ES2907553T3 - Cultivo o expansión in vitro de tejido humano o animal - Google Patents

Abstract

Método de cultivo o expansión in vitro de tejido humano o animal, que comprende reducir el tamaño del tejido de una muestra obtenida de tejido humano o animal; generar un conjunto colocando el tejido reducido en tamaño entre dos andamiajes de manera que el conjunto es un conjunto de sándwich; disponer el conjunto dentro de una cámara de cultivo de un sistema de perfusión 3D; y perfundir el conjunto en el sistema de perfusión 3D durante un tiempo predefinido.

Description

DESCRIPCIÓN

Cultivo o expansión in vitro de tejido humano o animal

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método de cultivo o expansión in vitro de tejido humano o animal, a un método para poner a prueba (“testing”) la eficacia del tratamiento tumoral o de cáncer que utiliza dicho método de cultivo o expansión, y a un método de enriquecimiento de células de un tipo celular a partir de un tejido tumoral humano o animal que utiliza dicho método de cultivo o expansión.

Antecedentes de la técnica

En los últimos años, las pruebas científicas que demuestra la insuficiencia de los cultivos celulares monocapa han fomentado el desarrollo de técnicas que permiten el cultivo de células en un medio tridimensional (3D). Entre dichas técnicas se incluyen la utilización de biomateriales porosos adecuados, es decir, andamiajes, que pueden sembrarse con células, aunque pueden comprender además agregados celulares, estructuras de tejidos o de tipo tisular, biopsias y similares. Por ejemplo, se han establecido cultivos in vitro estáticos de especímenes tumorales procedentes de tumores epiteliales, tales como el cáncer colorrectal, que han permitido la supervivencia y expansión de tejido primario, aunque en un grado muy limitado. Además, por ejemplo, en los documentos WO 2010/035049 A1, AU 2004202491 B2 y WO 01/48153 A1, se describen técnicas para la preparación de tejido para el cultivo.

En consecuencia, se han puesto a disposición herramientas para responder a necesidades específicas inherentes a dichas técnicas. Entre dichas herramientas, los biorreactores proporcionan un medio fisicoquímico controlado que resulta adecuado para el cultivo de las células en 3D. En particular, los biorreactores de perfusión han demostrado ser eficaces en la superación de las limitaciones típicas de los cultivos estáticos. Entre dichas limitaciones se incluyen la falta de una siembra celular uniforme en todo el andamiaje, un transporte de masas limitado, es decir, el suministro de nutrientes y la eliminación de desechos, particularmente en la parte central del andamiaje.

En el presente contexto, el documento WO 2013/182574 A1 presenta un biorreactor y sistema de perfusión 3D que permite un funcionamiento y una manipulación convenientes en un cultivo celular eficiente de tejido humano o animal. Además de otros, puede incrementarse la disponibilidad de nutrientes y el suministro de oxígeno mediante la utilización de dicho sistema de biorreactor perfundido 3D.

Sin embargo, algunas estirpes celulares específicas, tales como estirpes celulares de cáncer, ampliamente utilizadas para estudios preclínicos, sólo reflejan mínimamente la heterogeneidad del tejido (tumoral) del que se originan. Son mayoritariamente homogéneas genéticamente, con alguna heterogeneidad morfológica limitada y adaptadas a placas de plástico durante décadas de cultivos in vitro. Un estudio reciente ha comparado los cambios del número de copia, las mutaciones y los perfiles de expresión de ARNm de estirpes celulares de cáncer ovárico utilizadas habitualmente y muestras tumorales de cáncer ovárico seroso de alto grado. Alarmantemente, las estirpes celulares utilizadas raramente en dicho caso eran más similares a los perfiles tumorales afines que las estirpes celulares utilizadas habitualmente. Debido a lo anterior, la traducción de los estudios basados en estirpes celulares en sus contrapartidas de paciente no siempre resulta fácil de realizar.

El microambiente tumoral consiste en componentes celulares, por ejemplo, células estromales e inmunitarias, y no celulares, por ejemplo, la matriz extracelular. Aunque caracterizadas por su crecimiento celular invasivo maligno in vivo la mayoría de células de cáncer depende fuertemente de dichos factores para un crecimiento sostenido in vivo, así como in vitro. Las células estromales e inmunitarias influyen fuertemente sobre los patrones de crecimiento tumoral.

En el contexto del cáncer colorrectal, se ha demostrado que la retención del contacto célula-célula incrementa la eficiencia de la generación de esferoides de células tumorales a partir de especímenes de cáncer colorrectal primario. Por lo tanto, la provisión de señales dependientes del nicho podría resultar crucial para las células tumorales.

Por otra parte, los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX), generados mediante la implantación subcutánea de tejido tumoral, han sido propuestos para superar las limitaciones de disponibilidad de material tumoral. La eficiencia informada depende del tipo tumoral y para el cáncer colorrectal es de aproximadamente 68%. Puede observarse crecimiento tumoral después de 1 a 2 meses. Los estudios han mostrado que los tumores generados se corresponden más con la lesión metastásica que con el tumor primario del que se han derivado.

Para los xenoinjertos derivados del cultivo celular de esferoides y derivados de pacientes, la heterogeneidad del microambiente tumoral inicial se pierde con el tiempo, ya que sólo sobrevive y se expande la fracción de células epiteliales. En el caso de los PDX, las células estromales humanas se sustituyen por células estromales de ratón.

Por lo tanto, la composición inicial resulta drásticamente modificada.

Por lo tanto, existe una necesidad de sistemas o métodos de cultivo que permitan la supervivencia con el tiempo de tejido tumoral completo, incluyendo los tipos celulares implicados, tales como componentes estromales y componentes epiteliales.

Divulgación de la invención

Según la invención dicha necesidad se satisface mediante un método de cultivo o expansión in vitro de tejido humano o animal según se define mediante las características en la reivindicación independiente 1, un método de poner a prueba la eficacia del tratamiento tumoral o del cáncer según se define mediante las características en la reivindicación 9 y mediante un método de enriquecimiento en células de un tipo celular de tejido tumoral humano o animal según se define mediante las características en la reivindicación independiente 13. Las formas de realización preferidas son el objeto de las reivindicaciones dependientes.

En particular, la invención se refiere a un método de cultivo o expansión in vitro de tejido humano o animal, que comprende las etapas de: obtención de una muestra de tejido humano o animal; reducir el tamaño (“downsizing”) del tejido de la muestra; generar un conjunto mediante la colocación del tejido de tamaño reducido entre dos andamiajes de manera que el conjunto es un conjunto de sándwich, disponiendo el conjunto dentro de una cámara de cultivo de un sistema de perfusión 3D, y perfundir el conjunto en el sistema de perfusión 3D durante un tiempo predefinido.

El tejido humano o animal puede ser tejido de cáncer y, particularmente, tejido de cáncer colorrectal. Además, el tejido puede ser tejido de glioblastoma, tejido de melanoma, tejido de cáncer de vejiga, tejido de cáncer de próstata, tejido de cáncer de mama o cualquier otro tejido tumoral.

El sistema de perfusión 3D puede ser particularmente un biorreactor de perfusión 3D, tal como el biorreactor descrito en el documento WO 2013/182574 A1.

La expresión "reducir de tamaño" tal como se utiliza en la presente memoria puede referirse particularmente a una predigestión y/o un tratamiento mecánico del tejido. El tejido digerido o reducido de tamaño pueden ser agregados celulares y fragmentos de tejido de una pluralidad de células, tal como decenas a cientos de células. Los trozos de tejido o agregados celulares pueden presentar un tamaño de entre aproximadamente 0.5 mm y aproximadamente 2 mm, tal como, por ejemplo, de 1 mm x 1 mm. De esta manera, la reducción de tamaño del tejido puede estar relacionada con proporcionar agregados celulares y/o fragmentos de tejidos o con fragmentar el tejido.

El andamiaje puede realizarse en cualquier material de origen natural o sintético adecuado. Por ejemplo, puede realizarse en polietileno o particularmente, en colágeno, que puede ser comparativamente eficiente con respecto al crecimiento y la manipulación. El andamiaje puede recubrirse con o sin proteínas de matriz extracelular (por ejemplo, matrigel, etc.) y/o precultivarse con fuentes celulares apropiadas (por ejemplo, células estromales, etc.). Además, el andamiaje puede proporcionarse en una forma adaptada a la forma de la cámara de cultivo del biorreactor. Por ejemplo, para cámaras de cultivo cilíndricas del sistema de perfusión 3D, el andamiaje preferentemente puede presentar una forma de disco.

Para perfundir el conjunto en el biorreactor, puede utilizarse un medio que, por ejemplo, puede seleccionarse de entre el grupo de: medio libre de suero o medio que contiene suero que consiste en suero humano o animal, plasma derivado de pacientes, suero humano agrupado, suero de feto bovino o combinaciones de los mismos. Tal como es conocido a partir de datos anteriores, el suero autólogo y humano puede resultar preferido, ya que estimula el crecimiento de células tanto estromales como epiteliales, mientras que el suero de feto bovino (FCS) preferentemente estimula la expansión de las células estromales. El suero autólogo (SA) puede prepararse mediante la recolección de una muestra de sangre completa del paciente relacionado con el tejido tumoral, con una jeringa sin adición de anticoagulantes; centrifugación de la sangre a 2600g durante 30 minutos y a 4°C, y recolección del sobrenadante definido como SA. Puede obtenerse plasma autólogo (aHP) mediante el mismo procedimiento, aunque recogiendo sangre con anticoagulantes (como heparina o EDTA).

El método según la invención permite incrementar en varias veces la cantidad total de tejido, por ejemplo, de una estirpe celular de cáncer colorrectal mediante perfusión directa en el sistema de perfusión 3D. Basándose en características morfológicas y la expresión de genoma completo, las estructuras de tipo tisular generadas pueden ser más similar a los tejidos generados in vivo, tales como tumores. Además, su sensibilidad o resistencia al tratamiento farmacológico es similar a la de los xenoinjertos y, por ejemplo, incluso las muestras de cáncer colorrectal tratadas mediante quimioterapia neoadyuvante. Por lo tanto, el sistema de perfusión 3D puede preservar importantes funciones del tejido tumoral inicial. Mediante la utilización de trozos de tejido pequeños, es decir, el tejido de tamaño reducido, puede mantenerse la composición del microambiente tumoral inicial y puede conseguirse la integración del tejido en el andamiaje circundante o próximo.

El método según la invención permite preparar y cultivar directamente especímenes de tejido fresco in vitro, tal como especímenes tumorales de cáncer colorrectal, para un cultivo in vitro altamente eficiente utilizando un sistema de biorreactor perfundido, es decir, el sistema de perfusión 3D. Debido a que las células individuales del tejido experimentan en la mayoría de casos la muerte celular debido a la falta de señales microambientales, la utilización de tejido de tamaño reducido, incluyendo agregados celulares y fragmentos de tejido de cientos de células, puede ayudar no sólo a evitar la muerte celular in vitro, sino a mantener el microambiente tisular heterogénea inicial que consiste en tipos celulares específicos, tales como células epiteliales, estromales e inmunitarias.

De esta manera, el método según la invención permite cultivar eficientemente el tejido tumoral completo durante el tiempo. Puede permitir una supervivencia incrementada de todos los tipos celulares originales, tales como tanto partes estromales como epiteliales del tumor inicial.

Preferentemente, la reducción del tamaño del tejido comprende pretratar mecánicamente el tejido. Dicho pretratamiento mecánico puede ser el corte, trituración, recorte o similar y combinaciones de los mismos. De esta manera el tejido puede reducirse de tamaño eficientemente. Alternativa o adicionalmente, la reducción del tamaño del tejido comprende preferentemente pretratar enzimáticamente el tejido. Lo anterior puede proporcionar una reducción de tamaño eficiente adicional del tejido, en la que una combinación con el pretratamiento mecánico puede resultar particularmente beneficiosa.

Preferentemente, el método según la invención comprende además limpiar el tejido antes de generar el conjunto. De esta manera, puede llevarse a cabo la operación de limpieza después de la reducción de tamaño del tejido, o particularmente antes de reducir el tamaño del tejido. Dependiendo del tejido, dicha operación de limpieza puede resultar particularmente beneficiosa. Mientras que, por ejemplo, el tejido mamario típicamente es aséptico, de manera que no resulta necesario ninguna operación de limpieza, el tejido del colon presenta bacterias, de manera que limpiar el tejido puede resultar útil. De esta manera, la limpieza del tejido preferentemente comprende lavar el tejido. Dicho lavado puede proporcionar una limpieza comparablemente simple del tejido. Alternativa o adicionalmente, la operación de limpieza del tejido preferentemente comprende el tratamiento antiséptico. El tratamiento antiséptico puede llevarse a cabo, por ejemplo, con una octenidina o una preparación que comprende dihidrocloruro de octenidina. Dicho tratamiento antiséptico permite limpiar eficientemente el tejido, en el que una combinación con el lavado puede resultar particularmente beneficiosa.

Preferentemente, generar el conjunto comprende disponer una rejilla en un lado y una rejilla adicional en la otra cara. De esta manera, generar el conjunto puede comprender fijar las rejillas, el andamiaje o andamiajes y limpiar el tejido que se ha reducido de tamaño junto con un anillo. El anillo puede ser particularmente un anillo realizado en politetrafluoroetileno (Teflon). Dicho conjunto comprende el andamiaje o andamiajes, rejilla y, finalmente, el anillo puede formar un conjunto compacto que permite una carga o manipulación estática comparativamente fácil, por ejemplo, en relación con el biorreactor.

La generación del conjunto comprende colocar el tejido que se ha reducido de tamaño entre dos andamiajes de manera que el conjunto sea un conjunto de tipo sándwich. Además, el conjunto puede comprender una pluralidad de andamiajes que alternan con una pluralidad de capas de tejido que se ha reducido de tamaño. Por ejemplo, dos capas de células pueden alternar con tres andamiajes o tres capas de células pueden alternar con cuatro andamiajes. En los casos en que se utiliza una rejilla para generar el conjunto, la rejilla puede disponerse en uno de los andamiajes y una rejilla adicional en el otro de los andamiajes. En particular, la rejilla puede disponerse en la cara del andamiaje orientada hacia el exterior del tejido que se ha reducido de tamaño y limpiado y la rejilla adicional puede disponerse en la cara del otro de los andamiajes orientada hacia el exterior del tejido que se ha reducido de tamaño y limpiado.

Preferentemente, dentro del sistema de perfusión 3D el conjunto se perfunde directamente. En el presente contexto, el término "directo" se refiere a perfundir el tejido con un medio a través del conjunto o constructo. Por lo tanto, en contraste, son tecnologías de rebosamiento que utilizan microcanales o tecnologías similares en las que se suministra una capa celular 2D con nutrientes mediante flujo continuo sobre, y no a través de, las células. Sin embargo, ha resultado ser más eficiente dejar que las células crezcan más homogéneamente al perfundir directa y tridimensionalmente las células.

Preferentemente, la perfusión del conjunto dentro del biorreactor se aplica en sentidos alternos. En comparación con la perfusión unidireccional, una perfusión en sentidos alternos puede incrementar la eficiencia de crecimiento del tejido.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método de poner a prueba la eficacia del tratamiento tumoral o del cáncer, que comprende: obtener tejido del tumor o cáncer de un paciente; cultivar el tejido en un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores; aplicar un tratamiento al tejido; monitorizar el tejido, y evaluar los cambios en el crecimiento, viabilidad y/o volumen monitorizados del tejido tras el tratamiento.

De esta manera, el tratamiento puede comprender la provisión de una o una pluralidad de sustancias o medicamentos, la aplicación de un régimen de dosificación particular, la irradiación, quimioterapias, protocolos de irradiación o cualquier otro tratamiento adecuado para tratar los pacientes tumorales o de cáncer, o combinaciones de los mismos. Dicho método permite evaluar un tratamiento particular con respecto a su eficiencia en un tumor o cáncer particular o específico. Lo anterior hace posible una evaluación eficiente de un tratamiento apropiado para un tumor o cáncer particular.

Preferentemente, dicho método comprende, además: obtener tejido adicional del tumor o cáncer del paciente; cultivar el tejido adicional en el método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores; aplicar un segundo tratamiento al tejido adicional; monitorizar el tejido adicional; y seleccionar el primer tratamiento o el segundo tratamiento mediante la evaluación del crecimiento, viabilidad y/o volumen monitorizado del tejido y del tejido adicional tras el tratamiento.

El tratamiento y el segundo tratamiento puede llevarse a cabo secuencial o simultáneamente. Pueden llevarse a cabo durante un periodo de tiempo predefinido idéntico. De esta manera, el periodo de tiempo puede predefinirse que es un par de días.

Mediante la comparación de la situación in vitro de una muestra de tejido tumoral derivado de paciente particular tratada diferencialmente, puede seleccionarse un tratamiento in vivo apropiado u optimizado. Lo anterior permite seleccionar eficientemente un tratamiento preferido para el paciente.

Preferentemente, el primer tratamiento comprende la provisión de una primera sustancia en el tejido y el segundo tratamiento comprende la provisión de una segunda sustancia al tejido adicional. Las primera y segunda sustancias pueden comprender ingredientes farmacéuticos activos iguales o diferentes. Las primera y segunda sustancias pueden ser medicamentos adecuados para tratar los pacientes tumorales o de cáncer.

Preferentemente, el primer tratamiento comprende un primer régimen de dosificación y el segundo tratamiento comprende un segundo régimen de dosificación. De esta manera, los primer y segundo tratamientos pueden ser, por ejemplo, la provisión de una sustancia o una pluralidad de sustancias a las diferentes dosis.

Otro aspecto adicional de la invención se refiere a un método de enriquecimiento en células de un tipo celular específico de tejido tumoral humano o animal, que comprende cultivar el tejido tumoral en un método de cultivo o expansión in vitro de tejido humano o animal tal como se ha indicado anteriormente durante un periodo de tiempo predefinido. Por ejemplo, dichas células pueden ser células de estroma tumoral, células inmunitarias infiltrantes de tumor o células epiteliales tumorales. De esta manera, el método preferentemente comprende además el aislamiento de las células del tipo celular a partir del tejido tumoral.

Preferentemente, el método comprende además las etapas de: comparación de la pluralidad de medios de perfusión con respecto a sus capacidades de propagar las células del tipo celular; la identificación de un medio de perfusión de entre la pluralidad de medios de perfusión bajo consideración de sus capacidades, y la selección del medio de perfusión preferido para perfundir el conjunto de sándwich en el biorreactor. Lo anterior permite enriquecer eficientemente en un tipo celular específico. Para enriquecer en las células estromales tumorales, por ejemplo, RPMI1640 puede ser el medio de perfusión preferido. En dicha forma de realización preferida, el tejido tumoral asimismo puede cultivarse en otro método diferente del método de cultivo o expansión in vitro de tejido humano o animal indicado anteriormente.

Dichos aspectos y otros de la invención resultarán evidentes y se dilucidarán haciendo referencia a la forma o las formas de realización descritas a continuación en la presente memoria.

Breve descripción de los dibujos

Los métodos según la invención se describen con mayor detalle a continuación en la presente memoria mediante formas de realización ejemplificativas y haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

Figura 1 representa un diagrama de flujo de una forma de realización de un método de poner a prueba la eficacia del tratamiento tumoral o de cáncer según la invención mediante la utilización de una forma de realización de un método de cultivo o expansión in vitro de tejido humano o animal según la invención.

Figuras 2 a 7 representan un primer ejemplo específico de una forma de realización adicional del método de cultivo o expansión in vitro de tejido humano o animal según la invención, en la que Figura 2 representa un cultivo de perfusión primario de especímenes de CRC.

Figura 3 representa la capacidad de formación de tejido bajo el cultivo de perfusión.

Figura 4 representa tinciones de inmunofluorescencia para marcadores epiteliales, estromales y de proliferación.

Figura 5 representa el efecto del flujo sobre el crecimiento del tejido.

Figura 6 representa la expansión del tejido durante un cultivo de 20 días.

Figura 7 representa la supervivencia de las células en suspensión.

Figuras 8 a 14 representan un segundo ejemplo específico de una forma de realización adicional del método de cultivo o expansión in vitro de tejido humano o animal según la invención, en la que

Figura 8 representa el diseño experimental.

Figura 9 representa un análisis histológico representativo del tejido tumoral que se ha reducido de tamaño, es decir, el espécimen tumoral P262; día 0 — tejido original; día 10 — después del cultivo en U-CUP; xenoinjerto el día 61 — suspensión de células individuales tumorales digeridas, inyectadas por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes.

Figura 10 representa unos marcadores de células hematopoyéticas.

Figura 11 representa un análisis de cuantificación.

Figura 12 representa unas histologías de tejido de cáncer de mama luminal A, es decir, en el panel izquierdo: tejido original, y en el panel derecho: tejido tumoral cultivado en biorreactor de perfusión 3D (H+E: hematoxilina-eosina, CK22: pan-citoqueratina, RE: receptor de estrógeno).

Figura 13 representa el ensayo in vitro de fármaco con cáncer de mama luminal A.

Figura 14 representa la inmunohistoquímica de cáncer de mama luminal A (MAM18) tratado durante 7 días con PHA (1 ng/ml) en el que CD45 tiñe los linfocitos infiltrantes totales, CD3 tiñe las células T y CD68 tiñe los macrófagos.

Descripción de las formas de realización

La figura 1 representa una forma de realización del método de poner a prueba la eficacia del tratamiento tumoral o de cáncer según la invención (el método de selección) en el que se aplica una forma de realización de un método de cultivo o expansión in vitro de tejido humano o animal según la invención (el método de cultivo). El método de selección comprende una primera etapa en la que tejido de un tumor y tejido adicional del mismo tumor se cultivan idénticamente con el método de cultivo 1, 1'. En éste, el tejido y el tejido adicional se limpian mediante lavado y tratamiento antiséptico y se reduce su tamaño o se predigieren mediante tratamiento mecánico y enzimático 11, 11'. Cada uno del tejido predigerido y el tejido adicional predigerido se dispone entre dos andamiajes de colágeno en forma de disco. Se disponen rejillas en la parte superior y en la parte inferior del conjunto de tejido de andamiaje y el conjunto de tejido adicional de andamiaje, respectivamente. El conjunto de rejilla, andamiajes y tejido, así como el conjunto de rejilla, andamiajes y tejido adicional a continuación se fijan entre sí mediante un anillo de politetrafluoroetileno (teflón). De esta manera, se forma un conjunto de sándwich y un conjunto de sándwich adicional 12, 12'.

El conjunto de sándwich y el conjunto de sándwich adicional a continuación se introducen en cámaras de cultivo de biorreactores de perfusión 3D tal como se indica en el documento 2013/182574 A1, 13, 13'. Dentro de los biorreactores de perfusión 3D, el conjunto de sándwich y el conjunto de sándwich adicional a continuación perfunden con un medio apropiado durante varios días, tal como, por ejemplo, durante diez días o veinte días, 14, 14'.

En una segunda etapa del método de selección, se aplica un primer tratamiento en el tejido 2 y se aplica un segundo tratamiento en el tejido adicional 2'. De esta manera, se proporciona un primer medicamento para el tratamiento de tumores al tejido en un primer régimen de dosificación y se proporciona un segundo medicamento diferente del primer medicamento en el tejido adicional en un segundo régimen de dosificación. En otras formas de realización, los primer y segundo medicamentos son iguales y los primer y segundo tratamientos únicamente varían en el régimen de dosificación aplicado o los primer y segundo regímenes de dosificación son iguales y los primer y segundo tratamientos sólo varían en los medicamentos utilizados. En otras formas de realización adicionales, se aplican más de dos tratamientos en el tejido tumoral.

Al final de la segunda etapa, el tejido y el tejido adicional son evaluados, en la que se califica la eficiencia del primer y segundo tratamientos 3. Por ejemplo, la comparación del tejido y el tejido adicional, por ejemplo, con respecto al volumen y/o la apoptosis, puede conducir a la conclusión de que el primer o el segundo tratamiento bloquea más eficientemente el tejido tumoral específico. A continuación, se selecciona el tratamiento más eficiente 4 y se aplica en el paciente 5.

A continuación, se describe con mayor detalle un primer ejemplo específico de una forma de realización adicional del método de cultivo o expansión in vitro de tejido humano o animal según la invención.

Medio, complementos y andamiaje

Se mantuvieron especímenes de células de tejido tumoral hasta 20 días en RPMI (Sigma-Aldrich®) o DMEM/F12 (Gibco®) que contenía GlutaMAXTM-l al 1% 100x (Gibco®), sulfato de kanamicina al 1% 100x (Gibco®), metronidazol (250x; 200 mg/ml, Braun), Cefuroxim (250x; 15 mg/ml, Braun), fungizol al 1% (Sigma-Aldrich), HEPe S 1 M al 1% (Gibco®), N-acetil-cisteína 1 mM (NAC, 500x, solución madre 500 mM, Sigma-Aldrich), nicotinamida 10 mM (Nic, 100x, solución madre 1 M, Sigma-Aldrich). Son suplementos adicionales la prostaglandina E2, 0.1 pg/ml (Tocris Bioscience) y el factor de crecimiento epidérmico, 25 ng/ml (Stem Cell Technologies, Grenoble, Francia).

Para las condiciones de cultivo derivado de sangre se utilizó plasma derivado de pacientes, suero humano agrupado (banco de sangre, University Hospital Basel, Suiza) o suero de feto bovino (Gibco®) a una concentración de 10%. Para los complementos de cultivo de organoides de cultivo estándar libre de suero, se utilizó B27 al 2% (Invitrogen) y N2 al 1% (Invitrogen).

Se obtuvieron andamiajes de colágeno (UF) (Ultrafoam Avitene Collagen Hemostat®, UF) de Davol Inc., Warwick, EE.UU. Se obtuvo una malla de andamiaje de polietileno no tejido (185 g/m2, punzonado, n° de cat. N. 72.185.503, PET) de Norafin Industries, Mildenau, Alemania. Se obtuvieron andamiajes entrecruzados con colágeno (Optimaix) de Matricel GmbH, Alemania. Los andamiajes se cortaron con un punzón de biopsia para 8 mm para el conjunto de sándwich de colágeno.

Materiales de tejido humano

Se obtuvieron muestras de especímenes de cáncer colorrectal recién resecado quirúrgicamente (n=24), glioblastoma (n=3) o cáncer de mama (n=11) de pacientes operados en University Hospital Base, Regiona1Hospital Olten o Regional Hospital Lugano. Las muestras de tejido iniciales eran de 3 a 5 mm de diámetro y fueron extraídas por un patólogo del centro tumoral. El tejido se lavó cuidadosamente en solución salina tamponada con fosfato a 4°C (PBS, Sigma-Aldrich).

Preparación de tejidos triturados y troceados o tejido que ha sido reducido en tamaño

El tejido se lavó tres veces con PBS y se trituró en trozos con un escalpelo. A continuación, el tejido triturado se predigirió enzimáticamente en DMEM (GIBCO) con colagenasa IV (100x, solución madre 20 kU/ml, Worthington CLSS-4), ADNasa I (100x, solución madre 50 mg/ml, Sigma Aldrich D5025), HEPES (100x, solución madre 1 M, GIBCO 15630-056), Kanamicina (100x; GIBCO 15160-047), anfotericina B (100x, solución madre 250 pg/ml; Sigma-Aldrich A9528), metronidazol (250x; solución madre 200 mg/ml, Braun), Cefuroxim (250x; solución madre 15 mg/ml, Braun) durante 1 hora a 37°C bajo rotación continuamente suave en un rotador de tubos MACSmix (Miltenyi Biotec). El tejido en trozos generado se lavó una vez con PBS, incluyendo EDTA 1:250 y suero humano agrupado al 10% (Blood Bank, University Hospital Basel, Suiza) y se trató posteriormente durante 5 min con una solución al 2.5% de Octenisept (Schülke&Mayr, Alemania)-solución de suero humano al 10%-PBS. Para eliminar el Octenisept por completo, se llevó a cabo un lavado adicional con EDTA-HS-PBS.

Cultivo perfundido 3D en un conjunto de sándwich de colágeno

Con trozos de tejido en cultivo en 3D bajo perfusión se utilizó el sistema biorreactor de perfusión para la siembra y cultivo celular de andamiajes 3D descrito en el documento WO 2013/182574 A1. Los fragmentos (trozos) de tejido predigeridos se introdujeron en el andamiaje junto con el digerido celular restante. Se pudieron introducir 2 a 3 fragmentos de tejido más grandes (de 0.5 mm de tamaño). A continuación, se transfirieron los andamiajes al soporte de andamiajes y se aplicó otro andamiaje para obtener el conjunto de sándwich-colágeno. Se utilizó una rejilla en la parte superior e inferior del andamiaje de colágeno y los andamiajes se fijaron mediante un anillo de teflón. A continuación, dicho constructo se introdujo en la cámara de cultivo del biorreactor de perfusión. Se seleccionó un caudal de 0.3 ml/min para el cultivo de perfusión.

Se llevó a cabo un cambio de medio dos veces a la semana. Los constructos se recolectaron a los 10 o 20 días. La cuantificación del ADN, y el análisis histológico y de inmunofluorescencia se llevaron a cabo para dichos puntos temporales.

Cultivo celular de organoides de los tejidos troceados

Para el cultivo celular de organoides de los tejidos troceados, se utilizó un método anterior descrito anteriormente por Sato et al. (Gastroenterology 2011). Brevemente, se cultivaron fragmentos, que medían 0.5 a 1 mm, en placas de 24 pocillos recubiertas con Matrigel (de factor de crecimiento reducido, sin rojo fenol; BD Bioscience, Suiza). El medio de cultivo con complementos se aplicó en capas y los fragmentos de tejido se cultivaron durante el mismo periodo de cultivo que los cultivos perfundidos 3D.

Cuantificación del ADN

Las muestras recogidas tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria se digirieron adicionalmente con solución de proteinasa K (1 mg/ml de proteinasa K, TRIS 50 mM, EDTA 1 mM, yodoacetamida 1 mM y pepstatina-A 10 pg/ml; Sigma-Aldrich, EE.UU.) en agua doblemente destilada o tampón de fosfato potásico durante 16 h a 56°C tal como se ha indicado anteriormente.

La cuantificación del ADN se llevó a cabo mediante un kit basado en fluorescencia disponible comercialmente, de nombre ensayo de proliferación celular CyQUANT® (Invitrogen, EE.UU.). Las soluciones de trabajo se prepararon de acuerdo con los protocolos del fabricante. Los análisis se llevaron a cabo mediante medición de la fluorescencia con un espectrofluorímetro de microplacas Spectra Max Gemini XS (Molecular Devices, EE.UU.). Las longitudes de onda de excitación y emisión eran de 485 nm y 538 nm, respectivamente. Las muestras en cada placa incluían una curva de calibración. Cada muestra se midió por triplicado.

Tinción histológica e inmunofluorescencia

Los tejidos tumorales-colágeno se fijaron después del cultivo de perfusión 3D durante la noche en paraformaldehído al 1.5% a 4°C, se incluyeron en parafina (TPC15 Medite, Suiza) y se seccionaron (5 pm de grosor) mediante un micrótomo (Leica, Suiza). Las secciones de parafina se desparafinaron, se hidrataron y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H+E), seguido de la observación bajo microscopia óptica.

Los análisis de inmunofluorescencia en secciones incluidas en parafina se llevaron a cabo tras la recuperación de antígenos a 95°C durante 30 min con la solución preparada para utilizar de recuperación de diana (DAKO S1700). Para caracterizar la población de células en proliferación se utilizó el anticuerpo monoclonal Ki67 1:100 (Rb mAb FITC, AbCAM, ab27619). Para la visualización de células estromales, se aplicó anticuerpo monoclonal vimentina (mAb de conejo, Cell Signaling 5741), y para las células epiteliales, se aplicó anticuerpo monoclonal EPCAM (mAb de ratón, Cell Signaling 2929). Con el fin de mejorar la fuerza e la señal, se aplicó un anticuerpo monoclonal secundario de cabra anticonejo, Alexa-Fluor 488 1: 400 (IgG, Invitrogen) y anticuerpo monoclonal de cabra antirratón Alexa-Fluor 546 1:400 (IgG, Invitrogen), respectivamente. Los núcleos se tiñeron con DAPI 1:100 (Invitrogen). Las secciones histológicas e inmunohistoquímicas se analizaron con un microscopio BX-61 (Olympus, Alemania).

Análisis de citofluorimetría de flujo

El sobrenadante de muestras primarias en cultivo se tiñó con EPCAM-APC (ab27619, clon SP6, Abcam, Cambridge, Reino Unido) y yoduro de propidio (Sigma-Aldrich). Los análisis se llevaron a cabo utilizando un citómetro de flujo FACSalibur (BD Biosciences, Alemania). Se ajustaron las puertas según el control de isotipo respecto a muestra no teñida.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se llevó a cabo tal como se ha indicado anteriormente (Flis et al., Anticancer Res 2009). Los datos se expresan como valores medios±desviación estándar (SD).

Resultados

Respecto a especímenes de cáncer colorrectal primario en cultivo para el cultivo 3D in vitro se aprovechó la ventaja de un biorreactor de perfusión anteriormente descrito adaptado a las necesidades específicas (figura 2). Debido a que informes anteriores mencionan la dependencia crítica de las células de tumor primario respecto de señales de nicho, la heterogeneidad celular y la arquitectura 3D, se utilizó tejido triturado predigerido o fragmentos de tejido para el cultivo de perfusión. El pretratamiento enzimático de fragmentos de tejido mejora su capacidad de formación de tejido (figura 2.1), tal como se ha mencionado anteriormente.

Los microorganismos comensales contaminan fuertemente los especímenes de tejido de CRC. Por lo tanto, se llevó a cabo un lavado inicial con PBS-EDTA complementado con HS al 10% y un tratamiento breve con Octenispet al 2.5%, para reducir la carga bacteriana.

Tras la preparación y pretratamiento, se colocaron fragmentos de tumor entre dos andamiajes de colágeno, por ejemplo, en un "andamiaje de sándwich" o conjunto de sándwich. Dicha etapa resulta necesaria no sólo para mantener en su sitio los especímenes de tejido después de la carga estática bajo perfusión, sino además para permitir la expansión y remodelado del tumor en el andamiaje circundante. Un cultivo de perfusión de diez días resulta en una profunda reestructuración de los andamiajes de colágeno en comparación con sus contrapartidas vacías (figura 3). Otros andamiajes sometidos a ensayo, tales como los andamiajes de polietileno o de colágeno entrecruzado, resultan menos adecuados para la generación de estructuras de tipo tisular (figura 2.3).

Los estudios iniciales han mostrado la superioridad del plasma humano autólogo sobre el suero de feto bovino en la formación más densa y de mayor tamaño de tejido mediante tinciones de H+E. Debido a que la disponibilidad de plasma humano autólogo habitualmente es limitada, se utilizó suero humano agrupado para el cultivo de tejidos, que pudo proporcionar estructuras de tejido similares con el tiempo. El suero humano agrupado muestra una tendencia de rendimiento y calidad de tejido superior en comparación con los enfoques convencionales sin suero que utilizan B27/N2, según la evaluación mediante cultivo celular de organoides y de perfusión. Tal como se ha indicado para los cultivos 3D estáticos, la adición de prostaglandina E 2 (PGE2) y factor de crecimiento epidérmico (EGF), podría ayudar a incrementar adicionalmente la formación de tejido. Mediante la medición de la cantidad de ADN total y la evaluación histológica, se observó una tendencia similar, y por lo tanto, se utilizó para el medio de cultivo de perfusión complementado con suero humano agrupado disponible comercialmente junto con EGF y PGE2.

Mediante la utilización del enfoque descrito anteriormente en la presente memoria para el cultivo tumoral, tras diez días de cultivo se observó un fuerte remodelado de los andamiajes de colágeno. En todos los casos sometidos a ensayo eran claramente visibles grandes nódulos tumorales de hasta un milímetro de diámetro. La capacidad de remodelado dependía del paciente individual y el estado del tejido, por ejemplo, fresco o congelado, antes del cultivo. Resulta interesante que el medio RPMI1640 aparentemente inducía una reestructuración más fuerte del andamiaje de colágeno que el medio DMEM/F12 (figura 3.A).

En la evaluación histológica se observó la formación de tejido heterogéneo con partes tanto epiteliales como estromales, según se detectó mediante tinción específica con EpCAM o vimentina, respectivamente (figuras 4.B, 3.C). En algunos casos, pudo observarse la infiltración por linfocitos. El medio RPMI1640 estimula la proliferación estromal en un grado ligeramente superior a DMEM, según se observa en la vista macroscópica y en la evaluación histológica (figura 3.B). Resulta interesante que las células epiteliales formaron barreras o estructuras de acinos y finalmente llevaron a sostener protuberancias de tipo vellosidad (figuras 3.C, 3.D), recapitulando la morfología del intestino. Sin embargo, la estructura epitelial seguía mostrando un fenotipo altamente dismórfico y anaplásico, consistentemente con su origen en la masa tumoral inicial.

La evaluación inmunofluorescente mediante tinción con EpCAM mostró que las estructuras nodulares eran en gran medida, aunque no exclusivamente, de naturaleza epitelial. El tejido era viable y proliferativo, según la tinción con el marcador de proliferación Ki67 (figura 4.A). Pudo observarse proliferación tanto en partes estromales como en partes epiteliales. La frecuencia de las células proliferantes era similar a la observada en el espécimen tumoral inicial.

Con el fin de evaluar la utilización de perfusión en el cultivo de tumores primarios, los cultivos perfundidos 3D se compararon con el cultivo de trozos de tejido mediante la técnica de cultivo de organoides. Macroscópicamente, tal como se ha mencionado anteriormente, tras diez días de cultivo de perfusión se observaron nódulos tumorales de gran tamaño, que medían hasta 2 milímetros, mientras que en los cultivos estáticos de organoides sólo pudieron observarse ligeras diferencias de tamaño y la evasión de células individuales (figura 5.A).

Según las muestras, tras diez días se alcanzó un incremento de 13 veces (+/- 7.3) de la cantidad de ADN total en los cultivos perfundidos, comparado con los cultivos estáticos. La diferencia tras veinte días de cultivo se redujo, aunque se mantuvo en 2.2 veces (figura 5.B). En efecto, en el caso de que se cultiven especímenes tumorales dentro del andamiaje de sándwich bajo condiciones estáticas, sólo se recupera una muestra pequeña tras el cultivo durante diez días y el andamiaje de colágeno circundante ha sido digerido en su mayor parte. En el cultivo perfundido, tiene lugar un remodelado del andamiaje. Además, en ausencia de perfusión, los tejidos se encuentran degradados en su mayor parte y son visibles signos de lisis tisular.

Debido a que el tejido tumoral puede mantenerse vivo y en proliferación durante diez días bajo el cultivo de perfusión, se evaluó si el tejido tumoral podía expandirse durante más tiempo. Por lo tanto, se cultivó el tejido tumoral durante diez o veinte días y se llevó a cabo un análisis histológico (figuras 6.A y 6.B). En comparación con el fragmento tumoral inicial, puede observarse una expansión del tejido y la maduración durante el tiempo, alcanzando un tejido compacto el día veinte. Pueden conservarse durante el tiempo tanto células estromales como células epiteliales.

Con el fin de evaluar el potencial de la técnica de cultivo perfundido 3D, se cultivó tejido tumoral durante doce días y se cultivó nuevamente la mitad del tejido tumoral posteriormente durante nueve días adicionales. El andamiaje de colágeno mostró en el primer punto temporal varios nódulos tumorales y en el punto temporal posterior, una densidad central más elevada con ligero remodelado. Histológicamente pudieron observarse células epiteliales y estromales en ambos puntos temporales, integradas en los andamiajes de colágeno.

Debido a que el tejido tumoral está desprendiendo células a la circulación durante el crecimiento, podían detectarse células tumorales en forma de células tumorales circulantes en el torrente sanguíneo. El número de células tumorales circulantes se correlaciona con el pronóstico y se correlaciona además con la respuesta al tratamiento. Resulta interesante que mediante el análisis de FACS del medio perfundido podían detectarse células tumorales vivas durante el tiempo, según la evaluación con EpCAM y PI (figura 7). Se detectaron células tumorales viables desprendidas durante veinte días y el porcentaje variaba según el tumor. Un número sustancial de células asimismo eran de naturaleza no epitelial.

Comentario del primer ejemplo anteriormente indicado

El cultivo de tumores primarios procedentes de biopsias del paciente o especímenes quirúrgicos in vitro ha sido un objetivo de la ciencia desde hace décadas. A pesar de los significativos esfuerzos invertidos en el pasado, sigue resultando muy difícil establecer un cultivo primario. Para muchos tipos de cáncer, resulta mucho más fácil conseguir que crezcan las células normales que las células cancerosas. Incluso para cánceres que resultan relativamente fáciles de cultivar, tales como los melanomas, sólo pueden establecerse los cánceres metastásicos en forma de líneas de células inmortales. Los estudios anteriores han mostrado que los tumores primarios dependen fuertemente de señales del microambiente tumoral para el cultivo in vitro con éxito. La conservación de un microambiente tumoral que consiste tanto en células benignas como malignas todavía resulta difícil de conseguir, incluso con dicha técnica de cultivo celular de organoides.

Con los métodos según la invención, puede conseguirse un nuevo protocolo para la preparación y cultivo directo in vitro de especímenes tumorales de cáncer colorrectal frescos para un cultivo in vitro altamente eficiente utilizando un sistema de biorreactor perfundido. Debido a que el digerido de células individuales del tejido tumoral en la mayoría de casos conduce a la muerte celular in vitro debido a que faltan las señales microambientales, se utilizan especímenes de cáncer colorrectal pretratadas mecánica y enzimáticamnete que conducen a agregados celulares y fragmentos de tejido de cientos de células. Por primera vez, lo anterior ha ayudado no sólo a evitar la muerte celular in vitro, sino asimismo a mantener el microambiente tumoral heterogéneo inicial que consiste en células epiteliales, estromales e inmunitarias juntas. Presumiblemente, dichas tensiones mecánicas y enzimáticas conducen al inicio de un proceso de cicatrización tisular que podría ayudar a la generación de tejido in vitro.

Debido a que los especímenes colorrectales se encuentran fuertemente dominados por comensales, en el presente contexto resulta esencial una reducción e inhibición del crecimiento bacteriano. El crecimiento bacteriano bajo condiciones óptimas, tales como las ofrecidas por medios perfundidos a 37°C, excede al crecimiento celular en un factor de varias veces. La adición de un cóctel de antibióticos resulta necesaria, además de dicho pretratamiento de éxito. Para otros tumores en los que la interacción con los comensales es menor pronunciada, pueden utilizarse menos antibióticos, ya que dichos aditivos asimismo conducen a una reducción de la capacidad proliferativa de las células mismas.

Resulta interesante que el cultivo con plasma autólogo derivado del paciente o suero humano agrupado resulta superior al suero de feto bovino, en el que sólo sobreviven unos cuantos fragmentos de tejido. Las células linfoides humanas sensibilizadas al suero de feto bovino están activas en la formación de citotoxicidad contra una amplia diversidad de células tumorales humanas y células diana normales en cultivo. Debido a que bajo las condiciones actuales se encuentran presentes células linfoides, la activación no específica debida al suero de feto bovino (FCS) puede conducir a la destrucción de los tejidos. El medio basado en suero sigue resultando superior a los enfoques sin suero. Algunos aditivos adicionales, tales como EGF o PGE2, pueden resultar útiles para incrementar la capacidad regenerativa de tejidos según las propiedades del tumor individual.

Mediante la utilización de perfusión directa de constructos tumorales en un conjunto de sándwich de colágeno, no sólo puede observarse la supervivencia del tejido tumoral heterogéneo, sino asimismo un fuerte remodelado e integración en el andamiaje. Para fines de ingeniería de tejidos general, los andamiajes son, además de las células y los factores de crecimiento, uno de los elementos principales y resultan cruciales para construir una arquitectura fisiológica. Los andamiajes de colágeno presentan una compatibilidad elevada para proporcionar soporte al crecimiento de diferentes tipos celulares y se ha demostrado que potencial la histogénesis bajo perfusión en sistemas de biorreactor.

En comparación con el cultivo celular establecido de organoides, en el que se seleccionan células epiteliales durante la etapa de cultivo, puede observarse la supervivencia estromal durante veinte días o más en el biorreactor perfundido. Lo anterior resulta importante en el contexto de que las interacciones tumor-estroma son cruciales para modificar las respuestas farmacológicas. Sin flujo, el tejido se degrada bajo condiciones estáticas, posiblemente debido a la disponibilidad limitada de oxígeno y nutrientes. Un cultivo de tejido tumoral con flujo puede conducir a una cantidad de tejido varias veces superior en comparación con conjuntos estáticos. El flujo es capaz de imitar en cierta medida la vascularidad en el flujo intersticial natural, con la estimulación mecánica adicional de las células por tensión de cizalla.

La formación de tejido bajo perfusión resulta posible en 66% de todos los casos, y en una proporción todavía mayor en el caso de que se excluyan las muestras contaminadas, ya que los comensales son un problema importante para el cultivo in vitro de cáncer colorrectal. Lo anterior supera significativamente la eficiencia informada de 30% para el cultivo de organoides de cáncer colorrectal primario y lo sitúa en niveles similares al xenoinjerto derivado de paciente (PDX), con una eficiencia informada de generación con éxito de tumor de 60% a 70%. Debido a que para los modelos de PDX se requieren hasta dos meses para hacer crecer un tumor que mide 6 a 8 mm (según la experiencia de los presentes inventores), el cultivo de perfusión en un biorreactor permite integrar el tejido tumoral en el andamiaje en un tiempo mucho más corto.

La calidad y composición del tejido es variable de paciente a paciente y existe cierta heterogeneidad de cultivo a cultivo, incluso procedente de los mismos pacientes, ya que el tejido de partida no es homogéneo. Resulta importante una selección correcta de los especímenes iniciales de tejido para obtener cultivos con éxito. La estandarización es la limitación principal de los cultivos de tejido generales frente a los cultivos de tipo organoide, y se requieren más estudios en el futuro para reducir la heterogeneidad en la capacidad de formación de tejido a partir del mismo material de partida. Pueden utilizarse criterios de selección estrictos del tejido antes del cultivo (tamaño, forma y evaluación patológica) o el incremento de los cultivos en biorreactor en paralelo para evitar dicho problema; sin embargo, el material de partida generalmente es limitado.

Las técnicas de cultivo descritas anteriormente en la presente memoria asimismo pueden utilizarse para otros tipos tumorales, tales como el cáncer de mama, el melanoma, el cáncer de vejiga, el cáncer de próstata, el glioblastoma y cualquier otro tejido tumoral.

En el cultivo 3D perfundido descrito anteriormente en la presente memoria, se preserva el microambiente tumoral durante el tiempo; por lo tanto, resulta posible la prueba de fármacos de una manera individualizada. Lo anterior abre nuevos campos en el cribado personalizado de fármacos. Una de las limitaciones principales todavía es la cantidad de material tumoral disponible. Debido a que, tal como puede observarse en la tabla 1, posteriormente, asimismo puede conseguirse crecimiento de tejido tumoral a partir de especímenes de tejido congelado, el cribado puede llevarse a cabo en unos centros y transportarse el tejido tumoral en medio de congelación. En el presente contexto, deberían identificarse marcadores de respuesta al tratamiento e implementarse para dichos cribados. Mediante la utilización de estirpes celulares de cáncer colorrectal, se ha encontrado que genes antiapoptóticos tales como c-Flip, Traf-1 y Bcl-2 pueden ser marcadores de la respuesta al tratamiento similares a muestras de paciente de cáncer rectal tratadas con terapia neoadyuvante.

Tabla 1: resultados de ensayo para tejido fresco y tejido congelado

El cultivo del microambiente tumoral completo in vitro puede ayudar adicionalmente a entender mejor los efectos del mismo sobre el crecimiento tumoral. Lo anterior podría abrir el cribado de identificación de potenciales fármacos de nuevas dianas, que resulta difícil de evaluar mediante la utilización de estirpes celulares tumorales por sí solas. En el contexto de la investigación tumoral presentan un gran potencial los nuevos cribados fenotípicos fisiológicos que integran el complejo microambiente.

Además, los linfocitos infiltrantes de tumor (LIT) en el microambiente tumoral contribuyen significativamente a la supervivencia del paciente. La expansión de dicha población y la retransfusión durante la terapia celular adoptiva resulta altamente eficiente. Los sistemas para expandir específicamente la población de LIT y/o los métodos para seleccionar para especificidad tumoral pueden ser de gran valor en el presente contexto. La técnica para el cultivo tumoral primario descrita anteriormente en la presente memoria puede ser de gran importancia en este aspecto.

A continuación, se describe con mayor detalle un segundo ejemplo específico de una forma de realización adicional del método de cultivo o expansión in vitro de tejido humano o animal según la invención.

Tal como se muestra en la figura 8, en el segundo ejemplo se adapta un biorreactor de perfusión 3D tal como se describe en el documento WO 2013/182574 A1, para el cultivo de trozos de tejidos primarios humanos. El sistema se somete a ensayo principalmente para el cáncer colorrectal y el cáncer de mama luminal A. De esta manera, se corta un espécimen de tejido manualmente en trozos pequeños, de un tamaño de 1 mm a 2 mm por lado. Los trozos se colocan entre dos andamiajes de colágeno con un diámetro de 8 mm para crear un conjunto o "sándwich" que a continuación se introduce en una cámara de perfusión del biorreactor de perfusión 3D. Para cada biorreactor se utilizan 8 a 10 ml de medio de cultivo. Los trozos se cultivan durante 10 a 20 días sin cambiar el medio.

Con el fin de incrementar la estandarización, el espécimen asimismo puede cortarse utilizando un dispositivo seccionador de tejido (seccionador de tejido McIlwain, Ted Pella Inc.). Sin embargo, la posibilidad de utilizar dicho instrumento depende de las propiedades mecánicas del tejido (blando o duro), lo que depende del tipo de tumor y del paciente. La opción de no realizar un cambio de medio es para limitar la disponibilidad de suero autólogo. En cualquier caso, debido a la reducida cantidad de células y la baja tasa de proliferación, el consumo del medio asimismo es lento, lo que en términos realistas permite evitar el cambio de medio. Una evaluación del pH muestra que no se produce ninguna variación durante el tiempo. El suero autólogo (SA) puede prepararse mediante la recolección de una muestra de sangre completa del paciente relacionado con el tejido tumoral, con una jeringa sin adición de anticoagulantes; centrifugación de la sangre a 2600g durante 30 minutos y a 4°C, y recolección del sobrenadante definido como SA. Puede obtenerse plasma autólogo (aHP) mediante el mismo procedimiento, aunque recogiendo sangre con anticoagulantes (como heparina o EDTA).

Para el cultivo en el biorreactor de perfusión 3D, se prepara el tejido tumoral. Debido a su propio origen, el tejido de cáncer colorrectal está altamente sometido a riesgo de contaminación y requiere una etapa de limpieza. En cuanto llega el tejido del análisis patológico, el tejido sigue el procedimiento siguiente: (i) lavado en PBS 3 veces, (ii) tratamiento antiséptico: 10 minutos en solución de Octenisept al 10%, y (iii) lavado en solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Asimismo se prepara el andamiaje o conjunto en el segundo ejemplo. El sistema de cultivo de sándwich requiere dos andamiajes para mantener los trozos de tejido en la cámara de perfusión del biorreactor de perfusión 3D. El andamiaje proporciona un soporte mecánico y biológico para el soporte a los trozos tumorales. El material de elección es el colágeno de tipo 1 (Avitene Ultrafoam, ref. n° 1050050). Dicho material llega en forma de una esponja seca y requiere una etapa de prehumectación que determina su encogimiento a 20% de la longitud. Se lleva a cabo una etapa de prehumectación a 4°C durante la noche o a 37°C durante 2 a 3 horas. Como solución de humectación, podría utilizarse PBS o el medio de cultivo. Además, durante dicha etapa, el andamiaje puede recubrirse con otro material para incrementar sus propiedades mecánicas y/o biológicas, tales como, por ejemplo, la utilización de una solución de Matrigel como recubrimiento.

El medio utilizado para el cultivo de trozos de tumor es una versión modificada que soporta la utilización de suero autólogo. Está compuesto de lo siguiente: DMEM/F12 (Invitrogen, 11320-074), complementado con: suero humano al 10% o suero autólogo al 10%, Glutamax (Gibco, 35050-061, 100x), Hepes (Gibco, 15630-056, 100x), Kanamicina (Gibco, 25389-940, 100x) y un cóctel de antibióticos (sólo para el cáncer colorrectal), que comprende: ciproxina (Bayer, 200x), metronidazol (Braun, 200 mg/ml, 250x), cefuroxima (Braun, 15 mg/ml, 250x), anfotericina B (Sigma-Aldrich, 100x), N-acetil-L-cisteína (Sigma-Aldrich, A9165-5G, 1 mM), nicotinamida (Sigma-Aldrich; N0636), factor de crecimiento epidérmico (EGF, Peprotech, 25 ng/ml) y prostaglandina E2 (PGE2, 1 ng/ml).

La figura 9 representa los resultados del segundo ejemplo para el cáncer colorrectal humano. En particular, presenta los resultados de un experimento representativo. Se informa del material original del paciente, el tejido tras 10 días de cultivo en el biorreactor de perfusión 3D y el tejido obtenido tras la inyección de tejido digerido en forma de suspensión de células individuales en ratones inmunodeficientes, generando tras 61 días un xenoinjerto derivado del paciente (PDX). La tinción de hematoxilina-eosina (H+E) mostró el mantenimiento de la organización del tejido en el cultivo de biorreactor de perfusión 3D, aunque en menor grado en comparación con PDX. Resulta más importante la conservación de las células tumorales epiteliales (positivas para EpCAM) y de las células estromales (positivas para vimentina) en un sistema de cultivo in vitro. Se observó que, tras 10 días de cultivo, varias células, mayoritariamente positivas para EpCAM, mostraban signos de proliferación por la expresión de proteína Ki67, aunque en menor medida que el tejido original.

La figura 10 representa una tinción positiva para CD45, un marcador de células hematopoyéticas excepto eritrocitos y plaquetas, que se utiliza para identificar todos los linfocitos infiltrantes de tumor (LIT), que muestra que, tras 10 días de cultivo, todavía se encontraban presentes estos tipos celulares. Sin embargo, todavía debe evaluarse su funcionalidad.

Tal como se muestra en la figura 11, puede llevarse a cabo un análisis de cuantificación que muestra la presencia de todos los componentes celulares tumorales más importantes mediante citometría de flujo o incluso mediante qRT-PCR. Asimismo podría llevarse a cabo una comparación completa con el tejido original que podría mostrar la posibilidad de mantener una proporción similar de los diferentes tipos celulares (figura 11, citometría de flujo).

La figura 12 representa los resultados de un tercer ejemplo para el cáncer de mama luminal A humano. De esta manera, se aplican esencialmente métodos y procedimientos iguales o similares, tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria, con relación al segundo ejemplo referido al tejido de cáncer colorrectal. Sin embargo, en contraste con el ejemplo de tejido de cáncer colorrectal o con por lo menos algunas muestras del mismo indicadas anteriormente en la presente memoria, en el tercer ejemplo, el tejido de cáncer de mama no se sometió a ningún procedimiento de limpieza, el tejido de cáncer de mama no se predigirió, el medio no contenía el cóctel de antibióticos tal como se ha especificado anteriormente y no se llevó a cabo ningún cambio de medio tal como se ha especificado para algunos ejemplos de cáncer colorrectal, anteriormente.

El cáncer de mama luminal A se define como positivo para receptor de estrógeno (ER), positivo para receptor de progesterona (PR), negativo para receptor 2 de factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) y con pocas células tumorales proliferativas (bajo % de células positivas para Ki67). Dicho tipo de tumor requiere estrógeno como factor de crecimiento para su supervivencia y expansión. El tejido que se ha reducido de tamaño o los trozos de tejido se cultivaron en un medio que contenía suero autólogo (SA) humano al 10%; por lo tanto, recibió todos los factores de crecimiento, comprendiendo el estrógeno. El suero autólogo (SA) se prepara mediante la recolección de una muestra de sangre completa del paciente relacionado con el tejido tumoral, con una jeringa sin adición de anticoagulantes; centrifugación de la sangre a 2600g durante 30 minutos y a 4°C, y recolección del sobrenadante definido como SA. La columna a la izquierda muestra la tinción de H+E de cáncer de mama Luminal A primario recién aislado y la tinción de ER. Resulta importante señalar que las estructuras de tipo glandular observables en el tejido primario asimismo eran visibles en la tinción de H+E del tejido producido en biorreactor. Se observa que las células dentro del tejido tumoral empiezan a invadir el andamiaje desde el día 7. Se mantuvieron células tumorales epiteliales hasta el último punto temporal, tal como muestra la tinción positiva para CK22 (pancitoqueratina, para la identificación de células epiteliales). Por el contrario, se perdió la expresión de ER el día 14.

Tras varios experimentos (9 especímenes sometidos a ensayo), los trozos de tejido empezaron a crecer en el andamiaje a los 7 días de iniciar el cultivo, formando estructuras glandulares similares al tejido tumoral in vivo. En el último punto temporal, a los 21 días, eran detectables más células en el andamiaje; por el contrario, en la parte interna de los trozos se observó un incremento de células apoptóticas.

Se evaluó el efecto de la suplementación con estrógeno sobre el cultivo in vitro. De esta manera, el objetivo era entender si una suplementación adicional de estrógeno exógeno (2-estradiol, Sigma-Aldrich, E2758, 200 ng/ml) puede fomentar una mejor supervivencia y proliferación del tejido en comparación con el control (sólo la cantidad de estrógeno presente en el suero autólogo). Los datos obtenidos no mostraban ninguna diferencia particular entre los trozos tumorales con la suplementación de estrógeno (E+) o sin (E-).

Asimismo se evaluó el efecto del fármaco antirreceptor de estrógeno sobre el cultivo in vitro y se muestra en la figura 13. El objetivo era verificar la posibilidad de realizar un ensayo farmacológico sobre un espécimen de tumor in vitro como prueba de concepto de la medicina personalizada. Como fármaco, se seleccionó el Fulvestrant (Sigma I4409) (un regulador negativo selectivo de los receptores de estrógeno (SERD)) debido a su prolongada semivida (en el ser humano es de 40 días) y debido a que se utiliza habitualmente a nivel clínico (concentración de fármaco utilizada: 100 nM) (Ensayo in vitro utilizando estirpes celulares de cáncer de mama positivo para ER: MCF-7, T47D, BT474 y MDA-MB-361. 7 días de tratamiento). Se añadió el fármaco al inicio del cultivo en biorreactor (día 0). Tal como puede observarse claramente en la figura 13, se produjo un efecto por el tratamiento de Fulvestrant.

Un componente importante del microambiente tumoral está representado por los linfocitos infiltrantes tumorales (LIT), que en algunos tipos tumorales desempeña un papel importante al determinar el pronóstico del paciente y está atrayendo mucho interés en la denominada inmunoterapia del cáncer. Mediante la utilización de PHA (fitohemaglutinina), se estimulan los LIT en su actividad metabólica y proliferativa, a fin de entender si resultaba posible su estimulación dentro de los trozos de tumor cultivados in vitro. Se añadió el PHA (1 ng/ml) al inicio del cultivo en biorreactor (día 0).

Tal como se muestra en la figura 14, a los 7 días, la presencia de los LIT todavía era detectable, con las células T positivas para CD3 principalmente en el andamiaje; por el contrario, los macrófagos CD68 todavía se encontraban en el tejido. Lo anterior plantea la posibilidad de estudiar la cuestión inmunitaria o someter a ensayo inmunoterapias del cáncer en especímenes de tumor cultivados in vitro.

Basándose en el segundo ejemplo y sus resultados, las perspectivas de uso del biorreactor de perfusión 3D descrito en el documento WO 2013/182574 A1 son que pueden utilizarse para: poner a prueba las rutas prometedoras en biología e inmunología tumoral in vitro; como herramienta para incrementar la incorporación tumoral de PDX (xenoinjerto derivado de paciente); como modelo in vitro preclínico para la validación de presuntos fármacos nuevos; después del cribado de alto contenido (HCS) para: ensayos 2D clásicos o ensayos 3D innovadores, y antes de experimentos animales: para medicina personalizada (MP) mediante la expansión de células tumorales primarias y para la expansión en un periodo breve o el mantenimiento de tejido vivo.

Aunque la invención se ha ilustrado y descrito en detalle en los dibujos y en la descripción anteriormente proporcionada, dichas ilustraciones y descripción deben considerarse ilustrativas o ejemplificativas, y no limitativas. Se entenderá que el experto ordinario podrá introducir cambios y modificaciones. En particular, la presente invención comprende formas de realización adicionales con cualquier combinación de características de diferentes formas de realización descritas anteriormente y posteriormente.

Además, en las reivindicaciones, la expresión "que comprende" no excluye otros elementos o etapas, y el artículo indefinido "un" o "una" no excluye una pluralidad. Una única unidad o etapa puede satisfacer las funciones de varias características mencionadas en las reivindicaciones. El mero hecho de que determinadas medidas se mencionen en reivindicaciones dependientes mutuamente diferentes no indica que una combinación de dichas medidas no pueda utilizarse ventajosamente. Los términos «esencialmente» y «aproximadamente» y similares con relación a un atributo o un valor particularmente asimismo definen exactamente el atributo o exactamente el valor, respectivamente. El término "aproximadamente" en el contexto de un valor o intervalo numérico dado se refiere a un valor o intervalo que se encuentra, por ejemplo, dentro de 20%, dentro de 10%, dentro de 5% o dentro de 2% del valor o intervalo dado. Cualesquiera signos de referencia en las reivindicaciones no deberían interpretarse como limitativos del alcance.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Método de cultivo o expansión in vitro de tejido humano o animal, que comprende

reducir el tamaño del tejido de una muestra obtenida de tejido humano o animal;

generar un conjunto colocando el tejido reducido en tamaño entre dos andamiajes de manera que el conjunto es un conjunto de sándwich;

disponer el conjunto dentro de una cámara de cultivo de un sistema de perfusión 3D; y

perfundir el conjunto en el sistema de perfusión 3D durante un tiempo predefinido.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la reducción de tamaño del tejido comprende pretratar mecánicamente el tejido.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que la reducción de tamaño del tejido comprende pretratar enzimáticamente el tejido.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además limpiar el tejido antes de generar el conjunto, en el que preferentemente limpiar el tejido comprende lavar el tejido y/o tratamiento antiséptico.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que generar el conjunto comprende disponer una rejilla sobre un lado del andamiaje y una rejilla adicional sobre el otro lado del andamiaje.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dentro del sistema de perfusión 3D el conjunto perfunde directamente.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la perfusión del conjunto dentro del sistema de perfusión 3D se aplica en sentidos alternos.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el andamiaje se recubre con proteínas de matriz extracelular.

9. Método de poner a prueba la eficacia del tratamiento de un tumor o de cáncer, que comprende

cultivar el tejido obtenido a partir del tumor o cáncer de un paciente en un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores (1);

aplicar un tratamiento al tejido (2);

monitorizar el tejido (3); y

evaluar el tejido monitorizado (4).

10. Método según la reivindicación 9, que comprende además:

cultivar el tejido adicional obtenido a partir del tumor o cáncer del paciente en un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 (1');

aplicar un segundo tratamiento al tejido adicional (2');

monitorizar el tejido adicional (3); y

seleccionar el primer tratamiento o el segundo tratamiento evaluando el tejido y el tejido adicional monitorizados (4).

11. Método según la reivindicación 10, en el que el primer tratamiento comprende la provisión de una primera sustancia al tejido y el segundo tratamiento comprende la provisión de una segunda sustancia al tejido adicional.

12. Método según la reivindicación 9 o 10, en el que el primer tratamiento comprende un primer régimen de dosificación y el segundo tratamiento comprende un segundo régimen de dosificación.

13. Método de enriquecimiento de células de un tipo celular a partir de un tejido tumoral humano o animal, que comprende cultivar el tejido tumoral en un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 durante un periodo de tiempo predefinido.

14. Método según la reivindicación 13, que comprende además aislar las células del tipo celular a partir del tejido tumoral.

15. Método según la reivindicación 13 o 14, que comprende:

comparar una pluralidad de medios de perfusión con respecto a sus capacidades de propagar las células del tipo celular;

identificar un medio de perfusión de la pluralidad de medios de perfusión en consideración a sus capacidades; y

seleccionar el medio de perfusión preferido para perfundir el conjunto de sándwich en el sistema de perfusión 3D.