ES2908080T3 - Compuestos - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fórmula general I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo: **(Ver fórmula)** en la que R1 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo o cicloalquilo opcionalmente sustituido; R2, cada uno de los cuales puede ser igual o diferente, representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo opcionalmente sustituido; y X es un grupo alquileno de cadena lineal o ramificada, un grupo cicloalquileno, arileno o aralquileno, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre halo, nitro y arilo, en el que el arilo está opcionalmente sustituido con uno o más grupos halo, alquilo, haloalquilo, alcoxi o nitro.
Description
DESCRIPCIÓN
Compuestos
El tratamiento fotodinámico (PDT) es una técnica para el tratamiento de lesiones precancerosas, cáncer y enfermedades no cancerosas. La PDT implica la administración de un fotosensibilizante o un precursor del mismo (es decir, un "agente fotosensibilizante") en un área de interés. El fotosensibilizante o precursor del mismo se absorbe en las células, donde un precursor de un fotosensibilizante se convierte en un fotosensibilizante. Tras la exposición del área de interés a la luz, el fotosensibilizante se excita, normalmente desde un estado de singlete fundamental a un estado de singlete excitado. Luego se somete a un cruce intersistémico a un estado de triplete excitado de mayor duración. Una de las pocas especies químicas presentes en el tejido con un estado de triplete fundamental es el oxígeno molecular. Cuando el fotosensibilizante y una molécula de oxígeno están en proximidad, puede tener lugar una transferencia de energía que permite que el fotosensibilizante se relaje a su estado de singlete fundamental y cree una molécula de oxígeno en estado de singlete excitado. El oxígeno singlete es una especie química muy agresiva y reaccionará muy rápidamente con cualquier biomolécula cercana. En última instancia, estas reacciones destructivas matarán las células a través de la apoptosis o la necrosis, por lo que, por ejemplo, las células cancerosas se eliminan selectivamente. Los mecanismos aún no se comprenden por completo, pero los estudios sugieren que el resultado clínico (es decir, la selectividad por las células cancerosas) no se debe a la absorción selectiva por parte de las células cancerosas. Más bien, hay niveles similares de absorción en todos los tipos de células, pero los procedimientos de conversión y eliminación son diferentes en las células malignas y, en general, en las células metabólicamente activas, tales como las células inflamadas o infectadas, lo que genera un gradiente de concentración entre el tejido canceroso y el normal.
Se conocen y describen en la bibliografía varios agentes fotosensibilizantes, incluyendo el ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) y ciertos derivados del mismo, por ejemplo, ésteres de 5-ALA, ambos de los cuales son precursores de fotosensibilizantes. Estos se convierten intracelularmente en protoporfirinas, tales como la protoporfirina IX (PpIX), que son fotosensibilizantes. Actualmente, varios productos farmacéuticos que comprenden 5-ALA o un éster del mismo están en uso clínico para PDT y diagnóstico fotodinámico (PDD). Uno de ellos es Metvix®, un producto dérmico en forma de crema que contiene éster metílico de 5-ALA (desarrollado por Photocure ASA, Noruega, y ahora comercializado por Galderma, Suiza), para el tratamiento fotodinámico de la queratosis actínica y el carcinoma de células basales. Otro es Levulan Kerastick® (DUSA Pharmaceuticals, Canadá), un producto para el tratamiento fotodinámico de la queratosis actínica que contiene 5-ALA. Hexvix® (desarrollado por Photocure ASA) es una solución acuosa que comprende éster hexílico de 5-ALA para instilación en la vejiga para el diagnóstico de cáncer de vejiga.
Galande et al, J. Comb. Chem. 2005, 174-177 divulga la preparación de un éster (2S)-2-carboxi-2-[[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino]etílico de 5-ALA.
El documento WO 2009/074811 divulga el uso de 5-ALA y ciertos ésteres del mismo en PDT. Vallinayagam et al, Synthesis, 2007, 3731-3735 divulga la síntesis de diversos derivados de 5-ALA para su uso en la preparación de profármacos basados en 5-ALA.
El documento WO 2006/051269 divulga el uso de ciertos ésteres de 5-ALA en la prevención o el tratamiento del acné.
Sin embargo, todavía existe la necesidad de fotosensibilizantes alternativos o precursores de los mismos. La presente invención aborda esta necesidad al proporcionar precursores de fotosensibilizantes según la fórmula general I a continuación.
De este modo, visto desde un primer aspecto, la invención proporciona un compuesto de fórmula general I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en la que
R1 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo o cicloalquilo opcionalmente sustituido;
R2, cada uno de los cuales puede ser igual o diferente, representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo opcionalmente sustituido;
y
X es un grupo de enlace que es un grupo alquileno de cadena lineal o ramificada, un grupo cicloalquileno, arileno o aralquileno, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de halo, nitro y arilo, en el que el arilo es opcionalmente sustituido por uno o más grupos halo, alquilo, haloalquilo, alcoxi o nitro.
En los compuestos de fórmula I, se prefiere que la porción -X-CO2R1 sea de naturaleza hidrofílica. El término "hidrofílico" significa que la porción -X-CO2R1 de la molécula tiene tendencia a interaccionar o estar disuelta con el agua u otros disolventes y/o sustancias polares. La naturaleza hidrofílica de esta porción de la molécula puede surgir de la naturaleza del grupo -CO2R1.
En una realización, el grupo -CO2R1 presente en la porción -X-CO2R1 de los compuestos de fórmula general I es un grupo hidrofílico. Un ejemplo típico y preferido de dicho grupo es -CO2H, es decir, donde R1 representa un átomo de hidrógeno. Los ejemplos alternativos preferidos son grupos -CO2R1 en los que R1 es un grupo alquilo de cadena lineal corta o ramificado, preferiblemente un grupo alquilo que contiene de 1 a 3 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, n-propilo, e isopropilo.
Si X es un grupo alquileno de cadena lineal, éste preferiblemente consiste en 1 a 16 átomos de carbono, es decir, metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, nonileno, decileno, undecileno, dodecileno, tridecileno, tetradecileno, pentadecileno o hexadecileno, más preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono, es decir, metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno o hexileno, aún más preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono, es decir, metileno, etileno, propileno o butileno.
Si X es un grupo alquileno ramificado, éste preferiblemente consiste en 2 a 10 átomos de carbono, más preferiblemente de 2 a 6 átomos de carbono. Los ejemplos preferidos son metil-metileno, dimetil-metileno, 1-metiletileno, 2-metil-etileno, 1,2-dimetiletileno, etil-metileno, isopropil-metileno, 1 -etil-etileno y 2-etil-etileno. Los ejemplos más preferidos son metil-metileno, etil-metileno e isopropil-metileno.
Si X es un grupo cicloalquileno, este preferiblemente consiste en 3 a 8 átomos de carbono, más preferiblemente de 5 o 6 átomos de carbono. Los ejemplos preferidos son ciclopentileno y ciclohexileno.
Si X es un grupo arileno, éste preferiblemente consiste en 6 a 12 átomos de carbono. Un grupo preferido es el fenileno, es decir, -C 6H4-, preferiblemente con las valencias libres en los átomos de carbono 1 y 4.
Si X es un grupo aralquileno, éste preferiblemente consiste en 7 a 15 átomos de carbono. Un grupo preferido es el bencileno, es decir, -CH2-C6H4-, preferiblemente con la valencia libre en el átomo de carbono 4 del anillo aromático. Cualquiera de los grupos X descritos anteriormente, es decir, grupos alquileno de cadena lineal o ramificada, grupos cicloalquileno, los grupos arileno o grupos aralquileno, pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de halo, nitro y arilo, en el que el arilo está opcionalmente sustituido con uno o más grupos halo, alquilo, haloalquilo, alcoxi o nitro.
R2, cada uno de los cuales puede ser igual o diferente, representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo opcionalmente sustituido (preferiblemente un alquilo C1-6, por ejemplo, un grupo alquilo C1-3). Cuando R2 es un grupo alquilo opcionalmente sustituido, los sustituyentes pueden ser sustituyentes hidrofílicos o no hidrofílicos como se define en este documento.
El término "sustituyente hidrofílico" indica un sustituyente capaz de formar enlaces de hidrógeno. Los sustituyentes hidrofílicos típicos y preferidos son hidroxilo, tiol, carboxilo, carbamoilo, éster y amina, más preferiblemente hidroxilo, amina y tiol.
El término "sustituyente no hidrofílico" indica un sustituyente que esencialmente no es capaz de formar enlaces de hidrógeno. Los sustituyentes no hidrofílicos no incluyen ninguno de los grupos mencionados en este documento como ejemplos de grupos hidrofílicos, tales como hidroxilo, tiol, carboxilo, carbamoilo, éster y amina. Los sustituyentes no hidrofílicos preferidos son halo, preferiblemente F o CI, nitro y arilo. Si el sustituyente no hidrofílico es un grupo arilo, dicho grupo arilo puede estar sustituido con uno o más grupos halo, alquilo, haloalquilo, alcoxi (por ejemplo, alcoxi C1-3) o nitro.
Los compuestos preferidos según la invención son aquellos en los que al menos un R2 representa un átomo de hidrógeno. En una realización preferida, cada R2 representa un átomo de hidrógeno.
En una realización preferida, la invención proporciona un compuesto de fórmula general I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que
R1 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada corta, preferiblemente un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que contiene de 1-3 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, npropilo o isopropilo;
R2, cada uno de los cuales puede ser igual o diferente, representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo opcionalmente sustituido, preferiblemente hidrógeno; y el grupo de enlace X es
(a) un grupo alquileno C1-6 opcionalmente sustituido, o
(b) un grupo cicloalquileno, arileno o aralquileno opcionalmente sustituido.
En una realización más preferida, la invención proporciona un compuesto de fórmula general I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que
cada uno de R1 y R2 representa un átomo de hidrógeno; y
el grupo de enlace X es
(a) un grupo alquileno C1-6 opcionalmente sustituido, o
(b) un grupo cicloalquileno, arileno o aralquileno opcionalmente sustituido.
En una realización más preferida, la invención proporciona un compuesto de fórmula general I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que
R1 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada corta, preferiblemente un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que contiene 1-3 átomos de carbono tales como metilo, etilo, n-propilo o isopropilo;
R2, cada uno de los cuales puede ser igual o diferente, representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo opcionalmente sustituido, preferiblemente hidrógeno; y
el grupo de enlace X es
(a) un grupo alquileno C1-4 de cadena lineal opcionalmente sustituido o un grupo alquileno C2-6 ramificado opcionalmente sustituido, o
(b) un grupo cicloalquileno C5-6 opcionalmente sustituido, un grupo arileno C6-12 opcionalmente sustituido o un grupo aralquileno C7-15 opcionalmente sustituido.
En una realización más preferida, la invención proporciona un compuesto de fórmula general I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que
cada uno de R1 y R2 representa un átomo de hidrógeno; y
el grupo de enlace X es
(a) un grupo alquileno C1-4 de cadena lineal opcionalmente sustituido o grupo alquileno C2-6 ramificado opcionalmente sustituido, o
(b) un grupo cicloalquileno C5-6 opcionalmente sustituido, un grupo arileno C6-12 opcionalmente sustituido, o un grupo aralquileno C7-15 opcionalmente sustituido.
En una realización, tales grupos X pueden no estar sustituidos. Alternativamente, tales grupos pueden estar sustituidos con uno o más sustituyentes no hidrofílicos como se describe anteriormente en este documento. Cuando el grupo de enlace X está sustituido, puede estarlo con uno o más sustituyentes no hidrofílicos. Cuando está presente más de un sustituyente, estos pueden ser iguales o diferentes y pueden estar unidos a átomos de carbono iguales o diferentes en la cadena de alquileno, anillo de cicloalquileno, anillo de arileno o cadena o anillo del grupo aralquileno.
En una realización, el grupo de enlace X es un grupo alquileno C1-6 de cadena lineal no sustituido. Ejemplos de tales grupos son un grupo alquileno C1 de cadena lineal no sustituido, es decir, un grupo metileno, un grupo alquileno C2 de cadena lineal no sustituido, es decir, un grupo etileno, un grupo alquileno C3 de cadena lineal no sustituido, es decir, un grupo propileno, un grupo alquileno C3 de cadena lineal no sustituido, es decir, un grupo propileno, un grupo alquileno C4 de cadena lineal no sustituido, es decir, un grupo butileno, un grupo alquileno C5 de cadena lineal no sustituido, es decir, un grupo pentileno, y un grupo alquileno C6 de cadena lineal no sustituido, es decir, un grupo hexileno. Los grupos de enlace X preferidos son grupos alquileno C1-4 de cadena lineal no sustituidos, es decir, metileno, etileno, propileno y butileno.
En otra realización, el grupo de enlace X es un grupo alquileno C1-6 de cadena lineal sustituido, preferiblemente un grupo alquileno C1-4 de cadena lineal sustituido, más preferiblemente un grupo alquileno C1-2 sustituido. Los sustituyentes preferidos son halo, preferiblemente F y Cl, y arilo. Cuando cualquier sustituyente es un grupo arilo, el arilo puede no estar sustituido o estar sustituido con uno o más grupos halo, alquilo, haloalquilo, alcoxi (por ejemplo, alcoxi C1-3) o nitro. En una realización preferida, dicho grupo arilo no está sustituido. Uno o más de tales sustituyentes (por ejemplo, uno o dos) se pueden unir a la cadena de alquileno. Cuando está presente más de uno de tales sustituyentes, estos pueden estar unidos al mismo átomo de carbono o a diferentes átomos de carbono presentes en el grupo de enlace X. En una realización, dos sustituyentes halo pueden estar unidos al mismo átomo de carbono. Los grupos alquileno C1-6 de cadena lineal, más preferiblemente los grupos alquileno C1-4 de cadena lineal, e incluso más preferiblemente los grupos alquileno C1-2 de cadena lineal que son mono o difluorados constituyen un aspecto preferido de la invención. Los grupos alquileno C1-6 de cadena lineal, más preferiblemente grupos alquileno C1-4 de cadena lineal, e incluso más preferiblemente grupos alquileno C1-2 de cadena lineal que están sustituidos con un sustituyente arilo, preferiblemente con fenilo, constituyen otro aspecto preferido de la invención.
En otra realización más, el grupo de enlace X es un grupo alquileno C2-6 ramificado no sustituido. Los ejemplos preferidos de tales grupos X son metil-metileno, es decir, -CH(CH3)-, etil-metileno, es decir, -CH(CH2CH3)-, e isopropilmetileno, es decir, -CH(CH-(CH3)2)-.
En otra realización más, el grupo de enlace X es un grupo alquileno C2-6 ramificado sustituido. Los sustituyentes preferidos son halo, preferiblemente F y Cl y arilo. Cuando cualquier sustituyente es cualquier grupo arilo, dicho arilo puede no estar sustituido o estar sustituido con uno o más grupos halo, alquilo, haloalquilo, alcoxi (por ejemplo, alcoxi C1-3) o nitro. En una realización preferida, dicho arilo no está sustituido. Halo es un sustituyente preferido y uno o más de tales sustituyentes se pueden unir a la cadena de alquileno ramificada. Cuando está presente más de uno de tales sustituyentes, estos pueden estar unidos al mismo átomo de carbono o a diferentes átomos de carbono presentes en la cadena de alquileno ramificada. Un ejemplo preferido de tal grupo X es trifluorometilmetileno.
En otra realización más, el grupo de enlace X es un grupo cicloalquileno no sustituido tal como ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclohexileno, cicloheptileno o ciclooctileno. Preferiblemente, el grupo de enlace X es un grupo cicloalquileno no sustituido que consiste en 5 o 6 átomos de carbono, es decir, ciclopentileno o ciclohexileno. En otra realización más, el grupo de enlace X es un grupo arileno no sustituido que consiste en 6 o 12 átomos de carbono. Un grupo de enlace X preferido de esta realización es fenileno, es decir, -C 6H4-, preferiblemente con las valencias libres en los átomos de carbono 1 y 4.
En otra realización más, el grupo de enlace X es un grupo arileno sustituido en el que el grupo arileno consiste en 6 o 12 átomos de carbono, preferiblemente 6 átomos de carbono. Los sustituyentes de anillo preferidos son halo y nitro. Uno o más de tales sustituyentes (por ejemplo, uno o dos) se pueden unir al anillo de arileno.
En otra realización más, el grupo de enlace X es un grupo aralquileno no sustituido que consiste en 7 a 11 átomos de carbono. Un grupo de enlace X preferido de esta realización es bencileno, es decir, -CH2-C6H4-, preferiblemente con la valencia libre en el átomo de carbono 4 del anillo aromático.
Los ejemplos preferidos del grupo X incluyen -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH(CH3)-, -CF2-, ciclohexileno, -CH2-C6H4-, -fenileno- y -CH(Ph) -(donde Ph = fenilo).
Los compuestos preferidos de la invención incluyen aquellos en los que X representa un grupo como se describe anteriormente y R1 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de cadena corta lineal o ramificada, preferiblemente un grupo alquilo que contiene de 1-3 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, n-propilo e isopropilo, y cada R2 es el mismo y representa hidrógeno.
Se puede hacer una mención particular de los siguientes que representan compuestos preferidos según la invención:
5-amino-4-oxopentanoato de carboximetilo
-amino-4-oxopentanoato de 2-carboxietilo
-amino-4-oxopentanoato de 3-carboxipropilo
-amino-4-oxopentanoato de carboxidifluorometilo
-amino-4-oxopentanoato de 1-carboxietilo
-amino-4-oxopentanoato de 1 -(isopropil carboxi)etilo
-amino-4-oxopentanoato de (4-carboxifenil)metilo
-amino-4-oxopentanoato de carboxifenilmetilo
-amino-4-oxopentanoato de 4-carboxibutilo
-amino-4-oxopentanoato de 5-carboxipentilo
-amino-4-oxopentanoato de 7-carboxiheptilo
-amino-4-oxopentanoato de 8-carboxioctilo
-amino-4-oxopentanoato de 9-carboxinonilo
-amino-4-oxopentanoato de 10-carboxidecilo
5-amino-4-oxopentanoato de 11-carboxiundecilo
y
5-amino-4-oxopentanoato de 15-carboxipentadecilo
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Como se usa en este documento, el término "alquilo", a menos que se indique lo contrario, se refiere a un grupo hidrocarburo saturado y pretende cubrir cualquier grupo alquilo de cadena larga o corta, de cadena lineal y ramificado.
Como se usa en este documento, el término "alquileno" se refiere a un radical divalente derivado de un alcano en el que las valencias libres forman enlaces sencillos con el resto de la molécula. El término incluye grupos alquileno de cadena lineal y ramificados. Como se usa en este documento, el término "cicloalquileno" se refiere a un radical divalente derivado de un cicloalcano en el que las valencias libres forman enlaces sencillos con el resto de la molécula.
Como se usa en este documento, el término "arilo" pretende cubrir los sistemas de anillos aromáticos. Tales sistemas de anillos pueden ser monocíclicos o policíclicos (por ejemplo, bicíclicos) y contienen al menos un anillo aromático insaturado. Cuando estos contienen anillos policíclicos, estos pueden estar fusionados.
El término "arileno", como se usa en este documento, se refiere a un radical divalente derivado de un hidrocarburo aromático en el que las valencias libres forman enlaces sencillos con el resto de la molécula.
El término "aralquileno", como se usa en este documento, se refiere a un radical divalente derivado de un alquilo sustituido con arilo o un arilo sustituido con alquilo con una valencia libre única tanto en la parte arilo como en la parte alquilo de la molécula en la que las valencias libres forman enlaces sencillos con el resto de la molécula. A menos que se indique lo contrario, el término "halo" o "átomo de halógeno" incluye flúor, cloro, bromo y yodo. Los compuestos de la invención se pueden proporcionar en forma de una amina libre, por ejemplo, -NH2, -NHR2 o -NR2R2, o preferiblemente en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Tales sales son preferiblemente sales de adición de ácido con ácidos orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables.
Los ácidos apropiados incluyen, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido nítrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido sulfónico y derivados del ácido sulfónico, ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido ascórbico, ácido oleico y ácido esteárico. Las sales adecuadas incluyen, de este modo, por ejemplo, clorhidrato, bromhidrato, nitrato, fosfato, sulfato, sulfonato, mesilato, tosilato, napsilato, acetato, lactato, citrato, tartrato, succinato, maleato, fumarato, ascorbato, oleato y estearato. Los ácidos preferidos son el ácido clorhídrico (HCl) y el ácido bromhídrico (HBr). Otros ácidos preferidos son ácido nítrico, ácido sulfónico y derivados de ácido sulfónico (por ejemplo, ácido metanosulfónico, ácido naftalenosulfónico o ácido toluenosulfónico) como se describe en el documento WO 2005/092838 de Photocure ASA.
El término "sal farmacéuticamente aceptable" indica una sal que es apropiada para su uso en un producto farmacéutico y que cumpla los requisitos relacionados con, por ejemplo, seguridad, biodisponibilidad y tolerabilidad (véase, por ejemplo, P. H. Stahl et al. (eds.) Handbook of Pharmaceutical Salts, Publisher Helvetica Chimica Acta, Zurich, 2002).
Los compuestos de la invención se pueden preparar usando procesos y procedimientos estándar bien conocidos en la técnica para la derivación de compuestos multifuncionales, por ejemplo, la derivación de ácidos carboxílicos. Como se sabe en la técnica, tales reacciones pueden implicar la protección y desprotección de grupos apropiados de modo que solo los grupos requeridos permanezcan activos y participen en la reacción bajo las condiciones de reacción elegidas. De este modo, por ejemplo, se pueden proteger los sustituyentes presentes en cualquiera de los reactivos usados para preparar los compuestos según la invención. De forma similar, el grupo -NR22 puede protegerse durante la reacción y desprotegerse posteriormente. Tales procedimientos de protección/desprotección son bien conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, McOmie en "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum, 1973 y T.W. Greene en "Protective Groups in Organic Chemistry", Wiley-Interscience, 1981.
Los compuestos de la invención se pueden preparar mediante un procedimiento que comprende al menos las siguientes etapas:
(a) hacer reaccionar un compuesto de fórmula II:
en la que cada R2', que puede ser igual o diferente, es un grupo R2 como se define en este documento o un derivado protegido del mismo
con un compuesto de fórmula III:
en la que X es como se define en este documento;
L representa un grupo saliente, por ejemplo, un átomo de halógeno; y
R1' es un grupo R1 como se define en este documento o un derivado protegido del mismo;
(b) desproteger un derivado protegido de un compuesto de fórmula I; y
(c) convertir un compuesto de fórmula I en una de sus sales farmacéuticamente aceptable.
La reacción de la etapa (a) se puede llevar a cabo convenientemente en un disolvente o mezcla de disolventes tales como agua, acetona, acetato de etilo, éter dietílico, metilformamida, tetrahidrofurano, etc., a temperaturas hasta el punto de ebullición de la mezcla, preferiblemente a temperatura ambiente. Las condiciones precisas de la reacción dependerán de los reactivos usados y las condiciones pueden elegirse de modo que se obtenga el máximo rendimiento del producto final.
La reacción de la etapa (a) se llevará a cabo convenientemente en presencia de un catalizador, por ejemplo, un ácido inorgánico u orgánico o un agente aglutinante de ácido tal como una base.
Los compuestos usados como materiales de partida son conocidos por la bibliografía y, en muchos casos, están disponibles comercialmente, o se pueden obtener usando métodos conocidos per se. 5-ALA, por ejemplo, está disponible en Sigma-Aldrich o Biosynth AG, Suiza.
Los compuestos de la invención preferiblemente toman la forma de sales farmacéuticamente aceptables y/o compatibles con la piel. Tales sales son preferiblemente las sales de adición de ácido con ácidos orgánicos o inorgánicos fisiológicamente aceptables que se han mencionado anteriormente en este documento.
Los compuestos de la invención son precursores de fotosensibilizantes, es decir, se pueden incorporar a las células y convertirse en protoporfirinas, que son fotosensibilizantes. Por tanto, los compuestos de la invención tienen valiosas propiedades farmacológicas, concretamente como precursores de fotosensibilizantes, lo que los hace útiles en métodos de tratamiento fotodinámico y diagnóstico fotodinámico, y en métodos cosméticos fotodinámicos.
De acuerdo con lo anterior, un aspecto adicional de la invención proporciona una composición que comprende un compuesto de fórmula I como se describe en este documento, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con al menos un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable o cosméticamente aceptable.
En una realización preferida, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I como se describe en este documento, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con al menos un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otra realización preferida, la invención proporciona una composición cosmética que comprende un compuesto de fórmula I como se describe en este documento, o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, junto con al menos un portador o excipiente cosméticamente aceptable.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un compuesto o composición farmacéutica como se describe en este documento para su uso como medicamento, por ejemplo, en un método de tratamiento fotodinámico y diagnóstico fotodinámico y especialmente para el tratamiento o diagnóstico de trastornos o anomalías de superficies externas o internas del cuerpo que responden al tratamiento o diagnóstico fotodinámico.
El uso de los compuestos y composiciones farmacéuticas descritos en este documento en el tratamiento o diagnóstico fotodinámico del cáncer, una infección asociada con el cáncer tal como una infección viral (por ejemplo, virus del papiloma humano, hepatitis B o virus de Epstein Barr) o infecciones bacterianas (por ejemplo, infección por Helicobacter pylori), o en el tratamiento o diagnóstico de una condición no cancerosa constituyen los aspectos preferidos de la invención.
Como se usa en este documento, los términos "cáncer" y "canceroso" se usan en relación con condiciones en las que están presentes células malignas. De este modo, las condiciones premalignas no están incluidas en estos términos.
El término "no canceroso" incluye condiciones benignas y premalignas.
Como se usa en este documento, el término "tratamiento" o "terapia" abarca tratamientos o terapias tanto curativas como profilácticas.
Las anomalías y trastornos que pueden tratarse o diagnosticarse según la presente invención incluyen cualquier anomalía o trastorno maligno, premaligno y benigno que responda al tratamiento o diagnóstico fotodinámico.
En general, las células que son metabólicamente activas responden al tratamiento o diagnóstico fotodinámico con los compuestos de la invención. Ejemplos de células metabólicamente activas son células que experimentan un patrón de crecimiento anormal. Tales patrones de crecimiento anormales incluyen un mayor número de células/aumento de la proliferación celular (hiperplasia), maduración y diferenciación anormales de las células (displasia) y proliferación anormal de células (neoplasia). Las células de un crecimiento hiperplásico quedan sujetas a los mecanismos de control reguladores normales. Las células de un crecimiento neoplásico son células genéticamente anormales que proliferan de una manera no fisiológica que no responde a los estímulos normales. Otros ejemplos de células metabólicamente activas son las células inflamadas.
Los compuestos y las composiciones farmacéuticas según la invención son particularmente apropiados para su uso en el tratamiento y diagnóstico fotodinámico de neoplasias y tumores (benignos, premalignos y malignos) en las superficies corporales internas y externas del cuerpo (por ejemplo, la piel). Ejemplos de tales neoplasias y tumores en las superficies corporales externas son la queratosis actínica y la enfermedad de Bowen.
Además, los compuestos y composiciones farmacéuticas según la invención son particularmente apropiados para su uso en el tratamiento y diagnóstico fotodinámico de enfermedades y trastornos asociados con infecciones virales, bacterianas y fúngicas tales como acné (asociado con la bacteria Propionibacterium acnes), neoplasia intraepitelial vaginal o cervical (asociada al virus del papiloma humano), cáncer de estómago (asociado a la bacteria Helicobacter pylori) y colitis pseudomembranosa (asociada a la bacteria Clostridium difficile).
Además, los compuestos y las composiciones farmacéuticas según la invención son particularmente apropiados para su uso en el tratamiento fotodinámico de infecciones de la piel o heridas con bacterias Gram-positivas. Tales infecciones a menudo son causadas por Staphylococcus aureus (S. aureus), y comúnmente se tratan con antibióticos, por ejemplo, penicilina. Existe una necesidad médica insatisfecha de encontrar tratamientos alternativos, ya que muchas cepas de S. aureus han desarrollado resistencia a los antibióticos. Otras bacterias Gram-positivas que están implicadas en infecciones bacterianas de heridas son, por ejemplo, Staphylococcus epidermis, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, y Micrococcus luteus.
Además, los compuestos y las composiciones farmacéuticas según la invención son particularmente apropiados para su uso en el tratamiento y diagnóstico fotodinámico de células inflamadas. La inflamación de las células suele ser un intento de protección por parte del organismo para eliminar los estímulos nocivos e iniciar el procedimiento de curación y, de este modo, a menudo se asocia con una infección. Ejemplos son el acné inflamatorio, la colitis (por ejemplo, la enfermedad inflamatoria intestinal, la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn) y la dermatitis infecciosa, es decir, la inflamación de la piel causada por una infección bacteriana, viral o fúngica.
Las superficies internas y externas del cuerpo que pueden tratarse según la invención incluyen la piel y todas las demás superficies epiteliales y serosas, incluidas, por ejemplo, las mucosas, los revestimientos de los órganos, por ejemplo, los tractos respiratorio, gastrointestinal y genitourinario, y glándulas con conductos que desembocan en tales superficies (por ejemplo, hígado, folículos pilosos con glándulas sebáceas, glándulas mamarias, glándulas salivales y vesículas seminales). Además de la piel, tales superficies incluyen, por ejemplo, el revestimiento de la vagina, el endometrio y el urotelio. Tales superficies también pueden incluir cavidades formadas en el cuerpo después de la escisión de tejido enfermo o canceroso, por ejemplo, cavidades cerebrales después de la escisión de tumores tales como los gliomas.
Las superficies de ejemplo incluyen de este modo: (i) piel y conjuntiva; (ii) el revestimiento de la boca, faringe, esófago, estómago, intestinos y apéndices intestinales, recto y canal anal; (iii) el revestimiento de las fosas nasales, senos nasales, nasofaringe, tráquea, bronquios y bronquiolos; (iv) el revestimiento de los uréteres, la vejiga urinaria y la uretra; (v) el revestimiento de la vulva, la vagina, el cuello uterino y el útero; (vi) la pleura parietal y visceral; (vii) el revestimiento de las cavidades peritoneal y pélvica, y la superficie de los órganos contenidos dentro de esas cavidades; y (viii) la duramadre y las meninges.
Para obtener las composiciones farmacéuticas según la invención, los compuestos según la fórmula I se pueden formular de cualquier manera convencional con uno o más portadores y excipientes fisiológicamente aceptables, según técnicas bien conocidas en la técnica. Cuando sea apropiado, los compuestos o composiciones según la invención se esterilizan, por ejemplo, por y-irradiación, autoclave o esterilización por calor, antes o después de la adición de un portador o excipiente cuando esté presente, para proporcionar formulaciones estériles.
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar sistémicamente (por ejemplo, por vía oral o parenteral) o localmente (por ejemplo, mediante inyección o por vía tópica) en o cerca del sitio afectado. Se prefieren las composiciones farmacéuticas tópicas e incluyen geles, cremas, ungüentos, aerosoles, lociones, pomadas, barras, polvos, pesarios, supositorios, aerosoles, gotas, soluciones y cualquiera de las otras formas farmacéuticas convencionales en la técnica. La administración tópica en sitios inaccesibles puede lograrse mediante técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de catéteres u otros sistemas apropiados de suministro de fármacos.
Los ungüentos, geles y cremas pueden, por ejemplo, formularse con una base acuosa u oleosa con la adición de agentes espesantes y/o gelificantes apropiados. Cualquier agente espesante o gelificante que se use debe ser no tóxico, no irritante y desprovisto de impurezas lixiviables. Deben ser inertes frente a los ingredientes activos, es decir, no deben promover su degradación. Formulaciones para el tratamiento de heridas, por ejemplo, el tratamiento de heridas infectadas por bacterias, se puede basar en formulaciones de gel, por ejemplo, hidrogeles. Los compuestos de la invención se pueden incorporar en tales formulaciones de hidrogel. Alternativamente, los compuestos se pueden incorporar en liposomas que se incorporan en los hidrogeles (véase, por ejemplo, J. Hurler et al., J. Pharm. Sci. 101, No. 10, 2012, 3906-3915). Las lociones se pueden formular con una base acuosa o aceitosa y, en general, también contendrán uno o más agentes emulsionantes, dispersantes, de suspensión, espesantes o colorantes. Los polvos se pueden formar con la ayuda de cualquier base de polvo apropiada. Las gotas, los aerosoles y las soluciones se pueden formular con una base acuosa o no acuosa que también comprende uno o más agentes dispersantes, solubilizantes o de suspensión. Los aerosoles se administran convenientemente desde paquetes presurizados, con el uso de un propulsor apropiado.
Alternativamente, las composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar en una forma adaptada para la administración oral o parenteral, por ejemplo mediante inyección intradérmica, subcutánea, intraperitoneal o intravenosa. De este modo, las formas farmacéuticas alternativas incluyen comprimidos simples o recubiertos, cápsulas, suspensiones y soluciones que contienen como portadores y excipientes almidón de maíz, lactosa, sacarosa, celulosa microcristalina, estearato de magnesio, polivinilpirrolidona, ácido cítrico, ácido tartárico, agua, agua/etanol, agua/glicerol, agua/sorbitol, agua/polietilenglicol, propilenglicol, alcohol estearílico, carboximetilcelulosa o sustancias grasas tales como grasas duras o mezclas apropiadas de los mismos. Si la composición farmacéutica según la invención comprende opcionalmente uno o más disolventes farmacéuticamente aceptables, tales disolventes pueden ser un ácido graso libre, un alcohol graso libre, una solución acuosa, por ejemplo, una solución reguladora o agua.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir además excipientes farmacéuticos comunes tales como agentes lubricantes, agentes espesantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes conservantes, cargas, aglutinantes, conservantes, potenciadores de la adsorción, por ejemplo, agentes de penetración superficial como se menciona a continuación, y similares. También se pueden usar agentes solubilizantes y/o estabilizantes, por ejemplo, ciclodextrinas (CD) a , p, y y HP-p ciclodextrina. El experto podrá seleccionar excipientes apropiados en función de su finalidad. Los excipientes comunes que se pueden usar en los productos farmacéuticos descritos en este documento se enumeran en diversos manuales (por ejemplo, D.E. Bugay and W.P. Findlay (Eds) Pharmaceutical excipients (Marcel Dekker, New York, 1999), E-M Hoepfner, A. Reng and P.C. Schmidt (Eds) Fiedler Encyclopedia of Excipients for Pharmaceuticals, Cosmetics and Related Areas (Edition Cantor, Munich, 2002) y H.P. Fielder (Ed) Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete (Edition Cantor Aulendorf, 1989)).
Todos los excipientes farmacéuticamente aceptables mencionados anteriormente son bien conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente de diversos fabricantes.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular para proporcionar una liberación rápida, sostenida o retardada del ingrediente activo después de la administración al paciente empleando procedimientos bien conocidos en la técnica.
La concentración de los compuestos descritos en este documento en las composiciones farmacéuticas depende de la naturaleza del compuesto, la composición, el modo de administración, la afección que se va a tratar o diagnosticar, y el sujeto al que se administra y se puede variar o ajustar según elección. Generalmente, sin embargo, los intervalos de concentración de 0.01 a 50 % en peso, tal como 0.05 a 20 % en peso, o 1 a 10 % en peso, por ejemplo, 1 al 5 % en peso, son apropiados. Se apreciará que la PDT puede requerir concentraciones más altas de los compuestos de la invención que las usadas en los métodos de diagnóstico.
En otra realización, las composiciones farmacéuticas pueden comprender además uno o más agentes bioadhesivos, por ejemplo, agentes mucoadhesivos como se describe en el documento WO 02/09690 de Photocure ASA.
Los compuestos de la invención se pueden formular y/o administrar con otros componentes activos que sirven para potenciar el efecto fotodinámico, por ejemplo, agentes que ayudan a la penetración superficial (o potenciadores de la penetración) y/o agentes quelantes. En el documento WO 2009/074811 de Photocure ASA se describen agentes auxiliares de penetración en la superficie y agentes quelantes apropiados y concentraciones apropiadas de tales agentes. Dependiendo de la naturaleza de la composición, los compuestos se pueden coadministrar con tales otros agentes opcionales, por ejemplo, en una sola composición o, como alternativa, se pueden administrar por separado (por ejemplo, secuencialmente). En algunos casos, puede ser beneficioso tratar previamente la superficie externa o interna del cuerpo que se va a tratar con un agente que ayude a la penetración de la superficie en una etapa separada antes de la administración del componente activo. Cuando se usa un agente que ayuda a la penetración en la superficie en una etapa de tratamiento previo, se puede usar en concentraciones más altas, por ejemplo, hasta el 100 % en peso. Si se usa una etapa de dicho tratamiento previo, la composición farmacéutica según la invención se puede administrar posteriormente hasta varias horas después del tratamiento previo, por ejemplo, a un intervalo de 5 a 60 minutos después del tratamiento previo.
Productos y kits que comprenden una composición farmacéutica como se describe en este documento y, opcionalmente, un agente que ayuda a la penetración superficie y/o un agente quelante, como una preparación combinada para su uso simultáneo, separado o secuencial en un método de tratamiento o diagnóstico fotodinámico de una anormalidad de una superficie externa o interna del cuerpo constituyen un aspecto adicional de la divulgación.
Visto de forma alternativa, este aspecto de la divulgación proporciona un kit para su uso en un método de tratamiento o diagnóstico fotodinámico de una enfermedad, trastorno o anormalidad de una superficie externa o interna del cuerpo, comprendiendo dicho kit:
(a) un primer recipiente que contiene un compuesto como se describe en este documento, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición farmacéutica como se describe en este documento;
(b) un segundo recipiente que contiene al menos un agente de ayuda a la penetración superficial; y opcionalmente (c) uno o más agentes quelantes contenidos ya sea dentro de dicho primer recipiente o en un tercer recipiente opcional.
Un aspecto adicional de la invención proporciona una composición farmacéutica como se describe en este documento para su uso en un método de tratamiento o diagnóstico fotodinámico de una enfermedad, trastorno o anormalidad de una superficie externa o interna del cuerpo, comprendiendo dicho método administrar al afectado superficie dicha composición farmacéutica y exponer dicha superficie a la luz.
Después de la administración de la composición farmacéutica a la superficie externa o interna del cuerpo, el área deseada para el tratamiento o para el examen (en el caso del diagnóstico) se expone a la luz (irradiación) para lograr la fotoactivación deseada. La duración del período de tiempo entre la administración y la exposición a la luz, es decir, el tiempo de incubación, dependerá de la naturaleza del compuesto, la naturaleza de la composición, la condición del tratado o diagnosticado y el modo de administración. Generalmente, es necesario que el compuesto de la invención dentro de la composición farmacéutica se libere lo suficiente para ser absorbido por las células del tejido que se va tratar o diagnosticar, convertirse en un fotosensibilizante y lograr una concentración en el tejido eficaz en el sitio de tratamiento/diagnóstico previsto antes de la fotoactivación. Por lo general, el tiempo de incubación será de hasta 10 horas, por ejemplo, de aproximadamente 10 minutos a 10 horas, por ejemplo, 30 minutos a 7 horas, o 1 hora a 5 horas. La administración local directa puede dar como resultado tiempos de incubación más cortos, por ejemplo, ningún tiempo de incubación (es decir, exposición intermedia a la luz después de la administración), aproximadamente de 1 minuto a 3 horas, por ejemplo, 5 minutos a aproximadamente 2 horas, o 15 minutos a 1.5 horas o 30 minutos a 1 hora. Cuando se requiere la absorción sistémica después de la administración oral, el tiempo de incubación puede ser mayor, por ejemplo, entre aproximadamente 30 minutos y 6 horas, por ejemplo, 2 a 5 horas o 3 a 4 horas. Los tiempos de incubación óptimos para maximizar la concentración del fotosensibilizante en el sitio diana pueden determinarse fácilmente, por ejemplo, por mediciones de fluorescencia a lo largo del tiempo.
La irradiación generalmente se aplicará durante un tiempo corto con una intensidad de luz alta, es decir, una tasa de fluencia alta, o para un tiempo más largo con una intensidad de luz baja, es decir, una tasa de fluencia baja. Este último puede ser el preferido para un procedimiento de PDT, especialmente cuando el paciente no está anestesiado. Los procedimientos de PDT de baja intensidad de luz dan como resultado una incomodidad reducida para el paciente sin ninguna reducción en la eficacia del tratamiento. Sin embargo, si el procedimiento de PDT o PDD requiere anestesia y/o inmovilización del paciente y/o debe realizarse en un quirófano, puede ser preferible la aplicación de irradiación durante un tiempo breve con una intensidad de luz alta, es decir, una tasa de fluencia alta. La tasa de fluencia depende de los medios de irradiación, es decir, de la lámpara o láser en particular que se use. La tasa de fluencia puede ser un parámetro inmanente que no puede ser elegido por el usuario de la lámpara/láser. Sin embargo, si se puede elegir la tasa de fluencia, para las lámparas que comprenden diodos emisores de luz, generalmente se pueden elegir tasas de fluencia de 0.5 a 100 mW/cm2. Para un procedimiento de tasa de fluencia baja, se prefieren tasas de fluencia por debajo de 50 mW/cm2. Más preferidas son las tasas de fluencia en el intervalo de 1-30 mW/cm2, más preferiblemente en el intervalo de 2 a 10 mW/cm2. Para un procedimiento de tasa de fluencia alta, se prefieren tasas de fluencia por encima de 50 mW/cm2, más preferiblemente en el intervalo de 50 a 70 mW/cm2.
La longitud de onda de la luz usada para la irradiación se puede seleccionar para lograr el efecto fotodinámico deseado. Irradiación con longitudes de onda de luz en el intervalo de 300-800 nm, por ejemplo, 400-700 nm y 500 700 nm, se ha encontrado que es particularmente eficaz. Para PDT, puede ser particularmente importante incluir las longitudes de onda de 630 y 690 nm. Se prefiere particularmente la luz roja (600 a 670 nm) ya que se sabe que la luz a esta longitud de onda penetra bien en el tejido. Para PDD, el área de interés se puede examinar primero con luz blanca. Para el diagnóstico fotodinámico real, generalmente se utilizará luz azul con una longitud de onda que por lo general oscila entre 360 y 450 nm, lo que da lugar a una fluorescencia en la región roja (por ejemplo, de 550 a 750 nm) que puede detectarse visualmente o medirse con espectrómetros apropiados.
En general, la irradiación para PDT se aplicará a una dosis de luz de 10 a 200 J/cm2, preferiblemente desde 20 a 100 J/cm2 y lo más preferiblemente de 25 a 60 J/cm2. Para PDD, la irradiación se realiza preferiblemente durante todo el procedimiento de diagnóstico o durante una parte del mismo, por ejemplo, cuando se combina con la detección de luz blanca. Tanto para PDT como para PDD, se puede usar una sola irradiación o, alternativamente, una dosis dividida de luz en la que la dosis de luz se administra en un número de fracciones, por ejemplo, se pueden emplear unos minutos a unas pocas horas entre irradiaciones. También se pueden aplicar irradiaciones múltiples. La duración de la irradiación para PDT (es decir, el tiempo de irradiación) depende de la tasa de fluencia del dispositivo de irradiación y la dosis de luz deseada. Esencialmente, la dosis de luz es el producto del tiempo de irradiación y la tasa de fluencia.
Se conocen en la técnica diversos medios de irradiación, por ejemplo, láser y lámparas. Estos últimos pueden ser lámparas que comprendan una bombilla, por ejemplo, una bombilla de xenón de arco corto o un tubo fluorescente.
Alternativamente, la lámpara puede comprender diodos emisores de luz o diodos emisores de luz orgánicos (LED y OLED). Para la irradiación de superficies internas del cuerpo, por ejemplo, el revestimiento de la vejiga o el colon, se pueden usar endoscopios. Normalmente, los endoscopios comprenden una fuente de luz externa (por ejemplo, un láser o una lámpara) que se acopla a una fibra óptica que funciona como guía de ondas para transmitir la luz desde la fuente de luz externa al área de interés.
En un aspecto adicional, la divulgación de este modo proporciona un método de formación de imágenes in vivo de un sitio diana en una superficie interna o externa del cuerpo, comprendiendo dicho método las siguientes etapas: (a) administrar a un sujeto, por ejemplo, un ser humano o animal no humano, un compuesto como se describe en este documento, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto o dicha sal;
(b) si es necesario, esperar el período de tiempo necesario para que el compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo sea captado por las células de dicho sitio diana, convertido en un fotosensibilizante y alcance una concentración eficaz en el sitio diana;
(c) exponer el sitio diana a la luz para fotoactivar el fotosensibilizante;
(d) detectar una fluorescencia indicativa de una anormalidad del sitio diana; y
(e) opcionalmente, convertir la fluorescencia detectada en una imagen de un área de interés.
En una realización preferida de este aspecto de la divulgación, el método de formación de imágenes se puede realizar en un sujeto al que se le ha administrado previamente dicho compuesto, una de sus sales farmacéuticamente aceptable, o una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto o dicha sal.
Los procedimientos de PDD descritos en este documento también se pueden realizar durante la cirugía en la que se administra al paciente un compuesto de la invención o una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto y luego se realiza la cirugía bajo luz azul. El hecho de que las anomalías emitan fluorescencia bajo la luz azul ayuda al cirujano a definir el "borde quirúrgico" y, así, permite una resección más selectiva del área enferma (por ejemplo, un tumor). El uso de los compuestos y las composiciones farmacéuticas descritos en este documento en métodos quirúrgicos constituye un aspecto adicional de la divulgación.
Los métodos terapéuticos y de diagnóstico descritos en este documento también se pueden usar en forma de terapia combinada. Por ejemplo, un curso de PDT realizado en relación con una anormalidad, trastorno o enfermedad de una superficie interna o externa del cuerpo usando un compuesto o composición como se describe en este documento puede ser seguido por un método PDD (por ejemplo, para determinar el grado en que la PDT ha sido eficaz y/o para detectar cualquier recurrencia de la condición).
En un aspecto adicional, la divulgación de este modo proporciona un compuesto o composición como se describe en este documento para su uso en un método que comprende las etapas de: (i) realizar un tratamiento fotodinámico de una anomalía, trastorno o enfermedad de una superficie interna o externa del cuerpo de un paciente; y (ii) realizar un diagnóstico fotodinámico en dicho paciente. Al menos una de las etapas (i) y (ii) se realiza después de la administración a dicho paciente de un compuesto o composición farmacéuticA según la invención. Preferiblemente, las etapas (i) y (ii) se realizarán ambas después de la administración de dicho compuesto o composición.
Después de la identificación de una anomalía, trastorno o enfermedad de una superficie interna o externa del cuerpo usando cualquiera de los métodos descritos en este documento, esto puede tratarse mediante técnicas terapéuticas alternativas, por ejemplo, por tratamiento quirúrgico o químico. Ejemplos de tratamientos actuales incluyen tratamiento quirúrgico, terapia de ablación endoscópica, ablación química, ablación térmica o ablación mecánica. En una realización de la invención, puede llevarse a cabo una aplicación adicional del compuesto o composición farmacéutica en el sitio de interés para efectuar la PDT.
Los compuestos de la invención también se pueden usar para técnicas de diagnóstico in vitro, por ejemplo, para el examen de las células contenidas en los fluidos corporales. La mayor fluorescencia asociada con células metabólicamente activas puede ser convenientemente indicativa de una anomalía o trastorno. Este método es muy sensible y se puede usar para la detección temprana de anomalías o trastornos, por ejemplo, carcinoma de vejiga o pulmón mediante el examen de las células epiteliales en muestras de orina o esputo, respectivamente. Otros fluidos corporales útiles que se pueden usar para el diagnóstico además de la orina y el esputo incluyen sangre, semen, lágrimas, líquido cefalorraquídeo, etc. También pueden evaluarse muestras o preparaciones de tejido, por ejemplo tejido de biopsia o muestras de médula ósea. De este modo, la presente divulgación se extiende al uso de los compuestos de la invención, o las sales farmacéuticamente aceptables, para el diagnóstico fotodinámico, y los productos y kits para realizar dicho diagnóstico.
Un aspecto adicional de la divulgación se refiere a un método de diagnóstico in vitro de anomalías, trastornos o enfermedades de una superficie interna o externa del cuerpo de un paciente analizando una muestra de fluido corporal o tejido de dicho paciente, dicho método comprendiendo al menos las siguientes etapas:
i) mezclar dicha muestra de tejido o fluido corporal con un compuesto como se ha descrito anteriormente, una de sus sales farmacéuticamente aceptable o una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto o dicha sal, ii) exponer dicha mezcla a la luz,
iii) determinar el nivel de fluorescencia, y
iv) opcionalmente, comparar el nivel de fluorescencia con los niveles de control.
Los compuestos según la invención también se pueden usar en el tratamiento fotodinámico de anomalías, trastornos o enfermedades de una superficie interna o externa del cuerpo causadas o asociadas de otro modo con bacterias, incluidas bacterias patógenas o bacterias condicionalmente patógenas, es decir, bacterias que son parte de la flora humana normal pero que pueden ser patógenos bajo determinadas condiciones.
La resistencia a múltiples fármacos es un problema creciente en el campo de las enfermedades infecciosas. Entre las muchas especies de bacterias patógenas que se han vuelto resistentes a los antibióticos convencionales se encuentra Staphylococcus aureus (S. aureus) que es responsable de causar infecciones en la piel, así como infectar heridas y quemaduras. Las cepas tóxicas de S. aureus pueden ingresar al torrente sanguíneo como resultado de tales infecciones y esto, a su vez, puede provocar complicaciones graves e incluso afecciones potencialmente mortales, tales como toxemia (síndrome de shock tóxico), endocarditis y neumonía. Las cepas resistentes de S. aureus incluyen S. aureus resistente a la meticilina (MRSA).
Se ha encontrado que los compuestos descritos en este documento, cuando se usan en PDT, son eficaces para matar, o al menos reducir el potencial proliferativo de células bacterianas, en particular bacterias Gram-positivas, especialmente Staphylococcus aureus.
Visto desde un aspecto adicional, la invención proporciona de este modo un compuesto o una composición farmacéutica como se describe en este documento para su uso en un método de tratamiento y/o prevención de una infección bacteriana, por ejemplo, para su uso en un método de tratamiento o prevención de una afección causada por o asociada con bacterias resistentes a fármacos.
En los lactantes, la infección por S. aureus puede provocar una enfermedad grave: el síndrome de la piel escaldada por estafilococos (SSSS). La enfermedad se presenta con la formación generalizada de ampollas llenas de líquido que tienen paredes delgadas y se rompen fácilmente. Además, S. aureus es extremadamente frecuente en pacientes con dermatitis atópica que son menos resistentes que otras personas. A menudo causa complicaciones y esta enfermedad se encuentra principalmente en lugares fértiles y activos, como las axilas, el cabello y el cuero cabelludo.
Como se describió anteriormente, los compuestos según la invención también encuentran un uso particular en métodos cosméticos fotodinámicos. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto adicional, la invención proporciona una composición cosmética que comprende un compuesto de fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con al menos un portador o excipiente compatible con la piel.
El término "cosmético", como se usa en este documento en relación con cualquier composición, producto, kit, método o uso, pretende definir un producto o método de tratamiento que se usa o se pretende que se use con fines cosméticos, es decir, para potenciar, mejorar o mantener el aspecto cutáneo general del individuo al que se administra.
El término "compatible con la piel" indica una sustancia que es apropiada para su uso en una composición dérmica cosmética, por ejemplo, en una composición para su uso en la piel de mamíferos, especialmente humanos. Un portador o excipiente "compatible con la piel" normalmente no es irritante y se tolera bien.
Para obtener las composiciones cosméticas según la invención, los compuestos de fórmula I se pueden formular de cualquier manera convencional con uno o más portadores y excipientes compatibles con la piel, según técnicas bien conocidas en la técnica. Cuando sea apropiado, los compuestos de las composiciones pueden esterilizarse usando métodos como se describen anteriormente en este documento en relación con las composiciones farmacéuticas. Las composiciones cosméticas se administran por vía tópica sobre la piel. Las composiciones cosméticas apropiadas incluyen geles, cremas, ungüentos, aerosoles, lociones, pomadas, barras, polvos, soluciones y cualquiera de las otras formulaciones cosméticas convencionales de la técnica.
Los ungüentos, geles, lociones, pomadas y cremas cosméticas pueden, por ejemplo, formularse con una base acuosa u oleosa (preferida para ungüentos y pomadas) con la adición de agentes espesantes y/o gelificantes apropiados. Cualquier agente espesante o gelificante que se use debe ser no tóxico, no irritante y desprovisto de impurezas lixiviables. Deben ser inertes frente a los compuestos de la invención, es decir, no deben promover su degradación. Las lociones y cremas se pueden formular con una base acuosa u oleosa y, en general, también contendrán uno o más agentes emulsionantes, dispersantes, de suspensión, espesantes o colorantes. Los polvos se pueden formar con la ayuda de cualquier base de polvo apropiada. Los aerosoles y las soluciones se pueden formular con una base acuosa o no acuosa que también comprende uno o más agentes dispersantes, solubilizantes o de suspensión.
Las composiciones cosméticas pueden incluir adicionalmente excipientes cosméticos comunes tales como agentes lubricantes, agentes espesantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes conservantes, perfumes, cargas, aglutinantes y conservantes. Pueden comprender además agentes de penetración superficial como se menciona a continuación, y similares. El experto podrá seleccionar excipientes apropiados en base a su finalidad. Los excipientes comunes que se pueden usar en los productos cosméticos descritos en este documento se enumeran en diversos manuales (por ejemplo, E-M Hoepfner, A. Reng and P.C. Schmidt (Eds) Fiedler Encyclopedia of Excipients for Pharmaceuticals, Cosmetics and Related Areas (Edition Cantor, Munich, 2002) y H.P. Fielder (Ed) Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete (Edition Cantor Aulendorf, 1989)). Además, en el documento WO 2011/107478 de Photocure ASA se divulgan excipientes y portadores apropiados compatibles con la piel y cantidades apropiadas de los mismos para su uso en las composiciones cosméticas según la invención.
Todos los excipientes cosméticos mencionados anteriormente son bien conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente de diversos fabricantes.
La cantidad deseada de los compuestos de la invención en las composiciones cosméticas dependerá de varios factores, incluyendo la naturaleza específica de la formulación, si se usa o no una fuente de luz en el tratamiento cosmético y, de ser así, el tipo de fuente de luz y la longitud de onda seleccionada, la duración del tratamiento cosmético y el número total de tratamientos. Teniendo en cuenta estos diversos factores, los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente la cantidad. La composición cosmética según la invención generalmente comprenderá 5 % en peso o menos de los compuestos de la invención, preferiblemente 0.02 a 3 % en peso, más preferiblemente 0.05 a 1.5 % en peso, por ejemplo, 0.5 a 1.25 % en peso y lo más preferiblemente 0.1 a 1.0 % en peso, siendo el intervalo desde 0.25 a 0.75 % en peso el más preferido. Al determinar la cantidad deseada dentro de estos intervalos, también se pueden considerar los siguientes criterios dentro del conocimiento y la experiencia de los expertos en la materia:
• composiciones cosméticas que son capaces de penetrar más profundamente en la piel, por ejemplo, debido a la naturaleza de la composición, la naturaleza del compuesto seleccionado de la invención o debido a la presencia de agentes que promuevan una penetración más profunda, por ejemplo, los agentes potenciadores de la penetración en la piel contendrán por lo general una concentración más baja de los compuestos de la invención que las composiciones que tienden a permanecer principalmente en la superficie de la piel;
• composiciones cosméticas destinadas a duraciones más largas del tratamiento de la piel (es decir, una incubación más prolongada de la composición sobre la piel y/o una iluminación más prolongada) normalmente contienen menos de los compuestos de la invención que las composiciones destinadas a duraciones más cortas del tratamiento; • composiciones cosméticas destinadas a más de un ciclo de tratamiento de la piel, por ejemplo, varios o muchos tratamientos, tales como varios tratamientos durante un período o tratamientos repetidos, normalmente contienen menos de los compuestos de la invención que las composiciones destinadas para su uso una vez o destinadas para su uso un número limitado de veces, a menudo con un retraso entre cada tratamiento;
• composiciones cosméticas destinadas al tratamiento de la piel con solo pocos signos de (foto)envejecimiento pueden contener menos de los compuestos de la invención que las composiciones destinadas al tratamiento de la piel gravemente (foto)envejecida.
Las composiciones cosméticas según la invención se pueden usar en un método de tratamiento cosmético. Dicho tratamiento cosmético puede llevarse a cabo para potenciar y/o mejorar el aspecto de la piel de un sujeto mamífero, preferiblemente un sujeto humano. En particular, se pueden mejorar los signos de (foto)envejecimiento, por ejemplo, reduciendo el aspecto de patas de gallo, ojeras, líneas finas, arrugas, disminuyendo el tamaño de los poros y mejorando la firmeza y elasticidad de la piel.
Las fuentes de luz apropiadas para tales tratamientos cosméticos, así como las tasas de fluencia, los tiempos de irradiación, las dosis de luz y las longitudes de onda apropiadas se divulgan en detalle en el documento WO 2011/107478 de Photocure ASA.
La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitantes y con referencia a las figuras adjuntas en las que:
La figura 1 muestra la fluorescencia de la piel de minicerdos después de la aplicación de una formulación en crema de bromhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de carboximetilo.
La figura 2 muestra el retraso en el crecimiento de bacterias S. aureus incubadas con bromhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de carboximetilo y bromhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 2-carboxietilo debido a efectos fotodinámicos.
En los ejemplos se usan las siguientes abreviaturas:
Boc -tert-butoxicarbonilo
Cbz - carboxibencilo
dec - se descompone
Ejemplo 1 - Preparación de hidrohaluros de 5-amino-4-oxopentanoato de carboximetilo (clorhidrato y bromhidrato) 1a- Preparación del 5-(Boc-amino)-4-oxopentanoato de t-butoxicarbonilmetilo
Se agregó gota a gota trietilamina (2.22 g; 22.0 mmol) a una solución agitada de ácido 5-(Boc-amino)-4-oxopentanoico (4.62 g; 20.0 mmol) y bromoacetato de t-butilo (4.30 g; 22.0 mmol) en acetato de etilo (60 mL) bajo argón a temperatura ambiente. La mezcla (lechada) se sometió a reflujo durante 17 h, luego se enfrió a temperatura ambiente, se vertió en HCl 0.5 M (100 mL) y se agitó a fondo. La porción acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 20 mL). Las soluciones orgánicas combinadas se lavaron con solución saturada de NaHCO3 (1 x 20 mL) y solución saturada de NaCl (1 x 20 mL), luego se secaron (MgSO4), se filtraron y evaporaron. La evaporación dio como resultado un aceite ámbar que se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice 60 de 40 x 55 mm eluida con acetato de etilo - hexano (1:1) (600 mL), recolectando 5 fracciones de 100 mL. La evaporación de las fracciones 1 y 2 dio como resultado 6.15 g (89 %) del producto (aceite de color amarillo).
1H RMN: (200 MHz; CDCla): 81.44 (9H, s), 1.47 (9H, s), 2.77 (4H, s), 4.06 (2H, d, J = 4.8 Hz), 4.49 (2H, s), 5.25 (1H, br s).
13C RMN: (50 MHz; CDCl3): 827.5, 28.0, 28.3, 34.2, 50.3, 61.3, 79.8, 82.5, 155.5, 166.5, 171.7, 203.9.
1b - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de carboximetilo
Se agregó una solución 4 M de cloruro de hidrógeno en dioxano (35 mL; 0.14 mol) al producto a partir de 1a (3.3 g; 9.5 mmol) y se agitó hasta que el aceite se disolvió con desprendimiento de gas. Después de reposar durante una hora, se evaporó el disolvente y se trituró el residuo con éter dietílico (4 x 20 mL); el aceite se solidificó en un polvo de color tostado. El residuo se filtró y se secó durante la noche en una pistola secadora a 50 °C y 17.33 hPa (13 mm Hg). Se obtuvieron 2.05 g (96 %) del producto (polvo de color tostado).
1H RMN: (300 MHz; DMSO-d6): 82.65 (2H, t, J = 6.2 Hz), 2.82 (2H, t, J = 5.9 Hz), 3.96 (2H, br s), 4.57 (2H, s), 8.40 (3H, br s).
13C RMN: (75 MHz; DMSO-de): 826.7, 34.1, 46.5, 60.7, 168.8, 171.5, 202.3.
1c - Preparación del bromhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de carboximetilo
Se agregó una solución al 30 % de bromuro de hidrógeno en ácido acético (12 mL) al producto a partir de 1a (3.3 g; 9.5 mmol) enfriado con un baño de hielo-agua y se agitó hasta que el aceite se disolvió con desprendimiento de gas. Después de agitar durante 15 min, la mezcla se trituró con hexano (4 x 20 mL) y éter dietílico (4 x 20 mL); el aceite se solidificó en un polvo de color tostado. El residuo se filtró y se secó durante la noche en una pistola secadora a ~50 °C y 16 hPa (12 mm Hg). Se obtuvieron 4.44 g (92 %) del producto (polvo de color tostado, pf 110-114 °C (dec)).
1H RMN: (300 MHz; DMSO-de): 82.66 (2H, t, J = 6.6 Hz), 2.85 (2H, t, J = 6.6 Hz), 4.02 (2H, d, J = 4.8 Hz), 4.57 (2H, s), 8.14 (3H, br s).
13C RMN: (75 MHz; DMSO-de): 826.7, 34.1, 46.6, 60.6, 168.8, 171.5, 202.3.
Ejemplo 2 - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 1 -(isopropilcarboxi)etilo
2a - Preparación del 2-bromopropanoato de bencilo
Se calentó a reflujo una mezcla de ácido 2-bromopropanoico (15.3 g; 100 mmol), alcohol bencílico (13.0 g; 120 mmol) y monohidrato de ácido p-toluenosulfónico (50 mg) en ciclohexano (200 mL) en un aparato Dean-Stark, durante 19 h. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se lavó con solución saturada de NaHCO3 (1 x 30 mL), agua (1 x 30 mL) y solución saturada de NaCl (1 x 30 mL). Después de secar (MgSO4), filtrar y evaporar, el residuo se destiló al vacío. Se obtuvieron 25.4 g (87 %) del producto (líquido incoloro, bp 111-113 °C/ 1.47 hPa (1,1 mm Hg).
1H RMN: (200 MHz; CDCla): 8 1.83 (3H, d, J = 7.0 Hz), 4.40 (1H, q, J = 7.0 Hz), 5.20 (2H, s), 7.36 (5H, s).
13C RMN: (50 MHz; CDCla): 821.6, 39.9, 67.5, 128.0, 128.4, 128.5, 135.0, 169.9.
2b- Preparación del 5-(Cbz-amino)-4-oxopentanoato de 1-(benciloxicarbonil)etilo
Se agregó gota a gota trietilamina a una solución agitada de ácido 5-(Cbz-amino)-4-oxopentanoico (4.00 g; 15.0 mmol) y el producto a partir de 2a (3.65 g; 15.0 mmol) en acetato de etilo (50 mL). La mezcla agitada se calentó a reflujo durante 2 días bajo argón. Después de enfriar a temperatura ambiente, se agregó solución de HCl 0.5 M (50 mL) y la mezcla se agitó a fondo. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 20 mL). Las soluciones de acetato de etilo combinadas se lavaron con solución saturada de NaHCO3 (2 x 15 mL) y solución saturada de NaCl (1 x 15 mL), luego se secaron (MgSO4). Después de la filtración y evaporación se obtuvo un aceite ámbar que se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice 60 de 60 x 55 mm eluida con acetato de
etilo - hexano (1:1) (1000 mL), recolectando 8 fracciones de 100 mL. La evaporación de las fracciones 3-5 dio como resultado 4.92 g (77 %) del producto (aceite).
1H RMN: (300 MHz; DMSO-de): 81.41 (3H, d, J = 7.0 Hz), 2.56 (2H, t, J = 6.3 Hz), 2.68 (2H, t, J = 6.3 Hz), 4.03 (2H, d, J = 7.1 Hz), 5.04 (2H, s), 5.06 (1H, q, J = 6.2 Hz), 5.16 (2H, s), 7.36 (10H, m), 7.54 (1H, br s).
13C RMN: (75 MHz; DMSO-de): 816.6, 26.9, 33.5, 49.6, 65.4, 66.1, 68.4, 127.6, 127.8, 128.3, 128.4, 135.6, 137.0, 156.3, 170.1, 171.6, 205.2.
2c- Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 1 -(isopropilcarboxi)etilo
Una mezcla agitada del producto a partir de 2b (4.92 g; 11.5 mmol), paladio al 10 % sobre carbón activado (100 mg), gas hidrógeno y cloruro de hidrógeno 2.0 M en éter dietílico (10 mL; 20 mmol) en 2- propanol (15 mL) y dioxano (15 mL) se hidrogenaron a aprox. 6 bar durante 2 días a temperatura ambiente. La mezcla se filtró a través de una almohadilla de Celite® 545 y el residuo se lavó con 2-propanol (2 x 5 mL). Los filtrados combinados se evaporaron y el aceite resultante se trituró con éter dietílico (4 x 10 mL), luego se almacenó en un congelador. El aceite no solidificó. Después de secar al vacío (a 0.01 hPa (0.005 mm Hg)) durante la noche, se obtuvieron 1.97 g (71 %) del producto (aceite viscoso, de color tostado).
1H RMN: (300 MHz; DMSO-de): 81.17 (6H, dd, J = 5.7 Hz), 1.37 (3H, d, J = 7.0 Hz), 2.60 (2H, t, J = 6.2 Hz), 2.80 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.93 (2H, br s), 4.88 (2H, m), 8.38 (3H, br s).
13C RMN: (75 MHz; DMSO-de): 816.6, 21.3, 26.8, 34.1, 46.5, 68.5, 68.7, 169.7, 171.5, 202.3.
Ejemplo 3 - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de carboxidifluorometilo
3a - Preparación de bromodifluoroacetato de bencilo
Este compuesto se preparó según el ejemplo 2a a partir del ácido bromodifluoroacético (9.82 g; 68.7 mmol), alcohol bencílico (7.0 g; 65 mmol) y monohidrato de ácido p-toluenosulfónico (50 mg) en ciclohexano (120 mL). El producto en bruto obtenido después de la evaporación se usó tal cual sin ningún tratamiento adicional en 3b.
1H RMN: (300 MHz; CDCla): 85.35 (2H, s), 7.39 (5H, s).
13C RMN: (75 MHz; CDCl3): 869.8, 108.8 (t, JC-F = 312 Hz), 128.6, 128.9, 129.2, 140.8, 159.5 (t, JC-F = 31 Hz). 3b - Preparación de (benciloxicarbonil)difluorometil 5-(Cbz-amino)-4-oxopentanoato
Se agregó trietilamina (3.5 mL; 2.5 g; 25 mmol) usando una jeringa a una mezcla agitada del producto en bruto de 3a (8.6 g; 20 mmol) y ácido 5-(Cbz-amino)-4-oxopentanoico (6.63 g; 25 mmol) en acetonitrilo seco (100 mL). La mezcla se sometió a reflujo durante 18 h, luego se evaporó el disolvente y el residuo de color rojo oscuro se disolvió en éter dietílico (100 mL) y HCl 0.5 M (100 mL). Después de mezclar completamente, la capa de éter se lavó con agua (2 x 15 mL), NaHCO3 saturado (2 x 15 mL) y solución saturada de NaCl (1 x 15 mL), luego se secó (MgSO4). Después de la filtración y la evaporación, el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice 60 de 60 x 55 mm eluida con diclorometano - éter dietílico (9:1) (1000 mL), recogiendo 10 fracciones de 75 mL. Después de la evaporación de las fracciones 2-5 y secado al vacío (0.03 hPa (0.02 mm Hg)) se obtuvieron 6.7 g (74 %) del producto (sólido de color rojo anaranjado pf 48-50 °C).
1H RMN: (300 MHz; DMSO-de): 82.56 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.73 (2H, t, J = 6.2 Hz), 3.90 (2H, d, J = 5.9 Hz), 5.05 (2H, s), 5.08 (2H, s), 7.36 (10H, s), 7.54 (1H, t, J = 5.7 Hz).
13C RMN: (75 MHz; DMSO-de): 827.2, 33.7, 49.6, 65.42, 65.44, 101.1, 127.6, 127.7, 127.8, 127.9, 128.27, 128.33, 136.1, 137.0, 156.3, 172.0, 174.8, 205.5.
3c - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de carboxidifluorometilo
Este compuesto se preparó a partir del producto a partir de 3b (4.0 g; 8.9 mmol), paladio al 10 % sobre carbono (0.20 g), gas hidrógeno y HCl 2 M en éter dietílico (10 mL; 20 mmol) en 2-propanol (75 mL) y tetrahidrofurano (25 mL) como se describe en el ejemplo 2c. Después de la filtración a través de Celite®, la solución se volvió a filtrar a través de un filtro de papel acanalado. Después de la evaporación, se obtuvo un aceite de color ámbar pálido que se trituró con éter dietílico (4 x 10 mL), dando como resultado 1.6 g (80 %) del producto (sólido gomoso de color tostado pálido). El producto obtenido era una mezcla que contenía principalmente clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de carboxidifluorometilo, algo de clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de isopropilo así como algo de clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 1-(isopropilcarboxi)difluorometilo. El clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de carboxidifluorometilo se puede aislar de la mezcla mediante métodos estándar, por ejemplo, HPLC preparativa. 1H RMN: (300 MHz; DMSO-de): 82.63 (2H, t, J = 6.3 Hz), 2.83 (2H, t, J = 6.5 Hz), 3.96 (2H, br s), 8.37 (3H, br, s). 13C RMN: (75 MHz; DMSO-de): 827.3, 34.2, 46.5, 171.4, 171.8, 202.5.
Ejemplo 4 - Preparación del bromhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 2-carboxietilo
4a - Preparación de 5-(Boc-amino)-4-oxopentanoato de 2-(t-butoxicarbonil)etilo
Se agregó una solución de N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC, 3.34 g; 16.2 mmol) en diclorometano seco (20 mL) usando una jeringa a una mezcla agitada de ácido 5-(Bocamino)-4-oxopentanoico (3.70 mL). g; 16.0 mmol), 3-hidroxipropanoato de t-butilo (2.31 g; 15.8 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP, 50 mg) en diclorometano (40 mL) a temperatura ambiente bajo argón. La suave reacción exotérmica se moderó con un baño de agua helada. Después de 2 días de agitación a temperatura ambiente, la mezcla se filtró con succión en un filtro de vidrio sinterizado. El residuo se lavó con diclorometano (3 x 20 mL). Los filtrados combinados se evaporaron y el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice 60 de 45 x 55 mm eluida con acetato de etilo -hexano (1:1) (500 mL), recogiendo 7 fracciones de 50 mL. Después de la evaporación de las fracciones 2-4, se obtuvieron 5.45 g (96 %) del producto (aceite de color amarillo pálido).
1H RMN: (300 MHz; DMSO-de): 81.38 (9H, s), 1.41 (9H, s), 2.49 (2H, t, J = 6.6 Hz), 2.53 (2H, t, J = 6.2 Hz), 2.66 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.76 (2H, d, J = 5.9 Hz), 4.16 (2H, t, J = 6.2 Hz), 7.06 (1H, t, J = 5.8 Hz).
13C RMN: (75 MHz; DMSO-de): 827.1, 27.6, 28.1, 33.5, 34.3, 49.4, 59.9, 78.0, 80.1, 155.7, 169.6, 171.9, 205.8. 4b - Preparación del bromhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 2-carboxietilo
Este compuesto se preparó a partir del producto a partir de 4a (5.43 g; 15.1 mmol) y 30 % de HBr en ácido acético (15 mL) según el ejemplo 1c. Se obtuvieron 3.38 g (79 %) del producto (goma ámbar que no solidificó).1
1H RMN: (300 MHz; DMSO-de): 82.55 (4H, t, J = 6.4 Hz), 2.80 (2H, t, J = 6.3 Hz), 4.00 (2H, d, J = 3.5 Hz), 4.19 (2H, t, J = 6.3 Hz), 8.10 (3H, br s).
13C RMN: (75 MHz; DMSO-de): 826.9, 33.2, 34.1, 46.6, 60.1, 171.8 (2C), 202.6.
Ejemplo 5 - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 3-carboxipropilo
5a - Preparación de 5-(Boc-amino)-4-oxopentanoato de 3-(benciloxicarbonil)propilo
Este compuesto se preparó a partir de 4-bromobutanoato de bencilo (7.2 g; 28.0 mmol), 5-(Boc-amino)-4-oxopentanoato (6.7 g; 29.0 mmol), trietilamina (2.95 mmol) y acetato de etilo (100 mL) como se describe en el ejemplo 1a. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice 60 de 60 x 55 mm, eluida con acetato de etilo - hexano (1:2) (750 mL), recogiendo 6 fracciones de 100 mL. Después de la evaporación de las fracciones 3 y 4, se obtuvieron 5.43 g (46 %) del producto (aceite de color amarillo).
1H RMN: (300 MHz; DMSO-de): 81.38 (9H, s), 1.85 (2H, m), 2.41-2.50 (4H, m), 2.67 (2H, t, J = 6.7 Hz), 3.77 (2H, d, J = 5.8 Hz), 4.02 (2H, t, J = 6.4 Hz), 5.10 (2H, s), 7.07 (1H, t, J = 5.7 Hz), 7.37 (5H, s).
13C RMN: (75 MHz; DMSO-de): 823.6, 27.2, 28.1, 30.0, 33.6, 49.4, 63.0, 65.4, 78.0, 127.87, 127.93, 128.4, 136.1, 155.7, 172.1, 172.2, 206.0.
5b - Preparación del 5-(Boc-amino)-4-oxopentanoato de 3-carboxipropilo
Este compuesto se preparó a partir del producto a partir de 5a (5.40 g; 13.2 mmol), paladio al 10 % sobre carbón activado (250 mg), gas hidrógeno y etanol al 96 % (100 mL) como se describe en el ejemplo 2c. Se obtuvieron 4.30 g del producto (aceite amarillento) que se usó en 5c sin ningún tratamiento adicional.
5c - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 3-carboxipropilo
Este compuesto se preparó a partir del producto a partir de 5b (4.20 g; 13.2 mmol), HCl 2 M en éter dietílico (7.5 mL; 15 mmol) y éter dietílico (50 mL) como se describe en el ejemplo 1b. Después de la evaporación del disolvente, el residuo oleoso se trituró con éter dietílico (4 x 10 mL) y se mantuvo durante la noche en un congelador hasta que solidificó en un sólido de color tostado pálido. Se obtuvieron 1.90 g (57 %) del producto después de secar a 16 hPa (12 mm Hg) y a temperatura ambiente.1
1H RMN: (300 MHz; DMSO-de): 81.80 (2H, m), 2.30 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.55 (2H, t, J = 6.7 Hz), 2.82 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.95 (2H, d, J = 5.1 Hz), 4.03 (2H, t, J = 6.5 Hz), 8.42 (3H, br s), 12.1 (1H, br s).
13C RMN: (75 MHz; DMSO-de): 823.6, 27.0, 30.1, 34.2, 46.4, 63.3, 171.9, 173.8, 202.6.
Ejemplo 6 - Preparación del bromhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de carboxifenilmetilo
6a - Preparación de a-bromofenilacetato de t-butilo
Se agregó ácido sulfúrico concentrado (0.55 mL; 10 mmol) a una suspensión agitada de MgSO4 anhidro (4.8 g; 40 mmol) en diclorometano seco (40 mL) a temperatura ambiente. Después de 15 min de agitación, se agregó ácido abromofenilacético (2.15 g; 10.0 mmol), seguido de alcohol t-butílico (4.8 mL; 50 mmol). El matraz de reacción se cerró con un tapón y la mezcla se agitó 7 días a temperatura ambiente. Se agregó solución saturada de NaHCO3 (75 mL) y agua (75 mL) a la mezcla de reacción. Después de separar, la capa acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 15 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua y se secaron (MgSO4). Después de filtrar y evaporar se obtuvieron 2.39 g (88 %) del producto (aceite incoloro).
1H RMN: (200 MHz; CDCh): 81.46 (9H, s), 5.25 (1H, s), 7.30-7.38 (3H, m), 7.48-7.56 (2H, m).
13C RMN: (50 MHz; CDCh): 827.7, 48.3, 83.0, 128.5, 128.6, 128.9, 136.2, 167.0.
6b - Preparación de a-[5-(Boc-amino)-4-oxopentanoiloxi]-fenilacetato de t-butilo
Este compuesto se preparó a partir del ácido 5-(Boc-amino)-4-oxopentanoico (1.97 g; 8.5 mmol), el producto a partir de 6a (2.35 g; 8.7 mmol) y trietilamina (0.88 g; 8.7 mmol) en acetato de etilo (30 mL) como se describe en el ejemplo 1a. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice 60 de 65 x 55 mm eluida con acetato de etilo - hexano (1:2) (1100 mL) recogiendo 18 fracciones de 50 mL. Después de la evaporación de las fracciones 3-8, se obtuvieron 2.79 g (78 %) del producto (aceite ámbar).
1H RMN: (200 MHz; CDCla): 81.39 (9H, s), 1.44 (9H, s), 2.75-2.85 (4H, m), 4.05 (2H, d, J = 4.8 Hz), 5.22 (1H, br s), 5.77 (1H, s), 7.35-7.46 (5H, m).
13C RMN: (50 MHz; CDCh): 827.7, 27.8, 28.3, 34.2, 50.3, 75.2, 79.8, 82.5, 127.4, 128.8, 128.9, 134.0, 155.7, 167.5, 171.6, 203.7.
6c - Preparación del bromhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de carboxifenilmetilo
Este compuesto se preparó a partir del producto a partir de 6b (2.75 g; 6.5 mmol) y HBr al 33 % en ácido acético (5 mL) como se describe en el ejemplo 1c. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice 60 de 40 x 55 mm, eluida con metanol al 10 % en acetonitrilo (400 mL), recogiendo 20 fracciones de 10 mL. Después de la evaporación de las fracciones 4-15 y secado al vacío durante 48 ha 40 °C y 0.01 hPa (0.01 mm Hg) se obtuvieron 1.60 g (71 %) del producto (espuma de color naranja, pf 77-80 °C).
1H RMN: (200 MHz; DMSO-de): 82.73 (2H, m), 2.85 (2H, m), 4.02 (2H, s), 5.82 (1H, s), 7.3-7.5 (5H, m), 8.13 (3H, br s).
13C RMN: (50 MHz; DMSO-de): 826.8, 34.1, 46.5, 74.1, 127.4, 127.9, 128.5, 134.0, 169.4, 171.2, 202.1.
Ejemplo 7 - Preparación del bromhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de (4-carboxifenil)metilo
7a - Preparación de 4-(bromometil)benzoato de t-butilo
Este compuesto se preparó a partir del ácido 4-(bromometil)benzoico (2.15 g; 10.0 mmol), alcohol t-butílico (4.8 mL; 50 mmol), MgSO4 anhidro (4.8 g; 40 mmol) y ácido sulfúrico concentrado en diclorometano (40 mL) como se describe en el ejemplo 6a. Después de 14 días, la mezcla se elaboró como se describe en el ejemplo 6a. Se obtuvieron 1.07 g (39 %) del producto (sólido de color blanco). El producto se usó en 7b sin purificación adicional. 1H RMN: (200 MHz; CDCh): 81.59 (9H, s), 4.49 (2H, s), 7.42 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.96 (2H, d, J = 8.4 Hz).
13C RMN: (50 MHz; CDCla): 828.1, 32.3, 81.2, 128.7, 129.8, 130.6, 141.9, 165.0.
7b- Preparación de [4-[5-(Boc-amino)-4-oxopentanoiloxi]metil]-benzoato de t-butilo
Este compuesto se preparó a partir del ácido 5-(Boc-amino)-4-oxopentanoico (0.81 g; 3.50 mmol), el producto en bruto de 7a (1.00 g; 3.7 mmol) y trietilamina (0.40 g; 4.0 mmol) en acetato de etilo (15 mL) como se describe en el ejemplo 1 a. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice 60 de 65 x 55 mm eluida con acetato de etilo - hexano (1:2) (1200 mL) recogiendo 16 fracciones de 50 mL. Después de la evaporación de las fracciones 6-10, se obtuvieron 0.59 g (40 %) del producto (aceite incoloro). 1H RMN: (200 MHz; CDCls): 81.44 (9H, s), 1.59 (9H, s), 2.73 (4H, s), 4.05 (2H, d, J = 5.0 Hz), 4.1 (1H, br s), 5.15 (2H, s), 7.37 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.98 (2H, d, J = 8.2 Hz).
13C RMN: (50 MHz; CDCh): 827.7, 28.2, 28.3, 34.3, 50.3, 81.1 (2C), 127.4 (2C), 129.6 (2C), 131.8, 140.0, 165.2, 172.0, 203.9.
7c - Preparación del bromhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de (4-carboxifenil)metilo
Este compuesto se preparó a partir del producto a partir de 7b (0.50 g; 1.2 mmol) y HBr al 33 % en ácido acético (2 mL) como se describe en el ejemplo 1c. La adición de HBr dio una precipitación inmediata de sólidos de color blanco. El precipitado se trituró con hexano y éter dietílico como se describe en el ejemplo 1c. El residuo se secó al vacío durante 48 h a 40 °C y 0.01 hPa (0.01 mm Hg), se obtuvieron 0.37 g (88 %) del producto (polvo de color blanco, pf 198-200 °C (dec)).
1H RMN: (200 MHz; DMSO-de): 82.68 (2H, t, J = 6.2 Hz), 2.88 (2H, t, J = 6.2 Hz), 4.03 (2H, s), 5.19 (2H, s), 7.49 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.96 (2H, d, J = 8.4 Hz), 8.13 (3H, br s).
13C RMN: (50 MHz; DMSO-de): 827.0, 34.2, 46.6, 64.8, 127.3, 129.2, 130.1, 140.8, 166.8, 171.6, 202.4.
Ejemplos 8 a 15 - Preparación de clorhidratos de 5-amino-4-oxopentanoato de carboxialquilo de cadena lineal Estructura general de clorhidratos de 5-amino-4-oxopentanoato de carboxialquilo de cadena lineal descritos en los ejemplos 8 a 15:
n = 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 15 Procedimientos generales usados para la preparación de los compuestos en los ejemplos 8 a 15:
Procedimiento A Preparación de ésteres bencílicos usando carbodiimidas
Una solución de N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N,N'-diisopropilcarbodiimida en diclorometano seco (10 mL) se agregó gota a gota mediante una jeringa a una solución agitada del ácido carboxílico, alcohol bencílico o 2,2,2-tricloroetanol, y 4-pirrolidinilpiridina en diclorometano seco (40 mL) bajo argón. Después de agitar durante uno o dos días a temperatura ambiente, la mezcla se filtró al vacío y el residuo se lavó con un poco de diclorometano. El disolvente se evaporó y el residuo se secó al vacío a 50 °C (temperatura del baño) y 0.02 hPa (0.014 mm Hg) usando un aparato Kugelrohr para eliminar el exceso de alcohol bencílico.
Procedimiento B Preparación de ésteres bencílicos mediante destilación azeotrópica
Una mezcla de ácido carboxílico, alcohol bencílico y ácido p-toluenosulfónico en tolueno se calentó a reflujo durante la noche a través de una trampa Dean-Stark. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se lavó con solución saturada de NaHCO3 (1 x 15 mL) y NaCl saturada (1 x 15 mL). Después de secar (MgSO4), filtrar y evaporar, el residuo se secó al vacío a 50 °C (temperatura del baño) y 0.02 hPa (0.014 mm Hg) usando un aparato Kugelrohr.
Procedimiento C Acoplamiento de ésteres a derivados de 5-ALA N-protegidos: w-bromoalcanoatos y 5-(Cbz-amino)-4-oxopentanoato de cesio
Se calentó o -bromoalcanoato de bencilo, 5-(Cbz-amino)-4-oxopentanoato de cesio y Nal (10 mg) en DMSO seco (25 mL) a 100 °C (temperatura del baño) bajo argón, durante la noche. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con agua (150 mL) y se extrajo con éter dietílico (5 x 25 mL). Las soluciones de éter combinadas se lavaron con agua (2 x 10 mL), solución saturada de NaCl (1 x 10 mL) y se secaron (MgSO4). Después de la filtración y la evaporación, el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice 60 eluida con acetato de etilo-hexano (1:1). Las fracciones que contenían el producto se evaporaron para aislar el éster de 5-ALA protegido.
Procedimiento D Acoplamiento de ésteres a derivados 5-ALA N-protegidos: o -hidroxialcanoatos y ácido 5-(Cbzamino)-4-oxopentanoico
Se agregó una solución de N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) en diclorometano seco (10 mL) a una solución agitada de o-hidroxialcanoato, ácido 5-(Cbz-amino)-4-oxopentanoico, y ácido 4-pirrolidinilpiridina (50 mg) en diclorometano seco (25 mL) bajo argón. Después de agitar la mezcla a temperatura ambiente durante 1-3 días, se filtró al vacío. El filtrado se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice 60 eluida con acetato de etilo-hexano (1:1). Las fracciones que contenían el producto se evaporaron para aislar el éster de 5-ALA protegido.
Procedimiento E Esteres de acoplamiento a derivados de 5-ALA N-protegidos: w-hidroxialcanoatos de tricloroetilo y ácido 5-(Bocamino)-4-oxopentanoico
Se agregó gota a gota una solución de N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC, 2.41 g; 14.1 mmol) en diclorometano seco (15 mL) a una solución agitada de o-hidroxialcanoato de 2,2,2-tricloroetilo, ácido 5-(Boc-amino)-4-oxopentanoico y piridina en diclorometano seco enfriado a 0 °C (temperatura del baño) bajo argón. Después de agitar durante una hora a 0 °C, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se filtró al vacío y se agregó ácido acético (3 mL) al filtrado. Después de reposar 30 min, la mezcla se volvió a filtrar y el filtrado se diluyó con éter dietílico (150 mL). La solución se lavó con HCl 1 M (3 x 25 mL), agua (3 x 25 mL), solución saturada de NaHCO3 (2 x 25 mL) y solución saturada de NaCl (1 x 25 mL). Después de secar (MgSO4), filtrar y evaporar, el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice 60 eluida con acetato de etilo-hexano. Las fracciones que contenían el producto se evaporaron para dar el producto.
Ejemplo 8 - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 4-carboxibutilo
8a - Preparación de 5-bromopentanoato de bencilo
Este compuesto se preparó a partir del ácido 5-bromopentanoico (1.81 g; 10.0 mmol), alcohol bencílico (1.62 g; 15.0 mmol) y ácido p-toluenosulfónico (50 mg) en tolueno (100 mL) usando el procedimiento B. Se obtuvieron 2.60 g (96 %) del producto (aceite transparente). El producto se usó en 8c sin purificación adicional.
1H RMN (200 MHz; CDCh): 81.8-1.9 (4H, m, J = 7.2 Hz), 2.39 (2H, t, J = 7.2 Hz); 3.39 (2H, t, J = 6.4 Hz); 5.12 (2H, s), 7.35 (5h, s) ppm.
13C RMN (50 MHz; CDCla): 823.5, 31.9, 32.9, 33.2, 66.2, 128.1, 128.2, 128.4, 135.8, 172.7 ppm.
8b - Preparación de 5-(Cbz-amino)-4-oxopentanoato de cesio
Se agregó ácido 5-(Cbz-amino)-4-oxopentanoico (2.66 g; 10.0 mmol) a una solución agitada de carbonato de cesio (1.64 g; 5.0 mmol) en agua desionizada (40 mL). Después de que cesó el desprendimiento de CO2, la mezcla se congeló con nitrógeno líquido y se liofilizó durante la noche. Se obtuvieron 4.2 g (-100 %) del producto (sólido de color tostado pálido). El producto fue usado en 8c sin purificación adicional.
8c - Preparación de 5-(Cbz-amino)-4-oxopentanoato de 4-(benciloxicarbonil)butilo
Este compuesto se preparó a partir de los productos de 8a (0.73 g; 2.7 mmol) y 8b (1.0 g; 2.5 mmol) según el procedimiento C. El producto en bruto se purificó en una columna de gel de sílice 60 de 75 * 45 mm eluida con acetato de etilo-hexano (1:1) (1000 mL) recolectando 13 fracciones de 50 mL. Se recogieron las fracciones que contenían el producto (5-8), y después de la evaporación se obtuvieron 0.82 g (72 %) del producto (sólido amarillento, pf 53-56 °C).
1H RMN (200 MHz; DMSO-de): 81.58 (4H, br s), 2.3-2.5 (4H, t superpuesta), 2.69 (2H, t, J = 6 Hz), 3.89 (2H, d, J = 5.8 Hz), 3.99 (2H, br s); 5.04 (2H, s), 5.09 (2H, s), 7.36 (10H, s) ppm.
13C RMN (50 MHz; DMSO-de): 820.9, 23.6, 27.2, 32.8, 33.6, 49.6, 63.4, 65.2, 65.3, 127.5, 127.6, 127.7, 127.8, 128.1, 128.2, 136.0, 136.8, 156.2, 171.9, 172.3, 205.3 ppm.
8d - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 4-carboxibutilo
Una mezcla agitada del producto a partir de 8c (0.70 g; 1.54 mmol), HCl 12 M (0.13 mL; 1.54 mmol), Pd al 10 %/C (Degussa tipo E101 NE/W) (100 mg), y 2-propanol (25 mL) se hidrogenó a temperatura ambiente y 4 bares de presión durante la noche. La mezcla se filtró a través de una almohadilla de Celite® 545; el filtrado se evaporó y el residuo se trituró con éter dietílico seco (3 x 5 mL). Después de secar el residuo a temperatura ambiente y 0.01 hPa (0.01 mm Hg), se obtuvieron 0.38 g (97 %) del producto (sólido de color blanco).
1H RMN (200 MHz; DMSO-cfe): 81.4-1.7 (4H, m), 2.25 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.55 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.82 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.9-4.1 (4H, m), 8.43 (3H, s) ppm.
13C RMN (50 MHz; DMSO-cfe): 820.9, 23.5, 27.0, 30.0, 34.2, 46.4, 63.6, 171.8, 173.6, 202.3 ppm.
Ejemplo 9 - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 5-carboxipentilo
9a - Preparación de 6-bromohexanoato de bencilo
Este compuesto se preparó a partir del ácido 6-bromohexanoico (1.95 g; 10.0 mmol), alcohol bencílico (1.62 g; 15.0 mmol) y ácido p-toluenosulfónico (50 mg) en tolueno (100 mL) usando el procedimiento B. 2.80 g (98 % del producto (aceite claro). El producto se usó en 9b sin purificación adicional.1
1H RMN (200 MHz; CDCfe): 8 1.4-1.5 (2H, m, J = 6.8 Hz), 1.6-1.7 (2H, m, J = 7.2 Hz), 1.8-1.9 (2H, m, J = 7.4 Hz), 2.37 (2H, t, J = 7.4 Hz); 3.38 (2H, t, J = 6.6 Hz); 5.12 (2H, s), 7.35 (5H, s) ppm.
13C RMN (50 MHz; CDCla): 824.0, 27.7, 32.3, 33.4, 34.0, 66.1, 128.1, 128.4, 135.9, 173.0 ppm.
9b - Preparación de 5-(Cbz-amino)-4-oxopentanoato de 5-(benciloxicarbonil)pentilo
Este compuesto se preparó a partir del producto a partir de 9a (0.77 g; 2.7 mmol) y 8b (1.0 g; 2.5 mmol) según el procedimiento C. El tiempo de reacción fue de 2 días. El producto en bruto se purificó en una columna de gel de sílice 60 de 75 x 45 mm eluida con acetato de etilo-hexano (1:1) (1000 mL) recogiendo 14 fracciones de 50 mL. Se recogieron las fracciones que contenían el producto (5-7), y después de la evaporación se obtuvieron 0.52 g (44 %) del producto (aceite ámbar que solidificó en un sólido ceroso al reposar en el congelador).
1H RMN (200 MHz; DMSO-cfe): 81.25-1.38 (2H, m), 1.45-1.6 (4H, m), 2.36 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.47 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.69 (2H, t, J = 6.2 Hz), 3.85-4.1 (4H, d y t superpuestas, J = 6 y 6.4 Hz), 5.04 (2H, s), 5.09 (2H, s), 7.36 (10H, s) ppm. 13C RMN (50 MHz; DMSO-cfe): 824.0, 24.7, 27.2, 27.6, 33.2, 33.6, 49.6, 63.6, 65.2, 65.3, 127.5, 127.6, 127.7, 127.8, 128.1, 128.2, 136.1, 136.8, 156.2, 171.9, 172.4, 205.3 ppm.
9c - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 5-carboxipentilo
Este compuesto se preparó a partir del producto a partir de 9b (0.45 g; 0.96 mmol), HCl 12 M (0.08 mL; 0.96 mmol), Pd al 10 %/C (100 mg), gas hidrógeno y 2-propanol (25 mL) usando el procedimiento del ejemplo 8d. Se obtuvieron 0.20 g (77 %) del producto (sólido de color blanco).
1H RMN (200 MHz; DMSO-cfe): 81.2-1.4 (2H, m), 1.4-1.7 (4H, m), 2.22 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.55 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.82 (2H, t, J = 6.2 Hz), 3.9-4.1 (4H, m), 8.41 (3H, s) ppm.
13C RMN (50 MHz; DMSO-cfe): 824.0, 24.8, 27.0, 27.7, 33.4, 34.2, 46.4, 63.8, 171.8, 174.1, 202.3 ppm.
Ejemplo 10 - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 7-carboxiheptilo
10a - Preparación de 8-bromooctanoato de bencilo
Este compuesto se preparó a partir del ácido 8-bromooctanoico (2.23 g; 10.0 mmol), alcohol bencílico (1.19 g; 11.0 mmol), N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC, 2.27 g; 11.0 mmol) y 4-pirrolidinilpiridina (50 mg) en diclorometano seco (50 mL) usando el procedimiento A. Se obtuvieron 3.14 g (100 %) del producto (aceite transparente que finalmente solidificó al reposar).1
1H RMN (200 MHz; CDCfe): 8 1.33 (6H, br s), 1.6-1.7 (2H, m), 1.75-1.9 (2H, m), 2.35 (2H, t, J = 7.8 Hz); 3.38 (2H, t, J = 6.8 Hz); 5.11 (s, 2H), 7.35 (s, 5H) ppm. 13C RMN (50 MHz; CDCla): 824.8, 27.9, 28.3, 28.9, 32.6, 33.8, 34.2, 66.0, 128.1, 128.4, 136.0, 173.3 ppm.
10b - Preparación de 5-(Cbz-amino)-4-oxopentanoato de 7-(benciloxicarbonil)heptilo
Este compuesto se preparó a partir del producto a partir de 10a (0.79 g; 2.5 mmol) y 8b (1.0 g; 2.5 mmol) según el procedimiento C. El tiempo de reacción fue de 2 días. El producto en bruto se purificó en una columna de gel de sílice 60 de 80 x 45 mm eluida con acetato de etilo-hexano (1:1) (1000 mL) recogiendo 13 fracciones de 50 mL. Se recogieron las fracciones que contenían el producto (3-6), y después de la evaporación se obtuvieron 0.83 g (67 %) del producto (aceite ámbar que solidificó en un sólido ceroso al reposar en el congelador, pf 52-54 °C).
1H RMN (200 MHz; DMSO-de): 81.26 (6H, br s), 1.53 (4H, br s), 2.34 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.48 (2H, t, J = 5.8 Hz), 2.69 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.38 (1H, t, J = 6.6 Hz), 3.89 (2H, d, J = 6 Hz), 3.98 (2H, t, J = 6.6 Hz), 5.04 (2H, s), 5.08 (2H, s), 7.35 (10H, s) ppm.
13C RMN (50 MHz; DMSO-de): 824.3, 25.1, 26.3, 27.2, 27.9, 33.4, 33.7, 49.6, 63.8, 65.1, 65.3, 127.4, 127.7, 128.2, 136.1, 136.8, 156.1, 171.8, 172.5, 205.2 ppm.
10c - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 7-carboxiheptilo
Este compuesto se preparó a partir del producto a partir de 10b (0.70 g; 1.4 mmol), HCl 12 M (0.12 mL; 1.4 mmol), Pd al 10 %/C (100 mg), gas de hidrógeno y 2-propanol (25 mL) usando el procedimiento del ejemplo 8d. Se obtuvieron 0.30 g (70 %) del producto (sólido de color blanco).
1H RMN (200 MHz; DMSO-de): 81.28 (6H, s), 1.4-1.7 (4H, m), 2.20 (2H, t, J = 7 Hz), 2.55 (2H, t, J = 6.2 Hz), 2.81 (2H, t, J = 6.2 Hz), 3.9-4.1 (4H, m), 8.42 (3H, s) ppm.
13C RMN (50 MHz; DMSO-de): 824.3, 25.1, 27.0, 27.9, 28.2, 28.3, 33.6, 34.2, 46.4, 63.9, 171.8, 174.2, 202.3 ppm. Ejemplo 11 - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 8-carboxioctilo
11a - Preparación de nonanedioato de hidrógeno de bencilo
Se sometió a reflujo una mezcla agitada de ácido nonanedioico (18.8 g; 0.10 mol), alcohol bencílico (10.8 g; 0.10 mol) y ácido p-toluenosulfónico (0.2 g) en tolueno (200 mL) a través de una trampa Dean-Stark, durante la noche. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se extrajo con N-metil-D-glucamina acuosa al 10 % (4 x 25 mL). El último extracto fue una emulsión lechosa. Los tres primeros extractos se combinaron, se acidificaron con HCl 1 M (50 mL) y se filtraron para dar ácido nonanedioico recuperado (3.8 g). La emulsión se acidificó con HCl 1 M y se dejó separar durante la noche. La capa orgánica se evaporó y el residuo se disolvió en hexano (200 mL) y éter dietílico (50 mL). La solución se extrajo con N-metil-D-glucamina al 10 % (2 x 50 mL) (las emulsiones se rompieron agregando un poco de etanol). La solución orgánica se lavó con agua (1 x 25 mL) y la solución acuosa combinada se acidificó con HCl 1 M (150 mL). Después de la extracción con diclorometanotetrahidrofurano (4:1) (5 x 10 mL), los extractos combinados se secaron (Na2SO4), filtraron y evaporaron. Se obtuvieron 13.0 g (47 %) del producto (aceite que solidificó al reposar).
1H RMN (200 MHz; CDCI3): 81.31 (6H, br s), 1.5-1.8 (4H, m), 2.25-2.4 (4H, m); 5.11 (s, 2H), 7.34 (5H, s), 10.4 (1H, br s) ppm.
13C RMN (50 MHz; CDCI3): 824.6, 28.8, 34.0, 34.2, 66.1, 128.1, 128.4, 136.0, 173.5, 179.9 ppm.
11b - Preparación de 9-hidroxinonanoato de bencilo
El producto a partir de 11a (12.9 g; 46.3 mmol) se agregó en porciones a una mezcla agitada de borohidruro de sodio (1.70 g; 45.0 mmol) en tetrahidrofurano seco (25 mL). Después de que cesó el desprendimiento de hidrógeno, se agregó gota a gota una solución de dimetil eterato de trifluoruro de boro (4.6 mL; 5.7 g; 50 mmol) en tetrahidrofurano seco (15 mL). La reacción exotérmica se moderó con un baño de agua fría. Después de agitar durante 4 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se hidrolizó con agua fría (20 mL). La mezcla se separó y la fase orgánica se evaporó; el residuo se mezcló con agua (20 mL) y diclorometano (70 mL) para dar una emulsión que se separó al reposar durante la noche. La capa orgánica se lavó con agua (4 x 15 mL) hasta que los lavados fueron neutros al papel de pH. Después del secado (Na2SO4), filtración y evaporación, se obtuvieron 11.95 g (98 %) del producto (aceite).
1H RMN (200 MHz; CDCh): 8 1.30 (8H, br s), 1.4-1.75 (4H, m), 2.34 (2H, t, J = 7.6); 3.62 (2H, t, J = 6.6 Hz), 5.10 (2H, s), 7.34 (5H, s) ppm.
13C RMN (50 MHz; CDCla): 824.9, 25.6, 29.0, 29.1, 32.6, 34.3, 63.0, 66.0, 128.0, 128.4, 136.0, 173.6 ppm.
11c - Preparación de 5-(Cbz-amino)-4-oxopentanoato de 8-(benciloxicarbonil)octilo
Este compuesto se preparó a partir del producto a partir de 11b (1.1 g; 4.2 mmol), ácido 5-(Cbz-amino)-4-oxopentanoico (1.0 g; 3.8 mmol), 4-pirrolidinilpiridina (60 mg) y N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC, 0.87 g; 4.2 mmol) en diclorometano
(35 mL) según el procedimiento D. El tiempo de reacción fue de 3 días. El producto en bruto se purificó en un 85 x 45 columna de gel de sílice de 60 mm eluida con acetato de etilo-hexano (1:1) (1000 mL) recogiendo 14 fracciones de 50 mL. Fracciones que contenía el producto (4-7) se evaporaron y se obtuvieron 1.5 g (77 %) del producto.
1H RMN (200 MHz; DMSO-de): 8 1.24 (8H, br s), 1.54 (4H, t superpuesta, J = 6.2 Hz), 2.34 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.48 (2H, t, J = 6.2 Hz), 2.69 (2H, t, J = 6.2 Hz), 3.89 (2H, d, J = 6 Hz), 3.97 (2H, t, J = 6.6 Hz), 5.04 (2H, s), 5.08 (2H, s), 7.35 (10H, s) ppm.
13C RMN (50 MHz; DMSO- de): 823.6, 24.3, 25.0, 27.2, 27.9, 33.3, 33.6, 49.6, 63.8, 65.1, 65.3, 127.5, 127.6, 127.7, 128.1, 128.2, 136.1, 136.8, 156.2, 171.9, 172.5, 205.3 ppm.
11d - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 8-carboxioctilo
Este compuesto se preparó a partir del producto a partir de 11c (1.4 g; 2.7 mmol), HCl 12 M (0.25 mL; 3.0 mmol), Pd al 10 %/C (100 mg), gas hidrógeno y 2-propanol (25 mL) usando el procedimiento del ejemplo 8d. Se obtuvieron 0.54 g (62 %) del producto (sólido de color blanco).
1H RMN (200 MHz; DMSO-de): 8 1.1-1.7 (12H, m), 2.20 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.54 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.81 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.9-4.1 (4H, m), 8.40 (3H, s) ppm.
13C RMN (50 MHz; DMSO-de): 824.4, 25.1, 27.0, 28.0, 28.4, 28.5, 33.5, 34.2, 46.4, 63.9, 171.8, 174.2, 202.3 ppm.
Ejemplo 12 - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 9-carboxinonilo
12a - Preparación de 10-hidroxidecanoato de 2,2,2-tricloroetilo
Se agregó gota a gota una solución de N,N'-dicidohexilcarbodiimida (DCC, 2.41 g; 14.1 mmol) en diclorometano seco (15 mL) a una solución agitada de ácido 10-hidroxidecanoico (1.88 g; 10.0 mmol), 2,2,2-tricloroetanol (6.13 g; 41.0 mmol) y piridina (4.1 mL) en diclorometano seco (35 mL) enfriado a 0 °C (temperatura del baño) bajo argón. Después de agitar durante una hora a 0 °C, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se filtró al vacío y se agregó ácido acético (3 mL) al filtrado. Después de reposar 30 min, la mezcla se volvió a filtrar y el filtrado se diluyó con éter dietílico (150 mL). La solución se lavó con HCl 1 M (3 x 25 mL), agua (3 x 25 mL), solución saturada de NaHCO3 (2 x 25 mL) y solución saturada de NaCl (1 x 25 mL). Después de secar (MgSO4), filtrar y evaporar, el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice 60 de 170 x 25 mm eluida con acetato de etilo:hexano (1:1), recogiendo 12 fracciones de 25 mL. Las fracciones 3- 5 se evaporaron y el residuo se secó al vacío a 50 °C y 0.07 hPa (0.05 mm Hg) en un aparato Kugelrohr para eliminar el exceso de 2,2,2-tricloroetanol. Se obtuvieron 2.1 g (66 %) del producto (aceite incoloro).
1H RMN (200 MHz; CDCh): 81.32 (10H, br s), 1.4-1.8 (5H, m), 2.47 (2H, t, J = 7.2 Hz); 3.63 (2H, t, J = 6.4 Hz), 4.74 (2H, s) ppm.
13C RMN (50 MHz; CDCla): 824.7, 25.6, 29.0, 29.1, 29.28, 29.32, 32.6, 33.9, 63.0, 73.8, 95.0, 172.1 ppm.
12b - Preparación del 10-[5-(Boc-amino)-4-oxopentanoiloxi]decanoato de 2,2,2-tricloroetilo
Este compuesto se preparó a partir del ácido 5-(Boc-amino)-4-oxopentanoico (1.00 g; 4.3 mmol), el producto a partir de 12a (1.37 g; 4.3 mmol), N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC, 1.03 g; 5.0 mmol) y piridina (2.0 mL) en diclorometano (40 mL) usando el procedimiento E. El producto en bruto se purificó en una columna de gel de sílice 60 de 100 x 50 mm eluida con acetato de etilo-hexano (1:2), recogiendo 16 fracciones de 50 mL. A partir de la evaporación de las fracciones 4-9 se obtuvieron 1.6 g (71 %) del producto (aceite amarillento).
1H RMN (200 MHz; CDCh): 81.31 (10H, br s), 1.44 (9H, s), 1.5-1.8 (4H, m), 2.46 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.6-2.8 (4H, m), 4.0-4.1 (4H, m), 4.74 (2H, s) ppm.
13C RMN (50 MHz; CDCh): 824.7, 25.7, 25.8, 27.8, 28.3, 28.5, 28.9, 29.2, 29.3, 32.7, 33.9, 50.3, 64.9, 73.8, 95.0, 171.9, 172.3, 204 ppm.
12c - Preparación de 5-(Boc-amino)-4-oxopentanoato de 9-carboxinonilo
Se agregó una solución molar de fosfato dihidrógeno de potasio (KH2PO4) (4.0 mL; 4.0 mmol) seguida de polvo de zinc (2.0 g; 30 mmol) a una solución agitada del producto a partir de 12b (1.50 g; 2.8 mmol) en tetrahidrofurano (25 mL). Después de agitar durante 18 h a temperatura ambiente, se agregó una nueva porción de solución de KH2PO4 1 M (5 mL) y zinc (2.0 g; 30 mmol). Se agregó solución adicional de KH2PO41 M (25 mL) después de 5 h y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla se filtró al vacío y el residuo se lavó con acetato de etilo. El acetato de etilo en el filtrado se evaporó y la solución acuosa se extrajo con diclorometano (4 x 5 mL). Los extractos combinados se secaron (Na2SO4), filtraron y evaporaron. Se obtuvieron 1.04 g (93 %) del producto (sólido ceroso de color amarillo pálido).
1H RMN (200 MHz; CDCh ): 81.30 (10H, br s), 1.44 (9H, s), 1.5-1.7 (4H, m), 2.34 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.6-2.8 (4H, m), 4.0-4.1 (4H, m) ppm.
13C RMN (50 MHz; CDCla): 824.7, 25.7, 25.8, 27.8, 28.3, 28.5, 29.0, 29.1, 29.2, 29.3, 32.6, 34.0, 50.3, 65.0;
172.4, 179.1 ppm.
12d - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 9-carboxinonilo
Se agregó una solución 1.0 M de HCl en éter dietílico (7.0 mL; 7.0 mmol) a una solución agitada del producto a partir de 12c (1.0 g; 2.5 mmol) en acetato de etilo (10 mL) a temperatura ambiente bajo argón. Después de 7 h, se evaporó el exceso de disolvente y se trituró el residuo con éter dietílico (4 x 5 mL). El residuo se secó durante la noche a 40 °C y 20 hPa (15 mm Hg) para dar 0.11 g de sólido de color blanco. Los extractos etéreos combinados se evaporaron y disolvieron en etanol al 96 % (25 mL) y HCl 1 M en éter dietílico (5 mL). Después de agitar durante 10 días a temperatura ambiente, la mezcla se filtró y el residuo se trituró con éter dietílico como antes para dar 0.22 g de una segunda cosecha. El análisis de LC-MS indicó que el producto contenía aprox. el 30 % de ácido 5-amino-4-oxopentanoico; los cultivos combinados se purificaron mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice 60 de 165 x 25 mm eluida secuencialmente con acetonitrilo (100 mL), metanol al 2.5 % en acetonitrilo (500 mL), metanol al 5 % en acetonitrilo (500 mL), luego metanol al 7 % en acetonitrilo (1000 mL), recolectando 47 fracciones de 50 mL. Las fracciones que contenían el producto se evaporaron y el residuo se disolvió en agua (10 mL). La solución se liofilizó durante la noche y se obtuvieron 0.17 g (20 %) del producto (sólido de color blanco, pf 98-102 °C, se ablanda, sin pf agudo).
1H RMN (200 MHz; DMSO-de): 81.26 (10H, br s), 1.4-1.6 (4H, m), 2.19 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.54 (2H, t, J = 6.4), 2.81 (2H, t, J = 6.6 Hz), 3.9-4.1 (4H, m), 8.5 (3H, br s) ppm.
13C RMN (50 MHz; DMSO-de): 824.4, 25.2, 27.0, 28.0, 28.4, 28.48, 28.54, 28.6, 33.6, 34.2, 46.4, 63.9, 171.8, 174.1, 202.3 ppm.
Ejemplo 13 - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 10-carboxdecilo
13a - Preparación del 11-bromoundecanoato de bencilo
Este compuesto se preparó a partir del ácido 11-bromoundecanoico (2.65 g; 10.0 mmol), alcohol bencílico (1.62 g; 15.0 mmol) y ácido p-toluenosulfónico (50 mg) en tolueno (100 mL) usando el procedimiento B. Se obtuvieron 3.62 g del producto, que se usaron en 13b sin purificación adicional.
1H RMN (200 MHz; CDCh): 81.27 (12H, br s), 1.6-1.7 (2H, m), 1.8-1.9 (2H, m), 2.35 (2H, t, J = 7.4 Hz); 3.39 (2H, t, J = 6.8 Hz); 5.11 (2H, s), 7.34 (5H, s) ppm. 13C RMN (50 MHz; CDCla): 824.9, 28.1, 28.7, 28.8, 29.0, 29.1, 29.3, 32.8, 33.9, 34.3, 66.0, 128.0, 128.4, 136.0, 173.4 ppm.
13b - Preparación del 5-(Cbz-amino)-4-oxopentanoato de 10-(benciloxicarbonil)decilo
Este compuesto se preparó a partir del producto a partir de 13a (0.96 g; 2,7 mmol) y 8b (1.0 g; 2.5 mmol) según el procedimiento C. El producto en bruto se purificó en una columna de gel de sílice 60 de 70 * 45 mm eluida con acetato de etilo-hexano (1:1) (1000 mL) recolectando 13 fracciones de 50 mL. La fracción que contenía el producto (3) se evaporó y se obtuvieron 0.69 g (47 %) del producto (sólido de color rosado, pf 70-72 °C).
1H RMN (200 MHz; DMSO-de): 81.23 (12H, br s), 1.54 (4H, br s), 2.34 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.48 (2H, m), 2.69 (2H, t, J = 6.2 Hz), 3.89 (2H, d, J = 6.6 Hz), 3.98 (2H, t, J = 6.2 Hz), 5.04 (2H, s), 5.08 (2H, s), 7.35 (10H, s) ppm. 13C RMN (50 MHz; DMSO-de): 823.6, 24.3, 25.2, 27.2, 28.0, 28.3, 28.5, 28.7, 33.4, 33.6, 49.6, 63.8, 65.1, 65.3, 127.5, 127.6, 127.7, 128.1, 128.2, 136.1, 136.8, 156.2, 171.9, 172.5, 205.3 ppm.
13c - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 10-carboxidecilo
Este compuesto se preparó a partir del producto a partir de 13b (0.0 g; 1,1 mmol), HCl 12 M (0.09 mL; 1.1 mmol), Pd al 10 %/C (100 mg), gas hidrógeno y 2-propanol (25 mL) usando el procedimiento del ejemplo 8d. Se obtuvieron 0.20 g (51 %) del producto obtenido (sólido de color blanco).
1H RMN (200 MHz; DMSO-de): 81.1-1.7 (16H, m), 2.19 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.54 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.81 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.9-4.1 (4H, m), 8.41 (3H, s) ppm.
13C RMN (50 MHz; DMSO-de): 824.4, 25.2, 27.0, 28.0, 28.4, 28.55, 28.62, 28.74, 33.6, 34.2, 46.4, 64.0, 170.6, 171.8, 202.3 ppm.
Ejemplo 14 - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de11-carboxiundecilo
14a - Preparación de 12-hidroxidodecanoato de 2,2,2-tricloroetilo
Este compuesto se preparó a partir del ácido 12-hidroxidodecanoico (2.0 g; 9.2 mmol), 2,2,2-tricloroetanol (6.0 g; 40 mmol), N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC, 4.1 g; 20 mmol) y piridina (5.0 mL) en diclorometano seco (50 mL) usando el procedimiento del ejemplo 12a. Se obtuvieron 3.63 g (66 %) del producto (aceite incoloro).
1H RMN (200 MHz; CDCh): 81.28 (14H, br s), 1.5-1.75 (4H, m), 2.46 (2H, t, J = 7.6 Hz); 3.63 (2H, t, J = 6.4 Hz), 4.74 (2H, s) ppm.
13C RMN (50 MHz; CDCla): 824.7, 25.7, 28.6, 29.0, 29.1, 29.2, 29.4, 32.7, 33.9, 62.9, 73.8, 95.0, 172.0 ppm.
14b - Preparación del 12-[5-(Boc-amino)-4-oxopentanoiloxi]dodecanoato de 2,2,2-tricloroetilo
Este compuesto se preparó a partir del ácido 5-(Boc-amino)-4-oxopentanoico (2.0 g; 8.6 mmol), el producto a partir de 14a (3.0 g; 8.6 mmol), N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC, 2.1 g; 10.0 mmol) y piridina (4.0 mL) en diclorometano (75 mL) usando el procedimiento E. El producto en bruto se purificó en una columna de gel de sílice 60 de 90 x 50 mm eluida con acetato de etilo-hexano (1:3), recogiendo 13 fracciones de 50 mL. Tras la evaporación de las fracciones 6-11, se obtuvieron 1.44 g (30 %) del producto (aceite amarillento).
1H RMN (200 MHz; CDCh): 81.28 (14H, br s), 1.45 (9H, s), 1.5-1.8 (4H, m), 2.46 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.6-2.8 (4H, m), 4.0- 4.1 (4H, m), 4.74 (2H, s) ppm.
13C RMN (50 MHz; CDCh): 824.7, 25.8, 28.3, 28.5, 29.1, 29.2, 29.3, 29.4, 29.5, 33.9, 34.3, 50.3, 64.9, 73.8, 74.1, 95.0, 172.0, 172.3, 204.1 ppm.
14c - Preparación del 5-(Boc-amino)-4-oxopentanoato de 11-carboxiundecilo
Este compuesto se preparó a partir del producto a partir de 14b (1.38 g; 2.5 mmol) en tetrahidrofurano (25 mL) siguiendo el procedimiento del ejemplo 12c y usando las mismas cantidades de solución de KH2PO41 M y polvo de zinc. Después del tratamiento, se obtuvo 1.0 g (93 %) del producto (aceite de color amarillo pálido).
1H RMN (200 MHz; CDCh): 81.28 (14H, br s), 1.44 (9H, s), 1.5-1.7 (4H, m), 2.33 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.6-2.8 (4H, m), 4.0- 4.1 (4H, m) ppm.
13C RMN (50 MHz; CDCh): 824.7, 25.8, 28.3, 28.5, 29.0, 29.2, 29.3, 29.4, 32.6, 34.0, 50.3, 65.0, 172.4, 178.9, 204.3 ppm.
14d - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 11-carboxiundecilo
Se agregó una solución 1.0 M de HCl en éter dietílico (5.0 mL; 5.0 mmol) a una solución agitada del producto a partir de 14c (0.95 g; 2.2 mmol) en acetato de etilo (10 mL) a temperatura ambiente bajo argón. Después de 5 días, la mezcla se filtró y el residuo se trituró con éter dietílico (2 x 5 mL). El residuo se secó durante la noche a 40 °C y 20 hPa (15 mm Hg) para dar 0.11 g de sólido de color blanco. Los extractos de éter combinados se evaporaron. El análisis de LC-MS indicó que el producto contenía aprox. 25 % del ácido 5-amino-4-oxopentanoico; los cultivos combinados se purificaron mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice 60 de 150 x 25 mm, eluida secuencialmente con metanol al 3 % en acetonitrilo (1000 mL), metanol al 6 % en acetonitrilo (1000 mL), luego metanol al 9 % en acetonitrilo (2000 mL), recolectando 56 fracciones de 50 mL. Las fracciones que contenían el producto se evaporaron y el residuo se disolvió en agua (10 mL). La solución se secó por congelación durante la noche y se obtuvieron 0.06 g (7.5 %) del producto (sólido de color blanco, pf 110-115 °C (se ablanda, sin pf agudo)).
1H RMN (200 MHz; DMSO-de): 81.25 (14H, br s), 1.4-1.6 (4H, m), 2.19 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.55 (2H, t, J = 6.2 Hz), 2.80 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.9-4.1 (4H, m), 9.1 (3H, br s) ppm.
13C RMN (50 MHz; DMSO-de): 824.4, 25.2, 27.0, 28.0, 28.4, 28.5, 28.6, 28.8, 33.6, 34.1, 46.4, 64.0, 171.8, 174.2, 202.4 ppm.
Ejemplo 15 Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 15-carboxipentadecilo
Este compuesto se preparó a partir del ácido 16-hidroxihexadecanoico (2.45 g; 9.0 mmol), alcohol bencílico (4.9 g; 45 mmol) y ácido p-toluenosulfónico (100 mg) en tolueno (100 mL) usando el procedimiento B. Se obtuvieron 2.82 g del producto en bruto que fue una mezcla 1:1 del producto esperado y el éster entre dos moléculas del ácido 16-hidroxihexadecanoico. Se agregó una solución de NaH (aprox. 100 mg) (lavado previamente tres veces con hexano seco) en alcohol bencílico (10 g) al producto en bruto y la mezcla se agitó a 100 °C (temperatura del baño) bajo argón, durante 3 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se diluyó con diclorometano (75 mL) y se lavó con una solución acuosa de ácido cítrico al 10 % (1 x 10 mL) y se secó (Na2SO4). Después de la filtración y la evaporación, el residuo se secó al vacío a 50 °C (temperatura del baño) y 0.02 hPa (0.014 mm Hg) usando un aparato Kugelrohr.
Se obtuvieron 2.56 g (76 %) del producto (sólido de color blanco). La RMN de protones indicó que quedó aprox. el 10 % del éster dímero.
1H RMN (200 MHz; CDCla): 8 1.25 (22H, br s), 1.55-1.65 (4H, m, J = 7.6 Hz), 1.9 (1H, br s), 2.35 (2H, t, J = 7.4 Hz); 3.63 (2H, t, J = 6.6 Hz); 5.11 (2H, s), 7.34 (5H, s) ppm.
13C RMN (50 MHz; CDCla): 8 24.9, 25.7, 28.9, 29.1, 29.2, 29.4, 29.6, 32.8, 34.3, 63.0, 66.0, 128.0, 128.2, 128.4, 136.0, 173.6 ppm.
15b - Preparación del 5-(Cbz-amino)-4-oxopentanoato de 15-(benciloxicarbonil)pentadecilo
Este compuesto se preparó a partir del producto a partir de 15a (1.2 g; 3.2 mmol), ácido 5-(Cbz-amino)-4-oxopentanoico (0.84 g; 3.2 mmol), 4-pirrolidinilpiridina (50 mg) y N,N'-diisopropilcarbodiimida (0.50 g; 4.0 mmol) en diclorometano (35 mL) según el procedimiento D. El tiempo de reacción fue de 3 días. El producto en bruto se purificó en una columna de gel de sílice 60 de 85 x 55 mm eluida con acetato de etilo-hexano (1:1)
(1000 mL) recolectando 13 fracciones de 50 mL. Las fracciones que contenían el producto (3-6) se evaporaron y se obtuvieron 0.57 g (29%) de producto (sólido de color blanco, pf 78-81°C).
1H RMN (200 MHz; DMSO-cfe): 8 1.24 (22H, br s), 1.54 (4H, br s), 2.33 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.48 (2H, br s), 2.68 (2H, br s), 3.88 (2H, br s), 3.98 (2H, br s), 5.04 (2H, s), 5.08 (2H, s), 7.34 (10H, s) ppm.
13C RMN (50 MHz; DMSO-cfe): 8 24.4, 25.3, 27.4, 28.1, 28.3, 28.6, 28.9, 33.5, 33.8, 49.8, 63.9, 65.2, 65.5, 127.4, 127.6, 127.7, 128.1, 128.2, 136.9, 171.8, 205.2 ppm.
15c - Preparación del clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 15-carboxipentadecilo
Este compuesto se preparó a partir del producto a partir de 15b (0.45 g; 0.74 mmol), HCl 12 M (0.062 mL; 0.74 mmol), Pd al 10 %/C (100 mg), gas hidrógeno y 2-propanol (25 mL) usando el procedimiento del ejemplo 8d. Se obtuvieron 0.06 g (19 %) del producto (sólido de color blanco).
1H RMN (200 MHz; DMSO-cfe): 8 1.1-1.7 (28H, m), 2.25 (2H, m), 2.52 (2H, m), 2.82 (2H, m), 3.9-4.1 (4H, m), 8.43 (3H, s), 12.1 (1H, br s) ppm.
13C RMN (50 MHz; DMSO-cfe): 8 24.4, 25.3, 27.0, 27.2, 27.6, 28.0, 28.4, 28.6, 28.9, 33.6, 34.2, 46.4, 63.9, 171.8, 174.1, 202.3 ppm.
Ejemplo 16 - Estudio de fluorescencia cutánea in vivo en ratones desnudos sanos
Se llevó a cabo un estudio para evaluar el potencial de los compuestos de la invención como precursores de fotosensibilizantes para aplicación en la piel. Como tales, los compuestos de la invención deben poder penetrar en la piel, ser absorbidos por las células de la piel y convertirse en fotosensibilizantes. El resultado de este procedimiento se puede visualizar exponiendo la piel a la luz que excita las moléculas fotosensibilizantes y determinar la cantidad de energía que se libera en forma de fluorescencia cuando las moléculas fotosensibilizantes excitadas se relajan a un estado energéticamente más bajo.
Los siguientes compuestos de la invención se probaron en la piel de ratones desnudos sanos:
Compuesto 2: Clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 1 -(isopropilcarboxi)etilo (preparado según el ejemplo 2) Compuesto 4: Bromhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 2-carboxietilo (preparado según el ejemplo 4) Compuesto 7: Bromhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de (4-carboxifenil)metilo (preparado según el ejemplo 7) Los compuestos 2, 4 y 7 anteriores se formularon como cremas en Unguentum Merck. Los compuestos fueron probados en cantidades equimolares:
16 % (160 mg/g) del compuesto 2
16 % (160 mg/g) del compuesto 4; y
19 % (190 mg/g) del compuesto 7.
Se incluyeron en el experimento 3 grupos de ratones (5 ratones/grupo, recibiendo cada ratón de un grupo la misma formulación de crema). Se aplicaron aproximadamente 100 pL de formulación de crema en el dorso de un ratón. Los ratones se mantuvieron en la oscuridad durante 6 horas antes de la medición de la fluorescencia de la piel para evitar el fotoblanqueo. Para la evaluación de la fluorescencia de la piel, se usó una cámara de fluorescencia (Medeikonos PDD/PDT, Medeikonos AB, Gotemburgo, Suecia) y se tomaron imágenes del dorso de cada ratón. La excitación se llevó a cabo a longitudes de onda de 365 y 405 nm y 2 s de tiempo de iluminación. Cada imagen se calibró con un estándar de fluorescencia (Uranyl Standard, J&M, Analytische Mess- und Regeltechnik GmbH, Hamburgo, Alemania) y se ajustó para la fluorescencia de fondo. La cantidad media de fluorescencia de la piel en cada imagen se calculó mediante un software analizador de imágenes (MatLab 7.2.0.232, Math-Works, Natick, MA, EE. UU.) y se calculó la cantidad media de fluorescencia de la piel para cada grupo de ratones (5 ratones/compuesto).
Resultados:
Los 3 compuestos probados dieron como resultado fluorescencia de la piel con el compuesto 2, 1- clorhidrato de (isopropilcarboxi)etilo 5-amino-4-oxopentanoato, mostrando el nivel más alto de fluorescencia.
Ejemplo 17 - Estudio de fluorescencia de piel in vivo en minicerdos
El compuesto 1c (bromhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de carboximetilo, preparado según el ejemplo 1c) se formuló como una crema en Unguentum Merck (15 %, 150 mg/g; 0.56 mmol).
La crema se administró en la piel del dorso de minicerdos. Previamente a la aplicación de la crema, se limpió la piel circundante con agua estéril y gasas, si fuera necesario. Se aplicaron 0.5 g de crema a cada sitio de prueba (50 mm de diámetro) dando como resultado una capa de crema homogénea y luego se cubrió con un apósito (Tegaderm®). Se usó la gasa Vet-Flex® para mantener el apósito en su lugar.
Se evaluó la fluorescencia de la piel a 630 nm antes de la aplicación de la crema y 1.5, 5 y 12 horas después de la aplicación de la crema usando el instrumento FluoDerm (DiaMedico ApS, Dinamarca) según las instrucciones del fabricante. El instrumento FluoDerm es un dispositivo portátil para la medición objetiva in vivo en tiempo real de la fluorescencia promedio en un campo circular con un diámetro de 40 mm. Las medidas se corrigieron electrónicamente para la luz ambiental real. Los resultados se muestran en la figura 1.
Resultados:
Puede verse en la figura 1 que la fluorescencia de la piel aumentó con el tiempo.
Biopsias de piel:
La crema se administró como se describe anteriormente. En el t = 0 (es decir, antes de la administración de la crema), 1.5, 5 y 12 horas, se tomaron muestras de biopsia usando un punzón de biopsia de 10 mm (AcuPunch 10 mm, Acuderm, EE. UU.). Las muestras fueron tomadas y manipuladas en una habitación mínimamente iluminada. Cada muestra se eliminó de cualquier tejido adiposo subcutáneo y después se cortó por la mitad. A continuación, cada muestra se congeló rápidamente en nitrógeno líquido, en una bolsa de papel de aluminio o similares, y se transfirió a un congelador a -80 °C.
Las muestras de biopsia se seccionaron a 10 |im y nuevamente se tuvo cuidado de minimizar la luz circundante. Cuando pudieron identificarse las glándulas sebáceas y la epidermis, se preparó una serie de 3 secciones consecutivas de cada muestra. Las secciones se examinaron en 15 minutos en un microscopio Leica DMRXE equipado tanto para microscopía de luz ordinaria como para microscopía de fluorescencia. La epidermis y las glándulas sebáceas se localizaron mediante microscopía de luz convencional. Esto se llevó a cabo en 5 segundos y luego se cambió la fuente de luz a una lámpara de mercurio/fluorescencia con juego de filtros; filtro de excitación 390-447 nm, divisor de haz 455 nm y filtro de emisión > 600 nm. Las secciones fueron fotografiadas inmediatamente. Sin mover la muestra, la fuente de luz se cambió de nuevo a microscopía de luz convencional y las secciones se fotografiaron exactamente en la misma posición que para la microscopía de fluorescencia. Además de la epidermis y las glándulas sebáceas, se analizó la dermis y si se encontró fluorescencia también se fotografió. Para investigar más a fondo la localización de todas las estructuras analizadas, las secciones se tiñeron con hematoxilina/eosina. El análisis de imágenes se realizó usando el programa de software Image J (versión Fiji-win32.exe). Con este programa, se midió la intensidad de fluorescencia promedio por píxel de las imágenes guardadas.
Resultados:
Después de 1.5 horas, ya se podía ver la fluorescencia en las glándulas sebáceas, y después de 5 horas, la fluorescencia también se vio en la epidermis. El compuesto 1c muestra de este modo una selectividad por las glándulas sebáceas y, por tanto, puede ser útil para el tratamiento fotodinámico de enfermedades que afectan a las glándulas sebáceas, tales como acné, queratosis pilaris, hiperplasia sebácea, carcinoma de glándulas sebáceas o adenoma sebáceo.
Ejemplo 18 - Estudio de fluorescencia cutánea in vivo en ratones desnudos sanos y ratones desnudos con piel dañada por UV.
Se llevó a cabo un experimento para evaluar el potencial del compuesto 6 para mostrar una acumulación selectiva en la piel dañada por UV. Para la evaluación, la fluorescencia de la piel después de la aplicación del compuesto se midió in vivo en piel de ratón sana y en piel de ratón dañada por UV. Se estableció un modelo de ratones desnudos con piel dañada por UV (daño actínico) como se describe por K. Togsverd-Bo et al., Exp. Dermatol. 2012, 21, 260 264.
Cantidades equimolares del compuesto 2 (clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 1 -(isopropilcarboxi)etilo preparado según el ejemplo 2) y compuesto 5 (clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 3-carboxipropilo
preparado según el ejemplo 5) se formularon como crema en Unguentum Merck: compuesto 2: 16 %, 160 mg/g y compuesto 5: 14 %, 140 mg/g, respectivamente.
Se incluyeron en el experimento un grupo de ratones desnudos sanos (10 ratones, grupo de control) y un grupo de ratones desnudos con piel dañada por UV (10 ratones). Se aplicaron aproximadamente 125 |iL de formulación de crema sobre el dorso de cada ratón. Antes de la aplicación de la crema, se despegó la piel dorsal de cada ratón cinco veces para potenciar la penetración del compuesto: se presionó una película adhesiva (cinta adhesiva, 3M) sobre la piel del área de aplicación, se retiró la tira de cinta con un rápida movimiento y se usó una nueva tira de cinta. Los ratones se mantuvieron en la oscuridad durante 3 horas antes de la medición de la fluorescencia de la piel para evitar el fotoblanqueo. Se evaluó la fluorescencia de la piel como se describe en el ejemplo 17 y se calculó la cantidad media de fluorescencia de la piel para cada grupo de ratones.
Resultados:
Se determinó la proporción entre la fluorescencia de la piel [a.u.] en piel de ratón dañada por UV y la fluorescencia de la piel [a.u.] en piel sana de ratón.
La proporción para el compuesto 2 fue 1.14 mientras que la proporción para el compuesto 5 fue 2.72. Por lo tanto, el compuesto 2 muestra alguna selectividad para la piel dañada por los rayos UV mientras que el compuesto 5 muestra una selectividad pronunciada para la piel dañada por los rayos UV.
Ejemplo 19 - Eficacia de la PDT en bacterias
La eficacia de diversos compuestos según la invención para matar bacterias a través de una reacción fotodinámica fue investigada en la bacteria Gram positiva Staphylococcus aureus.
Se probaron los siguientes compuestos de la invención:
Compuesto 1c: Bromhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de carboximetilo (preparado según el ejemplo 1c) Compuesto 4: Bromhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 2-carboxietilo (preparado según el ejemplo 4) Cepa bacteriana: cepa de S. aureus DSM 20231 (ATCC 12600). La cepa bacteriana se cultivó durante 24 horas en agar infusión de corazón (Difco) a 35-37 °C antes de realizar el experimento y se volvió a suspender en PIPES 20 mM, pH 7.2-7.4 a una concentración correspondiente a un estándar McFarland 0.5 (aproximadamente 1-5 x 108 CFU/mL). Con el fin de garantizar cultivos celulares viables y comprobar el tamaño y la pureza del inóculo, se prepararon stocks bacterianos inmediatamente antes de la experimentación y se determinaron las CFU/mL en un ensayo de colonia estándar.
Toxicidad en la oscuridad: "Toxicidad en la oscuridad", es decir, el efecto tóxico de los compuestos en ausencia de luz (y, por lo tanto, no relacionado con los efectos de la PDT), puede incluir la muerte de células bacterianas y, por lo tanto, puede interferir con la medición precisa del efecto de la PDT, que también resulta en la muerte celular bacteriana. La toxicidad en la oscuridad se puede medir determinando la toxicidad de cada compuesto en las mismas condiciones experimentales, pero en ausencia de luz, evitando así cualquier efecto PDT. El uso de los compuestos de la invención en condiciones que producen baja toxicidad en la oscuridad es ventajoso porque los efectos de la toxicidad en la oscuridad también podrían incluir dañar o matar células no diana e interferir con el propio tratamiento de PDT. En vista de estas consideraciones, un agente óptimo para su uso en la eliminación de células bacterianas mediada por PDT debe mostrar tanto una baja toxicidad oscura como una alta potencia para inducir un efecto fotodinámico para eliminar las células bacterianas diana.
La toxicidad en la oscuridad se determinó como se describe en el párrafo "tratamiento con PDT" a continuación, excepto que la placa no estaba iluminada. Posteriormente, se llevó a cabo un ensayo en microplaca como se describe a continuación.
La toxicidad en la oscuridad de los compuestos 1c y 4 se probó a concentraciones de 0.001, 0.1, 1 y 10 mM. sin oscuridad se observó toxicidad a cualquiera de estas concentraciones.
Tratamiento con PDT: se prepararon soluciones madre de los compuestos 1c y 4 en DMSO a 100 mM. Antes del experimento, se pipetearon 0.02 mL de DMSO (control) o solución madre de los compuestos 2 y 3 en pocillos de VisiPlates-24 para obtener concentraciones de 0.01 mM, 0.1 mM y 1 mM. A cada pocillo se le agregaron 2 mL del cultivo madre bacteriano seguido de mezcla con una pipeta automática. Todos los pocillos contenían una concentración final de DMSO al 1 %. Después de 4 horas de incubación, la placa se iluminó con luz roja (lámpara Aktilite® CL128) durante 32 minutos (dosis de luz 148 J/cm2). Para conseguir una iluminación uniforme de todos los pocillos, la placa se iluminó desde abajo (pocillos de fondo plano) mientras se aplicaba un pequeño movimiento circular dentro del campo de la lámpara.
Ensayo de microplacas: después de la iluminación, todo el contenido de los pocilios se transfirió a tubos Eppendorf y se reintrodujeron 0.1 mL del contenido en los pocillos de una microplaca. Al inóculo reintroducido se le agregó 1.5 mL de caldo de infusión de corazón (Difco) para la generación de curvas de crecimiento. Todas las transferencias se realizaron mediante una mezcla completa de los contenidos mediante pipeteo.
Las placas se incubaron a 37 ± 1 °C aplicando la función de temperatura de un contador Victor 1420 Multilabel. (Perkin Elmer, Turku, Finlandia). Las curvas de crecimiento se generaron midiendo la absorbancia a 595 nm a intervalos regulares hasta que las células bacterianas entraron en la fase logarítmica de crecimiento. Las mediciones fueron realizadas automáticamente por el Multilabel Counter.
Los datos sin procesar se representaron en ejes semilogarítmicos (log10 de absorbancia frente al tiempo (1 unidad = 15 min)) para determinar el tiempo después de la inoculación en el que las células bacterianas entran en la fase logarítmica de crecimiento (es decir, la duración de la fase de latencia). La duración de la fase de latencia depende del número de células supervivientes y aumenta proporcionalmente a la eficacia del tratamiento fotodinámico.
Resultados:
Los resultados se muestran en la figura 2 en la que se puede ver que ambos compuestos fueron efectivos para matar S. aureus y fueron capaces de retrasar eficazmente el nuevo crecimiento de las células bacterianas.
Ejemplo 20 - Prueba de Ames
La prueba de Ames (véase B.N. Ames et al, Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test. Mutation Research 31, 347-364, 1975) es un método de prueba estándar aprobado por las autoridades reguladoras para detectar la capacidad de un compuesto químico de prueba para inducir mutaciones en ciertas cepas bacterianas. Si un compuesto químico de prueba induce tales mutaciones, no se puede usar en un compuesto farmacéutico para su uso en humanos.
El objetivo de este estudio fue evaluar el potencial mutagénico y el potencial fotomutagénico del compuesto 1c, bromhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de carboximetilo (preparado según el ejemplo 1c) mediante el examen de su capacidad para revertir dos cepas de Salmonella typhimurium que requieren histidina, TA98 y TA100, en ausencia y presencia de un sistema metabolizante hepático de rata (S-9) y también en ausencia y presencia de luz visible. Este último se evaluó ya que el compuesto 1c es absorbido por las células bacterianas y convertido en un fotosensibilizante que, al iluminar dichas células, podría inducir productos mutagénicos.
Los resultados muestran que el compuesto 1c no indujo mutación o fotomutación en esas dos cepas de Salmonella typhimurium, cuando se ensayaron en las condiciones empleadas para este estudio.
Ejemplo 21 - Estudio de fluorescencia PplX in vitro en células cancerosas
Se llevó a cabo un estudio para evaluar el potencial de los compuestos de la invención como precursores de fotosensibilizantes. Como tal, los compuestos de la invención deben ser absorbidos por las células y deben convertirse en fotosensibilizantes, es decir, PplX. El resultado de este procedimiento se puede visualizar exponiendo las células a la luz que excita las moléculas de PplX y determinar la cantidad de energía que se libera en forma de fluorescencia cuando las moléculas de PplX excitadas se relajan a un estado energéticamente más bajo.
Se probaron los siguientes compuestos de la invención:
Compuesto 5 (clorhidrato de 5 amino-4-oxopentanoato de 3-carboxipropilo preparado según el ejemplo 5) Compuesto 9 (clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 5-carboxipentilo preparado según el ejemplo 9) Compuesto 10 (clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 7-carboxiheptilo preparado según el ejemplo 10) Compuesto 12 (clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 9-carboxinonilo preparado según el ejemplo 12) Compuesto 14 (clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 11-carboxiundecilo preparado según el ejemplo 14) Compuesto 15 (clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 15-carboxipentadecilo preparado según el ejemplo 15) Los siguientes compuestos se usaron como compuestos de referencia:
Clorhidrato de 5-ALA (ALA)
Clorhidrato de éster hexílico de 5-ALA (HAL)
Las soluciones madre de los compuestos anteriores se prepararon disolviéndolas en DMSO a una concentración de 100 mM. Las concentraciones usadas en los experimentos se obtuvieron diluyendo las soluciones madre con PBS o medio de cultivo celular.
Cultivo celular y tratamiento de células con compuestos y referencias:
Se subcultivaron células WiDr derivadas de un adenocarcinoma primario del colon rectosigmoide en medio RPMI 1640 (Gibco) que contiene 10 % de suero de ternero fetal, 100 U/mL de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina y 1 % de glutamina. Las células se dividieron 1:100 dos veces por semana y se mantuvieron a 37 °C y 5 % de CO2 en un ambiente húmedo.
Para llevar a cabo los experimentos, se agregaron 5X105 células WiDr en 2 ml del medio descrito anteriormente a cada pocillo de las placas plásticas de cultivo de tejidos de 6 pocillos (Nunc) y se dejaron durante 48 h a 37 °C y 5 % de CO2 en un ambiente húmedo para una correcta fijación al sustrato. A continuación, las células se lavaron dos veces con medio RPMI 1640 sin suero, seguido de la adición a los pocillos de las diluciones apropiadas de los compuestos y las referencias anteriores en 2 ml de medio de cultivo fresco hasta concentraciones finales de 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3 y 1 mM por duplicado. A dos pocillos, solo se agregaron 2 ml de medio de cultivo fresco. Estas células no tratadas sirvieron como control. Las células se incubaron a 37 °C, durante cuatro horas en la oscuridad.
Toxicidad en la oscuridad:
La toxicidad en la oscuridad, es decir, la toxicidad celular en ausencia de luz, se midió mediante el ensayo MTS inmediatamente después de las 4 horas de incubación descritas anteriormente con los compuestos y las referencias a diversas concentraciones. Para el clorhidrato de ALA y los compuestos 5, 9, 10, 12 y 14 no se observó toxicidad celular para ninguna de las concentraciones probadas. Para el clorhidrato de éster hexílico, se observó una toxicidad celular débil en el intervalo de 0.3 a 1 mM con una tasa de supervivencia celular mínima del 85 %. El compuesto 15 fue tóxico en concentraciones superiores a 0.1 mM.
Formación de PplX:
Después del tratamiento con los compuestos de la invención y los compuestos de referencia como se describe anteriormente, las células se lavaron dos veces con PBS y se rasparon del sustrato con un raspador de células Costar en una solución de HCO41M en metanol al 50 %.
Los restos celulares se eliminaron por centrifugación. PplX se extrajo cuantitativamente de las células con este procedimiento. El contenido de PplX en cada muestra se determinó fluorométricamente usando un espectrofluorímetro Perkin Elmer LS50B. PplX se excitó a 407 nm y la fluorescencia emitida se midió a 606 nm usando un filtro de corte de paso largo (530 nm) en el lado de emisión. Se agregó a las muestras un patrón de concentración conocida de PplX a concentraciones que aumentaban la fluorescencia total en un 50-100 %. La concentración de PplX en cada muestra se calculó en relación con el contenido de proteína en las células de control medido mediante un ensayo de proteína de ácido bicinconínico.
Resultados de la formación de PplX:
Los resultados muestran que todos los compuestos probados son agentes fotosensibilizantes útiles en células cancerosas, es decir, tienen una potencial para ser usado en el tratamiento fotodinámico del cáncer: todos los compuestos probados se convierten en PplX en las células cancerosas y las concentraciones a las que se forma un
máximo de PplX no son tóxicos para las células, es decir, no hay toxicidad oscura observado a tales concentraciones. Hay una tendencia de que la concentración máxima de PplX tiende a ocurrir en concentraciones más bajas para los compuestos de cadena más larga.
Ejemplo 22 - Estudio de fluorescencia PplX in vitro en células de vejiga de rata
El clorhidrato de éster hexílico de 5-ALA (HAL) es el ingrediente activo de Hexvix®, un fármaco disponible comercialmente para la detección fotodinámica del cáncer de vejiga. Los estudios de investigación también muestran el uso de Hexvix® para el tratamiento fotodinámico del cáncer de vejiga. HAL se convierte en PplX en células de cáncer de vejiga y se puede detectar por su fluorescencia característica. Los primeros estudios en el desarrollo de Hexvix® se llevaron a cabo en células y tejido de vejiga de rata como modelo para células y tejido de vejiga humana. Este estudio se llevó a cabo como una primera etapa para evaluar el potencial de los compuestos de la invención como precursores de fotosensibilizantes que se pueden usar en la vejiga. En tal primera etapa, la concentración apropiada para los compuestos se establece in vitro comparando la fluorescencia PplX de los compuestos con la de HAL. En base a los resultados, se establece la concentración para un futuro estudio in vivo. Se probaron los siguientes compuestos:
Compuesto 4: Bromhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 2-carboxietilo (preparado según el ejemplo 4) Compuesto 5: (Clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 3-carboxipropilo preparado según el ejemplo 5) Compuesto 8: Clorhidrato de 5-amino-4-oxopentanoato de 2-carboxibutilo preparado según el ejemplo 8)
Se usó clorhidrato de éster hexílico de 5-ALA (HAL) como compuesto de referencia.
Mediciones de PplX en células de vejiga de rata:
Se cultivaron células de vejiga de rata (AY-27) en el medio de cultivo (RPMI 1640 suplementado con suero de ternero fetal al 9 %, L-glutamina al 1 % (200 mM) y penicilina al 1 % (10000 UI), estreptomicina (10 000 pg.mL'1). Las células en crecimiento exponencial (AY-27) se incubaron durante 2 horas con soluciones recién preparadas de 0.8 mM HAL (que es una décima parte de la concentración que se usa para la detección de cáncer de vejiga en pacientes humanos) y soluciones recién preparadas de los compuestos 4, 5 y 8 a concentraciones de 3 - 15 mM (véase la tabla a continuación). Las células de control recibieron medio sin suero sin ningún compuesto de prueba o de referencia. Después de la incubación, las soluciones o el medio se descartaron y las células se enjuagaron 2 veces con PBS enfriado con hielo. Se extrajo PplX de las células usando una mezcla de extracción de lisis enfriada con hielo, que constaba de etanol/DMSO/ácido acético (80/20/1, v/v/v). El lisado celular se centrifugó (400 g, 10 min, 2 °C), las pellas se trituraron y la suspensión se sonicó durante 15 min antes de centrifugarla. La señal de fluorescencia de PplX se midió con un espectrómetro Perkin-Elmer LS 55 (Perkin-Elmer, Beaconsfield, Reino Unido) y se expresó en función del contenido de proteína. La intensidad de fluorescencia a 635 nm en cada muestra se informó en una curva de calibración establecida con PplX (Sigma-Aldrich, Francia) diluida en la mezcla de extracción como se describe anteriormente. La concentración de PplX se expresó en relación con el contenido de proteína. Brevemente, se agregó una mezcla de solución reguladora de lisis (EDTA 1 mM, Triton X-100 al 1 % y Tris-HCl 10 mM; pH 7.4) a placas de células congeladas junto con solución de PMSF (antiproteasa) 500 mM en DMSO. Los lisados se mantuvieron en hielo durante 30 minutos y se centrifugaron a 4 °C, durante 20 minutos a 15000 g.
A continuación, se midió el contenido de proteínas frente a una curva de calibración de BSA mediante un kit de ensayo de proteínas Biorad DC (Bio-Rad, Francia) en base a un método desarrollado por Lowry.
Todos los experimentos se realizaron en 4 - 5 réplicas bajo luz tenue. Para concentraciones de compuestos > 1 mM, la citotoxicidad se evaluó con la prueba MTT. Las células en crecimiento exponencial se incubaron con solución o medio recién preparado como se describe anteriormente durante 2 horas en placas de 96 pocillos. Después de la incubación, las soluciones o el medio se desecharon y las células se lavaron dos veces con PBS. Luego se agregaron 50 pl de MTT (2.5 mg.ml'1) a 150 pl de medio RPMI libre de suero por pocillo y se incubó durante 3 horas. La absorbancia se midió disolviendo cristales de formazán con 50 pl de DMSO. La absorbancia se normalizó a la de las células de control.
(continuación)
Se puede ver en la tabla que HAL, que se usó como referencia, generó alrededor de 304 pmol PpIX/mg de proteína con un nivel de citotoxicidad aceptable del 15 %.
El compuesto 4 indujo concentraciones de PplX que fueron significativamente más bajas en comparación con HAL a aproximadamente la misma concentración (1 mM). Aproximadamente la mitad de la concentración PplX de HAL se obtuvo con aproximadamente 6 veces la concentración (es decir, 5 mM). A mayor concentración, se indujo citotoxicidad.
Los compuestos 5 y 8 indujeron concentraciones de PplX que eran similares a las de HAL a concentraciones comparables (es decir, 1 mM) y a 5 mM. Los niveles de citotoxicidad también fueron comparables y aceptables a 1 mM. Por tanto, los compuestos 5 y 8 son candidatos prometedores para su uso como precursores de fotosensibilizantes en PDD y PDT en la vejiga.
Experimentos de pH:
La vejiga es sensible a un pH bajo, mientras que los compuestos de la invención (y los ésteres de ALA en general) forman pirazinas a un pH más alto. Por tanto, una solución de los compuestos de la invención no debe dar como resultado un pH que no sea tolerable para la vejiga.
El efecto de los compuestos de prueba sobre el pH en el medio se probó agregando los compuestos a 1,5 y 25 mM al medio RPMI 1640 seguido de la medición del pH. Se encontró que los compuestos a 1 mM no cambiaron el pH en el medio mientras que los compuestos a 5 y 25 mM cambiaron el pH desde 7.5 a 7.1 y 5.5, respectivamente. Trazando los datos se encontró por interpolación que los compuestos a 15 mM darían como resultado un pH de 6.0. Por debajo de pH 6, pueden ocurrir efectos adversos en la vejiga (contracciones, etc.). 15 mM está muy por encima de la concentración anticipada de 10 mM para estudios in vivo (en base a las experiencias con HAL y la suposición de que se usará in vivo 10 veces la concentración in vitro).
Claims (15)
1. Un compuesto de fórmula general I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en la que
R1 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo o cicloalquilo opcionalmente sustituido;
R2, cada uno de los cuales puede ser igual o diferente, representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo opcionalmente sustituido; y
X es un grupo alquileno de cadena lineal o ramificada, un grupo cicloalquileno, arileno o aralquileno, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre halo, nitro y arilo, en el que el arilo está opcionalmente sustituido con uno o más grupos halo, alquilo, haloalquilo, alcoxi o nitro.
2. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R1 es hidrógeno o un grupo alquileno corto, de cadena lineal o ramificado, preferiblemente metilo, etilo, n-propilo o isopropilo.
3. Un compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que X es un grupo alquileno de cadena lineal que consiste en 1 a 16 átomos de carbono.
4. Un compuesto según la reivindicación 3, en el que X es un grupo alquileno de cadena lineal que consiste en 1 a 6 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono.
5. Un compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el grupo X es un grupo alquileno C1-4 de cadena lineal opcionalmente sustituido, un grupo alquileno C2-6 ramificado opcionalmente sustituido, un grupo cicloalquileno C5-6 opcionalmente sustituido, un grupo arileno C6-12 opcionalmente sustituido, o un grupo aralquileno C7-15 opcionalmente sustituido.
6. Un compuesto según cualquier reivindicación anterior, en el que cada R2 representa hidrógeno.
7. Un compuesto según la reivindicación 1, que es un compuesto seleccionado de cualquiera de los siguientes, o un compuesto farmacéuticamente sal aceptable de los mismos:
8. Una composición que comprende un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, junto con al menos un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable o cosméticamente aceptable
9. Una composición según la reivindicación 8, en la que el compuesto de fórmula I es uno en el que X es un grupo alquileno de cadena lineal que consiste en 1 a 16 átomos de carbono.
10. Una composición según la reivindicación 9, en la que el compuesto de fórmula I es uno en el que X es un grupo alquileno de cadena lineal que consiste en 1 a 6 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono.
11. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 para su uso en un método de tratamiento o diagnóstico fotodinámico.
12. Un compuesto para su uso según la reivindicación 11, en el tratamiento o diagnóstico de un trastorno o anomalía de una superficie externa o interna del cuerpo que responde al tratamiento o diagnóstico fotodinámico.
13. Un compuesto o composición para su uso según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en el que dicho método es para el tratamiento o diagnóstico de cáncer (por ejemplo, cáncer de vejiga, cáncer de colon o cáncer de estómago); una infección asociada con el cáncer, tal como una infección viral (por ejemplo, virus del papiloma humano, hepatitis B o virus de Epstein Barr); una infección viral, bacteriana o fúngica (por ejemplo, infección por Helicobacter pylori o acné); o una condición no cancerosa tal como inflamación (por ejemplo, acné inflamatorio, colitis o dermatitis infecciosa).
14. Un compuesto o composición para su uso según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en el que dicho método es para el tratamiento o diagnóstico de cáncer.
15. Un compuesto según la reivindicación 3 o la reivindicación 4 o una composición según la reivindicación 9 o la reivindicación 10 para su uso en un método de tratamiento o diagnóstico fotodinámico de cáncer.
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