ES2900632T3 - Células T CD4+ productoras de IL-10 para uso en el tratamiento de un cáncer - Google Patents

Células T CD4+ productoras de IL-10 para uso en el tratamiento de un cáncer Download PDF

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Abstract

Una célula T CD4+ que expresa IL-10 humana para uso en el tratamiento y/o prevención de un tumor, en la que dicho tumor expresa CD13, HLA de clase I y CD54, en la que dicha célula ha sido modificada genéticamente para sobreexpresar o expresar altos niveles de IL-10 con respecto a una célula de referencia.

Description

DESCRIPCIÓN
Células T CD4+ productoras de IL-10 para uso en el tratamiento de un cáncer
Campo técnico
La presente invención se refiere a una célula T CD4+ que produce altos niveles de IL-10 para su uso en el tratamiento y/o prevención de un tumor que expresa CD13, HLA de clase I y CD54 y/o para su uso en la inducción de injerto contra tumor (IcT). La presente invención se refiere también a un método in vitro para seleccionar un sujeto a tratar con dicha célula.
Antecedentes de la técnica
Las células T reguladoras (T reg) son un componente fundamental del sistema inmunológico sano, ya que desempeñan un papel fundamental en la promoción y el mantenimiento de la tolerancia. A lo largo de los años, se han identificado varios tipos de Treg y, hasta la fecha, las mejor caracterizadas son las Treg de expresión de secuencia en cabeza de tenedor P3 (FOXP3) (Treg CD25+)1 y las células T reguladoras de tipo 1 (Tr1)2. Las células Tr1 se inducen en la periferia tras la estimulación crónica del antígeno (Ag) en presencia de IL-102, y se caracterizan por la coexpresión de CD49b y LAG-33 y la capacidad de secretar IL-10, factor de crecimiento transformante (TGF)-p, cantidades variables de IFN-y y niveles bajos de IL-2, y cantidades mínimas de IL-4 e IL-172-4. Las células Tr1 suprimen las respuestas de las células T principalmente a través de la secreción de IL-10 y TGF-p25 y mediante la destrucción específica de las células presentadoras de antígenos mieloides mediante la liberación de granzima B (GzB) y perforina6. Las células Tr1 son inducidas in vitro cuando las células T se activan en presencia de IL-10 humana recombinante o células dendríticas tolerogénicas (DC-10) que secretan grandes cantidades de IL-10 y expresan el transcrito 4 similar a la inmunoglobulina (ILT4) y HLA-G78.
En la última década se ha dedicado mucho esfuerzo a desarrollar métodos adecuados para la inducción/expansión in vitro de Treg CD25+ y de células Tr1 para la terapia celular basada en Treg para promover o restaurar la tolerancia en enfermedades mediadas por células T. La terapia celular basada en Treg se ha probado ampliamente en modelos preclínicos de enfermedad de injerto contra hospedador (EICH)9-11 y modelos de ratón humanizados de xeno-EICH12. Los ensayos clínicos de prueba de principio en el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (alo-TCMH) demostraron la seguridad de la terapia celular basada en Treg CD25+13-17. Se infundieron Treg recién aisladas14-15’17 o CD25+ policlonales expandidas in vitro13,16 después de un alo-TCMH o un TCMH haploidéntico para neoplasias malignas oncológicas para prevenir la EICH. En estos estudios se observó una reducción de la EICH en comparación con los controles históricos. Recientemente, se ha mostrado que en pacientes tratados con Treg CD25+, la incidencia acumulada de recaídas era significativamente menor que en los controles17. Los inventores seguían un enfoque a medida del donante-paciente usando células T de donante anergizadas con IL-10 específicas del hospedador (IL-10 DLI), que contienen células Tr1 como terapia basada en Treg. Se obtuvo IL-10 DLI in vitro con estimulación de aloAg en presencia de IL-10 o DC-10 exógena. Los inventores demostraron la seguridad y viabilidad de la infusión de células Tr1 en un ensayo clínico destinado a proporcionar reconstitución inmunitaria en ausencia de EICH grave en pacientes con cáncer hematológico sometidos a TCMH haploidéntico18. Aunque se trató a una pequeña cohorte de pacientes, los resultados demostraron que después de la infusión de IL-10 DLI solo se observó EICH leve (grado II o III, que responde a la terapia) y se logró una firma de tolerancia. Además, el tratamiento aceleraba la reconstitución inmunitaria después del trasplante y se correlacionaba con la remisión prolongada de la enfermedad18. Una gran diferencia entre los ensayos basados en Treg CD25+ y el ensayo de IL-10 DLI es que, en los primeros, se administró un conjunto de células policlonales no específicas de Ag, mientras que los inventores usaron un producto celular que contenía células Tr1 específicas del hospedador derivadas del donante cebadas in vitro.
Andolfi y col. divulga el uso de un vector lentivírico bidireccional (LV) que codifica la IL-10 humana y el gen marcador, la proteína fluorescente verde (GFP), que se coexpresan de forma independiente para generar células CD4LV-IL-10. Las células CD4LV-IL-10 mostraban características típicas de Tr1: el fenotipo anérgico, la supresión dependiente de IL-10 y TGF-p de las respuestas de células T alogénicas, la capacidad de suprimir de una manera independiente del contacto de célula a célula in vitro. Las células CD4LV-IL-10 podían controlar la enfermedad de xenoinjerto contra hospedador (EICH), demostrando su función supresora in vivo18.
A pesar de los recientes avances en el establecimiento de protocolos de inmunoterapia basada en Tr1 con células T anergizadas con IL-10 específicas de aloAg inducidas in vitro, las poblaciones resultantes aún contienen contaminantes que podrían limitar potencialmente la eficacia in vivo de las células Tr1 para modular las respuestas mediadas por células T. Por lo tanto, existe la necesidad de una población de células puras que expresen IL-10 para su uso en terapia.
Sumario de la invención
En la presente invención, se generó una célula T CD4+ que produce altos niveles de IL-10. En particular, se generó una población de células T CD4+ manipuladas con IL-10 (CD4IL-10) homogénea transduciendo células T CD4+ humanas con un vector lentivírico bidireccional (LV) que codifica IL-10 humana y ANGFR, como gen marcador de grado clínico, lo que conduce a una sobreexpresión constitutiva de IL-10. Sorprendentemente, la población de células CD4IL-10 de la invención era capaz de eliminar el tumor, pero mantenía la característica intrínseca, similar a Tr1, de prevenir la xeno-EICH. Sorprendentemente, la población de células CD4IL-10 de la invención destruye tumores (o células diana) que expresan CD13. La expresión de CD13 en el tumor o en las células diana es determinante para la actividad antitumoral de la población de células CD4IL-10. Además, la actividad destructora de CD4IL-10 de la invención requiere la presencia de CD13, HLA de clase I y CD54 en el tumor. Por lo tanto, la transferencia adoptiva de células CD4IL-10 de la invención media un potente efecto antitumoral in vivo, preferiblemente un efecto antileucemia (injerto contra leucemia, IcL), y previene la xeno-EICH sin comprometer el efecto de IcL mediado por TCMH.
De forma similar a las células T CD4IL-10 policlonales descritas anteriormente, las células T CD4IL-10 aloespecíficas también son capaces de eliminar estirpes de células tumorales CD13+ de una manera dependiente de HLA-1.
Las células CD4IL-10 de la presente invención expresan homogéneamente GzB, son CD18+, que en asociación con CD11 a forma LFA-1, CD2+y CD226+. Además, las células CD4IL-10 de la presente invención adquirieron la capacidad de eliminar células diana, tales como células tumorales, por ejemplo, células mieloides primarias, tales como blastos leucémicos primarios. Los inventores demuestran que la actividad antileucémica de las células CD41L-10 es específica de las células mieloides y requiere la presencia de HLA de clase I en el tumor. Los inventores identifican CD13, CD54 y, opcionalmente, CD112 de HLA de clase I como biomarcadores de actividad antileucémica de células CD4IL-10. Además, los inventores aportan pruebas de que la transferencia adoptiva de células CD4IL-10 media potentes efectos tumorales antimieloides y antileucémicos in vivo y previene la xeno-EICH sin comprometer el efecto antileucémico mediado por las células T alogénicas.
En resumen, los inventores mostraron que las células CD4IL-10 i) destruyen específicamente células diana, en particular células mieloides; ii) median efectos antitumorales (IcTIcT) o antileucémicos (IcL), iii) permiten que las células T alogénicas mantengan su efecto antileucémico (IcL); y iv) mantienen la capacidad de inhibir la EICH. En el contexto de tumores sólidos, la capacidad de la inmunoterapia con células CD4IL-10 para eliminar células tumorales se denomina injerto contra tumor (IcTIcT), mientras que en el contexto de enfermedades hematológicas el efecto antitumoral mediado por inmunoterapia con células T CD4IL-10 o alogénicas se denomina injerto contra leucemia (IcL).
Según los hallazgos, las células CD4IL-10 de la presente invención previenen la EICH mientras que al mismo tiempo conservan la IcL en pacientes afectados por una variedad de neoplasias malignas hematológicas que reciben alo-TCMH. Además, la capacidad de las células CD4IL-10 para eliminar la leucemia mieloide de una manera independiente de aloAg pero dependiente de HLA de clase I las convierte en un enfoque terapéutico interesante para limitar, y posiblemente superar, la recaída de leucemia causada por la pérdida de alelos HLA compartidos después de un TCMH haploidéntico o un TCMH coincidente no relacionado. Además, las células CD4IL-10 median los efectos antileucémicos de una manera independiente de aloAg, lo que hace posible el uso de células autólogas o incluso de terceros como inmunoterapia. Además, las células CD4IL-10 podrían usarse como células antitumorales en el contexto de otras neoplasias malignas mediadas por células mieloides aberrantes, tales como en las manifestaciones extramedulares (ME) de la LMA, que incluyen el sarcoma mieloide y la leucemia cutis. Hasta ahora, el tratamiento para la ME es la quimioterapia. En especial, la ME es a menudo una forma de recaída después de un alo-TCMH. Finalmente, pudiendo eliminar también las células mieloides no transformadas (es decir, monocitos y CD mieloides), las células CD4IL-10 también pueden usarse como terapia adyuvante en otras neoplasias malignas, tales como en tumores sólidos, donde se sabe que las células mieloides asociadas a tumores desempeñan un papel crítico en la promoción de la neovascularización tumoral.
Los inventores generaron una población homogénea de células T CD4+ productoras de IL-10 humana (CD4IL-10) mediante transferencia génica mediada por vectores lentivíricos. Las células CD4IL-10 de la presente invención i) destruyen específicamente las células diana que expresan CD13, CD54 y HLA de clase I, en particular células leucémicas y blastos primarios. Las células diana también pueden expresar marcadores adicionales tales como CD112, CD58 o CD155, ii) median efectos antileucémicos y antitumorales in vivo, y iii) conservan el IcL mediado por células T alogénicas.
En general, la inmunoterapia con células CD4IL-10 representa una herramienta innovadora para prevenir la EICH en pacientes afectados por una variedad de neoplasias malignas hematológicas que reciben alo-TCMH. Además, abre nuevas perspectivas también en el contexto de otras neoplasias malignas mediadas por células mieloides aberrantes.
En particular, la presente invención se refiere a algunas aplicaciones específicas de células CD4IL-10:
1) Se orientan a células, p. ej. células tumorales, en particular blastos leucémicos, que expresan CD13, CD54 y HLA-I, opcionalmente CD112, lo que conduce a un método para seleccionar al paciente que se va a tratar con las células CD4IL-10.
2) Las células CD4IL-10 transferidas adoptivamente in vivo median el IcL pero no obstaculizan el efecto de IcL de las células T alogénicas humanas.
3) Las células CD4IL-10 inhiben la expansión de las células T alogénicas en los tejidos periféricos, previniendo la EICH.
4) Selección de paciente y diseño de protocolo terapéutico ad hoc: Las células CD4IL-10 pueden usarse no solo para prevenir la EICH después de un TCMH alogénico, sino también como inmunoterapia para eliminar selectivamente los blastos en caso de recaída de la enfermedad.
El sorprendente y notable efecto de las células CD4IL-10 de la presente invención reside en el hecho de que no sólo tales células pueden suprimir tumores (tales como tumores hematológicos) sino que no inducen EICH, como lo hace el alo-TCMH. Además, las células CD4IL-10 de la presente invención no inhiben el IcL mediado por alo-TCMH. Todos estos datos juntos demuestran las propiedades superiores y ventajosas de las células CD4IL-10 de la presente invención para los tumores y para el tratamiento y/o prevención de EICH conservando al mismo tiempo IcT y/o IcL después de alo-TCMH para curar neoplasias malignas mieloides.
Por lo tanto, la presente invención proporciona una célula T CD4+ que produce altos niveles de IL-10 para su uso en el tratamiento y/o prevención de un tumor, en la que dicho tumor expresa CD13, HLA de clase I y CD54.
Preferiblemente, dicha célula se modifica para producir altos niveles de IL-10. Preferiblemente, dicha célula está modificada genéticamente para producir IL-10. Preferiblemente, dicha célula expresa CD18 y/o CD2 y/o CD226. Aún más preferiblemente, dicha célula es CD226++, es decir, expresa altos niveles de CD226. Preferiblemente, dicha célula expresa granzima B (GzB).
Preferiblemente, dicha célula previene la EICH. Preferiblemente, dicha célula induce injerto contra tumor (IcT) y/o induce injerto contra leucemia (IcL). Preferiblemente, dicha célula es autóloga, heteróloga, policlonal o aloespecífica. Una célula preferida es autóloga y policlonal o heteróloga y policlonal.
Preferiblemente, dicho tumor expresa además al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en: CD112, CD58. Preferiblemente, dicho tumor expresa además CD155. Preferiblemente, el tumor es un tumor sólido o hematológico. Preferiblemente, el tumor es leucémico o un tumor mieloide.
Preferiblemente, el tumor está mediado por una célula seleccionada del grupo que consiste en: macrófagos, monocitos, granulocitos, eritrocitos, trombocitos, mastocitos, células B, células T, células NK, células dendríticas, células de Kupffer, células microgliales y células plasmáticas. Preferiblemente, el tumor sólido o el tumor hematológico se selecciona de una célula del grupo que consiste en: cáncer suprarrenal, cáncer anal, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, tumores cerebrales/del SNC en adultos, tumores cerebrales/del SNC en niños, cáncer de mama, cáncer de mama en hombres, cáncer de origen primario desconocido, enfermedad de Castleman, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon/recto, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, tumores de la familia Ewing, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, tumor del estroma gastrointestinal (TEGI), enfermedad trofoblástica gestacional, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer laríngeo e hipofaríngeo, leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA, incluyendo sarcoma mieloide y leucemia cutis), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia mielomonocítica crónica (LMMC), leucemia en niños, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, tumor carcinoide de pulmón, linfoma, linfoma de piel, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, cáncer de cavidad nasal y de senos paranasales, cáncer de nasofaringe, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, linfoma no Hodgkin en niños, cáncer de orofaringe y cavidad oral, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pene, tumores hipofisarios, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma - cáncer de tejidos blandos en adultos, cáncer de piel, cáncer de piel - basocelular y espinocelular, cáncer de piel - melanoma, cáncer de piel - células de Merkel, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de timo, cáncer de tiroides, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms.
Preferiblemente, el tumor es refractario a una intervención terapéutica. Preferiblemente, dicha célula se usa en combinación con una intervención terapéutica. La combinación puede ser simultánea o realizarse en diferentes momentos. Preferiblemente, la intervención terapéutica se selecciona del grupo que consiste en: quimioterapia, radioterapia, alo-TCMH, transfusión de sangre, trasplante de médula sanguínea.
La invención también proporciona una célula T CD4+ que produce altos niveles de IL-10 para su uso en el tratamiento y/o prevención de la recaída de leucemia.
La invención también proporciona una célula T CD4+ que produce altos niveles de IL-10 para su uso en un método para inducir injerto contra tumor (IcT). Preferiblemente, dicha célula se modifica para producir altos niveles de IL-10. Preferiblemente, dicha célula está modificada genéticamente para producir IL-10.
La invención también proporciona una composición que comprende una célula T CD4+ como se definió anteriormente y excipientes apropiados para su uso en el tratamiento y/o prevención de un tumor en la que dicho tumor expresa CD13, HLA de clase I y CD54 o para su uso en el tratamiento y/o prevención de la recaída de leucemia o para su uso en un método para inducir injerto contra tumor (IcT).
Preferiblemente, la composición comprende además un agente terapéutico.
La invención también proporciona un método in vitro para seleccionar un sujeto para ser tratado con una célula T CD4+ que produce un alto nivel de IL-10, que comprende detectar la presencia de una célula que expresa CD13, HLA de clase I y CD54 en una muestra biológica obtenida del sujeto, en el que si se detecta la presencia de la célula que expresa CD13, HLA de clase I y CD54, el sujeto se selecciona para ser tratado con dicha célula T CD4+. Preferiblemente, la célula expresa además CD112 y/o CD58. Preferiblemente, se detecta la presencia de CD13, HLA de clase I, CD54 y CD112.
Preferiblemente, la célula expresa además CD155.
La invención también proporciona el uso de un kit en el método definido anteriormente, en el que el kit comprende medios para detectar la presencia de una célula que expresa al menos CD13, HLA de clase I y CD54 en una muestra biológica.
En la presente invención, está contemplada cualquier célula CD4+ que produzca altos niveles de IL-10 (también denominada CD4IL-10). Preferiblemente, la célula produce constitutivamente altos niveles de IL-10. Tal célula puede obtenerse mediante cualquier modificación genética, fusión celular o cualquier otro medio conocido en la materia. Una célula T CD4+ que produce altos niveles de IL-10 puede generarse por cualquier medio conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, se puede obtener una población pura de células productoras de IL-10 mediante la selección de células T CD49b+LAG-3+ a partir de células T anergizadas con IL-10 específicas de aloAG inducidas (como se describe en el documento WO2013192215).
Dicha célula productora de IL-10 es una célula T CD4+ que produce, sobreexpresa o expresa de forma constitutiva altos niveles de IL-10 con respecto a una célula de referencia. En particular, la célula secreta al menos 1 ng/ml de IL-10 como se determina según métodos conocidos en la materia, tal como se describe en la sección de materiales y métodos.
En la presente invención, la célula CD4+ modificada genéticamente para producir IL-10 es una célula T CD4+ que produce, sobreexpresa o expresa de forma constitutiva altos niveles de IL-10 con respecto a una célula de referencia. En particular, la célula secreta al menos 1 ng/ml de IL-10 como se determina según métodos conocidos en la materia, tal como se describe en la sección de materiales y métodos.
La célula T CD4+ también puede producir o expresar altos niveles de IFN-y con respecto a una célula de referencia. En particular, la célula expresa al menos 1 ng/ml de IFNy como se determina según métodos conocidos en la materia, tal como se describe en la sección de materiales y métodos.
En la presente invención, una célula de referencia puede ser una célula CD4+ transducida con un lentivirus para la expresión de GFP (células CD4GFP), como se describe en el presente documento.
En la presente invención, el sujeto a tratar está afectado por un tumor y puede recibir células T CD4+ policlonales autólogas o heterólogas que producen un alto nivel de IL-10.
En la presente invención, una célula T CD4+ policlonal significa una célula T CD4+ aislada de sangre periférica o sangre del cordón. Dicha célula T CD4+ policlonal puede ser autóloga (cuando se ha obtenido del paciente a tratar) o heteróloga (cuando se ha obtenido de un sujeto que no es el paciente a tratar).
Una célula similar a Tr1 es una célula que condensa las características de una célula T r1: las células T r1 suprimen las respuestas de las células T principalmente a través de la secreción de IL-10 y TGF-p y por la destrucción específica de células presentadoras de antígeno mieloides mediante la liberación de granzima B (GzB) y perforina.
En la presente invención, las células T CD4+ modificadas genéticamente producen niveles constitutivamente altos de IL-10 y pueden usarse como terapia adyuvante en protocolos destinados a prevenir EICH mientras permiten mantener IcL después de alo-TCMH.
En la presente invención, el injerto contra leucemia (IcL) es un componente principal de los efectos beneficiosos generales del trasplante alogénico de médula ósea (TMO) en el tratamiento de la leucemia. El término injerto contra leucemia (IcL) se usa para describir la respuesta inmunomediada, que conserva un estado de remisión continua de una neoplasia maligna hematológica después de trasplantes alogénicos de células madre de médula ósea. El efecto de IcL después del trasplante alogénico de médula ósea (TMO) está bien aceptado. En las reacciones de IcL, la alorespuesta suprime la leucemia residual.
El efecto de injerto contra tumor (IcT) aparece después del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (TCMH). El injerto contiene linfocitos T del donante que son beneficiosos para el receptor. Las células T del donante eliminan las células T malignas residuales del hospedador (IcL) o eliminan diversos tipos de tumores. El IcT podría desarrollarse después de reconocer aloantígenos específicos del tumor o del receptor. Podría conducir a la remisión o al control inmunológico de las neoplasias malignas hematológicas. Este efecto se aplica en mieloma y leucemias linfoides, linfoma, mieloma múltiple y posiblemente cáncer de mama.
En la presente invención, inmunoterapia aloespecífica significa terapia celular con células T que han sido cebadas/estimuladas con células aisladas o generadas a partir de un donante alógeno. En el caso de alo-TCMH, significa células T del donante de TCMH que han sido cebadas/estimuladas con células aisladas del receptor (paciente) que será tratado con TCMH.
La célula T CD4+ modificada genéticamente para producir niveles constitutivamente altos de IL-10 de la presente invención puede usarse sola o en combinación con otra intervención terapéutica tal como radioterapia, quimioterapia, terapias inmunosupresoras e inmunomoduladoras.
La quimioterapia puede incluir abitrexato (inyección de metotrexato), Abraxane (inyección de paclitaxel), Adcetris (inyección de brentuximab vedotina), adriamicina (doxorrubicina), inyección de adrucilo (5-FU (fluorouracilo)), Afinitor (everolimús), Afinolimus Disperz (PEMETREXED), Alkeran Injection (inyección de melfalán), Alkeran Tablets (melfalán), Aredia (pamidronato), Arimidex (anastrozol), Aromasin (exemestano), Arranon (nelarabina), Arzerra (inyección de ofatumumab), Avastin (bevacizumab), Bexxar (tositumomab), BiCNU (carmustina), Blenoxane (bleomicina), Bosulif (bosutinib), Busulfex Injection (inyección de busulfano), Campath (alemtuzumab), Camptosar (irinotecán), Caprelsa (vandetanib), Casodex (bicalutamida), CeeNU (lomustina), CeeNU Dose Pack (lomustina), Cerubidine (daunorrubicina), Clolar (inyección de clofarabina), Cometriq (cabozantinib), Cosmegen (dactinomicina), CytosarU (citarabina), Cytoxan (citoxano), Cytoxan Injection (inyección de ciclofosfamida), Dacogen (decitabina), DaunoXome (inyección de complejo lipídico de daunorrubicina), Decadron (dexametasona), DepoCyt (inyección de complejo lipídico de citarabina), Dexamethasone Intensol (dexametasona), Dexpak Taperpak (dexametasona), Docefrez (docetaxel), Doxil (inyección de complejo lipídico de doxorrubicina), Droxia (hidroxiurea), DTIC (decarbazina), Eligard (leuprolida), Ellence (Ellence (epirrubicina)), Eloxatin (Eloxatin (oxaliplatino)), Elspar (asparaginasa), Emcyt (estramustina), Erbitux (cetuximab), Erivedge (Vismodegib), Erwinaze (asparaginasa de Erwinia chrysanthemi), Ethyol (amifostina), Etopophos (inyección de etopósido), Eulexin (flutamida), Fareston (toremifeno), Faslodex (fulvestrant), Femara (letrozol), Firmagon (inyección de degarelix), Fludara (fludarabina), Folex (inyección de metotrexato), Folotyn (inyección de pralatrexato), FUDr (FUDR (floxuridina)), Gemzar (gemcitabina), Gilotrif (afatinib), Gleevec (mesilato de imatinib), Gliadel wafer (oblea de carmustina), Halaven (inyección de eribulina), Herceptin (Trastuzumab), Hexalen (altretamina), Hycamtin (topotecán), Hycamtin (topotecán), Hydrea (hidroxiurea), Iclusig (ponatinib), Idamycin PFS (idarrubicina), Ifex (ifosfamida), Inlyta (axitinib), Intron A alfab (interferon alfa-2a), Iressa (gefitinib), Istodax (inyección de romidepsina), Ixempra (inyección de ixabepilona), Jakafi (ruxolitinib), Jevtana (inyección de cabazitaxel), Kadcyla (Ado-trastuzumab emtansina), Kyprolis (carfilzomib), Leukeran (clorambucilo), Leukine (sargramostim), Leustatin (cladribina), Lupron (leuprolida), Lupron Depot (leuprolida), Lupron DepotPED (leuprolida), Lysodren (mitotano), Marqibo Kit (inyección de complejo lipídico de vincristina), Matulane (procarbazina), Megace (megestrol), Mekinist (trametinib), Mesnex (mesna), Mesnex (inyección de mesna), Metastron (cloruro de estroncio-89), Mexate (inyección de metotrexato), Mustargen (mecloretamina), Mutamycin (mitomicina), Myleran (busulfano), Mylotarg (gemtuzumab ozogamicina), Navelbine (vinorelbina), Neosar Injection (inyección de ciclofosfamida), Neulasta (filgrastim), Neulasta (pegfilgrastim), Neupogen (filgrastim), Nexavar (sorafenib), Nilandron (Nilandron (nilutamida)), Nipent (pentostatina), Nolvadex (tamoxifeno), Novantrone (mitoxantrona), Oncaspar (pegaspargasa), Oncovin (vincristina), Ontak (denileucina diftitox), Onxol (inyección de paclitaxel), Panretin (alitretinoína), Paraplatin (carboplatino), Perjeta (inyección de pertuzumab), Platinol (cisplatino), Platinol (inyección de cisplatino), PlatinolAQ (cisplatino), PlatinolAQ (inyección de cisplatino), Pomalyst (pomalidomida), Prednisone Intensol (prednisona), Proleukin (aldesleucina), Purinethol (mercaptopurina), Reclast (ácido zoledrónico), Revlimid (lenalidomid), Rheumatrex (metotrexato), Rituxan (rituximab), RoferonA alfaa (interferón alfa-2a), Rubex (doxorrubicina), Sandostatin (octreotida), Sandostatin LAR Depot (octreotida), Soltamox (tamoxifeno), Sprycel (dasatinib), Sterapred (prednisona), Sterapred DS (prednisona), Stivarga (regorafenib), Supprelin LA (implante de histrelina), Sutent (sunitinib), Sylatron (inyección de Peginterferón Alfa-2b (Sylatron)), Synribo (inyección de omacetaxina), Tabloid (tioguanina), Taflinar (dabrafenib), Tarceva (erlotinib), Targretin Capsules (bexaroteno), Tasigna (decarbazina), Taxol (inyección de paclitaxel), Taxotere (docetaxel), Temodar (inyección de temozolomida), Tepadina (tiotepa), Thalomid (talidomida), TheraCys BCG (BCG), Thioplex (tiotepa), TICE BCG (BCG), Toposar (inyección de etopósido), Torisel (temsirolimús), Treanda (hidrocloruro de bendamustina), Trelstar (inyección de triptorelina), Trexall (metotrexato), Trisenox (trióxido de arsénico), Tykerb (Iapatinib), Valstar (valrubicina intravesical), Vantas (implante de histrelina), Vectibix (panitumumab), Velban (vinblastina), Velcade (bortezomib),Vepesid (etopósido), Vepesid (inyección de etopósido), Vesanoid (tretinoína), Vidaza (azacitidina), Vincasar PFS (vincristina), Vincrex (vincristina), Votrient (pazopanib), Vumon (tenipósido), Wellcovorin IV (inyección de leucovorina), Xalcori (crizotinib), Xeloda (capecitabina), Xtandi (enzalutamida), Yervoy (inyección de ipilimumab), Zaltrap (inyección de Ziv-aflibercept), Zanosar (estreptozocina), Zelboraf (vemurafenib), Zevalin (ibritumomab tiuxetano), Zoladex (goserelina), Zolinza (vorinostat), Zometa (ácido zoledrónico), Zortress (everolimús), Zytiga (abiraterona), nimotuzumab e inhibidores de puntos de control inmunitarios tales como nivolumab, pembrolizumab/MK-3475, pidilizumab y AMP-224 orientados a PD-1; y BMS-935559, MEDI4736, MPDL3280A y MSB0010718C orientados a PD-L1 y aquellos orientados a CTLA-4 tales como ipilimumab.
Radioterapia significa el uso de radiación, habitualmente rayos X, para tratar una dolencia. Los rayos X se descubrieron en 1895 y desde entonces la radiación se ha usado en medicina para el diagnóstico y la investigación (rayos X) y el tratamiento (radioterapia). La radioterapia puede ser desde fuera del cuerpo como radioterapia externa, usando rayos X, irradiación de cobalto, electrones y, más raramente, otras partículas tales como protones. También puede ser desde el interior del cuerpo como radioterapia interna, que usa metales o líquidos radiactivos (isótopos) para tratar el cáncer.
La célula T CD4+ de la presente invención puede usarse en una cantidad que el experto en la materia puede determinar fácilmente según el peso corporal y otros factores conocidos. En particular, se pueden administrar de 104 a 108 células/kg. Preferiblemente se usan 106 células/kg.
La célula T CD4+ modificada genéticamente para producir niveles constitutivamente altos de IL-10 de la presente invención puede usarse con una única o múltiples administraciones. Por ejemplo, las células T CD4+ que producen altos niveles de IL-10 de la invención, en particular genéticamente modificadas, pueden administrarse según diferentes calendarios que comprenden: todos los días, cada 7 días o cada 14 o 21 días, cada mes.
La célula T CD4+ de la presente invención puede administrarse según diferentes vías de administración que comprenden sistémica, subcutánea e intraperitoneal. Típicamente, la célula se administra tal cual, dentro de una solución salina o fisiológica que puede contener 2-20 %, preferiblemente 7 % de albúmina de suero humano.
En el caso de un tumor sólido, la célula T CD4+ de la presente invención puede actuar sobre las células que rodean al tumor, tales como monocitos/macrófagos, células de Kupffer, microglía.
En el caso de un tumor hematológico, la célula T CD4+ de la presente invención actúa sobre la propia célula tumoral, por ejemplo, sobre blastos de leucemia que expresan CD13, CD54, HLA de clase I y opcionalmente CD112.
En la presente invención, una célula diana es una célula que expresa el marcador de superficie celular CD13, CD54 y HLA de clase I. Una célula diana comprende una célula mieloide.
En la presente invención, un tumor sólido es una neoplasia (nuevo crecimiento de células) o lesión (daño de estructuras anatómicas o alteración de funciones fisiológicas) formada por un crecimiento anormal de células de tejido corporal distintas de la sangre, médula ósea o células linfáticas. Un tumor sólido consiste en una masa anormal de células que pueden provenir de diferentes tipos de tejidos, tales como el hígado, el colon, la mama o el pulmón, y que inicialmente crece en el órgano de su origen celular. Sin embargo, tales cánceres pueden diseminarse a otros órganos a través del crecimiento de tumores metastásicos en etapas avanzadas de la enfermedad.
En la presente invención, un tumor hematológico es un tipo de cáncer que afecta a la sangre, la médula ósea y los ganglios linfáticos. Los tumores hematológicos pueden derivar de cualquiera de los dos principales linajes de células sanguíneas: estirpes celulares mieloides y linfoides. La estirpe celular mieloide normalmente produce granulocitos, eritrocitos, trombocitos, macrófagos y mastocitos, mientras que la estirpe celular linfoide produce células B, T, NK y plasmáticas. Los linfomas (p. ej., linfoma de Hodgkin), las leucemias linfocíticas y el mieloma derivan de la línea linfoide, mientras que la leucemia mielógena aguda y crónica (LMA, LMC), los síndromes mielodisplásicos y las enfermedades mieloproliferativas son de origen mieloide. Como la sangre, la médula ósea y los ganglios linfáticos están íntimamente conectados a través del sistema inmunológico, una enfermedad que afecte a un sistema hematológico puede afectar también a los otros dos.
En la presente invención, el tumor a tratar puede ser refractario o resistente a una intervención terapéutica. La tendencia de las células malignas a adquirir mutaciones que les permitan resistir los efectos de los fármacos antineoplásicos es un factor importante que limita la eficacia de la quimioterapia. Los tumores que son mezclas heterogéneas de células quimiosensibles y quimiorresistentes puede parecer inicialmente que responden al tratamiento, pero luego recaen cuando las células quimiosensibles se eliminan y las células resistentes a los fármacos se vuelven predominantes.
El mecanismo más común para esto es la sobreexpresión de proteínas especializadas incrustadas en la membrana plasmática llamadas glicoproteínas que "bombean" activamente los fármacos fuera de la célula antes de que puedan ejercer su efecto farmacológico. Dado que este mecanismo no es específico de un fármaco (es decir, funciona con cualquier molécula potencialmente tóxica), puede hacer que un tumor sea resistente a muchos fármacos, incluso fármacos a los que no ha estado expuesto previamente. Este importante fenómeno se denomina "farmacorresistencia múltiple".
La presente invención se ilustrará mediante ejemplos no limitativos con referencia a las siguientes figuras.
Figura 1. Las células CD4IL-10 son fenotípica y funcionalmente superponibles a las células Tr1. A. Esquema de los vectores LV-IL-10/ANGFR y LV-GFP/An GFR. La presencia del promotor bidireccional (mCMV/PGK) permite la expresión corregulada de genes de ANGFR e IL-10 o GFP humanos. ^ , señal de encapsidación que incluye la porción 5' del gen GAG (GA); RRE, elemento de respuesta a rev; cPPT, tramo central de polipurina; poliA, sitio de poliadenilación del virus de simio 40; CTE, elemento de transporte constitutivo; WPRE, elemento regulador postranscripción del virus de la hepatitis de la marmota. B. Las células CD4IL-10 y CD4GFP se estimularon con AcM anti-CD3 y anti-CD28 solubles inmovilizados durante 48 horas y se midieron los niveles de IL-10, IL-4, IFN-y e IL-17 mediante ELISA en sobrenadantes de cultivo. Todas las muestras se probaron por duplicado-triplicado. Se presentan la media ± EEM de n = 35 para IL-10 e IL-4, n = 29 para IFN-y y n = 7 para IL-17 de células CD4IL-10 y de n = 19 para IL-10 e IL-4, n = 16 para IFN-y y n = 12 para IL-17 de células CD4GFP. **P<0,01; ****P<0,0001, prueba t de Mann Whitney. C. Las células CD4IL-10 suprimen la proliferación de células T in vitro. Las células PBMC alogénicas se marcaron con CSFE y se estimularon con AcM anti-CD3 y anti-CD28 inmovilizados solos (histograma gris claro relleno) o en presencia de células CD4IL-10 (línea continua roja) o células CD4GFP (línea continua negra) a una relación de 1:1. Después de 4 días de cultivo, se determinó el porcentaje de PBMC en proliferación mediante dilución de CSFE. Se muestra un donante representativo de los seis probados. La supresión mediada por células CD4IL-10 o células CD4GFP se calculó de la siguiente manera: ([respondedor de la proliferación-transductor de la proliferación)/respondedor de la proliferación] x 100). D. La expresión de CD18, CD2 y CD226 en células T CD4+, CD4IL-10 y CD4GFP recién aisladas se evaluó por FACS. Células CD4IL-10 sin teñir (histograma gris claro relleno, control de isotipo), células T CD4+ recién aisladas (histograma de línea negra discontinua), células CD4GFP (histograma de línea negra), células CD4IL-10 (histograma de línea continua roja). Los números indican la IMF en células CD4+ seleccionadas. Se muestra un donante representativo de los 5 probados.
Figura 2. Las células CD4IL'10 lisan específicamente las estirpes celulares mieloides de una manera dependiente de GzB y de HLA de clase I. A. Las células CD4IL-10 y CD4GFP se cocultivaron con estirpes celulares diana CD3, CD14, U937, BV-173, Daudi, K562 y ALL-CM a una relación de 5:1 (E:T). Después de 6 horas, se midió la desgranulación de las células CD4IL-10 y c D4gfp mediante la coexpresión de CD107a y granzima (GzB). Los números en cuadrantes indican el porcentaje de células positivas, se representa un donante representativo. B. La citotoxicidad de células CD4IL-10 y c D4gfp contra células u 937, BV-173, Daudi, K562 y ALL-CM se determinó mediante ensayo de liberación de 51Cr. Se informa de la media ± EEM de la citotoxicidad realizada por duplicado; media ± EEM de n = 6 y de n = 4 donantes independientes para células CD4IL-10 y CD4GFP contra células ALL-CM y U937, y de n = 4 y de n = 2 para células CD4IL-10 y CD4GFP contra células BV-173, Daudi y K562. *P<0,05, prueba t de Mann Whitney.
C. Las células CD4IL-10 y CD4GFP se cocultivaron con células c D14, U937, BV-173, K562, THP-1 y ALL-CM a una relación de 1:1. Después de 3 días, las estirpes celulares leucémicas residuales (CD45bajoCD3-) fueron analizadas y contadas por FACS. La citólisis mediada por células CD4IL-10 se midió como índice de eliminación (véanse Materiales y Métodos) para cada célula diana. El análisis se realizó al menos en tres experimentos independientes. Los puntos representan el índice de eliminación de células CD4IL-10 generadas a partir de diferentes donantes sanos. Las líneas representan valores medios del índice de eliminación. El recuadro rectangular indica el umbral de citotoxicidad. D. Las células CD4IL-10 y CD4GFP se cocultivaron con la estirpe celular diana ALL-CM o U937 a una relación de 1:1 (E:T) en presencia de 10 pg/ml de AcM anti-HLA de clase I o de control de isotipo. Después de 3 días, las estirpes celulares leucémicas residuales (CD45bajoCD3-) fueron analizadas y contadas por FACS. Se midió el efecto citolítico por células CD4IL-10 como índice de eliminación para cada célula diana. Los puntos representan células CD4IL-10 generadas a partir de diferentes donantes sanos. Las líneas representan valores medios del índice de eliminación. *P<0,05, prueba t de Mann Whitney. E. Las células CD4IL-10 se preincubaron con Z-AAD-CMK a las concentraciones indicadas y se cocultivaron con células diana ALL-CM y U937 a una relación de 50:1 (E:T), y la citotoxicidad se determinó mediante la liberación de 51Cr. Se informa de la media ± EEM de n = 3 donantes independientes realizados por triplicado.
Figura 3. Las células CD4IL-10 las células se desgranulan específicamente cuando se cocultivan con células mieloides. Se cocultivaron células CD4IL-10 y CD4GFP con las estirpes celulares diana CD3, CD14, U937, BV-173, Daudi, K562 y ALL-CM a una relación de 5:1 (E:T). Después de 6 horas, se midió la desgranulación de las células CD4IL-10 y CD4GFP mediante la coexpresión de CD107a y granzima (GzB). Se informa de la media ± EEM de n = 15 para células CD4il-10, y n = 12 para células CD4GFP cultivadas solas o con células ALL-CM o U937, n = 5 para células CD4IL-10 y n = 2 para células CD4GFP cocultivadas con células CD3, n = 10 para células CD4IL-10 y n = 8 para células CD4GFP cocultivadas con células CD14, n = 5 para células CD4IL-10 y n = 6 para células CD4GFP cocultivadas con células BV-173, n = 4 para células CD4IL-10 y n = 6 para células CD4GFP cocultivadas con células Daudi, y n = 11 para células CD4IL-10 y n = 9 para células CD4GFP cocultivadas con células K562. *** P<0,001; ****P<0,0001, prueba t de Mann Whitney.
Figura 4. Las células CD4IL-10 destruyen específicamente in vitro blastos primarios que expresan CD13, CD54 y CD112. A. La expresión de CD13, CD54, HLA de clase I, CD58, CD155 y CD112 en células CD14, U937, BV-173, K562, Daudi, THP-1 y ALL-CM recién aisladas se analizó mediante FACS. Los números indican los porcentajes de células positivas (línea continua negra) según el control de isotipo (histograma gris claro relleno). B. Las células CD4IL-10 y CD4GFP se cocultivaron con blasto primario a una relación de 1:1 (E:T). Después de 3 días, los blastos leucémicos residuales (CD45bajoCD3-) fueron analizados y contados mediante FACS. Se midió el efecto citolítico de las células CD4IL-10 como índice de eliminación (véase Materiales y Métodos) para cada célula diana. Los puntos representan cada blasto primario cocultivado con células CD4IL-10. El recuadro rectangular indica el umbral de citotoxicidad. C.
Correlación entre citotoxicidad y expresión de marcadores específicos en blastos primarios. Los gráficos representan porcentajes de blastos primarios positivos para CD13, CD54, HLA de clase I, CD58, CD155 y CD112 frente al índice de eliminación de células CD4IL-10 para cada blasto primario analizado en un ensayo de cocultivo (media ± EEM). La línea representa la regresión lineal. Se informa del valor P de la correlación y del coeficiente de determinación (R2) (prueba de dos colas).
Figura 5. La expresión de CD13 define la especificidad destructora de células CD4IL-10. A. La expresión de CD13, CD54, HLA de clase I, CD58, CD155 y CD112 en las estirpes celulares U266 y MM1S se analizó mediante FACS. Los números indican los porcentajes de células positivas (línea continua negra) según el control de isotipo (histograma gris claro relleno). B. Las células CD4IL-10 y CD4GFP se cocultivaron con células ALL-CM, K562, MM1S y U266 a una relación de 1:1. Después de 3 días, las estirpes celulares leucémicas residuales (CD45bajoCD3-) fueron analizadas y contadas mediante FACS. Se midió la citólisis mediada por células CD4IL-10 como índice de eliminación (véase Materiales y Métodos) para cada célula diana. El análisis se realizó al menos en tres experimentos independientes. Los puntos representan el índice de eliminación de células CD4IL-10 generadas a partir de diferentes donantes sanos. Las líneas representan valores medios del índice de eliminación. El recuadro rectangular indica el umbral de citotoxicidad.
Figura 6. El mecanismo molecular subyacente a la actividad lítica de las células CD4IL-10 es comparable al de células Tr1 auténticas. Este mecanismo requiere una adhesión estable entre células CD4IL-10 y blastos CD13+ mediada por la interacción LFA-1/CD54, la activación de células CD4IL-10 a través de HLA de clase I (señal 1), a través de CD2 (señal 2) y a través de CD226 (señal 3), que conduce a la liberación de GzB y la destrucción de blastos leucémicos.
Figura 7. La localización in vivo de las células CD4IL-10 influye en su actividad antileucémica. A. Las células CD4il'10 retrasaban el crecimiento tumoral subcutáneo de ALL-CM. A los ratones NSG se les inyectó por vía subcutánea ALL-CM (2x106 células/ratón). Tres días después, los ratones recibieron PBMC alogénicas (2x106 células/ratón) o células CD4il-10, o células CD4gfp (1x106 células/ratón). Se midió el crecimiento del tumor en los puntos temporales indicados después de la inyección de ALL-CM. Los análisis estadísticos se realizaron comparando ratones tratados con células CD4il-10 (ALL-CM CD4il-10) frente a ratones de control no tratados (ALL-CM): *P<0,05, **P<0,01; ***P<0,001; ANOVA bidireccional más posprueba de Bonferroni. B. Las células CD4il-10 no median el efecto de IcL en el modelo de terapia con células T de leucemia de ALL-CM. A los ratones NSG se les inyectó por vía intravenosa ALL-CM (5x106 células/ratón) solas o, en el día tres, con PBMC alogénicas (5x106 células/ratón), células CD4il-10, o células CD4gfp (2,5x106 células/ratón). Se siguió la supervivencia libre de leucemia (presencia de más del 50 % de blasto humano hCD45+hCD3- circulante en sangre periférica) a lo largo del tiempo después de la inyección de células. Se presentan los datos obtenidos de cuatro experimentos independientes. C. Localización in vivo de células CD4il-10. A los ratones NSG se les inyectó por vía intravenosa ALL-CM (5x106 células/ratón) solas o, en el día tres, con PBMC alogénicas (5x106 células/ratón), células CD4il-10, o células CD4gfp (2,5x106 células/ratón). El día 7 y 14, los porcentajes de células T humanas (hCD45+hCD3+) en sangre periférica, médula ósea, bazo, pulmón e hígado fueron evaluados mediante FACS. Media ± DE de n = 6 ratones para ALL-CM PBMC y para ALL-Cm células CD4gfp, y n = 7 ratones para ALL-CM células CD4il-10 en la sangre periférica el día 7, y media ± DE de n = 3 ratones para a LL-CM PBMC y ALL-CM células CD4gfp, y n = 4 ratones para ALL-CM células CD4il-10, el día 7 en otros órganos (panel superior). Media ± DE de n = 3 ratones por grupo el día 14 (panel inferior). D. Las células CD4il-10 median el efecto antileucémico en un modelo de tumores extramedulares. Se inyectaron por vía intravenosa a ratones NSG células de leucemia THP-1 (2x106 células/ratón). Tres días después, los ratones recibieron PBMC alogénicas (2x106 células/ratón), o catorce días después a los ratones se les inyectó células CD4il-10, o células CD4gfp (1x106 células/ratón). El crecimiento tumoral se analizó midiendo los pesos de hígados infiltrados con THP-1. Se presentan la media ± EEM de n = 6 ratones para THP-1, n = 5 ratones para THP-1 PBMC, n = 4 ratones para THP-1 células CD4il-10, y n = 2 ratones para THp-1 células CD4gfp.
Figura 8. Las células CD4IL-10 no expresan CXCR4. Se analizó en células CD4il-10, ALL-CM y PBMC la expresión de CXCR4 y de CD62L mediante FACS. Los números indican el porcentaje de células positivas (línea continua negra) según el control de isotipo (histograma gris claro relleno). Se muestra un representante de cada tres probados.
Figura 9. La transferencia adoptiva de células CD4IL-10 previene la EICH al tiempo que evita el injerto contra la leucemia de las células T alogénicas. A. Localización in vivo de células CD4il-10 en ratones acondicionados. Los ratones NSG fueron irradiados de forma subletal e inyectados por vía intravenosa con ALL-CM (5x106 células/ratón). Tres días después, los ratones recibieron PBMC alogénicas (5x106 células/ratón) o células CD4il-10, o células CD4gfp (2,5x106 células/ratón). El día 7 y 14, los porcentajes de células T humanas (hCD45+hCD3+) y ALL-Cm (hCD45+hCD3-) en médula ósea y sangre periférica fueron evaluados mediante FACS. Media ± EEM de n = 9 ratones para ALL-CM PBMC y para a Ll -CM células CD4il-10, y n = 7 para ALL-CM células CD4gfp en el día 7 y n = 14 para ALL-CM PBMC, n = 11 para ALL-CM células c D4il-10, y n = 7 para ALL-CM células CD4gfp en el día 14 en el hueso. Media ± EEM de n = 17 ratones para ALL-CM PBMC y para ALL-CM células CD4il-10, y n = 10 para ALL-CM células CD4gfp en el día 7 y n = 16 para ALL-CM PBMC, n = 14 para ALL-CM células CD4il-10, y n = 8 para ALL-CM células CD4gfp en el día 14 en la sangre periférica. Los datos se obtuvieron de dos a cinco experimentos independientes. B. La transferencia adoptiva de células CD4il-10 previene la xeno-EICH al tiempo que evita el IcL mediado por PBMC alogénicas humanas. Los ratones NSG fueron irradiados de forma subletal e inyectados por vía intravenosa con ALL-CM (5x106 células/ratón). Tres días después, los ratones recibieron PBMC alogénicas (5x106 células/ratón) solas o en combinación con células CD4il-10 (2,5x106 células/ratón). Como control, los ratones fueron inyectados con células CD4il-10 o células CD4gfp (2,5x106 células/ratón) solas. Se siguió la supervivencia libre de leucemia (presencia de más del 50 % de blasto humano hCD45+hCD3- circulante en sangre periférica) y la supervivencia libre de xeno-EICH (presencia de más del 50 % de los linfocitos T humanos hCD45+hCD3+ circulantes en sangre periférica con una pérdida de peso superior al 20 %) a lo largo del tiempo después de la inyección de células. El análisis estadístico se realizó comparando ratones tratados con ratones de control no tratados (ALL-CM): *P<0,05, ****P<0,0001; ANOVA bidireccional más posprueba de Bonferroni.
Figura 10. Las células CD4IL-10 expresan TIGIT (inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM). En las células CD4gfp y CD4il-10 se analizó la expresión de TIGIT mediante FACS. Los números indican el porcentaje de células positivas (células CD4gfp, línea continua negra, células CD4il-10, línea continua roja) según el control de isotipo (histograma gris claro relleno). Se muestra un representante de cada tres probados.
Figura 11. Las células T CD4+ aloespecíficas enriquecidas se transducen eficazmente con LV-IL-10. A. Protocolo para generar y caracterizar células alo-CD4IL-10. Las células T CD4+ aloespecíficas enriquecidas se transdujeron con LV-IL-10 o LV-GFP durante una estimulación secundaria con las mismas alo-CDm usadas para cebar (véase también Materiales y Métodos). Las células T CD4+ humanas se estimularon con alo-CDm durante 14 días. Después del cultivo, las células T CD4+ se volvieron a estimular con alo-CDm 24 horas antes de la transducción con LV-IL-10 o LV-GFP a una MOI de 20. B. Análisis de las células transducidas analizadas mediante FACS el día 6 después de la transducción. Las frecuencias de las células ANGFR+ están indicadas. Se presentan los resultados colectivos de donantes individuales. Cada punto representa un solo donante probado, las líneas indican la media ± EEM del porcentaje de transducción.
Figura 12. La expresión de IL-10 reforzada en células T CD4+ aloespecíficas promueve su conversión en células similares a Tr1 con la capacidad de destruir células mieloides. A. Las respuestas proliferativas se evaluaron 3 o 5 días después del cultivo de células alo-CD4IL-10 y alo-CD4ñNGFR con CDm alogénicas (alo-CDm) o de terceros, respectivamente, mediante la incorporación de 3H-Thy durante 16 horas adicionales. Las barras representan el valor medio con EEM de n = 19 para la estimulación alogénica y n = 16 para la estimulación de terceros probada en más de 5 experimentos independientes. Todas las muestras se probaron por duplicado o triplicado, ***p<0,001, prueba de rango con signo de muestras pareadas de Wilcoxon. B. Se dejaron células alo-CD4IL-10 o alo-CD4ñNGFR inactivadas o estimuladas con las mismas alo-CDm usadas para cebar o una CDm de terceros (relación 10:1), y la producción de IL-10 se determinó mediante ELISA 48 horas después de la activación. Las barras representan el valor medio con EEM de n = 12-26 donantes probados en 5 experimentos independientes. Todas las muestras se probaron por duplicado-triplicado, ***p<0,001, ****p <0,0001 prueba de rango con signo de muestras pareadas de Wilcoxon. C. Se probó en células alo-CD4IL-10 o alo-CD4ñNGFR su capacidad para suprimir la proliferación de células T CD4+ autólogas cebadas con alo-CDm. Las células T CD4+ autólogas cebadas (respondedoras) se marcaron con tinte eFluor y se estimularon con alo-CDm (relación 10:1) solas o en presencia de células alo-CD4IL-10 o alo-CD4ñNGFR a una relación de 1:1. Después de 3 días de cultivo, se determinó la capacidad supresora analizando la dilución del tinte eFluor. En el panel izquierdo se muestra un donante representativo de cada cuatro probados. La supresión mediada por células alo-CD4IL-10 o células alo-CD4ñNGFR se calculó de la siguiente manera: ([respondedor de la proliferación - transductor de la proliferación)/respondedor de la proliferación x 100). En el panel derecho, los puntos representan la supresión de células alo-CD4IL-10 o células alo-CD4ñNGFR generadas a partir de diferentes donantes sanos. Las líneas representan el valor medio ± EEM del % de supresión. D. Se cocultivaron células CD4IL-10 y CD4ñNGFR con ALL-CM, U937, K562, CDm alo o CDm de terceros como células diana a una relación 1:1. Después de 3 días, las estirpes celulares leucémicas residuales (CD45bajoCD3-) fueron analizadas y contadas mediante FACS. Se midió la citólisis mediada por células CD4IL-10 como índice de eliminación (véanse Materiales y Métodos) para cada célula diana. El análisis se realizó en dos experimentos independientes. Los puntos representan el índice de eliminación de células CD4IL-10 generadas a partir de diferentes donantes sanos cocultivadas con n = 5 células ALL-CM, n = 6 células U937, n = 6 células K562, n = 4 CDm alo y n = 4 CDm de terceros. Las líneas representan valores medios del índice de eliminación. El recuadro rectangular indica el umbral de citotoxicidad.
Figura 13. La expresión de HLA I de clase I se anula por la alteración del gen de la microglobulina p2. Se analizó la expresión de CD54, HLA de clase I, CD58, CD155 y CD112 en estirpes celulares p2m-/- ALL-CM y p2m-/- U937 mediante FACS. Los números indican los porcentajes de células positivas (línea continua negra) según el control de isotipo (histograma gris claro relleno). Se muestran datos representativos de al menos tres experimentos independientes.
Figura 14. La destrucción mediada por CD4IL-10 de estirpes celulares mieloides es dependiente de HLA de clase I. A. Se cocultivaron células CD4IL-10 y CD4ñNGFR con las estirpes celulares diana ALL-Cm , p2m-/- ALL-CM, U937 o p2m-/- U937 a una relación 1:1 (E:T). Después de 3 días, las estirpes celulares leucémicas residuales (CD45bajoCD3-) fueron analizadas y contadas mediante FACS. Se midió el efecto citolítico por células CD4IL-10 como índice de eliminación para cada célula diana. Los puntos representan CD4IL-10 generada a partir de n = 8 donantes sanos diferentes cocultivados con ALL-CM y p2m-/- ALL-CM, n = 5 donantes sanos diferentes cocultivados con U937 y p2m-/- U937 probados en dos experimentos independientes. *P <0,05, **P<0,001 prueba de rango con signo de muestras pareadas de Wilcoxon bilateral. B. Las células CD4IL-10 y CD4ñNGFR se cocultivaron con la estirpe celular diana ALL-CM o U937 a una relación 5:1 (E:T) en presencia de 10 pg/ml de AcM anti-HLA de clase I o de control de isotipo. Después de 6 horas, se midió la desgranulación de las células CD4IL-10 y CD4ñNGFR mediante la coexpresión de CD107a y granzima (GzB). Se informa de una media ± EEM de células GzB+CD107a+ CD4IL-10, generadas a partir de ocho donantes sanos diferentes probados en dos experimentos independientes. * P <0,05, prueba de rango con signo de muestras pareadas de Wilcoxon bilateral.
Figura 15. La destrucción de estirpes celulares mieloides mediada por células CD4IL-10 es independiente de TCR. Se cocultivaron células CD4IL-10 y CD4ñNGFR con la estirpe celular diana ALL-CM o U937 a una relación 5:1 (E:T) en presencia de 10 pg/ml de AcM anti-HLA de clase II o de control de isotipo. Después de 6 horas, se midió la desgranulación de células CD4IL-10 y CD4ñNGFR mediante la coexpresión de CD107a y granzima (GzB). Se informa de una media ± EEM de células GzB+CD107a+ CD4IL-10, generadas a partir de cuatro donantes sanos diferentes probados en dos experimentos independientes.
Descripción detallada de la invención
Materiales y métodos
Construcción de plásmido. La secuencia codificante de IL-10 humana se escindió de pH15C (ATCC n.° 68192). El fragmento de 549 pb resultante se clonó en el sitio de clonación múltiple de pBluKSM (Invitrogen) para obtener pBluKSM-hIL-10. Se obtuvo un fragmento de 555 pb por escisión de hIL-10 de pBluKSM-hIL-10 y ligación a 1074.1071.hPGK.GFP.WPRE.mhCMV.dNGFR.SV40PA (llamado aquí LV-ANGFR), para obtener LV-IL-10/ANGFR. La presencia del promotor bidireccional (promotor PGK humano más elemento central mínimo del promotor CMV en dirección opuesta) permite la coexpresión de los dos transgenes. La secuencia de LV-IL-10/ANGFR se verificó mediante pirosecuenciación (Primm).
Producción y titulación de vectores. Los LV de tercera generación pseudotipados con VSV-G se produjeron por cotransfección transitoria de Ca3CÜ4 de cuatro plásmidos en células 293T y se concentraron por ultracentrifugación como se describe19 con una pequeña modificación: se añadió butirato de sodio 1 pM a los cultivos para la recogida del vector. El título se estimó en células 293T mediante dilución limitante, y las partículas de vector se midieron mediante captura inmune del antígeno p24 de VIH-1 Gag (NEN Life Science Products; Waltham, MA). La infectividad del vector se calculó como la relación entre título y partícula. Para los vectores concentrados, los títulos variaban de 5x108 hasta 6x109 unidades transductoras/ml y la infectividad de 5x104 a 105 unidades transductoras/ng de p24.
Pacientes y donantes. Todos los protocolos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional y las muestras se recogieron bajo consentimiento informado por escrito según la Declaración de Helsinki. Las características de los pacientes se enumeran en la Tabla 1.
Tabla 1. Características de los pacientes
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1Subtipos de LMA y LLA según la clasificación Franco-americana-británica (FAB).
2Categorías de LMA y LLA según la clasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS).
N.A. no aplicable; Flt3 ITD, duplicación de tándem interno de Flt3; NPM1, nucleofosmina; BM, médula ósea; PB, sangre periférica
Se prepararon células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación sobre gradientes de Ficoll-Hypaque. Las células T CD4+ se purificaron mediante selección negativa con el kit de aislamiento de células T CD4 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) con una pureza resultante de > 95 %. Las células T CD14+ y CD3+ se purificaron mediante selección positiva con microperlas CD14+ y CD3+ (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) con una pureza resultante de > 95 %. Las estirpes celulares U937 (estirpe celular monocítica), K562 (estirpe celular eritroleucémica), BV-173 (una leucemia linfoblástica pre-B20, Daudi (estirpe celular linfoblástica B), THP1 (leucemia mielomonocítica) se obtuvieron de la ATCC. La estirpe celular ALL-CM derivada de un paciente con LMC que padece una crisis blástica linfoide con cromosoma Filadelfia positivo se describe en Bondanza y col.41. Para generar estirpes celulares ALL-CM y U937 deficientes en p2m, las células se nucleofectaron mediante el sistema Nucleofector Amaxa 4D con unidad X (LONZA group ltd, CH) usando el programa EP100. Brevemente, 3x105 células se resuspendieron en una solución que contenía 20 pl de solución SF (LONZA) y 3 pl de plásmido Cas9 premezclado (500 ng) y el plásmido específico de guía B2M n.° 18 CRISPR (Ga Gt AGc GCg AGCa Ca GCTA (SEQ ID N.° 1) cortado en el exón 1 de B2M, 250 ng). Después de la nucleofección, las células se expandieron en cultivo. En todas las estirpes celulares se probó de forma rutinaria la contaminación por micoplasmas.
Transducción de células T CD4+ humanas. Las células T CD4+ purificadas se activaron durante 48 horas con anticuerpo monoclonal anti-CD3 soluble (AcM, 30 ng/ml, OKT3, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania), AcM anti-CD28 (1 pg/ml, BD, Biosciences) y rhlL-2 (50 U/ml, Chiron, Italia) y se transdujeron con LV-GFP/ANGFR (c D4gfp), LV-IL-10/ANGFR (CD4IL-10) con MOI de 20 como se describió anteriormente18. Las células T CD4+ANGFR+ transducidas se purificaron 14 días después de la transducción mediante clasificación por FACS o usando microperlas CD271+ (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) y se expandieron en medio X-VIVO 15 suplementado con suero humano al 5 % (BioWhittaker-Lonza, Washington, DC), 100 U/ml de penicilina-estreptomicina (BioWhittaker) y 50 U/ml de rhIL-2. Las células CD4GFP y CD4IL'10 se estimularon cada dos semanas en presencia de una mezcla de alimentación alogénica que contenía 106 PBMC (irradiadas a 6.000 rad) por ml, 105 células JY (una estirpe celular linfoblastoide transformada con virus de Epstein-Barr que expresa altos niveles de antígeno leucocitario humano y moléculas coestimuladoras, irradiadas a 10.000 rad) por ml, y AcM anti-CD3 soluble (1 pg/ml). Los cultivos se mantuvieron en 50-100 U/ml de rhlL-2 (PROLEu K iN, Novartis, Italia). Todos los análisis fenotípicos FACS, experimentos in vitro e in vivo, se realizaron en células desde al menos 12 días después de la adición de la alimentación, en estado de reposo.
Para generar células transducidas específicas de aloantígeno, se estimularon células T CD4+ sin tratamiento previo (106/pocillo) con células dendríticas maduras alogénicas (CDm) (105/pocillo) en un volumen final de 1 ml en placas de 24 pocillos. En los días 7 y 10, la mitad del medio se reemplazó por medio fresco suplementado con 25 U/ml de rhIL-2, y el día 14, las células se recogieron, lavaron y transdujeron con LV-GFP/ANGf R (CD4ñNGFR) o LV-IL-10/ANGFR (CD4IL-10) con MOI de 20 después de 24 horas de estimulación secundaria con la misma alo-CDm usada para el cebado. Las células T CD4+ANGFR+ transducidas se purificaron y expandieron como antes.
Determinación de citocinas. Para medir la producción de citocinas, se estimularon células CD4GFP y CD4IL-10 con AcM anti-CD3 inmovilizados (10 pg/ml) y anti-CD28 solubles (1 pg/ml) en un volumen final de 200 pl de medio (placas de fondo redondo de 96 pocillos, 2x105/pocillo). Los sobrenadantes del cultivo se recolectaron después de 48 horas de cultivo y los niveles de IL-4, IL-10, IFN-y e IL-17 se determinaron mediante ELISA según las instrucciones del fabricante (BD Biosciences).
Ensayos de supresión. Para probar la capacidad supresora de las células CD4GFP y CD4IL-10, se marcaron PBMC alogénicas con CFSE (Molecular Probes) o eFluor670 (Invitrogen) antes de la estimulación con AcM anti-CD3 inmovilizados (10 pg/ml) y anti-CD28 solubles (1 pg/ml). Se añadieron células supresoras a una relación de 1:1. Después de 4-6 días de cultivo, se determinó la proliferación de células respondedoras marcadas con CFSE/eFluor670 mediante citometría de flujo.
Ensayos de citotoxicidad. La desgranulación de células T se evaluó en un ensayo de citometría de flujo de CD107a, según el protocolo descrito en 6. En algunos experimentos se añadieron AcM anti-HLA de clase I (clon W6/32, Biolegend, EE.UU.) y control de isotipo (IgG2a, k, BD Pharmigen, EE.UU.) a las concentraciones indicadas. La actividad citotóxica de las células CD4GFP y CD4IL-10 se analizó en un ensayo de liberación de 51Cr estándar como se describe en detalle en otra parte. Brevemente, se incubaron 103 células ALL-CM, BV-173, Daudi, U937 o K562 diana marcadas con 51Cr (NEN Dupont, Milán, Italia) durante 4 horas con células CD4GFP y CD4IL-10 células a diversas relaciones de células efectoras-diana, sembradas en placas por duplicado. Posteriormente, se retiró el sobrenadante y se contó en un contador y. El porcentaje de lisis específica se calculó según la fórmula: 100x (liberación experimental -liberación espontánea de 51Cr)/(liberación máxima - liberación espontánea). En algunos experimentos se añadió Z-AAD-CMK (Sigma, CA, EE. UU.) a las concentraciones indicadas. Como alternativa, la citotoxicidad de las células CD4GFP y CD4IL-10 se analizó en experimentos de cocultivo. Brevemente, las células diana y efectoras (células CD4GFP y CD4IL-10) se sembraron en placas a una relación 1:1 durante 3 días. Al final del cocultivo, las células se recolectaron y las células supervivientes se contaron y analizaron mediante FACS. El índice de eliminación (IE) se calculó como 1-(número de dianas que permanecieron en el cocultivo con CD4IL-10/número de dianas que permanecieron en el cocultivo con CD4GFP). En algunos experimentos se añadieron AcM anti-HLA de clase I (clon W6/32, Biolegend, EE.UU.) y control de isotipo (IgG2a, k, BD Pharmigen, EE.UU.) a las concentraciones indicadas.
Análisis de citometría de flujo. Para la detección de antígenos de superficie celular se tiñeron células CD4IL-10 y CD4GFP con AcM anti-CD4 (BD Pharmingen, EE. UU.), anti-CD226 (Biolegend, EE. UU.), anti-CD2, anti-CD18, anti-CXCR4 (BD Pharmingen, EE. UU.) después de une etapa de bloqueo de 2.4G2. Para la detección de antígenos de superficie celular en células diana, se tiñeron estirpes celulares leucémicas y blastos primarios con anti-CD45, anti-HLA de clase I, anti-CD112, anti-CD155 (Biolegend, EE. UU.), anti-CD13, anti- CD54, anti-CD58 (BD Pharmigen, EE. UU.). Las células se incubaron con los AcM antes mencionados durante 30 min a 4 °C en PBS con FBS al 2 %, se lavaron dos veces y se fijaron con formaldehído al 0,25 %. Para evaluar el quimerismo humano en sangre periférica de ratones NSG tratados, las células se tiñeron conjuntamente con AcM anti-CD45 humano (Biolegend), anti-CD3 humano (BD Bioscience), anti-CD33 humano (Miltenyi Biotech), anti-CD271 (Miltenyi Biotech) y anti-CD45 murino (BD Bioscience).
Las muestras se adquirieron usando un citómetro de flujo FACS Canto II (Becton Dickinson, EE. UU.) y los datos se analizaron con FCS express (De Novo Software, CA, EE. UU.). Los inventores establecieron marcadores de cuadrante en controles no teñidos.
Modelo de injerto contra leucemia, modelo de leucemia de ALL-CM: Se obtuvieron ratones NSG hembra de 6-8 semanas de edad de Charles-River Italia (Calco, Italia). El protocolo experimental fue aprobado por el comité interno para estudios en animales de la institución inventora (Institutional Animal Care and Use Committee [IACUC n.° 488]). El día 0 se infundieron a los ratones leucemia de ALL-CM (5x106) y tres días después PBMC alogénicas (5x106) o células CD4IL-10 o CD4GFP (2,5x106). Las células se resuspendieron en 250 pl de PBS y se infundieron por vía intravenosa. La supervivencia y la pérdida de peso se monitorizaron al menos 3 veces por semana como se describió anteriormente 20 y los ratones moribundos fueron sacrificados humanamente por razones éticas. A intervalos semanales, se extrajo sangre de los ratones y se determinó el quimerismo humano calculando la frecuencia de células CD45+ humanas dentro de la población total de linfocitos. En algunos experimentos, los ratones fueron sacrificados los días 7 y 14 después de la inyección de ALL-CM para analizar la distribución de células humanas en diferentes órganos.
Modelo de injerto contra leucemia, modelo de leucemia de THP-1: Se obtuvieron ratones NSG hembra de 6-8 semanas de edad de Charles-River Italia (Calco, Italia). El protocolo experimental fue aprobado por el comité interno para estudios en animales de la institución inventora (Institutional Animal Care and Use Committee [IACUC # 488]). El día 0 se infundieron a los ratones leucemia de THP-1 (2x106) y tres días después PBMC alogénicas (2x106) o catorce días después células CD4IL-10 o CD4GFP (1 x106). Las células se resuspendieron en 250 gl de PBS y se infundieron por vía intravenosa. La supervivencia y la pérdida de peso se monitorizaron al menos 3 veces por semana como se describió anteriormente 20 y los ratones moribundos fueron sacrificados humanamente por razones éticas. Los ratones se sacrificaron en la semana 5 después de la inyección de THP1 para analizar células humanas en el hígado.
Modelo de tumor de ALL-CM subcutáneo: Se usaron ratones NSG hembra de 6-8 semanas de edad. El protocolo experimental fue aprobado por el comité interno de estudios en animales del Instituto Científico San Raffaele (Institutional Animal Care and Use Committee [IACUC # 488]). El día 0 se infundieron a los ratones células ALL-CM (2x106) y tres días después PBMC alogénicas (2x106) o células CD4IL-10 (1 x106) o células CD4GFP (1 x106). Las células se resuspendieron en 1 ml de PBS y se infundieron por vía subcutánea. El crecimiento del sarcoma se monitorizó mediante mediciones al menos 3 veces por semana y los ratones moribundos se sacrificaron humanitariamente por razones éticas.
Modelo de enfermedad de injerto contra leucemia y de injerto contra hospedador: Se usaron ratones NSG hembra de 6-8 semanas de edad. El protocolo experimental fue aprobado por el comité interno de estudios en animales del Instituto Científico San Raffaele (Institutional Animal Care and Use Committee [IACUC # 488]). En el día 0, los ratones recibieron irradiación corporal total con una dosis única de 175-200 cGy de irradiación de un acelerador lineal según el peso de los ratones, y se les infundió inmediatamente ALL-CM (5x106). El día 3, a los ratones se inyectaron luego PBMC alogénicas (5x106) solas o en presencia de células CDGFP y CD4IL-10 (2,5x106). Las células se resuspendieron en 250 gl de PBS y se infundieron por vía intravenosa. La supervivencia y la pérdida de peso se monitorizaron al menos 3 veces por semana como se describió anteriormente 20 y los ratones moribundos fueron sacrificados humanamente por razones éticas. A intervalos semanales, se extrajo sangre de los ratones y se determinó el quimerismo humano calculando la frecuencia de células CD45+ humanas dentro de la población total de linfocitos. En algunos experimentos, los ratones fueron sacrificados los días 7 y 14 después de la inyección de ALL-CM para analizar la distribución de células humanas en diferentes órganos.
Análisis estadístico. Los análisis estadísticos de los datos funcionales se realizaron usando una prueba U de Mann-Whitney para datos no paramétricos y usando una prueba de análisis de varianza de dos vías. Las pruebas ANOVA y las comparaciones múltiples de Bonferroni se usaron para analizar los datos de los experimentos in vivo. Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraban significativos. Los cálculos estadísticos se realizaron con el programa Prism 5.0 (GraphPad Software).
Resultados
Las células CD4IL-10 destruyen las células mieloides de una manera dependiente de HLA de clase I y GzB. Los inventores generaron células CD4IL-10 mediante la transducción de células T CD4+ con un LV bidireccional novedoso que cocodifica IL-10 humana y ANGFR, como gen marcador de grado clínico (Figura 1A). Como control, las células T se transdujeron con una LV bidireccional que codifica GFP (en la posición de IL-10) y ANGFR (Figura 1A). Como se describió anteriormente 18, la expresión forzada de IL-10 humana en células T CD4+ permite la generación de células (células CD4IL-10) superponibles a las células Tr1. Las células CD4IL-10, en contraste con las células CD4GFP transducidas con LV de control, secretaban niveles significativamente más altos de IL-10 (p<0,0001). Se observaron niveles significativamente más altos de IFN-y (p<0,01) y cantidades bajas comparables de IL-4 e IL-17 (Figura 1B). Se cree que las propiedades, características y actividades biológicas de las células CD4IL-10 se deben al alto nivel de IL-10 producido. Las células CD4IL-10, pero no las células CD4GFP, suprimían las respuestas de células T in vitro (Figura 1C). Las células CD4IL-10 expresaban CD18, que en asociación con CD11 a forma LFA-1, CD2 y CD226 a niveles más altos que los detectados en células T CD4+ recién aisladas de memoria y en células CD4GFP (Figura 1D).
Par evaluar la capacidad de las células CD4IL-10 para destruir células mieloides transformadas, los inventores probaron un panel de estirpes celulares leucémicas. Se usaron linfocitos T (CD3) y monocitos (CD14) recién aislados como control negativo y positivo, respectivamente. Los inventores evaluaron primero la desgranulación de células CD4IL-10 y CD4GFP mediante la coexpresión de GzB y la proteína de membrana asociada a lisosomas1 (LAMP-1 o CD107a), un marcador de desgranulación citotóxica en células NK y linfocitos T citotóxicos. Cuando las células CD4IL-10 se cultivaban conjuntamente con CD14, U937, una estirpe celular monocítica, y ALL-CM, una estirpe celular derivada de un paciente que padecía una crisis linfoblástica de leucemia mielógena crónica 2021, se detectaba una proporción significativamente más alta de células GzB+CD107a+ (se probaron un mínimo de nueve donantes, CD4IL-10 frente a CD4GFP, p<0,001 y p<0,0001, respectivamente, Figura 2A y 3). La frecuencia de las células GzB+CD107a+ generadas en cocultivo con células U937 y ALL-CM también era significativamente más alta en comparación con la desgranulación espontánea de células CD4IL-10 (p<0,001 y p<0,0001, prueba T pareada, respectivamente). Por el contrario, las células CD4IL-10 no se degranulaban cuando se cocultivaban con CD3, BV-173, una leucemia linfoblástica pre-B 22, Daudi, una línea celular linfoblástica B, o K562, una línea celular eritroleucémica (Figura 2A y 3).
Consistentemente con la activación y la liberación de GzB, las células CD4IL-10 lisaban a una relación 100:1 (Tef:diana) células U937 y ALL-CM a niveles significativamente más altos en comparación con células CD4GFP (p <0,05). Por el contrario, las células CD4IL-10 no lisaban las células BV-173, Daudi o K562 (Figura 2B). De manera similar, en experimentos de cocultivo las células CD4IL-10 eliminaban CD14, U932, ALL-CM y THP-1, una estirpe celular monocítica prototípica, pero no las células BV-173 o K562 (Figura 2C).
La adición de un AcM pan anti-HLA de clase I (clon W6/32) inhibía la desgranulación de células CD4IL-10 (datos no mostrados), y evitaba significativamente la destrucción de células ALL-CM y U937 (p <0,05) (Figura 2D). Además, la destrucción mediada por CD4IL-10 de células ALL-CM y U937 era dependiente de GzB, ya que la adición del inhibidor de GzB Z-AAD-CMK inhibía la lisis de una manera dependiente de la dosis. (Figura 2E). En general, estos datos mostraban que las células CD4IL-10 lisaban estirpes celulares mieloides, pero no estirpes celulares linfoblásticas o eritroblásticas pre-B, a través de un mecanismo que requiere activación mediada por HLA de clase I y es dependiente de GzB.
Las células CD4IL-10 destruyen específicamente blastos leucémicos CD13+ que expresan CD54 y CD112 in vitro.
A continuación, los inventores investigaron el fenotipo de las estirpes celulares leucémicas. Los resultados indicaban que las células U937, THP-1 y ALL-CM dianas de la lisis mediada por CD4IL-10 eran CD13+ y expresaban CD54, HLA de clase I, CD58, CD155 y CD112 (Figuras 4A). Aunque las células CD13+, BV-173 que no se destruían por células CD4IL-10 eran HLA de clase I+CD58+ pero expresaban CD54 y CD112 a niveles bajos. Según el papel de HLA de clase I en la promoción de la activación de células CD4IL-10, aunque las células K562 y Daudi que expresan CD54, CD58, CD155 o CD112, HLA de clase Ineg no se destruían (Figuras 4A).
A continuación, los inventores determinaron si las células CD4IL-10 pueden eliminar los blastos primarios de LMA (Tabla 1). Como controles negativos, los inventores usaron blastos de LLA primarios. Las células CD4IL-10, generadas a partir de cuatro donantes sanos diferentes, destruían a cuatro de los ocho blastos de LMA primarios probados (Figura 4B). Se realizaron estudios de correlación para definir si la destrucción mediada por CD4IL-10 de los blastos de LMA primarios se asociaba con la expresión de marcadores específicos. Los resultados mostraron que la lisis mediada por CD4IL-10 se correlacionaba con la expresión de CD13, de CD54 y de CD112 en los blastos de LMA, pero no con c D58 o CD155 (Figura 4C). En particular, las células CD4IL-10 no eliminaban la Leu n.° 7 que era CD13+CD54+ pero CD112neg (Figura 4C). Sorprendentemente, las células CD4IL-10 eliminan de manera eficiente la Leu n.° 10, un blasto primario de LLA que era CD13+ CD54+CD112+ (Figura 4B). La expresión de CD13 es determinante para la actividad antileucémica de las células CD4IL-10, ya que dos estirpes celulares de mieloma múltiple humano U266 y MM1S que eran CD54+CD112+ pero no expresaban CD13 no se destruían (Figura 5A-B). Con base en estos datos, se llega a la conclusión de que las células CD4IL-10 eliminan células leucémicas CD13+ y la destrucción mediada por CD4IL-10 óptima requiere una adhesión mediada por CD54/LFA-1 estable y una activación mediada por CD112/CD226 (Figura 6).
CD13, CD54 y CD112 se pueden usar como biomarcadores para la identificación de la diana del efecto antileucémico de células CD4IL-10.
Las células CD4IL-10 median los efectos antileucémicos in vivo. Para probar la actividad antileucémica de las células CD4IL-10 in vivo, se usaron cuatro modelos humanizados diferentes clínicamente relevantes: el sarcoma mieloide subcutáneo, el modelo de leucemia de ALL-CM2021, el tumor mieloide extramedular24 y el modelo de IcL/xeno-EICH de inmunoterapia de células T. Los inventores desarrollaron el modelo humanizado de sarcoma mieloide subcutáneo: se inyectaron por vía subcutánea a ratones NSG células ALL-CM y tres semanas más tarde desarrollaron sarcoma mieloide subcutáneo (13,9 ± 1,16 mm, media ± EEM, n = 9, Figura 7A). En este modelo, se inyectaron PBMC, células CD4IL-10 o CD4GFP dentro del tumor el día tres después de la infusión de ALL-CM. El tratamiento con células CD4il-10 retrasaba significativamente el crecimiento del sarcoma mieloide (Figura 7A). En particular, en los ratones inyectados con CD4IL-10 no se observaban signos de desarrollo tumoral dentro de los primeros 14 días, y el día 21 el tamaño del tumor en los ratones tratados con CD4IL-10 era significativamente menor que el de los ratones no tratados (7,6 ± 0,9 mm, media ± EEM, n = 8; p<0,001; Figura 7A). Como era de esperar, los ratones inyectados con células CD4GFP desarrollaron sarcoma mieloide de manera similar a los ratones de control no tratados, mientras que la inyección de PBMC alogénicas prevenía por completo el crecimiento del tumor. (Figura 7A).
A continuación, los inventores evaluaron si las células CD4IL-10 median los efectos antileucémicos in vivo usando el modelo de leucemia de ALL-CM de terapia con células T en ratones NSG no acondicionados 2122. Después de la infusión de células ALL-CM, los ratones NSG desarrollaron leucemia en cuatro semanas (Figura 7B). En este sistema, la inyección de PBMC alogénicas, tres días después de la exposición a ALL-CM, retrasaba la progresión de la leucemia (Figura 7B), y después de cuatro semanas se detectaba una proporción significativamente menor de blastos humanos circulantes (en promedio 4,8 %, p<0,01) en comparación con los ratones de control no tratados (datos no mostrados). La transferencia adoptiva de células CD4IL-10 o células CD4GFP el día tres después de la infusión de ALL-CM no retrasaba el desarrollo de leucemia (Figura 7B), y en la semana cuatro, el porcentaje de blastos circulantes era comparable al observado en ratones de control no tratados (datos no mostrados).
En general, se mostró que las células CD4IL-10 retrasaban el desarrollo del sarcoma mieloide subcutáneo, mientras que no inhiben el crecimiento de la leucemia. Se postuló que, en el modelo de leucemia de ALL-CM, las células CD4IL-10 no se colocalizan con las células leucémicas en la médula ósea. Para probar esta hipótesis, primero se investigó la expresión de CXCR4 que se sabe que regula el anidamiento de células madre hematopoyéticas humanas y la leucemia mieloide en la médula ósea de ratones humanizados 25-27. A diferencia de las células ALL-CM y PBMC, las células CD4IL-10 en reposo no expresan niveles significativos de CXCR4 (Figura 8). A continuación, se investigó la localización in vivo de células CD4IL-10 en ratones NSG inyectados con ALL-CM y tres días después con PBMC, células CD4IL-10 o CD4GFP. La frecuencia de células CD4IL'10 circulantes en el día siete después de la transferencia era en promedio 16,3 % (± 15,7 %, media ± DE, n = 7), y disminuyó a 6,7 % (± 2,2 %, media ± DE, n = 3) el día catorce (Figura 7C). Se obtuvieron resultados similares en ratones inyectados con células CD4GFP. En la médula ósea, se detectaron células CD4IL'10 con una frecuencia muy baja el día siete (0,4 ± 0,5 % de media ± DE, n = 7) y desaparecieron el día catorce.
(Figura 7C). Además, en el día siete, las células CD4IL-10 y CD4GFP localizadas en el bazo y el pulmón y sus frecuencias disminuyeron el día catorce (Figura 7C). Finalmente, aunque a baja frecuencia, también se identificaron células CD4IL-10 en el hígado en ambos puntos temporales analizados. (Figura 7C). En sangre periférica de ratones tratados con PBMC, se encontraron más del 70 % y 30 % de células T humanas en el día siete y catorce, respectivamente. (Figura 7C). También se identificaron células T en el bazo, pulmón, hígado y médula ósea de ratones inyectados con PBMC en ambos puntos temporales (Figura 7C).
Dado que las células CD4IL-10 se localizan en el hígado, se probó la actividad antileucémica de células CD4IL-10 en un modelo de tumor mieloide deTHP-1 24 (Figura 7D). En este modelo, se inyectaron PBMC en ratones NSG el día tres después de la infusión de células THP-1, mientras que las células CD4IL-10 o CD4GFP se infundieron dos semanas después de la inyección del tumor, momento en el que la presencia de células THP-1 era evidente en el hígado (datos no mostrados). Los resultados demostraban que la transferencia adoptiva de células CD4IL-10 y de PBMC inhibían de manera comparable la capacidad de las células THP-1 para formar nódulos hepáticos, mientras que no se observaron diferencias en el desarrollo de tumores entre ratones inyectados con CD4GFP y de control no tratados (Figura 7D).
Estos hallazgos indican que a pesar de la limitada vida útil in vivo, las células CD4IL-10 median efectos antileucémicos potentes y específicos en tejidos periféricos en diferentes modelos humanizados.
La transferencia adoptiva de células CD4IL-10 previene la xeno-EICH mientras que evita el IcL de las células T alogénicas.
A continuación, los inventores investigaron los efectos de las células CD4IL-10 sobre ambos de IcL y xeno-EICH mediados por células T humanas alogénicas in vivo. Con este fin, se desarrolló un modelo humanizado de IcL/xeno-EICH: los ratones NSG se irradiaron subletalmente, se inyectaron con células ALL-CM y tres días después recibieron PBMC alogénicas solas o en combinación con células CD4IL-10 (Figura 9A y B). Dado que el acondicionamiento causa un aumento en la expresión y secreción de SDF-1 por las células estromales dentro de la médula ósea murina28, se analizó la localización in vivo localización de las células CD4IL-10 en ratones NSG irradiados subletalmente inyectados con ALL-CM y tres días después con PBMC, células CD4IL-10 o CD4GFP. La frecuencia de las células CD4IL-10 en la médula ósea el día siete después de la transferencia daban como resultado en promedio 22,3 % (± 9,6 %, media ± EEM, n = 9), y luego disminuyeron a 0,3 % (± 0,2 %, media ± EEM, n = 11) en el día catorce (Figura 9A). La sangre periférica probada en paralelo mostraba resultados comparables, con hasta un 34,3 % (± 8,2 %, media ± EEM, n = 17) de células CD4IL-10 circulantes en el día siete, que luego disminuyó a 3,0 % (± 1,6 %, media ± EEM, n = 14) en el día catorce. Se obtuvieron resultados similares en ratones inyectados con células CD4GFP (Figura 9A). En la médula ósea de ratones inyectados con PBMC se detectaron 39,4 % (± 7,0 %, media ± SEM, n = 8) y 23,5 % (± 5,0 %, media ± SEM, n = 14) de células T humanas en el día siete y catorce, respectivamente. En la sangre periférica de ratones inyectados con PBMC, se detectaron células T humanas en ambos puntos temporales analizados (Figura 9A). Estos datos indican que en ratones NSG acondicionados las células CD4IL-10 migran a la médula ósea.
Luego, los inventores probaron la capacidad de las células CD4IL-10 para mediar el efecto antileucémico en ratones NSG acondicionados. Los resultados mostraron que la transferencia adoptiva de células CD4IL-10 en el día tres después de la inyección de ALL-CM retrasaba significativamente la progresión de la leucemia (P <0,05), mientras que el tratamiento con células CD4GFP no (Figura 9B). Cabe señalar que la progresión de la leucemia en ratones inyectados con CD4IL-10 no era significativamente diferente a la observada con ratones inyectados con PBMC (P<0,0001, Figura 9B). Sin embargo, los ratones tratados con PBMC desarrollaban xeno-EICH grave y morían en veinte días. (Figura 9B).
Sorprendentemente, la cotransferencia de células CD4IL-10 y PBMC retrasaba significativamente la progresión de la leucemia (P <0,05), sin signos de xeno-EICH (Figura 9B). En general, estos hallazgos demuestran que la transferencia adoptiva de células CD4IL-10 previene la xeno-EICH, mientras que evita el IcL mediado por células T alogénicas.
Además, usando la plataforma LV-IL-10, los inventores generaron células CD4IL-10 específicas de aloantígeno que destruyen estirpes celulares leucémicas mieloides in vitro de una manera independiente del antígeno. Se generaron células T transducidas con LV-10 específicas de aloantígeno (alo)CD4IL-10 por estimulación de células T CD4+ sin tratamiento previo estimuladas con células dendríticas maduras alogénicas (alo-CDm) y transducción tras estimulación secundaria (Figura 11A). La eficiencia de transducción de células CD4+ sin tratamiento previo era en promedio de 55 % (Figura 11B). Las células alo-CD4IL-10 proliferaban significativamente menos (p<0,001, Figura 12A) y producían niveles significativamente más altos de IL-10 tras la reestimulación con alo-CDm, en comparación con células alo-CD4ñNGFR (p<0,0001, Figura 12B). Por el contrario, las células alo-CD4IL-10 y alo-CD4ñNGFR mostraban una capacidad proliferativa baja similar en respuesta a antígenos de terceros, (Figura 12A), aunque alo-CD4IL-10 producía niveles significativamente más altos de IL-10 (p<0,001, Figura 12B). Las células alo-CD4IL-10 pero no alo-CD4ñNGFR suprimían eficazmente la proliferación de estirpes de células T aloespecíficas activadas con alo-CDm, pero no con una CDm de terceros (Figura 12C). Las células alo-CD4IL-10 destruían las estirpes celulares leucémicas ALL-CM y U937, pero no K562, similarmente a lo observado con células CD4IL-10 policlonales (Figura 12D). Estos resultados muestran que la expresión de IL-10 reforzada en células T CD4+ aloespecíficas promueve su conversión en células similares a Tr1 capaces de destruir estirpes celulares mieloides.
Para determinar el papel de la expresión de HLA de clase I en células diana en la destrucción mediada por CD4IL-10, se eliminó selectivamente la expresión de HLA de clase I en las estirpes celulares ALL-CM y U937 alterando el gen que codifica la p2-microglobulina. Las estirpes celulares ALL-CM y U937 deficientes en p2m (p2m-/-) (Figura 13) se destruían por células CD4IL-10 a niveles significativamente más bajos en comparación con las estirpes celulares ALL-CM (p <0,001) y U937 (p <0,05) positivas de p2m (Figura 14A). Además, se mostró que la adición de un AcM pan anti-HLA de clase I (clon W6/32) no inhibía la destrucción mediada por CD4IL-10 de las estirpes celulares ALL-CM y U937 (p <0,05; Figura 2D de patente), y prevenía la desgranulación de células CD4IL-10 como se muestra por la frecuencia significativamente más baja (p <0,05) de células GzB+CD107a+ en cocultivo de células CD4IL-10 y estirpes celulares ALL-CM o U937 en presencia del AcM W6/32 (Figura 14B). De forma interesante, la adición de un AcM pan anti-HLA de clase II no inhibe la desgranulación de cocultivos de células CD4IL-10 con estirpes celulares ALL-CM o U937, lo que indica que las células CD4IL-10 no requieren activación mediada por TCR para experimentar sus efectos citolíticos contra las células diana mieloides (Figura 15).
Discusión
Los inventores mostraron previamente que la expresión forzada de IL-10 confiere un fenotipo y función similares a Tr1 a las células T CD4+ humanas, incluida la destrucción de células mieloides 19. Ahora generan células CD4IL-10 que usan un LV bidireccional novedoso que codifica IL-10 y ÚNGFR humanos como gen marcador de grado clínico. Los inventores muestran que las células CD4IL-10 adquirían la expresión de CD18, CD2 y CD226, y la capacidad de secretar GzB. Proporcionan evidencias de que las células CD4IL-10 destruyen estirpes celulares leucémicas in vitro e in vivo, y que esta destrucción es específica para células diana, preferiblemente células mieloides. Por primera vez se establece que las células CD4IL-10 eliminan los blastos leucémicos primarios. Se demuestra que la expresión de HLA de clase I en células mieloides diana es necesaria pero no suficiente para promover la citotoxicidad mediada por CD4IL-10, que también requiere adhesión estable mediada por CD54 y activación a través de CD226. CD13, CD54 y CD112 son biomarcadores de la destrucción mediada por CD4IL-10 de blastos primarios. En modelos de ratones humanizados, las células CD4IL-10 median potentes efectos antileucémicos y previenen la xeno-EICH sin comprometer el IcL mediado por las células T alogénicas.
La correlación entre la expresión del marcador CD13 y la capacidad de las células CD4IL-10 para eliminar blastos primarios (Figura 4) indica que la expresión de CD13 determina la especificidad diana de las células CD4IL-10. Además, la destrucción de blastos primarios por células CD4IL-10 se correlaciona con la expresión de CD54 (Figura 4), revelando la importancia de la adhesión estable entre células diana y CD4IL-10 para una citólisis eficaz, como se mostró anteriormente para las células Tr1 6. CD54 en blastos mieloides permite una interacción estable y prolongada con LFA-1 (CD18-CD11a) en células CD4IL-10, que se requiere para alcanzar el umbral de señalización necesario para activar la función efectora que culmina con la secreción de gránulos líticos que contienen GzB. No obstante, la expresión de CD54 no es suficiente para convertir los blastos CD13+ en diana de la lisis mediada por CD4IL-10. La expresión de CD112, uno de los ligandos de CD226 implicados en la citólisis mediada por Tr1 6, también se requiere (Figura 4). La interacción entre CD112 en blastos leucémicos mieloides y CD226 en células CD4IL-10 conduce a su activación, parecido al mecanismo descrito previamente para la lisis de blastos de LMA mediada por NK29. Siendo la señalización posterior de CD226 dependiente de su asociación con LFA-130, se puede concluir que la interacción CD112/CD226 promueve la estabilización del conjugado de células CD4IL-10-diana que desencadena la desgranulación de células CD4IL-10. La activación de células T mediada por CD226 puede ser inhibida por TIGIT31, otro receptor para CD112 y CD15532. TIGIT se une a CD155 con mayor afinidad que CD226 e inhibe la citotoxicidad y la producción de IFN-y de las células NK3334. Cabe destacar que las células CD4IL-10 expresan TIGIT (Figura 10); no obstante, el hallazgo de que CD155 se expresa menos que CD112 en blastos primarios2935 y que la lisis mediada por CD4IL-10 no se correlaciona con la expresión de CD155, sugiere que la activación de células CD4IL-10 a través de la interacción CD226/CD112 es dominante sobre la inhibición mediada por TIGIT/CD155. Con base en estos hallazgos, se encuentra que la expresión selectiva de CD13, CD54 y CD112 en blastos leucémicos podría usarse como biomarcador del efecto antileucémico mediado por células CD4IL-10.
La inhibición del reconocimiento de HLA de clase I mediante la neutralización de AcM, o la falta de expresión de HLA de clase I en blastos diana, previene la actividad lítica mediada por células CD4IL-10 (Figura 2), como se muestra para las células Tr1 6. Además de la activación mediada por CD226, las células CD4IL-10 tienen que activarse a través de HLA de clase I para liberar GzB y destruir las células diana. La capacidad de las células CD4IL-10 para eliminar la leucemia mieloide de una manera independiente de aloAg pero dependiente de HLA de clase I las convierte en una herramienta interesante para limitar, y posiblemente superar, la recaída de la leucemia causada por la pérdida de alelos de HLA compartidos después de un TCMH haploidéntico o un TCMH coincidente no relacionado36-38.
Las células CD4IL-10 median el efecto antileucémico en modelos murinos humanizados de tumores mieloides. Este efecto antitumoral está estrictamente relacionado con la colocalización de CD4IL-10 y células leucémicas. Se muestra que las células CD4IL-10 presentan una actividad antitumoral eficaz cuando se inyectan localmente dentro del sarcoma mieloide o se inyectan sistémicamente en ratones con tumores mieloides que porta el hígado. (Figura 7). Además, la inmunoterapia de células CD4IL-10 previene el desarrollo de leucemia en ratones humanizados acondicionados, en los que una frecuencia significativa de células CD4IL-10 están presentes en la médula ósea tan pronto como siete días después de la infusión (Figura 9). El efecto antileucémico ejercido dentro de la médula ósea por las células CD4IL-10 no se alcanza en ratones humanizados no acondicionados (Figura 7). En el último escenario, las células CD4IL-10 están presentes en cantidades limitadas y durante un corto período de tiempo en la médula ósea y, por lo tanto, no controlan la progresión de la leucemia, que ocurre en momentos posteriores. Cabe señalar que la vida útil limitada de las células CD4IL-10 podría ser beneficiosa en caso de inmunoterapia, ya que podría evitar el riesgo de inmunosupresión general. Este es uno de los aspectos importantes a considerar en el caso de la inmunoterapia basada en células Treg.
La inmunoterapia de células CD4IL-10 previene la xeno-EICH sin obstaculizar el efecto antileucémico de las PBMC alogénicas. (Figura 9). De forma similar, la coinfusión de Treg CD4+CD25+ humanas expandidas in vitro o recién aisladas con PBMC alogénicas39 o células T de donantes convencionales17 rescataba ratones humanizados de leucemia y sobrevivían sin xeno-EICH. En el primer estudio, se ha mostrado que las Treg CD4+CD25+ humanas migran a la médula ósea, donde se convierten en células T productoras de IL-17 y pierden la capacidad de suprimir la actividad antitumoral de las células T humanas 39. Por el contrario, Martelli y col.17 propuso que el fracaso de las Treg CD4+CD25+ humanas en anidar en hueso permite que las células T alogénicas controlen el desarrollo de la leucemia. Estos datos apoyan la hipótesis de que las células CD4IL-10 se comportan de manera diferente a las Treg CD4+CD25+ dado que migran a la médula ósea donde eliminan la leucemia mieloide sin limitar el IcL mediado por PBMC alogénicas.
En general, los datos actuales apoyan la hipótesis de que la inmunoterapia con células CD4IL-10 puede: i) mediar efectos antileucémicos, IcL; ii) mediar el efecto antitumoral, IcT, iii) permitir mantener el efecto de IcL de las células T alogénicas; y vi) mantener la capacidad de inhibir la EICH.
Además, los inventores mostraron que LV-hIL-10 se puede usar para convertir células T CD4+ aloespecíficas en células similares a Tr1 aloespecíficas (células alo-CD4IL-10), que destruyen específicamente las células diana mieloides y suprimen las respuestas de células T aloespecíficas in vitro. De forma interesante, la falta de HLA de clase I en las células diana, o la inhibición del reconocimiento de HLA de clase I mediante AcM neutralizantes, anula la destrucción mediada por CD4IL-10 in vitro e in vivo, sugiriendo que la activación de las células CD4IL-10 a través de la interacción receptor/HLA de clase I es necesaria para la liberación de GzB y la destrucción de las células diana. Por el contrario, la inhibición de HLA de clase II no afecta la activación de células CD4IL-10 y la eliminación de células mieloides diana.
La presente invención proporciona evidencias para el uso de inmunoterapia de células CD4IL-10 después de alo-TCMH para neoplasias malignas hematológicas con el objetivo de inhibir la EICH al tiempo que permite mantener el IcL. La expresión de CD13, CD54 y HLA-I y opcionalmente CD112 en células tumorales, en particular blastos mieloides, permite la selección de pacientes y el diseño de protocolo terapéutico ad hoc.
Además, la presente invención proporciona evidencias para el uso de inmunoterapia de células CD4IL-10 policlonales o aloespecífica para mediar IcT y proporcionar IcL en el contexto de tumor o alo-TCMH, respectivamente. Además, el hallazgo de que las células c D4il-10 eliminan la leucemia mieloide de una manera independiente de TCR pero dependiente de HLA de clase I sugiere su posible uso para limitar, y posiblemente superar, la recaída de leucemia causada por la pérdida de alelos de HLA no compartidos después de alo-TCMH.
Referencias
1. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M. y Toda, M. J Immunol 155, 1151-1164 (1995).
2. Groux, H. y col. Nature 389, 737-742 (1997).
3. Gagliani, N. y col. Nat Med (2013).
4. Bacchetta, R. y col. J Exp. Med. 179, 493-502 (1994).
5. Roncarolo, M.G. y col. Immunol R ev212, 28-50 (2006).
6. Magnani, C.F. y col. Eur J Immunol6 de abril (2011).
7. Bacchetta, R. y col. Haematologica (2010).
8. Gregori, S. y col. Blood 116, 935-944 (2010).
9. Hoffmann, P. y col. J Exp Med 196, 389-399 (2002).
10. Edinger, M. y col. Nat Med 9, 1144-1150 (2003).
11. Cohen, J.L. y col. J Exp Med 196, 401 -406 (2002).
12. Gregori, S., Goudy, K.S. y Roncarolo, M.G. Front Immunol 3, 30 (2012).
13. Trzonkowski, P. y col. Clin Immunol 133, 22-26 (2009).
14. Edinger, M. y Hoffmann, P. Curr Opin Immunol23, 679-684 (2011).
15. Di lanni, M. y col. Blood 117, 3921-3928 (2011).
16. Brunstein, C.G. y col. IBlood (2010).
17. Martelli, M.F. y col. Blood (2014).
18. Bacchetta, R. y col. Front Immunol 5, 16 (2014).
19. Andolfi, G. y col. Mol Ther20, 1778-1790 (2012).
20. De Palma, M. y Naldini, L. Methods Enzymol346, 514-529 (2002).
21. Bondanza, A. y col. Blood 107, 1828-1836 (2006).
22. Hambach, L. y col. Leukemia 20, 371-374 (2006).
23. Pegoraro, L. y col. J Natl Cáncer Inst 70, 447-453 (1983).
24. Casucci, M. y col. Blood 122, 3461-3472 (2013).
25. Dar, A., Kollet, O. y Lapidot, T. Exp Hematol 34, 967-975 (2006).
26. Tavor, S. y col. Cancer Res 64, 2817-2824 (2004).
27. Kollet, O. y col. Blood 97, 3283-3291 (2001).
28. Ponomaryov, T. y col. J Clin Invest 106, 1331 -1339 (2000).
29. Pende, D. y col. Blood 105, 2066-2073 (2005).
30. Shibuya, K. y col. Immunity 11,615-623 (1999).
31. Lozano, E., Domínguez-Villar, M., Kuchroo, V. y Hafler, D.A. J Immunol 188, 3869-3875 (2012).
32. Yu, X. y col. Nat Immunol 10, 48-57 (2009).
33. Georgiev, H. y col. Eur J Immunol44, 307-308 (2014).
34. Stanietsky, N. y col. Eur J Immunol43, 2138-2150 (2013).
35. Sánchez-Correa, B., y col. Immunol Cell B io l90, 109-115 (2012).
36. Vago, L. y col. N Engl J Med 361,478-488 (2009).
37. Villalobos, I.B., y col. Blood 115, 3158-3161 (2010).
38. Toffalori, C. y col. Blood 119, 4813-4815 (2012).
39. Guichelaar, T. y col. Clin Cancer Res 19, 1467-1475 (2013).
40. Bacchetta, R. y col. Blood, 45 (Resumen de la reunión anual de ASH) (2009).
41. Bondanza A y col. Blood; 117: 6469-78 (2011).
Listado de secuencias
<110> Ospedale San Raffaele S.r.l.
Fondazione Centro San Raffaele
Fondazione Teletón
<120> Células T CD4 productoras de IL-10 y usos de las mismas
<130> PCT 129138
<150> EP15159075.9
<151 > 13-03-2015
<160> 1
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintético
<400> 1
gagtagcgcg agcacagcta 20

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Una célula T CD4+ que expresa IL-10 humana para uso en el tratamiento y/o prevención de un tumor, en la que dicho tumor expresa CD13, HLA de clase I y CD54, en la que dicha célula ha sido modificada genéticamente para sobreexpresar o expresar altos niveles de IL-10 con respecto a una célula de referencia.
2. La célula T CD4+ para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha célula expresa CD18 y/o CD2 y/o CD226.
3. La célula T CD4+ para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha célula expresa granzima B (GzB).
4. La célula T CD4+ para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha célula no induce EICH o en la que dicha célula destruye las células mieloides, preferiblemente dichas células mieloides son células mieloides CD14+, preferiblemente dichas células mieloides son células mieloides CD13+.
5. La célula T CD4+ para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha célula previene la EICH.
6. La célula T CD4+ para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha célula induce injerto contra tumor (IcT) y/o induce injerto contra leucemia (IcL).
7. La célula T CD4+ para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha célula es autóloga, heteróloga, policlonal o aloespecífica.
8. La célula T CD4+ para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho tumor expresa además al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en: CD112, CD58, preferiblemente dicho tumor expresa además CD155, preferiblemente el tumor es un tumor sólido o hematológico, preferiblemente dicho tumor es leucémico o un tumor mieloide, preferiblemente el tumor está mediado por una célula seleccionada del grupo que consiste en: macrófagos, monocitos, granulocitos, eritrocitos, trombocitos, mastocitos, células B, células T, células Nk , células dendríticas, células de Kupffer, células microgliales y células plasmáticas, preferiblemente el tumor sólido o el tumor hematológico se selecciona de una célula del grupo que consiste en: cáncer suprarrenal, cáncer anal, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, tumores cerebrales/del SNC en adultos, tumores cerebrales/del SNC en niños, cáncer de mama, cáncer de mama en hombres, cáncer de origen primario desconocido, enfermedad de Castleman, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon/recto, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, tumores de la familia Ewing, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, tumor del estroma gastrointestinal (TEGI), enfermedad trofoblástica gestacional, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer laríngeo e hipofaríngeo, leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA, incluyendo sarcoma mieloide y leucemia cutis), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia mielomonocítica crónica (LMMC), leucemia en niños, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, tumor carcinoide de pulmón, linfoma, linfoma de piel, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, cáncer de cavidad nasal y de senos paranasales, cáncer de nasofaringe, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, linfoma no Hodgkin en niños, cáncer de orofaringe y cavidad oral, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pene, tumores hipofisarios, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma - cáncer de tejidos blandos en adultos, cáncer de piel, cáncer de piel - basocelular y espinocelular, cáncer de piel - melanoma, cáncer de piel - células de Merkel, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de timo, cáncer de tiroides, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms.
9. La célula T CD4+ para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el tumor es refractario a una intervención terapéutica.
10. La célula T CD4+ para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha célula se usa en combinación con una intervención terapéutica, preferiblemente la intervención terapéutica se selecciona del grupo que consiste en: quimioterapia, radioterapia, alo-TCMH, transfusión de sangre, trasplante de médula sanguínea.
11. Una célula T CD4+ que expresa IL-10 humana para uso en el tratamiento y/o prevención de la recaída de leucemia, o para uso en un método para inducir injerto contra tumor (IcT), en la que dicha célula ha sido modificada genéticamente para sobreexpresar o expresar niveles altos de IL-10 con respecto a una célula de referencia.
12. Una composición que comprende una célula T CD4+ como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y excipientes apropiados para uso en el tratamiento y/o prevención de un tumor, en la que dicho tumor expresa CD13, HLA de clase I y CD54, o para uso en el tratamiento y/o prevención de recidiva de leucemia o para uso en un método para inducir injerto contra tumor (IcT).
13. La composición para uso según la reivindicación 12, que comprende además un agente terapéutico.
14. Un método in vitro para seleccionar un sujeto para ser tratado con una célula T CD4+ que expresa IL-10 humana, en el que dicha célula ha sido modificada genéticamente para sobreexpresar o expresar altos niveles de IL-10 con respecto a una célula de referencia, comprendiendo el método detectar la presencia de una célula que expresa CD13, HLA de clase I y CD54 en una muestra biológica obtenida del sujeto, en el que si se detecta la presencia de la célula que expresa CD13, HLA de clase I y CD54, el sujeto se selecciona para ser tratado con dicha célula T CD4+.
15. El método según la reivindicación 14, en el que la célula expresa además CD112 y/o CD58.
16. El método según la reivindicación 14 o 15, en el que la célula expresa además CD155.
17. Un uso de un kit en un método de acuerdo con las reivindicaciones 14 a 16 en donde el kit comprende medios para detectar la presencia de una célula que expresa al menos CD13, HLA de clase I y CD54 en una muestra biológica.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI794171B (zh) 2016-05-11 2023-03-01 美商滬亞生物國際有限公司 Ｈｄａｃ抑制劑與ｐｄ-ｌ１抑制劑之組合治療
TWI808055B (zh) 2016-05-11 2023-07-11 美商滬亞生物國際有限公司 Hdac 抑制劑與 pd-1 抑制劑之組合治療
CA3054621A1 (en) 2017-03-22 2018-09-27 Novartis Ag Compositions and methods for immunooncology
CN113826014A (zh) * 2019-04-16 2021-12-21 明尼苏达大学董事会 由凋亡供体白细胞诱导的移植耐受性的生物标志物
WO2022005462A1 (en) * 2020-06-30 2022-01-06 Tr1X, Inc. Poly-donor cd4+ t cells expressing il-10 and uses thereof
US20230285560A1 (en) * 2020-08-14 2023-09-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cd200 blockade to increase the anti-tumor activity of cytotoxic t cells
TW202334399A (zh) 2021-12-30 2023-09-01 美商Ｔｒ１Ｘ股份有限公司 表現ｉｌ－１０之多供體ｃｄ４＋ｔ細胞及其用途
WO2023129929A1 (en) 2021-12-30 2023-07-06 Tr1X, Inc. Cd4+ t cells expressing il-10 and chimeric antigen receptors and uses thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003004625A1 (en) * 2001-07-02 2003-01-16 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Methods of generating human cd4+ th2 cells and uses thereof
WO2013192215A1 (en) 2012-06-18 2013-12-27 Yale University Compositions and methods for diminishing an immune response

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