충전하는 것은 공기-액체 계면에서 아크 방전 생성에 유리한 불충분한 충전을 유발한다. 아크 방전은 전기 인터페이스와 컴포넌트를 손상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 반응 챔버 내부의 생물학적 물질에도 유해할 수 있는 열과 고전류를 생성한다. 또한, 시스템의 최종 사용자는 튜브에 대한 장력이 정의되지 않은 상태로 튜브를 삽입하고, 이는 내경을 알 수 없게 한다. 연동 펌프를 사용하는 경우 이는 다시 펌프 회전당 처리된 체적의 불확실성을 야기한다. 따라서 우수한 재현성의 전기천공 성능을 위해서는 정확한 충전이 달성되어야 한다.
EP 3 138 920 B1은 세포의 전기천공 방법 및 전기천공을 위한 일회용 디바이스를 개시하고 있다. 디바이스는 세포 현탁액 및 세포 내로 전달될 화합물을 포함하는 유체를 수용하는 유체 격실을 포함한다. 디바이스는 대응하는 접지 전극뿐만 아니라 제1 전극 및 제2 전극을 더 포함한다. 유체는 미리 정의된 충전 수준으로 유체 구획으로 도입되며, 충전 수준은 제1 전극과 제2 전극 사이의 정전용량 또는 접지 전극 사이의 전기 저항을 측정함으로써 결정된다. 예를 들어, 전극 사이의 최대 용량에 도달할 때까지 충전이 계속된다. 전기천공 후 처리된 세포 현탁액은 유체 격실에서 비워진다. 유체 구획의 충전 수준을 제어하여 디바이스를 반연속 모드로 동작시킬 수 있다. 또한, 더 많은 체적의 세포 현탁액을 처리하기 위해 충전, 전기천공 및 비움 프로세스를 반복할 수 있다.
그러나, 다수의 전기천공 사이클이 수행되어야 하는 경우, 전기천공 챔버의 정확한 충전이 모든 사이클에 대해 보장될 수 없다는 것이 여전히 종래 기술의 디바이스 및 방법의 단점이다.
본 발명의 목적은, 다수의 전기천공 사이클을 수행하더라도 챔버의 과충전을 방지할 수 있고, 모든 사이클에 대해 우수한 재현성의 전기천공 성능을 보장하기 위해, 예측할 수 없는 챔버 체적의 환경에서도 정확한 충전을 달성할 수 있는, 현탁액에 전기장을 인가하기 위한 디바이스의 적어도 하나의 챔버 내에서 세포, 세포 유도체, 세포소기관, 세포내 입자 및/또는 소수포 현탁액의 충전 수준을 제어하기 위한 방법 및 디바이스를 제공하는 것이다.
이 목적은 현탁액에 전기장을 인가하기 위한 디바이스의 적어도 하나의 챔버 내에서 세포, 세포 유도체, 세포소기관, 세포내 입자 및/또는 소수포 현탁액의 충전 수준을 제어하는 방법에 의해 충족되며, 디바이스는 적어도 제1 전극 및 제2 전극, 챔버의 일 단부에 배치된 적어도 하나의 유입구 포트, 및 챔버의 반대쪽 단부에 배치된 적어도 하나의 유출구 포트를 포함하고, 제1 전극은 유입구 포트에서 챔버 내에 배치되고 제2 전극은 유출구 포트에서 챔버 내에 배치되고, 챔버는 적어도 하나의 접지(상대) 전극을 더 포함하고, 이 방법은
a) 현탁액이 유입구 포트를 통해 챔버로 충전되는 충전 절차를 시작하는 단계;
b) 충전 절차 동안 제2 전극과 접지 전극 사이의 챔버 내 전기 저항을 여러 시점에서 측정하는 단계; 및
c) 충전 절차 종료를 포함하는 종료 루틴을 개시하는 단계- 제2 전극과 접지 전극 사이의 전기 저항의 적어도 하나의 변화에 따라 종료 루틴이 개시됨 -를 포함한다.
즉, 본 발명에 따르면 챔버에 충전된 현탁액의 양은 유출구 포트에서 전기 저항의 적어도 하나의 변화를 결정함으로써 여러 전기천공 사이클의 과정에서 동적으로 제한된다. 이를 위해, 제2 전극과 접지 전극 사이, 예를 들어, 유출구 포트 옆에 배치된 전극과 그 상대 전극 사이의 저항은 각각의 사이클의 충전 절차 동안 여러 시점에서 측정된다. 저항의 변화가 검출되고 나면, 종료 루틴이 개시되고, 선택적으로 지연된 종료 루틴 후에 충전 절차가 최종적으로 종료된다. 그 결과, 챔버의 충전 체적이 다수의 전기천공 사이클의 과정에서 연속적으로 감소하더라도 챔버의 과충전을 피할 수 있다. 따라서, 챔버의 정확한 충전이 각각의 전기천공 사이클 동안 보장되고, 따라서, 개선된 재현성의 전기천공 성능이 보장될 수 있다. 귀중하고 값비싼 생물학적 물질의 낭비를 효과적으로 피할 수 있다는 것이 본 발명에 따른 방법의 또 다른 이점이다.
본 발명의 유리한 실시예에서, 종료 루틴은 전기 저항이 미리 결정된 값에 도달했을 때 개시된다. 잔해, 잔류물 및 기포가 종료 루틴 알고리즘을 너무 일찍 트리거하게 할 수 있는 경우, 잔류물과 실제 샘플 효과 사이를 구별하기 위해 경험적으로 결정된 임계값을 도입할 수 있다. 이 실시예에서 종료 루틴은 미리 결정된 저항 값에 도달한 후 및/또는 저항이 이 값 아래로 떨어진 후에만 개시된다. 예를 들어, 저항이 특정 한계(미리 결정된 값) 아래로 떨어지고 나면 디바이스의 제어 시스템이 종료 루틴의 시작을 트리거한다.
본 발명의 다른 유리한 실시예에서 충전 절차는 종료 조건이 충족되면 종료되고, 상기 종료 조건은
- 저항의 변화의 제1 기울기가 제1 미리 결정된 임계값을 초과하는 것, 및
-저항 변화의 제2 기울기가 미리 결정된 제2 임계값에 도달하는 것을 포함하고, 여기서, 제2 임계값은 제1 임계값에 의해 표현되는 기울기보다 더 낮은 기울기를 나타낸다.
이 실시예에 따르면, 챔버에 충전되는 현탁액의 양은 전기 저항의 변화 범위를 결정함으로써 동적으로 제한된다. 즉, 저항 변화의 기울기가 감소하면 종료 루틴이 개시되고 선택적으로 지연된 종료 루틴 후에 충전 절차가 최종적으로 종료된다. 예를 들어, 저항 변화의 기울기가 특정 미리 설정된 임계값(제1 임계값)을 초과하는 것으로 결정되고 나면, 디바이스의 제어 시스템은 다른 특정 미리 설정된 임계값(제2 임계값)에 도달할 때까지 기울기가 다시 감소하기를 기다린다.
본 발명의 다른 유리한 실시예에서, 종료 조건은 제2 기울기 이후에 결정된 저항 변화의 제3 기울기가 제2 임계값과 같거나 아래에 있는 것을 더 포함한다. 따라서, 측정 변동에 의해 야기되는 부정확성을 감소시키기 위해, 제2 임계값에 도달하거나 적어도 2개의 연속적인 측정이 언더런(underrun)하는 경우에만 충전 절차가 종료된다.
본 발명의 다른 유리한 실시예에서, 종료 루틴은 종료 조건이 충족되는 것으로 결정된 후의 지연된 종료를 포함하고, 여기서, 최종 종료 전에 적어도 하나의 미리 설정된 파라미터에 기초하여 충전 절차가 계속된다. 이러한 조치에 의해, 저항과 충전 수준의 상관 관계에서 경험적으로 결정된 변동을 효과적으로 보상할 수 있다. 즉, 충전간에 지속적으로 증가하는 완벽한 충전량의 편차가 보상될 때까지 충전 절차를 계속한다.
예를 들어, 미리 설정된 파라미터는 연동 펌프에 의해 수행되는 다수의 단계를 포함할 수 있다. 그러나, 처리되는 액체의 양을 정밀하게 제어할 수 있는 임의의 펌프(예컨대, 주사기 또는 주입 펌프)가 본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있다. 연동(스테퍼 모터(stepper motor)) 펌프의 단계 수는 예를 들어, 수학식 N_target = (N_p + N_sts)/2 + P에 의해 계산될 수 있고, 여기서, N_target는 충전 절차를 완료하는 데 필요한 계산된 단계 수이고, N_p는 이전 충전 절차 동안 수행된 단계 수이고, N_sts는 최신 표준 검출 목표 단계 수이고, P는 경험적으로 결정된 단계 수이다. 본 명세서에 사용된 "최신 표준 검출 목표 단계(current standard detection target steps)"라는 표현은 단지 최신 충전 사이클 정보와 독립적으로 계산된 목표 단계 수(펌프 회전 및 그에 따른 체적과 상관됨)를 의미한다. 이 단계 수와 이전 사이클로부터의 단계 수는 그 후 샘플에 의해 야기되는 자연적 변동으로 인해 평균화/평활화된다.
완벽한 충전량과 여전히 편차가 있는 것으로 확인되면, 이 문제는 충전에 연동 펌프의 추가 단계(N)를 추가하여 해결할 수 있다. 따라서, 연동 펌프의 단계 수는 예를 들어, 수학식 N_target = ((N_now + S - R) + N_p) / 2 + P - N에 의해 계산될 수 있고, 여기서, N_target는 충전 절차를 완료하는 데 필요한 계산된 단계 수이고, N_now는 최신 단계 수이고, S는 미리 설정된(경험적으로 결정된) 단계 수이고, R은 전기 전압 펄스의 에너지와 상관된 미리 설정된 단계 수이며, N_p는 이전 충전 절차 동안 수행된 단계 수이고, P는 경험적으로 결정된 단계 수이고, N은 (이전의 모든) 충전 절차(사이클) 수에 20이 승산된 것이다. 본 명세서에 사용된 용어 "최신(current)"은 이 충전에 대한 모든 충전 기준이 충족되고 디바이스의 제어 시스템만이 적절한 충전에 필요한 나머지 단계를 계산/예측하여야 할 때, 진행중인 충전 동안 지금까지 수행된 실제 펌프 단계 수를 지칭한다.
본 발명의 추가적인 유리한 실시예에서, 초기 전달 절차는 충전 절차가 시작되기 전에 시작되며, 상기 전달 절차는 유입구 포트의 상류의 혼합 지점에서 기질 또는 프로브와 세포, 세포 유도체, 세포소기관, 세포내 입자 및/또는 소수포의 현탁액을 혼합하는 것 및 제1 전극에서 저항 강하가 검출될 때까지 유입구 포트를 통해 챔버 내로 혼합물 또는 현탁액을 충전하는 것을 포함하며, 전기 저항은 초기 전달 절차 동안 여러 시점에서 제1 전극과 접지 전극 사이의 챔버 내에서 측정된다. 즉, 이 "프라이밍(priming)" 프로세스에서 제1 전극과 접지 전극 사이, 예를 들어, 유입구 포트 옆에 배치된 전극과 그 상대 전극 사이의 저항이 측정된다. 빈 전기천공 챔버의 무한 전기 저항이 더 낮은 값으로 떨어지면 액체(현탁액/혼합물)가 유입구 포트에 가장 가까운 전극에 도달했음이 확실하게 나타나게 된다. 유입구 포트의 상류에서 프로브와 현탁액을 혼합하고 유입구 포트에서 저항을 측정하는 것은 현탁액이 챔버 내로 도입되기 전에 전기천공을 위해 완벽하게 준비되는 것을 보증하고, 그래서, 튜브 길이, 세포 현탁액의 광학적 특성에 무관해지고, 프라이밍 프로세스 동안 용량성 방법 같은 더 복잡한 측정을 피하게 한다. 특히, 반응 챔버의 유입구 포트에 있는 전극(들)은 액체의 제1 부분이 반응 챔버에 도달한 때를 결정하기 위해 챔버 내부의 액체 기반 전기 변화를 검출하는 데 사용된다.
이 실시예에서, 제1 전극에서 검출된 저항 강하는 5 내지 15 Ohms의 범위, 바람직하게는 약 10 Ohms의 전기 저항의 감소를 포함할 수 있다. 따라서, 유입구 포트에서 세포 현탁액의 저항 기반 액체 검출을 위한 저항 임계값은 예를 들어, 프라이밍 시작시 초기 저항 측정 값보다 약 10 Ohms 낮아야 한다. 제1 전극에서 측정된 저항이 이 10 Ohms만큼 떨어지자마자 현탁액이 검출된 것으로 간주되어야 한다.
기질 또는 프로브와 현탁액의 완전한 혼합을 보장하기 위해, 초기 전달 절차는 저항 강하가 검출될 때 챔버 내로의 현탁액의 충전을 정지하는 것 및 그런 다음, 충전 절차가 시작되기 전에 기질 또는 프로브와 현탁액이 혼합되는 혼합 지점으로 역방향으로 현탁액을 퇴피시키는 것을 더 포함한다. 이러한 조치를 통해, 현탁액이 전기천공을 위해 챔버에 진입하기 전에 기질이나 프로브와 완벽하게 혼합되는 것을 보장한다.
초기 전달 절차가 존재하는 경우, 이는 제1 충전 절차가 시작되기 전에 한 번만 수행된다.
전기천공을 수행하기 위해, 충전 절차가 종료된 후 적어도 하나의 전극을 통해 적어도 하나의 전압 펄스를 공급함으로써 챔버 내의 현탁액에 전기장이 인가된다. 챔버를 현탁액으로 충전하고 후속적으로 적어도 하나의 전압 펄스를 공급하는 것은 미리 정의된 수의 사이클 동안 반복될 수 있다. 따라서, 회분식(batch) 프로세스와 달리, 일종의 반연속 프로세스로 현탁액의 분취액을 전기천공을 연속적으로 반복함으로써 대량의 현탁액을 처리할 수 있다.
이 목적은 또한 적어도 하나의 챔버 내에서 세포, 세포 유도체, 세포소기관, 세포내 입자 및/또는 소수포의 현탁액에 전기장을 인가하기 위한 디바이스에 의해 충족되며, 이는 적어도 제1 전극 및 제2 전극, 챔버의 일 단부에 배치된 적어도 하나의 유입구 포트, 및 챔버의 반대쪽 단부에 배치된 적어도 하나의 유출구 포트를 포함하고, 제1 전극은 유입구 포트에서 챔버 내에 배치되고 제2 전극은 유출구 포트에서 챔버 내에 배치되고, 챔버는 적어도 하나의 접지(상대) 전극을 더 포함한다. 본 발명에 따르면, 적어도 제2 전극은 제2 전극과 접지 전극 사이의 챔버 내부의 전기 저항을 측정하는 제1 센서 전극이다. 유출구 포트에서 전기 저항을 제어함으로써, 챔버의 충전 체적이 다수의 전기천공 사이클의 과정에서 연속적으로 감소하더라도 챔버의 과충전을 피할 수 있다. 따라서, 챔버의 정확한 충전이 각각의 전기천공 사이클 동안 보장되고, 따라서, 개선된 재현성의 전기천공 성능이 보장될 수 있다. 귀중하고 값비싼 생물학적 물질의 낭비를 효과적으로 피할 수 있다는 것이 본 발명에 따른 디바이스의 또 다른 이점이다.
본 발명에 따른 디바이스의 유리한 실시예에서, 제1 전극은 제1 전극과 접지(상대) 전극 사이의 챔버 내의 전기 저항을 측정하기 위한 제2 센서 전극이다. 제1 전극에서 전기 저항을 제어함으로써 액체(현탁액)가 유입구 포트에 가장 가까운 전극에 도달했음을 확실하게 나타낼 수 있다. 특히, 반응 챔버의 유입구 포트에 있는 전극(들)은 액체의 제1 부분이 반응 챔버에 도달한 때를 결정하기 위해 챔버 내부의 액체 기반 전기 변화를 검출하는 데 사용된다.
본 발명은, 다수의 전기천공 사이클을 수행하더라도 챔버의 과충전을 방지할 수 있고, 모든 사이클에 대해 우수한 재현성의 전기천공 성능을 보장하기 위해, 예측할 수 없는 챔버 체적의 환경에서도 정확한 충전을 달성할 수 있는, 현탁액에 전기장을 인가하기 위한 디바이스의 적어도 하나의 챔버 내에서 세포, 세포 유도체, 세포소기관, 세포내 입자 및/또는 소수포 현탁액의 충전 수준을 제어하기 위한 방법 및 디바이스를 제공한다.
본 발명은 도면을 참조하여 추가로 예시적으로 상세히 설명된다.
도 1은 본 발명에 따른 방법의 예시적인 현탁액 처리 절차를 나타내는 흐름도를 도시한다.
도 2는 본 발명에 따른 방법의 초기 전달 절차("프라이밍")의 예시적인 순서를 나타내는 흐름도를 도시한다.
도 3은 충전 절차 및 종료 루틴을 포함하는 본 발명에 따른 방법의 예시적인 실시예를 나타내는 흐름도를 도시한다.
도 4는 본 발명에 따른 디바이스의 유출구 포트에서 전극에 의해 측정된 충전 절차 동안의 예시적인 전기 저항 과정을 나타내는 도면을 도시한다.
X축은 이루어진 측정의 수를 도시하고(간격: 스테퍼 모터 펌프의 약 33 단계);
Y축은 [Ohm] 단위로 측정된 전기 저항을 도시한다.
도 5는 본 발명에 따른 디바이스의 예시적인 실시예의 외부 측면의 사시도를 도시한다.
도 6은 도 5에 따른 디바이스의 하나의 컴포넌트의 내부 측면의 평면도를 도시한다.
도 7은 도 5에 따른 디바이스의 또 다른 컴포넌트의 내부 측면의 평면도를 도시한다.
도 1은 본 발명에 따른 전체 현탁액 처리 프로세스의 실시예의 개요를 도시한다. 먼저 챔버가 현탁액으로 충전되기 전에 초기 전달 절차("프라이밍")가 시작된다. 초기 전달 절차는 유입구 포트의 상류에 있는 혼합 지점에서 기질/프로브와 현탁액을 혼합하는 것 및 유입구 포트를 통해 챔버 내로 혼합물을 충전하는 것을 포함한다. 이 전달 절차는 제1 충전 절차가 시작되기 전에 한 번만 수행된다. 초기 전달 절차는 도 2를 참조하여 더 상세히 설명된다. 프라이밍이 성공적이지 못한 경우 현탁액 처리 프로세스가 종료된다. 프라이밍이 성공적이면 충전 절차가 시작된다. 충전 절차는 현탁액/프로브 혼합물을 챔버에 충전하고 최적의 충전 수준에 도달할 때까지 충전 수준을 제어하는 것을 포함한다. 충전 절차는 도 3을 참조하여 더 상세히 설명된다. 그 후, 혼합물에 하나 이상의 전압 펄스(들)를 인가함("펄싱")으로써 전기천공을 수행한다. 펄싱 이후, 그리고 미리 설정된 사이클 수에 아직 도달하지 않은 경우, 챔버가 비워지고 혼합물의 제2(다음) 분취량(aliquot)이 전기천공을 위해 챔버에 충전된다. 충전 및 펄싱 프로세스는 미리 설정된 사이클 수만큼 여러 번 반복될 수 있다. 미리 설정된 사이클 수에 도달하거나, 또는 챔버 내의 2개의 전극 사이에서 측정된 전기 저항이 두 번의 연속 측정에 대해 범위를 벗어나는("Error2") 경우, 챔버가 비워지고 현탁액 처리 프로세스가 최종적으로 종료된다.
도 2는 초기 전달 절차("프라이밍")의 예시적인 순서를 도시한다. 튜브 길이, 현탁액의 광학적 특성과 무관해지고 초기 전달 절차 동안 용량성 방법과 같은 더 복잡한 측정을 피하기 위해, 반응 챔버의 전극을 사용하여, 현탁액의 제1 분획물이 반응 챔버에 도달할 때를 결정하기 위해 챔버 내부의 액체 기반 전기 변화를 관찰한다. 이를 위해, 초기 전달 절차("프라이밍")는 세포, 세포 유도체, 세포소기관, 세포내 입자 및/또는 소수포의 현탁액을 제1 저장소로부터 혼합 지점으로, 이어서 반응 챔버의 유입구 포트로 펌핑하는 제1 펌프(도 2에서 언급된 "상부 펌프", 제1 펌프는 본 예에서 연동식 스테퍼 모터 펌프임)를 시동함으로써 시작된다. 챔버의 제1 전극(도 2에서 언급된 "최하위(전극) 세그먼트")에서의 전기 저항 측정은 제1 펌프의 미리 설정된 수의 단계가 수행되었을 때 시작된다. 예를 들어, 펌핑은 저항 측정을 시작하기 전에 1,000 단계로 시작할 수 있다. 이는 시작하자마자 저항에 영향을 미치고 이동하는 작은 액체 분획물에 면역적이다(도 4, "초기 저항의 강하" 참조). 제1 전극에서 측정된 저항이 미리 설정된 타임아웃 기간(예를 들어, 60초) 내에 미리 결정된 임계값 아래로 떨어지면 제1("상부") 펌프가 정지된다. 예를 들어, 저항 임계값은 프라이밍 시작시 처음에 측정된 저항 값보다 약 10 Ohms 낮을 수 있다. 제1 전극에서 측정된 저항이 10 Ohms만큼 떨어지자마자 현탁액이 검출된 것으로 간주되어야 한다. 즉, 이 "프라이밍" 프로세스에서 제1 전극과 접지 전극 사이의 유입구 포트 근방의 저항이 측정된다. 빈 전기천공 챔버의 무한 전기 저항이 미리 결정된 임계값 아래로 떨어지면, 현탁액이 유입구 포트에 가장 가까운 전극에 도달했음이 확실하게 나타날 수 있다.
충분한 저항 강하의 검출로 인해 제1 펌프가 정지되고 별도의 기질/프로브 공급이 선택되지 않은 경우, 초기 전달 절차가 종료되고 충전 절차가 시작된다(도 3 참조). 그러나, 제1 전극에서 저항 강하가 검출되지 않으면, 이 경우, 제1("상부") 펌프가 마찬가지로 정지되고 루틴은 오류 표시와 함께 종료된다. 충분한 저항 강하의 검출로 인해 제1 펌프가 정지되고 별도의 기질/프로브 공급이 형성되어 있는 경우, 현탁액은 제1 펌프의 작동 방향을 반대로 하여 혼합 지점으로 퇴피된다. 혼합 지점에서, 현탁액이 기질 또는 프로브와 혼합된다. 이를 위해 제2 펌프(도 2에서 언급된 "하부 펌프", 제2 펌프는 본 예에서 연동 스테퍼 모터 펌프임)가 시동되어 제2 저장소로부터 혼합 지점으로 기질 또는 프로브를 펌핑한다. 유입구 포트의 상류에서 프로브와 현탁액을 혼합하고 혼합물이 챔버에 진입할 때 저항을 측정하는 것은 현탁액이 챔버에 도입되기 전에 전기천공을 위해 현탁액이 완벽하게 준비되는 것을 보증한다. 따라서, 다양한 튜브 길이와 현탁액의 다양한 광학적 특성으로 인한 불완전한 혼합물을 피할 수 있다. 바람직하게는, 적어도 하나의 광학 센서는 기질 또는 프로브를 포함하는 액체를 검출하기 위해 제2 저장소와 혼합 지점을 연결하는 튜브에서 혼합 지점의 상류에 배치된다. 미리 설정된 타임아웃 기간 내에 광학적으로 액체가 검출되지 않으면, 제2 "하부" 펌프가 정지되고 루틴이 오류 표시와 함께 종료된다. 그러나, 기질/프로브를 포함하는 액체가 검출되면, 제2 "하부" 펌프가 마찬가지로 정지되고, 혼합 지점과 유입구 포트를 연결하는 튜브는 그 후 두 펌프가 동시에 작동하여 유입구 포트(도 2에서 언급한 바와 같은 "카트리지 입구(entrance)")에 도달할 때까지 혼합물로 충전된다. 그 후, 초기 전달 절차가 종료되고 충전 절차가 시작된다(도 3 참조).
도 3은 본 발명에 따른 충전 절차 및 종료 루틴의 예시적인 실시예를 도시하고 있는 반면, 도 4는 충전 절차 동안의 전형적인 저항 특성을 도시한다. 본 발명에 따르면, 반응 챔버의 충전은 유출구 포트(제2 전극)에서 챔버의 전기 저항 특성을 모니터링함으로써 제어된다. 충전 절차가 시작되면, 적어도 하나의 펌프(예를 들어, 도 2에 따른 제1("상부") 및/또는 제2("하부") 펌프)가 특정 체적의 현탁액/혼합물을 챔버로 펌핑한다. 예를 들어, 연동(스테퍼 모터) 펌프를 사용하는 경우, 펌프는 미리 결정된 모터 단계 수(N_p)로 설정된다. 제1 충전(사이클)에 대해 N_p는 디폴트(default) 값으로 설정되고 모든 추가 충전(사이클)에 대해 N_p는 이전 충전의 값을 기초로 미리 결정된 값으로 설정된다.
전체 충전 절차 동안, 반응 챔버의 유출구 포트에서 제2 전극의 저항 값이 연속적으로 측정된다. 저항이 미리 결정된 값(한계 "임계값 T1") 아래로 떨어지고 나면 종료 루틴이 개시된다. 시스템이 저항 변화의 제1 기울기가 미리 결정된 제1 임계값(T2)을 초과한다고 결정하면, 시스템은 저항 변화의 제2 기울기가 적어도 2번의 연속 측정에 대해 미리 결정된 제2 임계값(T3)에 도달할 때까지 기울기가 다시 감소하기를 기다린다. 이러한 기준이 충족되면, 펌프(N_now 단계에 있음)는 다른 고정량의 단계(S) 동안 계속 회전한다. 체적 감소의 효과는 또한 전달된 전압 펄스의 에너지에 의해 영향을 받기 때문에, 이는 목표 단계 수를 R만큼 감소시킴으로써 펌프 보정으로 진행한다.
광범위한 실험을 통해, 최신 충전(제1 충전 사이클이 아닌 경우)에 대한 목표 펌프 단계를 다음과 같이 설정하면 저항과 충전 수준의 상관 관계 변동을 충분히 감소시킬 수 있음이 나타났다:
(이전 충전의 단계 수 "N_p" + 최신 표준 검출 목표 단계) / 2 + 고정 값(P)
이들 실험은 충전간에 지속적으로 증가하는 완벽한 충전량과의 편차를 여전히 나타내었다. 이는 일정한 값과 최신 충전 사이클의 곱인 추가 단계 N을 충전에 추가하여 해결된다:
N_target = ((N_now + S - R)+N_p)/2 + P - N
이러한 추가 펌프 단계가 수행된 후, 챔버 충전이 종료된다. 또한, 펌프의 단계 수는 이전 충전 단계보다 더 높을 수 없다(제1 충전 사이클이 아닌 경우). 따라서, 미리 설정된 최대 펌프 단계 수(N_max)에 도달하면, 챔버 충전이 종료된다.
T1은 예를 들어, 500Ohm으로 설정될 수 있으며;
T2는 예를 들어, 50Ohm/400 펌프 단계(시스템에 따라 다름)로 설정될 수 있고;
T3은 예를 들어, 20Ohm으로 설정될 수 있고;
S는 예를 들어, 850으로 설정될 수 있고;
R은 전압 펄스 에너지와 상관되는 단계 수로 설정되고;
P는 경험적으로 결정된 값(예를 들어, 200)이고;
N은 예를 들어, 20이 승산된 충전 사이클 수로 설정되고;
N_now는 최신 단계 수이고;
N_p는 이전의 조합된 단계 수이다(제1 펌프 + 제2 펌프)이고;
N_target는 최신 충전을 완료하기 위한 목표 단계 수(제1 펌프 + 제2 펌프 조합)이다.
도 5는 본 발명에 따른 디바이스(1)의 예시적인 실시예의 외부 측면을 도시하고, 도 6 및 도 7은 각각 도 5에 따른 디바이스(1)의 하나의 컴포넌트의 내부 측면을 도시한다. 디바이스(1)는 베이스 부재(2, 30)를 포함하고, 각각의 베이스 부재(2, 30)는 서로 부착되는 2개의 컴포넌트(베이스 부재(2, 30))로 조립된 디바이스(1)의 컴포넌트를 나타낸다. 그 외부 측면에서, 베이스 부재(2, 30)는 각각 도관을 곡선형 반응 챔버(6)의 포트(7, 8, 10, 11)에 연결하기 위한 커넥터(31)를 구비한다. 처리될 현탁액/프로브를 위한 하나 이상의 저장소 및 처리된 현탁액을 위한 하나 이상의 용기는 적절한 도관을 통해 커넥터(31)에 연결될 수 있다. 현탁액은 저장소(들)/컨테이너(들)과 커넥터(31) 사이의 현탁액 회로에 연결될 수 있는 펌핑 요소, 예를 들어, 진공 펌프 또는 연동 펌프 등에 의해 챔버(6)에 충전되고 그로부터 배출될 수 있다. 디바이스(1)가 공통 도관 및 펌핑 시스템과 호환되도록 하기 위해, 커넥터(31)는 루어 슬립(Luer slip) 또는 루어 락 커넥터(Luer lock connector)일 수 있다.
베이스 부재(30)는 챔버(6) 내의 전극(4, 5)에 전기적 연결을 제공하기 위한 다수의 전도성 영역(32)을 더 포함한다. 전도성 영역(32)은 전기 전도성 폴리머, 특히 전기 전도성 물질 또는 고유 전도성 폴리머로 도핑된 폴리머를 포함할 수 있다. 전도성 영역(32)은 전극(4, 5)과 적어도 하나의 전기 접점(33) 사이에 전기적 연결을 제공하도록 설계된다. 이 실시예에서, 전도성 영역(32)은 전기 전도성 물질로 적어도 부분적으로 충전된 베이스 부재(30)의 구멍이다. 전도성 영역(32)은 적어도 하나의 전도성 경로, 예를 들어, 베이스 부재(도시되지 않음)의 층 상의 구리 트랙을 통해 적어도 하나의 전기 접점(33)과 전기적으로 결합된다. 전기 접점(33)은 전원 및/또는 전압 펄스 발생기에 직접 또는 간접 전기적 연결을 제공하기 위해 적어도 하나의 전기 접점에 의해 접촉될 수 있다.
베이스 부재(2, 30) 각각은 4개의 전극(4, 5)이 제공된 곡선형 리세스(3)를 포함한다. 디바이스(1)의 바람직한 실시예에 따르면, 챔버(6)는 적어도 2개의 세그먼트를 포함할 수 있고, 각각의 세그먼트는 적어도 2개의 전극을 포함하고, 접지(상대) 전극은 적어도 2개의 세그먼트의 공통 전극이다. 즉, 3개의 전극은 세그먼트 전극(4)인 반면 하나의 전극은 상대 전극(5)이다. 베이스 부재(2)는 서로 부착되는 2개의 컴포넌트로 조립된 디바이스(1)의 하나의 컴포넌트를 나타내며, 여기서 이러한 컴포넌트의 적어도 내부 측면은 반대로 설계된다. 즉, 베이스 부재(2)와 베이스 부재(30)는 서로 부착된 경면 반전된(mirror-inverted) 내부 측면을 갖고, 따라서, 베이스 부재(2, 30)의 리세스(3)는 세포, 세포 유도체, 세포소기관, 세포내 입자 및/또는 소수포의 현탁액을 보유하기 위한 챔버(6)를 형성한다. 이 챔버(6)에서, 예를 들어, 핵산 또는 단백질과 같은 생물학적 활성 분자를 세포, 세포 유도체, 세포소기관, 세포내 입자 및/또는 소수포에 전달하기 위해 세포, 세포 유도체, 세포소기관, 세포내 입자 및/또는 소수포에 전기장이 인가될 수 있다. 이를 위해, 베이스 부재(2)의 전극(4, 5)과 베이스 부재(30)의 대응하는 전극(4, 5)은 전극 쌍을 형성하고, 베이스 부재(2)의 세그먼트 전극(4)과 베이스 부재(30)의 대향하여 배열된 상대 전극(5)은 3개의 전극 쌍을 형성하는 반면, 베이스 부재(2)의 상대 전극(5)과 베이스 부재(30)의 대향하여 배열된 3개의 세그먼트 전극(4)은 또한 3개의 전극 쌍을 형성한다. 이 구성에서, 베이스 부재(2)의 상대 전극(5)과 베이스 부재(30)의 상대 전극(5)은 각각 3개의 세그먼트의 공통 전극이고, 따라서, 챔버(6)는 6개의 세그먼트를 포함하고, 여기서 각각의 세그먼트에는 하나의 세그먼트 전극(4)과 하나의 공통 상대 전극(5)의 영역이 제공된다.
2개의 포트(7, 8)가 챔버(6)의 일 단부(9)에 배치되고 2개의 포트(10, 11)가 챔버(6)의 반대쪽 단부(12)에 배치된다. "하부" 단부(12)에서, 포트(10, 11)의 하나의 포트는 챔버(6)를 충전하기 위한 유입구 포트로 사용될 수 있고 포트(10, 11)의 다른 포트는 챔버(6)를 배출하기 위한 유출구 포트 또는 챔버(6)를 비우기 위한 추가 유출구 포트로 사용할 수 있다. 반대쪽 단부(9)에서 포트(7, 8)의 하나의 포트는 챔버(6)를 배출하기 위한 유출구 포트로서 사용될 수 있고, 포트(7, 8)의 다른 포트는 챔버(6)를 배출하기 위해 또는 예를 들어, 챔버(6)를 환기하기 위해 추가 유출구 포트로 사용될 수 있다. 따라서, 이 예시적인 실시예에서, 각각의 단부(9, 12)에는 2개의 포트(7, 8, 10, 11)가 제공되고, 이를 통해 챔버(6)가 현탁액으로 충전될 수 있고/있거나 이를 통해 현탁액이 챔버(6) 밖으로 퍼지될 수 있다. 유동 방향에 따라, 챔버의 일 단부는 적어도 하나의 유입구 포트를 포함하는 반면 챔버의 반대쪽 단부는 적어도 하나의 유출구 포트를 포함한다. 예를 들어, 포트(10, 11) 중 적어도 하나를 유입구 포트로 사용하고, 포트(7, 8) 중 적어도 하나를 유출구 포트로 사용하는 경우, 단부(12)의 유입구 포트(10, 11) 옆에 있는 전극(4)은 정의에 따라 제1 전극(20)(제2 센서 전극)이고, 단부(9)의 유출구 포트(7, 8) 옆의 전극(4) 정의에 따라 제2 전극(21)(제1 센서 전극)이다. 따라서, 본 예시적인 실시예에서, 베이스 부재(30)의 제2 전극(21)과 베이스 부재(2)의 접지 전극(5) 사이에서 충전 절차를 제어하기 위한 전기 저항을 측정한다. 초기 전달 절차를 제어하기 위한 전기 저항의 측정은 베이스 부재(2)의 제1 전극(20)과 베이스 부재(30)의 접지 전극(5) 사이에서 측정된다. 그러나, 앞서 설명한 바와 같이 본 발명에 따른 방법을 달성하기에 적절한 한, 임의의 다른 전극 구성 및/또는 챔버 설계가 실현될 수 있다.

Claims (15)

  1. 현탁액에 전기장을 인가하기 위한 디바이스의 적어도 하나의 챔버 내에서 세포, 세포 유도체, 세포소기관, 세포내 입자 및/또는 소수포(vesicle)의 현탁액의 충전 수준을 제어하기 위한 방법에 있어서, 상기 디바이스는 적어도 제1 전극 및 제2 전극, 상기 챔버의 일 단부에 배치된 적어도 하나의 유입구(inlet) 포트, 및 상기 챔버의 반대쪽 단부에 배치된 적어도 하나의 유출구(outlet) 포트를 포함하고, 상기 제1 전극은 상기 유입구 포트에서 상기 챔버 내에 배치되고 상기 제2 전극은 상기 유출구 포트에서 상기 챔버 내에 배치되고, 상기 챔버는 적어도 하나의 접지 전극을 더 포함하고, 상기 방법은,
    a) 상기 현탁액이 상기 유입구 포트를 통해 상기 챔버로 충전되는 충전 절차를 시작하는 단계;
    b) 상기 충전 절차 동안 상기 제2 전극과 상기 접지 전극 사이의 상기 챔버 내 상기 전기 저항을 여러 시점에서 측정하는 단계; 및
    c) 상기 충전 절차 종료를 포함하는 종료 루틴을 개시하는 단계- 상기 제2 전극과 상기 접지 전극 사이의 상기 전기 저항의 적어도 하나의 변화에 따라 상기 종료 루틴이 개시됨 -를 포함하는, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 전기 저항이 미리 결정된 값에 도달했을 때 상기 종료 루틴이 개시되는, 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 종료 조건이 충족되면 상기 충전 절차가 종료되고, 상기 종료 조건은,
    - 상기 저항의 변화의 제1 기울기가 제1 미리 결정된 임계값을 초과하는 것, 및
    - 상기 저항 변화의 제2 기울기가 미리 결정된 제2 임계값에 도달하는 것을 포함하고, 상기 제2 임계값은 상기 제1 임계값에 의해 표현되는 상기 기울기보다 더 낮은 기울기를 나타내는, 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종료 조건은 상기 제2 기울기 이후에 결정된 상기 저항 변화의 제3 기울기가 상기 제2 임계값과 같거나 그 아래에 있는 것을 더 포함하는, 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종료 루틴은 상기 종료 조건이 충족되는 것으로 결정된 후 지연된 종료를 포함하고, 적어도 하나의 미리 설정된 파라미터에 기초하여 최종 종료 전에 상기 충전 절차가 계속되는, 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 미리 설정된 파라미터는 연동 펌프에 의해 수행되는 단계 수를 포함하는, 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 단계 수는 수학식 N_target =(N_p + N_sts)/2 + P에 의해 계산되고, 여기서, N_target는 상기 충전 절차를 완료하는 데 필요한 계산된 단계 수이고, N_p는 이전 충전 절차 동안 수행된 단계 수이고, N_sts는 최신 표준 검출 목표 단계(current standard detection target step) 수이고, P는 경험적으로 결정된 단계 수인, 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 단계 수는 수학식 N_target =((N_now + S-R) + N_p)/2 + P-N에 의해 계산되고, 여기서, N_target는 상기 충전 절차를 완료하는 데 필요한 계산된 단계 수이고, N_now는 최신 단계 수이고, S는 미리 설정된 단계 수이고, R은 전기 전압 펄스의 에너지와 상관된 미리 설정된 단계 수이며, N_p는 이전 충전 절차 동안 수행된 단계 수이고, P는 경험적으로 결정된 단계 수이고, N은 20이 승산된 충전 절차 수인, 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 초기 전달 절차는 상기 충전 절차가 시작되기 전에 시작되며, 상기 전달 절차는 유입구 포트의 상류의 혼합 지점에서 기질 또는 프로브와 세포, 세포 유도체, 세포소기관, 세포내 입자 및/또는 소수포의 현탁액을 혼합하는 것 및 상기 제1 전극에서 저항 강하가 검출될 때까지 상기 유입구 포트를 통해 상기 챔버 내로 상기 혼합물 또는 상기 현탁액을 충전하는 것을 포함하며, 상기 전기 저항은 상기 초기 전달 절차 동안 여러 시점에서 상기 제1 전극과 상기 접지 전극 사이의 상기 챔버 내에서 측정되는, 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 저항 강하는 5 내지 15 Ohms 범위, 바람직하게는 약 10 Ohms의 전기 저항의 감소를 포함하는, 방법.
  11. 청구항 9 또는 10에 있어서, 상기 초기 전달 절차는 상기 저항 강하가 검출될 때 상기 챔버 내로의 상기 현탁액의 충전을 정지하는 것 및 그런 다음, 상기 충전 절차가 시작되기 전에 상기 기질 또는 상기 프로브와 상기 현탁액이 혼합되는 상기 혼합 지점으로 역방향으로 상기 현탁액을 퇴피시키는 것(retracting)을 더 포함하는, 방법.
  12. 청구항 9 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 전달 절차는 상기 제1 충전 절차가 시작되기 전에 한 번만 수행되는, 방법.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 충전 절차가 종료된 후 적어도 하나의 전극을 통해 적어도 하나의 전압 펄스를 공급함으로써 상기 챔버 내의 상기 현탁액에 전기장이 인가되고 및/또는 상기 챔버를 상기 현탁액으로 충전하고 후속적으로 적어도 하나의 전압 펄스를 공급하는 것이 미리 정의된 수의 사이클 동안 반복되는, 방법.
  14. 적어도 하나의 챔버 내의 세포, 세포 유도체, 세포소기관, 세포내 입자 및/또는 소수포의 현탁액에 전기장을 인가하기 위한 디바이스(1)로서, 적어도 제1 전극 및 제2 전극(20, 21), 상기 챔버(6)의 일 단부(12)에 배치된 적어도 하나의 유입구 포트(10, 11), 및 상기 챔버(6)의 반대쪽 단부(9)에 배치된 적어도 하나의 유출구 포트(7, 8)를 포함하고, 상기 제1 전극(20)은 상기 유입구 포트(10, 11)에서 상기 챔버(6) 내에 배치되고 상기 제2 전극(21)은 상기 유출구 포트(7, 8)에서 상기 챔버(6) 내에 배치되고, 상기 챔버(6)는 적어도 하나의 접지 전극(5)을 더 포함하는, 디바이스(1)에 있어서,
    적어도 상기 제2 전극(21)은 상기 제2 전극(21)과 상기 접지 전극(5) 사이의 상기 챔버(6) 내의 전기 저항을 측정하기 위한 제1 센서 전극인 것을 특징으로 하는 디바이스.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 제1 전극(20)은 상기 제1 전극(20)과 상기 접지 전극(5) 사이의 상기 챔버(6) 내의 전기 저항을 측정하기 위한 제2 센서 전극인, 디바이스.
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