ES2910415T3 - Proteínas de fusión contra el VIH con actividad dual antiviral e inmunomodulatoria - Google Patents

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Abstract

Proteína de fusión que comprende del extremo N-terminal en dirección al extremo C-terminal: (a) los dominios extracelulares D1 y D2 del receptor CD4 humano, (b) el segmento Fc de una inmunoglobulina G humana, (c) un conector peptídico de secuencia (GGGGS)n donde 4 <= n <= 10, y (d) un polipéptido derivado de gp41, en la que dicho polipéptido es T-20 o C34, en la que la secuencia de aminoácidos de T-20 es la SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de C34 es la SEQ ID NO: 9.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de fusión contra el VIH con actividad dual antiviral e inmunomodulatoria
Sector de la Invención
La presente invención se refiere a proteínas de fusión contra el VIH con actividades antiviral e inmunomodulatoria mejoradas. Las proteínas de fusión de la presente invención se caracterizan por tener una gran capacidad para (i) bloquear la entrada del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) a células huésped e (ii) inducir la activación de células asesinas naturales (NK) y otras células del sistema inmune. Varias formas de estos polipéptidos se describen y ejemplifican en el presente documento. La presente invención también incluye las secuencias aisladas de ácidos nucleicos, vectores y células huésped que expresan dichos polipéptidos, al igual que sus aplicaciones terapéuticas y diagnósticas en salud humana.
Estado de la Técnica
La infección de VIH es una de las mayores amenazas globales para la salud humana. Se estima que más de 78 millones de personas en el mundo han sido infectadas por el VIH desde 1981. Aproximadamente la mitad de estas personas han muerto durante el mismo período a causa del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) resultante de la infección. Véase UNAIDS, http://www.unaids.org/, octubre de 2015.
La generación de anticuerpos protectores es el principal mecanismo para desarrollar vacunas contra patógenos humanos. Sin embargo, el desarrollo de inmunógenos capaces de inducir la producción de dichos anticuerpos contra el VIH ha sido infructuoso hasta la fecha. La preparación de estos inmunógenos requiere, primero, la identificación de los epítopos conservados a fin de asegurar una respuesta estable y continua y, segundo, el diseño de nuevos inmunógenos capaces de presentar dichos epítopos de la forma más eficiente. Véase Haynes B, Curr Opin Immunol. 2015; 35:39-47. En contraposición a estos pobres avances en el diseño de inmunógenos, una cantidad importante de nuevos y potentes anticuerpos (i.e. anticuerpos neutralizantes de amplio espectro, bNAbs) contra la glicoproteína de la envuelta del VIH se han descrito recientemente. Véase Mascola J, et al., Inmunnol Rev. 2013; 254:225-244. De igual manera, se han propuesto moléculas sintéticas basadas en estructuras de anticuerpos como nuevos agentes terapéuticos. Véase Gardner M, et al., Nature 2015; 519:87-91. En efecto, anticuerpos de alta potencia pueden proteger a sujetos no infectados contra el VIH o pueden ser utilizados en la erradicación de VIH en pacientes infectados. Véase Mascola, 2013, supra. También se ha propuesto el uso de anticuerpos neutralizantes contra la glicoproteína de la envuelta y sus subunidades para prevenir la replicación de VIH in vivo. Véase Yang X, et al., J. Virol. 2005; 79:3500-3508. Los anticuerpos son especialmente relevantes en la terapia del VIH debido a su función dual como agentes antivirales capaces de bloquear la replicación del virus, mediante su unión a la glicoproteína de la envuelta del VIH, y como activadores de las células NK, a través de la interacción de las regiones constantes de los anticuerpos (Fc) con el receptor CD16 expresado en la superficie de las células NK y otras células. Esta interacción posibilita que las células inmunitarias CD16+ puedan eliminar células infectadas mediante el mecanismo conocido como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Véase Milligan C, et al., Cell Host Microbe. 2015; 17:500-506. Al parecer ambas actividades se requieren para la protección de sujetos no infectados. Sin embargo, hay aún una necesidad en la técnica para desarrollar anticuerpos neutralizantes con mejor actividad antiviral y ADCC.
Nagashima K y col. (“Human immunodeficiency virus type 1 entry inhibitors PRP 542 and T-20 are potently synergistic in blocking virus-cell and cell-cell fusion” Journal of Infectious Diseases. JID, University of Chicago Press, vol. 183, no. 7, (2001) pp. 1121-1125) dan a conocer la combinación de PRO542, una proteína de fusión que comprende el dominio D1 y D2 de CD4 y el segmento Fc de una IgG y T-20.
Por otra parte, Mattthew G y col. ("AAV-expressed eCD4-Ig provides durable protection from multiple SHIV challenges" Nature, vol. 519, no. 7541, (2015) pp. 87-91) y la solicitud de Patente PCT WO 2011/156747 dan a conocer una proteína de fusión que comprende dos componentes, a saber una proteína CD4-Ig fusionada a un péptido derivado del co-receptor CCR5. Ambas partes han demostrado inhibir al VIH (véase también Jacobson JM y col. "Treatment of Advance Human Immun-odeficiency Virus Type 1 Disease with the viral entry Inhibitor PRO 542" Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol. 48, no. 2, (2004), pp. 423-429).
Características de la Invención
La presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende del extremo N-terminal en dirección al extremo C-terminal:
(a) los dominios extracelulares D1 y D2 del receptor CD4 humano,
(b) el segmento Fc de una inmunoglobulina G humana,
(c) un conector peptídico de secuencia (GGGGS)n, donde 4 < n < 10, y
(d) un polipéptido derivado de gp41, en la que dicho polipéptido es T-20 o C34, en la que la secuencia de aminoácidos de T-20 es la SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de C34 es la s Eq ID NO: 9.
Las proteínas de fusión de la presente invención tienen actividades antivirales y ADCC más altas que cualquier otro derivado descrito en su sector técnico. Véase Gardner, 2015, supra.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión de la presente invención, a los vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos y a las células huéspedes que comprenden los ácidos nucleicos y vectores indicados anteriormente.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de fusión, ácidos nucleicos, vectores y células huésped de la presente invención, o mezclas de los mismos.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de las proteínas de fusión, ácidos nucleicos, vectores, células huésped, composiciones farmacéuticas y combinaciones de la presente invención, o mezcla de los mismos, como medicamento. En una versión adicional de este aspecto, la presente invención se refiere al uso de las proteínas de fusión, ácidos nucleicos, vectores, células huésped, composiciones farmacéuticas y combinaciones de la presente invención, o mezcla de los mismos, en el tratamiento o prevención de infecciones por VIH o SIDA.
Además, la presente invención también se refiere a un método de preparar las proteínas de fusión de la presente que comprende las etapas de (a) cultivar células huésped que comprenden los ácidos nucleicos de la invención, (b) expresar dichos ácidos nucleicos y (c) aislar las proteínas de fusión del medio de cultivo de las células huésped.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro de inactivación del VIH que comprende la etapa de poner en contacto al virus con una proteína de fusión de la presente invención.
Breve Descripción de las Figuras
Figura 1. Representación esquemática de los diferentes cambios introducidos a la molécula de la inmunoglobulina G humana subclase 1 (IgG1) para obtener la primera generación de las proteínas de fusión de la invención.
Figura 2. Representación esquemática de las proteínas de fusión de primera generación Moléculas-1-5.
Figura 3. Representación esquemática del razonamiento seguido para determinar la longitud del conector peptídico en la Molécula-5. Asumiendo (i) que existe una distancia de 30 Á entre el sitio de unión del correceptor de gp120 y la región diana de T-20 (gp41 en el centro del trímero) y (ii) que el conector adoptaría una conformación a-hélice cuyos enlaces peptídicos tendrían una distancia de 1.5 Á, se consideró que un conector de al menos 20 residuos sería necesario para permitir la interacción simultánea de las secuencias CCR5 y T- 20 con sus respectivas dianas. Teniendo en cuenta estas consideraciones, se incluyó un conector flexible (GGGGS)n (SEQ iD NO:5), donde n=5, entre las secuencias CCR5 y T-20.
Figura 4. Capacidad neutralizante de las proteínas de fusión de primera generación: Moléculas-0-6, (a) neutralización del aislado de VIH NL4-3, (b) neutralización del aislado de VIH BaL y (c) neutralización del aislado de VIH AC10.
Figura 5. Actividad ADCC de las proteínas de fusión de primera generación Molécula-1, Molécula-5 y Molécula-6. Un anticuerpo IgGb12 se utilizó como control.
Figura 6. Representación esquemática de las proteínas de fusión de segunda generación: Moléculas-7-11. Figura 7. Capacidad neutralizante de las proteínas de fusión de segunda generación Moléculas-7-8 y Moléculas-10-11 contra un panel de aislados de VIH: NL4-3, BaL y AC10. Las Molécula-0, Molécula-1 y Molécula-5 se utilizaron como referencias, (a) neutralización del aislado de VIH NL4-3, (b) neutralización del aislado de VIH BaL y (c) neutralización del aislado de VIH AC10.
Figura 8. Actividad ADCC de las proteínas de fusión de segunda generación Molécula-5, Molécula-7 y Molécula-8. Un anticuerpo IgGb12 y la Molécula-1 se utilizaron como controles.
Figura 9. Capacidad neutralizante de las proteínas de fusión de segunda generación Molécula-5, Molécula-7 y Molécula-8 contra un panel de aislados de VIH subtipo B. Las Molécula-0 y Molécula-1 se utilizaron como referencias.
Figura 10. Resumen de los valores IC50 de una selección de moléculas contra un panel de aislados de VIH. Figura 11. Potencia antiviral de Molécula-5 en presencia de las concentraciones indicadas de medicamentos antiretrovirales, (a) 3TC, (b) efavirenz y (c) raltegravir.
Figura 12. Inactivación irreversible de la infectividad del VIH (aislado BaL) por Molécula-5 y por el derivado C34 de Molécula-7.
Figura 13. Resumen de los valores IC50 de los derivados de Molécula-5 y Molécula-7 que muestran diferentes polipéptidos de gp41 en el término C de la proteína contra un panel de virus del subtipo B del VIH. Se utilizaron Molécula-1 y Molécula-6 como referencias.
Figura 14. Resumen de los valores IC50 de los derivados de MOLECULE-7 que muestran diferentes subclases de IgG contra un panel de virus del subtipo B del VIH.
Figura 15. Niveles plasmáticos de los derivados de anticuerpos-proteínas de fusión en ratones tratados con AAV, (a) dos semanas después de la inyección de AAV y (b) tres semanas después de la inyección de AAV.
Figura 16. Viremia plasmática del VIH determinada una semana después de la infección por el VIH de ratones humanizados tratados con MOLECULE 5 (0,5 mg/animal) o con PBS (infección de control).
Figura 17. Unión de concentraciones crecientes de MOLECULE-5 a células MOLT infectadas crónicamente que expresan la glicoproteína de Env de VIH de NL4-3 (izquierda) o BaL (derecha) en su superficie.
Figura 18. Diagrama del plásmido de expresión pABT-5. Se muestran las características principales del plásmido, tales como el marcador de selección y el marco abierto de lectura.
Figura 19. Diagrama del plásmido de expresión pABT-7. Se muestran las características principales del plásmido, tales como el marcador de selección y el marco abierto de lectura.
Figura 20. Diagrama del plásmido de expresión pABT-8. Se muestran las características principales del plásmido, tales como el marcador de selección y el marco abierto de lectura.
Depósito de Microorganismos
Los plásmidos pABT-5, pABT-7 y pABT-8 fueron depositados el 27 de octubre de 2015 bajo números de acceso DSM 32188, dSm 32189 y DSM 32190, respectivamente, en la DSMZ (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH), InhoffenstraBe 7 B, D-38124 Braunschweig, República Federal de Alemania.
Listado de Secuencias
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos presentadas en el listado de secuencias adjunto se muestran de acuerdo a las abreviaciones y códigos utilizados convencionalmente en el campo técnico. Sólo se muestra una cadena de cada secuencia de nucleótidos. La cadena complementaria se considera como incluida por la referencia a la secuencia presentada. En el listado de secuencias anexo:
SEQ ID NO:1 es la secuencia de aminoácidos del dominio D1 del receptor CD4 humano.
SEQ ID NO:2 es la secuencia de aminoácidos del dominio D2 del receptor CD4 humano.
SEQ ID NO:3 es la secuencia de aminoácidos del segmento Fc de la inmunoglobulina G1 (IgG 1) humana. SEQ ID NO:4 es la secuencia de aminoácidos del segmento Fc de la inmunoglobulina G1 (IgG 1) humana con mutaciones puntuales G236A, S239D, A330L e I332E.
SEQ ID NO:5 es la secuencia de aminoácidos del conector peptídico.
SEQ ID NO:6 es la secuencia de aminoácidos de la región N-terminal del receptor CCR5 humano.
SEQ ID NO:7 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido T-20. SEQ ID n O:8 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido T-1249. SEQ ID NO:9 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido C34.
SEQ ID NO:10 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido T-2635. SEQ ID NO:11 es la secuencia de aminoácidos de la Molécula-0.
SEQ ID NO:12 es la secuencia de aminoácidos de la Molécula-1. SEQ ID NO:13 es la secuencia de aminoácidos de la Molécula-2. SEQ ID NO:14 es la secuencia de aminoácidos de la Molécula-3.
SEQ ID NO:15 es la secuencia de aminoácidos de la Molécula-4. SEQ ID NO:16 es la secuencia de aminoácidos de la Molécula-5. SEQ ID NO:17 es la secuencia de aminoácidos de la Molécula-6. SEQ ID NO:18 es la secuencia de aminoácidos de la Molécula-7. SEQ ID NO:19 es la secuencia de aminoácidos de la Molécula-8. SEQ ID NO:20 es la secuencia de aminoácidos de la Molécula-10. SEQ ID NO:21 es la secuencia de aminoácidos de la Molécula-11.
SEQ ID NO:22 es la secuencia nucleotídica del dominio D1 del receptor CD4 humano.
SEQ ID NO:23 es la secuencia nucleotídica del dominio D2 del receptor CD4 humano.
SEQ ID NO:24 es la secuencia nucleotídica del segmento Fc de la inmunoglobulina G1 (IgG 1) humana.
SEQ ID NO:25 es la secuencia nucleotídica del segmento Fc de la inmunoglobulina G1 (IgG1) humana con mutaciones puntuales G236A, S239D, A330L e I332E.
SEQ ID NO:26 es la secuencia nucleotídica del conector peptídico.
SEQ ID NO:27 es la secuencia nucleotídica de la región terminal 5' del receptor CCR5 humano.
SEQ ID NO:28 es la secuencia nucleotídica del polipéptido T-20. SEQ ID n O:29 es la secuencia nucleotídica del polipéptido T-1249. SEQ ID NO:30 es la secuencia nucleotídica del polipéptido C34.
SEQ ID NO:31 es la secuencia nucleotídica del polipéptido T-2635. SEQ ID NO:32 es la secuencia nucleotídica de la Molécula-0.
SEQ ID NO:33 es la secuencia nucleotídica de la Molécula-1. SEQ ID NO:34 es la secuencia nucleotídica de la Molécula-2. SEQ ID NO:35 es la secuencia nucleotídica de la Molécula-3. SEQ ID NO:36 es la secuencia nucleotídica de la Molécula-4. SEQ ID NO:37 es la secuencia nucleotídica de la Molécula-5. SEQ ID NO:38 es la secuencia nucleotídica de la Molécula-6. SEQ ID NO:39 es la secuencia nucleotídica de la Molécula-7. SEQ ID NO:40 es la secuencia nucleotídica de la Molécula-8. SEQ ID NO:41 es la secuencia nucleotídica de la Molécula-10. SEQ ID NO:42 es la secuencia nucleotídica de la Molécula-11.
Descripción Detallada de la Invención
La presente invención se refiere a proteínas de fusión del VIH con actividad dual antiviral e inmunomodulatoria mejorada. Las proteínas de fusión de la presente invención se caracterizan por tener una capacidad mejorada para (i) bloquear la entrada del virus de la inmuodeficiencia humana (VIH) a células huésped e (ii) inducir funciones efectoras a través de la activación de las células asesinas naturales (NK).
1. Definiciones de términos y expresiones generales
El término "AC10", como se usa en el presente documento, se refiere a un aislado de VIH caracterizado por su resistencia a anticuerpos contra del sitio de unión del receptor CD4. "AC10" se considera como un aislado de clase 2. Véase Seaman M, et al., J. Virol 2010; 84:1439-1452.
El término "AAV" o "virus adenoasociado", como se usa en el presente documento, se refiere a un virus de la familia Parvoviridae que comprende una sola cadena lineal de ADN genómico de aproximadamente cinco mil nucleótidos. Al menos once serotipos de AAV (AAV1-11) se conocen en la técnica.
El término "vector AAV", como se usa en el presente documento, se refiere a un ácido nucleico caracterizado por una secuencia AAV de repeticiones terminales invertidas (ITR) localizado en el extremo 5' terminal y una secuencia AAV ITR localizada en el extremo 3' terminal que flanquean una secuencia de nucleótidos codificante para un polipéptido, dicha secuencia codificante operativamente unida a elementos reguladores de la transcripción (e.g. promotores, potenciadores) y a una secuencia de poliadenilación. El vector AAV puede incluir, además, uno o más intrones insertados entre los exones de la secuencia codificante para el polipéptido. Véase Samulski J, et al., Annu. Rev. Virol. 2014; 1:427-451.
El término "SIDA", como se usa en el presente documento, se refiere a la fase sintomática de la infección de VIH, e incluye el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida Humana y el Complejo Relacionado con el SIDA o "ARC". Véase Adler M, et al., Brit. Med. J 1987; 294:1145-1147. Las manifestaciones inmunológicas y clínicas del SIDA son conocidas en el arte e incluyen, por ejemplo, la incidencia de infecciones oportunistas y varios tipos de cáncer resultantes de inmunodeficiencias.
El término "aminoácido", como se usa en el presente documento, incluye aminoácidos naturales y sintéticos, al igual que análogos de aminoácidos u otras moléculas que copian o mimetizan las funciones de aminoácidos naturales. Los aminoácidos se identifican por sus códigos de una o tres letras de acuerdo a la comisión de nomenclatura bioquímica de la IUPAC-IUB. Los nucleótidos, por su parte, pueden denominarse por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
El término "ADC" o "conjugado anticuerpo-medicamento", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo, derivado de anticuerpo, complejo de anticuerpos o proteína de fusión basada en un anticuerpo conjugado a un agente terapéutico. La conjugación puede ser covalente o no covalente. Preferentemente, la conjugación es covalente.
El término "AT" o "terapia antiretroviral", como se usa en el presente documento, se refiere a la administración de uno o más medicamentos antiretrovirales (i.e. antiretrovirales VIH) para inhibir la replicación del VIH. AT comprende típicamente la administración de al menos un agente antiretroviral (o, regularmente, un cóctel de medicamentos antiretrovirales) tales como inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa reversa (e.g. zidovudina (AZT), lamiduvina (3TC), abacavir), inhibidores no nuleosídicos de la transcriptasa reversa (e.g. nevarapina, efavirenz) e inhibidores de proteasa (e.g. indinavir, ritonavir, lopinavir). El término "HAART" o "terapia antiretroviral eficaz" (Highly Active Antiretroviral Therapy en inglés) se refiere al régimen de tratamiento diseñado para suprimir agresivamente la replicación del VIH y la progresión del SIDA. HAART consiste usualmente de tres o más medicamentos diferentes tales como, por ejemplo, dos inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa reversa y un inhibidor de proteasa.
El término "eficacia de unión", como se usa en el presente documento, se refiere a la afinidad de una molécula al receptor CD4, y preferentemente, a los dominios D1 y D2 de dicho receptor. En el contexto de la presente invención, "afinidad" significa la fuerza con la que dicha molécula se une al sitio de unión a CD4 de gp120. En algunas formas de realización, la interacción tiene una constante de afinidad de cómo máximo 10"6 moles/litro, como máximo 10"7 moles/litro, o como máximo 10"8 moles/litro. En general, la frase "que se une" o "que se une específicamente" se refiere a la unión específica de un compuesto a otro, en donde el nivel de unión, medido por cualquier ensayo estándar, es significativamente mayor de manera estadística al control utilizado para el ensayo.
El término "C34", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido derivado de gp41 de secuencias SEQ ID NO:9 que cubre parte de la región HR2 de gp41. Véase Eggnik D, et al., J. Virol 2008; 82(13):6678-6688.
El término "CCR5", como se usa en el presente documento, se refiere al receptor de quimiocina C-C de tipo 5, también conocido como CD195, un receptor conformado por 7 dominios transmembrana que se acopla a proteínas G. CCR5 se une a diferentes quimiocinas y actúa como co-receptor del polipéptido Env de VIH durante el proceso de entrada de VIH a las células. La función co-receptora de VIH involucra diferentes regiones de CCR5. Sin embargo, una primera interacción ocurre entre la región N-terminal del CCR5 que se proyecta extracelularmente y el sitio de unión de Env de VIH localizado en la subunidad gp120. Véase Lagenaur L, et al., Retrovirology 2010; 7:11. La secuencia completa de aminoácidos de CCR5 posee el número de acceso UniProt P51681 (18 de agosto de 2015).
El término "CD4" o “receptor CD4”, como se usa en el presente documento, se refiere al grupo de diferenciación 4, una glicoproteína expresada, en la superficie de las células auxiliares T, monocitos, macrófagos, y células dendríticas. CD4 es un correceptor que ayuda al receptor de células T (TCR) durante su unión a una célula presentadora de antígeno. Usando la parte que reside dentro de la célula T (TCR), CD4 amplifica la señal generada por el TCR reclutando una enzima, conocida como tirosina quinasa lck, que es esencial para la activación de muchas moléculas implicadas en la cascada de señalización de una célula T activada. La secuencia completa de aminoácidos de CD4 humana posee el número de acceso de UniProt P01730 (18 de junio de 2012).
El término "codón optimizado", tal como se utiliza aquí, se refiere a la alteración de los codones en nucleicos para reflejar el uso típico de codones del organismo anfitrión para mejorar la expresión de un polipéptido de referencia sin alterar su secuencia de aminoácidos. Existen varios métodos y herramientas de software conocidos en la técnica para la optimización de codones. Véase Narum D, et al., Infect. Immun. 2001; 69(12):7250-7253), Outchkourov N, et al., Protein Expr. Purif. 352002; 24(1):18-24, Feng L, et al., Biochemistry 2000; 39(50):15399-15409 y Humphreys D, et al., Protein Expr. Purif. 2000; 20(2):252-264.
El término "comprender" o "comprende", como se usa en el presente documento, incluye también los términos "consistir" o "consiste" según la práctica generalmente aceptada en materia de patentes.
El término "Env" o "gp160" como se usa en el presente documento, se refiere a una glicoproteína que posee (i) la antigenicidad específica o (ii) la actividad biológica de la proteína de envoltura externa (Env) de VIH. Env comprende dos subunidades, las glicoproteínas gp120 y gp41. Varios ejemplos de secuencias de los polipéptidos gp160 se conocen en el arte. Véase números de acceso GenBank AAB05604 y AAD12142.
El término "región del fragmento cristalizable" o "región Fc", como se usa en el presente documento, se refiere a la región de la cola de un anticuerpo que interacciona con los receptores de la superficie celular denominados receptores de Fc y algunas proteínas del sistema del complemento.
La expresión "variante funcionalmente equivalente", como se usa en el presente documento, se refiere a (i) un polipéptido resultante de la sustitución, inserción o deleción de uno o más aminoácidos que conserva sustancialmente la actividad de su polipéptido de referencia y (ii) un polinucleótido resultante de la sustitución, inserción o deleción de una o más bases que conserva sustancialmente la actividad del polipéptido expresado por el ácido nucleico de referencia. Las variantes funcionalmente equivalentes contempladas en el contexto de la presente invención incluyen polipéptidos que muestran al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 98 % o 99 % de similitud con las secuencias SEQ ID NO: 1-10 o polinucleótidos que muestran al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 98 % o 99 % de similitud con las secuencias SEQ ID NO:22-31. El grado de similaridad entre dos polipéptidos o dos polinucleótidos puede determinarse mediante uso de método y algoritmos para ordenadores que son ampliamente conocidos en el arte. Preferentemente, la similaridad entre secuencia de aminoácidos se determina mediante el programa BLASTP. Véase Alstchul S, et al., "Blast Manual" (NCBI NLM NIH, Bethesda, MD, EEUU, 2001).
El término "proteína de fusión", como se usa en el presente documento, se refiere a proteínas generadas por tecnología génica que consisten en dos o más dominios funcionales derivados de diferentes proteínas. Se puede obtener una proteína de fusión por medios convencionales (e.g. mediante expresión génica de la secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína de fusión en una célula adecuada).
El término "gp41", como se usa en el presente documento, se refiere a la glicoproteína gp41 de la envuelta del VIH-1. Gp41 es una subunidad que forma, junto con gp120, la glicoproteína Env de VIH-1. Env es un trímero compuesto de tres subunidades externas (gp120) y tres unidades transmembrana (gp41). El segmento extracelular de gp41 contiene tres regiones funcionales esenciales: un péptido de fusión (FP), una secuencia de repetición héptada N-terminal (HR1) y una secuencia de repetición héptada C-terminal (HR2). Las regiones HR1 y HR2 contienen un número de motivos similares a cremalleras de leucina que favorecen su enrollamiento. Véase Peisajovich S, Shai Y, Biochem. Biopys. Acta 2003; 1614122-129; Suárez T, et al., FEBS Lett. 2000: 477:145-149; Chan D, et al., Cell 1997;89:263-273. Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de un gran número de variantes de gp41 se conocen en el arte. Véase HIV Sequence Database, http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html. noviembre de 2015.
El término "inhibidores de gp41", como se usa en el presente documento, se refiere a una serie de polipéptidos de diferente tamaño que cubren la región HR2 de gp41. Estos inhibidores incluyen, pero no están limitados, a los polipéptidos derivados de gp41, como los polipéptidos T-20, C34, T-1249 y T-2635.
La expresión "polipéptido derivado de gp41", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido derivado de la región HR1 o HR2 de gp41. Las secuencias de las regiones HR1 y HR2 son conocidas en el arte. Véase Lupas A, Trends Bkochem. Sci. 1996; 21-375-382 y Chambers P, et al., J. Gen. Virol. 1990; 71:3074-3080. Preferentemente, el polipéptido derivado de gp41 puede contener aminoácidos adicionales localizados en sus extremos N- y C-terminal. Preferentemente, estos aminoácidos adicionales son menos de diez, y más preferentemente, menos de cinco. La realización más preferida contiene menos de tres aminoácidos adicionales.
El término "gp120", como se usa en el presente documento, se refiere a una glicoproteína que tiene la especificad antigénica o la función biológica de la proteína de la envuelta externa (Env) del VIH. Una "proteína gp120" es una molécula derivada de una región gp120 de un polipéptido Env. Los polipéptidos salvajes (wt) de gp120 maduros tienen aproximadamente 500 aminoácidos en su secuencia primaria. Gp120 está muy N-glicosilada y tiene un peso molecular de alrededor 120 kD. La secuencia de aminoácidos de gp120 tiene aproximadamente 511 aminoácidos. Gp120 contiene cinco dominios relativamente conservados (C1-C5) entremezclados con cinco dominios variables (V1-V5). Los dominios variables contienen extensas sustituciones, inserciones y deleciones de aminoácidos. Un "polipéptido gp120" incluye tanto subunidades únicas como multímeros. La parte gp41 está anclada en (y atraviesa) la bicapa de membrana del virión, mientras que el segmento gp120 sobresale en el entorno circundante. El dominio de unión al receptor de gp120 está localizado en la mitad N-terminal de la proteína. Éste está seguido por una región rica en prolina (PRR), que se propone como una bisagra o un gatillo de la maquinaria de fusión. El extremo C- terminal de gp120 está muy conservado e interacciona con gp41. Varias secuencias ejemplares de polipéptidos gp160 salvajes se conocen en el arte. Véase números de acceso de GenBank AABO5604 y AAD12142.
El término "VIH", como se usa en el presente documento, incluye VIH-1 y VIH-2 y VISH y VIS. "VIH-1" significa el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo l. VIH-1 incluye, pero no está limitado, a partículas víricas extracelulares y formas de VIH-1 asociadas con células infectadas por VIH-1. El virus VIH-1 puede representar cualquiera de los subtipos principales conocidos (clases A, B, C, D, E, F, G y H) o subtipo atípico (grupo O) incluyendo cepas de laboratorio y aislados primarios. "VIH-2" significa el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 2. VIH-2 incluye, pero no está limitado a, partículas víricas extracelulares y formas de VIH-2 asociadas con células infectadas por VIH-2. El término "VISH" se refiere al virus de la inmunodeficiencia simia-humana, un virus híbrido que combina partes del VIH y el VIS y que se utiliza mayormente para fines de investigación. El término "VIS" se refiere al virus de la inmunodeficiencia simia, un virus similar al VIH que infecta monos, chimpancés y otros primates no humanos. VIS incluye, pero no está limitado a, partículas víricas extracelulares y formas de VIS asociadas con células infectadas por VIS.
La expresión "exposición al VIH" o "expuesto al VIH", como se usa en el presente documento, se refiere al contacto de un sujeto no infectado con un sujeto infectado de VIH o que muestra síntomas del SIDA. "Exposición al VIH" o "expuesto al VIH" incluye, pero no está limitado, al contacto entre los fluidos corporales de dicho sujeto infectado de VIH o que muestra síntomas del SIDA y la membrana mucosa, cortadura o abrasión en el tejido de un sujeto no infectado (e.g. mediante la punción de una aguja infectada o la práctica de sexo sin protección) de manera tal que el virus pueda transferirse del sujeto infectado al sujeto no infectado. La expresión "infección de VIH", como se usa en el presente documento, se refiere a indicaciones de la presencia del virus VIH en un individuo tales como seropositividad asintomática, el Complejo Relacionado con el SIDA (ARC) y el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida Humana (SIDA).
El término “IC50”, como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad requerida de un agente activo particular para inhibir el 50 % de un proceso biológico dado o de uno de sus componentes (i.e. una enzima, célula, receptor celular o microorganismo).
Los términos "similar", "similaridad" o "porcentaje de similaridad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean (introduciendo espacios, si es necesario) para la máxima correspondencia, sin considerar ninguna sustitución conservadora de aminoácidos como parte de la identidad de la secuencia. El porcentaje de similaridad se puede medir usando algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Se conocen en la técnica varios algoritmos y software que se pueden usar para obtener alineamientos de secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Los ejemplos de algoritmos adecuados para determinar la similaridad de una secuencia incluyen, pero no están limitados a, los algoritmos BLAST, Gapped BLAST y BLAST 2.0, WU-BLAST-2, ALIGN y ALIGN-2. Véase Altschul S, et al., Nuc. Acids Res. 1977; 25:3389-3402, Altschuk S, et al., J. Mol. Biol. 1990; 215:403-410, Altschul S, et al., Meth Enzymol. 1996; 266:460-480, Karlin S, et al., Proc Ntal. Acad. Sci. USA 1993; 90:5873-5877, Genentech Corp, South San Francisco, CA, EEUU, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast. noviembre de 2015. Los métodos de alineación de secuencia para comparación se pueden realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith-Waterman, mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman-Wunsch, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson-Lipman, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos o mediante alineamiento manual e inspección visual. Véase Smith T, Waterman M., Adv. Appl. Math. 1981; 2:482- 489; Needleman S, Wunsch C, J. Mol. Biol. 1970; 48:443-453; Pearson W, Lipman D, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85-2444­ 24448; los programas GAP, BESTFIT, fAs TA y TFASt A, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI, EEUU; Ausubel F, et al., Eds., "Short Protocols in Molecular Biology", 5a Ed. (John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, NY, EEUU, 2002).
El término "kit", como se usa en el presente documento, se refiere a un producto que contiene los diferentes reactivos necesarios para llevar a cabo los métodos de la invención, embalados de forma que permite su transporte y almacenamiento. Los materiales adecuados para embalar los componentes del kit incluyen cristal, plástico (e.g. polietileno, polipropileno, policarbonato), botellas, viales, papel o sobres.
El término "anticuerpo neutralizante", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, derivado de anticuerpo, complejo de anticuerpos o proteína de fusión basada en el anticuerpo que se une a una molécula extracelular (e.g. una proteína o dominio proteico en la superficie de un virus patogénico) e interfiere con la capacidad de la molécula extracelular para infectar una célula o modular su actividad. Típicamente, las proteínas de fusión usadas en el método de la presente invención se unen a la superficie de la molécula extracelular e inhiben o reducen la unión de la misma a la célula en al menos el 99 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 60 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 % o el 10 % en comparación a la unión de la molécula extracelular a dicha célula en ausencia de dichas proteínas de fusión o en presencia de un control negativo. Los métodos para confirmar si un derivado de anticuerpo tiene capacidad neutralizante ya se han descrito en la técnica. Véase Li M, et al., J. Virol. 2005; 79- 10108-10125, Wei X, et al., Nature 2003; 422-307-312, y Montefiori D, Curr. Protoc. Immunol. 2005; Jan, Chapter 12:Unit 12.11. En el contexto de la invención, este antígeno es preferentemente gp120 y este cuerpo infeccioso es preferentemente VIH. En particular, el término “anticuerpo neutralizante de VIH” se refiere a un derivado de anticuerpo con afinidad al lugar de unión CD4 de gp120, como IgGb12. El término "anticuerpos neutralizantes" incluye la subclase de los bNnAb. Como se usa en el presente documento, "anticuerpo ampliamente neutralizante" o "bNnAb" se entiende como un anticuerpo capaz de ser utilizado como un agente terapéutico en la prevención o tratamiento de VIH o SIDA causados por más de 7 cepas diferentes de VIH, y preferentemente, de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20 o más cepas diferentes de VIH, cuando se administra en una dosis eficaz.
El término "célula NK" como se usa en el presente documento, ser refiere a una "célula asesina natural", una clase critica de linfocito citotóxico del sistema inmune innato. Las células NK proveen una respuesta rápida contra células infectadas viralmente y contra la formación de tumores. Las células NK se activan alrededor de 3 días después de una infección. En general, las células inmunitarias detectan HLA expuesto en la superficie de células infectadas viralmente y contra la formación de tumores. Las células Nk , sin embargo, son únicas, al poseer la capacidad de reconocer células estresadas en ausencia de anticuerpos y HLA, facilitando de esta manera una respuesta inmune mucho más rápida. Las células NK se definen como linfocitos granulares de gran tamaño y constituyen el tercer tipo de células diferenciadas que se derivan del mismo precursor linfocítico común (i.e. que da origen a los linfocitos B y T). Las células NK se diferencian y maduran en la médula ósea, ganglios linfáticos, bazo sanguíneo, amígdalas y glándula timo, desde donde entran en circulación. Las células NK se caracterizan por expresar usualmente los marcadores de superficie CD16 (FcyRIII) y CD56 humanos.
Los términos "NL4-3" y "BaL", como se usan en el presente documento, se refieren a dos diferentes aislados de VIH utilizados comúnmente en investigación. El aislado NL4-3 fue clonado de los proviruses NY5 y LAV. Véase Adachi A, et al., J. Virol. 1986; 59; 284-291. El aislado BaL se obtuvo de un cultivo primario de células adherentes derivadas de tejido pulmonar. Véase Gartner S, et al., Science 1986; 59; 215-219.
Los términos "ácido nucleico", "polinucleico" y "secuencia de nucleótidos", como se usan en el presente documento, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud formada por ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. El término incluye polinucleótidos tanto mono como bicatenarios, así como polinucleótidos modificados (e.g. metilados, protegidos). Típicamente, un ácido nucleico es una "secuencia codificante", término que se refiere, según el presente documento, a una secuencia de ADN que primero se transcribe y luego se traduce a un polipéptido dentro de una célula huésped cuando dicha secuencia se coloca bajo el control de elementos reguladores apropiados. Los límites de la secuencia codificante están determinados en general por un codón inicial ubicado en el extremo "5' (amino) y un codón de terminación situado en el extremo 3' (carboxilo). La secuencia codificante puede incluir, además, secuencias procariotas de ADN, ADN complementario de ARN mensajero eucariota, secuencias de ADN genómicas de origen eucariota (e.g. mamífero) y secuencias sintéticas de ADN. La secuencia de terminación de la transcripción se localiza usualmente al extremo 3' de la secuencia codificante.
El término "operativamente unido", como se usa en el presente documento, significa que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a la(s) secuencia(s) reguladora(s) de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (e.g. en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped). Véase Auer H, Nature Biotechnol. 2006; 24:41-43.
La expresión "panel de aislados de VIH", como se usa en el presente documento, se refiere a una colección de referencia de aislados de VIH de clase 2/3 que se utilizan como virus pseudotipados de Env a fin de facilitar la estandarización de ensayos donde se miden las respuestas de anticuerpos neutralizantes al VIH. Véase Mascola R, et al., J. Virol. 2005; 79(16):10108-10125. Los pseudovirus exhiben un fenotipo de neutralización que es típico de la mayoría de aislados de VIH primarios. Los genes de gp160 fueron clonados de infecciones agudas o tempranas de origen sexual y comprenden un amplio espectro de diversidad genética, antigénica y geográfica del subtipo B de VIH. Estos clones usan CCR5 como co- receptor. Véase Li M, et al., J. Virol. 2005; 79(16):10108-10125.
Las expresiones "administración parenteral", "administrado parenteralmente" y "administrado por vía parenteral", como se usan en el presente documento, se refieren a las rutas de administración otras que las rutas de administración enteral y tópica, realizadas usualmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, las rutas de administración intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradermal, intraperitoneal, transtecal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intracisterna y la administración mediante infusión.
La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, incluye solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, y agentes isotónicos o retardantes de la absorción que son fisiológicamente compatibles con las proteínas de fusión, ácidos nucleicos, vectores y células huésped de la invención.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan aquí de forma intercambiable y se refieren a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos copian o mimetizan las funciones de un aminoácido natural, así como a polímeros de aminoácidos naturales y sintéticos.
Los términos "prevenir" y "prevención", como se usan en el presente documento, se refieren a inhibir el origen o disminuir la aparición de una enfermedad en un sujeto. La prevención puede ser completa (e.g. la ausencia total de células patológicas en un sujeto). La prevención también puede ser parcial, tal como, por ejemplo, la reducción de células patológicas en un sujeto. La prevención también se refiere a una susceptibilidad reducida a un estado clínico. Según el contexto de la presente invención, los términos "prevenir" y "prevención" se refieren específicamente a impedir o reducir la probabilidad de contraer una infección de VIH en un sujeto no infectado y que ha sido expuesto al VIH.
El término "muestra", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier fluido biológico y, en particular, sangre, suero, plasma, linfa, saliva, células de sangre periférica o suero de células tisulares, saliva, semen, esputo, líquido cefalorraquídeo (LCR), lágrimas, moco, sudor, leche o extractos cerebrales, obtenidos en un sujeto. El tejido corporal puede comprender tejido de la glándula timo, ganglios linfáticos, bazo, médula ósea o amígdalas. El término "muestra" se refiere también a muestras no biológicas (e.g. obtenidas de agua o bebidas).
El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a un individuo, planta o animal, tal como un ser humano, un primate no humano (e.g. chimpancés y otras especies de simios y monos), animales de granja, tales como aves, peces, ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos, tales como perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores como ratones, ratas y cobayas. El término no indica una edad o sexo particulares. El término "sujeto" abarca un embrión y un feto. Preferentemente, el sujeto es humano.
El término "T-1249", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido derivado de gp41 de secuencia SEQ ID NO:8 que cubre parte de la región HR2 de gp41. Véase Eggink, 2008, supra.
El término "T-20", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido derivado de gp41 de secuencias SEQ ID NO:7 que cubre parte de la región HR2 de gp41, también conocido como enfuvirtida. Véase CAS [159519-65-0] y US5464933. Este polipéptido tiene actividad antiviral a escala nanomolar y ha sido utilizado en el tratamiento de VIH. Véase Zhang D, et al., Expert Opin Ther Pat. 2015; 25:159-173 y Eggink, 2008, supra.
El término "T-2635", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido derivado de gp41 de secuencia SEQ ID NO:10 que cubre parte de la región HR2 de gp41. Véase Eggingk, 2008, supra.
El término "agente terapéutico", como se usa en el presente documento, se refiere a un átomo, molécula o compuesto útil para la prevención o tratamiento de una enfermedad. Ejemplos de agentes terapéuticos incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, antiretrovirales VIH, medicamentos, agentes citotóxicos, agentes pro- apoptosis, toxinas, nucleasas (e.g. ADNasas, ARNasas), hormonas, inmunomoduladores, agentes quelantes, compuestos de Boro, agentes fotoactivos o tintes, radionúclidos (e.g. trazadores radioactivos), oligonucleótidos, ARNi, ARNsi, agentes antiangiogénicos, agentes quimioterapéuticos, citocinas, quimiocinas, profármacos, enzimas, proteínas adherentes, péptidos y sus combinaciones.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a la dosis o cantidad de las proteínas de fusión, los ácidos nucleicos, los vectores y las composiciones farmacéuticas de la invención, o sus mezclas, que produce una respuesta terapéutica o un efecto deseado en un sujeto.
Los términos "terapia" o "terapéutico", tal como se utilizan en el presente documento, se refieren al uso de las proteínas de fusión, los ácidos nucleicos, los vectores y las composiciones farmacéuticas de la invención, o sus mezclas, para el tratamiento o la prevención de una enfermedad, incluidos, entre otros, el VIH y el SIDA.
Los términos "tratar" y "tratamiento", como se usan en el presente documento, se refieren a la administración de las proteínas de fusión, ácidos nucleicos, vectores, células huésped y composiciones farmacéuticas de la invención, o sus mezclas, para controlar la evolución de una enfermedad después de que hayan aparecido sus signos clínicos. Se entiende que el control de la evolución de la enfermedad significa la obtención de resultados clínicos beneficiosos o deseados que incluyen, pero no están limitados a, la reducción de los síntomas, la reducción de la duración de la enfermedad, la estabilización de los estados patológicos (específicamente para evitar deterioro adicional), el retraso en el progreso de la enfermedad, la mejora del estado patológico y la remisión (tanto parcial como total). El control de la evolución de la enfermedad también implica una extensión de la supervivencia, comparada con la supervivencia esperada si no se aplicara tratamiento. Según el contexto de la presente invención, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren específicamente a impedir o reducir la infección y destrucción de células T CD4+ sanas en un sujeto infectado con VIH. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se encuentran limitados a, aumentar el contaje absoluto de células T CD4+ (na'ive) (rango 10-3520), un aumento en el porcentaje de células T CD4+ sobre el total de células inmune circulantes (rango 1-50 %), o un incremento en contaje de células T CD4+ como un porcentaje del contaje de células T CD4+ normales en un sujeto no infectado (rango 1-161 %). "Tratamiento" también se refiere a extender la expectativa de vida de un sujeto infectado en comparación con su expectativa de vida si no fuera tratado.
El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico, lineal o circular que comprende un ácido nucleico de la presente invención operativamente unido a segmentos adicionales que posibilitan su replicación autónoma en una célula huésped o según el casete de expresión de dicha molécula de ácido nucleico.
2. Proteínas de fusión
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden del extremo N-terminal en dirección al extremo C-terminal:
(a) los dominios extracelulares D1 y D2 del receptor CD4 humano,
(b) el segmento Fc de una inmunoglobulina G humana,
(c) un conector peptídico de secuencia (GGGGS)n donde 4 < n < 10, y
(d) un polipéptido derivado de gp41, en la que dicho polipéptido es T-20 o C34,
en la que la secuencia de aminoácidos de T-20 es la SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de C34 es la SEQ ID NO: 9.
Las proteínas de fusión de la presente invención se caracterizan por poseen actividades antiviral y ADCC más altas que cualquier otro derivado descrito en el arte.
En una forma de realización, el dominio D1 de las proteínas de fusión de la invención comprende los aminoácidos 26-125 del receptor CD4 humano (i.e. número de acceso UniProtKB PO1730) o variantes funcionalmente equivalentes de los mismos. En otra realización, el dominio D2 de las proteínas de fusión de la invención comprende los aminoácidos 126-203 del receptor CD4 humano o variantes funcionalmente equivalentes de los mismos. Preferentemente, los dominios D1 y D2 comprenden las secuencias SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, respectivamente, o variantes funcionalmente equivalentes de las mismas.
En una forma de realización ulterior, el segmento Fc de la IgG comprende un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Preferentemente, la IgG es del isotipo IgG1. Más preferentemente, el segmento Fc de la IgG comprende las mutaciones puntuales G236A, S239D, A330L y I332E. La realización más preferida es aquella donde el segmento Fc de la IgG 1 comprende la secuencia SEQ ID NO:4 o variantes funcionalmente equivalentes de la misma.
En una forma adicional de realización, las proteínas de fusión de la invención comprenden en la posición (c) la secuencia del receptor CCR5 humano que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 6.
En una forma adicional de realización, las proteínas de fusión de la invención comprenden las Molécula-5, Molécula-6, Molécula-7, Molécula-8, Molécula-10, Molécula- 11 o variantes funcionalmente equivalentes de las mismas. Preferentemente, las proteínas de fusión de la invención comprenden las Molécula-5, Molécula-6, Molécula-7, Molécula- 8 o variantes funcionalmente equivalentes de las mismas. Más preferentemente, las proteínas de fusión de la invención comprenden la Molécula. En una versión de esta realización, las Molécula-5, Molécula-6, Molécula-7, Molécula-8, Molécula-10 y Molécula-11 comprenden las secuencias SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 y SEQ ID NO:21, respectivamente, o variantes funcionalmente equivalentes de las mismas.
Preferentemente, la proteína de fusión de la invención comprende:
(1) (a) los dominios extracelulares D1 y D2 del receptor CD4 humano, (b) el segmento Fc de una IgG1 humana, (c) un conector peptídico de secuencia (GGGGS)n donde 4 < n < 10, y una secuencia del receptor CCR5 humano, y (d) un polipéptido derivado de gp41 seleccionado del grupo que consiste en T-20 o C34, en el que la IgG1 es de tipo salvaje o contiene las mutaciones puntuales G236A, S239D, A330L y I332E. (2) (a) los dominios extracelulares D1 y D2 del receptor CD4 humano, (b) el segmento Fc de una IgG2 humana, (c) un conector peptídico de secuencia (GGGGS)n donde 4 < n < 10, y una secuencia del receptor CCR5 humano, y (d) un polipéptido derivado de gp41 seleccionado del grupo que consiste en T-20 o C34. (3) (a) los dominios extracelulares D1 y D2 del receptor CD4 humano, (b) el segmento Fc de una IgG3 humana, (c) un conector peptídico de secuencia (GGGGS)n donde 4 < n < 10, y una secuencia del receptor CCR5 humano, y (d) un polipéptido derivado de gp41 seleccionado del grupo que consiste en T-20 o C34, y
(4) (a) los dominios extracelulares D1 y D2 del receptor CD4 humano, (b) el segmento Fc de una IgG4 humana, (c) un conector peptídico de secuencia (GGGGS)n donde 4 < n < 10, y una secuencia del receptor CCR5 humano, y (d) un polipéptido derivado de gp41 seleccionado del grupo que consiste en T-20 o C34.
Más preferentemente, las proteínas de fusión de la invención comprenden: (a) los dominios extracelulares D1 y D2 del receptor CD4 humano, (b) el segmento Fc de una IgG1 humana que contiene las mutaciones puntuales G236A, S239D, A330L y I332E, (c) un conector peptídico de secuencia (GGGGS)n donde 4 < n < 10, una secuencia del receptor CCR5 humano, y (d) un polipéptido derivado de gp41 seleccionado del grupo que consiste en T-20 o C34.
Las proteínas de fusión de la invención son útiles para prevenir (i.e. neutralizar) la unión de moléculas (e.g. VIH) al receptor CD4 humano en células expresando dicho grupo de diferenciación en su superficie (e.g. células T auxiliares, monocitos, macrófagos, células dendríticas). Preferentemente, las proteínas de fusión de la invención se usan para prevenir la unión de proteínas gp160 ubicadas en la envuelta viral del VIH a los receptores CD4 humanos de las células T auxiliares. Las proteínas de fusión de la invención se caracterizan por tener una capacidad neutralizante de IC50 de 10 ng/mL o menos, y preferentemente, por una IC50 de menos de 5 ng/mL, menor a 2,5 ng/mL, menor a 1,25 ng/mL, menor a 0,625 ng/mL, menor a 0,312 ng/mL, menor a 0,156 ng/mL, menor a 0,07 ng/mL o menor a 0,035 ng/mL.
En una forma adicional de realización, las proteínas de fusión de la invención se modifican químicamente mediante su conjugación a un polímero a fin de, por ejemplo, aumentar su vida media. Varios métodos de unir polipéptidos a polímeros se conocen en el arte. Véase US4766106, US4179337, US44925285 y US4609546. Preferentemente, los polímeros son polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG). PEG es un polímero soluble en agua que posee la fórmula general R (O--CH2--CH2 )n O--R donde R es un hidrógeno o un grupo protector tal como un grupo alquilo o alcanol. Preferentemente, el grupo protector tiene entre 1 y 8 átomos de carbono, más preferentemente, el grupo protector es un radical metilo. Preferentemente, n es un número entre 1 y 1.000, y más preferentemente, entre 2 y 500. Preferentemente, el peso molecular promedio de PEG más preferido es entre 1.000 y 40.000, más preferido entre 2.000 y 20.000, y preferentemente entre 3.000 y 12.000.
En una forma de realización ulterior, las proteínas de fusión de la invención se unen a un agente terapéutico para formar un conjugado anticuerpo-medicamento (ADC). Por ejemplo, las condiciones o enfermedades oportunistas incidentales al SIDA, tales como el sarcoma de Kaposi, pueden ser tratadas por un ADC formado por una proteína de fusión de la invención e interferón alfa, una antracilina liposomal (e.g. Doxil) o paclitaxel. Otros a Dcs efectivos para el tratamiento de otras enfermedades, tales como infecciones virales y bacterianas (e.g. Herpes zoster, neumonía, tuberculosis), enfermedades de la piel u otros tipos de cáncer (e.g. linfoma) asociados al SIDA, también pueden prepararse al combinar una proteína de fusión de la invención y un agente terapéutico apropiado.
3. Ácidos nucleicos, vectores y células huésped
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican para las proteínas de fusión de la invención, a sus casetes de expresión y a los vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos.
Preferentemente, los ácidos nucleicos son polinucleótidos que incluyen, pero que no se limitan a, deoxiribonucleótidos (ADN) y ribonucleótidos (Ar N) unidos mediante enlaces de fosfatos. En una forma de realización, los ácidos nucleicos de la invención comprenden los polinucleótidos codificantes para los dominios extracelulares D1 y D2 del receptor CD4 humano (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23), el segmento Fc de la IgG1 humana (SEQ ID NO:24), un conector peptídico (SEQ ID NO:26), la secuencia del receptor CCR5 humano (SEQ ID NO:27) y el polipéptido T-20 (SEQ ID NO:28) o variantes funcionalmente equivalentes de los mismos. Preferentemente, los ácidos nucleicos de la invención codifican para las Moléculas-5 (SEQ ID NO:37), Molécula-6 (SEQ ID NO:38), Molécula-7 (SEQ ID NO:39), Molécula-8 (SEQ ID NO:40), Molécula-10 (SEQ ID NO:41), Molécula-11 (SEQ ID NO:42) o variantes funcionalmente equivalentes de las mismas. Las variantes funcionalmente equivalentes de los ácidos nucleicos de la invención pueden obtenerse mediante la inserción, deleción o sustitución de uno o varios nucleótidos con respecto a sus secuencias de referencia. Dichos polinucleótidos modificados se caracterizan porque sus secuencias les permiten hibridar en condiciones muy restrictivas con los polinucleótidos de referencia. Las condiciones típicas de la hibridación muy restrictiva incluyen incubación en SSC 6X (SSC 1X: NaCl 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M) y formamida al 40 % a 42°C durante 14 horas, seguido por uno o varios ciclos de lavado usando SSC 0,5X, SDS (dodecilsulfato de sodio) al 0,1 % a 60°C. Alternativamente, las condiciones muy restrictivas incluyen las que comprenden una hibridación a una temperatura de aproximadamente 50-55°C en SSC 6X y un lavado final a una temperatura a 68°C en SSC de l-3X. Las condiciones restrictivas moderadas comprenden la hibridación a una temperatura de aproximadamente 50°C hasta aproximadamente 65°C en NaCl 0,2 o 0,3 M, seguido por lavado a aproximadamente 50°C hasta aproximadamente 55°C en SSC 0,2 X SDS al 0,1 %. En una forma de realización adicional, los ácidos nucleicos de la invención se caracterizan por tener codones optimizados.
En otra forma de realización, se utiliza una variante de un ácido nucleico que posee al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de similaridad con su ácido nucleico de referencia, cuando dicha variante codifica para una proteína de fusión de la invención o una variante funcionalmente equivalente del mismo.
Los ácidos nucleicos de invención pueden requerir ser cortados con enzimas de restricción antes de ser ligados a un vector (e.g. 1, 2 o 3 nucleótido terminales pueden ser eliminados). En una forma de realización adicional, la presente invención se refiere a dichos ácidos nucleicos cortados en sus extremos 5' y 3' por enzimas de restricción.
En otra forma de realización, la presente invención se refiere a un casete de expresión que comprende un ácido nucleico de la invención, una secuencia promotora y una región 3' - UTR. El casete puede contener, opcionalmente, un marcador de selección.
En una forma de realización ulterior, la presente invención se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico de la invención. En un aspecto adicional de esta realización, el ácido nucleico de la invención está contenido en un casete de expresión que a su vez está comprendido por dicho vector. Vectores que pueden ser utilizados con la presente invención incluyen, pero no se encuentran limitados a, vectores procariotas (e.g. pUC18, pUC19), plásmidos Bluescript y sus derivados (e.g. mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, Rp4)), fagos y vectores lanzadera (e.g. pSA3, pAT28), vectores de expresión de levaduras (e.g. plásmidos 2-micras), plásmidos de integración, vectores y Ep , plásmidos centroméricos y análogos, vectores de expresión de células de insectos (e.g. series pAC, pVL), vectores de expresión de plantas (e.g. pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE), vectores de expresión de células eucariotas superiores ya sean de origen viral (e.g. adenoviruses, a Av , retroviruses, lentiviruses) como no-viral (e.g. pSilencer 4.1-CMV (Ambion®, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, EEUU), pcDNA3, pcDNA 3.1, pcDNA3.1/hyg, pcDNA3.4, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL, pKSV-10, pBPV-1, pML2d, pTDTl). Preferentemente, el vector es un plásmido pcDNA3.1. Más preferentemente, el vector es un plásmido pABT-5, pABT-7 o pABT-8.
En una forma de realización adicional, el vector viral de la presente invención es un vector AAV. Los vectores AAV que codifican para las proteínas de fusión de la presente invención pueden ser construidos de acuerdo a técnicas de biología molecular conocidas en el arte. Véase Brown T, "Gene Cloning" (Chapman & Hall, Londres, GB, 1995); Watson R, et al., "Recombinant DNA", 2nd Ed. (Scientific American Books, Nueva York, NY, EEUU, 1992); Alberts B, et al., "Molecular Biology of the Cell" (Garland Publishing Inc., Nueva York, NY, EEUU, 2008); Innis M, et al., Eds., "PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications" (Academic Press Inc., San Diego, CA, EEUU, 1990); Erlich H, Ed., "PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification" (Stockton Press, Nueva York, NY, EEUU, 1989); Sambrook J, et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EEUU, 1989); Bishop T, et al., "Nucleic Acid and Protein Sequence. A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, GB, 1987); Reznikoff W, Ed., "Maximizing Gene Expression" (Butterworths Publishers, Stoneham, MA, EEUU, 1987); Davis L, et al., "Basic Methods in Molecular Biology" (Elsevier Science Publishing Co., Nueva York, NY, EEUU, 1986), Schleef M, Ed., "Plasmid for Therapy and Vaccination" (Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, DE, 2001).
Por ejemplo, células HEK 293 (expresando genes E1), un primer plásmido auxiliar (que provee la función adenovirus), un segundo plásmido auxiliar (que provee los genes rep del serotipo 2 de AAV y los genes cap del serotipo a Av de interés (e.g. AAV8)) y un plásmido conteniendo el constructo de interés (e.g. Molécula-5, Molécula-7) flanqueado por secuencias ITRs pueden ser utilizados para producir los vectores virales de la invención. A fin de producir dicho vector, el Ad N complementario de la proteína de fusión de la invención puede ser clonado en un plásmido AAV bajo el control de un promotor ubicuo (por ejemplo, CAG) o específico de la célula.
Los vectores AAV (partículas virales) pueden generarse mediante la transfección triple de células HEK 293 en ausencia del virus auxiliar. Véase Matsushita T, et al., Gene Ther. 1998; 5:938-945 y Wright J, et al., Mol. Ther.
2005; 12:171-178. Las células se cultivan hasta un 70 % de confluencia en botellas cilíndricas (Roller Bottles; Corning Inc., Corning, NY, EEUU) en DMEM (medio de cultivo Dulbecco modificado Eagle) suplementado con 10 % BFS (suero fetal bovino). Posteriormente, las células se co- transfectan con: 1) un plásmido conteniendo el casete de expresión de la proteína de fusión de interés flanqueado por las secuencias ITRs virales, 2) un plásmido auxiliar conteniendo los genes rep y cap (capl, cap9) de a Av y 3) un plásmido conteniendo las funciones adenovirus auxiliares. Entonces, se purifican los vectores mediante el uso de dos gradientes de cloruro de cesio consecutivos utilizando protocolos ya descritos en el arte. Véase Ayuso E, et al., Gene Ther.
2010; 17:503-510. Posteriormente, se dializan los vectores utilizando PBS y se filtran. Los vectores se cuantifican mediante qPCR y se almacenan a - 80°C hasta su uso.
En otra forma de realización adicional, la presente invención se refiere a una célula huésped que comprende un ácido nucleico, casete de expresión o vector de la invención. Las células huésped utilizables en la presente invención pueden ser de cualquier tipo, incluyendo células procariotas y eucariotas. Preferentemente, las células son procariotas, de levadura o de mamífero. Más preferentemente, las células son células HEK 293 y células CHO.
4. Composiciones farmacéuticas
En un aspecto ulterior, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica conteniendo al menos una de las proteínas de fusión, ácidos nucleicos, vectores o células huésped de la invención (referidos de ahora en más ya sea en forma individual o conjunta como "agente(s) activo(s) de invención") o a una mezcla de las mismas formulada en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicha composición farmacéutica se utiliza para tratar VIH o SIDA en un sujeto infectado o para prevenir la infección con VIH en un sujeto no infectado. En una forma de realización, la composición contiene múltiples (e.g. dos o más) proteínas de fusión, ácidos nucleicos, vectores o células huésped de la invención. En una forma de realización de la invención, la composición comprende al menos las proteínas de fusión Molécula-3, Molécula-4, Molécula-5, Molécula-6, Molécula-7, Molécula-8, Molécula-10 o Molécula-11, los ácidos nucleicos, vectores o células huésped que expresan dichas proteínas de fusión o una mezcla de ellas. Preferentemente, la composición comprende al menos las proteínas de fusión Molécula-5, Molécula-7 o Molécula-8, los ácidos nucleicos, vectores o células huésped que expresan dichas proteínas de fusión o una mezcla de ellas. Más preferentemente, la composición comprende al menos la proteína de fusión Molécula-7, los ácidos nucleicos, vectores o células huésped que expresan dicha proteína de fusión o una mezcla de ellas. La preparación de composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de fusión de la invención es conocida en el arte. Véase McNally E, et al., Eds., "Protein Formulation and Delivery" (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, EEUU, 2000), Hovgaard L, et al., Eds., "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", 2nd Ed. (CRC Press, Boca Raton, FL, EEUU, 2012) and Akers M, et al.,Pharm Biotechnol. 2002; 14:47-127.
Preferentemente, el vehículo de la composición es apropiado para la administración de los agentes activos de la invención por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidermal (e.g. por inyección o infusión). De acuerdo a la ruta de administración, el agente activo puede estar recubierto para impedir o retardar el efecto de condiciones que pudieran inactivar dicho agente.
En una forma de realización ulterior, se proveen composiciones farmacéuticas especialmente apropiadas para su uso en terapia génica ("inmunización pasiva"). Dichas composiciones farmacéuticas comprenden al menos uno de los ácidos nucleicos o vectores de la invención o sus mezclas. Estas composiciones pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos en el arte. Véase André S, et al., J. Virol. 1998, 72:1497-1503; Mulligan M, Webber J, AIDS 1999; 13(Suppl A):S105-S112; O'Hagan D, et al., J. Virol. 2001; 75:9037- 9043; Rainczuk A, et al., lnfect. Immun.
2004; 72:5565-5573. La selección del vector utilizado para vehiculizar el ácido nucleico no es crítica para llevar a cabo la invención siempre y cuando dicho ácido nucleico sea expresado correctamente en el sujeto tratado. Ejemplos de vectores apropiados para su uso con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, virus y plásmidos. Preferentemente, se emplea un vector AAV cuando se utiliza un vector de tipo viral. Preferentemente, se emplea un plásmido pcDNA3.1 o pVAXl (lnvitrogen Corp., Carlsbad, CA, EEUU; cuyas secuencias de ADN se encuentran disponibles en www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/invitrogen.html. octubre de 2015), pNGVL (National Gene Vector Laboratory, University of Michigan, MI, EEUU), p414cyc (número de acceso ATCC 87380) o p414GALS (número de acceso ATCC 87344) cuando se utiliza un vector de tipo plasmídico. Más preferentemente, se utiliza un vector plasmídico pcDNA3.1. Los plásmidos pABT-5, pABT-7 y pABT-8 son los vectores plasmídicos más preferidos.
El diseño y usos de protocolos de inmunización pasiva son conocidos en el arte. Véase Donnelly J, et al., Annu. Rev. Immunol. 1997; 15:617-648; Robinson H, Pertmer T, Adv. Virus Res. 2000; 55:1-74; Gurunathan S, et al., Annu. Rev. Immunol. 2000; 18:927-974 (2000); Ulmer J, Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2001; 4:192-197. Dentro del contexto de la presente invención, la inmunización pasiva se configura para inducir la expresión in vivo de las proteínas de fusión de la invención en un sujeto. Véase Ulmer J, et al., Science 1993; 259:1745-1749. En una versión de esta realización, se clona el ácido nucleico de interés en un plásmido bacteriano. Dicho plásmido bacteriano es modificado para optimizar su expresión en eucariotas e incluye: (i) un sitio de replicación bacteriano (e.g. ColE1 de E. coli), (ii) un gen de resistencia a antibióticos (e.g. kanamicina), (iii) una secuencia promotora fuerte (e.g. cytomegalovirus (CMV) o virus 40 (SV40) de simio) para favorecer la expresión en células de mamífero, (iv) un sitio de clonado múltiple localizado en dirección 3' de la secuencia promotora para insertar el ácido nucleico de interés y (v) una señal de poliadenilación SV40 o de hormona de crecimiento bovina (BGH) para estabilizar el ARNm.
Una realización es proveer también vectores basados en cepas bacterianas atenuadas o no patogénicas que sirven para vehiculizar plásmidos capaces de expresar las proteínas de fusión de la invención. Estas cepas incluyen, pero no están limitadas a, especies de Escherichia spp., Salmonella spp., Shigella spp., Mycobacterium spp.y Listeria spp.
La cepa particular de Escherichia utilizada no es crítica para llevar a cabo la presente invención. Ejemplos de cepas de Escherichia apropiadas para su uso con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, Escherichia coli cepas DH5a, Hb 101, HS-4, 4608-58, 1184-68, 53638-C-17, 13-80, y 6-81, E. coli enterotoxigénica, E. coli enteropatogénica y E. coli enterohermorrágica. Véase Sambrook, 1989, supra; Sansonetti P, et al., Ann. Microbiol. 1982; 132A:351-355); Evans D, et al., lnfect. Immun. 1975; 12:656- 667; Donnenberg S, et al., J. lnfect. Dis. 1994; 169:831-838; McKee M, O'Brien A, lnfect. Immun. 1995; 63:2070-2074.
La cepa particular de Salmonella utilizada no es crítica para llevar a cabo la presente invención. Ejemplos de cepas de Salmonella apropiadas para su uso con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, S. typhi (número de acceso ATCC 7251), S. typhimurium (número de acceso ATCC 13311), S. galinarum (número de acceso ATCC 9184), S. enteriditis (número de acceso ATCC 4931), S. typhimurium (número de acceso ATCC 6994), S. typhi aroC, aroD doble mutante (Hone D, et al., Vaccine 1991; 9:810-816) y S. typhimurium aroA mutante (Mastroeni D, et al., Micro. Pathol. 1992; 13:477-491).
La cepa particular de Shigella utilizada no es crítica para llevar a cabo la presente invención. Ejemplos de cepas de Shigella apropiadas para su uso con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, S. flexneri (número de acceso ATCC 29903), S. flexneri CVD1203 (número de acceso ATCC 55556), S. flexneri 15D (Sizemore D, et al., Vaccine 1997; 15:804-807; Sizemore D, et al., Science 1995, 270:299-302), S. sonnei (número de acceso ATCC 29930) y S. dysenteriae (número de acceso ATCC 13313).
La cepa particular de Mycobacterium utilizada no es crítica para llevar a cabo la presente invención. Ejemplos de cepas de Mycobacterium apropiadas para su uso con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, M. tuberculosis cepa CDC1551 (Griffith T, et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1995; 152:808-811), M. tuberculosis cepa Beijing (van Soolingen D, et al., J. Clin. Microbiol. 1995; 33:3234-3238), M. tuberculosis cepa H37Rv (número de acceso ATCC 25618), M. tuberculosis cepa auxótrofa de pantotenate (Sambandamurthy V, Nat. Med. 2002; 8:1171-1174, M. tuberculosis cepa rpoV mutante (Collins D, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1995; 92: 8036, M. tuberculosis cepa auxótrofa de leucina (Hondalus M, et al., lnfect. Immun. 2000; 68(5):2888-2898), BCG cepa danesa (número de acceso ATCC 35733), BCG cepa japonesa (número de acceso ATCC 35737), BCG cepa Chicago (número de acceso ATCC 27289), BCG cepa Copenhagen (ATCC No. 27290), Bc G cepa Pasteur (número de acceso ATCC 35734), Bc G cepa Glaxo (número de acceso ATCC 35741), BCG cepa Connaught (número de acceso ATCC 35745) y BCG cepa Montreal (número de acceso ATCC 35746).
La cepa particular de Listeria utilizada no es crítica para llevar a cabo la presente invención. Ejemplos de cepas de Listeria monocytogenes apropiadas para su uso con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, L. monocytogenes cepa 10403S (Stevens R, et al., J. Virol. 2004; 78:8210-8218), L. ivanovii y L. seeligeri cepas (Haas A, et al., Biochim. Biophys. Acta. 1992; 1130:81-84) o mutantes de L. monocytogenes cepas como (i) actA plcB doble mutante (Peters C, et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003; 35:243- 253; Angelakopoulos H, et al., lnfect. Immun. 2002; 70:3592-3601) o (ii) dal dat doble mutante (Thompson R, et al., lnfect. Immun. 1998; 66:3552-3561).
Los métodos para administrar vectores mediante el uso de vehículos bacterianos son conocidos en el arte. Véase US6500419, US5877159 y US5824538; Shata M, et al., Mol. Med. Today 2000; 6:66-71; Hone D, Shata M, J. Virol. 2001; 75:9665-9670; Shata M, et al., Vaccine 2001; 20:623-629; Rapp U and Kaufmann S, Int. Immunol. 2004, 16:597-605; Dietrich G, et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 2003; 5:10-19; Gentschev I, et al., J. Biotechnol. 2000; 83:19-26. El tipo de plásmido empleado para expresar las proteínas de fusión de la invención mediante los vehículos bacterianos antes dichos no es crítico para llevar a cabo la invención.
En una forma de realización adicional, se provee el uso de un vector AAV para administrar los ácidos nucleicos de la invención.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser administradas de acuerdo a métodos conocidos en el arte. La ruta de administración seleccionada puede variarse según los resultados que se deseen. Los agentes activos de la invención pueden prepararse con vehículos que retarden la liberación del agente tales como formulaciones de liberación controlada (e.g. implantes, parches transdérmicos, sistemas de microencapsulación). También pueden utilizarse polímeros biodegradables o biocompatibles como, por ejemplo, acetato de viniletileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Se conocen varios métodos para preparar dichas formulaciones en el arte. Véase Robinson J, et al., Eds., "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems" (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, EEUU, 1978).
Para administrar un agente activo de la invención por ciertas vías de administración, puede ser necesario recubrir el agente con, o coadministrar el agente con, un material para prevenir su inactivación o para asegurar su correcta distribución in vivo. Por ejemplo, el agente activo puede ser administrado utilizando un vehículo (e.g. liposoma) o diluyente farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, soluciones salinas y amortiguadoras. Los liposomas incluyen emulsiones CGF al igual que liposomas convencionales. Véase Strejan G, et al., J. Neuroimmunol. 1984; 7:27-41. Varios métodos para la producción de liposomas se conocen en el arte. Véase US4522811, US5374548 y US5399331. Los liposomas pueden comprender uno o más grupos funcionales con afinidad a células u órganos específicos. Esta afinidad puede mejorar la administración del agente activo. Ejemplos de dichos grupos funcionales incluyen, pero no están limitados a, folato o biotina, manósidos y el receptor surfactante de la proteína A. En una realización de la invención, los agentes activos se formulan mediante el uso de liposomas. Preferentemente, los liposomas incluyen un grupo funcional con una afinidad celular específica. Preferentemente, los agentes activos formulados en forma de liposomas se administran de manera inyectable. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, soluciones o dispersiones estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables o dispersiones. La presente invención contempla el uso de dichos vehículos en la medida en que los mismos no sean incompatibles con los agentes activos de la invención. Otros compuestos activos también pueden incorporarse a las composiciones farmacéuticas de la invención.
En general, las composiciones farmacéuticas de la invención son estériles y estables bajo sus condiciones típicas de producción y almacenamiento. Las composiciones pueden ser formuladas en forma de soluciones, microemulsiones, liposomas u otros mecanismos apropiados para la administración de los agentes activos de la invención. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión adecuado conteniendo, por ejemplo, agua, etanol, un polialcohol (e.g. glicerol, glicol de propileno, glicol de polietileno líquido) o una mezcla de ellos. Una fluidez adecuada de la composición puede lograrse, por ejemplo, recubriendo el agente activo (e.g. con lecitina), controlando el tamaño de las partículas (i.e. en el caso de dispersiones) y usando surfactantes. En muchos casos, es preferible añadir agentes isotónicos a la composición (e.g. azúcares, polialcoholes (manitol, sorbitol), sal común). La absorción prolongada de composiciones inyectables puede lograrse mediante la adición al vehículo de compuestos que retardan la absorción (e.g. sales de monoesteratos, gelatina).
Las soluciones estériles inyectables pueden prepararse mediante la incorporación de la cantidad requerida del agente activo de la invención a un vehículo farmacéuticamente aceptable en combinación con uno o más excipientes. Posteriormente, la solución puede ser microfiltrada y esterilizada. Las dispersiones se preparan, generalmente, mediante la adición del agente activo a un vehículo estéril farmacéuticamente aceptable que contiene un medio de dispersión y uno o más excipientes. El método preferido para preparar polvos estériles de acuerdo a la presente invención son el secado al vacío y la liofilización, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo.
El régimen de dosificación de los agentes activos de la invención puede ajustarse para inducir una respuesta deseada óptima (e.g. una respuesta terapéutica). Por ejemplo, una dosis única o múltiples dosis pueden ser administradas a un sujeto. Cuando se utilizan múltiples dosis, éstas pueden ser aumentadas o reducidas proporcionalmente a través del tiempo según las exigencias de la situación terapéutica. Por ejemplo, las proteínas de fusión de la invención pueden ser administradas subcutáneamente una o dos veces por semana o una o dos veces por mes mediante inyección.
Se considera especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales de la invención en unidades de dosificación que faciliten su administración y uniformidad de uso. Una unidad de dosificación, según se usa en el presente documento, se refiere a una formulación que contiene una cantidad específica de un agente activo de la invención. Dicha cantidad se calcula para producir un efecto terapéutico deseado en un sujeto. Las unidades de dosificación a ser utilizadas dependen de las características del agente activo y del efecto terapéutico deseado.
Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, antioxidantes solubles en agua (e.g. ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio metabisulfito de sodio, sulfito de sodio), antioxidantes solubles en aceite (e.g. palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol) y agentes quelantes de metales (e.g. ácido cítrico, ácido etilendiamino tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico). Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden todas aquellas adecuadas para la administración oral, nasal, tópica (e.g. bucal, sublingual), rectal, vaginal o parenteral de dichas composiciones. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en unidades de dosificación y pueden preparase de acuerdo a métodos conocidos en el arte. La cantidad de agente activo que puede combinarse con un vehículo farmacéuticamente aceptable para obtener una unidad de dosificación puede variar de acuerdo al sujeto a ser tratado y a la ruta de administración a ser utilizada. En general, la cantidad de agente activo que se combina con el vehículo para obtener una unidad de dosificación es aquella que induce un efecto terapéutico. Esta cantidad de agente activo puede variar desde alrededor del 0.001 % al 90 % (p/p), preferentemente, del 0.005 % al 70 % (p/p) y, más preferentemente, del 0.01 % al 30 % (p/p), de la unidad de dosificación.
Las formulaciones de las composiciones de la presente invención adecuadas para su administración por vía vaginal incluyen, pero no están limitadas a, pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas y aerosoles conteniendo uno o más vehículos conocidos en el estado de la técnica por ser adecuados. Las formas de dosificación para la administración tópica o la administración transdérmica de las composiciones de esta invención incluye polvos, aerosoles, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El agente activo de la invención puede mezclarse en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y con los conservantes, tampones o propulsores que puedan ser necesarios.
Las formulaciones de las composiciones de la presente invención pueden contener adyuvantes tales como, por ejemplo, agentes dispersantes, agentes emulsificantes, agentes humectantes y preservativos. La presencia de microorganismos puede ser prevenida mediante el uso de métodos de esterilización y el uso de agentes antibacterianos y antimicóticos (e.g. paraben, clororobutanol, ácido fenólico sórbico). También puede ser conveniente incluir agentes isotónicos (e.g. azúcares, cloruro de sodio) en las composiciones.
Los niveles reales de dosificación de los agentes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar para lograr la respuesta terapéutica deseada en un sujeto. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una serie de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad del agente concreto de la invención empleado, su cantidad, la vía de la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción o expresión del agente del agente activo empleado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos o materiales utilizados en combinación con las composiciones farmacéuticas particulares empleadas, la edad, el sexo, la condición, el estado de salud general y los antecedentes médicos del sujeto tratado y otros factores similares conocidos en las artes médicas. Un médico o veterinario con conocimientos ordinarios puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad terapéuticamente eficaz del agente o agentes activos necesarios. Por ejemplo, el médico o veterinario podría iniciar las dosis de los agentes activos de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles inferiores que la requerida para conseguir el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta conseguir el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composición de la invención será aquella cantidad del agente activo que sea la menor dosis efectiva para producir un efecto terapéutico. Dicha dosis efectiva dependerá generalmente de los factores descritos anteriormente. Se prefiere que la administración sea parenteral, más preferiblemente intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea. Si se desea, la dosis diaria efectiva de una composición farmacéutica puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis aplicadas por separado a intervalos adecuados a lo largo del día, opcionalmente, en formas de dosificación unitarias. Aunque es posible que un agente activo de la invención se administre solo, es preferible administrar dicho agente como una composición farmacéutica.
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse utilizando aparatos o dispositivos médicos conocidos en el arte. Por ejemplo, en una realización particular, la formulación se administra mediante un sistema de inyección hipodérmica sin agujas. Véase US5399163, US5383851, US5312335, US5064413, US4941880, US4790824 y US4596556. Ejemplos de implantes y módulos útiles para realizar la presente invención incluyen, pero no están limitados a, bombas de infusión para administrar medicamentos (e.g. US4447233 (no-implantable, velocidad constante), US4447224 (implantable, velocidad variable), US4487603 (implantable, velocidad constante)), aparatos para administrar medicamentos a través de la piel (e.g. US4486194) y sistemas osmóticos (e.g. US4439196, US4475196). Varios de dichos aparatos, sistemas y módulos se conocen en el arte.
Las composiciones farmacéuticas de la invención deben ser estériles y fluidas en la medida en que la composición se pueda administrar con una jeringa. Además de agua, el portador puede ser una solución salina isotónica tamponada, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes (por ejemplo, manitol, sorbitol) y cloruro de sodio en la composición. La absorción a largo plazo de las composiciones inyectables puede lograrse mediante incluir un agente que retrase la absorción (por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina) en la composición.
5. Métodos de prevención y tratamiento
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un proceso para tratar o bien prevenir la infección por el VIH o el SIDA en un sujeto, el cual comprende la administración a dicho sujeto de al menos una de las proteínas de fusión, ácidos nucleicos, vectores, células huésped o composiciones farmacéuticas de la invención, o sus mezclas. Los beneficios terapéuticos de los agentes activos y composiciones farmacéuticas de la invención en relación a la infección por v Ih o los síntomas del SIDA incluyen, por ejemplo, prevenir o retardar la infección inicial de un sujeto que ha sido expuesto al VIH, reducir la carga viral de un sujeto infectado con el VIH, prolongar la fase asintomática en sujeto infectado con el VIH, mantener una carga viral baja en un sujeto infectado con VIH cuyos niveles virales han sido reducidos mediante terapia antirretroviral (AT), impedir el decrecimiento o aumentar los niveles de células T CD4 (i.e. específicas y no específicas para VIH-1) en un sujeto no tratado o en un sujeto sometido a un régimen de terapia antiretroviral, mejorar el estado de salud general y la calidad de vida de un sujeto VIH positivo en fase SIDA y prolongar la vida de un sujeto VIH positivo en fase SIDA. El efecto de las terapias de la invención puede ser comparado por un médico o veterinario con las condiciones previas al tratamiento, o con la condición esperada de un sujeto sin tratar, para determinar si el tratamiento es eficaz para inhibir el SIDA. En una forma de realización preferida, los agentes activos y composiciones farmacéuticas de la invención se usan para prevenir una infección con el VIH o el SIDA. En otra realización preferida, los agentes activos y composiciones farmacéuticas de la invención se usan para el tratamiento de una infección con el VIH o el SIDA.
Los agentes activos y las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de la infección por VIH o del SIDA. Aunque todos los sujetos que pueden estar afectados por el VIH o sus equivalentes pueden ser tratados de esta manera (por ejemplo, chimpancés, macacos, babuinos o humanos), los agentes activos y las composiciones farmacéuticas de la invención están dirigidos particularmente a sus usos terapéuticos en humanos. A menudo, puede ser necesaria más de una administración para conseguir el efecto terapéutico deseado; el protocolo exacto (dosis y frecuencia) puede establecerse mediante procedimientos clínicos estándar.
La presente invención contempla, además, la reducción o eliminación de los síntomas y condiciones asociados a la infección con el VIH o el SIDA. Entre éstos se incluyen los síntomas y condiciones asociados a la frase más temprana de la infección con el VIH tales como, por ejemplo, el herpes zóster, las erupciones cutáneas e infecciones de uñas, las llagas bucales, las infecciones recurrentes de garganta y nariz y la pérdida de peso. También se incluyen los síntomas y condiciones asociados a la fase sintomática más plena de la infección con el VIH tales como, por ejemplo, la candidiasis oral y vaginal, la diarrea persistente, la pérdida de peso, la tos persistente, la tuberculosis y las infecciones recurrentes de virus herpes, tales como las úlceras bucales causadas por Herpes simplex. De igual manera, las terapias de la presente invención pueden ser usadas para tratar o prevenir los síntomas y condiciones asociados al SIDA tales como, por ejemplo, diarrea, náusea y vómitos, candidiasis oral, infecciones vaginales recurrentes y persistentes, cáncer cervical, linfadenopatía generalizada persistente (PGL), infecciones severas de la piel, verrugas y tiña, infecciones respiratorias, neumonía (i.e. causada especialmente por Pneumocystis carinii (PCP)), herpes zóster, problemas del sistema nervioso (e.g. dolor, entumecimiento, sensación de "hormigueo" en las manos y los pies), problemas neurológicos, sarcoma de Kaposi, linfoma, tuberculosis u otras infecciones oportunistas similares.
En otra forma de realización preferida, los agentes activos y composiciones farmacéuticas de la invención se administran a un sujeto infectado con VIH o expuesto al VIH en combinación con al menos un agente terapéutico. Preferentemente, el agente terapéutico se emplea regularmente para la prevención o tratamiento de la infección con el VIH o el SIDA. Ejemplos de agentes terapéuticos incluyen, pero no se encuentran limitados a, medicamentos que forman parte de un régimen de terapia antiretroviral convencional (AT) o altamente eficaz (HAART), tales como los inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa reversa (e.g. delaviridina, efavirenz, etravirina, nevaparina), los inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa reversa (e.g. abacavir, emtricitabina, lamiduvina, tenofovir, zidovudina) y los inhibidores de proteasa (e.g. amprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, ritonavir, saquinavir), referidos en este documento como "agente(s) antirretroviral(es)", ya sea de forma individual o conjunta. En una versión de esta forma de realización, se administran a un sujeto al menos un agente activo o composición farmacéutica de la invención en combinación con al menos un agente antirretroviral de manera simultánea. En otra versión de esta realización, el agente activo o composición farmacéutica de la invención se administran al sujeto antes del agente antirretroviral. En otra versión de esta realización, el agente activo o composición farmacéutica de la invención se administran al sujeto después del agente antirretroviral, como, por ejemplo, después de la interrupción o terminación de un régimen a T o HAART.
En una realización adicional, las proteínas de fusión de la invención se administran a un sujeto en combinación con agentes terapéuticos capaz de inducir la expresión de la proteína gp120 de VIH en la superficie de células infectadas en su etapa latente, favoreciendo su rápida eliminación mediante la acción de las células NK. Véase Siliciano J, et al, J Allergy Clin Immunol. 2014; 134(1 ):12-19.
6. Métodos de inactivación y detección
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método in vitro para inactivar el VIH que comprende contactar el virus con al menos uno de los derivados de anticuerpos de la invención. Preferentemente, el método se lleva a cabo con una muestra que contiene, o que se sospecha pueda contener, el VIH. El método puede implementarse bajo condiciones que favorezcan la unión de los derivados de anticuerpos al VIH tal y como se describen en el arte. Véase Lu L, et al., Retrovirology 2012; 9(104), 1-14. En un aspecto ulterior, la presente invención da a conocer un método para detectar una molécula o un fragmento de dicha molécula (e.g. HIV o gp120) que se une a los dominios de D1 y D2 del receptor CD4 humano en una muestra que comprende las etapas (a) contactar la muestra con un derivado de anticuerpo de la invención y (b) determinar si el derivado de anticuerpo se une a una molécula presente en la muestra. La muestra puede ser de origen biológico incluyendo, pero no limitada a, muestras obtenidas de sangre, suero, orina, tejido u otro material biológico proveniente de un sujeto no infectado, infectado o potencialmente infectado (e.g. sujetos manteniendo exposiciones al VIH periódicas o intermitentes). La muestra puede ser también de origen no biológico (e.g. obtenida del agua o bebidas). Preferentemente, la molécula es el VIH y, más preferentemente, la proteína gp120 de la envuelta viral del VI H.
En una forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un método para detectar el VIH en una muestra que comprende (a) contactar la muestra con un derivado de anticuerpo de la invención y (b) determinar si el derivado de anticuerpo se une a una molécula de VIH presente en la muestra. Preferentemente, la muestra es de sangre o suero.
Las muestras pueden ser manejadas a fin de utilizarse en los métodos detección. En una realización preferida, el contacto entre la muestra y el derivado de anticuerpo es prolongado (i.e. la muestra de reacción se incuba bajo condiciones que favorecen la estabilidad de la muestra y del derivado de anticuerpo). Las condiciones óptimas de reacción de la etapa de contacto pueden ser modificadas por un experto en la materia de manera rutinaria. Los tampones adecuados que pueden añadirse en la etapa de contacto incluyen tampones fisiológicos que no interfieren con el ensayo a realizar. Por ejemplo, se puede usar un tampón del tipo Tris o que contenga trietanolamina (TEA). El pH de estas soluciones tampón (y el reactivo de lisis resultante, incluida la solución tampón) puede variar en el rango de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,00, opcionalmente de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 9,0, preferentemente de aproximadamente 7,0 a 8,5, e incluso más preferentemente de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,0, o, aproximadamente de 7,0, aproximadamente de 7,5, aproximadamente de 8,0, o aproximadamente de 8,5. Las condiciones ejemplares de "contacto" pueden comprender una incubación de 15 minutos a 4 horas (por ejemplo, 1 hora a 4°C, 37°C o a temperatura ambiente). Sin embargo, estas condiciones pueden variar de acuerdo con, por ejemplo, la naturaleza de los socios de unión que interactúan. Además, pueden añadirse otros reactivos adecuados, como agentes de bloqueo para reducir la unión no específica. Por ejemplo, puede utilizarse 1-4 % de BSA u otro agente de bloqueo adecuado (por ejemplo, leche). Las condiciones de contacto pueden variar y adaptarse en función del objetivo del método de detección. Por ejemplo, si la temperatura de incubación es, por ejemplo, la temperatura ambiente o 37°C, esto puede aumentar la posibilidad de identificar los ligantes que son estables en estas condiciones (por ejemplo, estables en las condiciones encontradas en el cuerpo humano).
Preferentemente, el contacto entre las proteínas de fusión de la invención y la muestra se lleva a cabo bajo condiciones que favorecen la formación de complejos entre las los derivados de anticuerpos y moléculas, o fragmentos de moléculas, presentes en la muestra. La formación de estos complejos indica, por ejemplo, la presencia de VIH en la muestra y es entonces detectada y medida por medios adecuados. Estos medios de detección y medición dependen de la naturaleza de los socios de unión e incluyen, pero no están limitados a, ensayos de unión homogéneos o heterogéneos como, por ejemplo, radio-inmunoensayos (RIA), ELISA, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, citometría de flujo (e.g. FACS), BIACORE y análisis Western Blot. Las técnicas de ensayo preferidas, especialmente para el análisis a gran escala de sueros y sangre y productos derivados de la sangre, son la citometría de flujo, el ELISA y las técnicas de Western blot.
Preferentemente, la medición se realiza mediante citometría de flujo (e.g. FACS). Tal como se usa en el presente documento, el término "citometría de flujo" se refiere a un ensayo en el que se determina la proporción de un material en una muestra marcando el material (e.g. uniendo un anticuerpo marcado al material), haciendo que una corriente de fluido que contiene el material pase a través de un haz de luz, separando la luz emitida por la muestra en sus longitudes de onda constituyentes mediante el uso de una serie de filtros y espejos, y analizando el espectro resultante. La citometría de flujo permite la detección sensible y la cuantificación rápida de algunas características de células únicas, tales como la complejidad del tamaño relativo y la fluorescencia endógena, así como el análisis cualitativo de cualquier compuesto celular que se pueda marcar con un fluorocromo. Véase Melamed M, et al., "Flow Cytometry and Cell Sorting", 2a Ed. (Wiley-Liss, Nueva York, NY, EEUU, 1990). Una de las principales ventajas de la citometría de flujo es la rápida cuantificación de analitos en un gran número de partículas o células. Generalmente, los fluorocromos seleccionados para su uso como marcadores detectables se seleccionan en función de su capacidad de fluorescencia cuando son excitados por la luz con la longitud de onda utilizada por el láser. Cuando el fluorocromo es excitado por el rayo láser, emite luz que es evaluada por los tubos fotomultiplicadores del citómetro de flujo. Esta técnica es capaz de analizar 10.000 células/partículas en 1 o 2 minutos. Los citómetros de flujo disponen de filtros para detectar la emitancia de varios fluorocromos que emiten fluorescencia a diferentes longitudes de onda y permiten utilizar cuatro o más fluorocromos diferentes como marcadores detectables, lo que significa que actualmente se pueden detectar al menos 4 moléculas diferentes simultáneamente. Estos métodos y aparatos para analizar la muestra están disponibles comercialmente y son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, el citómetro de flujo FACSCalibur; BD Biosciences Corp., Franklin Lakes, NJ, EE.UU.).
En una realización preferida, dicha medición comprende el análisis de la muestra, preferentemente por citometría de flujo utilizando un reportero capaz de unirse al derivado de anticuerpo, preferentemente, a la región Fc de dicho derivado de anticuerpo. Preferiblemente, el informador comprende una fracción detectable y, más preferiblemente, es un anticuerpo secundario específico de Fc acoplado a una fracción detectable. Los motivos detectables útiles incluyen fluoróforos. Por "fluoróforo" (o "fluorocromo" o "cromóforo") se entiende un compuesto fluorescente que puede reemitir luz tras la excitación de la luz. Entre los fluoróforos que pueden utilizarse se encuentran los biológicos (por ejemplo, las proteínas) y fluoróforos químicos. Algunos ejemplos de fluoróforos biológicos son el zafiro T, Cerulean, mCFPm, CyPet, EGFP, PA-EGFP, Emerald, EYFP, Venus, mCitrine, mKO, mOrange, DSRed, JRed, mStrawberry, mCherry, PA-mCherry, mRuby, Tomato, mPlum, mKate, mKatushka, Kaede, Halotag, y flúor supereclíptico. Los fluoróforos químicos ejemplares comprenden el alexafluor, la rodamina, el BODIPY, la tetrametilrhodamina, los tintes de cianina, la fluoresceína, los puntos cuánticos, los tintes IR, los tintes FM y el tinte ATTO. Un anticuerpo secundario también puede marcarse con enzimas útiles para la detección, como, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina o glucosa oxidasa. Cuando un anticuerpo está marcado con una enzima detectable, puede detectarse añadiendo reactivos adicionales que la enzima utiliza para catalizar un producto de reacción que puede discernirse. Por ejemplo, cuando el agente peroxidasa de rábano picante está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobenzidina conduce a un producto de reacción coloreado, que es detectable visualmente. Un anticuerpo también puede marcarse con biotina y detectarse mediante la medición indirecta de la unión de avidina o estreptavidina. Cabe señalar que la propia avidina puede marcarse con una enzima o una etiqueta fluorescente.
Preferiblemente, el anticuerpo secundario Fc empleado es específico para la especie de la que deriva el anticuerpo primario (por ejemplo, humano). En una realización, dicho anticuerpo secundario específico de Fc se selecciona del grupo que consiste en IgA (por ejemplo, IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG (por ejemplo, IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4) e IgM. Preferentemente, el anticuerpo secundario es IgG y, más preferentemente, IgG 1. Dicho anticuerpo secundario específico de Fc puede ser cualquier anticuerpo de vertebrado, preferentemente cualquier anticuerpo de mamífero y, más preferentemente, 5 cualquier anticuerpo no humano (por ejemplo, un conejo, ratón, rata, cabra, caballo, oveja o burro).
Para su uso como reactivos en los ensayos mencionados, las proteínas de fusión de la invención pueden adherirse convenientemente a la superficie interior de los pozos de microtitulación. Las proteínas de fusión de la invención pueden unirse directamente al pozo de microtitulación. Sin embargo, la máxima unión de las proteínas de fusión a los pocillos puede lograrse tratando previamente los pocillos con polilisina antes de la adición de las proteínas de fusión. Además, las proteínas de fusión de la invención pueden unirse covalentemente a los pocillos por medios conocidos en la técnica. Generalmente, las proteínas de fusión de la invención se utilizan entre 0,01 y 100 pg/mL para el recubrimiento, aunque también pueden utilizarse cantidades mayores o menores. A continuación, se añaden las muestras a los pocillos recubiertos con los derivados de anticuerpos-proteínas de fusión de la invención.
Procedimientos Generales
1. Construcción de los derivados de CD4-hulgG
Los dominios extracelulares D1 y D2 del receptor CD4 humano se unieron al segmento Fc de una IgG 1 humana que incluía los dominios bisagra CH2 y CH3, para producir una molécula CD4-IgG1. Utilizando dicha molécula CD4-IgG1 como estructura matriz, se diseñaron proteínas de fusión con las siguientes características:
(a) Mutaciones puntuales G236A, S239D, A330L e I332E en la cadena Fc con el propósito de aumentar la respuesta mediada por ADCC. Véase Bournazos S, et al., Cell 2014; 158:1243-1253.
(b) La adición de la secuencia N-terminal del receptor CCR5 humano al extremo C- terminal de la cadena Fc (MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIA)(SEQ ID NO:6).
(c) La adición de la secuencia del polipéptido T-20 al extremo C-terminal de la cadena Fc (YTSLIHSLIEESQNQQEKKNEQELLELDKASLWNWF) (SEQ ID NO:7).
(d) La adición simultánea de la secuencia N-terminal del receptor CCR5 humano (MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIA)(SEQ ID NO:6) y la secuencia del polipéptido T-20 (TSLIHSLIEESQNQQEKKNEQELLELDKASLWNWF)(SEQ ID NO:7) con un número variable de conectores peptídicos flexibles (GGGGS) (SEQ ID NO:5).
Todos los polinucleótidos que expresan las proteínas de fusión de la invención fueron sintetizados utilizando el proceso GeneArt y ensamblados en el laboratorio en los plásmidos de expresión pcDNA3.1 y pcDNA3.4.
Los plásmidos fueron reconstituidos utilizando una solución amortiguadora 10mM Tris pH=8 a 0,5 pg/pL. Una cepa de E. c o liquímicamente competente (One Shot® TOP 10, Life Technologies Corp., Carslbad, CA, EEUU) se transformó con 1 pL del plásmido siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, 1 pL del plásmido se añadió a un tubo conteniendo la bacteria y se incubó en hielo por 15 minutos. Posteriormente, el tubo se incubó a 42°C por 30 segundos. Inmediatamente después se puso el tubo en hielo por 2 minutos. La bacteria fue resuspendida en 250 pL de medio de cultivo (S.O.C.® Medium; Life Technologies Corp., Carslbad, CA, EEUU) y fue incubada durante 1 hora a 37°C y 225 rpm en una incubadora en agitación Innova 4000 (New Brunswick Scientific Co., Inc., Enfield, CT, EEUU). A continuación, 100 pL de una dilución 1/100 de las células de cultivo se extendieron en placas de agar LB de selección de ampicilina (100 pg/ml). Las placas se incubaron a 37°C entre 16-24 horas en una incubadora (Heraerus®; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU). Se aisló una colonia y se inoculó en 5 mL de medio LB de selección con ampicilina (100 pg/mL) y se incubó durante 8 horas a 37°C y 225 rpm en un agitador de incubadora Innova 4000 (New Brunswick Scientific Co., Inc., Enfield, CT, USA). A continuación, se inocularon 500 mL de medio LB de selección de ampicilina (100 pg/mL) con 500 pL del cultivo descrito anteriormente y se incubaron a 37°C y 225 rpm durante 16 horas como se ha descrito anteriormente. Las bacterias se recolectaron por centrifugación a 3000xg durante 45 minutos a temperatura ambiente en una centrífuga Eppendorf 5810R (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) y se aislaron los plásmidos utilizando el Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen NV, Venlo, NL) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Los plásmidos purificados se cuantificaron por espectrofotometría utilizando un instrumento nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU).
2. Producción, cuantificación y purificación de proteínas de fusión
Células HEK 293 fueron transfectadas con plásmidos codificantes para las diferentes proteínas de fusión de la invención utilizando un kit de transfección (Clontech® Calphos; Takara Bio Inc., Otsu, JP) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Pasadas 48 horas, el sobrenadante del medio de cultivo fue recolectado y filtrado utilizando un filtro de 0,45 pm de porosidad (EMD Milipore®; Merck kGaA, Darmstadt, DE). El sobrenadante filtrado se almacenó a -20°C hasta su uso.
Las proteínas de fusión fueron cuantificadas mediante ELISA. En resumen, una solución 1 pg/mL de un anticuerpo F(ab)2 de cabra (Fc-específico) anti-IgG humana (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc., West Grove, Pa , EEUU) en PBS se añadió a una placa de 96 pocillos (MaxiSorp®/Nunc-Immuno® 96 MicroWell; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU) a razón de 100 pL/pocillo. Tras el bloqueo con PBS/10 %FBS/0,05 % tween20 y el lavado, se añadieron a la placa diluciones en serie del sobrenadante del cultivo (que contenía la proteína recombinante) en un tampón de bloqueo (100 pL/pozo) y se incubaron durante la noche a 4°C. Como referencias, se utilizaron diluciones de 0,1 pg/mL, 0,05 pg/mL, 0,025 pg/mL de la proteína purificada e-CD4-IgG. A continuación, se lavó de nuevo la placa y se añadió una dilución 1/10000 de un anticuerpo secundario HRP-F (ab)2 de cabra (Fc-específico) anti-IgG humana (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc., West Grove, PA, EEUU) en una solución tampón/bloqueante a razón de 100 pL/pocillo. La placa se incubó a temperatura ambiente por 1 hora. Se lavó la placa y se detectaron los anticuerpos fijados a los pocillos utilizando un sustrato OPD. La reacción se detuvo utilizando una solución 4N de H2S04 . El producto de la reacción se midió utilizando un lector de placas ELISA a 492 nm.
Las proteínas fueron purificadas utilizando una columna de sefarosa-proteína A (GE Healthcare, Inc., Stamford, CT, EEUU). Las proteínas fueron producidas utilizando un medio de cultivo libre de suero, como se indica arriba. El sobrenadante fue recolectado y centrifugado a 3000xg durante 10 minutos. Luego el sobrenadante se filtró utilizando un filtro de 0,45 pm de porosidad para remover los residuos celulares. El sobrenadante clarificado se añadió a las perlas de sefarosa-proteína A previamente lavadas y se incubó durante la noche a 4°C con rotación de extremo a extremo. Se lavó la proteína A con tampón salino Tris (TBS) y la proteína unida se eluyó con una solución 4M de MgCl2. Alternativamente, las proteínas se purificaron utilizando columnas de la matriz de afinidad CaptureSelect FcXL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU) y se eluyeron con tampón de glicina pH=3,5. La proteína purificada se dializó mediante PBS y se concentró mediante ultrafiltración, se cuantificó mediante ELISA o espectrofotometría y se almacenó a -802C hasta su uso.
3. Ensayos de neutralización
Aislados de VIH-1, a saber, NL4-3, BaL, AC10, SVBP6, SVBP8, SVBP11, SVBP14, SVBP15, SVBPl7, SVBP18, SVBP19, fueron generados como pseudovirus utilizando plásmidos de expresión de Env y el vector pSG3. Véase Sánchez-Palomino S, et al., Vaccine 2011; 29:5250-5259. La capacidad de neutralización viral de las proteínas de fusión de la invención se midió utilizando un ensayo estándar TZM-bl. Véase Li, 2005, supra. Utilizando una placa de 96 pocillos, se mezclaron 100 pL de una solución de las proteínas de fusión de la invención, previamente diluida, y 50 pL de los pseudovirus en presencia de 200 TCID50 (dosis infecciosas de cultivo de tejidos, en inglés). La mezcla se incubó a 37°C por 1 hora. Posteriormente, se añadieron a cada pocillo 100 pL de una solución conteniendo 10.000 células repórter TZM-bl/luciferasa. Se incubó la placa a 37°C y bajo una atmósfera de 5 % CO2 por 48 horas. Se analizaron diluciones en serie de las proteínas de fusión de la invención en un rango de 1000 a 0,1 ng/mL de concentración. A continuación, se trataron las células repórter TZM-bl con dextrano (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EEUU) para promover su infectividad. Se utilizó un sustrato de la luciferasa Britelite Plus® (PerkinElmer, Inc., Waltham, m A, EEUU) como elemento de lectura. Los ajustes no lineales de los datos de neutralización se calcularon utilizando valores normalizados ajustados a una curva de inhibición de un sitio con pendiente variable de Hill. Todos los análisis estadísticos y ajustes no lineales fueron llevados a cabo mediante el programa GraphPad Prism v5.0. (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EEUU).
4. Ensayos de actividad ADCC
Se realizó un ensayo de actividad ADCC con las proteínas de fusión de la invención a fin de evaluar su capacidad para activar células NK y así inducir la destrucción de células infectadas con VIH. Véase Alpert M, et al., J. Virol. 2012; 86:12039-12052. Se utilizó la línea KHYG-1 CD16+ como fuente de células efectoras NK y la línea CEM.NKR.CCR5+ Luc como fuentes de células diana. Las células diana fueron infectadas con un aislado BaL altamente infeccioso 5 días antes del comienzo del ensayo. Las células infectadas se cultivaron en un medio de cultivo R10 (RPMI suplementado con 10 % de suero fetal bovino) a 37°C. En una placa de 96 pocillos se co-cultivaron 104 de células diana (> 40 % de ellas infectadas) y 105 de células efectoras en un medio de cultivo R10 suplementado con r-IL-2 (10 U/mL). El co-cultivo se realizó en presencia de diferentes concentraciones de las proteínas de fusión de la invención o de moléculas basadas en anticuerpos y utilizando un volumen total de reacción de 200 pL por pocillo en placas de 96 pocillos con fondo redondo U. El co-cultivo se incubó a 37°C por 8 horas. Posteriormente, las células fueron resuspendidas y 150 pL de las células en suspensión fueron mezcladas con un sustrato de luciferasa Britelite Plus® (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, EEUU), el cual fue utilizado como elemento de lectura. Dado que las células diana expresan luciferasa al infectarse con VIH, la reducción en la actividad de esta enzima es una medida directa de la capacidad de las proteínas de fusión de la invención para inducir la muerte de células infectadas con VIH mediante la activación de células NK.
Ejemplo 1
Diseño de las proteínas de fusión CD4-IgG
Se preparó una proteína de fusión CD4 humana/IgG murina según descrito previamente. Esta proteína de fusión ha sido utilizada en el pasado para identificar anticuerpos con actividad anti CD4. Véase Carrillo J, et al., PLOS One 2015; 10 (3):0120648; figura 1. Se realizaron varias modificaciones a la secuencia de la proteína CD4-IgG1 a fin de aumentar su actividad antiviral y ADCC dado que la proteína de fusión original posee una capacidad terapéutica limitada. Véase Jacobson J, et al., Antimicrob Agents Chermother, 2004: 48(2): 423-429. Primeramente, el fragmento Fc de la IgG1 humana fue mutado puntualmente en las posiciones G236A, S239D, A33OL e I332E, según descrito en el arte, para aumentar su actividad ADCC. Véase Bournazos, 2014, supra. También se realizaron otras modificaciones para aumentar la interacción con la Env de VIH, incluyendo la adición de una secuencia de 29 aminoácidos correspondiente al extremo de N- terminal de la región extracelular del receptor CCR5 humano (SEQ ID NO:6) o la adición de la secuencia del polipéptido T-20 (SEQ ID NO:7) al extremo C-terminal de la cadena Fc. Véase Gardner, 2015, supra. Al proceder de esta manera consideramos que la adición de un péptido capaz de unirse a gp41 y bloquear los eventos previos a la entrada del VIH a sus células diana tendría un efecto sinérgico sobre la actividad antiviral de dichas proteínas de fusión. Consecuentemente, se diseñaron derivados de anticuerpos conteniendo ambas secuencias: la del receptor CCR5 humano (s Eq ID NO:6) y la del polipéptido T-20 (SEQ ID NO:7). Véase figuras. 1 y 2.
También consideramos que el efecto sinérgico sobre la actividad antiviral aumentaría aún más si las secuencias CCR5 y T-20 fueran capaces de interaccionar al mismo tiempo con sus dianas respectivas. Con este objetivo en mente, se introdujo un conector peptídico que se extendiese desde el sitio de unión del correceptor hasta gp41. Véase figura 3.
Se preparó una proteína de fusión eCD4-IgG1 (Molécula-1), según descrito previamente, para efectos de comparación. La proteína de fusión eCD4-IgG1 es el anticuerpo sintético más potente contra el VIH que se conoce en el arte hasta el momento. Véase Gardner, 2015, supra. La cadena Fc de la Molécula-1 fue mutada en las posiciones G236A, S239D, A33OL e I332E, al igual que las proteínas de fusión de la invención, a fin de obtener una mejor base de comparación. Estas modificaciones resultaron en la proteína de fusión eCD4-mIgG1 (Molécula-2).
Ejemplo 2
Actividad antiviral de las proteínas de fusión de primera generación
Se evaluó la actividad antiviral de las proteínas de fusión de la invención mediante un ensayo de neutralización estándar. Se utilizaron 3 tipos diferentes de virus para el ensayo: (i) la cepa NL4-3 de VIH-1, un aislado de tropismo X4, (ii) la cepa BaL de VIH-1 (tropismo R5), y (iii) el aislado primario AC10 de VIH-1. Las cepas NL4-3 y BaL se utilizan experimentalmente en laboratorios. El aislado AC10 es un virus clase 2 muy difícil de neutralizar. También se llevó a cabo una caracterización más amplia de la actividad neutralizante utilizando un panel de virus subtipo B de VIH ampliamente conocidos en el arte. Véase Li, 2005, supra.
En resumen, utilizando una placa de 96 pocillos se mezclaron 100 pL de una muestra de plasma, previamente diluida, y 50 pL de los pseudovirus en presencia de 200 TCID50. La mezcla se incubó a 37°C por 1 hora. Posteriormente, se añadieron a cada pocillo 100 pL de una solución conteniendo 10.000 células repórter TZM-bl/luciferasa. Se incubó la placa a 37°C y bajo una atmósfera de 5 % CO2 por 48 horas. Se analizaron diluciones en serie de las proteínas de fusión de la invención en un rango de 1000 a 0,1 ng/mL de concentración. A continuación, se trataron las células repórter TZM-bl con dextrano (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EEUU) para promover su infectividad. Se utilizó un sustrato de la luciferasa Britelite Plus® (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, EEUU) como elemento de lectura. Los ajustes no lineales de los datos de neutralización se calcularon utilizando valores normalizados ajustados a una curva de inhibición de un sitio con pendiente variable de Hill. Todos los análisis estadísticos y ajustes no lineales fueron llevados a cabo mediante el programa GraphPad Prism v5.0. (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EEUU).
A continuación, se ensayó la capacidad de todas las moléculas para bloquear la infectividad de los aislados NL4-3 y BaL. Para la neutralización de NL4-3, la molécula-4, conteniendo una secuencia CCR5, mostró un valor IC50 de 7,1 ng/mL, mientras que la Molécula-3, conteniendo una secuencia T-20, mostró ser más potente, al obtener un valor IC50 de 2,2 ng/mL. Un valor menor fue observado con respecto a la molécula de referencia eCD4-IgG1 (Molécular-1, IC50=1,2 ng/mL) y su derivada con el segmento Fc mutado, la Molécula-2 (IC50=1,1 ng/mL). El compuesto más potente fue el derivado de anticuerpo conteniendo ambas secuencias CCR5 y T-20 (Molécula-5) que mostró un valor de IC50 de 0,06 ng/mL. Estos resultados sugieren que la combinación de las secuencias c CR5 y T-20 con un conector peptídico de extensión variable confiere una actividad antiviral más potente. Véase figura 4 (a); Tabla 1. Una menor actividad neutralizante se observó para la Molécula-0 y la Molécula-6, que contenían solo secuencias de CD4.
Resultados similares a los anteriores fueron observados con el aislado BaL. El orden de la actividad antiviral en el ensayo de neutralización de BaL fue Molécula-4 < Molécula-3 < Molécula-1 (eCD4-IgG1) < Molécula-2 (eCD4-mIgG1) < Molécula-5. Otra vez, la Molécula-5 demostró ser la más potente al obtener un valor IC50 de 0,01 ng/mL, un valor 100 veces mayor que la molécula de referencia eCD4-IgG1 (Molécula-1, IC50=1,1 ng/mL). Véase figura 4 (b); Tabla 1. Nuevamente, se observó que las Molécula-0 y Molécula-6 que contenían la secuencia CD4 solamente, mostraron las actividades neutralizantes más bajas.
Sorprendentemente, sólo la Molécula-5 mostró tener actividad antiviral en contra del aislado AC10. El resto de las proteínas de fusión de primera generación fueron inefectivas en contra de AC10 dentro del rango de concentraciones analizado. Véase figura 4 (c); Tabla 1.
Tabla 1
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Ejemplo 3
Actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de las proteínas de fusión de primera generación Una característica adicional de las proteínas de fusión de la invención es su habilidad para activar las células NK y mediar la ADCC. Este mecanismo es muy importante para la remoción rápida y eficiente de células infectadas con VIH. La ADCC contribuye además a la protección de sujetos no infectados contra la exposición al VIH y su infección. Véase Euler Z, et al., AIDS Res Hum Retroviruses 2015; 31(1):13-24.
Se evaluó la actividad ADCC de las proteínas de fusión de la invención utilizando un ensayo descrito previamente en el arte. Véase Alpert M, et al., J. Virol. 2012; 86:12039-12052. En este ensayo, la capacidad de matar las células NK se mide en función de la expresión de luciferasa en una línea celular repórter infectada con VIH. La habilidad de los derivados de anticuerpos conteniendo las secuencias CCR5 y T-20 (Molécula-5) se comparó con la proteína de fusión CD4-IgG1 (Molécula-6, conteniendo un segmento Fc mutado) y la proteína de fusión de referencia eCD4-IgG1 (Molécula-1). El análisis de la curva dosis- respuesta de las células infectadas con el aislado BaL de VIH muestra valores IC50 de 71,4 ng/mL y 66,2 ng/mL para la Molécula-1 y el anticuerpo IgGb12, respectivamente. Por otro lado, las moléculas conteniendo el segmento Fc mutado obtuvieron valores IC50 más bajos. Las Molécula-6 y Molécula-5 mostraron valores IC50 de 15,0 ng/mL y 14,9 ng/mL, respectivamente, y además fueron efectivas en la erradicación de células infectadas con VIH. Véase figura 5. Estos resultados sugieren que las mutaciones realizadas al segmento Fc de los derivados de anticuerpos de la invención mejoran significativamente su capacidad protectora.
Ejemplo 4
Optimización de la longitud del enlazador y análisis del papel de la secuencia CCR5
Aunque la Molécula-5 mostró actividades antiviral (+10.000 %) y ADCC (500 %) superiores a la proteína de fusión de referencia eCD4-i-IgG1 (Molécula 1), consideramos oportuno realizar modificaciones adicionales al esquema general de las proteínas de fusión de primera generación a fin de mejorar aún más dichas actividades. El propósito de estas modificaciones fue: (i) optimizar la longitud del conector peptídico y (ii) analizar si la inclusión de la secuencia CCR5 contribuía a las actividades antiviral y ADCC de las proteínas de fusión de manera significativa. Con este objetivo en mente, se preparó una nueva colección de proteínas de fusión siguiendo los protocoles antes descritos. Esta nueva colección incluyó proteínas de fusión con conectores peptídicos de largos diferentes y que contenían o no la secuencia CCR5. Véase figura 6.
Ejemplo 5
Actividad antiviral de las proteínas de fusión de segunda generación
Se evaluó la actividad antiviral de las proteínas de fusión de segunda generación siguiendo el protocolo del Ejemplo 2.
Se ensayó la capacidad de todas las moléculas para bloquear la infectividad de los aislados NL4-3 y BaL. Para la neutralización de NL4-3, las Molécula-5, Molécula-7 y Molécula-8 mostraron las potencias más altas con valores de IC50 significativamente cercanos de 0,06 ng/mL, 0,017 ng/mL y 0,031 ng/mL, respectivamente. Por otro lado, la Molécula-10 mostró la potencia más baja (IC50=1,8 ng/mL), mientras que la Molécula-11 mostró una potencia intermedia (IC50=0,35 ng/mL). Los valores de IC50 de los compuestos de referencia Molécula-1 (eCD4-IgG1) y Molécula-0 (CD4-IgG1) fueron 1,2 ng/mL y 8,9 ng/mL, respectivamente. Las Molécula-5, Molécula-7 y Molécula-8 resultaron ser mucho más potentes que la Molécula-1. Por ejemplo, la Molécula-7 es 1000 % más potente que la Molécula-1 para inactivar el aislado NL4-3 de VIH. Véase figura 7 (a); Tabla 2. Resultados similares a los anteriores se observaron con el aislado BaL. El orden de la actividad antiviral en el ensayo de neutralización de BaL fue Molécula-7 < Molécula-8 < Molécula-5 < Molécula-11 < Molécula-1 (eCD4-IgG 1) < Molécula-10. De nuevo, la Molécula-7 demostró ser la más potente al obtener un valor IC50 de 0,005 ng/mL, un valor 20.000 % mejor que la molécula de referencia, Molécula-1 (eCD4-IgG1). Véase figura 7 (b); Tabla 2.
Es importante destacar que sólo las proteínas de fusión según la invención (es decir, Molécula-7, Molécula-5, Molécula-11 y Molécula-8) mostraron actividad antiviral contra el aislado AC10. Molécula-7 mostró la mayor actividad antiviral con un valor IC50 de 1,3 ng/mL, mientras que Molécula-8 y Molécula-5 mostraron una potencia dos/tres veces menor; una potencia que seguía siendo mucho mayor que Molécula-1 (eCD4-IgG1, que mostró un IC50>100 ng/mL). Véase la figura 7(c); Tabla 2.
Los datos anteriores sugieren, sorprendentemente, que la secuencia CCR5 podría no ser necesaria para la actividad antivírica, ya que tanto la Molécula-5 como la Molécula-7 muestran una actividad antivírica similar. La secuencia CCR5 podría estar actuando como una secuencia espaciadora en lugar de ofrecer un beneficio en la actividad antiviral. Esto podría ser coherente con la menor afinidad de interacción de la región N-terminal de CCR5 con gp120 en comparación con la afinidad de CD4 por gp120 o del polipéptido T-20 por gp41. Además, estos resultados indican también que (a) la longitud del enlazador por sí misma o (b) en combinación con las mutaciones introducidas en la región Fc tiene un efecto sobre la actividad antiviral de las proteínas de fusión de los derivados de anticuerpos de la invención. Esta propiedad sería sugerida por una comparación de los valores de IC50 de la Molécula-5 y la Molécula-8 con la Molécula-1 para los tres aislamientos, que muestra que una proteína mutada con un enlazador pero sin una secuencia CCR5 (Molécula -8) tiene una potencia comparable a la de una proteína mutada con un enlazador y una secuencia CCR5 (Molécula-5) y una potencia mucho mayor que una proteína no mutada sin enlazador (Molécula-1). Véase la figura 7(a)-(c); Tabla 2.
Tabla 2
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Ejemplo 6
Actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de las proteínas de fusión de segunda generación Se evaluó la actividad ADCC de las proteínas de fusión de segunda generación siguiendo el protocolo del Ejemplo 3.
La habilidad de las Molécula-5, Molécula-7 y Molécula-8 para inducir actividad ADCC se comparó con la proteína de fusión de referencia eCD4-IgG1 (Molécula-1) y el anticuerpo neutralizante IgGb12. El análisis de la curva dosis-respuesta de las células infectadas con el aislado BaL de VIH mostró que las Molécula-5, Molécula-7 y Molécula-8 poseían valores IC50 de 14,9 ng/mL, 23,8 ng/mL y 14,3 ng/mL, respectivamente. Por otro lado, la proteína de referencia eCD4-IgG1 (Molécula-1) y el anticuerpo IgGb12 obtuvieron valores IC50 de 71,4 ng/mL y 66,2 ng/mL, respectivamente, demostrando de esta manera tener una potencia menor que las Molécula-5, Molécula-7 y Molécula-8. Véase figura 8.
De nuevo, estos resultados sugieren que las mutaciones introducidas al segmento Fc de las proteínas de fusión potencian la actividad ADCC. Las Molécula-5 y Molécula-8 demostraron ser 500 % más potentes que la Molécula- 1, mientras que la Molécula-7 demostró ser 300 % más potente que dicha proteína de referencia.
A fin de caracterizar ulteriormente las actividades antiviral y ADCC de los derivados de anticuerpos de segunda generación, se analizaron las Molécula-5, Molécula-7 y Molécula- 8 en contra de un panel conocido de virus subtipo B de VIH. Véase Li, 2005, supra. La Molécula-0 y Molécula-1 se utilizaron como referencia. En resumen, la Molécula-0 mostró tener una baja actividad antiviral y fue incapaz de neutralizar los aislados primarios a 100 ng/mL. La Molécula-1 mostró una actividad ligeramente superior, pero sólo un virus del panel fue neutralizado por debajo de 100 ng/mL. Véase figura 9. En contraposición, las Molécula-5, Molécula-7 y Molécula-8 mostraron valores IC50 en el rango de 1 ng/mL a 25 ng/mL y fueron capaces de neutralizar todos los virus del panel. Véase figura 10.
Ejemplo 7
Actividad antiviral de las proteínas de fusión en combinación con medicamentos antiretrovirales
Se realizó un ensayo de neutralización estándar para evaluar la actividad antiviral de la Molécula-5 contra el aislado del VIH NL4-3 en presencia de diferentes concentraciones de los siguientes fármacos antirretrovirales: 3TC/lamivudina, efavirenz (EFV) y raltegravir (RAL), como se describe en el ejemplo 2. Se determinaron los valores de IC50 para la Molécula-5 (rango de concentración: 0,02 a 0,00001 pg/mL) en presencia de las siguientes concentraciones de fármacos antirretrovirales:
3TC - 40, 8, 1.6, 0.32, 0.064, 0.013, 0.0026 and 0.0005 pM;
EFV - 0.1, 0.02, 0.004, 0.0008, 0.0002, 0.00003, 0.000006 and 0.000001 pM; y
RAL - 0.05, 0.01, 0.002, 0.0004, 0.00008, 0.00002, 0.000003 and 0.0000006 pM.
La Molécula-5 fue eficaz bloqueando la infectividad del VIH en todos los casos con un IC50 en el rango de pg/mL alto (104 pg/mL fue el valor más bajo detectado mientras que 257 pg/mL fue el más alto). Véase la figura 11 (a)-(c).
Ejemplo 8
Actividad de inactivación viral de las proteínas de fusión
Para evaluar la inactivación irreversible del VIH inducida por las proteínas de fusión, se incubó un stock viral BaL del VIH altamente infeccioso en medio de cultivo Dm Em con diluciones seriadas (rango de concentración: 0,7 pg/mL a 0,7 pg/mL) de la Molécula-5 o del derivado C34 de la Molécula-7 (rango de concentración: 1 pg/mL a 1 pg/mL). Tras 1 hora de incubación a 37°C, las muestras se diluyeron con DMEM y los virus y las proteínas solubles se separaron mediante la adición del reactivo LentiX Concentrator (Takara/Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, EE.UU.). La mezcla se incubó durante 30 minutos a 4°C y posteriormente se centrifugó a 1.500 x g durante 45 minutos a 4°C. Se eliminaron los sobrenadantes y los pellets virales se volvieron a suspender en DMEM. La infectividad de los virus tratados se analizó por titulación en células TZM-bl. Véase Li M, et al., J. Virol. 2005; 79:10108-10125. Se calculó el valor TCID50 de cada preparación para evaluar la infectividad restante de los virus tratados.
Ambas moléculas ensayadas fueron eficaces para inactivar de forma irreversible la infectividad de la cepa viral BaL con valores de IC50 de 0,055 y 0,044 pg/mL para la Molécula-5 y para el derivado C34 de la Molécula-7, respectivamente. Notablemente, no se detectó infectividad viral a concentraciones superiores a 0,1 pg/mL de ambas proteínas; por lo tanto, se logró una reducción de más de cinco logs en el título de infectividad viral. Véase la figura 12.
Ejemplo 9
Actividad antiviral de las proteínas de fusión con diferentes polipéptidos de gp41
Se introdujeron mutaciones silenciosas en la secuencia completa de la Molécula-5 y la Molécula-7 para permitir la escisión de la secuencia T20 (SEQ ID NO:28). Esta secuencia fue sustituida por las siguientes secuencias T1249 (SEQ 5 ID NO:29), C34 (SEQ ID NO:30) y T2635 (SEQ ID NO:31).
Las moléculas se produjeron por transfección transitoria de células HEK-293T como se ha descrito anteriormente y se realizó un ensayo de neutralización estándar para evaluar la actividad antiviral de estos nuevos derivados de Molécula-5 y Molécula-7 contra un panel de aislados del subtipo B del VIH, incluyendo aislados adaptados en laboratorio y primarios. Véase la figura 13.
Todos los derivados de Molécula-5 y Molécula-7 Molécula-5-T-1249, Molécula-5-C34, Molécula-5-T-2635, Molécula-7-T-1249, Molécula-7-C34 y Molécula-7-T-2635 fueron eficaces en el bloqueo de la infectividad del VIH en todos los casos con IC50 en el rango de pg/mL o ng/mL, mostrando una mayor potencia y cobertura que las moléculas de control Molécula-1 o Molécula-6. Véase la figura 13.
Ejemplo 10
Actividad antiviral de las proteínas de fusión que muestran diferentes secuencias de IgG humana
Se introdujeron sitios de restricción Kpnl y Nhel en la secuencia completa de los derivados C34 derivados de la Molécula-5 y la Molécula-7 para permitir la escisión de la porción Fc de la IgG humana con las mutaciones puntuales G236A, S239D, A330L e I332E (SEQ ID:25).
Esta secuencia se sustituyó por una secuencia de IgG 1 humana de tipo salvaje (SEQ ID NO:24), IgG2 humana, IgG3 humana e IgG4 humana. Las moléculas se produjeron por transfección transitoria de células HEK-293T como se ha descrito anteriormente y se realizó un ensayo de neutralización estándar para evaluar la actividad antiviral contra los virus NL4-3 y BaL (para los nuevos derivados Molécula-5) y contra un panel de aislados del subtipo B del VIH SVBP, incluyendo aislados adaptados en laboratorio y primarios difíciles de neutralizar para los nuevos derivados Molécula-7.
Todos los derivados de la Molécula-5, Molécula-5-IgG1, Molécula-5-IgG2, Molécula-5-IgG3 y Molécula-5-IgG4, fueron igualmente eficaces en el bloqueo de la infectividad del VIH en todos los casos con IC50 en el rango de pg/mL o ng/mL, mostrando una potencia similar. Véase la Tabla 3. Todos los derivados de la Molécula-7, Molécula-7-IgG1, Molécula-7-IgG2, Molécula-7-IgG3 y Molécula-7-IgG4, fueron igualmente eficaces en el bloqueo de la infectividad del VIH en todos los casos con IC50 en el rango de pg/mL o ng/mL, mostrando una potencia y cobertura similares. Véase la figura 14.
Tabla 3
Figure imgf000026_0001
Ejemplo 11
Expresión de las proteínas de fusión in vivo mediante vectores virales AA Vs
Ratones NSG (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, EEUU) fueron mantenidos bajo condiciones libres de patógenos (SPF, specific pathogen-free, en inglés).
Para inducir una expresión estable de las proteínas de fusión en estos animales, se clonaron las secuencias codificantes para la Molécula-5 (SEQ ID NO:37), Molécula-6 (SEQ ID NO: 38), Molécula-7 (SEQ ID NO:39) y Molécula-8 (SEQ ID NO:40) en plásmidos que expresan AAV8 (CBATEG, Univesitat Autónoma de Barcelona, Barcelona, Es ). Se diluyeron 1X1011 partículas virales en 40 pL de una solución 100 mM de citrato de sodio (10 mM Tris, pH=8). Posteriormente, se inyectó intramuscularmente la solución con el vector viral a ratones de 8 semanas de edad. Al mismo tiempo, se administraron 10 millones de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de seres humanos sanos a los ratones por vía intraperitoneal. Después de dos semanas, se inyectaron los ratones con 10000 TCDI50 del aislado NL4-3 de VIH (TCDI50 se define como la dosis de cultivo que infecta 50 % de las células) por vía intraperitoneal. Se recogieron muestras de sangre semanalmente y el recuento de células T c D4+ y CD8+ se analizó por citometría de flujo utilizando perlas Perfect Count® (Cytognos SL, Salamanca ES) en combinación con los siguientes anticuerpos: anti­ humano CD45-V450, CD3-APC/Cy7, CD4-APC, CD8-V500, CD14-PerCP/CY5.5, CD56-PE, CD16-Fitc y anti­ ratón CD45 PE/Cy7. Las muestras se analizaron con un citómetro de flujo LSR II® (BD Biosciences Corp., Franklin Lakes, NJ, EE.UU.). También se analizaron las muestras para determinar los niveles de derivados de anticuerpos mediante el método ELISA descrito anteriormente. Después de 3 semanas de la infección, se sacrificaron los ratones y se recogieron muestras de sangre y tejido. Las muestras se analizaron por citometría de flujo y se determinó la carga viral y el ADN total del VIH mediante qPCR.
Se encontraron niveles detectables de proteínas de fusión en la mayoría de animales tratados 2 y 3 semanas después del tratamiento con AAV, en comparación con los grupos no tratados. Además, el nivel de expresión fue estable en todos los animales. Véanse las figuras 15(a) y 15(b).

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Proteína de fusión que comprende del extremo N-terminal en dirección al extremo C-terminal:
(a) los dominios extracelulares D1 y D2 del receptor CD4 humano,
(b) el segmento Fc de una inmunoglobulina G humana,
(c) un conector peptídico de secuencia (GGGGS)n donde 4 < n < 10, y
(d) un polipéptido derivado de gp41, en la que dicho polipéptido es T-20 o C34,
en la que la secuencia de aminoácidos de T-20 es la SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de C34 es la SEQ ID NO: 9.
2. Proteína de fusión, según la reivindicación 1, en la que el segmento Fc de la inmunoglobulina G humana comprende el subtipo IgG1.
3. Proteína de fusión, según las reivindicaciones 1 o 2, en la que el segmento Fc de la IgG o IgG1 humana comprende las mutaciones puntuales G236A, S239D, A330L e I332E.
4. Proteína de fusión, según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además en la posición c) de la reivindicación 1 la secuencia del receptor CCR5 humano tal como se indica en la SEQ ID NO: 6.
5. Secuencia de nucleótidos aislada codificante para la proteína de fusión según la reivindicación 1.
6. Secuencia de nucleótidos, según la reivindicación 6, en la que sus codones han sido optimizados.
7. Vector de expresión que comprende las secuencias de nucleótidos según las reivindicaciones 5 a 6
8. Célula huésped que comprende las proteínas de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, las secuencias de nucleótidos según las reivindicaciones 5 a 6, o el vector de expresión según la reivindicación 7.
9. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de las proteínas de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, las secuencias de nucleótidos según las reivindicaciones 5 a 6, el vector de expresión según la reivindicación 7, la célula huésped según la reivindicación 8 o una mezcla de los mismos.
10. Proteína de fusión, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, las secuencias de nucleótidos según las reivindicaciones 5 a 6, el vector de expresión según la reivindicación 7, la célula huésped según la reivindicación 8 o la composición farmacéutica según la reivindicación 9, para su uso como medicamento.
11. Proteína de fusión, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, las secuencias de nucleótidos según a las reivindicaciones 5 a 6, el vector de expresión según la reivindicación 7, la célula huésped según la reivindicación 8 o la composición farmacéutica según la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento del VIH o el SIDA.
12. Proteína de fusión, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, las secuencias de nucleótidos según las reivindicaciones 5 a 6, el vector de expresión según la reivindicación 7, la célula huésped según la reivindicación 8 o la composición farmacéutica según la reivindicación 9, para su uso en la prevención del VIH o el SIDA.
13. Método para preparar las proteínas de fusión, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las etapas de: (a) cultivar una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos según las reivindicaciones 5 a 6, (b) expresar la secuencia de nucleótidos y (c) recuperar las proteínas de fusión del medio de cultivo.
14. Método in vitro para inactivar VIH que comprende contactar el virus con las proteínas de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
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