ES2907751T3 - Preparaciones placentarias acelulares - Google Patents

Abstract

Una composición derivada de placenta que comprende un extracto acelular de tejido placentario y uno o más inhibidores de proteasas exógenos, en donde el tejido placentario comprende un disco placentario.

Description

DESCRIPCIÓN

Preparaciones placentarias acelulares

Campo

En el presente documento se describen composiciones biológicas, métodos de hacer composiciones, y métodos de usar composiciones. En formas de realización, una composición deriva de un tejido de placenta.

Antecedentes

La placenta humana conecta el feto con la pared uterina de la madre y es responsable de la protección y desarrollo del feto eficazmente desde la concepción hasta el momento del nacimiento.

Se han divulgado composiciones placentarias que comprenden células placentarias y otros componentes placentarios derivados de tejido de placenta en el documento WO 2015/171142. El documento US 2007/0071740 se dirige a composiciones de membrana amniótica y el uso de las mismas. Se divulgan métodos de fabricación de productos de membrana amniótica inmunocompatibles en el documento US 2011/0206776. El documento WO 2008/060377 divulga composiciones fabricadas a partir de membrana amniótica, membrana de cordón umbilical, o ambas. Kim et al. (Experimental Eye Research, 70(3), p.329-337) divulga el uso de material de membrana amniótica para el tratamiento de lesiones oculares.

Compendio

La presente invención se refiere a las siguientes formas de realización:

1. Una composición derivada de placenta que comprende un extracto acelular de tejido placentario y uno o más inhibidores de proteasa exógenos, en donde el tejido placentario comprende un disco placentario.

2. La composición derivada de placenta de la forma de realización 1, en donde el uno o más inhibidores de proteasa comprende clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenesulfonilo (AEBSF), aprotinina pulmonar bovina, N-(trans-epoxisuccinil)-L-leucina 4-guanidinobutilamida, leupeptina, N-etilmaleimida (NEM), fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol-bis-(2-aminoetil(éter)NNN'N'-tetraacético, cloruro de amonio, boceprevir, danoprevir, narlaprevir, telaprevir, o vaniprevir.

3. La composición derivada de placenta de cualquiera de las formas de realización 1-2, en donde el tejido placentario además comprende corion velloso.

4. La composición derivada de placenta de cualquiera de las formas de realización 1-3, en donde la composición comprende mayores cantidades de concentración de interleuquinas relativo a una composición derivada de placenta de cualquiera de las formas de realización 1-3 que se prepara en ausencia de inhibidores de proteasas exógenos.

5. Una preparación placentaria acelular que comprende un tejido placentario y uno o más inhibidores de proteasa exógenos, en donde el tejido placentario comprende un disco placentario, dicha preparación es obtenible por el siguiente proceso:

(1) homogenización del tejido placentario;

(2) lisis celular para generar restos celulares sólidos y un fluido acelular;

(3) separación del fluido acelular de los restos celulares sólidos; y

(4) liofilización y/o congelación del fluido acelular.

6. La preparación placentaria de la forma de realización 5, en donde el uno o más inhibidores de proteasa se añaden antes de la homogenización.

7. La preparación placentaria de cualquiera de las formas de realización 5-6, en donde el uno o más inhibidores de proteasa comprende clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenesulfonilo (AEBSF), aprotinina pulmonar bovina, N-(trans-epoxisuccinil)-L-leucina 4-guanidinobutilamida, leupeptina, N-etilmaleimida (NEM), fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol-bis-(2-aminoetil(éter)NNN'N'-tetraacético, cloruro de amonio, boceprevir, danoprevir, narlaprevir, telaprevir, o vaniprevir.

8. La preparación placentaria de cualquiera de las formas de realización 5-7, en donde el tejido placentario además comprende corion velloso.

9. La preparación placentaria de cualquiera de las formas de realización 5-8, que además comprende diluyentes, excipientes o soportes.

10. La preparación placentaria de cualquiera de las formas de realización 5-9, en donde la preparación comprende mayores cantidades de concentración de interleuquinas relativo a una preparación placentaria de cualquiera de las formas de realización 5-9 que se prepara en ausencia de inhibidores de proteasas exógenos.

11. La preparación placentaria de cualquiera de las formas de realización 5-10, en donde los inhibidores no se eliminan de la preparación placentaria.

12. Un método de hacer un producto placentario acelular que comprende:

(1) añadir uno o más inhibidores de proteasas exógenos a tejido placentario, en donde el tejido placentario comprende un disco placentario;

(2) homogenizar el tejido placentario;

(3) lisar el tejido placentario para generar restos celulares sólidos y un fluido acelular;

(4) separar el fluido acelular de los residuos celulares sólidos; y

(5) liofilizar y/o congelar el fluido acelular.

13. El método de la forma de realización 12, en donde el uno o más inhibidores de proteasa comprende clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenesulfonilo (AEBSF), aprotinina pulmonar bovina, N-(trans-epoxisuccinil)-L-leucina 4-guanidinobutilamida, leupeptina, N-etilmaleimida (NEM), fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol-bis-(2-aminoetil(éter)NNN'N'-tetraacético, cloruro de amonio, boceprevir, danoprevir, narlaprevir, telaprevir, o vaniprevir.

14. El método de la forma de realización 12 o 13, que además comprende filtrar el fluido acelular.

15. La composición o preparación placentaria de cualquiera de las formas de realización 1 a 11 para uso en tratar a un individuo que tiene una enfermedad seleccionada del grupo que comprende artritis, cicatrización, tratamiento de cicatrices, crecimiento de tejido, cicatrización de tejido, regeneración/reparación de matriz tisular, injerto, inflamación y afecciones asociadas con modular la señalización de TGF-p y otras proteínas placentarias.

La presente divulgación se refiere a composiciones y métodos asociados de preparar y usar productos/composiciones de tejido placentario. El tejido placentario incluye el disco placentario y el saco amniótico. El saco amniótico comprende dos capas principales, el corion y el amnios.

En una forma de realización, la composición descrita en el presente documento comprende inhibidores de proteasas. En algunas formas de realización, los inhibidores de proteasas se pueden añadir al tejido placentario durante el proceso de purificación y pueden no eliminarse.

En ciertas formas de realización, el tejido placentario se procesa para aislar proteínas deseables y quimioquinas del tejido placentario. En una forma de realización de la presente divulgación, un método comprende añadir inhibidores de proteasas a un producto placentario y después administrar una o más de homogenización macroscópica y lisis celular. En algunas formas de realización, el método además comprende separación del fluido de componentes celulares sólidos, filtración, liofilización y/o congelación.

En ciertas formas de realización, las composiciones descritas en el presente documento se pueden usar en el tratamiento de artritis, cicatrización, tratamiento de cicatrices, crecimiento y cicatrización de tejido, regeneración/reparación de matriz tisular, injerto, inflamación y afecciones asociadas con modular la señalización de TGF-p y otras proteínas.

La composición y métodos de la presente divulgación pueden ser deseables debido a las elevadas concentraciones de proteínas relativo a las composiciones convencionales que no usan inhibidores de proteasas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra las cantidades de concentración de proteína de interleuquina 2 y proteína inflamatoria de macrófagos 3 de tejido placentario tanto en presencia como ausencia se inhibidores de proteasa.

La figura 2 muestra las cantidades de concentración de proteína de proteína quimiotáctica de granulocitos 2, proteína quimiotáctica de monocitos 1, y proteína inflamatoria de macrófagos 1 de tejido placentario tanto en presencia como ausencia se inhibidores de proteasa.

La figura 3 muestra las cantidades de concentración de proteína de interleuquina 8 de tejido placentario tanto en presencia como ausencia se inhibidores de proteasa.

La figura 4 muestra las cantidades de concentración de proteína de factor inhibidor de macrófagos de tejido placentario tanto en presencia como ausencia se inhibidores de proteasa.

La figura 5 muestra los resultados de un ensayo de cicatrización usando homogenizado placentario humano (HPH) en presencia de un control negativo sin suero (A), en presencia de suero que se ha purificado en presencia de inhibidores de proteasas (B), y en presencia de suero que se ha purificado en ausencia de inhibidores de proteasas (C). Como se usan en el presente documento, los términos purificado y aislado son intercambiables.

La figura 6 muestra las cantidades de concentración de proteína en una composición placentaria con inhibidores de proteasa, fluido amniótico a término, y fluido amniótico de la semana 16-20.

Descripción detallada de la invención

La presente divulgación se refiere a composiciones y métodos asociados de preparar productos/composiciones de tejido placentario. La placenta humana conecta el feto con la pared uterina de la madre y es responsable de la protección y desarrollo del feto eficazmente desde la concepción hasta el momento del nacimiento. Durante la gestación, la placenta ayuda a que el feto se desarrolle proporcionando nutrientes y oxígeno, realizando algunas funciones de inmunidad, y liberando factores de crecimiento y citoquinas, proteínas pequeñas que actúan para dirigir la migración celular.

Durante la gestación, la placenta proporciona nutrientes, factores de crecimiento, y citoquinas al feto a través del cordón umbilical y el líquido amniótico. Tanto el feto como la placenta expresan antígenos que son distintos de la madre, y aun evitan ser rechazados por el sistema inmunitario materno durante la gestación. Las células residuales, propiedades de transporte, y respuesta inmunitaria limitada del tejido placentario ayudan a hacerlo deseable y/o ventajoso para utilizar tejido placentario en aplicaciones médicas.

El tejido placentario se puede recoger típicamente después de una cirugía de cesárea electiva. El tejido placentario también se puede recoger después de un parto vaginal normal. El tejido se puede usar sin modificar en algunas aplicaciones. Sin embargo, sería ventajoso mejorar el desempeño del tejido placentario para aplicaciones médicas mejoradas. Por ejemplo, es ventajoso y/o deseable aislar proteínas, factores de crecimiento y quimioquinas del tejido placentario, para varias aplicaciones médicas.

Para fines de describir ciertas formas de realización de la presente divulgación, se hace referencia en el presente documento a tejido placentario humano. Formas de realización de la presente divulgación, sin embargo, no están limitadas a comprender tejido placentario humano natural. Formas de realización de la presente divulgación pueden incluir, pero no están limitadas a: tejido de placenta humano natural o sintético; tejido de placenta de mamífero natural o sintético; tejido de placenta natural o sintético de otros animales, por ejemplo, bovino, equino, porcino, ovis, capra, o camélido; y/o composiciones naturales y/o sintéticas que tienen propiedades similares al tejido de placenta.

El tejido placentario comprende el disco placentario, el saco amniótico, y el cordón umbilical, sus vasos y gelatina de Wharton que amortigua los vasos del cordón umbilical. El saco amniótico comprende el corion externo y el amnios interno. El corion comprende una capa reticular, capa basal, y capa trofoblasto. La capa trofoblasto puede estar adherida a la decidua materna. El cordón umbilical conecta la placenta al feto, y puede transportar sangre oxigenada y nutrientes al feto. Mucho del disco placentario está compuesto de vellosidades coriónicas, que son extensiones del árbol velloso coriónico. Mediante estas estructuras, se puede producir la nutrición fetal y el intercambio de citoquinas y factores de crecimiento fetales y maternos.

Las vellosidades de la placenta están compuestas de tres capas de componentes con diferentes tipos celulares en cada una: (1) sincitiotrofoblastos/citotrofoblastos que pueden recubrir la superficie entera del árbol velloso y bañar en sangre materna en el espacio intervelloso; (2) células mesenquimatosas, macrófagos de origen mesenquimatoso (células de Hofbauer), y fibroblastos que pueden estar localizados en el estroma central velloso entre los trofoblastos y vasos fetales; y (3) células vasculares fetales que incluyen células de músculo liso vasculares, células perivasculares (pericitos), y células endoteliales. Las células de Hofbauer pueden sintetizar VEGF y otros factores proangiogéncos que inician la vasculogénesis en la placenta.

Tanto el feto como la placenta pueden expresar antígenos que son diferentes de los de la madre, y aun evitan ser rechazados por el sistema inmunitario materno durante la gestación. Se cree que la respuesta inmunitaria limitada del tejido placentario ayuda a la placenta a evitar rechazo fetal durante la gestación.

Las propiedades de transporte, células residuales, y respuesta inmunitaria limitada del tejido placentario ayudan a hacerlo deseable para utilizar tejido placentario en aplicaciones médicas. El tejido placentario se puede recoger típicamente después de una cirugía de cesárea electiva. El tejido placentario también se puede recoger después de un parto vaginal normal. El tejido placentario se puede obtener a través de bancos de tejidos registrados en la FDA. El tejido se puede usar sin modificar en algunas aplicaciones. Sin embargo, sería ventajoso mejorar el desempeño del tejido placentario para aplicaciones médicas mejoradas.

Los productos/composiciones placentarias descritos en el presente documento pueden tener propiedades beneficiosas relativas a esas preparaciones placentarias del estado de la técnica. Por ejemplo, los productos/composiciones placentarias de la presente divulgación incluyen inhibidores de proteasas que se añaden al tejido placentario durante el proceso de purificación y no se eliminan. Los métodos de la divulgación incluyen el tratamiento de artritis, cicatrización, tratamiento de cicatrices, crecimiento y cicatrización de tejido, injerto, inflamación y afecciones asociadas con modular la señalización de TGF-p y otras proteínas.

Hasta la fecha, varias preparaciones se han purificado de la placenta que se han usado para una variedad de fines tales como tratar inflamación, tratamiento de cicatrices, modular la señalización de TGF-p, tratar apoptosis y estados asociados. Sin embargo, porque las agencias reguladoras gubernamentales pueden requerir condiciones de ensayo más rigurosas y ensayos clínicos más extensos cuando se añaden aditivos exógenos a preparaciones (tal como aditivos a varias preparaciones amnióticas o placentarias), los expertos en la materia han sido reacios a incluir estos aditivos en preparaciones purificadas debido al coste añadido, requisitos reguladores añadidos, así como otros factores. Sin embargo, las preparaciones creadas por otros que no han podido incluir y/o contemplan incluir estos aditivos también ha fracaso desgraciadamente en revelar el verdadero potencial valor/usos de estas preparaciones. Es con estas deficiencias en mente que la presente divulgación se desarrolló.

Composiciones placentarias

En formas de realización, la presente divulgación se refiere a productos y composiciones de tejido placentario. El tejido placentario como se usa en el presente documento comprende tejido de corion frondoso, tejido de decidua basal y/o tejido de interconexión, que puede ser en todo o en parte. En algunas formas de realización, las composiciones descritas en el presente documento tienen propiedades beneficiosas relativas a preparaciones placentarias convencionales del estado de la técnica. Por ejemplo, en algunas formas de realización, los productos/composiciones placentarias descritas en el presente documento comprenden inhibidores de proteasas que se añaden al tejido placentario durante el proceso de purificación. En algunas formas de realización, los inhibidores de proteasas pueden permanecer en el producto placentario.

En una forma de realización, los inhibidores de proteasas se pueden eliminar antes de usar el producto placentario para tratar a un individuo que padece varias afecciones, incluyendo, artritis, cicatrización, tratamiento de cicatrices, crecimiento y cicatrización de tejido, injerto, inflamación y afecciones asociadas con modular la señalización de TGF-p y otras proteínas. Por ejemplo, al emplear una columna que tiene anticuerpos que específicamente se unen a los inhibidores de proteasas, los inhibidores de proteasas se pueden eliminar antes del tratamiento de dicho individuo. Como se usa en el presente documento, los términos, malestares, enfermedades y afecciones se pueden usar de forma intercambiable.

En una forma de realización, la presente divulgación se refiere a composiciones purificadas y preparaciones de placenta/corion velloso, es decir, composiciones que se pueden preparar a partir de materiales de placenta/corion velloso. En algunas formas de realización, al menos un componente de las composiciones purificadas se puede obtener de preparaciones de placenta/corion velloso. En algunas formas de realización, la presente divulgación también se refiere a composiciones purificadas en las que al menos un componente de la composición purificada se puede obtener de placenta y corion humanos. En una forma de realización, la presente divulgación se refiere a métodos para preparar cualquiera de las composiciones y preparaciones purificadas descritas en el presente documento. La presente divulgación también se refiere a métodos para almacenar y conservar cualquiera de las composiciones y preparaciones purificadas anteriormente mencionadas. Además, la presente divulgación se refiere a métodos para usar las composiciones y preparaciones purificadas anteriormente mencionadas, incluyendo métodos de conservación, métodos de cultivo celular, métodos de cultivo tisular, métodos terapéuticos, métodos profilácticos y métodos cosméticos.

En una forma de realización, los métodos para reducir o prevenir inflamación en un sujeto comprenden proporcionar una cantidad eficaz de una composición de inhibición de la inflamación a un sujeto en necesidad de inhibición o prevención de inflamación, donde la composición comprende al menos un material amniótico humano seleccionado de una membrana amniótica humana, una gelatina amniótica humana, un estroma amniótico humano, placenta/corion velloso o una combinación de los mismos extraídos de una placenta. En algunas formas de realización, el material se puede extraer del material amniótico humano. En algunas formas de realización, la composición puede comprender, por ejemplo, hialuronano (HA) de alto peso molecular entrecruzado, gen 6 estimulado por el factor de necrosis tumoral (TSG-6), pentraxina (PTX-3) y trombospondina (TSP-1).

En algunas formas de realización, el método de extracción puede comprender, obtener una placenta humana, aislar el material amniótico humano de la placenta, y homogenizar el material amniótico humano en un tampón adecuado. En algunas formas de realización, se puede usar placenta humana congelada o previamente congelada. Si la placenta está congelada, el procedimiento puede comprender descongelar la placenta antes de aislar el material amniótico humano de la placenta descongelada. Opcionalmente, el método puede además comprender liofilizar el homogenizado a polvo. Opcionalmente, el método puede comprender mezclar el homogenizado o el polvo con un soporte farmacéuticamente aceptable para una forma farmacéutica no sólida o una forma farmacéutica sólida de liberación extendida. En una forma de realización, el procedimiento de preparación puede sustituir la etapa de liofilizar el homogenizado con la etapa de centrifugar el homogenizado, aislar el sobrenadante del homogenizado centrifugado, y opcionalmente liofilizar el sobrenadante a un polvo. En una forma de realización, se puede alternativa o adicionalmente congelar el homogenizado centrifugado. En algunas formas de realización, la composición se puede proporcionar como una forma farmacéutica no sólida o una forma farmacéutica sólida de liberación extendida.

En una forma de realización, la presente divulgación se refiere a añadir inhibidores de proteasas a una preparación placentaria antes de someterla cualquier etapa de purificación descrita en el presente documento de la preparación placentaria. En una forma de realización, los inhibidores de proteasas pueden permanecer en la preparación placentaria a lo largo del protocolo de purificación entero. En algunas formas de realización, los inhibidores de proteasas pueden permanecer en la preparación placentaria que se ha purificado cuando el producto purificado se usa para uno de los métodos divulgados en el presente documento. En una forma de realización, los inhibidores de proteasas se pueden añadir a células vivas y/o tejidos vivos cuando se someten al protocolo de purificación.

En una forma de realización, la presente divulgación se refiere a una composición sin células que comprende uno o más de factores de crecimiento y/o citoquinas derivadas de origen placentario, donde dicha composición comprende al menos un inhibidor de proteasa.

En una forma de realización, el inhibidor de proteasas puede ser uno o más inhibidores que inhiben serina proteasas, cisteína proteasas, metaloproteasas, aspártico proteasas, treonina proteasas, o inhibidores de tripsina. En algunas formas de realización, el uno o más inhibidores de proteasas pueden inhibir todas de serina proteasas, cisteína proteasas, metaloproteasas, aspártico proteasas, treonina proteasas, e inhibidores de tripsina. En algunas formas de realización, los inhibidores de proteasas pueden inhibir serina proteasas y cisteína proteasas.

En una forma de realización, los inhibidores de proteasas que se pueden usar en la presente divulgación incluyen uno o más de clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenesulfonilo (AEBSF), aprotinina pulmonar bovina, N-(transepoxisuccinil)-L-leucina 4-guanidinobutilamida, leupeptina, N-etilmaleimida (NEM), fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol-bis-(2-aminoetil(éter)NNN'N'-tetraacético, cloruro de amonio, boceprevir, danoprevir, narlaprevir, telaprevir, o vaniprevir.

En una forma de realización, la composición placentaria puede estar derivada de tejidos y/o células de cualquiera o más del corion, la placenta, la lámina amniótica, el amnios, el cordón umbilical, el mesodermo, el saco vitelino, el exoceloma, células de Hofbauer, células endoteliales, y/o el endodermo. En una forma de realización, la composición placentaria purificada deriva de células y/o tejido del corion al que se ha añadido inhibidores de proteasas antes de cualquier etapa de purificación. En una forma de realización, los inhibidores de proteasas que se pueden añadir incluyen clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenesulfonilo (AEBSF), aprotinina pulmonar bovina, N-(transepoxisuccinil)-L-leucina 4-guanidinobutilamida, y leupeptina. Se ha encontrado que cuando se usa el corion como el material de partida en el proceso de purificación, que se puede obtener un producto de purificación más uniforme.

Método de purificar composiciones

En una forma de realización, la presente divulgación se refiere a una preparación sin células que puede conservar las proteínas tanto de la matriz extracelular como de compartimentos intracelulares de la placenta. En una forma de realización, la presente divulgación se refiere a una preparación sin células que puede conservar las proteínas encontradas en las células trofoblásticas. En una forma de realización, la divulgación se refiere a una preparación sin células que puede conservar las proteínas en los citotrofoblastos, que pueden sintetizar varias citoquinas y factores de crecimiento para el desarrollo fetal. Alternativamente y/o además, la presente divulgación se refiere a una preparación sin células que puede conservar las proteínas encontradas en los sincitiotrofoblastos, que son pseudocélulas que pueden almacenar productos de citotrofoblastos. El sincitiotrofoblasto es una capa multinuclear que se puede formar y expandir a lo largo de la gestación por fusión intercelular de la capa alimentadora subyacente de citotrofoblastos vellosos mononucleares.

En una forma de realización, al añadir inhibidores de proteasa a lo largo del proceso de purificación y mantenerlos como parte de la composición, se puede ser capaz de aislar composiciones que tienen concentraciones significativamente elevadas de proteínas relativas a esas preparaciones donde no se usan inhibidores de proteasas. Por ejemplo, en una forma de realización, al menos una de las siguientes proteínas se puede encontrar a niveles elevados relativos a esos métodos de purificación donde no se usan inhibidores de proteasas: proteína quimiotáctica de granulocitos 2 (GCP-2), interleuquina 2 (IL-2), interleuquina 8 (IL-8), proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1), factor inhibidor de macrófagos (MIF), proteína inflamatoria de macrófagos 1 (MEP-1a) y proteína inflamatoria de macrófagos 3 (MEP-3a). En algunas formas de realización, varias de estas proteínas se encuentran a concentraciones elevadas. En algunas formas de realización, todas estas proteínas se encuentran a concentraciones elevadas relativas a esas preparaciones/composiciones que se realizan en ausencia de inhibidores de proteasas.

En algunas formas de realización, la concentración de proteína de purificación puede coincidir con las citoquinas y factores de crecimiento que están presentes en el corion en la 16a semana de la gestación humana. En una forma de realización, la composición aislada puede mostrar propiedades superiores comparada con preparaciones/composiciones convencionales que no usan inhibidores de proteasas. Por ejemplo, la cicatrización en las preparaciones/composiciones usando los métodos de la presente divulgación puede ser inesperadamente superior a composiciones aisladas sin usar inhibidores de proteasas.

En algunas formas de realización, el método de purificar la composición puede comprender un número de etapas de purificación. En algunas formas de realización, el método de purificación puede comprender homogenización y lisis celular. En algunas formas de realización, los métodos de purificación pueden comprender además aislamiento de tejidos. En algunas formas de realización, la placenta se puede pretratar para aislar el tejido eliminando cantidades en exceso de sangre del tejido. Por ejemplo, la placenta, que se puede almacenar en solución salina normal esperando el procesamiento se puede colocar en un recipiente con una solución tamponada, tal como solución salina tamponada en fosfato (PBS), y mezclar para eliminar el exceso de sangre. En algunas formas de realización, el recipiente de tejido en solución se puede sonicar, colocar en una plataforma vibratoria, o agitar. En algunas formas de realización, trozos de placenta se pueden homogenizar macroscópicamente usando un mezclador de laboratorio o medio similar. Opcionalmente, los trozos se pueden homogenizar con PBS 1X que comprende inhibidor de proteasas (PI). En algunas formas de realización, el PI puede estar a una concentración final de 1X. Sin pretender estar vinculado por ninguna teoría, el inhibidor de proteasa puede prevenir la ruptura de proteínas, específicamente factores de crecimiento, quimioquinas y citoquinas presentes en las células de la placenta.

En algunas formas de realización, la solución homogenizada se puede separar para eliminar el exceso de sangre liberada durante el proceso de homogenización. En algunas formas de realización, la separación se puede realizar por filtración o centrifugación, donde el fluido se puede descartar y los sólidos retener para procesamiento adicional. Los sólidos se pueden compactar durante la centrifugación, formando una masa en el fondo del recipiente. En algunas formas de realización, los sólidos se pueden lavar o más veces para eliminar adicionalmente el exceso de sangre de los sólidos homogenizados. Opcionalmente, los sólidos lavados se pueden enfriar antes de procesamiento adicional. En algunas formas de realización, los sólidos lavados se pueden enfriar a menos de 10 °C.

En algunas formas de realización, la lisis celular se puede realizar por varios métodos incluyendo, pero no limitados a, homogenización a alta presión, congelar/descongelar, química, sonicación, presión osmótica, mezclado a alta cizalla, o combinaciones de las mismas. Sin pretender estar vinculado por ninguna teoría, la lisis celular puede liberar quimioquinas, citoquinas y factores de crecimiento de las células. En algunas formas de realización, las células lisadas o restos celulares se pueden separar del fluido. El fluido o sobrenadante puede comprender quimioquinas, citoquinas y factores de crecimiento y en algunas formas de realización, se puede retener para procesamiento adicional.

En algunas formas de realización, el método de purificación puede además comprender disección de tejido antes de la homogenización. La disección opcional puede aumentar la eficacia del proceso de homogenización. La disección también puede permitir que se usen métodos aumentados para la homogenización, sin un tamaño en la alimentación de tejido. Como un ejemplo, el tejido se puede cortar en trozos más pequeños, tal como 2 pulgadas por 2 pulgadas.

En algunas formas de realización, el método de purificación puede comprender además la separación de fluido de los componentes celulares sólidos, por ejemplo, por filtración o centrifugación. En algunas formas de realización, el método de purificación puede además comprender liofilización y/o congelación o algún otro protocolo de purificación. En algunas formas de realización, las preparaciones de homogenizado placentario humano (HPH) se pueden conservar por liofilización colocándolas en viales estériles, colocando en viales estériles en forma líquida para uso posterior, secado por rociado, u otros métodos que conoce un experto en la materia. En algunas formas de realización, el HPH se puede añadir a otros productos placentarios.

En algunas formas de realización, las etapas de purificación pueden comprender: (1) aislamiento de tejido; (2) homogenización; (3) lisis celular; (4) separación del fluido de los componentes celulares sólidos; y (5) liofilización y/o congelación o algún otro protocolo de purificación.

En algunas formas de realización, los inhibidores de proteasas se pueden añadir después de que el tejido se haya aislado. En algunas formas de realización, los inhibidores de proteasas pueden estar presentes durante la lisis celular. En una forma de realización, los inhibidores de proteasas pueden estar presentes a lo largo de la purificación entera de la composición, incluyendo cuando la composición se puede usar en los métodos descritos en el presente documento.

Composiciones para uso farmacéutico

En una forma de realización, la presente divulgación se refiere a generar composiciones farmacéuticas. En algunas formas de realización, la composición farmacéutica puede contener sales farmacéuticamente aceptables, solvatos y productos de los mismos, y puede contener diluyentes, excipientes, soportes u otras sustancias necesarias para aumentar la biodisponibilidad o extender la duración de los ingredientes/compuestos de la presente divulgación.

En algunas formas de realización, los sujetos que pueden ser tratados por los ingredientes/compuestos y composiciones de la presente divulgación incluyen, pero no están limitados a, caballos, vacas, ovejas, cerdos, ratones, perros, gatos, primates tal como chimpancés, gorilas, monos rhesus, y seres humanos. En una forma de realización, un sujeto puede ser un ser humano en necesidad de tratamiento contra el cáncer.

Las composiciones farmacéuticas que contienen los ingredientes/compuestos de la divulgación pueden estar en una forma adecuada para inyección ya sea por sí mismas o alternativamente, usando liposomas, micelas, y/o nanoesferas. Alternativamente, en algunas formas de realización, las composiciones farmacéuticas pueden estar en una forma que permite que se administre por vía tópica.

Alternativamente, en algunas formas de realización, las composiciones pretendidas para inyección se pueden preparar según cualquier método conocido, y tales composiciones pueden comprender uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en solventes, cosolventes, agentes solubilizantes, agentes humectantes, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, agentes espesantes, agentes quelantes, antioxidantes, agentes reductores, conservantes antimicrobianos, tampones, agentes de ajuste del pH, agentes de carga, protectores, ajustadores de tonicidad, y aditivos especiales. Además, se pueden usar otros excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos que son adecuados para la fabricación de inyectables.

En algunas formas de realización, la composición puede ser suspensiones acuosas que comprenden los ingredientes placentarios activos en una mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Tales excipientes pueden comprender agentes de suspensión y/o agentes dispersantes/humectantes. Los agentes de suspensión pueden incluir, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma arábiga. Los agentes dispersantes o humectantes pueden ser un fosfátido natural, tal como lecitina, o un producto de condensación sintetizado, tal como productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo, estearato de polioxietileno, productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo, heptadecaetilenoxicetanol, productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitol polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato sorbitano polietileno. En algunas formas de realización, las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más agentes colorantes.

En algunas formas de realización, se pueden formular suspensiones oleaginosas suspendiendo el principio activo en un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo, o aceite de coco, o en un aceite de vaselina tal como parafina líquida. Las suspensiones oleaginosas pueden comprender un agente espesante, por ejemplo, cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. En algunas formas de realización, se pueden añadir agentes edulcorantes y agentes saborizantes para proporcionar una preparación oral agradable. En algunas formas de realización, estas composiciones se pueden conservar por la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.

En algunas formas de realización, polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua pueden proporcionar los principios activos en mezcla con un agente dispersante o humectante, agente de suspensión y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión se ejemplifican por los ya mencionados anteriormente. En algunas formas de realización, también pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo, agentes edulcorantes, saborizantes o colorantes.

En algunas formas de realización, las composiciones farmacéuticas de la divulgación también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleaginosa puede comprender un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de oliva o aceite de cacahuete, un aceite de vaselina, por ejemplo, parafina líquida, o una mezcla de los mismos. Opcionalmente, los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas naturales, por ejemplo, goma arábiga o goma tragacanto, fosfátidos naturales, tal como soja, lecitina y ésteres, ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato sorbitano, o productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato sorbitano polioxietileno. En algunas formas de realización, las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular según los métodos conocidos usando agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspensión descritos anteriormente. Opcionalmente, la preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. En algunas formas de realización, entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden emplear están agua, agua para inyección estéril (SWFI), solución de Ringer, y solución de cloruro de sodio isotónica. Además, en algunas formas de realización, se pueden emplear convenientemente aceites no volátiles como solventes o medio de suspensión. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite no volátil bando usando mono- o diglicéridos sintéticos. Además, en algunas formas de realización, se pueden usar ácidos grasos, tal como ácido oleico en la preparación de inyectables.

En algunas formas de realización, una solución de la divulgación se puede proporcionar en un envase sellado, especialmente uno hecho de vidrio, bien en forma de dosis unitaria o en una forma de dosis múltiple.

En algunas formas de realización, cualquier sal farmacéuticamente aceptable de los ingredientes de la presente divulgación se puede usar para preparar una solución de la divulgación. Los ejemplos de sales adecuadas pueden ser, por ejemplo, las sales con ácidos inorgánicos minerales tal como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico, y similares, y las sales con ciertos ácidos orgánicos tal como acético, succínico, tartárico, ascórbico, cítrico, glutámico, benzoico, metanosulfónico, etanosulfónico y similares. En una forma de realización, los ingredientes de la divulgación pueden estar en una sal de ácido clorhídrico incluyendo un mono, di o triclorhidrato.

En algunas formas de realización, la composición también puede comprender uno o más componentes adicionales tal como un agente cosolubilizante, que puede ser igual que un solvente, un agente de ajuste de la tonicidad, un agente estabilizante, un conservante, o mezclas de los mismos. Los ejemplos de solventes, agentes cosolubilizantes, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes estabilizantes y conservantes que pueden ser adecuados para una formulación en solución se describen a continuación.

En algunas formas de realización, los solventes y agentes cosolubulizantes adecuados pueden incluir, pero no están limitados a, agua; agua para inyección estéril (SWFI); solución salina fisiológica; alcoholes, por ejemplo, etanol, alcohol bencílico y similares; glicoles y polialcoholes, por ejemplo propilenglicol, glicerina y similares; ésteres de polialcoholes, por ejemplo, diacetina, triacetina y similares; poliglicoles y poliéteres, por ejemplo, polietilenglicol 400, éteres metílicos de propilenglicol y similares; dioxolanos, por ejemplo, isopropilidenglicerina y similares; dimetilisosorbida; derivados de pirrolidona, por ejemplo, 2-pirrolidona, N-metil-2-pirrolidina, polivinilpirrolidona (agente cosolubilizante solo) y similares; alcoholes grasos polioxietilenados; ésteres de ácidos grasos polioxietilenados; polisorbatos, por ejemplo, Tween™, derivados polioxietileno de polipropilenglicoles, por ejemplo, Pluronics™. Los agentes de ajuste de tonicidad adecuados pueden incluir, pero no están limitados a, cloruros inorgánicos farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, cloruro de sodio; dextrosa; lactosa; manitol; sorbitol y similares.

En algunas formas de realización, los conservantes adecuados para la administración fisiológica pueden ser, por ejemplo, ésteres de ácido parahidroxibenzoico, por ejemplos ésteres de metilo, etilo, propilo y butilo, o mezclas de los mismos, clorocresol y similares.

En algunas formas de realización, los agentes estabilizantes adecuados incluyen, pero no están limitados a, monosacáridos, por ejemplo, galactosa, fructosa y fucosa, disacáridos, por ejemplo, lactosa, polisacáridos, por ejemplo, dextrano, oligosacáridos cíclicos, por ejemplo, alfa-, beta-, gamma-ciclodextrina, polioles alifáticos, por ejemplo, manitol, sorbitol, y tioglicerol, polioles cíclicos, por ejemplo, inositol, y solventes orgánicos, por ejemplo, alcohol etílico y glicerol.

En algunas formas de realización, los anteriormente mencionados solventes y agentes solubilizantes, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes estabilizantes y conservantes se pueden usar solos o como una mezcla de dos o más de ellos en una formulación en solución.

En una forma de realización, una formulación en solución farmacéutica puede comprender las composiciones descritas en el presente documento o sales farmacéuticamente aceptables de las mismas, y un agente seleccionado del grupo que consiste en solución de cloruro de sodio (es decir, solución salina fisiológica), dextrosa, manitol o sorbitol, en donde el agente está en una cantidad de menos que o igual al 5 %. En algunas formas de realización, el pH de tal formulación también se puede ajustar para mejorar la estabilidad de almacenamiento usando un ácido o base farmacéuticamente aceptable.

En algunas formas de realización, la concentración de los ingredientes placentarios activos en la formulación o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos puede ser menor de 100 mg/ml. Por ejemplo, la concentración puede ser menor de 100 mg/ml, puede ser menor de 75 mg/ml, menor de 50 mg/ml, menor de 10 mg/ml, o menor de 10 mg/ml y mayor de 0,01 mg/ml, o entre 0,5 mg/ml y 5 mg/ml, o entre 1 mg/ml y 3 mg/ml. En una forma de realización, la concentración que se usa puede ser la concentración ideal para tratar suficientemente la enfermedad y/o afección que se trata.

En algunas formas de realización, para formulaciones en solución, varias composiciones de la presente divulgación pueden ser más solubles o estables durante periodos más largos en soluciones a un pH menor de 6. Además, en algunas formas de realización, las sales ácidas de los ingredientes en las composiciones de la presente divulgación pueden ser más solubles en soluciones acuosas que sus homólogos de base libre, pero cuando las sales ácidas se añaden a soluciones acuosas el pH de la solución puede ser demasiado bajo para ser adecuado para la administración. Por tanto, en algunas formas de realización, las formulaciones en solución que tienen un pH por encima de pH 4,5 se pueden combinar antes de la administración con una solución diluyente de pH mayor de 7 de modo que el pH de la formulación de combinación administrada puede ser pH 4,5 o mayor. En una forma de realización, la solución diluyente comprende una base farmacéuticamente aceptable tal como hidróxido de sodio. En otra forma de realización, la solución diluyente puede estar a un pH de entre 10 y 12. En otra forma de realización, el pH de la formulación combinada administrada puede ser mayor de 5,0. En otra forma de realización, el pH de la formulación combinada administrada puede estar entre pH 5,0 y 7,0.

En algunas formas de realización, las composiciones descritas en el presente documento se pueden pasar a través de un filtro. Opcionalmente, uno o más componentes adicionales tal como agentes cosolubilizantes, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes estabilizantes y conservantes, por ejemplo, del tipo previamente especificado, se pueden añadir a la solución antes de pasar las composiciones a través de un filtro esterilizante.

Métodos de usar la composición

En algunas formas de realización, las composiciones descritas en el presente documento se pueden usar en terapia de combinación con otras composiciones que se sabe se usan en las enfermedades y/o afecciones que la presente divulgación está diseñada para abordar. Las dosis de los compuestos/composiciones coadministradas pueden variar dependiendo del tipo de cofármaco empleado, del fármaco especifico empleado, de la enfermedad o afección que se trata y así sucesivamente. Además, en algunas formas de realización, cuando se coadministran con uno o más agentes biológicamente activos, los compuestos/composiciones proporcionadas en las mismas se pueden administrar simultáneamente con el/los agente(s) biológicamente activo(s) de la presente divulgación o se pueden administrar secuencialmente. Si se administran secuencialmente, el médico puede determinar la secuencia apropiada de administrar proteína en combinación con el/los agente(s) biológicamente activo(s).

En una forma de realización, múltiples agentes terapéuticos se pueden administrar en cualquier orden o incluso simultáneamente. Si se administran simultáneamente, los múltiples agentes terapéuticos se pueden proporcionar en una única forma unificada, o en múltiples formas (a modo de ejemplo solo, ya sea como una única píldora o como dos píldoras separadas). Opcionalmente, uno de los agentes terapéuticos se puede dar en múltiples dosis, o ambos se pueden dar como múltiples dosis. Si no son simultáneos, el tiempo entre las múltiples dosis puede variar desde más de cero semanas a menos de cuatro semanas. Además, en algunas formas de realización, los métodos, composiciones y formulaciones de combinación no tienen que estar limitados al uso de solo dos agentes; el uso de múltiples combinaciones terapéuticas también se puede prever.

En una forma de realización, los agentes farmacéuticos que comprenden la terapia de combinación divulgada en el presente documento pueden ser una forma farmacéutica combinada o en formas farmacéuticas separadas pretendidas para administración sustancialmente simultánea. Opcionalmente, los agentes farmacéuticos que comprenden la terapia de combinación también se pueden administrar secuencialmente, con cualquier compuesto terapéutico que se administre por una pauta que llama a una administración en dos etapas. En algunas formas de realización, la pauta de administración en dos etapas puede llamar para administración secuencial de los agentes activos o administración separada de los agentes activos separados. En algunas formas de realización, el periodo de tiempo entre las múltiples etapas de administración puede variar de, unos pocos minutos a varias horas, dependiendo de las propiedades de cada agente farmacéutico, tal como potencia, solubilidad, biodisponibilidad, semivida en plasma, y perfil cinético del agente farmacéutico.

Además, las composiciones de la presente divulgación y composiciones purificadas descritas en el presente documento también se pueden usar en combinación con procedimientos que pueden proporcionar beneficio adicional o sinérgico al paciente. A modo de ejemplo solo, se espera que los pacientes encuentren beneficio terapéutico y/o profiláctico en los métodos descritos en el presente documento, en donde la composición farmacéutica de un compuesto divulgado en el presente documento y/o combinaciones con otros agentes terapéuticos se pueden combinar con ensayo genético para determinar si ese individuo es un portador de un gen mutante que se sabe está correlacionado con ciertas enfermedades o afecciones.

Las composiciones de la presente divulgación descritas en el presente documento y terapias de combinación se pueden administrar antes, durante o después de la aparición de una enfermedad o afección, y el tiempo de administrar la composición que contiene uno o más principios activos puede variar. Por tanto, por ejemplo, los compuestos se pueden usar como un profiláctico y se puede administrar continuamente a sujetos con una propensión a desarrollar afecciones o enfermedades con el fin de prevenir la aparición de la enfermedad o afección. En algunas formas de realización, las formulaciones y composiciones de la presente divulgación se pueden administrar a un sujeto durante o tan pronto como sea posible después del inicio de los síntomas. Por ejemplo, la administración de las formulaciones y composiciones se puede iniciar en las primeras 48 horas del inicio de los síntomas, o en las primeras 48 horas del inicio de los síntomas, o en las primeras 6 horas del inicio de los síntomas, o en a las 3 horas del inicio de los síntomas. En algunas formas de realización, la administración inicial puede ser a través de cualquier ruta práctica, tal como, por ejemplo, una inyección intravenosa, una inyección en embolada, infusión durante 5 minutos a aproximadamente 5 horas, una píldora, una cápsula, parche transdérmico, administración yugal, administración tópica y similares, o cualquier combinación de las mismas. En algunas formas de realización, las formulaciones y composiciones se pueden administrar tan pronto como sea practicable después de que se detecte o sospeche el inicio de una enfermedad o afección, y durante una duración de tiempo necesario para el tratamiento de dicha enfermedad, tal como, por ejemplo, desde aproximadamente 1 mes hasta aproximadamente 3 meses. La duración del tratamiento puede variar para cada sujeto, y la duración se puede determinar usando criterios conocidos. Por ejemplo, las composiciones que contienen ingredientes que tratan la enfermedad o afección se pueden administrar durante al menos 2 semanas, o de aproximadamente 1 mes hasta aproximadamente 5 años, o de aproximadamente 1 mes hasta aproximadamente 3 años.

La presente divulgación también se refiere a usar las composiciones y formulaciones de la presente divulgación en kits que se pueden usar para tratar enfermedades y afecciones que requieren tratamiento. En algunas formas de realización, tales kits pueden incluir un soporte, embalaje, o envase que puede estar compartimentado para recibir uno o más envases tal como viales, tubos, y similares. Opcionalmente, cada uno de los envase(s) puede incluir uno de los elementos separados que se va a usar en un método descrito en el presente documento. Los envases adecuados pueden incluir, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, y tubos de ensayo. Los envases pueden estar formados de una variedad de materiales tal como vidrio o plástico.

En algunas formas de realización, los artículos de manufactura proporcionados en el presente documento pueden contener materiales de embalaje. Los ejemplos de materiales de embalaje farmacéuticos incluyen, pero no están limitados a, blísteres, botellas, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, viales, envases, jeringas, botellas y cualquier material de embalaje adecuado para una formulación seleccionada y modo pretendido de administración y tratamiento. Una amplia gama de formulaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento se puede contemplar como son una variedad de tratamientos para cualquier enfermedad, trastorno, o afección.

Se pueden contemplar varios métodos de uso en la presente divulgación. En los métodos se incluyen métodos de hacer y usar las preparaciones placentarias de la presente divulgación incluyendo el tratamiento de individuos que están en necesidad de dicho tratamiento.

Preparación placentaria

En una forma de realización, la presente divulgación se refiere a una preparación placentaria en donde dicha preparación placentaria puede estar derivada de un tejido placentario, donde el tejido placentario se puede someter a etapas de procesamiento que comprenden homogenización macroscópica y lisis celular. En algunas formas de realización, el tejido placentario se puede someter a etapas de procesamiento que además comprenden la separación de fluido de los componentes celulares sólidos, filtración, y liofilización y/o congelación para generar la preparación placentaria. En algunas formas de realización, la preparación placentaria además comprende uno o más inhibidores de proteasas. En algunas formas de realización, la preparación placentaria puede estar derivada de tejido placentario, donde el tejido placentario ha experimentado las siguientes etapas en el orden de: (a) homogenización; (b) lisis celular; (c) separación del fluido de los componentes celulares sólidos; y (d) liofilización y/o congelación para generar la preparación placentaria, donde la preparación placentaria además comprende uno o más inhibidores de proteasas. En algunas formas de realización, la preparación se puede filtrar después de la separación y antes de las etapas de liofilización.

En algunas formas de realización, la preparación placentaria comprende añadir el uno o más inhibidores de proteasas antes de la homogenización macroscópica. En algunas formas de realización, el uno o más inhibidores de proteasas comprende uno o más de clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenesulfonilo (AEBSF), aprotinina pulmonar bovina, N-(trans-epoxisuccinil)-L-leucina 4-guanidinobutilamida, y leupeptina. Opcionalmente, el uno o más inhibidores de proteasas se puede seleccionar del grupo que consiste en clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenesulfonilo (AEBSF), aprotinina pulmonar bovina, N-(trans-epoxisuccinil)-L-leucina 4-guanidinobutilamida, y leupeptina.

En algunas formas de realización, el tejido placentario puede ser el corion. En algunas formas de realización, la preparación placentaria puede además comprender diluyentes, excipientes o soportes. En algunas formas de realización, la preparación placentaria puede comprender mayores cantidades de concentración de interleuquinas relativa a preparaciones que se preparan en ausencia de inhibidores de proteasas. En algunas formas de realización, otras proteínas presentes en la preparación que comprende inhibidores de proteasas se pueden aislar en mayores concentraciones relativas a proteínas en la preparación que se aíslan en ausencia de inhibidores de proteasas. En algunas formas de realización, los inhibidores de proteasas pueden no eliminarse de la preparación placentaria.

En una forma de realización, la presente divulgación se refiere a un método de tratar un individuo que puede tener una enfermedad seleccionada del grupo que comprende artritis, cicatrización, tratamiento de cicatrices, crecimiento de tejido, cicatrización de tejido, regeneración/reparación de matriz tisular, injerto, inflamación y afecciones asociadas con modular la señalización de TGF-p en donde el método comprende administrar la preparación placentaria como se enumera en el presente documento. Tejido se usa en el presente documento según su significado generalmente aceptado en biología, es decir, un conjunto de células similares. Los tejidos específicos incluyen, pero no están limitados a, músculo, nervio, óseo, conjuntivo, epitelial, vascular, y similares.

En una forma de realización, la presente divulgación se refiere a un método de tratar un individuo que puede tener una enfermedad seleccionada del grupo que comprende artritis, cicatrización, tratamiento de cicatrices, crecimiento de tejido, cicatrización de tejido, regeneración/reparación de matriz tisular, injerto, inflamación y afecciones asociadas con modular la señalización de TGF-p y otras proteínas en donde dicho método comprende administrar a dicho individuo una cantidad eficaz de una preparación placentaria que puede estar derivada de tejido placentario, donde el tejido placentario se puede someter a etapas de procesamiento que comprenden homogenización macroscópica y lisis celular. En algunas formas de realización, las etapas de procesamiento pueden además comprender separación del fluido de componentes celulares sólidos, filtración y liofilización y/o congelación para generar la preparación placentaria. En algunas formas de realización, la preparación placentaria puede además comprender uno o más inhibidores de proteasas. En algunas formas de realización de dicho método, el uno o más inhibidores de proteasas se puede añadir antes de la homogenización macroscópica. En algunas formas de realización, el uno o más inhibidores de proteasas se puede seleccionar del grupo que comprende clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenesulfonilo (AEBSF), aprotinina pulmonar bovina, N-(trans-epoxisuccinil)-L-leucina 4-guanidinobutilamida, y leupeptina. En algunas formas de realización, el uno o más inhibidores de proteasas se puede eliminar antes de la administración de la preparación placentaria a dicho individuo.

En una forma de realización, la presente divulgación se refiere a un método de hacer una preparación placentaria para tratar un individuo que puede tener una enfermedad seleccionada del grupo que comprende artritis, cicatrización, tratamiento de cicatrices, crecimiento de tejido, cicatrización de tejido, regeneración/reparación de matriz tisular, injerto, inflamación y afecciones asociadas con modular la señalización de TGF-p, en donde dicho método puede comprender: obtener tejido placentario y añadir inhibidores de proteasas al tejido placentario y después administrar una o más de las siguientes etapas: (a) homogenización macroscópica; (b) lisis celular; (c) separación del fluido de los componentes celulares sólidos; y (d) liofilización y/o congelación para generar la preparación placentaria. En algunas formas de realización, se puede realizar una etapa de filtración después de la separación y antes de la etapa de liofilización.

En algunas formas de realización, la etapa de separación se puede realizar por centrifugación. En algunas formas de realización, la etapa de liofilización se puede realizar a presión reducida. Por ejemplo, la etapa de liofilización se puede realizar a 0,5 atmósferas o menos, o 0,3 atmósferas o menos, o 0,2 atmósferas o menos, o 0,1 atmósferas o menos, o 0,05 atmósferas o menos, o 0,01 atmósferas o menos, o 0,001 atmósferas o menos. En algunas formas de realización, el tejido placentario puede comprender un corion. En algunas formas de realización, el tejido placentario puede consistir en el corion.

Ejemplo 1

Se obtuvo placenta/membrana amniótica y el homogenizado placentario humano se aisló como sigue. Se obtuvo la placenta/membrana amniótica de un hospital contratado a través de donación de placenta. Se cribó la donante según las directrices de la Asociación Americana de Bancos de Tejido (AATB). La placenta/membrana se colocó en solución salina normal al 0,9 % (NS, NaCl 154 mM, 308 mOsm/l). La placenta se retiró de la NS al 0,9 %, el disco placentario se separó de la membrana amniótica, corion y cordón umbilical, y se disecó en trozos de aproximadamente 1,5 pulgadas por 2 pulgadas. Estos trozos más pequeños de disco placentario se colocaron en un recipiente con aproximadamente 400 ml de solución salina tamponada en fosfato 1X (PBS, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO44,3 mM, KH2PO41,47 mM, pH 7,4). El recipiente se colocó en una plataforma vibratoria y se agitó a 120 rpm durante 12 a 24 h. Los trozos de disco placentario se homogenizaron macroscópicamente usando un mezclador de laboratorio con PBS 1X o PBS 1X que contenía inhibidores de proteasas (PI) a una concentración final 1X (AEBSF 500 uM, aprotinina 150 nM, E-64 1 uM, leupeptina 1 uM). El homogenizado grueso se colocó en recipientes de 250 ml y se centrifugó durante 10 minutos a 4.000 veces la gravedad. El homogenizado grueso se echó en el recipiente para una proporción de aproximadamente 1:5, volumen de tejido:volumen total. El envase se agitó con vórtex para resuspender el precipitado. La suspensión se centrifuga durante 10 minutos a 4.000 veces la gravedad. Este procedimiento de lavado se repite durante un total de tres lavados. La mezcla no se centrifugó después del último lavado. Los lavados eliminaron sangre del tejido. El contenido de los recipientes de 250 ml se diluyó con PBS 1X o PBS 1X-PI 1X hasta duplicar el volumen. La mezcla se colocó después en un depósito de alimentación conectado a un homogenizador de alta presión. El homogenizado se colocó después en recipientes de 250 ml y se centrifugó a 15.000 veces la gravedad durante 10 minutos.

Este procedimiento se realizó en 6 discos placentarios. En la etapa de homogenización macroscópica, los discos placentarios se separaron en dos grupos, un grupo se terminó con PBS 1X y el otro se terminó con PBS 1X-PI 1X.

Se usó un lector multiplex Bio-Plex MAGPIX (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) para cuantificar las cantidades de citoquinas y factores de crecimiento presentes en la solución extraída de los discos placentarios. Se obtuvo un ensayo Bio-Plex pro Human Chemokine plano, 40-plex (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Los estándares se diluyeron en diluyente apropiado. Las perlas de ensayo se diluyeron y se añadieron 50 pl a cada pocillo de la placa de 96 pocillos y se lavaron dos veces con tampón de ensayo. La placa se colocó en un soporte de placa magnético y la solución se eliminó de los pocillos. Se cargaron los estándares, muestras y blancos en cada pocillo respectivo de la placa de 96 pocillos y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente (nota: se realizaron medidas en duplicado en cada estándar, muestra y blanco). La placa se lavó colocando la placa en el soporte de placa magnético, eliminando la solución, lavando con tampón de lavado, y eliminando el tampón de lavado colocando la placa de pocillos en el soporte de placa magnético. Se añadieron los anticuerpos de detección en cada pocillo y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces con tampón de lavado y se añadió estreptavidina-indicador PE a cada pocillo. La placa se incubó durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces en tampón de ensayo y se tomaron medidas en el lector multiplex MAGPIX. Los datos se analizaron en un software lector Bio-Plex (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y se utilizó un ANOVA bidireccional para comparar los grupos de tratamiento.

La tabla 1 a continuación muestra los datos con las concentraciones de proteínas aisladas de la placenta en presencia y ausencia de inhibidores de proteasas.

Tabla 1

Los datos en la tabla 1 muestran que la adición de inhibidores de proteasas aumenta la cantidad de las varias proteínas aisladas de la placenta. Sin pretender estar unido por ninguna teoría, la concentración aumentada de proteína probablemente aumenta la biodisponibilidad de varias proteínas para ayudar en tratar enfermedades y/o afecciones.

Las figuras 1-4 muestran los resultados de ensayos que determinan la cantidad de varias proteínas amnióticas en presencia de inhibidores de proteasas (barra oscura) y ausencia de inhibidores de proteasas (barra clara) de inhibidores de proteasas. La figura 1 muestra las cantidades de concentración de proteína aislada de interleuquina 2 (IL-2) y proteína inflamatoria de macrófagos 3 (MIP-3a) de tejido placentario. La figura 2 muestra las cantidades de concentración de proteína aislada de proteína quimiotáctica de granulocitos 2 (GCP-2), proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1), y proteína inflamatoria de macrófagos 1 (MIP-1a) de tejido placentario. La figura 3 muestra las cantidades de concentración de proteína aislada de interleuquina 8 (IL-8) de tejido placentario. La figura 4 muestra las cantidades de concentración de proteína aislada de factor inhibidor de macrófagos (MIF) de tejido placentario. Las composiciones que comprenden inhibidores de proteasas todas mostraron un aumento estadísticamente significativo en la concentración de proteína aislada en comparación con esas sin inhibidores de proteasas. El menor aumento fue con IL-2, que produjo un aumento de casi el 24 % en la concentración de IL-2 en la composición que comprende inhibidores de proteasas, con un valor p menor de 0,05 (Fig. 1). Se mostró un aumento similar en la concentración de proteína para MIF, GCP-2 y MIP-1a, cada una muestra aumentos del 45-52 % en composiciones que comprenden inhibidores de proteasas sobre esas sin inhibidores de proteasas. El valor p para GCP-2 y MIP-1a era menor de 0,01; el valor p para MIF era menor de 0,05 (Fig. 2 y Fig. 4). Se mostró un aumento significativo en la concentración de proteína para MIP-3a y MCP-1 en las composiciones con proteasas inhibidas más que duplicando cada una la concentración de proteína, con aumentos del 111 % y 312 %, respectivamente. El valor p para MIP-3a era menor de 0,05; el valor p para MCP-1 era menor de 0,01 (Fig. 1 y Fig. 2). Se mostró un aumento notable en la concentración de proteína para IL-8, con un aumento del 1173 % en la composición que comprende inhibidores de proteasas sobre esa sin inhibidores de proteasas, con un valor p de menos de 0,05 (Fig. 3).

Ejemplo 2

El método siguiente es ilustrativo de un proceso de la divulgación que se puede usar para hacer las preparaciones placentarias de la presente divulgación.

Etapa 1

Se obtuvo la placenta/membrana amniótica de un hospital contratado a través de un coordinador de donación de placenta. El coordinador/departamento QA criba la donante según los estándares de la AATB y la empresa. El coordinador coloca la placenta/membrana amniótica en solución salina normal al 0,9 % (NS).

Etapa 2

La placenta se retira de la NS al 0,9 % y se diseca en trozos de aproximadamente 1,5 pulgadas por 2 pulgadas. Los trozos más pequeños de disco placentario se colocaron en un recipiente con aproximadamente 400 ml de solución salina tamponada en fosfato 1X (PBS). El recipiente se colocó en una plataforma vibratoria y se agitó a 120 rpm durante 12-24 h. Agitar el tejido en PBS elimina grandes cantidades de sangre del tejido.

Etapa 3

Homogenización macroscópica: Los trozos de placenta se homogenizaron macroscópicamente usando un mezclador de laboratorio con PBS 1X que también contiene inhibidor de proteasas (PI) a una concentración final 1X. El inhibidor de proteasas se puede utilizar para prevenir la ruptura de proteínas, específicamente factores de crecimiento, quimioquinas y citoquinas presentes en las células de la placenta.

Centrifugación: El homogenizado grueso se coloca en recipientes de 250 ml y se centrifuga durante 5 minutos a 10000 x g. Esta etapa separa el fluido sanguíneo del tejido homogenizado. El tejido mezclado puede formar un precipitado en el fondo del recipiente. El fluido sanguíneo se desecha.

Lavado: Se echa PBS 1X con PI 1X en el recipiente para una proporción de ~1:5, volumen de tejido:volumen total. El recipiente se agita con vórtex para resuspender el precipitado. La suspensión se centrifuga durante 5 minutos a 4000 x g. Este procedimiento de lavado se repite durante un total de tres lavados. La mezcla no se centrifuga después del último lavado. Estos lavados eliminan sangre del tejido. La mezcla se enfría a 4 °C.

Etapa 4

Se logra lisis celular por uno de los siguientes procedimientos. La lisis celular puede liberar quimioquinas, citoquinas, y factores de crecimiento de las células.

Homogenización a alta presión: El contenido de los recipientes de 250 ml se diluye con PBS 1X con PI 1X hasta duplicar el volumen. La mezcla se coloca después en depósito de alimentación enfriado conectado a un homogenizador de alta presión. El fin de esta etapa es lisar cualquier célula no lisada. La presión y el número de pases se optimizarán mediante ensayos para niveles de quimioquinas y citoquinas, así como bioactividad.

Congelación/descongelación: El contenido de los recipientes de 250 ml se echa en bolsas estériles y se sella doblemente usando un sellador de calor. Después de sellar, las bolsas se colocan en una bandeja en un congelador de -30 °C. El número de bolsas varía basado en el volumen total de mezcla de homogenizado grueso. El homogenizado grueso se echa en las bolsas a un volumen que produce bolsas de aproximadamente 1 pulgada de espesor cuando se depositan en la bandeja. Las bolsas de homogenizado grueso congeladas se retiran del congelador y se colocan en un baño de agua templada de 37,8 °C a 43,3 °C. El homogenizado se retira del baño de agua caliente tan pronto como está descongelado por completo. La mezcla descongelada se echa en un recipiente y se mezcla un homogenizador manual a alta velocidad. La mezcla homogenizada se coloca en una bolsa estéril y se sella. Este procedimiento se repite durante un total de hasta 3 congelaciones/descongelaciones.

Lisis química: El homogenizado grueso se centrifuga y el sobrenadante se descarta. El precipitado se lava con tampón de lavado celular de Bio-Rad. El volumen de tampón de lavado celular varía basado en el volumen de tejido. Se añade dos veces el volumen de tejido de tampón. El precipitado y el tampón se agitan con el vórtex para resuspender el precipitado. La mezcla se centrifuga durante 5 min a 10000 x g. El sobrenadante se descarta. Se añade solución de lisis celular de Bio-Rad. El volumen de solución de lisis celular varía basado en el volumen de tejido. Se añade dos veces el volumen de tejido de solución de lisis. El precipitado y la solución de lisis se agitan con el vórtex para resuspender el precipitado. La mezcla se coloca en la nevera y se deja reposar durante 5 min.

Centrifugación: Después de completar uno de los procedimientos anteriores el homogenizado se coloca en recipientes de 250 ml y se centrifuga a 15000 X g durante 10 minutos. Esta etapa separa los restos celulares del fluido. El fluido debe contener quimioquinas, citoquinas y factores de crecimiento. El sobrenadante se retiene.

Etapa 5

Filtración al vacío: El sobrenadante de la etapa anterior se coloca en un sistema de filtración la vacío. El sistema contiene dos filtros. El filtro inicial tiene un tamaño de poro de 1 pm, que está seguido por un filtro con un tamaño de poro de 0,45 pm. Esta etapa es para eliminar cualquier resto celular restante y para clarificar el sobrenadante. El filtrado se retiene.

Etapa 6

Preparaciones de HPH (homogenizado placentario humano) - Se puede conservar PH de una de las siguientes maneras: (1) liofilizado y colocado en viales estériles con ensayos para asegurar la bioactividad después de la liofilización; (2) colocado en viales estériles en forma líquida para uso posterior, por ejemplo, para inyección; o (3) secado por rociado. Se pueden combinar HPH con otros productos placentarios, tal como membrana amniótica. En un ejemplo, una membrana amniótica empapada, se puede usar el siguiente proceso.

Ejemplo 3 - Ensayo de herida usando los materiales generados en el ejemplo 1.

Se realizó un ensayo de arañazo, un ensayo in vitro estándar de cicatrización, en 3 muestras de tanto PBS 1X como PBS 1X-PI 1X de la extracción de disco placentario. Se cultivaron fibroblastos de piel humana en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10 % en placas de 12 pocillos. Cuando se alcanzó una monocapa, se usó un rascador celular para eliminar una fina línea de células del fondo del cultivo. Los pocillos se lavaron 3 veces en solución salina tamponada de Dulbecco (DPBS) para eliminar las células disueltas. Se administraron los artículos de prueba en DMEM sin suero a un volumen de aproximadamente el 10 % del volumen total de cada pocillo. Se analizaron las placas en ArrayScan ZTI según las instrucciones del fabricante, con fotomicrografías tomadas cada 2 horas durante las primeras 24 horas, después una vez cada 48 y 72 horas.

La figura 5 muestra los resultados de un ensayo de cicatrización. Se realizó un ensayo de cicatrización in vitro de 24 horas donde los fibroblastos se trataron con (A) control negativo, medio de crecimiento normal que no contenía suero, (B) el 10 % en volumen de solución de HPH procesada con inhibidores de proteasas en el medio descrito anteriormente, y (C) el 10 % en volumen de solución de HPH procesada sin inhibidores de proteasas en el medio descrito en A. La línea superior en las imágenes representa la línea orinal de herida en el tiempo 0, mientras que la línea inferior indica el movimiento más lejano de las células en el espacio herido. Una mayor distancia es deseable para la cicatrización. Las imágenes son de 24 horas tras la lesión. El tratamiento de fibroblastos con HPH procesado con inhibidor (B) proporcionó casi dos veces la migración celular que el control negativo (A). El control negativo (A) era aproximadamente igual al del HPH procesado sin tratamiento de inhibidores (C).

Ejemplo 4

Se obtuvo la placenta/membrana amniótica de un hospital contratado a través de donación de placenta. Se cribó la donante según las directrices de la Asociación Americana de Bancos de Tejido (AATB). La placenta/membrana se colocó en solución salina normal al 0,9 % (NS, NaCl 154 mM, 308 mOsm/l). La placenta se retiró de la NS al 0,9 %, el disco placentario se separó de la membrana amniótica, corion y cordón umbilical, y se disecó en trozos de aproximadamente 1,5 pulgadas por 2 pulgadas. Estos trozos más pequeños de disco placentario se colocaron en un recipiente con aproximadamente 400 ml de solución salina tamponada en fosfato 1X (PBS, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO44,3 mM, KH2PO4 1,47 mM, pH 7,4). El recipiente se colocó en una plataforma vibratoria y se agitó a 120 rpm durante 12 a 24 h. Los trozos de disco placentario se homogenizaron macroscópicamente usando un mezclador de laboratorio con PBS 1X o PBS 1X que contenía inhibidores de proteasas (PI) a una concentración final 1X(AEBSF 500 uM, aprotinina 150 nM, E-641 uM, leupeptina 1 uM). El homogenizado grueso se colocó en recipientes de 250 ml y se centrifugó durante 10 minutos a 4.000 x la gravedad (g). El homogenizado grueso se echó en el recipiente para una proporción de aproximadamente 1:5, volumen de tejido:volumen total. El recipiente se agitó con vórtex para resuspender el precipitado. La suspensión se centrifugó durante 10 minutos a 4.000 x g. Este procedimiento de lavado se repitió durante un total de tres lavados. La mezcla no se centrifugó después del último lavado. Los lavados eliminan sangre del tejido. El contenido de los recipientes de 250 ml se diluyó con PBS 1X o PBS 1X-PI 1X hasta duplicar el volumen. La mezcla se colocó después en un depósito de alimentación conectado a un homogenizador de alta presión. El homogenizado se colocó después en recipientes de 250 ml y se centrifugó a 15.000 x g durante 10 minutos. Este procedimiento se realizó en 6 discos placentarios.

El líquido amniótico a término se obtuvo de un hospital de contrato a través de donación, donde la donante se cribó según los estándares de la AATB. Se recogió líquido de 10 donantes para cuantificación de citoquinas y factores de crecimiento.

Se usó un lector multiplex Bio-Plex MAGPIX (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) para cuantificar las cantidades de citoquinas y factores de crecimiento presentes en la solución extraída de los discos placentarios. Se obtuvo un ensayo Bio-Plex Pro Human Chemokine plano, 40-plex (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Los estándares se diluyeron en diluyente apropiado. Se diluyeron perlas de ensayo y se añadieron 50 pl a cada pocillo de la placa de 96 pocillos y se lavaron dos veces con tampón de ensayo. Esta placa se colocó en un soporte de placa magnético y la solución se eliminó de los pocillos. Se cargaron los estándares, muestras y blancos en cada pocillo respectivo de la placa de 96 pocillos y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente (nota: se realizaron medidas en duplicado en cada estándar, muestra y blanco). La placa se lavó colocando la placa en el soporte de placa magnético, eliminando la solución, lavando con tampón de lavado, y eliminando el tampón de lavado colocando la placa de pocillos en el soporte de placa magnético. Se añadieron los anticuerpos de detección en cada pocillo y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces con tampón de lavado y se añadió estreptavidina-indicador PE a cada pocillo. La placa se incubó durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces en tampón de ensayo y se tomaron medidas en el lector multiplex MAGPIX. Los datos se analizaron en un software lector Bio-Plex (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y se utilizó un ANOVA bidireccional para comparar los grupos de tratamiento.

Los valores de citoquinas y factores de crecimiento de líquido amniótico de la semana 16-20 se obtuvieron de las publicaciones enumeradas a continuación:

1. Heikkinen J, Mottonen M, PuLkki K, Lassila O, Alanen A. Cytokine levels in midtrimester amniotic fluid in normal pregnancy and in the prediction of pre-eclampsia. Scand J Immunol. 2001;53(3):310-4.

2. Payne m S, Feng Z, Li S, Doherty DA, Xu B, Li J, Li L, Keelan JA, Zhou YH, Dickinson JE, Hu Y, Newnham JP.

Second trimester amniotic fluid cytokine concentrations, Ureaplasma sp colonization status and sexual activity as predictors of preterm birth in Chinese and Australian women. BMC Pregnancy Childbirth. 2014;14:340.

3. Burns C, Hall ST, Smith R, Blackwell C. Cytokine levels in late pregnancy: Are female infants better protected against inflammation? Front Immunol; 6:318.

Los resultados se muestran en la figura 6. Los métodos descritos producen un producto menos variable que el del líquido amniótico a término o líquido amniótico de la semana 16-20, como se indica por la menor desviación estándar. Los métodos descritos producen un producto que varía en del 11 al 25 %, mientras que las cantidades en el producto natural (ambos líquidos amnióticos) pueden variar desde el 44 hasta más del 100 %. Hay también un equilibrio más favorable entre componentes inflamatorios y antiinflamatorios del producto producido por los métodos descritos. Los componentes inflamatorios, IL-1 beta, IL-6 y TNF-alfa, son mucho menores en el producto producido por los métodos descritos que los encontrados en el líquido amniótico a término. Hay una proporción más favorable de IL-6 a IL-10 en el producto descrito por el método (10,8) que en el líquido amniótico a término (34,5). Hay mayores cantidades de componentes antiinflamatorios, IL-8 y MCP-1, en el producto producido por el método descrito que los encontrados en el líquido amniótico a término. Por último, las cantidades de estas proteínas, IL-1 beta, IL-6, TNF-alfa, IL-8, IL-10, y MCP-1, en el producto producido por los métodos descritos es más similar a las cantidades descritas para líquido amniótico de la semana 16-20 que líquido a término.

El término “cantidad eficaz” como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad suficiente de un agente, un compuesto, o ingredientes que se administran que aliviará a algún grado uno o más de los síntomas de la enfermedad o afección que se trata. El resultado puede ser la reducción y/o alivio de los signos, síntomas, o causas de una enfermedad, o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. Por ejemplo, una “cantidad eficaz” para usos terapéuticos es la cantidad de la composición que incluye un compuesto como se divulga en el presente documento requerida para proporcionar una disminución clínicamente significativa en síntomas de la enfermedad sin efectos secundarios adversos excesivos. Una “cantidad eficaz” apropiada en cualquier caso individual se puede determinar usando técnicas, tal como un escalado de la dosis. Una “cantidad eficaz” de un compuesto/ingredientes divulgados en el presente documento, es una cantidad eficaz para lograr un efecto farmacológico deseado o mejora terapéutica sin efectos secundarios adversos excesivos. Se entiende que “una cantidad eficaz” puede variar de sujeto a sujeto, debido a la variación en el metabolismo de la composición, edad, peso, estado general del sujeto, la afección que se trata, la gravedad de la afección que se trata, y el juicio del médico.

Se contempla y por tanto está en el ámbito de la presente invención que cualquier característica que se describe anteriormente se pueda combinar con cualquier otra característica que se describe anteriormente (incluso si esas características no se describen juntas). Se debe entender que la presente invención contempla y por tanto está en el ámbito de la invención que cualquier elemento que se describe se puede omitir de las composiciones (excepto para los necesarios para producir la utilidad deseada de la invención) y/o métodos de la presente invención. Cuando se divulgan intervalos, se debe indicar que cualquier punto numérico que se ajusta en el ámbito de ese intervalo se contempla como un nuevo punto final para un subintervalo. Además, se debe entender que la presente invención contempla modificaciones menores que se pueden hacer a los compuestos, composiciones y métodos de la presente invención. En cualquier caso, la presente invención se define por las siguientes reivindicaciones, que siguen y la amplitud de interpretación que permite la ley.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición derivada de placenta que comprende un extracto acelular de tejido placentario y uno o más inhibidores de proteasas exógenos, en donde el tejido placentario comprende un disco placentario.

2. La composición derivada de placenta de la reivindicación 1, en donde el uno o más inhibidores de proteasas comprende clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenesulfonilo (AEBSF), aprotinina pulmonar bovina, N-(trans-epoxisuccinil)-L-leucina 4-guanidinobutilamida, leupeptina, N-etilmaleimida (NEM), fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol-bis-(2-aminoetil(éter)NNN'N'-tetraacético, cloruro de amonio, boceprevir, danoprevir, narlaprevir, telaprevir, o vaniprevir.

3. La composición derivada de placenta de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el tejido placentario además comprende un corion velloso.

4. La composición derivada de placenta de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la composición comprende mayores cantidades de concentración de interleuquinas relativo a una composición derivada de placenta de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que se prepara en ausencia de inhibidores de proteasas exógenos.

5. Una preparación placentaria acelular que comprende un tejido placentario y uno o más inhibidores de proteasas exógenos, en donde el tejido placentario comprende un disco placentario, dicha preparación es obtenible mediante el siguiente proceso:

(1) homogenización del tejido placentario;

(2) lisis celular para generar restos celulares sólidos y un fluido acelular;

(3) separación de fluido acelular de los restos celulares sólidos; y

(4) liofilización y/o congelación del fluido acelular.

6. La preparación placentaria de la reivindicación 5, en donde el uno o más inhibidores de proteasas se añade antes de la homogenización.

7. La preparación placentaria de cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en donde el uno o más inhibidores de proteasas comprende clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenesulfonilo (AEBSF), aprotinina pulmonar bovina, N-(trans-epoxisuccinil)-L-leucina 4-guanidinobutilamida, leupeptina, N-etilmaleimida (NEM), fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol-bis-(2-aminoetil(éter)NNN'N'-tetraacético, cloruro de amonio, boceprevir, danoprevir, narlaprevir, telaprevir, o vaniprevir.

8. La preparación placentaria de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en donde el tejido placentario además comprende un corion velloso.

9. La preparación placentaria de cualquiera de las reivindicaciones 5-8, que comprende además diluyentes, excipientes o soportes.

10. La preparación placentaria de cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en donde la preparación comprende mayores cantidades de concentración de interleuquinas relativo a una preparación placentaria de cualquiera de las reivindicaciones 5-9 que se prepara en ausencia de inhibidores de proteasas exógenos.

11. La preparación placentaria de cualquiera de las reivindicaciones 5-10, en donde los inhibidores de proteasas no se eliminan de la preparación placentaria.

12. Un método de hacer un producto placentario acelular que comprende:

(1) añadir uno o más inhibidores de proteasas exógenos a tejido placentario, en donde el tejido placentario comprende un disco placentario;

(2) homogenizar el tejido placentario;

(3) lisar el tejido placentario para generar restos celulares sólidos y un fluido acelular;

(4) separar el fluido acelular de los restos celulares sólidos; y

(5) liofilizar y/o congelar el fluido acelular.

13. El método de la reivindicación 12, en donde el uno o más inhibidores de proteasas comprende clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenesulfonilo (AEBSF), aprotinina pulmonar bovina, N-(trans-epoxisuccinil)-L-leucina 4-guanidinobutilamida, leupeptina, N-etilmaleimida (NEM), fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol-bis-(2-aminoetil(éter)NNN'N'-tetraacético, cloruro de amonio, boceprevir, danoprevir, narlaprevir, telaprevir, o vaniprevir.

14. El método de la reivindicación 12 o 13, que además comprende filtrar el fluido acelular.

15. La composición o preparación placentaria de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para uso en tratar a un individuo que tiene una enfermedad seleccionada del grupo que comprende artritis, cicatrización, tratamiento de cicatrices, crecimiento de tejido, cicatrización de tejido, regeneración/reparación de matriz tisular, injerto, inflamación y afecciones asociadas con modular la señalización de TGF-p y otras proteínas placentarias.