ES2897424T3 - Proceso de superposición multicelular - Google Patents

Abstract

Un proceso de superposición multicelular, comprendiendo el proceso las etapas de: a) formar un material de núcleo (2), b) formar un material de cápsula (3), c) encapsular el núcleo (2) con el material de cápsula (3), d) añadir la cápsula (3) a un sustrato, y e) exponer la cápsula (3) a al menos un agente bioactivante, caracterizándose el proceso de superposición multicelular por que el material de cápsula (3) comprende un polímero soluble en agua, un componente fibroso, y un disolvente, y en donde el núcleo (2) comprende una o más células de mamífero (1), medio de cultivo celular y un hidrogel.

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso de superposición multicelular

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso de superposición multicelular.

Antecedentes de la invención

La ingeniería tisular es muy prometedora para la reparación de traumatismos, regeneración de tejidos después de una lesión o enfermedad, o incluso para la reconstrucción de órganos completos. En la actualidad los injertos de piel se cultivan in vitro regularmente para trasplantarlos a pacientes con quemaduras o para reparar grandes áreas de piel. También es posible cultivar vejigas enteras in vitro, así como otros tejidos tales como cartílago y hueso. Uno de los problemas a los que se enfrentan los científicos es cómo regenerar tejidos cuando no solo se requiere un gran número de células, sino también muchos tipos de células.

Un gran número de células requiere grandes cantidades de nutrientes, lo que es problemático no solo en la fase de crecimiento in vitro, sino después del trasplante al paciente. Este problema se ha abordado parcialmente para algunos tejidos, y la piel es un buen ejemplo en el que este tipo de ingeniería ha tenido cierto éxito. En la actualidad es posible extender células madre en un paciente para reparar el daño cutáneo. La tecnología requiere un dispositivo que extienda las células madre autodonadas (autólogas) del propio paciente para tratar quemaduras y otras heridas. El método se usa junto con una técnica que aísla células madre adultas para su aplicación en el sitio de la herida, donde se diferencian en piel normal. Este tratamiento puede reemplazar los métodos convencionales de tratamiento de heridas graves, tales como injerto de piel. Los estudios demuestran que el tejido cutáneo dañado se regenera después del tratamiento con pistola cutánea significativamente más rápido que después de los métodos de tratamiento tradicionales, y esto se debe principalmente a que una gran cantidad de células vivas viables se suministran directamente a la zona requerida. Desafortunadamente, esta tecnología no se ha extendido para que incluya la regeneración de la piel perdida debido a otras lesiones o enfermedades cutáneas y también está limitada porque solo es eficaz inmediatamente después del incidente por quemaduras. Un avance en este tipo de tecnología es imprimir células cutáneas en heridas por quemaduras. En realidad la "tinta" está formada por diferentes tipos de células cutáneas. Se usa un escáner para determinar el tamaño y la profundidad de la herida. Los diferentes tipos de células cutáneas se encuentran a diferentes profundidades. Estos datos guían a la impresora a medida que aplica capas del tipo correcto de células para cubrir la herida.

Otra técnica que se usa para administrar un gran número de células a una zona objetivo es la microencapsulación. La tecnología de microencapsulación celular implica la inmovilización de las células dentro de una membrana polimérica semipermeable que permite la difusión bidireccional de moléculas tal como la entrada de oxígeno, nutrientes, factores de crecimiento, etc., esenciales para el metabolismo celular y la difusión hacia el exterior de productos de desecho y proteínas terapéuticas. Al mismo tiempo, la naturaleza semipermeable de la membrana evita que las células inmunitarias y los anticuerpos destruyan las células encapsuladas considerándolas invasores extraños. El potencial de usar microencapsulación celular en aplicaciones clínicas satisfactorias se puede realizar solo si se optimizan varios requisitos encontrados durante el proceso de desarrollo, tales como el uso de un polímero biocompatible apropiado para formar la matriz semipermeable mecánica y químicamente estable, producción de microcápsulas de tamaño uniforme, uso de un policationes inmunocompatibles apropiados reticulados con el polímero de encapsulación para estabilizar las cápsulas, selección de un tipo de célula adecuado dependiendo de la situación. El motivo principal de la tecnología de encapsulación celular es superar el problema existente del rechazo de injertos en aplicaciones de ingeniería tisular y por lo tanto reducir la necesidad del uso a largo plazo de fármacos inmunosupresores después de un trasplante de órganos para controlar los efectos secundarios.

Con respecto a la diabetes, los científicos están estudiando ampliamente el potencial de usar páncreas bioartificial, para el tratamiento de la diabetes mellitus, basándose en la encapsulación de células de los islotes dentro de una membrana semipermeable. Estos dispositivos podrían eliminar la necesidad de fármacos inmunosupresores además de resolver por último el problema de la escasez de donantes de órganos. El uso de microencapsulación podría proteger a las células de los islotes del rechazo inmunológico y podría permitir el uso de células animales o células productoras de insulina modificadas genéticamente. Se espera que el desarrollo de estas microcápsulas encapsuladas en islotes pueda evitar la necesidad de las inyecciones de insulina que necesitan los pacientes diabéticos de tipo 1 varias veces al día. Sin embargo, los dos obstáculos principales a los que se enfrenta esta técnica son la disponibilidad limitada de órganos de donantes y la necesidad de inmunosupresores para prevenir una respuesta inmunitaria en el cuerpo del paciente. Los polímeros usados para microencapsulación de islotes son alginato, quitosano, polietilenglicol (PEG), agarosa, sulfato de celulosa de sodio y poliacrilatos insolubles en agua, siendo el alginato y el PEG los polímeros usados comúnmente. Sin embargo, todavía existen varios problemas importantes que es necesario superar, tales como la biocompatibilidad y la inmunoprotección.

El uso de microcápsulas encapsuladas en células para el tratamiento de varias formas de cáncer ha mostrado un gran potencial. Un enfoque adoptado por los investigadores es mediante el implante de microcápsulas que contienen células secretoras de citoquinas modificadas genéticamente. Un ejemplo de esto se demostró cuando los mioblastos de ratón no autólogos secretores de citoquina IL-2 modificados genéticamente implantados en ratones mostraron un retraso en el crecimiento del tumor con un aumento de la tasa de supervivencia de los animales. Sin embargo, la eficacia de este tratamiento fue breve debido a una respuesta inmunitaria hacia las microcápsulas implantadas. Otro enfoque para la supresión del cáncer es mediante el uso de inhibidores de la angiogénesis para prevenir la liberación de factores de crecimiento que conducen a la propagación de tumores. Se ha estudiado ampliamente el efecto del implante de microcápsulas cargadas con células xenogénicas genéticamente modificadas para secretar endostatina, un fármaco antiangiogénico que provoca apoptosis en las células tumorales. Sin embargo, este método de administración local de microcápsulas no fue factible en el tratamiento de pacientes con muchos tumores o en casos de metástasis y ha dado lugar a estudios recientes que involucran el implante sistémico de las cápsulas. Numerosos estudios se han dedicado al desarrollo de métodos eficaces para permitir la regeneración del tejido cardíaco en pacientes después de una cardiopatía isquémica. Un enfoque emergente para responder a los problemas relacionados con la reparación del tejido isquémico es mediante el uso de una terapia basada en células madre. Sin embargo, todavía se está investigando el mecanismo real por el cual esta terapia basada en células madre tiene efectos generativos sobre la función cardíaca. Aunque para la administración celular se han estudiado numerosos métodos, la eficacia del número de células retenidas en el corazón que late después del implante es aún muy baja. Un enfoque prometedor para superar este problema es mediante el uso de terapia de microencapsulación celular que se ha mostrado que permite una mayor retención celular en comparación con la inyección de células madre libres en el corazón.

El documento de patente US 4352883 desvela un proceso para encapsular tejido o células individuales de modo que permanezcan viables y en un estado protegido dentro de una membrana que es permeable a nutrientes, iones, oxígeno y otros materiales necesarios tanto para mantener el tejido como para apoyar sus funciones metabólicas normales, pero impermeable a bacterias, linfocitos y proteínas grandes del tipo responsable de las reacciones inmunoquímicas que dan como resultado el rechazo.

Incluso con todos los estudios anteriores, todavía existen problemas con el rechazo, cómo colocar múltiples tipos de células en el mismo lugar que el que se podría encontrar en un órgano complejo o parte del cuerpo, y cómo retener la cápsula en el lugar correcto.

Los inventores han diseñado en la actualidad un proceso de superposición multicelular que supera los inconvenientes mencionados anteriormente asociados a la técnica anterior.

Sumario de la invención

En la presente solicitud se proporciona un proceso de superposición multicelular, comprendiendo el proceso las etapas de:

a) formar un material de núcleo,

b) formar un material de cápsula,

c) encapsular el núcleo con el material de cápsula,

d) añadir la cápsula a un sustrato,

e) exponer la cápsula a al menos un agente bioactivante,

caracterizándose el proceso de superposición multicelular por que el material de cápsula comprende un polímero soluble en agua, un componente fibroso, y un disolvente y en donde el núcleo comprende una o más células de mamífero, medio de cultivo celular y un hidrogel.

La presente invención es ventajosa principalmente porque significa que el material de núcleo se mantiene de una manera más estable que con cualquier método convencional. Por lo tanto el material del núcleo permanece viable durante más tiempo y en condiciones ambientales más extremas. Además, el método proporciona un proceso de superposición de material de núcleo sobre un sustrato, permitiendo la capacidad de activar selectivamente diversas regiones o partes del material de núcleo sobre dicho sustrato.

Se apreciará que el método de la invención no se limita al singular, y por lo tanto preferentemente, el método comprende formar una pluralidad de cápsulas, añadir una pluralidad de cápsulas a un sustrato y exponer la pluralidad de cápsulas a al menos un agente bioactivante. Esto permite una diversidad de construcciones.

El núcleo comprende una o más células de mamífero, medio de cultivo celular y un hidrogel. Esto permite que el método a usar cuando el material de núcleo incluya material celular y al formar el núcleo como se describe, el material celular se mantenga en un ambiente estable y viable. Cuando el núcleo comprende células de mamífero, significa que el método se puede usar para superponer células sobre un sustrato, que a continuación se pueden hacer crecer en cultivo para formar un tejido o un órgano o simplemente otras generaciones de las células. Un crecimiento de este tipo es más eficaz que en los métodos convencionales, debido al mejor ambiente de almacenamiento de las células en el núcleo y la cápsula.

Preferentemente, las células son células madre. Esto permite la superposición de células madre sobre un sustrato que a continuación se puede usar para generar muchos tipos diferentes de células, que cuando se cultivan pueden crecer en tejidos u órganos, dependiendo del tipo de diferenciación hacia el que se dirigen. Las células también pueden ser células del propio paciente, células autólogas o mezclas de las mencionadas anteriormente.

Preferentemente, el medio de cultivo celular comprende medio de crecimiento selectivo, factor de crecimiento o tampón. Esto permite una administración rápida de nutrientes para las células una vez que comienzan a crecer sobre el sustrato.

Preferentemente, el hidrogel comprende cualquiera de gelatina, polietilenglicol, glicerol, alginato, dextrano-40, trehalosa, o DMSO. Estos materiales son crioprotectores y protegen el material celular durante el almacenamiento en congelación. El hidrogel proporciona amortiguación a las células y ayuda a transferir gases hacia y desde las células cuando están en cultivo.

El núcleo puede comprender además al menos un agente bioactivante seleccionado entre el grupo que consiste en factores de crecimiento, inhibidores de crecimiento o selectores de crecimiento. Esto tiene el beneficio de que cuando las células comienzan su ciclo de cultivo sobre el sustrato, el agente bioactivante está fácilmente disponible y por lo tanto no hay retraso en los patrones de diferenciación o crecimiento que promueven los agentes.

Preferentemente, la etapa de formación del núcleo comprende combinar una o más células de mamífero, al menos un agente bioactivante, medio de cultivo celular y un hidrogel. La combinación puede ser una mezcla simple o una combinación de aditivos.

El material de cápsula comprende un polímero soluble en agua, un componente fibroso, y un disolvente. Esta mezcla estabiliza el material de núcleo y lo hace utilizable. Es decir, se puede transportar, congelar, manipular, etc. El material de cápsula también, una vez formado alrededor del núcleo, amortigua las tensiones de cizalladura ejercidos sobre el núcleo y sobre las células en el núcleo de las fuerzas ejercidas en el transporte o mezcla. De lo contrario, estas tensiones podrían estimular a las células a diferenciarse incorrectamente. Las propiedades de la formulación de cápsula ayudan a la formación electrohidrodinámica de estructuras núcleo-cápsula.

Preferentemente, el polímero soluble en agua comprende óxido de polietileno [PEO] y/o polietilenglicol [PEG]. Cuando las células están en el ambiente de cultivo, el PEO y/o el PEG van a producir un hidrogel que ayuda al cultivo celular. Otros polímeros solubles en agua adecuados incluyen polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, ácido poliacrílico, poliacrilamida, polifosfatos, goma xantana, pectinas, derivados de quitosano, dextrano, ácido hialurónico, albúmina, almidón y derivados a base de almidón, alginato, gelatina, quitosano, colágeno, agarosa o sulfato de celulosa y sus copolímeros.

Preferentemente, el componente fibroso comprende nanofibras criomolidas, fibras molidas criosónicas o nanofibras bioactivas cortadas litográficamente. Las fibras permiten la construcción de la cápsula que de otro modo se podría desintegrar. La molienda segmenta las fibras. El procedimiento de "segmentación de fibras" también muele las fibras hasta longitudes y tamaños dentro de un intervalo en particular. Por lo tanto, la viscosidad de la cápsula se controla. Esto es importante ya que es necesario que las cápsulas contengan los núcleos, y que también los liberen cuando se encuentran en el ambiente de cultivo.

Preferentemente, las fibras comprenden polímeros naturales y/o sintéticos. Las fibras ayudan a la formación del material de la matriz extracelular cuando las células se encuentran en el ambiente de cultivo. Esto puede acelerar cualquier proceso de generación de masa tisular.

Preferentemente, los polímeros naturales comprenden colágeno reticulado y/o ácido hialurónico reticulado. Preferentemente, los polímeros sintéticos comprenden cualquiera de ácidos polilactida glicólico, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, o policapralactona.

Preferentemente, el componente fibroso está infundido con una enzima. La enzima, que puede ser trehalasa, por ejemplo, descompone las moléculas complejas del hidrogel en azúcares tales como glucosa, que a continuación se ponen a disposición de las células en cultivo.

Preferentemente, el componente fibroso está infundido con un absorbente electromagnético. Los ejemplos de absorbente electromagnético adecuado incluyen, pero no se limitan a, negro de carbono, nanoescamas de grafeno, puntos cuánticos o nanopartículas. Estos aditivos ayudan al calentamiento controlado de la fibra para calentar el microambiente celular y para ayudar a la liberación de agentes bioactivos dentro o unidos a la fibra.

Preferentemente, el disolvente comprende agua, solventes orgánicos y mezclas de agua y disolventes orgánicos (por ejemplo, DMSO). Esto proporciona una viscosidad adecuada y un fluido volátil para el material de núcleo.

Preferentemente, el material de cápsula comprende además al menos un agente bioactivante seleccionado entre el grupo que consiste en factores de crecimiento, inhibidores de crecimiento, agentes antimicrobianos o agentes antiinflamatorios. Si una enzima se almacena en el revestimiento de la cápsula, su diana generalmente se podría almacenar en el núcleo. Esto tiene el mismo efecto que el mismo agente en el material de núcleo.

Preferentemente, la etapa de encapsular el núcleo con el material de la cápsula comprende la electropulverización tanto de los núcleos formados como del material de cápsula concéntricamente en una torre de caída enfriada criogénicamente. Esto tiene el efecto de que el material de núcleo y el material de cápsula se unen al final del conjunto del tubo concéntrico. El ambiente también tiene un punto de rocío muy bajo para ayudar a la evaporación del agua de la superficie. Las cargas electrostáticas inducidas en la superficie de la cápsula ayudan al modo de goteo. Cuando las cápsulas del núcleo-cubierta caen a través de una torre de caída enfriada con criovapor, se retiran la mayoría de los disolventes de la cápsula. La evaporación del disolvente reduce la temperatura de la cápsula, lo que a su vez aumenta la viscosidad y aumenta la tensión superficial. En esta etapa, la iluminación con radiación electromagnética se podría usar para controlar el proceso de formación de la cápsula. A medida que las cápsulas continúan cayendo, se enfrían aún más mediante un vapor criogénico que baja la temperatura por debajo de la temperatura de transición vítrea del agua (< -135 °C). Las cápsulas caen sobre una superficie que se puede inclinar para reducir los impactos de choque. El resultado es un polvo de criobiocápsula a una temperatura inferior a -135 °C en el que las células del interior aún son viables.

Preferentemente, la etapa de añadir la cápsula al sustrato se realiza en un proceso de fabricación aditiva. Esto significa que se puede controlar la adición de las cápsulas al sustrato y aplicar el patrón de adición a partir de un patrón determinado previamente. Es decir, si se quisiera producir un disco o una forma rectangular, se podría hacer. Como se describirá a continuación, se crea preferentemente un lecho fluidizado de cápsulas con las cápsulas fluidizadas en un vapor de nitrógeno líquido. El vapor que contiene las cápsulas se extrae y se mezcla con aire seco tibio y se dirige hacia el sustrato, momento en el que las cápsulas se depositan sobre el sustrato. En este proceso se controla el calentamiento de la cápsula mediante la radiación térmica a partir de un tubo de administración calentado o mediante iluminación a partir de fuentes de emisión con una longitud de onda que coincide con la de los absorbentes electromagnéticos incorporados en la cápsula. La gestión térmica de la vía de administración de la cápsula asegura que las cápsulas se depositen sobre el sustrato por encima de 0 °C, generalmente 4 °C.

Preferentemente, el proceso de fabricación aditiva es cualquiera de sinterización a alta velocidad, impresión por chorro de tinta, impresión PolyJet, pulverización, deposición de alta resolución, pulverización, distribución mediante jeringa, electropulverización en campo cercano o chorro de aerosol. Estos métodos permiten la adición localizada de cápsulas (y otros componentes) a un sustrato.

Preferentemente, comprende además la deposición de una barrera sobre el sustrato. Preferentemente, la barrera partículas hidrófobas secas. Estas se pueden suministrar en un disolvente biocompatible hidrófobo volátil (por ejemplo, Fluorinert). La barrera impide que grupos de cápsulas se mezclen entre sí en el mismo sustrato, y también impide que cualquier líquido que se coloque posteriormente sobre las cápsulas y sobre el sustrato se transfiera de un grupo de cápsulas al otro. Por lo tanto, los bioactivadores correctos se mantienen con los contenidos celulares adecuados.

Preferentemente, las partículas hidrófobas comprenden partículas de PTFE. Preferentemente, la deposición de partículas hidrófobas secas sobre el sustrato se realiza mediante cualquiera de sinterización a alta velocidad, impresión por chorro de tinta, impresión PolyJet, pulverización, deposición de alta resolución, pulverización, distribución mediante jeringa, electropulverización en campo cercano o chorro de aerosol.

Preferentemente, la etapa de exponer la cápsula a al menos un agente bioactivante comprende irrigar las cápsulas con una solución acuosa que comprende uno o más agentes bioactivantes. Esto se realiza preferentemente mediante cualquiera de impresión por chorro de tinta, impresión PolyJet, pulverización, deposición de alta resolución o chorro de aerosol. Las formulaciones que se depositan usando estos métodos pueden contener absorbentes electromagnéticos y/o agentes bioactivos. El disolvente vehículo podría ser generalmente agua o mezclas de agua y disolventes orgánicos (por ejemplo, DMSO). La energía electromagnética, que se encuentra dentro de la banda de absorción del absorbente electromagnético, se convierte generalmente para producir un efecto de calentamiento. Este calor puede elevar la temperatura del microambiente celular que inicia la actividad metabólica celular en los sitios seleccionados definidos por la ubicación del absorbente.

Preferentemente, la fuente de radiación electromagnética será un láser, diodo emisor de luz o fuentes especializadas de emisión en el infrarrojo cercano.

Cuando el sustrato se ilumina con luz en el infrarrojo cercano después de colocar una capa de cápsulas sobre el sustrato, significa que se pueden calentar uniformemente en el grosor de la capa de la deposición de cápsulas. Por lo tanto, todas las células se activan a la vez. Aunque todas las células depositadas se pueden activar si las multicapas de células no son demasiado gruesas.

Preferentemente, los uno o más agentes bioactivantes se seleccionan entre el grupo que consiste en factores de crecimiento, inhibidores de crecimiento, agentes antimicrobianos y agentes antiinflamatorios.

Preferentemente, las etapas d) y e) se repiten consecutivamente para superponer una matriz tridimensional de cápsulas. Esto significa que las células se pueden cultivar en grupos de masa para crear estructuras sólidas tridimensionales y tejidos y órganos.

Preferentemente, las cápsulas que se forman tienen entre 20 pm y 50 pm de diámetro.

Preferentemente, una pluralidad de cápsulas que comprenden tipos de células programadas para producir un primer tipo de tejido se colocan sobre el sustrato adyacente a una pluralidad de cápsulas que comprenden tipos de células programadas para producir un segundo tipo de tejido. Por lo tanto, en el mismo sustrato se pueden tener dos grupos de células uno al lado del otro. Esto significa que se puede cultivar un tipo de tejido junto a otro tipo de tejido. El tipo de tejido depende del tipo de célula y de los activadores usados.

Además, una pluralidad de cápsulas que comprenden tipos de células programadas para producir un primer tipo de tejido se puede colocar sobre el sustrato interpuesto con una pluralidad de cápsulas que comprenden tipos de células programadas para producir un segundo tipo de tejido. Esto significa que se puede cultivar un tipo de tejido dentro de otro. Por ejemplo, vasos sanguíneos dentro de un hueso.

El núcleo, material de cápsula o componente fibroso puede comprender además un absorbente de infrarrojo cercano. Esto tiene dos beneficios. El primer beneficio significa que se puede obtener un mayor control del proceso de calentamiento cuando las cápsulas se depositan sobre el sustrato desde el lecho fluidizado. Esto se logra al iluminar la boquilla de administración con una luz infrarroja. El segundo beneficio es que si se ilumina el sustrato con luz infrarroja después de haber colocado las cápsulas sobre el sustrato y colocarlas a diversas profundidades, significa que se pueden calentar uniformemente en todo el grosor de la deposición de cápsulas. Por lo tanto, todas las células se activan a la vez.

Breve descripción de los dibujos

La invención se describirá ahora a modo de ejemplo y/o ilustración únicamente con referencia a los dibujos adjuntos en los que:

La Figura 1 es una sección transversal de una realización de la cápsula fabricada de acuerdo con una realización del método de la invención.

La Figura 2 muestra un ejemplo del conjunto de electrohilado usado en la invención.

La Figura 3 muestra una imagen de SEM de la malla de fibra.

La Figura 4 muestra una imagen de SEM de la malla de fibra criomolida.

La Figura 5 muestra un esquema de una realización del método para formar las cápsulas alrededor del núcleo. La Figura 6 muestra un esquema de una realización del método de fabricación de la capa aditiva.

La Figura 7 muestra un esquema de una realización del método de adición de materiales de barrera al sustrato. La Figura 8 muestra la irrigación de criocápsulas descongeladas con soluciones.

La Figura 9 muestra una sección transversal de los resultados de una realización del método en el que se repiten las etapas D y e.

La Figura 10 muestra el biorreactor de tejido/órgano resultante.

La Figura 11 muestra la recuperación de tejido/órgano después de la retirada de partículas hidrófobas.

Descripción detallada de la realización ilustrada

A continuación se describirá una realización de la invención a modo de ejemplo.

Formación del núcleo

Un material de núcleo se formó mediante la mezcla de células madre (1), con un medio de cultivo celular, agentes crioprotectores y agentes bioactivos (2). La mezcla se realizó en condiciones estériles. Véase la Figura 1 para una representación del núcleo dentro de la cápsula 3.

Generación de segmentos de nanofibra

Usando un aparato de electrohilado habitual (véase la figura 2) se produjo una malla no tejida de ácido poliláctico-coglicólico [PLGA] (figura 3). Como ejemplo, una solución de electrohilado de polímero PLGa al 6 % en peso (Purac) disuelto en hexafluoroisopropanol (HFIP) se mezcló con una solución acuosa de 20 microgramos de factor de crecimiento liofilizado en 333 microlitros de TRIS 5 mM (pH 7,6) que contenía albúmina de suero bovino al 0,1 %). La solución se cargó en una jeringa de polipropileno que estaba conectada a un tubo de extremo romo de acero inoxidable de calibre 21 mediante un tubo de PTFE. El tubo estaba conectado a un suministro de alto voltaje. La temperatura de la solución de electrohilado se mantuvo por debajo de 37 °C. El ambiente entre la solución de electrohilado de la aguja de electrohilado se controló de modo que la humedad relativa y la temperatura ambiente no variaran. Los valores habituales fueron una RH de un 60 % y una temperatura de 25 °C. Un tambor colector giratorio que tenía una superficie conductora se colocó a una distancia de 300 mm del extremo abierto del tubo de acero inoxidable. La superficie del tambor se polarizó a un voltaje entre 0 kV y -12,5 kV. El tubo de acero inoxidable se polarizó entre 10 kV y 30 kV. La solución de electrohilado se bombeó a una tasa controlada (1 ml/hora) a través del tubo. Las fuerzas electrostáticas que actúan sobre la solución que emergen del extremo del tubo provocaron la formación de un cono y un chorro. Las propiedades reológicas y el peso molecular del PLGA dieron como resultado un entrelazamiento ya que se perdió el disolvente de la superficie de la solución. Esto dio como resultado la formación de fibras. La densidad de carga electrostática aumentó a medida que la fibra se movía hacia el tambor colector. Las fuerzas electrostáticas que surgen causaron una extensión de alargamiento de la fibra de modo que se pudieron producir fibras micrométricas y nanométricas. Hubo un vuelo aleatorio de la fibra entre el tubo y el colector y esto dio como resultado la colocación de una malla de nanofibras aleatoria del colector giratorio. Tras un tiempo definido, la malla se retiró y se dejó secar para asegurar que se retiraran todos los disolventes. A continuación se aplicó un PEG y/o solución de PEG y se dejó secar. Se controló la proporción de peso del PEG y/o polímero de PEG con respecto al peso de la nanofibra. A continuación la malla seca se sometió a criomolienda para crear partículas infundidas con fibras cortas (figura 4).

Generación del material de cápsula

A continuación el material de cápsula se formó disolviendo las partículas producidas en agua para crear la formulación de material de cápsula. Para un polímero de PEO con un peso molecular de 2.000.000 de PEO se usó una proporción de un 2 % en peso de partículas con respecto al agua.

Encapsulación del núcleo con el material de cápsula.

Usando un aparato de electropulverización, el material de núcleo 1 y el material de cápsula 3 se liberaron/pulverizaron en un recipiente sobre vapor de nitrógeno líquido. El aparato de electropulverización tenía un tubo de administración concéntrico 4 de modo que los dos materiales se suministrarán juntos (véase la figura 5). La electrostática y la pérdida de disolvente crearon una estructura de partículas de núcleo-cubierta antes de que la cápsula pasara a través de un vapor de nitrógeno líquido. El resultado fue un polvo de criobiocápsula. El polvo de las cápsulas se mantuvo en un estado de crioconservación en vapor de nitrógeno líquido con fines de almacenamiento. Adición de la cápsula al sustrato (figura 6)

En esta etapa se creó un lecho fluidizado 5 del polvo de la biocápsula suspendiendo el polvo en vapor de nitrógeno líquido de flujo forzado. A continuación se extrajeron muestras del vapor que contenían algunas cápsulas y se combinaron con aire caliente usando un efecto Venturi. El aire caliente provocó un calentamiento controlado en el tubo de administración de las cápsulas para asegurar la administración por encima de 0 °C. Usando un tubo de PTFE de calibre liso y una aguja de PTFE, las cápsulas se depositaron a continuación en una bandeja 6 de PTFE con temperatura controlada y se dejaron descongelar. Se depositaron dos juegos de cápsulas en capas individuales en zonas distintas del ensayo. En esta etapa, pero usando un sistema de administración diferente, las cápsulas de PTFE 8 (figura 7) se añadieron a la bandeja alrededor de las cápsulas 10.

Exponer la cápsulas a los agentes bioactivantes (figura 8).

Usando un tercer sistema de administración, un agente bioactivo A en una solución acuosa se irrigó sobre el primer grupo de cápsulas y una solución acuosa con el agente bioactivo B se irrigó sobre el segundo grupo de cápsulas. El proceso de añadir las cápsulas al sustrato y añadir el PTFE y añadir el agente bioactivo se repitió (Figura 9) hasta que se crearon apilamientos 12 de los dos conjuntos de cápsulas.

A continuación las partículas de PTFE se retiraron y se añadió medio de cultivo. A continuación se añadió el medio de cultivo y las cápsulas se desintegraron dejando solo los dos grupos de células activadas diferencialmente.

Véase la Figura 10 para el biorreactor de tejido/órgano resultante, que a continuación se cultiva para producir el tejido/órganos requeridos (figura 11).

Claims (30)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso de superposición multicelular, comprendiendo el proceso las etapas de:

a) formar un material de núcleo (2),

b) formar un material de cápsula (3),

c) encapsular el núcleo (2) con el material de cápsula (3),

d) añadir la cápsula (3) a un sustrato, y

e) exponer la cápsula (3) a al menos un agente bioactivante,

caracterizándose el proceso de superposición multicelular por que el material de cápsula (3) comprende un polímero soluble en agua, un componente fibroso, y un disolvente, y en donde el núcleo (2) comprende una o más células de mamífero (1), medio de cultivo celular y un hidrogel.

2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el método comprende formar una pluralidad de cápsulas (3), añadir una pluralidad de cápsulas (3) a un sustrato y exponer la pluralidad de cápsulas (3) a al menos un agente bioactivante.

3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las células (1) son células madre.

4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el medio de cultivo celular comprende medio de crecimiento selectivo, factor de crecimiento o tampón.

5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el hidrogel comprende cualquiera de gelatina, polietilenglicol, glicerol, alginato, dextrano-40, trehalosa, o DMSO.

6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el núcleo (2) comprende además al menos un agente bioactivante seleccionado entre el grupo que consiste en factores de crecimiento, inhibidores de crecimiento, agentes antimicrobianos o agentes antiinflamatorios.

7. Un proceso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde la etapa de formar el núcleo (2) comprende combinar una o mas células de mamífero (1), al menos un agente bioactivante, medio de cultivo celular y un hidrogel.

8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polímero soluble en agua comprende óxido de polietileno y/o polietilenglicol.

9. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el componente fibroso comprende nanofibras bioactivas criomolidas, fibras molidas criosónicas, o fibras cortadas litográficas.

10. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde las fibras comprenden polímeros naturales y/o sintéticos.

11. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde los polímeros naturales comprenden colágeno reticulado o ácido hialurónico reticulado.

12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde los polímeros sintéticos comprenden ácidos polilactida glicólicos, ácido poliláctico, ácido poliglicólico o policapralactona.

13. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde el componente fibroso se infunde con una enzima.

14. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en donde el componente fibroso se infunde con un absorbente electromagnético.

15. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el disolvente comprende cualquiera de agua o disolventes orgánicos.

16. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en donde el material de cápsula (3) comprende además al menos un agente bioactivante seleccionado entre el grupo que consiste en factores de crecimiento, inhibidores de crecimiento, agentes antimicrobianos o agentes antiinflamatorios.

17. Un proceso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde la etapa de encapsular el núcleo (2) con el material de cápsula (3) comprende electropulverizar tanto los núcleos formados como el material de cápsula (3) concéntricamente en una torre de caída enfriada criogénicamente.

18. Un proceso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde la etapa de añadir la cápsula (3) al sustrato se realiza en un proceso de fabricación aditiva.

19. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el proceso de fabricación aditiva es cualquiera de sinterización a alta velocidad, impresión por chorro de tinta, impresión PolyJet, pulverización, deposición de alta resolución, pulverización, distribución mediante jeringa, electropulverización en campo cercano o chorro de aerosol.

20. Un proceso de acuerdo con las reivindicaciones 17 o 18, en donde la etapa de adición comprende además la deposición de una barrera sobre el sustrato.

21. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la barrera comprende partículas hidrófobas secas.

22. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 21, en donde las partículas hidrófobas comprenden partículas de PTFE.

23. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 21 o la reivindicación 22, en donde la deposición de partículas hidrófobas secas sobre el sustrato es mediante cualquiera de sinterización a alta velocidad, impresión por chorro de tinta, impresión PolyJet, pulverización, deposición de alta resolución, pulverización, distribución mediante jeringa, electropulverización en campo cercano o chorro de aerosol.

24. Un proceso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde la etapa de exponer la cápsula (3) a al menos un agente bioactivante comprende irrigar las cápsulas (3) con una solución acuosa que comprende uno o más agentes bioactivantes.

25. Un proceso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde la exposición se realiza mediante cualquiera de sinterización a alta velocidad, impresión por chorro de tinta, impresión PolyJet, pulverización, deposición de alta resolución o chorro de aerosol.

26. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 24 o 25, en donde los uno o más agentes bioactivantes se seleccionan entre el grupo que consiste en factores de crecimiento, inhibidores de crecimiento, agentes antimicrobianos o agentes antiinflamatorios.

27. Un proceso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde las etapas d) y e) se repiten consecutivamente en orden para superponer una matriz tridimensional de cápsulas (3).

28. Un proceso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde las cápsulas (3) formadas tienen entre 20 pm y 50 pm de diámetro.

29. Un proceso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde una pluralidad de cápsulas (3) que comprenden tipos de células programadas para producir un primer tipo de tejido se colocan sobre el sustrato adyacente a una pluralidad de cápsulas (3) que comprenden tipos de células programadas para producir un segundo tipo de tejido.

30. Un proceso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde el núcleo (2), el material de cápsula (3) o el componente fibroso comprende además un absorbente de infrarrojo cercano.