ES2907467T3 - Fragmentos variables insertables de anticuerpos y dominios a1-a2 modificados de ligandos NKG2D - Google Patents

Abstract

Una molécula de dominio α1-α2 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 17, en donde dicha molécula de dominio contiene todos de (a)-(c): (a) un resto S en la posición correspondiente a la posición 103 de SEQ ID NO: 17, (b) un resto A, P, S, T o H en la posición correspondiente a la posición 165 de SEQ ID NO: 17; y (c) un resto G en la posición correspondiente a la posición 162 de SEQ ID NO: 17, y en donde dicha molécula de dominio muestra una mayor afinidad de unión a un NKG2D humano en comparación con SEQ ID NO: 17.

Description

DESCRIPCIÓN

Fragmentos variables insertables de anticuerpos y dominios a1-a2 modificados de ligandos NKG2D

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

Esta solicitud se refiere generalmente a la producción de polipéptidos que tienen propiedades específicas de unión a antígenos de los dominios Fv, por ejemplo, fragmentos variables insertables de anticuerpos y dominios a1-a2 modificados de ligandos NKG2D.

Información de antecedentes

Un anticuerpo (Ab), Figura 1, también conocido como una inmunoglobulina (Ig), en muchos mamíferos incluyendo los seres humanos, es un proteína grande en forma de Y usada por el sistema inmunitario para identificar y neutralizar objetos extraños tales como bacterias y virus (Charles Janeway (2001). Immunobiology. (5a ed.), Capítulo 3. Garland Publishing. ISBN 0-8153-3642-X (texto completo electrónico a través de NCBI Bookshelf). El anticuerpo reconoce una parte única de la diana extraña, llamada un antígeno. Cada punta de los dos brazos de la "Y" de un anticuerpo contiene un sitio de unión al antígeno, o un parátopo, (una estructura análoga a una cerradura) que es específica para un epítopo particular (similar a una llave) de un antígeno, permitiendo que estas dos estructuras se unan con precisión. Usando este mecanismo de unión, un anticuerpo puede etiquetar un microbio o una célula infectada para el ataque por otras partes del sistema inmunitario o puede neutralizar su diana directamente, por ejemplo, al bloquear una parte de un microbio que es esencial para su invasión y supervivencia. La producción de anticuerpos es la función principal del sistema inmunitario humoral o "adaptativo". Los anticuerpos se secretan por las células plasmáticas. Los anticuerpos en la naturaleza pueden producirse en dos formas físicas, una forma soluble que se secreta por la célula y una forma unida a la membrana que se une a la superficie de una célula B a través del "tallo" de la Y.

Los anticuerpos son glucoproteínas que pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas y normalmente están formados por unidades estructurales básicas, cada una con dos cadenas pesadas grandes y dos cadenas ligeras pequeñas. Hay varios tipos diferentes de cadenas pesadas de anticuerpos y varias clases diferentes de anticuerpos, que se agrupan en diferentes isotipos basándose en qué cadena pesada posean. Se conocen cinco isotipos de anticuerpos diferentes en mamíferos (Market E, Papavasiliou FN (octubre de 2003). "V(D)J recombination and the evolution of the adaptive immune system". PLoS Biol. 1 (1): E16. doi:10.1371/journal.pbio.0000016. PMC 212695. PMID 14551913). Aunque la estructura general de todos los anticuerpos es muy similar, una pequeña región en la punta de cada brazo de la proteína en forma de Y es extremadamente variable, permitiendo que existan millones de anticuerpos con estructuras de punta ligeramente diferentes, o sitios de unión a antígeno. Esta región se conoce como la región hipervariable o variable. Cada una de estas variantes naturales puede unirse a un antígeno diferente. Esta enorme diversidad de anticuerpos permite que el sistema inmunitario se adapte y reconozca una diversidad igualmente amplia de antígenos (Hozumi N, Tonegawa S (1976). "Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73 (10): 3628-3632. doi:10.1073/pnas.73.10.3628. PMC 431171. PMID 824647.)

La molécula de Ig natural en forma de "Y" consiste en cuatro cadenas polipeptídicas; dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas conectadas por enlaces disulfuro, Figura 1. Cada cadena pesada tiene dos regiones principales, la región constante (CH) y la región variable (VH). La región constante es esencialmente idéntica en todos los anticuerpos del mismo isotipo, pero difiere en anticuerpos de diferentes isotipos. Una cadena ligera también tiene dos dominios sucesivos: una región constante más pequeña (CL) y la región variable (VL) (Woof J, Burton D (2004). "Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures". Nat Rev Immunol 4 (2): 89-99. doi:10.1038/nri1266. PMID 15040582).

Algunas partes de un anticuerpo tienen las mismas funciones. Cada uno de los dos brazos de la Y, por ejemplo, contiene los sitios que pueden unirse a los antígenos y, por lo tanto, reconoce objetos extraños específicos. Esta región del anticuerpo se denomina región Fv (fragmento, variable). Está compuesta por un dominio variable de la cadena pesada (V^h) y una región variable de la cadena ligera (V^l) del anticuerpo (Hochman J, Inbar D, Givol D (1973). An active antibody fragment (Fv) composed of the variable portions of heavy and light chains. Biochemistry 12 (6): 1130­ 1135. doi:10.1021/bi00730a018. PMID 4569769). El parátopo tiene forma en un extremo de la Fv y es la región para la unión a los antígenos. Se compone de bucles variables de cadenas p, tres en cada una en la V^l y en la V^h y es responsable de la unión al antígeno, Figura 2. Estos 6 bucles se denominan regiones determinantes de complementariedad (las CDR) (North B, Lehmann A, Dunbrack RL (2010). "A new clustering of antibody CDR loop conformations". J Mol Biol 406 (2): 228-256. doi:10.1016/j.jmb.2010.10.030. PMC 3065967. PMID 21035459).

Los polipéptidos útiles que poseen una función de unión a antígeno específica pueden derivar de las CDR de las regiones variables de los anticuerpos. Estos dos dominios variables de anticuerpos, uno de la cadena ligera (VL) y otro de la cadena pesada (V^h), cada uno con 3 CDR pueden fusionarse en tándem, en cualquier orden, usando un único péptido enlazador corto de 10 a aproximadamente 25 aminoácidos para crear un polipéptido de fragmento variable monocatenario lineal (scFv) que comprende uno de cada uno de los dominios variables de cadena pesada y ligera, Figura 3 (Bird, R. E., Hardman, K. D., Jacobson, J. W., Johnson, S., Kaufman, B. M., Lee, S. M., Lee, T., Pope, S. H., Riordan, G. S. y Whitlow, M. (1988) Single-chain antigen-binding proteins, Science 242, 423-426; Huston, J. S., Levinson, D, Mudgett-Hunter, M, Tai, M-S, Novotny, J, Margolies, M.N., Ridge, R., Bruccoleri, RE., Haber, E., Crea, R. y Opperman, H. (1988). Protein engineering of antibody binding sites: Recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. PNAS 85: 5879-5883).

El enlazador es habitualmente rico en glicina para la flexibilidad, así como serina, treonina o aminoácidos cargados para la solubilidad y puede conectar el extremo N de la V^h con el extremo C de la V^l o viceversa. Esta proteína retiene la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar de la retirada de las regiones constantes y la introducción de un único enlazador. Este formato permite a un experto en la materia de la tecnología del ADN recombinante fusionar genéticamente el scFv lineal con el extremo N o C de una proteína parental para impartir a la proteína parental las propiedades de unión al antígeno del scFv. Hay muchas otras disposiciones propuestas o creadas de regiones scFv polivalentes y en tándem, pero lo más importante, como se describe a continuación, todas tienen al menos dos extremos espacialmente distantes, Figura 4 (Le Gall, F.; Kipriyanov, SM; Moldenhauer, G; Little, M (1999). "Di-, tri- and tetrameric single chain Fv antibody fragments against human CD19: effect of valency on cell binding". FEBS Letters 453 (1): 164-168. doi:10.1016/S0014-5793(99)00713-9. PMID 10403395).

La base de datos Uniprot desvela un ligando NKG2D, antígeno relacionado con la cadena MHC de clase I MICH2 (fragmento) OS = pan trogloditas (n.° de registro de la base de datos Q5JCT8).

B. McFarland et al. Structure. Abril de 2003;11(4):411-22. doi: 10.1016/s0969-2126(03)00047-9 desvela un análisis de las interacciones entre el inmunorreceptor tipo lectina tipo C NKG2D y los ligandos tipo MHC de clase I.

S Henager et al. Protein Sci. septiembre de 2012;21(9):1396-402. doi: 10.1002/pro.2115 desvelan una combinación de diferentes estrategias diseñadas para la maduración de afinidad racional de la interfaz MICA-NKG2D. S Radaev et al. Immunity. Diciembre de 2001;15(6):1039-49. doi: 10.1016/s1074-7613(01)00241-2 desvelan que la plasticidad conformacional se revela mediante la estructura cocristalina de NKG2D y su ligando ULBP3 similar a MHC de clase I.

El documento US 2014/302072 desvela proteínas MIC no naturales. Lengyel et al. J Biol Chem. 19 de octubre de 2007;282(42):30658-66, doi: 10.1074/jbc.M704513200 desvelan que las mutaciones diseñadas para desestabilizar la conformación unida al receptor aumentan la velocidad de asociación y la afinidad de MICA-NKG2D. Li et al. Nat Immunol. Mayo de 2001;2(5):443-51, doi: 10.1038/87757 desvelan la estructura compleja del inmunorreceptor activador Nk G2D y su ligando MICA de tipo MHC de clase I.

El documento US 2012/295288 desvela un marcador serológico para detectar el cáncer de páncreas y un método para el uso del marcador serológico.

El documento US 2003/147847 desvela polipéptidos y ADN de ULBP. S. Radaev et al. J Immunol. 1 de diciembre de 2002;169(11):6279-85 doi: 10.4049/jimmunol.169.11.6279 desvelan que existe un reconocimiento de ligando diverso por parte de NKG2D.

Sumario de la invención

La invención se define en la reivindicación 1. Un aspecto adicional y realización preferida se define en la reivindicación dependiente. Cualquier aspecto, realización y ejemplo de la presente divulgación que no caiga dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona meramente con fines ilustrativos.

En consecuencia, la presente invención proporciona una molécula de dominio a1-a2 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 17,

en donde dicha molécula de dominio contiene todos de (a)-(c):

(a) un resto S en la posición correspondiente a la posición 103 de SEQ ID NO: 17,

(b) un resto A, P, S, T o H en la posición correspondiente a la posición 165 de SEQ ID NO: 17; y

(c) un resto G en la posición correspondiente a la posición 162 de SEQ ID NO: 17,

y en donde dicha molécula de dominio muestra una mayor afinidad de unión a un NKG2D humano en comparación con SEQ ID NO: 17.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Un dibujo de un anticuerpo de mamífero típico que muestra su estructura en forma de Y y sus componentes estructurales.

Figura 2. Un dibujo de la estructura de una región Fv de un anticuerpo de mamífero natural que muestra las 3 CDR marcadas (Regiones Determinantes de la Complementariedad) de la V^h y los 3 bucles sin marcar de las CDR V^l, que forman el parátopo o sitio de unión a antígeno.

Figura 3. Un dibujo de las dos estructuras posibles de un fragmento variable de cadena única (scFv), incluyendo los sitios de unión al antígeno el extremo N a la izquierda y el extremo C a la derecha. La región enlazadora única, o péptido enlazador, en cada scFv se muestra como una flecha.

Figura 4. Fragmentos variables monocatenarios (scFv) polivalentes. Estructura de scFv divalentes (arriba) y trivalentes (abajo), en tándem (izquierda) y formato de di-/trimerización (derecha). Obsérvese que cada uno tiene 2 o más extremos libres espacialmente distantes.

Figuras 5A y 5B. Diagrama de un fragmento variable insertable, iFv. Diagrama de un fragmento variable insertable, iFv. (A) Estructura de los dominios variable ligero (VL) y variable pesado (VH) del anticuerpo de unión a FGFR3 que muestra la topología del dominio del formato iFv. Las flechas grises representan las 2 regiones enlazadoras (LR), una y solo una de las cuales se usa tradicionalmente para conectar los extremos de VL y VH para crear un scFv. La LR con un borde punteado conectaba el extremo C de VL con el extremo N de VH (visible detrás de la molécula). La LR con un borde sólido conectaba el extremo C de VH con el extremo N de VL. Los segmentos del dominio VL dividido se marcan como Nt y Ct como se describe en el texto. Como resultado de la creación de un par no natural de extremos N y C entre la cadena 1 (S1) y la cadena 2 (S2), la VL se ha dividido en un segmento N-terminal (VLN) y un segmento C-terminal (VLC). Las 6 CDR de VL y VH se representan como los bucles en la parte superior de la figura. (B) Esquema del diseño del dominio para insertar un iFv en el bucle 1 (L1) de MICA-a3 con o sin una región espaciadora (SR). Un iFv también podría insertarse de manera similar en el bucle 2 (L2) y/o el bucle 3 (L3).

Figura 6. Curvas de valoración para las moléculas de sMICA modificadas que se unen a los pocillos recubiertos con FGFR3. El sMICA unido se detectó mediante ELISA usando NKG2D-Fc para confirmar la actividad biespecífica. Ambas versiones de los fragmentos variables insertados (MICA-a3-iFv.1 y MICA-a3-iFv.2) se unieron a FGFR3 de manera comparable a la fusión C-terminal de un scFv (MICA-scFv).

Figuras 7A y 7B. Estabilidad térmica o MICA-a3-iFv.2. Curvas de valoración de ELISA de unión de MICA-scFv (A) o MICA-a3-iFv.2 (B) a pocillos recubiertos con FGFR3 después de la exposición a las temperaturas indicadas (grados Celsius) durante 1 hora. El MICA-a3-iFv exhibió una fuerte unión a FGFR3 después de la exposición a 80 °C, mientras que MICA-scFv perdió una actividad significativa después de la exposición a 70 °C.

Figura 8. Ensayos de lisis de células diana mediada por NK. Las células efectoras NKL se co-incubaron células diana P815 que expresan FGFR3 cargadas con calceína en una relación efector:diana de 15:1. El aumento de las concentraciones de un MICA de control negativo (sMICA) no tuvo ningún efecto sobre la lisis de las células diana, mientras que las variantes de MICA-a3-iFv de unión a FGFR3 indicadas estimularon la lisis de las células diana. En comparación con MICA-scFv, ambas variantes de MICA-a3-iFv dirigieron una mayor lisis de células diana.

Figuras 9A y 9B. Unión a diana y actividad de lisis celular de una variante de sMICA específica de CD20. MICA-a3-iFv.3 exhibió una unión valorable a pocillos recubiertos con CD20 en un ELISA (A) y también mejoró la lisis celular mediada por NK de células Ramos que expresan CD20 (B). En (B), las células efectoras NKL se co­ incubaron con células Ramos que expresan CD20 cargadas con calceína en una relación efector:diana de 15:1 y concentraciones crecientes del control negativo (sMICA) o MICA-a3-iFv.3.

Figura 10. Curvas de valoración para las proteínas NKG2DL-a3-iFv.2 que se unen a pocillos recubiertos con FGFR3. La proteína unida se detectó mediante ELISA usando NKG2D-Fc para confirmar la actividad biespecífica. Todas las versiones de las proteínas NKG2DL-a3-iFv.2 probadas (OMCP, ULBP1, 2, 3, 4, 6) se unieron a FGFR3 de manera similar.

Figura 11. Ensayos de lisis de células diana mediada por NK. Las células efectoras NKL se co-incubaron células diana P815 que expresan FGFR3 cargadas con calceína en una relación efector:diana de 15:1. El aumento de las concentraciones de un MICA de control negativo (sMICA) no tuvo ningún efecto sobre la lisis de las células diana, mientras que cada uno indicaba lisis de células diana estimulada por la proteína NKG2DL-a3-iFv.2.

Figura 12. Mutagénesis dirigida a la estructura del dominio a1-a2 de MICA para mejorar la afinidad de NKG2D. (A) Estructura del dominio a1-a2 de MICA (PDB 1HYR) con la superficie de unión a NKG2D asignada a 57 restos de color gris oscuro. (B) Se identificaron seis posiciones como sitios clave para las mutaciones de afinidad de NKG2D. Los restos de aminoácidos de tipo silvestre están marcados y sus cadenas laterales se muestran en esferas de color gris oscuro.

Figuras 13A y 13B. ELISA de competición NKG2D-Fc para variantes a1-a2 de intervalo de afinidad. (A) Datos de valoración para un panel de variantes de afinidad a1-a2 (15-18), de tipo silvestre (TS) o proteínas MICA solubles WED que inhiben la unión de NKG2D-Fc humana a placa cubierta con MICA. (B) El mismo conjunto de proteínas en (A) valorado contra NKG2D-Fc de ratón. En ambos ensayos las variantes 15, 16, 17 y 18 muestran valores de CI⁵⁰ significativamente menores que las proteínas TS y WED. Los valores de CI⁵⁰ en equilibrio se muestran en la Tabla 3.

Figura 14. Análisis de la cinética de asociación y disociación de las variantes a1-a2 que se unen a NKG2D, como se mide por interferometría de biocapa en un instrumento Octet. Trazas cinéticas para un panel de variantes a1-a2. Las fases de asociación y disociación se ajustaron usando una única ecuación de unión exponencial 1:1 y las constantes de velocidad de activación y desactivación derivadas de los ajustes se muestran en la Tabla 3.

Figura 15. Ensayo de destrucción de células diana mediado por NK para las variantes a1-a2 dirigidas a células diana que expresan FGFR3. Las células efectoras NKL se co-incubaron con calceína cargada, Células diana P815 que expresan FGFR3 en una relación efector:diana de 15:1. El aumento de las concentraciones de un MICA de control negativo (sMICA) no tuvo ningún efecto sobre la lisis de las células diana, mientras que las variantes a1-a2 indicadas estimularon la lisis de las células diana. Con respecto a TS y WED-MICA, las variantes 16, 17 y 18 exhibieron una destrucción significativamente mayor a bajas concentraciones.

Figura 16. Análisis de la cinética de asociación y disociación de las variantes a1-a2 20, 25 y 48 que se unen a NKG2D, como se mide por interferometría de biocapa en un instrumento Octet. Las fases de asociación y disociación se ajustaron usando una única ecuación de unión exponencial 1:1 y las constantes de velocidad de activación y desactivación derivadas de los ajustes se muestran en la Tabla 5,

Figura 17. Ensayo de destrucción de células diana mediada por NK, basado en calceína para las variantes a1-a2 16, 25 y WED dirigidas a células diana P815 que expresan FGFR3.

Figura 18. Alineación de secuencias de proteínas de los dominios a1-a2 de MICA y ULBP (SEQ ID NO.: 77-83). Los aminoácidos resaltados en gris se seleccionaron para la mutagénesis de NNK en ULBP2 (60 aminoácidos) y ULBP3 (36 aminoácidos). Los restos resaltados en negro se identificaron como posiciones clave para seleccionados e identificados como mutaciones que modulan la afinidad de unión a NKG2D (Tablas 6 y 7).

Figuras 19A y 19B. Valoraciones de ELISA de fagos de variantes de ULBP que se unen a NKG2D. (A) Las variantes de ULBP2 mostradas en el fago se valoraron frente a NKG2D y las afinidades de unión relativas se midieron con respecto a la ULBP2 nativa (TS, círculos negros). (B) Las variantes de ULBP3 mostradas en el fago se valoraron frente a NKG2D y las afinidades de unión relativas se midieron con respecto a la ULBP3 nativa (TS, círculos negros).

Figuras 20A-D. Las fusiones de dominios nativo (TS), WED variante modificado, a1-a225 o 48 contra la cadena pesada (A) o la cadena ligera (B) de un anticuerpo específico de FGFR3 afectaron a la destrucción de células diana dependientes de NK. Las fusiones de las variantes 25 y 48 con la cadena pesada (C) o la cadena ligera (D) mejoraron significativamente el grado de destrucción y la potencia de destrucción en comparación con las fusiones variantes WED y nativas (TS).

Figuras 21A-C. Cada una de las fusiones del dominio variante 25 a1-a2 con las cadenas pesadas o cadenas ligeras de anticuerpos dirigidos a EGFR humano (A), HER2 (B), o PDL1 (C) mejoró la destrucción de células diana mediada por células NKL. Se muestra la destrucción escasa o ausente por los respectivos anticuerpos parentales, cetuximab (A), trastuzumab (B) y anti-PDL1 (C).

Figuras 22A y 22B. Fusiones basadas en trastuzumab de células NK variantes del brazo de dominio 25 a1-a2 in vivo. Trastuzumab parental, la fusión de trastuzumab HC_25 y la fusión de trastuzumab LC_25 se conjugaron con Alexa Fluor. A grupos de tres ratones C57BL/6 se les inyectó una dosis única de 100 |jg del parental, la fusión HC o la fusión LC; y se extrajo sangre de cada animal en los tiempos indicados para los análisis ELISA de PK en plasma (A) y análisis de citometría de flujo de las moléculas marcadas fluorescentemente unidas a las células NK periféricas (B).

Figuras 23A-C. Los anticuerpos antifármacos generados en los mismos animales descritos en el Ejemplo 7 y la Figura 21 administraron Trastuzumab parental (A), fusiones HC basado en Trastuzumab (B) y en Trastuzumab-LC (C) a la variante 25. El plasma control (Ctrl) procedía de un ratón al que no se le administró ningún agente que contuviera anticuerpos.

Figuras 24A y 24B. Anticuerpos generados en animales a los que se administró la variante 25 de fusiones de dominio a1-a2 a trastuzumab-HC y -LC, como se describe en el Ejemplo 7 y las Figuras 21-22, unida tanto al anticuerpo parental (A) como al dominio a1-a2 (B).

Figura 25. Actividad antitumoral de una fusión anti-PDL1 a la variante 25. Se implantaron tumores singénicos MC38 por vía subcutánea en ratones C57BL/6 y los tumores crecieron hasta un promedio de 100 mm3 antes del inicio del tratamiento. Tras el inicio del tratamiento, cuatro cohortes de 10 ratones por grupo se trataron por vía parenteral con vehículo, anti-CTLA4 (100 ug i.p.), anti-PDL1 parental (300 ug i.v.) o fusión anti-PDL1 HC_25 (300 ug i.v.) en los días 1,4 y 7. Se midieron los volúmenes tumorales (mm cúbicos) en cada animal en los tiempos indicados.

Descripción detallada de la invención

La información técnica que se expone más adelante puede, en algunos aspectos, ir más allá de la divulgación de la invención, que se define de manera exclusiva por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para situar la presente invención en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Dicha información técnica adicional que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no forma parte de la presente invención.

En el presente documento se desvelan péptidos de fragmentos variables insertables (iFv). Debido a que el extremo C y el extremo N de las moléculas scFv que incluyen las estructuras scFv polivalentes están muy separados espacialmente, las estructuras de scFv no pueden insertarse en una región de bucle incrustada dentro de un plegamiento de proteína de una proteína parental o receptora sin interrumpir o desestabilizar su plegamiento o plegamientos y/o sin alterar el marco Fv requerido para posicionar correctamente las CDR o las regiones hipervariables para retener sus propiedades de unión a antígeno.

Para insertar el fragmento variable de un anticuerpo que contiene hasta 6 CDR en una o más regiones de bucle de una molécula de proteína parental naciente sin alterar los plegamientos estructurales del fragmento variable o de la proteína parental, los presentes inventores inventaron una nueva clase de péptidos de unión a antígeno derivados de los dominios variables de anticuerpos de cadena ligera y pesada. Las nuevas estructuras contenían dos regiones enlazadoras, en lugar del enlazador único tradicional de estructuras scFv, más un dominio variable dividido. Conceptualmente, los extremos canónicos de los dominios variable ligero (VL) y pesado (VH) se fusionaron en un péptido continuo o "circular". Esa estructura peptídica circular que contiene las 6 CDr del Fv puede dividirse después conceptualmente en uno de varios sitios novedosos posibles para crear un Fv insertable (iFv). El sitio de división no natural puede crearse dentro del dominio variable de cadena ligera o pesada en o cerca del vértice o girar un bucle para crear nuevos extremos N y C únicos posicionados espacialmente proximales entre sí, preferentemente en 0,5 a 1,5 nm, para poder insertarse en bucles de otras proteínas o polipéptidos (parentales o receptores) sin alterar la estructura, estabilidad o función deseable. Esta nueva clase de péptidos se denomina fragmento variable insertable (iFv). La especificidad de unión o direccionamiento transmitida por un iFv a una molécula receptora puede cambiarse insertando en el receptor otro iFV o diferente basado en un anticuerpo o scFv diferente o reemplazando 1 o más de las CDR de un iFv insertable existente.

La inserción de uno o más polipéptidos iFv que exhiben propiedades específicas de unión a antígeno de los dominios Fv en otras proteínas y, por lo tanto, que proporcionan propiedades de unión novedosas tendrá múltiples utilidades. Dichos usos incluyen, pero no se limitan a, permitir que la proteína parental se una al antígeno específico, dirigirse al antígeno, detectar la presencia de antígeno, eliminar el antígeno, entrar en contacto o acercarse al antígeno, administrar una carga útil al antígeno o a la célula que expresa el antígeno, reclutar el antígeno e imaginar la presencia del antígeno. Una carga útil podría conjugarse directamente con uno o ambos del extremo amino y el extremo carboxilo de un iFv o indirectamente con un iFv a través de una proteína o péptido parental. Los ejemplos de cargas útiles incluyen, pero no se limitan a, un cromóforo, un fluoróforo, un farmacóforo, un átomo, un isótopo pesado o radiactivo, un agente de formación de imágenes, un agente quimioterapéutico o una toxina. Un iFv cargado puede usarse para localizar o identificar la presencia de una molécula diana a la que se une específicamente el iFv y, como tal, puede servir como agentes de formación de imágenes o agentes de diagnóstico in vitro o in vivo que son pequeños y estables. Además, a uno o ambos del extremo amino y el extremo carboxilo de un péptido iFv se puede conjugar un agente quimioterapéutico o una molécula tóxica para crear un conjugado de iFv-fármaco, por ejemplo, como tratamiento para una neoplasia maligna o infección. Una única carga útil puede conjugarse tanto al extremo amino como al extremo carboxi de un péptido iFv para abarcar o conectar los dos extremos; dicha expansión puede estabilizar aún más el iFv bloqueando los extremos de la degradación de la exopeptidasa o protegiendo el iFv de la desnaturalización o el despliegue.

Los ejemplos de proteínas o polipéptidos parentales o receptores que son candidatos para inserciones de péptidos iFv incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, proteínas compuestas por plegamientos de Ig o dominios de Ig, globulinas, albúminas, fibronectinas y dominios de fibronectina, integrinas, proteínas fluorescentes, enzimas, proteínas de la membrana externa, proteínas receptoras, receptores de células T, receptores de antígeno quimérico, antígenos víricos, cápsides de virus, ligandos víricos para receptores celulares, bacteriocinas de alto peso molecular, histonas, hormonas, knottinas, péptidos o polipéptidos cíclicos, proteínas de la familia de histocompatibilidad mayor (MHC), proteínas MIC, lectinas y ligandos para lectinas. También es posible insertar estructuras iFv en moléculas receptoras no proteicas tales como polisacáridos, dendrímeros, poliglicoles, peptidoglucanos, antibióticos y policétidos.

Las células linfocíticas naturales (NK) y ciertas células T (CD8+ ap y y§) del sistema inmunitario tienen funciones importantes en seres humanos y otros mamíferos como defensa innata de primera línea contra células neoplásicas e infectadas por virus (Cerwenka, A. y L.L. Lanier. 2001. NK cells, viruses and cancer. Nat. Rev. Immunol. 1:41-49). Las células NK y ciertas células T exhiben en sus superficies NKG2D, un inmunorreceptor de superficie prominente, homodimérico, responsable de reconocer una célula diana y activar la defensa innata contra la célula patológica (Lanier, LL, 1998. NK cell receptors. Ann. Rev. Immunol. 16: 359-393; Houchins JP et al. 1991. DNA sequence analysis of NKG2, a family of related cDNA clones encoding type II integral membrane proteins on human NK cells. J. Exp. Med. 173: 1017-1020; Bauer, S et al., 1999. Activation of NK cells and T cells by NKG2D, a receptor for stress-inducible MICA. Science 285: 727-730). La molécula NKG2D humana posee un dominio extracelular similar a la lectina de tipo C que se une a sus ligandos afines, el 84 % de secuencia idéntica u homóloga, MICA y MICB monoméricos, análogos polimórficos de las glucoproteínas relacionadas con la cadena (MIC) de Clase I del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) (Weis et al. 1998. The C-type lectin superfamily of the immune system. Immunol. Rev. 163: 19-34; Bahram et al. 1994. A second lineage of mammalian Mh C class I genes. PNAS 91:6259-6263; Bahram et al.

1996a. Nucleotide sequence of the human MHC class I MICA gene. Immunogenetics 44: 80-81; Bahram y Spies TA.

1996. Nucleotide sequence of human MHC class I MICB cDNA. Immunogenetics 43: 230-233). La expresión no patológica de MICA y MICB está restringida al epitelio intestinal, queratinocitos, células endoteliales y monocitos, pero la expresión superficial aberrante de estas proteínas MIC se produce en respuesta a muchos tipos de estrés celular tales como proliferación, oxidación y choque térmico y marca la célula como patológica (Groh et al. 1996. Cell stressregulated human MHC class I gene expressed in GI epithelium. PNAS 93: 12445-12450; Groh et al. 1998. Recognition of stress-induced MHC molecules by intestinal y§T cells. Science 279: 1737-1740; Zwirner et al. 1999. Differential expression of MICA by endothelial cells, fibroblasts, keratinocytes and monocytes. Human Immunol. 60: 323-330). La expresión patológica de proteínas MIC también parece implicada en algunas enfermedades autoinmunitarias (Ravetch, JV y Lanier LL. 2000. Immune Inhibitory Receptors. Science 290: 84-89; Burgess, SJ. 2008. Immunol. Res. 40: 18-34). La regulación diferencial de los ligandos NKG2D, tales como los MICA y MICB polimórficos, es importante para proporcionar al sistema inmunitario un medio para identificar y responder a una amplia gama de señales de emergencia y, al mismo tiempo, proteger las células sanas de ataques no deseados (Stephens HA, (2001) MICA and MICB genes: can the enigma of their polymorphism be resolved? Trends Immunol. 22: 378-85; Spies, T. 2008. Regulation of NKG2D ligands: a purposeful but delicate affair. Nature Immunol. 9: 1013-1015).

La infección vírica es un inductor común de la expresión de la proteína MIC e identifica la célula infectada por el virus para el ataque de células NK o T (Groh et al. 1998; Groh et al. 2001. Co-stimulation of CD8+ aPT-cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2: 255-260; Cerwenka, A. y L.L. Lanier. 2001). De hecho, para evitar un ataque tal a su célula hospedadora, el citomegalovirus y otros virus han desarrollado mecanismos que evitan la expresión de proteínas MIC en la superficie de la célula que infectan para escapar de la ira del sistema inmunitario innato (Lodoen, M., K. Ogasawara, J.A. Hamerman, H. Arase, J.P. Houchins, E.S. Mocarski y L.L. Lanier.

2003. NKG2D-mediated NK cell protection against cytomegalovirus is impaired by gp40 modulation of RAE-1 molecules. J. Exp. Med. 197:1245-1253; Stern-Ginossar et al., (2007) Host immune system gene targeting by viral miRNA. Science 317: 376-381; Stern-Ginossar et al., (2008) Human microRNAs regulate stress-induced immune responses mediated by the receptor NKG2D. Nature Immunology 9: 1065-73; Slavuljica, I A Busche, M Babic, M Mitrovic, I Gasparovic, D Cekinovic, E Markova Car, EP Pugel, A Cikovic, VJ Lisnic, WJ Britt, U Koszinowski, M Messerle, A Krmpotic y S Jonjic. 2010. Recombinant mouse cytomegalovirus expressing a ligand for the NKG2D receptor is attenuated and has improved vaccine properties. J. Clin. Invest. 120: 4532-4545).

A pesar de su estrés, muchas células malignas, tales como aquellas del cáncer de pulmón y el cáncer de cerebro por glioblastoma, también evitan la expresión de proteínas MIC y como resultado pueden ser particularmente agresivas ya que también escapan del sistema inmunitario innato (Busche, A et al. 2006, NK cell mediated rejection of experimental human lung cancer by genetic over expression of MHC class I chain-related gene A. Human Gene Therapy 17: 135-146; Doubrovina, Es , MM Doubrovin, E Vider, RB Sisson, RJ O'Reilly, B Dupont y YM Vyas, 2003. Evasion from NK Cell Immunity by MHC Class I Chain-Related Molecules Expressing Colon Adenocarcinoma (2003) J. Immunology 6891-99; Friese, M. et al. 2003. MICA/NKG2D-mediated immunogene therapy of experimental gliomas. Cancer Research 63: 8996-9006; Fuertes, MB, MV Girart, LL Molinero, CI Domaica, LE Rossi, m M Barrio, J Mordoh, GA Rabinovich y NW Zwirner. (2008) Intracellular Retention of the NKG2D Ligand MHC Class I Chain-Related Gene A in Human Melanomas Confers Immune Privilege and Prevents NK Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Immunology, 180: 4606 -4614).

La estructura de alta resolución de MICA humana unida a NKG2D se ha resuelto y demuestra que el dominio a3 de MICA no tiene interacción directa con NKG2D (Li et al. 2001. Complex structure of the activating immunoreceptor NKG2D and its MHC class I-like ligand MICA. Nature Immunol. 2: 443-451; Protein Data Bank accession code 1h Yr ). El dominio a3 de MICA, como el del MICB, está conectado al dominio de la plataforma a1-a2 por un péptido enlazador corto, flexible y en sí mismo se posiciona de forma natural como "espaciador" entre la plataforma y la superficie de la célula que expresa MIC. Las estructuras tridimensionales de los dominios humanos MICA y MICB a3 son casi idénticas (distancia media cuadrática <1 A en 94 C-aa) y funcionalmente intercambiables (Holmes et al. 2001. Structural Studies of Allelic Diversity of the MHC Class I Homolog MICB, a Stress-Inducible Ligand for the Activating Immunoreceptor NKG2D. J Immunol. 169: 1395-1400).

Como se usa en el presente documento, una "proteína MIC soluble", "MICA soluble" y "MICB soluble" se refieren a una proteína MIC que contiene los dominios a1, a2 y a3 de la proteína MIC pero sin los dominios transmembrana o intracelulares.

El dominio de plataforma a1-a2 de una proteína MIC soluble está unido al dominio a3 y es difusible en el espacio intercelular o intravascular del mamífero. Preferentemente los dominios de la plataforma a1-a2 de las proteínas MIC no naturales develados en el presente documento son al menos un 80 % idénticos u homólogos a un dominio a1-a2 nativo o natural de una proteína MICA o MICB humana y se unen a NKG2D. El dominio de plataforma a1-a2 puede ser el 85 % idéntico a un dominio de plataforma a1-a2 nativo o natural de una proteína MICA o MICB humana y se une a NKG2D. El dominio de la plataforma a1-a2 es el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % puede ser idéntico a un dominio de plataforma a1-a2 nativo o natural de una proteína MICA o MICB humana y se une a NKG2D.

Una etiqueta peptídica heteróloga puede fusionarse con el extremo N o el extremo C de un dominio a1-a2 o una proteína MIC soluble para ayudar en la purificación de la proteína MIC soluble. Las secuencias de etiquetas incluyen péptidos tales como una poli-histidina, myc-péptido o una etiqueta FLAG. Dichas etiquetas pueden retirarse después del aislamiento de la molécula MIC mediante métodos conocidos por los expertos en la materia.

Como se usa en el presente documento "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente; y una "molécula heteróloga", "péptido heterólogo", "secuencia heteróloga" o "átomo heterólogo" es una molécula, péptido, ácido nucleico o secuencia de aminoácidos o átomo, respectivamente, que no se encuentra de forma natural o normal en conjunción física con la molécula en cuestión.

La expresión "que comprende", que se usa indistintamente con "que incluye", "que contiene", o "caracterizado por", es lenguaje inclusivo o abierto y no excluye elementos o etapas de métodos adicionales que no se hayan mencionado. La expresión "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en la reivindicación. La expresión "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a los materiales o etapas especificados y aquellos que no afectan materialmente a la característica o características básicas y novedosas de la invención reivindicada. La presente divulgación contempla realizaciones de las composiciones y métodos de la invención correspondientes al alcance de cada una de estas expresiones. Por lo tanto, una composición o método que comprende los elementos o etapas enumerados contempla realizaciones particulares en las cuales la composición o el método consisten esencialmente en esos elementos o etapas.

Como se usa en el presente documento, los términos "un", "una" y "cualquiera" tienen la intención de incluir tanto las formas singulares como las plurales.

Esta solicitud pretende abarcar cualquier variación, uso o adaptación de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo las desviaciones de la presente divulgación que se dan en la práctica conocida o habitual dentro de la técnica a la que pertenece la invención y que pueden aplicarse a las características esenciales expuestas anteriormente en el presente documento.

EJEMPLOS de iFv y dominios a l - a2 modificados de ligandos NKG2D

Ejemplo 1 (iFv). Como ejemplos específicos, los presentes inventores sintetizaron un fragmento de ADN de 1126 pb y 1144 pb (SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente) que codifican en el siguiente orden: el dominio a3 del aminoácido 182 al aminoácido 194 (el comienzo del bucle 1 del dominio a3) de MICA humana (como péptido parental), sin espaciador o una región espaciadora de aminoácidos GGS (SR), un péptido iFv basado en la estructura de un anticuerpo de unión al receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos (Fg Fr 3) (MAbR3; Qing, J., Du, X., Chen, Y., Chan, P., Li, H., Wu, P., Marsters, S., Stawicki, S., Tien, J., Totpal, K., Ross, S., Stinson, S., Dornan, D., French, D., Wang, Q. R., Stephan, J. P., Wu, Y., Wiesmann, C. y Ashkenazi, A. (2009) Antibody-based targeting of FGFR3 in bladder carcinoma and t(4;14)-positive multiple myeloma in mice, The Journal of clinical investigation 119, 1216-1229.), sin espaciador u otra región espaciadora GGS, la parte distal del bucle 1 del dominio a3 que comienza en el aminoácido 196 e incluye la parte carboxi-terminal restante del dominio a3 hasta el aminoácido 276 de una molécula de MICA soluble. Cada polinucleótido de ADN sintético bicatenario codificó después un polipéptido que contenía 6 CDR en forma de un iFv insertado en el bucle 1 del dominio a3 de MICA.

Este propio péptido iFv (SEQ ID NO.:3), codificado por SEQ ID NO.:4, contenía dos regiones enlazadoras (LR) idénticas típicas que correspondían a los restos GGSSRSSSSGGGGSGGGG (SEQ ID NO.:5) (Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C. y Barbas, C. F., 3a. (2011) Generation of human Fab antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences, Cold Spring Harbor protocols 2011). Un LR unió el extremo C de VL con el extremo N del dominio VH y el segundo LR unió el extremo C del dominio VH con el extremo N de VL. Conceptualmente, esta nueva estructura es el péptido continuo o "circular" mencionado anteriormente y contenía 6 CDR del Fv de partida. La cadena VL variable del anticuerpo se dividió eficazmente dentro de la región del bucle entre las cadenas beta 1 y 2 (S1 y S2) y, por lo tanto, creó un nuevo segmento N-terminal (VLN) y un nuevo segmento C-terminal (VLC) con un acompañando a un par de nuevos extremos C y N no naturales, respectivamente, Figura 5A. Este par de extremos creó un sitio único para la unión o conjugación del iFv a la molécula receptora tal como una proteína. El esquema del iFv insertado en el dominio a3 principal se muestra en la Figura 5B.

Para producir las proteínas MICA solubles con un péptido iFv heterólogo insertado en el dominio a3, los presentes inventores generaron un vector de expresión baculovírico para acomodar las secuencias de ADN (SEQ ID NO.: 1 y 2) que codifican el a3-iFv.1 (SEQ ID NO.:6) y a3-iFv.2 (SEQ ID NO.:7), respectivamente. Los fragmentos de ADN se amplificaron por PCR, se digirieron usando las enzimas de restricción Ncol y EcoRI y se subclonaron en el vector de expresión baculovírico, SW403, reemplazando el dominio a3 de tipo silvestre. SW403 es un vector de expresión baculovírico derivado de pVL1393 (Invitrogen, Inc.) en el que se había clonado previamente sMICA de tipo silvestre (restos 1-276) usando los sitios 5' BamHI y 3' EcoRI. El nuevo vector de expresión se cotransfectó con ADN baculovírico en células de insecto SF9 y el baculovirus se cultivó durante dos ciclos de amplificación y se usó para expresar las proteínas MICA-a3-iFv etiquetadas con His en células de insecto T.ni de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen). La expresión se llevó a cabo en un volumen de 100 ml durante tres días y el medio de crecimiento se recogió para la purificación de la proteína soluble secretada usando cromatografía de afinidad con Ni. El MICA-a3-iFv monomérico se purificó a >90 % de pureza con el peso molecular esperado de 60,9 kDa según lo determinado por SDS-PAGE. La caracterización funcional se llevó a cabo mediante ELISA de unión y ensayos de destrucción de células diana in vitro.

Las proteínas MICA-a3-iFv purificadas se analizaron en un ELISA de unión a FGFR3 para confirmar la unión simultánea a la diana FGFR3 y al receptor NKG2D. FGFR3 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) se recubrió sobre placas Maxisorp a una concentración de 2 ug/ml. Cada proteína MICA se valoró, se permitió que se uniera a FGFR3 durante 1 hora y se lavó para retirar la proteína sMICA no unida. La proteína MICA-a3-iFv unida se detectó usando NKG2D-Fc y conjugado anti-Fc-HRP. La Figura 6 muestra que la unión de MICA-a3-iFv.1 y MICA-a3-iFv.2 a FGFR3 fue comparable a la de un MICA-scFv, hecho fusionando al extremo C de MICA soluble un scFv tradicional construido a partir de MAbR3. Estos resultados de ELISA también indicaron que las especificidades de unión de FGFR3 y NKG2D del scFv y el dominio a1-a2, respectivamente, se retuvieron por el MICA modificado y demostraron que el péptido iFv insertado usando diferentes formatos de espaciador era funcional.

Los presentes inventores probaron y compararon la estabilidad térmica de sMICA-a3-iFv.2 con la de sMICA-scFv. Ambas proteínas se sometieron durante 1 h a temperaturas crecientes de 60-90 °C y después se dejaron equilibrar a temperatura ambiente durante 1 hora antes de ensayarse para las propiedades de unión mediante ELISA. Los resultados de la Figura 7 mostraron que MICA-a3-iFv.2 puede someterse a temperaturas de hasta 80 °C sin perder la unión específica a FGFR3. El MICA-scFv tradicional perdió actividad de unión a 70 °C. Este resultado indicó que la MICA soluble que contiene el formato iFv inventado es significativamente más estable que las fusiones terminales de un scFv tradicional (Miller, B. R., Demarest, S. J., Lugovskoy, A., Huang, F., Wu, X., Snyder, W. B., Croner, L. J., Wang, N., Amatucci, A., Michaelson, J. S. y Glaser, S. M. (2010) Stability engineering of scFvs for the development of bispecific and multivalent antibodies, Protein engineering, design & selection: PEDS 23, 549-557; Weatherill, E. E., Cain, K. L., Heywood, S. P., Compson, J. E., Heads, J. T., Adams, R. y Humphreys, D. P. (2012) Towards a universal disulphide stabilised single chain Fv format: importance of interchain disulphide bond location and vL-vH orientation, Protein engineering, design & selection: PEDS25, 321-329).

Se demostró la capacidad de MICA-a3-iFv de redirigir la lisis mediada por células NK de células diana que expresan FGFR3 in vitro en un ensayo de liberación de calceína. La línea celular de linfocitos citolíticos naturales (NK), NKL, se cocultivó con células diana P815 cargadas con calceína que expresan ectópicamente FGFR3. Los resultados en la Figura 8 mostraron que las dos moléculas MICA-a3-iFv indujeron una lisis mediada por NK significativamente mayor en comparación con la fusión tradicional MICA-scFv, mientras que el control de MICA soluble no dirigido no tuvo actividad de destrucción. Estos resultados confirmaron que el iFv inventado se unía al FGFR3 en las células diana y en el contexto de la molécula de proteína parental completa, MICA soluble, indujo una potente lisis mediada por células NK.

La aplicabilidad del formato iFv a otros dominios variables de anticuerpos se demostró construyendo de manera similar un a3-iFv.3 (SEQ ID NO.:8), que contenía un iFv derivado de un anticuerpo específico de CD20 (Du, J., Wang, H., Zhong, C., Peng, B., Zhang, M., Li, B., Huo, S., Guo, Y. y Ding, J. (2007) Structural basis for recognition of CD20 by therapeutic antibody Rituximab, The Journal of biological chemistry 282, 15073-15080). La Figura 9 muestra que MICA-a3-iFv.3 pudo unirse específicamente a los pocillos recubiertos con CD20 en un ELISA basado en placa como se describe anteriormente y también indujo la lisis mediada por NK de células Ramos que expresan CD20 en un ensayo de liberación de calceína.

Ejemplo 2 (dominios a l - a2 modificados de ligandos NKG2D). Las proteínas humanas denominadas ULBP-1 a ULBP-6 son, como MICA y MICB, ligandos de la superficie celular de origen natural, inducibles por estrés, que se unen a los receptores NKG2D y activan las células NK humanas y ciertas células T (15; Cerwenka A, Lanier LL (2004). NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi:10.1034/j.1399-0039.2003.00070.x. PMID 12753652). Además, la proteína OMCP del virus de la viruela bovina es un dominio secretado que, al igual que el dominio a1-a2 de las proteínas MIC, se une a NKG2D. OMCP exhibe una afinidad muy alta por NKG2D, aparentemente para bloquear el reconocimiento de NKG2D de los ligandos de estrés naturales inducidos por el virus en su célula hospedadora infectada (Eric Lazear, Lance W. Peterson, Chris A. Nelson, David H. Fremont. J Virol. Enero de 2013; 87(2): 840-850. doi: 10.1128/JVI. 01948-12). Si bien los ULBP y OMCP se consideran ligandos NKG2D (NKG2DL) que comparten la estructura de dominio canónica a1-a2, la homología de secuencia con MICA a1-a2 es inferior al 27 % y, naturalmente, todos carecen de un dominio a3 para unir dominios de direccionamiento. Los presentes inventores construyeron una serie de proteínas ULB y OMCP no naturales mediante la unión de los polipéptidos heterólogos que se dirigían a y destruían específicamente las células que expresaban FGFR3 como resultado de la fusión con cada una de ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, ULBP-4, ULBP-6 y OMCP, un dominio a3 modificado de MICA en el cual se había insertado un iFv de direccionamiento. Además, los presentes inventores modificaron el dominio a1-a2 de MICA para mejorar la afinidad del dominio a1-a2 por NKG2D y después lo unieron a las moléculas heterólogas de los dominios a1-a2 modificados tales como los polipéptidos. Para producir las proteínas que consisten en dominios a1-a2 de ULBP y OMCP unidos a dominios a3-iFv modificados, los presentes inventores generaron un vector de expresión baculovírico para acomodar los fragmentos de ADN (SEQ ID NO: 9-14) que codificaban los diferentes dominios a1-a2 de ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, ULBP-4, ULBP-6 y OMCP (SEQ ID NO: 15-20), respectivamente. Los fragmentos de ADN se amplificaron por PCR, se digirieron usando las enzimas de restricción BlpI y Ncol y se subclonaron individualmente en el vector de expresión baculovírico, KLM44, reemplazando el dominio MICA a1-a2. KLM44 era un vector de expresión baculovírico derivado de SW403 en el cual se había clonado previamente MICA-a3-iFv.2 (ejemplo 1). Las nuevas construcciones NKG2DL-a3-iFv.2, que contienen las fusiones de dominio ULBP y OMCP a1-a2 a a3-iFv.2 (ULBP1-a3-iFv.2, ULBP2-a3-iFv.2, ULBP3-a3-iFv.2, ULBP4-a3-iFv.2, ULBP6-a3-iFv.2 y OMCP-a3-iFv.2; SEQ ID n O.:21-26, respectivamente), se cotransfectaron con ADN baculovírico en células de insecto SF9. El baculovirus se cultivó durante dos ciclos de amplificación y se usó para expresar estas proteínas NKG2DL-a3-iFv.2 etiquetadas con His en células de insecto T.ni de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen). La expresión se llevó a cabo en un volumen de 100 ml durante tres días y el medio de crecimiento se recogió para la purificación de la proteína soluble secretada usando cromatografía de afinidad con Ni. Las proteínas monoméricas de peso molecular correcto se purificaron a una pureza > 90 % como se determina por SDS-PAGE. La caracterización funcional se llevó a cabo mediante ELISA de unión y ensayos de destrucción de células diana in vitro.

Las 6 proteínas NKG2DL-a3-iFv.2 purificadas se analizaron en un ELISA de unión a FGFR3 para confirmar la unión simultánea a la diana FGFR3 y al receptor NKG2D. FGFR3 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) se recubrió sobre placas Maxisorp a una concentración de 2 ug/ml. Cada proteína NKG2DL-a3-iFv.2 se valoró, se permitió que se uniera a FGFR3 durante 1 hora y se lavó para retirar la proteína no unida. La proteína NKG2DL-a3-iFv.2 unida se detectó usando NKG2D-Fc y conjugado anti-Fc-HRP. La Figura 10 muestra que las 6 proteínas NKG2DL-a3-iFv.2 se unieron potentemente a FGFR3, como se esperaba, a través de la interacción con el dominio iFv.2, y la actividad de unión de NKG2D fue retenida por los dominios NKG2DL a1-a2 fijados, lo que demostró que el dominio a3-iFv adjunto impartió actividad de unión funcional de FGFR3 a las proteínas ULBP y OMPC que, como las proteínas MIC, se unen a NKG2D.

Se demostró la capacidad de las proteínas NKG2DL-a3-iFv.2 de redirigir la lisis mediada por células NK de células diana que expresan FGFR3 in vitro en un ensayo de liberación de calceína. La línea celular de linfocitos citolíticos naturales (NK), NKL, se cocultivó con células diana P815 cargadas con calceína que expresan ectópicamente FGFR3. Los resultados en la Figura 11 mostraron que OMCP-a3-iFv.2 indujo la mayor lisis mediada por n K, mientras que las otras proteínas NKG2DL-a3-iFv.2 mostraron todas una actividad letal específica con diversos grados de potencia y cantidad de lisis. Estos resultados confirmaron que el iFv inventado imparte actividad de unión específica a otras proteínas que retienen sus propias propiedades funcionales e inducen diferentes niveles de lisis mediada por células de células dirigidas a iFv.

Ejemplo 3 (dominios a l - a2 modificados de ligandos NKG2D). Estos son ejemplos de fijación de polipéptidos a NKG2DL que se modificaron para mejorar significativamente su afinidad de unión al receptor NKG2D humano. El dominio a1-a2 de las proteínas MIC es un NKG2DL para el receptor NKG2D. Esta afinidad es suficiente para la activación fisiológica de las células NK y la estimulación de la lisis de las células que expresan proteínas MIC nativas de longitud completa irreversiblemente fijado a la superficie bidimensional de la membrana plasmática de una "célula diana" (Bauer S, Groh V, Wu J, Steinle A, Phillips JH, Lanier LL, Spies T., Science. 30 de julio de 1999;285(5428):727-9.). Sin embargo, debido a que las proteínas MIC solubles diseñadas desveladas en el presente documento se unen reversiblemente a antígenos diana específicos en la superficie de una célula diana, la afinidad de unión de la proteína MIC soluble diseñada a NKG2D afectará directamente la estabilidad del complejo dependiente de MIC soluble formado entre células NK y células que expresan antígenos diana. Especialmente si la afinidad entre sMICA y NKG2D aumenta por una velocidad de disociación sustancialmente más lenta o una velocidad de desviación de la sMICA modificada de NKG2D, se esperaría que la destrucción basada en células NK fuera mayor a densidades más bajas de moléculas MIC solubles unidas a una célula diana. Antes de la presente divulgación no se había identificado ninguna mutación a1-a2 que altere la actividad letal de las proteínas MIC solubles o reduzca significativamente la velocidad de unión para mejorar la afinidad de las proteínas MIC con NKG2D. Un esfuerzo de diseño computacional mostró que tres mutaciones en el dominio a1-a2 de MICA de tipo silvestre: N69W, K152E y K154D (WED-MICA) en combinación pueden afectar moderadamente la afinidad de unión de NKG2D al afectar la estabilidad de MICA no unida y, por lo tanto, su velocidad de asociación o velocidad de unión a NKG2D (Lengyel CS, Willis LJ, Mann P, Baker D, Kortemme T, Strong RK, McFarland BJ.J Biol Chem. 19 de oct de 2007;282(42):30658-66. Epub 8 de agosto de 2007); El extenso trabajo de diseño computacional posterior realizado por el mismo grupo escaneando mediante cálculos iterativos 22 posiciones de aminoácidos de MICA teóricamente en contacto con NKG2D, de acuerdo con las descripciones estructurales publicadas (Li P, Morris DL, Willcox BE, Steinle A, Spies T, Strong RK., Nat Immunol. Mayo de 2001;2(5):443-451), mostró experimentalmente que cuando se combina con el diseño computacional iterativo, más racional, de 3 cambios diseñado anteriormente de MICA cambió cualitativamente su afinidad por NKG2D de débil (Kd ~2,5 |jM) a moderadamente estrecha (Kd = 51 nM) con un total de siete mutaciones combinadas (Henager, Samuel H., Melissa A. Hale, Nicholas J. Maurice, Erin C. Dunnington, Carter J. Swanson, Megan J. Peterson, Joseph J. Ban, David J. Culpepper, Luke D. Davies, Lisa K. Sanders y Benjamin J. McFarland, 2102, Combining different design strategies for rational affinity maturation of the MICA-NKG2D interface. Protein Science 21:1396-1402). Por el contrario, el enfoque experimental descrito en el presente documento seleccionó experimentalmente modificaciones de aminoácidos de MICA que ralentizaron la velocidad de disociación entre el dominio a1-a2 de MICA y NKG2D, comenzando con un MICA estabilizado por los 3 cambios de WED de Lengyel et al (Lengyel CS, Willis LJ, Mann P, Baker D, Kortemme T, Strong RK, McFarland BJ., J Biol Chem. 19 de oct de 2007;282(42):30658-66. Epub 8 de agosto de 2007).

Este ejemplo desvelado en el presente documento se refiere a la modificación de la afinidad de unión a NKG2D de las proteínas MIC solubles mediante la ingeniería de mutaciones específicas en posiciones de aminoácidos seleccionadas dentro del dominio a1-a2 que influyen en la cinética de unión fuera de la velocidad y, por lo tanto, alteran la actividad de destrucción mediada por células NK de las moléculas MIC marcadas como diana no naturales inventadas.

Para modificar por ingeniería dominios a1-a2 no naturales solubles con afinidad alterada por NKG2D, se eligieron 57 restos en el dominio a1-a2 para mutagénesis extensa (Figura 12). Se sintetizaron bibliotecas de ADN sintético que codifican el dominio a1-a2 y que contienen codones mutagénicos NNK en cada una de las 57 posiciones de aminoácidos, se clonaron individualmente como fusiones con la proteína de cubierta menor pIII del fago M13 y se produjeron partículas de fago que mostraban las variantes mutagenizadas a1-a2 en células E. coli SS320 de acuerdo con metodologías convencionales (Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C. y Barbas, C. F., 3a. (2011) Generation of human Fab antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences, Cold Spring Harbor protocols 2011). Las bibliotecas de fagos a1-a2 se clasificaron para aumentar la afinidad de unión usando NKG2D biotinilado recombinante como el antígeno diana y se sometieron a ciclos iterativos de unión intencionalmente prolongada, lavado prolongado y elución de los clones de fago para seleccionar variantes de alta afinidad enriquecidas para velocidades de disociación o de separación lenta. Se produjo un conjunto de mutaciones específicas de aminoácidos a altas frecuencias en 6 posiciones en a1-a2 y se seleccionaron como sustituciones de aminoácidos preferidas con mayor afinidad de unión a NKG2D (Figura 12, Tabla 1).

Tabla 1. Mutaciones de afinidad seleccionadas en las 6 posiciones de aminoácidos indicadas del dominio a1-a2 de MIC. Las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 en cada una de las 6 posiciones se muestran en negrita en la primera fila de la tabla. Las mutaciones de afinidad identificadas se enumeran en frecuencia decreciente de arriba

Los presentes inventores sintetizaron polinucleótidos de ADN (SEQ ID NO. 27-30) que codifican los dominios a1-a2 de 4 variantes representativas 15, 16, 17, 18 que contenían diferentes combinaciones de mutaciones específicas descubiertas (Tabla 2).

Tabla 2. Secuencias de variantes de dominio a1-a2 específicas. Las sustituciones de aminoácidos específicas para las variantes 15, 16, 17 y 18 (SEQ ID NO.: 31-34, respectivamente) se enumeran en relación con los aminoácidos de SEQ ID NO.:35 en negrita. Todos los aminoácidos están representados por las abreviaturas IUPAC de una sola letra.

Para los NKG2DL en el ejemplo anterior, los presentes inventores fijaron directamente moléculas heterólogas tales como un polipéptido a cada uno de estos 4 NKG2DL a1-a2 modificados usando un péptido conector. Cuatro proteínas etiquetadas con His (SEQ ID NO.: 31-34) que consisten en NKG2DL modificados con moléculas heterólogas unidas se expresaron en células de insecto y se purificaron para caracterizar sus afinidades de unión a NKG2D y parámetros de unión cinética. Usando un ELISA de unión competitiva, los presentes inventores determinaron las afinidades de unión relativas a NKG2D de las 4 variantes a1-a2 modificadas. Una NKG2DL soluble de tipo silvestre (TS), proteína sMICA, se recubrió en todos los pocillos de una placa ELISA maxisorp para proporcionar un compañero de unión para el reactivo NKG2D-Fc humano. Soluciones de las cuatro variantes a1-a2, así como dominios TS y WED-a1-a2 (SEQ ID NO.: 35) se valoraron en los pocilios de ELISA y se les permitió inhibir competitivamente la unión de NKG2D-Fc humano 2 nM a la sMICA TS recubierta en la placa. El nivel de NKG2D-Fc humana que se unió a TS NKG2DL en la placa se detectó usando un anticuerpo anti-Fc-HRP. La Figura 13A muestra que las variantes 16, 17 y 18 exhibieron valores de CI⁵⁰ de 0,7, 0,6, 0,5 nM mientras que la variante 15 exhibió un valor de CI⁵⁰ de 1,7 nM, poseyendo todos una unión significativamente mejor a NKG2D, 27, 32, 38 y 11 veces mejor, que TS NKG2DL, respectivamente, así como sustancialmente mejor que WED-MICA (Tabla 3).

Tabla 3. Parámetros de enlace cinéticos y de equilibrio para las variantes a1-a2. Los valores de CI⁵⁰ derivaron de ajustes de 4 parámetros a las valoraciones de unión competitiva (Figura 12) y los parámetros de cinética de unión derivaron de ajustes exponenciales sencillos a la cinética de unión (Figura 13). Las constantes de unión en equilibrio

=

De manera importante, las diferencias de CI⁵⁰ relativas también se tradujeron en una mejor unión a NKG2D-Fc murino (Figura 13B) y demostraron la capacidad de mejorar la unión de dominios a1-a2 solubles modificados en receptores NKG2D humanos y no humanos, una propiedad importante para el desarrollo preclínico de fármacos.

Para comprender la base cinética de las afinidades alteradas, tanto las velocidades de activación como las de desactivación para la variante a1-a2 de NKG2DL que se unen a la NKG2D humana biotinilada recubierta en la superficie se midieron usando interferometría de biocapa (Octet) a 100 nM de cada una de las proteínas a1-a2 modificadas. De acuerdo con los resultados de los ELISA de CI⁵⁰, las variantes 16, 17 y 18 mostraron cada una reducciones significativas en la tasa de desviación (18 veces en relación con TS), que es en gran parte responsable del aumento de la afinidad (~30 veces con respecto a TS a1-a2) (Figura 14; Tabla 3). Aunque la variante 15 mostró una velocidad de desactivación lenta como lo hicieron 16, 17 y 18, su velocidad de activación se redujo, dando como resultado una afinidad más fuerte que TS pero más débiles que las variantes 16, 17 y 18. Debido a que la única diferencia entre la variante 15 (SEQ ID NO.:31) y 16 (SEQ ID NO.:32) era K125N frente a K125L, la mutación en la posición 125 alteró claramente la velocidad de activación mientras que la disminución de la velocidad de desactivación se atribuyó a la mutación H161R. Por lo tanto, mientras que el conjunto seleccionado de mutaciones NKG2DL (Tabla 1) se usó para aumentar la afinidad a1-a2 por NKG2D a través de una reducción significativa de la velocidad de desactivación, ciertas sustituciones también alteraron la velocidad de activación dando como resultado un intervalo de aumentos de afinidad incrementales que los presentes inventores mostraron en esta divulgación para tener actividad diferencial en los ensayos de destrucción mediada por células NK como se describe a continuación.

Se demostró la capacidad de las variantes de afinidad a1-a2 de redirigir la lisis mediada por células NK de células diana que expresan FGFR3 in vitro en un ensayo de liberación de calceína. La línea celular humana de linfocitos citolíticos naturales (NK), NKL, se cocultivó con células diana P815 cargadas con calceína que expresan ectópicamente FGFR3 y se valoró con proteínas MIC modificadas solubles. Los resultados en la Figura 15 mostraron que las actividades de destrucción de las variantes de MIC solubles específicas de FGFR3 se correlacionaron con sus afinidades a1-a2 modificadas por ingeniería genética. Específicamente, las variantes 16, 17 y 18 exhibieron ~15 veces más destrucción que TS a 0,78 nM. WED-MICA (SEQ iD NO.:35) fue solo ligeramente mejor que TS. Por lo tanto, la divulgación describe sustituciones de aminoácidos dentro del dominio a1-a2 que aumentaron la afinidad de unión de NKG2D al reducir la tasa de unión de la proteína MIC soluble a NKG2D humana y, en consecuencia, condujeron a la potencia letal predeciblemente aumentada. WED-MICA, que exhibió una afinidad algo mayor que TS MICA a NKG2D (Figura 13A) al aumentar la velocidad de activación en lugar de reducir la velocidad de desactivación (Figura 14), no mostró una mejora sustancial de la destrucción de células diana (Figura 15). Adicionalmente, como se muestra en la Figura 13B, WED-MICA exhibió una unión sustancialmente más escasa a NKG2D murino que incluso TS MICA, mientras que las variantes 15, 16, 17 y 18 exhibieron una mayor afinidad por la NKG2D tanto humana como murina, Figura 13A-B.

Estas variantes de afinidad a1-a2 NKG2DL 15, 16, 17 y 18 mejoraron la afinidad de unión del polipéptido unido al receptor NKG2D y, por lo tanto, mejoraron la lisis mediada por células NK de las células diana, Figura 15.

Ejemplo 4 (dominios a l - a2 modificados de ligandos NKG2D). Este Ejemplo de la presente divulgación se refiere a variantes de afinidad adicionales de a1-a2 NKG2DL derivadas de mutaciones específicas de modificaciones por ingeniería genética en posiciones de aminoácidos seleccionadas dentro del dominio a1-a2 de moléculas MIC solubles, como se describe en el Ejemplo 3 (Tabla 1), que también influyen en la cinética de unión de la velocidad de desactivación y, por lo tanto, alteran la actividad de destrucción mediada por células NK de los dominios a1-a2 no naturales. Mientras que las variantes 15-18 se centraron en mutaciones específicas que se encuentran en las posiciones S20, G68, K125 y H161, se aisló otro conjunto de variantes con mutaciones adicionales en E152, H158 y Q166 (Tabla 4).

Tabla 4. Secuencias de variantes de dominio a1-a2 específicas. Las sustituciones de aminoácidos específicas para las variantes 20, 25 y 48 se enumeran en relación con los aminoácidos de SEQ ID NO.:35, mostrados en negrita en l rim r fil l l . T l min i n r r n r l r vi r I PA n l l r .

Los polinucleótidos de ADN (SEQ ID NO. 36-38) que codifica los dominios a1-a2 de 3 variantes representativas 20, 25, 48 (SEQ ID NO. 39-41, respectivamente) que contenían diferentes combinaciones de mutaciones específicas descubiertas (Tabla 4) se sintetizaron. Para los NKG2DL en el ejemplo anterior, las moléculas heterólogas, tales como un polipéptido de unión a FGFR3, se unieron directamente a cada uno de estos 3 NKG2DL a1-a2 modificados usando un péptido enlazador. Las construcciones se clonaron en los sitios Xbal y BamHI de pD2509, un vector de expresión de células de mamífero basado en CMV. Tres proteínas etiquetadas con His (SEQ ID NO.: 39-41), que consisten en NKG2DL modificados con moléculas heterólogas unidas que se unen a FGFR3, se expresaron transitoriamente en células HEK293 usando el sistema de expresión Expi293 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Life Technologies) y se purificaron usando cromatografía de afinidad con Ni para obtener las proteínas aisladas para análisis bioquímicos y basados en actividad.

Para caracterizar las afinidades de unión de NKG2D, tanto las tasas de activación como las de desactivación para las tres variantes de NKG2DL a1-a2 que se unen a NKG2D humana biotinilada recubierta de superficie se midieron mediante interferometría de biocapa (Octeto). Se realizaron titulaciones de unión para cada proteína usando un intervalo de valoración de 1-100 nM, y los datos cinéticos se ajustaron para obtener velocidades de activación, velocidades de desactivación y constantes de unión en equilibrio.

La variante 25 (SEQ ID NO.: 40) contiene solo la adición de la mutación Q166S relativa a la variante 16 (SEQ ID NO.: 32) (Tabla 2) y exhibió una afinidad de unión a NKG2D de 62 pM en gran parte debido a la disminución de la velocidad de desactivación (Figura 16 y Tabla 5). Esto representó una mejora de 8 veces en la afinidad de unión en equilibrio debido a la mutación Q166S (compárense la Tabla 3 y la Tabla 5), y demostró que las mutaciones específicas en Q166 influyeron en la afinidad de unión a través de la disminución de la velocidad de desactivación.

Tabla 5. Parámetros de unión cinética para variantes a1-a2. Los parámetros de unión cinética derivaron de ajustes exponenciales únicos a la cinética de unión (Figura 16). Las constantes de unión en equilibrio (Kd) derivaron de los arámetros de unión cinética usando la ecuación Kd = k FF/k N.

La variante 20 (SEQ ID NO.: 39) contenía las mutaciones específicas G68A, E152Q, H158R y Q166F, y mantuvieron parámetros de unión similares a la variante 25 (Tabla 5), sugiriendo que esta combinación única de mutaciones específicas también ha mejorado la afinidad de unión a NKG2D debido a una disminución de la velocidad de desactivación.

La variante 48 (SEQ ID NO.: 41) contenía las mutaciones K125L y H161R encontradas en la variante 16 (Tabla 2); sin embargo, la adición de mutaciones E152A, H1581 y Q166A (Tabla 4) aumentaron significativamente la velocidad de desactivación, dando como resultado una reducción de 250 veces en la afinidad de unión de NKG2D (Figura 16 y Tabla 5). La mutación Q166A no es una de las mutaciones favorecidas de aumento de la afinidad seleccionadas para la posición Q166 (Tabla 1) y puede haber contribuido a la reducción observada en la velocidad de desactivación. Estos datos demostraron claramente que las combinaciones únicas de las mutaciones modificadas por ingeniería genética seleccionadas e identificadas en posiciones definidas dentro de los dominios a1-a2 ajustaron la afinidad de unión de NKG2D a través de la modulación de la velocidad de desactivación.

Las variantes de afinidad a1-a2 no naturales con polipéptidos fijados redirigieron la lisis mediada por células NK de células diana que expresan FGFR3, como se demuestra in vitro en un ensayo de liberación de calceína. La línea celular humana de linfocitos citolíticos naturales (NK), NKL, se cocultivó con células diana P815 cargadas con calceína que expresan ectópicamente FGFR3 y se valoró con proteínas ligando NKG2D a1- a2 modificadas solubles. Los resultados en la Figura 17 mostraron que las potencias de destrucción de las variantes de MIC solubles dirigidas a FGFR3 se correlacionaron con sus afinidades a1-a2 modificadas por ingeniería genética. Específicamente, la variante 25 exhibió una destrucción ~3 veces mayor que la variante 16 a 0,2 nM, lo que representa una mejora de ~5 veces en la CE⁵⁰ para destruir células. Además, los datos mostraron claramente la actividad de destrucción preferida entre las variantes de MIC solubles representativas en el orden de la variante 25> 16> WED (Figura 17).

Ejemplo 5 (dominios a l - a2 modificados de ligandos NKG2D). Esta realización se refiere a variantes de afinidad de a1-a2 NKG2DL adicionales derivadas a través de modificación por ingeniería genética de los dominios a1-a2 de proteínas ULBP. Las proteínas ULBP contienen dominios a1-a2, que son ligandos de NKG2D capaces de unirse al receptor de NKG2D (Cerwenka A, Lanier LL (2004). NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi:10.1034/j.1399-0039.2003.00070.x. PMID 12753652). Esta afinidad de la unión de NKG2D es suficiente para la activación fisiológica de las células NK y estimular la lisis de las células que expresan proteínas ULBP nativas de longitud completa unidas de forma natural e irreversible a la superficie bidimensional de la membrana plasmática de una "célula diana" (Cerwenka A, Lanier LL ( 2004). NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi:10.1034/j.1399-0039.2003.00070.x. PMID 12753652). Sin embargo, debido a que los dominios a1-a2 solubles diseñados fusionados con polipéptidos heterólogos en ciertas realizaciones de la presente invención se unen reversiblemente a antígenos diana específicos en la superficie de una célula diana, la afinidad de unión de los dominios ULBP a1-a2 diseñados a NKG2D afectará directamente la estabilidad de la sinapsis artificial formada entre las células NK y las células que expresan antígenos diana, como ya se ha demostrado mediante proteínas MIC solubles modificadas por ingeniería genética (Ejemplos 2-4). Para diversificar el repertorio de dominios a1-a2 no naturales diseñados como ligandos NKG2D, las proteínas ULBP se usaron como un sustrato o punto de partida para la modificación por ingeniería genética basada en la presentación en fagos de su afinidad de unión a NKG2D. A pesar de la homología estructural observada entre ULBP y MICA (Radaev, S., Rostro, B., Brooks, AG., Colonna, M., Sun, PD. (2001) Conformational plasticity revealed by the cocrystal structure of NKG2D and its class I MHC-like Ligand ULBP3. Immunity 15, 1039-49.), la homología de secuencia es <50 % para los dominios ULBP a 1-a2 con respecto a MICA (Figura 18). Por lo tanto, los presentes inventores buscaron las identidades de las posiciones de los codones en los dominios ULBP a1-a2 que mejoran la afinidad de unión de NKG2D.

Para modificar por ingeniería genética dominios a1-a2 no naturales solubles a partir de proteínas ULBP, se eligieron ULBP2 y ULBP3 para la presentación en fagos y la selección de mutantes con unión a NKG2D de alta afinidad. Sesenta posiciones de aminoácidos en el dominio a1-a2 de ULBP2 (SEQ ID NO.:16) y treinta y seis posiciones de aminoácidos en el dominio a1-a2 de ULBP3 (SEQ ID NO.: 17), se eligieron para mutagénesis extensiva (Figura 18). Además, se realizaron mutaciones conservativas de cisteína a serina en C103S en ULBP3 (SEQ ID NO.:17) y C8S en ULBP2 (SEQ ID NO.: 16) para retirar las cisteínas libres desapareadas que podrían interferir con la selección de fagos. Se sintetizaron bibliotecas de ADN sintético que codifican estos dominios a1-a2 y que contienen codones mutagénicos NNK en cada una de las posiciones de aminoácidos seleccionadas, individualmente; se clonaron como fusiones con la proteína de cubierta menor pIII del fago M13; y se produjeron partículas de fago que mostraban las variantes mutagenizadas a1-a2 ULBP2 o ULBP3 en células E. coli SS320 de acuerdo con metodologías convencionales (Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C. y Barbas, C. F., 3a. (2011). Generation of human Fab antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences, Cold Spring Harbor protocols 2011). Las bibliotecas de visualización de fagos a1-a2 se clasificaron para aumentar la afinidad de unión a NKG2D usando NKG2D-Fc humano como la proteína diana y se sometieron a ciclos iterativos de unión intencionalmente prolongada, lavado prolongado y elución de los clones de fago para seleccionar variantes de alta afinidad enriquecidas para velocidades de disociación o de separación lenta. Para ULBP2, se encontraron mutaciones específicas de aminoácidos a altas frecuencias en las posiciones R80, V151, V152 y A153 en a1-a2, y se identificaron como sustituciones de aminoácidos preferidas con afinidad de unión a NKG2D mejorada (Figura 19 A y Tabla 6).

Tabla 6. Mutaciones de afinidad seleccionadas en las 4 posiciones de aminoácidos indicadas del dominio a1-a2 de ULBP2. Las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 en cada una de las 4 posiciones se muestran en negrita en la primera fila de la tabla. Las mutaciones de afinidad identificadas se enumeran en frecuencia decreciente de rri . T l min i n r r n r l r vi r I PA n l l r .

Para ULBP3, se encontraron mutaciones específicas de aminoácidos a altas frecuencias en diferentes lugares en relación con ULBP2 (Figura 18). Las posiciones R162 y K165 en el dominio a1-a2 de ULBP3 contenían mutaciones específicas que se identificaron como sustituciones de aminoácidos preferidas con afinidad de unión a NKG2D mejorada (Figura 19 B y Tabla 7). Estos dominios a1-a2 no naturales modificados derivados de ULBP2 y ULBP3 pueden usarse para mejorar la unión de NKG2D en múltiples formatos terapéuticos como proteínas individuales o fusiones con péptidos o polipéptidos heterólogos.

Tabla 7. Mutaciones de afinidad seleccionadas en las 2 posiciones de aminoácidos indicadas del dominio a1-a2 de ULBP3. Las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 en cada una de las 2 posiciones se muestran en negrita en la primera fila de la tabla. Las mutaciones de afinidad identificadas se enumeran en frecuencia decreciente de arriba a abajo. Todos los aminoácidos están representados por las abreviaturas IUPAC de una sola letra.

Ejemplo 6 (Dominios a1-a2 modificados fusionados con péptidos de anticuerpos). Estos son ejemplos de fijación de polipéptidos de anticuerpos a NKG2DL que se modificaron para mejorar significativamente su afinidad de unión al receptor NKG2D humano. El dominio a1-a2 de las proteínas MIC es un NKG2DL para el receptor NKG2D. Los anticuerpos son glucoproteínas muy estables formadas por dos cadenas pesadas grandes y dos cadenas ligeras pequeñas (Figura 1). La gran cantidad de diversidad que puede generarse dentro de las regiones CDR de los dominios variables permite que se generen anticuerpos específicos para dianas de antígeno específicas (Hozumi N, Tonegawa S (1976). "Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73 (10): 3628-3632. doi: 10.1073/pnas.73.10.3628. PMC 431171. PMID 824647.) Los anticuerpos se han convertido en una importante plataforma terapéutica para el desarrollo de fármacos y pueden mediar tanto en la unión a la diana como en la neutralización, así como modular el sistema inmunitario a través del complemento y la unión del receptor Fc (Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. (2014) IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology 5, 520.). Antes de la presente divulgación, no existía un formato de anticuerpo IgG que pudiera activar directamente las células inmunitarias usando dominios a1-a2 no naturales que se unen más estrechamente que los NKG2DL nativos al receptor NKG2D. Los trabajos anteriores han demostrado que el ligando NKG2D de ratón, Rae1 beta, puede fusionarse con un anticuerpo anti-Her2 para su uso como agente antitumoral en ratones (Cho, HM., Rosenblatt, JD., Tolba, K., Shin, SJ., Shin, D., Calfa, C., Zhang, Y., Shin, SU. (2010) Delivery of NKG2D ligand using and anti-Her2 antibody-NKG2D ligand fusion protein results in an enhanced innate and adaptive antitumor response. Cancer Research 70, 10121-30.). Sin embargo, los ligandos de NKG2D de ratón no se unen a NKG2D humana y no hay ligandos de NKG2D humanos naturales con alta afinidad por la NKG2D humana y de ratón. Las fusiones entre los ligandos a1-a2 NKG2D modificados por ingeniería genética de la presente divulgación y la cadena pesada o la cadena ligera de los anticuerpos IgG (Figura 20 A y B) superaron estas limitaciones y destacaron la versatilidad de las fusiones de dominios a1-a2 modificados con proteínas o péptidos heterólogos.

Para generar fusiones variantes de dominio a1-a2 a anticuerpos, las secuencias de ADN que codifican el dominio a1-a2 para MIC TS, variantes WED, 25 y 48, se sintetizaron y se clonaron como fusiones C-terminales a la secuencia de cadena pesada (HC _TS, HC _WED, HC_25, HC_48) o de cadena ligera (LC TS, LC WED, LC_25, LC_48) del anticuerpo específico de FGFR3 (Qing, J., Du, X., Chen, Y., Chan, P., Li, H., Wu, P., Marsters, S., Stawicki, S., Tien, J., Totpal, K., Ross, S., Stinson, S., Dornan, D., French, D., Wang, Q. R., Stephan, J. P., Wu, Y., Wiesmann, C. y Ashkenazi, A. (2009) Antibody-based targeting of FGFR3 in bladder carcinoma and t(4; 14)-positive multiple myeloma in mice, The Journal of clinical investigation 119, 1216-1229.) (SEQ ID NO.: 42-49), respectivamente. Las fusiones resultantes se clonaron en el vector de expresión de mamíferos pD2509 y se expresaron como anticuerpos IgG completos emparejados con fusiones de cadena pesada o ligera de los dominios a1-a2 modificados (SEQ ID NO: 50­ 57), respectivamente. Las expresiones transitorias se llevaron a cabo en células HEK293 usando el sistema de expresión Expi293 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Life Technologies) y se purificaron usando cromatografía de afinidad de proteína A convencional. Se demostró la capacidad de las fusiones de anticuerpo a 1-a2 no naturales de redirigir la lisis mediada por células NK de células diana que expresan FGFR3 in vitro en un ensayo de liberación de calceína. La línea celular humana de linfocitos citolíticos naturales (NK), NKL, se cocultivó con células diana P815 cargadas con calceína que expresan ectópicamente FGFR3 y se valoró con las proteínas de fusión de anticuerpo modificadas por ingeniería genética. Los resultados en las Figuras 20C y 20D mostraron que las actividades de destrucción de las fusiones de anticuerpos a1-a2 no naturales específicos de FGFR3 se correlacionaron con sus afinidades NKG2D modificadas por ingeniería genética. Específicamente, los anticuerpos que contenían fusiones de cadena pesada o cadena ligera de variantes no naturales 25 y 48 (HC 25, HC_48 y LC_25, LC_48) destruyeron las células que expresaban FGFR3 más eficazmente que las fusiones de anticuerpos que contenían dominios TS o WED a1-a2.

Se demostró además que esto es un enfoque general y útil para fusionar dominios a1-a2 modificados con anticuerpos, fusionando el dominio variante 25 a1-a2 con el extremo C de la cadena pesada o de la cadena ligera del anticuerpo cetuximab específico de EGFR (patente de EE.UU. 6217866), trastuzumab anticuerpo específico de Her2 (Carter, P., Presta, L., Gorman, CM., Ridgway, JB., Henner, D., Wong, W l ., Rowland, AM., Kotts, C., Carver, ME., Shepard, HM. (1992) Proc Natl Acad Sci 15, 4285-9) o un anticuerpo anti-PDL1 (Patente de EE.UU. 20140341917) (SEQ ID NO.:58-63, respectivamente). Las fusiones resultantes se expresaron como anticuerpos IgG completos de cadena ligera y pesada emparejados con fusiones de cadena pesada o ligera del dominio 25 a1-a2 variante. Las expresiones transitorias se llevaron a cabo en células HEK293 usando el sistema de expresión Expi293 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Life Technologies) y se purificaron usando cromatografía de afinidad de proteína A convencional. Se demostró la capacidad de 25 fusiones de anticuerpo variantes de redirigir la lisis mediada por células NK de células diana que expresan la diana in vitro en un ensayo de liberación de calceína. La línea celular humana de linfocitos citolíticos naturales (NK), NKL, se cocultivó con células diana que expresan A431 EGFR cargadas con calceína, células diana que expresan SKBR3 Her2 o células B16 que expresan PDL1 y se valoraron con las respectivas proteínas de fusión de anticuerpos modificados por ingeniería genética específicos de diana. Los resultados en las Figuras 21A, 21B y 21C mostraron que las actividades destructoras de las fusiones de 25 anticuerpos variantes específicas de la diana mejoraron drásticamente en todos los casos con respecto al anticuerpo parental no fusionado y fueron muy potentes con valores de CE⁵⁰ sub-nanomolares. Estos datos muestran que las fusiones anticuerpo-variante a1-a2 modificadas son una plataforma universal para permitir que los anticuerpos IgG se unan estrechamente a NKG2D y para dirigir la lisis celular específica de antígeno.

Ejemplo 7 (fusiones de trastuzumab a variante 25 a1-a2 se unen a las células NK en vivos y provocan una potente presentación de antígeno). Las proteínas de fusión que contienen variantes de dominio a1-a2 que se unen a NKG2D se unen a células NK con alta afinidad in vivo. Por lo tanto, los anticuerpos específicos de antígeno que contienen fusiones a1-a2 modificadas se unen fuertemente a NKG2D y, por lo tanto, arman de manera eficaz la superficie de las células NK in vivo con anticuerpos para buscar células diana que expresen un antígeno particular. Esta actividad fue similar a la de las células CAR modificadas por ingeniería genética (Gill, S. y June, CH. (2015) Going viral: chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies. Immunol Rev 263, 68-89.), pero no requirió la modificación genética del tipo de célula que expresa NKG2D.

Para demostrar que los anticuerpos que contienen fusiones a1-a2 modificadas se unen a las células NK in vivo, trastuzumab y las correspondientes fusiones de cadena pesada y ligera de la variante 25 se analizaron in vivo para los perfiles farmacocinéticos (PK) séricos y la farmacodinámica (PD) del marcaje de células NK. Los tres anticuerpos: trastuzumab parental; fusión de trastuzumab HC_25; y fusión de trastuzumab LC_25, se conjugaron con Alexa Fluor 647 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Life Technologies). Se inyectó a grupos de tres ratones C57BL/6 una dosis única de 100 |jg de cada anticuerpo y se extrajo sangre en los puntos de tiempo indicados para ELISA de PK en plasma y citometría de flujo de células n K periféricas. El perfil farmacocinético del anticuerpo trastuzumab parental mostró una distribución de fase alfa típica en 24 h y una eliminación de fase beta consistente con una semivida de anticuerpos en ratones de más de 1 semana (Figura 22A). Tanto para las fusiones de cadena pesada como de cadena ligera con la variante 25, la fase alfa inicial mostró un volumen de distribución mucho mayor en relación con el anticuerpo parental, consistente con un sumidero NKG2D, mientras que la eliminación de la fase beta también fue consistente con la eliminación típica de anticuerpos en ratones (Figura 22 A). Usando citometría de flujo de células NK periféricas de la sangre del ratón, el nivel de tinción de células NK con Alexa Fluor 647 mostró un claro aumento dependiente del tiempo en el porcentaje de células NK marcadas con la fusión de anticuerpos, pero no el anticuerpo parental (Figura 22 B). El aumento en el marcaje por las fusiones alcanzó su punto máximo en 24 h, consistente con el sumidero observado en los perfiles PK para las fusiones, y fue estable al menos durante tres días después de la inyección. Los datos combinados de PK y Pd demuestran que los anticuerpos de trastuzumab que contienen fusiones variantes 25 a1-a2 formaron complejos estables con NKG2D en células NK in vivo.

Para evaluar la aparición de anticuerpos antifármaco (ADA) contra el anticuerpo humano IgG trastuzumab, las muestras de plasma del estudio PK/PD se evaluaron en busca de ADA mediante un ELISA. En las Figuras 23A-C, los ELISA para la unión de IgG de ratón a pocillos recubiertos con las 3 dosis respectivas de anticuerpos revelaron que solo los anticuerpos fusionados con la variante 25 provocaron ADA dentro de los siete días posteriores a una dosis única de anticuerpo. El anticuerpo original de trastuzumab no dio señal de ADA. Para determinar si las fusiones de anticuerpos provocaron una respuesta inmunitaria (ADA) tanto para el dominio a1-a2 como para el componente del anticuerpo (trastuzumab) cuando el anticuerpo trastuzumab en sí mismo no provocó una respuesta inmunitaria, el plasma positivo para ADA de las fusiones de anticuerpos se analizó contra el anticuerpo original y el dominio variante 25 a1-a2 individualmente; ambos restos reaccionaron con ADA del plasma (Figuras 24A y 24B). Estos datos demuestran que la fusión de la variante 25 de alta afinidad con el anticuerpo original media la captación dependiente de NKG2D y la presentación del antígeno para provocar respuestas inmunitarias potentes y rápidas al anticuerpo parental, que por sí solo no era tan inmunogénico en ratones. Por lo tanto, una variante de alta afinidad del dominio a1-a2 unido a un antígeno o inmunógeno proporcionó una presentación potente del antígeno y la propagación del epítopo, sirviendo eficazmente como un potente adyuvante para la inmunización.

Los efectos combinados demostrados de armar las células NK circulantes para la lisis de células diana dirigidas y mejorar la presentación de antígenos son actividades importantes para las fusiones de anticuerpos con dominios a1-a2 modificados que pueden proporcionar un beneficio terapéutico.

Claims (2)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de dominio a1-a2 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 17,

en donde dicha molécula de dominio contiene todos de (a)-(c):

(a) un resto S en la posición correspondiente a la posición 103 de SEQ ID NO: 17,

(b) un resto A, P, S, T o H en la posición correspondiente a la posición 165 de SEQ ID NO: 17; y

(c) un resto G en la posición correspondiente a la posición 162 de SEQ ID NO: 17,

y en donde dicha molécula de dominio muestra una mayor afinidad de unión a un NKG2D humano en comparación con SEQ ID NO: 17.

2. La molécula de dominio a1-a2 de la reivindicación 1,

en donde el aminoácido en la posición 165 es un resto P o H.