ES2895969T3 - Derivados de [1,2,4]triazolo como inhibidores de PDE1 para el tratamiento de diabetes - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula: **(Ver fórmula)** en donde X es CH2CH2, CH2CH2CH2, OCH2 o CH2O; y R es etilo, n-propilo, ciclopropilo o ciclobutilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; con la condición de que cuando X es CH2CH2, entonces R es distinto de ciclopropilo.

Description

DESCRIPCIÓN

Derivados de [1,2,4]triazolo como inhibidores de PDE1 para el tratamiento de diabetes

La presente invención se refiere a determinados inhibidores de PDE1 humana, a composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos, a métodos para usar los compuestos para tratar trastornos fisiológicos y a productos intermedios y procesos útiles en la síntesis de los compuestos.

Las fosfodiesterasas (PDE) son enzimas que regulan los niveles celulares de AMPc y GMPc controlando la velocidad a la que se hidrolizan estos nucleótidos cíclicos. PDE1, una PDE dependiente de calcio y calmodulina, es una de al menos 11 familias de PDE conocidas. La PDE1 se expresa en muchos tejidos, incluyendo el cerebro, corazón, pulmón, riñón y músculo liso. Además, la PDE1 está comprendida por una familia de tres isoformas conocidas, PDE1A, PDE1B y PDE1C.

Los pacientes que padecen diabetes a menudo desarrollan una forma de enfermedad renal crónica denominada enfermedad renal diabética (o nefropatía diabética). Se ha estimado que la enfermedad renal diabética puede afectar tanto como al 40 por ciento de los pacientes diabéticos. Las opciones de tratamiento para la enfermedad renal diabética son limitadas e incluyen el uso de medicaciones que reducen la presión sanguínea, control de los niveles de glucosa en sangre, dieta y peso e implementación de actividad física regular. Por lo tanto, existe la necesidad de opciones de tratamiento adicionales para los pacientes que padecen enfermedad renal crónica, particularmente enfermedad renal diabética.

La Patente de Estados Unidos N.° 9.175.010 desvela determinadas azolopirimidin-5-(6H)-onas condensadas con tiofeno, furano y piridina que son inhibidores de PDE1, y más particularmente, PDE1B, siendo útiles para el tratamiento de diversos trastornos fisiológicos, incluyendo trastornos neurológicos, cardiovasculares y renales. Además, la Patente europea N.° 0 040 401 desvela determinadas triazoloquinoxalin-4-onas sustituidas que poseen actividad antihipertensiva.

La presente invención proporciona determinados compuestos novedosos que son inhibidores de la PDE1 humana. Además, la presente invención proporciona determinados compuestos novedosos que son inhibidores selectivos de PDE1A, PDE1B y PDE1C humanas con respecto a otras PDE humanas, tales como PDE3A, PDE4D y PDE6AB. Adicionalmente, la presente invención proporciona determinados compuestos novedosos que pueden tener efectos antihipertensivos y también pueden mejorar el flujo sanguíneo renal. Además, los compuestos de la presente invención pueden reducir la fibrosis renal.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula I:

en donde X es CH2CH2, CH2CH2CH2, OCH2 o CH2O; y

R es etilo, n-propilo, ciclopropilo o ciclobutilo;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; con la condición de que cuando X es CH2CH2, entonces R es distinto de ciclopropilo.

Las referencias a los métodos de tratamiento en los párrafos siguientes de esta memoria descriptiva se deben interpretar como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

La presente invención también proporciona un método para tratar una enfermedad renal crónica en un paciente, que comprende administrar a un paciente que necesita dicho tratamiento una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula

La presente invención también proporciona un método para tratar una enfermedad renal diabética en un paciente, que comprende administrar a un paciente que necesita dicho tratamiento una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula La presente invención también proporciona un método para tratar la hipertensión en un paciente, que comprende administrar a un paciente que necesita dicho tratamiento una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I.

Además, la invención proporciona un compuesto de fórmula I para su uso en terapia. La invención proporciona además un compuesto de fórmula I para su uso en el tratamiento de la enfermedad renal crónica. Además, la invención proporciona un compuesto de fórmula I para su uso en el tratamiento de la enfermedad renal diabética. Además, la invención proporciona un compuesto de fórmula I para su uso en el tratamiento de la hipertensión. Asimismo, la invención proporciona el uso de un compuesto de fórmula I para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad renal crónica. Asimismo, la invención proporciona el uso de un compuesto de fórmula I para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad renal diabética. La invención proporciona además el uso de un compuesto de fórmula I para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la hipertensión.

La invención proporciona además una composición farmacéutica, que comprende un compuesto de fórmula I con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. La invención proporciona además un proceso para preparar una composición farmacéutica, que comprende mezclar un compuesto de fórmula I con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. Esta invención también incluye nuevos productos intermedios y procesos para la síntesis del compuesto de fórmula I.

Como se usan en el presente documento, los términos "tratando", "tratamiento" o "tratar" incluyen prohibir, restringir, ralentizar, detener o revertir el avance o gravedad de un síntoma o trastorno existente.

Como se usan en el presente documento, el término "paciente" se refiere a un mamífero, tal como un perro o un ser humano, siendo el paciente preferido un ser humano.

Como se usan en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad o dosis de compuesto de la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que, tras la administración de una dosis única o múltiple al paciente, proporciona el efecto deseado en el paciente en diagnóstico o tratamiento.

Un experto en la técnica puede determinar con facilidad una cantidad eficaz usando técnicas conocidas y observando los resultados obtenidos en circunstancias análogas. Al determinar la cantidad eficaz para un paciente, un experto en la técnica considera una cantidad de factores, que incluyen, pero no se limitan a: el tamaño, la edad y la salud general del paciente; la enfermedad o trastorno específico implicado; el grado de o la afectación o la gravedad de la enfermedad o trastorno; la respuesta del paciente individual; el compuesto particular administrado; el modo de administración; las características de biodisponibilidad de la preparación administrada; la posología seleccionada; el uso de medicación simultánea y otras circunstancias relevantes.

Los compuestos de la presente invención son eficaces a una dosis por día que está dentro del intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal. En algunos casos, los niveles de dosificación por debajo del límite inferior del intervalo antes mencionado pueden ser más que adecuados, mientras que en otros casos pueden emplearse dosis aún mayores con efectos secundarios aceptables y, por lo tanto, el intervalo de dosificación anterior no pretende limitar en modo alguno el alcance de la invención.

Los compuestos de la presente invención se formulan en forma de composiciones farmacéuticas administradas por cualquier vía que hace biodisponible el compuesto, incluyendo las vías oral y parenteral. Más preferentemente, dichas composiciones son para administración oral. Dichas composiciones farmacéuticas y los procesos para preparar las mismas se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, L.V. Allen, Editor, 22a edición, Pharmaceutical Press, 2012).

Los compuestos de fórmula I son particularmente útiles en los métodos de tratamiento de la invención, pero se prefieren ciertos grupos, sustituyentes y compuestos. Los párrafos siguientes describen dichos grupos, sustituyentes y compuestos preferidos. Se entenderá que estas preferencias son aplicables tanto a los métodos de tratamiento como a los nuevos compuestos de la invención.

Se prefiere que X sea CH2O.

Se prefiere que X sea OCH2.

Se prefiere que R sea n-propilo o ciclopropilo.

Se prefiere que los compuestos de fórmula I estén en la forma de base libre.

Se prefiere más que R sea ciclopropilo.

Los compuestos de fórmula Ia (X es OCH2 y R es ciclopropilo) y fórmula Ib (X es CH2O y R es ciclopropilo):

y las sales farmacéuticamente aceptables son las más preferidas siendo las bases libres correspondientes más preferidas.

Una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto de la invención se puede formar, por ejemplo, por la reacción de una base libre apropiada del compuesto de la invención y un ácido aceptable farmacéuticamente apropiado en un disolvente adecuado en condiciones estándar bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); y Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977).

Determinadas abreviaturas se definen de la siguiente manera: "ACN" se refiere a acetonitrilo; "AcOH" se refiere a ácido acético glacial; "CAS #" se refiere a "número de registro del Chemical Abstracts Service; "c-Bu" se refiere a ciclobutilo; "c-Pro" se refiere a ciclopropilo; "d" se refiere a día o días; "DBU" se refiere a 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno; "N.° Cat." se refiere a número de catálogo; "DCE" se refiere a 1,2-dicloroetano; "DCM" se refiere a diclorometano o cloruro de metileno; "DIPEA" se refiere a N,N-diisopropiletilamina; "DMF" se refiere a N,N-dimetilformamida; "DMSO" se refiere a dimetilsulfóxido; "EDCI" se refiere a 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida; "ES/MS" se refiere a espectrometría de masas por electropulverización; "EtOAc" se refiere a acetato de etilo; "Et2O" se refiere a éter dietílico; "EtOH" se refiere a etanol; "GCMS" se refiere a cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas; "HMDS" se refiere a hezametildisilazano; "HOBT" se refiere a hidroxibenzotriazol; "h" se refiere a hora u horas; "CI50" se refiere a la concentración de un agente que produce el 50 % de la respuesta inhibidora máxima posible para ese agente; "IPA" se refiere a isopropanol o alcohol isopropílico; "LC-ES/MS" se refiere a espectrometría de masas por cromatografía líquida y electropulverización; "pmol" se refiere a micromol o micromoles; "min" se refiere a minutos o minutos; "MeOH" se refiere a metanol o alcohol metílico; "MTBE" se refiere a metil-terc-butil éter; "NiNTA" se refiere a cromatografía con una fase estacionaria de agarosa funcionalizada con ácido nitrilotriacético como quelante; "POCb" se refiere a oxicloruro de fósforo; "RaNi" se refiere a níquel Raney; "TA" se refiere a temperatura ambiente; "SD" se refiere a desviación estándar; "SNAr" se refiere a sustitución aromática nucleófila; "TEA" se refiere a trietilamina; "TFA" se refiere a ácido trifluoroacético; "TFAA" se refiere a anhídrido trifluoroacético; "THF" se refiere a tetrahidrofurano; "Tris" se refiere a 2-amino-2-hidroximetil-propan-1,3-diol; "U/ ml" se refiere a unidades por mililitro; "wt" se refiere a peso.

Los compuestos de la presente invención se pueden preparar mediante diversos procedimientos conocidos por un experto habitual en la técnica, algunos de los cuales se ilustran en los esquemas, preparaciones y ejemplos a continuación. Un experto habitual en la técnica reconoce que las etapas sintéticas específicas para cada una de las rutas descritas pueden se combinar de diferentes formas o junto con etapas de esquemas diferentes, para preparar compuestos de la invención. Los productos de cada etapa en los esquemas siguientes pueden recuperarse mediante métodos convencionales bien conocidos en la técnica, que incluyen extracción, evaporación, precipitación, cromatografía, filtración, triturado y cristalización. En los esquemas siguientes, todos los sustituyentes, salvo que se indique lo contrario, son como se ha definido anteriormente. Los reactivos y materiales de partida están disponibles con facilidad para un experto habitual en la técnica. Sin limitar el alcance de la invención, los esquemas, preparaciones y ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar más la invención.

Esquema 1

El esquema 1 representa la síntesis de los compuestos de fórmula I (X = CH2CH2, R = CH2CH3, (CH²)²CH³). En el esquema 1, etapa A, aproximadamente 1 equivalente de etil-2-(alilamino)-2-oxo-acetato se condensa con aproximadamente 1,05 equivalentes de 2-aminociclohexanol en presencia de aproximadamente 1,1 equivalentes de una base orgánica no nucleófila adecuada tal como TEA en un disolvente orgánico polar tal como EtOH con calentamiento. El producto puede aislarse utilizando técnicas convencionales bien conocidas en este campo, tales como filtración. Por ejemplo, la mezcla de reacción se enfría y el precipitado resultante se recoge por filtración, con lavado posterior con un disolvente orgánico adecuado tal como EtOAc o Et2O y secado al vacío, para proporcionar N-alil-N'-(2-hidroxiciclohexil)oxamida, el producto del esquema 1, etapa A, en forma de una mezcla de isómeros cis y trans de pureza suficiente para su uso posterior sin más purificación.

En el esquema 1, etapa B, N-alil-N'-(2-hidroxiciclohexil)oxamida, el producto del esquema 1, etapa A, puede oxidarse en condiciones bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, aproximadamente 1 equivalente de N-alil-N'-(2-hidroxiciclohexil)oxamida se disuelve en una mezcla de disolventes orgánicos adecuada, tal como THF y DCM y se trata con aproximadamente 1,1 equivalentes de peryodinano de Dess-Martin en presencia de un exceso de una base inorgánica adecuada tal como NaHCO³ a 0 °C. Después de calentar a temperatura ambiente, el producto puede aislarse utilizando técnicas convencionales bien conocidas en este campo, tales como extracción y purificación por métodos cromatográficos. Más específicamente, la mezcla de reacción se inactiva con tiosulfato de sodio acuoso y NaHCO³ acuoso saturado. La mezcla de reacción se extrae con un disolvente orgánico adecuado tal como DCM, los extractos orgánicos combinados se secan sobre un agente secante adecuado tal como Na²SO⁴ , se filtran y se concentran hasta su sequedad. El producto en bruto se somete a purificación sobre sílice usando una mezcla adecuada de disolventes orgánicos, tal como hexanos/EtOAc, para proporcionar el producto del esquema 1, etapa B, N-alil-N'-(2-oxociclohexil)oxamida.

En el esquema 1, etapa C, aproximadamente 1 equivalente de N-alil-N'-(2-oxociclohexil)oxamida, el producto del esquema 1, etapa B, se cicla en condiciones de deshidratación térmica en presencia de una mezcla de aproximadamente 1,1 equivalentes de TFA y 1,1 equivalentes de TFAA en un disolvente ácido adecuado tal como ácido acético glacial. El producto puede aislarse utilizando técnicas convencionales bien conocidas en este campo, tales como evaporación y purificación por métodos cromatográficos. Más específicamente, la mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente y se evapora a presión reducida. El producto en bruto se somete a purificación sobre sílice usando una mezcla adecuada de disolventes orgánicos, tal como MeOH/EtOAc, para proporcionar el producto del esquema 1, etapa C, 4-alil-5,6,7,8-tetrahidro-1H-quinoxalin-2,3-diona.

En el esquema 1, etapa D, aproximadamente 1 equivalente del producto del esquema 1, etapa C, 4-alil-5,6,7,8-tetrahidro-1H-quinoxalin-2,3-diona, se trata con un agente de cloración adecuado, tal como POCl³ y se somete a calentamiento en un disolvente orgánico adecuado, tal como DCE. La mezcla de reacción se concentra a presión reducida después de enfriar a temperatura ambiente para proporcionar el producto del esquema 1, etapa D, 1-alil-3-cloro-3,4,5,6,7,8-hexahidroquinoxalin-2-ona, adecuado para su uso posterior sin más purificación.

En el esquema 1, etapa E, aproximadamente 1 equivalente de 1-alil-3-cloro-3,4,5,6,7,8-hexahidroquinoxalin-2-ona, el producto del esquema 1, etapa D, se calienta con aproximadamente 5 equivalentes de hidracina en un disolvente orgánico polar adecuado tal como EtOH. El producto puede aislarse utilizando técnicas convencionales bien conocidas en este campo, tales como extracción. Más específicamente, la mezcla de reacción se enfría y se concentra a presión reducida, se divide entre agua y un disolvente orgánico adecuado, tal como DCM y se separan las fases. El extracto orgánico se seca sobre Na²SO⁴ , se filtra y se concentra a presión reducida para obtener 1-alil-3-hidracino-5,6,7,8-tetrahidroquinoxalin-2-ona, el producto del esquema 1, etapa E, adecuado para su uso posterior sin más purificación.

En el esquema 1, etapa F, el producto del esquema 1, etapa E puede acoplarse a un ácido usando diversas técnicas de acoplamiento de amidas bien conocidas en este campo. Por ejemplo, aproximadamente 1 equivalente de 1-alil-3-hidracino-5,6,7,8-tetrahidroquinoxalin-2-ona, el producto de la etapa E, se disuelve en un disolvente orgánico adecuado, tal como DMF y se trata con aproximadamente 1,7 equivalentes de un reactivo de acoplamiento de amida adecuado, tal como HATU o TBTU y 1,7 equivalentes de un ácido carboxílico adecuado, tal como ácido 1-ciclopropilciclopropanocarboxílico (véase Eur. J. Org Chem., 2010, págs. 3295-3301), en presencia de 3,5-5 equivalentes de una base orgánica no nucleófila adecuada tal como TEA o DIPEA. El producto puede aislarse utilizando técnicas convencionales bien conocidas en este campo, tales como extracción. Más específicamente, la mezcla de reacción se diluye con EtOAc, se lava secuencialmente con NaHCO³ acuoso saturado y NaCl acuoso saturado, se seca sobre Na²SO⁴ , se filtra y se concentra a presión reducida para obtener N'-(4-alil-3-oxo-5,6,7,8-tetrahidroquinoxalin-2-il)-1-ciclopropil-ciclopropanocarbohidracida, el producto del esquema 1, etapa F, que se puede llevar adelante para su uso en la etapa siguiente sin más purificación.

En el esquema 1, etapa G, N'-(4-alil-3-oxo-5,6,7,8-tetrahidroquinoxalin-2-il)-1-ciclopropil-ciclopropanocarbohidracida, el producto del esquema 1, etapa F, puede ciclarse en condiciones térmicas o de microondas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, la N'-(4-alil-3-oxo-5,6,7,8-tetrahidroquinoxalin-2-il)-1-ciclopropilciclopropanocarbohidrazida se disuelve en un ácido orgánico adecuado, tal como AcOH y se calienta en un reactor de microondas. El producto puede aislarse utilizando técnicas convencionales bien conocidas en este campo, tales como métodos cromatográficos. Más específicamente, la mezcla de reacción se concentra a presión reducida y el producto en bruto se somete a cromatografía sobre sílice, usando una mezcla de disolventes orgánicos adecuada, tal como hexanos/EtOAc, para obtener 5-alil-1-(1-ciclopropilciclopropil)-6,7,8,9-tetrahidro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4-ona, el producto del esquema 1, etapa G.

En el esquema 1, etapa H, 5-alil-1-(1-ciclopropilciclopropil)-6,7,8,9-tetrahidro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4-ona, el producto del esquema 1, etapa G, se puede desalilar en diversas condiciones bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, aproximadamente 1 equivalente de 5-alil-1-(1-ciclopropilciclopropil)-6,7,8,9-tetrahidro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4-ona se disuelve en un disolvente orgánico desgasificado adecuado tal como DCM. La solución se trata con aproximadamente 3 equivalentes de ácido N,N-dimetilbarbitúrico y aproximadamente 0,2 equivalentes de tetraquis(trifenilfosfina)paladio con calentamiento. El producto puede aislarse utilizando técnicas convencionales bien conocidas en este campo, tales como métodos cromatográficos. Más específicamente, la mezcla de reacción se concentra a presión reducida y el resto resultante se somete a cromatografía en columna de fase inversa, usando una mezcla adecuada de agua tamponada y fases móviles orgánicas, tal como ACN que contiene aproximadamente TFA al 0,1 % y agua que contiene aproximadamente TFA al 0,1 %, para obtener 1-(1-ciclopropilciclopropil)-6,7,8,9-tetrahidro-5H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4-ona, el producto del esquema 1, etapa H.

En el esquema 1, etapa I, el producto del esquema 1, la etapa H puede alquilarse en diversas condiciones de alquilación convencionales bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, aproximadamente 1 equivalente de 1-(1-ciclopropilciclopropil)-6,7,8,9-tetrahidro-5H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4-ona, el producto de la etapa H, se disuelve en un disolvente orgánico adecuado, tal como DMF y se trata con aproximadamente 3 equivalentes de una base orgánica fuerte adecuada, tal como LHMDS, a temperatura ambiente o por debajo de ella. La mezcla de reacción posterior se trata con una mezcla de aproximadamente 3 equivalentes de un agente de alquilación apropiado, tal como yoduro de N-butilo. El producto puede aislarse utilizando técnicas convencionales bien conocidas en este campo, tales como dilución seguida de métodos cromatográficos. Más específicamente, la mezcla de reacción se diluye con un disolvente orgánico adecuado tal como EtOAc, se lava con NaCl acuoso saturado, se seca sobre Na²SO⁴ , se filtra y se concentra a presión reducida. El producto en bruto se purifica mediante cromatografía sobre sílice, usando un disolvente orgánico polar adecuado tal como EtOAc, para obtener el compuesto de fórmula I (X = CH2CH2, R = (CH²)²CH³), 5-butil-1-(1-ciclopropilciclopropil)-6,7,8,9-tetrahidro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4(5H)-ona, el producto del esquema 1, etapa I.

En el esquema 1, etapa J, el alqueno en el producto del esquema 1, etapa G, se puede reducir con una diversidad de métodos bien conocidos en la técnica, tales como hidrogenación. Por ejemplo, aproximadamente 1 equivalente de 5-alil-1-(1-cidopropilcidopropil)-6,7,8,9-tetrahidro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4-ona, el producto de la etapa G, se puede someter a atmósfera de hidrógeno a aproximadamente 413,685 kPa (60 psi) a temperatura ambiente en un disolvente polar apropiado, tal como EtOAc, en presencia de un metal reductor adecuado, tal como Pd/C o níquel Raney, durante aproximadamente 1 h. El producto puede aislarse utilizando técnicas convencionales bien conocidas en este campo, tales como filtración, evaporación y cromatografía. Más específicamente, la mezcla de reacción se puede filtrar y concentrar el filtrado a presión reducida. El producto en bruto resultante se purifica por cromatografía sobre sílice, usando un disolvente orgánico polar adecuado tal como EtOAc, para proporcionar el compuesto de fórmula I (X = CH2CH2, R = CH2CH3), 1-(1-ciclopropilciclopropil)-5-propil-6,7,8,9-tetrahidro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4(5H)-ona, el producto del esquema 1, etapa J.

Esquema 2

El esquema 2 representa la síntesis de 5-substituida-1-([1,1'-bi(ciclopropan)]-1-il-5,6,7,9-tetrahidro-4H-pirano[4,3-e][1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-4-onas (Fórmula I, X = OCH2, R = (CH²)²CH³ , c-Pro, c-Bu). En el esquema 2, etapa A, aproximadamente 1 equivalente de 3-aminotetrahidropiran-4-ol se condensa con aproximadamente 1 equivalente de un 2-amino-2-oxo-acetato de etilo N-sustituido en un disolvente orgánico polar, tal como EtOH, a reflujo durante aproximadamente 4 h. El producto puede aislarse utilizando técnicas convencionales bien conocidas en este campo, tales como filtración. Por ejemplo, la mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente y los sólidos resultantes se recogen por filtración, se lava con EtOH y se seca al vacío, para proporcionar N-sustituida-N'-(4-hidroxitetrahidropiran-3-il)oxamida.

En el esquema 2, etapas B y C, la oxidación de la N-sustituida-N'-(4-hidroxitetrahidropiran-3-il)oxamida, producto del esquema 2, etapa A y la posterior ciclación para proporcionar la 4,5,7,8-tetrahidropirano[3,4-b]pirazin-2,3-diona sustituida de forma apropiada se pueden llevar a cabo de forma similar a la descrita en el esquema 1, etapas B y C.

En el esquema 2, etapa D, aproximadamente 1 equivalente de la 4,5,7,8-tetrahidropirano[3,4-b]pirazin-2,3-diona sustituida de forma apropiada se puede combinar en exceso de hidrazina hidrato y la mezcla resultante se puede calentar térmicamente o someterse a irradiación con microondas. El producto puede aislarse utilizando técnicas convencionales bien conocidas en este campo, tales como dilución y extracción. Por ejemplo, la mezcla de reacción se diluye con agua y se extrae con una mezcla adecuada de disolventes orgánicos, tal como aproximadamente 3:1 de CHCl³/isopropanol. Los extractos se combinan, se lavan con NaCl acuoso saturado, se seca sobre MgSO⁴ , se filtra y se evapora a sequedad a presión reducida para proporcionar la 1-substituida-3-hidrazino-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-2-ona apropiada.

En el esquema 2, etapa E, la acilación de la 1-substituida-3-hidrazino-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-2-ona apropiada se puede conseguir con una diversidad de condiciones de acoplamiento de amida bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, aproximadamente 1 equivalente de 1-sustituida-3-hidrazino-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-2-ona se puede tratar con aproximadamente 1,5 equivalentes de ácido 1-ciclopropilciclopropanocarboxílico en presencia de aproximadamente 1,6 equivalentes de cada uno de HOBT y EDCI y aproximadamente 3 equivalentes de una base orgánica no nucleófila, tal como TEA o DIPEA, en un disolvente orgánico polar adecuado, tal como DMF o DMSO, a temperatura ambiente. El producto puede aislarse utilizando técnicas convencionales bien conocidas en este campo, tales como dilución y extracción. Más específicamente, la mezcla de reacción se diluye con agua, se extrae con un disolvente orgánico adecuado, tal como EtOAc o DCM y los extractos se lavan secuencialmente con LiCl acuoso al 10 % aproximadamente y NaCl acuoso saturado, se secan sobre Na²SO⁴ , se filtran y se concentran a presión reducida, para proporcionar el producto del esquema 2, etapa E, adecuado para su uso sin más purificación.

En el esquema 2, etapa F, la ciclación del producto del esquema 2, etapa E se puede realizar térmicamente en un disolvente básico, no nucleófilo, tal como HMDS que contiene una base no nucleófila tal como DIPEA o DBU. Por ejemplo, aproximadamente 1 equivalente del producto del esquema 2, etapa E se puede calentar en exceso de HMDS que contiene aproximadamente 0,2-0,8 equivalentes de DBU a aproximadamente 120 °C durante una noche. El producto puede aislarse utilizando técnicas convencionales bien conocidas en este campo, tales como cromatografía. Más específicamente, la mezcla de reacción se inactiva con MeOH y se calienta a aproximadamente 50 °C durante 90 min y la mezcla se concentra a presión reducida. El residuo resultante se purifica por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice usando una mezcla disolvente orgánica adecuada, tal como EtOAc/DCM y DCM/MeOH, para proporcionar el compuesto de fórmula 1 (X = OCH2, R = (CH²)²CH³ , c-Pro, c-Bu), 5-sustituida-1-([1,1'-bi(ciclopropan)]-1-il-5,6,7,9-tetrahidro-4H-pirano[4,3-e][1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-4-ona, el producto del esquema 2, etapa F.

Esquema 3

El esquema 3 representa la síntesis de 5-sustituida-1-([1,1'-bi(ciclopropan)]-1-il-8,9-dihidro-6H-pirano[3,4-e][1,2,4]triazoplo[4,3-a]pirazin-4(5H)-ona (Fórmula I, X = CH2O, R = c-Pro, (CH2)2c Hs). El esquema 3, etapa A, se puede realizar de manera similar a la descrita en el esquema 2, etapa A, para proporcionar la N-sustituida-N'-3-hidroxitetrahidropiran-4-il)oxamida, el producto del esquema 3, etapa A.

La posterior oxidación, en el esquema 3, etapa B, se puede realizar de manera similar a la descrita en el esquema 2, etapa B, para proporcionar la N-sustituida-N'-(3-oxotetrahidropiran-4-il)oxamida, el producto del esquema 3, etapa B.

En el esquema 3, etapa C, la ciclación de la N-sustituida-N'-(3-oxotetrahidropiran-4-il)oxamida, el producto del esquema 3, etapa B, a la 4-sustituida-1,5,7,8-tetrahidropirano[3,4-b]pirazin-2,3-diona, el producto del esquema 3, etapa C, se puede realizar de manera similar a la descrita en el esquema 2, etapa C.

En el esquema 3, etapa D, la cloración de la 4-sustituida-1,5,7,8-tetrahidropirano[3,4-b]pirazin-2,3-diona, el producto del esquema 3, etapa C, se puede realizar como se describe en el esquema 1, etapa D, para proporcionar la 4-sustituida-2-cloro-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-3-ona, el producto del esquema 3, etapa D.

En el esquema 3, etapa E, la conversión de la 4-sustituida-2-cloro-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-3-ona, el producto del esquema 3, etapa D, a la 4-sustituida-2-hidrazino-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-3-ona, el producto del esquema 3, etapa E (R = c-Pro), se puede realizar de manera similar a la descrita en el esquema 2, etapa D.

En el esquema 3, etapa F, la acilación de la 4-sustituida-2-hidrazino-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-3-ona, el producto del esquema 3, etapa E (R = c-Pro), se puede realizar de manera similar a la descrita en el esquema 2, etapa E, para proporcionar la N'-(4-sustituida-3-oxo-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-2-il)-1-ciclopropilciclopropancarbohidrazida, el producto del esquema 3, etapa F (R = c-Pro).

Como alternativa, en el esquema 3, etapa G, la 4-sustituida-2-cloro-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-3-ona, el producto del esquema 3, etapa D (R = (CH²)²CH³), se puede calentar con clorhidrato de 1-ciclopropilciclopropanocarbohidrazida en un disolvente orgánico apropiado, tal como ACN y se sometió a irradiación por microondas, para obtener N'-(4-sustituida-3-oxo-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-2-il)-1-ciclopropilciclopropancarbohidrazida, el producto del esquema 3, etapa G (R = c-Pro). Por ejemplo, aproximadamente 1 equivalente de 4-butil-2-cloro-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-3-ona, el producto del esquema 3, etapa D (R = (CH²)²CH³), se irradia en presencia de aproximadamente 0,95 equivalentes de clorhidrato de 1-ciclopropilciclopropanocarbohidrazida en ACN a aproximadamente 100 °C durante aproximadamente 1 h. El producto puede aislarse utilizando técnicas convencionales bien conocidas en este campo, tales como extracción. Más específicamente, la mezcla de reacción se inactiva con agua, se concentra parcialmente a un volumen de aproximadamente % - A a presión reducida y la mezcla resultante se extrae con un disolvente orgánico apropiado, tal como DCM o EtOAc. Los extractos orgánicos se pueden combinar, lavar con NaCl acuoso saturado, secar sobre Na²SO⁴ , filtrar y concentrar a presión reducida, para obtener N'-(4-sustituida-3-oxo-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-2-il)-1-ciclopropil-ciclopropancarbohidrazida, el producto del esquema 3, etapa G (R = (CH²)²CH³).

En el esquema 3, etapa H, la N'-(4-sustituida-3-oxo-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-2-il)-1-ciclopropilciclopropancarbohidrazida se puede ciclar en condiciones similares a las descritas en el esquema 2, etapa F, para proporcionar 5-sustituida-1-([1,1'-bi(ciclopropan)]-1-il-8,9-dihidro-6H-pirano[3,4-e][1,2,4]triazoplo[4,3-a]pirazin-4(5H)-ona (Fórmula I, X = CH2O, R = c-Pro, (CH²)²CH³), el producto del esquema 3, etapa H.

Esquema 4

El esquema 4 representa la ruta sintética para 1-([1,1-bi(ciclopropan)]-1-il)-5-(ciclopropilmetil)-5,6,7,8,9,10-hexahidro-4H-ddohepta[e][l,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-4-ona (Fórmula 1, X = CH2CH2CH2, R = c-Pro). En el esquema 4, etapa A, un experto en la técnica reconocerá que la apertura del epóxido de 8-oxabiciclo[5.1.0]octano se puede realizar usando una diversidad de nucleófilos en un disolvente orgánico polar apropiado. Por ejemplo, aproximadamente 1 equivalente de 8-oxabiciclo[5.1.0]octano se puede calentar a aproximadamente 160 °C durante aproximadamente 12-24 h en un recipiente cerrado herméticamente en presencia de NH4OH en una mezcla disolvente adecuada, tal como EtOH/THF (2:1). El producto puede aislarse utilizando técnicas convencionales bien conocidas en este campo, tales como evaporación. Más específicamente, la mezcla de reacción se puede concentrar a presión reducida para dar 2-aminocicloheptanol, el producto del esquema 4, etapa A, adecuado para su uso sin más purificación.

En el esquema 4, etapa B, la condensación de 2-(ciclopropilmetilamino)-2-oxoacetato de etilo con 2-aminocicloheptanol, el producto del esquema 4, etapa A, se puede realizar en condiciones similares a las descritas en el esquema 1, etapa A, para dar N-(ciclopropilmetil)-N'-(2-hidroxicicloheptil)oxamida, el producto del esquema 4, etapa B.

En el esquema 4, etapa C, N-(ciclopropilmetil)-N'-(2-hidroxicicloheptil)oxamida, el producto del esquema 4, etapa B, se puede oxidar en condiciones similares a las descritas en el esquema 1, etapa B, para dar N-(ciclopropilmetil)-N'-(2-oxocicloheptil)oxamida, el producto del esquema 4, etapa C.

En el esquema 4, etapa D, la ciclación de N-(ciclopropilmetil)-N'-(2-oxocicloheptil)oxamida, el producto del esquema 4, etapa C, se puede realizar como se describe en el esquema 1, etapa C, para dar 4-(ciclopropilmetil)-1,5,6,7,8,9-hexahidrociclohepta[b]pirazin-2,3-diona, el producto del esquema 4, etapa D.

En el esquema 4, etapa E, 4-(ciclopropilmetil)-1,5,6,7,8,9-hexahidrociclohepta[b]pirazin-2,3-diona se puede tratar con hidrazina en condiciones similares a las descritas en el esquema 2, etapa D, para proporcionar 4-(ciclopropilmetil)-2-hidrazino-6,7,8,9-tetrahidro-5H-ciclohepta[b]pirazin-3-ona, el producto del esquema 4, etapa E.

En el esquema 4, etapa F, la acilación de 4-(ciclopropilmetil)-2-hidrazino-6,7,8,9-tetrahidro-5H-ciclohepta[b]pirazin-3-ona, el producto del esquema 4, etapa E, se puede realizar en condiciones similares a las descritas en el esquema 2, etapa E, para dar 1-ciclopropil-N'-[4-(ciclopropilmetil)-3-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-5H-ciclohepta[b]pirazin-2-il]ciclopropanocarbohidrazida, el producto del esquema 4, etapa F.

En el esquema 4, etapa G, 1-ciclopropil-N'-[4-(ciclopropilmetil)-3-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-5H-ciclohepta[b]pirazin-2-il]ddopropanocarbohidrazida, el producto del esquema 4, etapa F, se puede ciclar en condiciones similares a las descritas en el esquema 2, etapa F, para proporcionar 1-([1,T-bi(ciclopropan)]-1-il)-5-(ciclopropilmetil)-5,6,7,8,9,10-hexahidro-4H-ddohepta[e][1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-4-ona, el producto del esquema 4, etapa G.

Preparaciones y ejemplos

Las preparaciones y ejemplos siguientes ilustran más la invención y representan síntesis habituales del compuesto de la invención. Los reactivos y los materiales de partida están disponibles con facilidad o un experto habitual en la técnica los puede sintetizar con facilidad. Debe entenderse que las preparaciones y los ejemplos se exponen con el fin de ilustrar y no de limitar y que el experto habitual en la técnica puede hacer distintas modificaciones.

La LC-ES/MS se realiza en un sistema de cromatografía líquida HP1100 de AGILENT®. Las mediciones de la espectrometría de masas por electropulverización (adquiridas en modo positivo y/o negativo) se realizan en un espectrómetro de masas cuadrupolo con detector selectivo de masas conectado a la HPLC HP1100. Condiciones de la LC-MS (pH bajo): columna: PHENOMENEX® GEMINI® NX C182,1 x 50 mm 3,0 pm; gradiente: 5-100 % de B en 3 min, después B al 100 % durante 0,75 min; temperatura de la columna: 50 °C /- 10 °C; caudal: 1,2 ml/min; Disolvente A: agua desionizada con HCOOH al 0,1 %; Disolvente B: ACN con ácido fórmico al 0,1 %; longitud de onda 214 nm. Condiciones de LC-MS alternativas (pH alto): columna: columnas XTERRA® MS C182,1 x 50 mm, 3,5 pm; gradiente: 5 % del disolvente A durante 0,25 min, gradiente del 5 % al 100 % del disolvente B en 3 min y el 100 % del disolvente B durante 0,5 min o del 10 % al 100 % del disolvente B en 3 min y al 100 % del disolvente B durante 0,75 min; temperatura de la columna: 50 °C /- 10 °C; caudal: 1,2 ml/min; Disolvente A: NH4HCO310 mM pH 9; Disolvente B: ACN; longitud de onda: 214 nm.

La cromatografía en fase inversa preparativa se realiza en un AGILENT® 1200 LC-ES/MS equipado con un espectrómetro de masas con detector selectivo de masas y un automuestreador/colector de fracciones LEAP®. Los métodos a pH alto se llevan a cabo en un PHENOMENEX® GEMINI®-NX de 75 x 30 mm, columna de 5 p de tamaño de partícula con una guarda de 10 x 20 mm. Caudal de 85 ml/min. El eluyente es bicarbonato de amonio 10 mM (pH 10) en acetonitrilo.

La GCMS se realiza en un sistema de cromatografía de gases 7890A de AGILENT®, equipado con un detector selectivo de masas 5975C de AGILENT® y un automuestreador 7693 de AGILENT®, usando una columna capilar de cromatografía de gases de Zebron™ (fenilarileno al 5 %, dimetilpolisiloxano al 95 %) con dimensiones 15 m x 0,25 pm x 0,25 mm (PHENOMENEX® n.° Cat. 75G-G010-11) de 60-280 °C a 35 °C/min y después una parada a 280 °C durante 2 min, con una relación de separación 90:1.

Los espectros de RMN se recogen en un espectrómetro de RMN AVIII HD de 400 MHz de Bruker, obtenidos como soluciones en CDCb o DMSO-d⁶ indicados en ppm, usando un disolvente residual [CDCb , 7,26 ppm; (CD³)²SO, 2,05 ppm] como estándar de referencia. Cuando se indican multiplicidades de pico, pueden usarse las siguientes abreviaturas: s (singlete), d (doblete), t (triplete), c (cuadruplete), m (multiplete), s a (singlete ancho), dd (doblete de dobletes), dt (doblete de tripletes). Constantes de acoplamiento (J), cuando se indican, se indican en hercios (Hz).

Preparación 1

N-alil-N'-(2-hidroxiciclohexil)oxamida

Esquema 1, etapa A: Combinar 2-aminociclohexanol (7,7 g, 66,8 mmol), etil-2-(alilamino)-2-oxo-acetato (10,0 g, 63,6 mmol, Matrix Scientific, n.° CAS 52781-10-9) y TEA (9,8 ml, 70,0 mmol) en EtOH (127,3 ml) y calentar la mezcla a 80 °C durante 4 h. Enfriar la mezcla a temperatura ambiente y agitar durante una noche. Aislar el precipitado resultante mediante filtración al vacío, lavar la torta de filtro con EtOAc y secar durante 4 h para obtener el compuesto del título (7,2 g, 50 % de rendimiento) en forma de un sólido cristalino de color blanco. Evaporar el filtrado a presión reducida y sonicar el sólido resultante en Et2O. Recoger el sólido por filtración al vacío, lavar la torta de filtro con Et2O y secar durante 1,5 h para dar un lote más del compuesto del título (2,8 g, 19 % de rendimiento adicional) en forma de un sólido cristalino de color blanco. El producto es una mezcla de isómeros cis y trans. ES/MS (m/z): 227,0 (M+H).

Preparación 2

N-alil-N'-(2-oxociclohexil)oxamida

Esquema 1, etapa B: Combinar N-alil-N'-(2-hidroxiciclohexil)oxamida (5,0 g, 22,1 mmol) y NaHCO3 (25,0 g, 297,6 mmol) en una mezcla de DCM (110,5 ml) y THF (36,8 ml) y enfriar la suspensión resultante a 0 °C. Añadir peryodinano de Dess-Martin (10,3 g, 24,3 mmol) a la suspensión y dejar que la mezcla se caliente lentamente a temperatura ambiente. Después de agitar durante una noche a temperatura ambiente, inactivar la mezcla mediante la adición de Na2S2O3 saturado (7,0 g en 50 ml de H2O) y NaHCO3 acuoso saturado. Agitar la mezcla bifásica a temperatura ambiente durante 2 h y separar las capas. Extraer la capa acuosa con DCM. Combinar los extractos orgánicos, secar sobre Na2SO4, filtrar y concentrar a presión reducida para proporcionar un residuo. Purificar el residuo por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con EtOAc:hexanos (1:1), para dar el compuesto del título (3,4 g, 69 % de rendimiento) en forma de un sólido de color blanquecino. ES/MS (m/z): 225,0 (M+H).

Preparación 3

4-alil-5,6,7,8-tetrahidro-1H-quinoxalin-2,3-diona

Esquema 1, etapa C: Añadir N-alil-N'-(2-oxociclohexil)oxamida (3,4 g, 15,2 mmol) a una mezcla de AcOH (15,2 ml, 264,6 mmol), t Fa (1,3 ml, 16,7 mmol) y TFAA (3,5 g, 16,7 mmol) y calentar la mezcla a 100 °C durante una noche. Enfriar la mezcla a temperatura ambiente y eliminar el disolvente a presión reducida para dar un aceite de color negro. Purificar el residuo por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con MeOH:EtOAc (gradiente de 0:1 a 1:4), para dar el compuesto del título (2,6 g, 83 % de rendimiento) en forma de un sólido de color castaño. ES/MS (m/z): 207,0 (M+H).

Preparación 4

1-alil-3-cloro-3,4,5,6,7,8-hexahidroquinoxalin-2-ona

Esquema 1, etapa D: Añadir POCl³ (2,0 g, 13,1 mmol) a una solución de 4-alil-5,6,7,8-tetrahidro-1H-quinoxalin-2,3-diona (2,6 g, 12,5 mmol) disuelta en DCE (62,6 ml) y calentar la mezcla a 75 °C durante 4,5 h. Añadir más POCh (1,0 g, 6,3 mmol) a la mezcla y continuar calentando a 75 °C durante 3,5 h. Enfriar la mezcla a temperatura ambiente y agitar durante una noche. Eliminar el disolvente a presión reducida y disolver el residuo resultante en tolueno. Eliminar el tolueno a presión reducida para dar el compuesto del título (2,81 g, >99 % de rendimiento) en forma de un aceite de color rojo oscuro. ES/MS (m/z): 225,0 (M+H).

Preparación 5

1-alil-3-hidracino-5,6,7,8-tetrahidroquinoxalin-2-ona

Esquema 1, etapa E: Añadir hidracina (2,0 g, 62,5 mmol) a una suspensión de 1-alil-3-cloro-3,4,5,6,7,8-hexahidroquinoxalin-2-ona (2,8 g, 12,5 mmol) en EtOH (50 ml) y calentar la mezcla durante una noche a reflujo. Enfriar la mezcla a temperatura ambiente y eliminar el disolvente a presión reducida. Dividir el resto resultante entre H2O y DCM. Separar la capa orgánica y extraer la capa acuosa con DCM. Combinar los extractos orgánicos, secar sobre Na2SO4, filtrar y concentrar a presión reducida para dar el compuesto del título (2,6 g, 95 % de rendimiento) en forma de un aceite de color naranja. ES/MS (m/z): 221,0 (M+H).

Preparación 6

N'-(4-alil-3-oxo-5,6,7,8-tetrahidroquinoxalin-2-il)-1-ciclopropil-ciclopropanocarbohidracida

Esquema 1, etapa F: Añadir ácido 1-ciclopropilciclopropanocarboxílico (2,3 g, 18,3 mmol), HATU (7,0 g, 18,3 mmol) y DIPEA (6,6 ml, 37,7 mmol) a una solución de 1-alil-3-hidracino-5,6,7,8-tetrahidroquinoxalin-2-ona (2,4 g, 10,8 mmol) en DMF (40 ml) y agitar la mezcla durante una noche a temperatura ambiente. Diluir la mezcla con EtOAc y lavar la mezcla secuencialmente con NaHCO3 acuoso saturado y NaCl acuoso saturado. Secar la mezcla orgánica sobre Na2SO4, filtrar y concentrar a presión reducida para dar el compuesto del título (3,5 g, >99 % de rendimiento) en forma de un aceite de color pardo. Es /MS (m/z): 329,2 (M+H).

Preparación 7

5-alil-1-(1-ciclopropilciclopropil)-6,7,8,9-tetrahidro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4-ona

Esquema 1, etapa G: Disolver N'-(4-alil-3-oxo-5,6,7,8-tetrahidroquinoxalin-2-il)-1-ciclopropil-ciclopropancarbohidracida (3,5 g, 10,8 mmol) en AcOH (10,0 ml, 174,5 mmol) y calentar la solución en un microondas a 130 °C durante 3,5 h. Eliminar el AcOH a presión reducida y purificar el residuo resultante por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con EtOAc:hexanos (gradiente de 4:1 a 1:0), para dar el compuesto del título (1,2 g, 35 % de rendimiento) en forma de un aceite de color pardo. ES/MS (m/z): 311,2 (M+H).

Preparación 8

1-(1-ciclopropilciclopropil)-6,7,8,9-tetrahidro-5H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4-ona

Esquema 1, etapa H: Añadir ácido N,N-dimetilbarbitúrico (1,3 g, 8,5 mmol) a una solución de 5-alil-1-(1-ciclopropilciclopropil)-6,7,8,9-tetrahidro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4-ona (877,4 mg, 2,8 mmol) en DCM (30 ml) y purgar con nitrógeno durante 10 minutos. Añadir tetraquis(trifenilfosfina)paladio (653,3 mg, 565,3 |jmol) y calentar la mezcla a 35 °C durante una noche. Enfriar la mezcla a temperatura ambiente y eliminar el disolvente a presión reducida para proporcionar un residuo. Purificar el residuo mediante cromatografía ultrarrápida de fase inversa (REDISEP™ Gold C-18, 415 g; gradiente: 20-48 % de una mezcla de TFA al 0,1 % en ACN en una mezcla de TFA al 0,1 % en H2O durante 22,9 min.) para dar el compuesto del título (392,7 mg, 51 % de rendimiento) en forma de un sólido de color castaño. ES/MS (m/z): 271,0 (M+H).

Preparación 9a

2-(ciclopropilmetilamino)-2-oxo-acetato de etilo

Añadir TEA (13 ml, 93,3 mmol) a una solución a -10 °C de oxalilcloruro de etilo (4,1 ml, 37 mmol) en DCM (75 ml). Añadir ciclopropilmetanamina (3,2 ml, 37 mmol) gota a gota y agitar la mezcla resultante a -10 °C durante 3 h, después calentar a TA durante una noche. Verter la mezcla de reacción en agua, diluir con DCM y ajustar el pH a ~ 6-7 con HCl 1 N. Separar las capas resultantes y lavar la capa orgánica con NaCl acuoso saturado, secar sobre Na²SO⁴ , filtrar y concentrar a presión reducida para proporcionar un semisólido. Disolver el semisólido en EtOAc y concentrar a presión reducida para obtener el compuesto del título (4,3 g, 69 % de rendimiento). RMN ¹H (DMSO-d⁶): 80,17-0,13 (m, 2H), 0,39-0,33 (m, 2H), 0,97-0,87 (m, 1H), 1,23 (t, 3H), 2,96 (t, 2H), 4,19 (c, 2H), 8,92 (s a, 1H).

Preparación 9b

2-(butilamino)-2-oxo-acetato de etilo

Preparar el compuesto esencialmente como se describe en la preparación 9a, usando oxalilcloruro de etilo y butilamina, para dar el compuesto del título (74 % de rendimiento). Es /MS (m/z): 174,9 (M+H).

Preparación 10

Clorhidrato de 1-ciclopropilciclopropanocarbohidrazida

Añadir una solución de carbazato de tere-butilo (10,5 g, 79,4 mmol) disuelto en DMF (100 ml) gota a gota a una mezcla de ácido 1-ciclopropilciclopropanocarboxílico (10 g, 79,3 mmol), EDCI (16,7 g, 87,1 mmol), HOBT (12 g, 87 mmol) y TEA (12,2 ml, 87,5 mmol) a 0 °C y agitar la mezcla resultante a TA durante una noche. Diluir con agua, extraer con DCM (3x), combinar los extractos orgánicos, lavar los extractos orgánicos combinados con LiCl acuoso al 10 % seguido de NaCl acuoso saturado, secar los extractos sobre Na2SO4, filtrar y concentrar a presión reducida. Añadir solución 4 M de HCl en dioxano (40 ml) al residuo resultante y agitar a TA durante una noche. Concentrar parcialmente la mezcla de reacción a presión reducida, diluir la mezcla concentrada con Et2O y filtrar y recoger el sólido resultante. Secar el sólido en horno de vacío durante 3 h para obtener el compuesto del título (11,5 g, 82 % de rendimiento) en forma de un sólido de color blanco. ES/MS (m/z): 141,2 (M+H).

Preparación 11

N-(ciclopropilmetil)-N'-(4-hidroxitetrahidropiran-3-il)oxamida

Esquema 2, etapa A: Añadir 2-(cidopropilmetilamino)-2-oxo-acetato de etilo (3,9 g, 17,16 mmol) y trietilamina (6,0 ml, 43 mmol) a una solución en agitación de 3-aminotetrahidropiran-4-ol (2,0 g, 17,1 mmol) en EtOH (35 ml). Calentar la solución resultante a 80 °C durante 4 h. Enfriar a TA, recoger el precipitado resultante por filtración, lavar la torta de filtro con EtOH y secar el sólido al vacío durante 3 d para dar el compuesto del título (5,7 g, 93 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 243 (M+H).

Preparación 12

N-(ciclopropilmetil)-N'-(4-oxotetrahidropiran-3-il)oxamida

Esquema 2, etapa B: Disolver N-(ciclopropilmetil)-N'-(4-hidroxitetrahidropiran-3-il)oxamida (2,7 g, 11,3 mmol) en DCM (120 ml). Enfriar la solución a 0 °C en un baño de hielo y añadir peryodinano de Dess-Martin (6,3 g, 14,7 mmol) en porciones. Calentar a TA durante una noche con agitación. Añadir más peryodinano de Dess-Martin (2,4 g, 5,6 mmol) a TA y agitar la reacción durante 3 h. Inactivar la reacción con Na2S2O3 acuoso saturado y NaHCO3 acuoso saturado con agitación vigorosa durante 30 min. Extraer la capa acuosa con DCM, combinar los extractos, lavar con NaOH 2 N, secar sobre MgSO4 anhidro, filtrar, concentrar a presión reducida y secar al vacío para obtener el compuesto del título (2,1 g, 77 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 241 (M+H).

Preparación 13

1-(ciclopropilmetil)-4,5,7,8-tetrahidropirano[3,4-b]pirazin-2,3-diona

Esquema 2, etapa C: Disolver N-(ciclopropilmetil)-N'-(4-oxotetrahidropiran-3-il)oxamida (2,1 g, 8,7 mmol) en AcOH (8,7 ml). Añadir TFA (725 pl, 9,6 mmol) y TFAA (3,7 ml, 26 mmol) y calentar a 75 °C durante 18 h. Verter la mezcla de reacción sobre un mínimo de hielo y diluir con DCM. Añadir NaHCO3 sólido con agitación hasta que el pH sea ~ 5-6. Separar las capas y extraer la capa acuosa con DCM. Lavar los extractos orgánicos con NaCl acuoso saturado, secar sobre MgSO4 anhidro, filtrar y concentrar a presión reducida para dar el compuesto del título en bruto (1,5 g, 59 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 223 (M+H).

Preparación 14

1-(ciclopropilmetil)-3-hidrazino-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-2-ona

Esquema 2, etapa D: Combinar 1-(cidopropilmetil)-4,5,7,8-tetrahidropirano[3,4-b]pirazin-2,3-diona (1,5 g, 6,2 mmol) e hidrazina hidrato (10 ml) e irradiar en el microondas a 135 °C durante 3 h. Diluir la reacción con agua y extraer con CHCb/IPA 3:1. Lavar los extractos con NaCl acuoso saturado, secar sobre MgSO4 anhidro, filtrar y concentrar a presión reducida para dar el compuesto del título en bruto (475 mg, 27 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 237 (M+H).

Preparación 15

1-ciclopropil-N'-[1-(ciclopropilmetil)-2-oxo-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-3-il]ciclopropanocarbohidrazida

Esquema 2, etapa E: Disolver 1-(ciclopropilmetil)-3-hidrazino-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-2-ona (475 mg, 1,7 mmol), ácido 1-ciclopropilciclopropanocarboxílico (316 mg, 2,5 mmol), HOBT (368 mg, 2,6 mmol) y EDCI (512 mg, 2,7 mmol) en DMF (4 ml) que contiene TEA (774 |jl, 5,6 mmol). Agitar la reacción a TA durante 2 h. Diluir con agua y extraer con EtoAc. Lavar los extractos con LiCl acuoso al 10 % seguido de NaCl acuoso saturado, secar sobre MgSO4 anhidro, filtrar y concentrar a presión reducida para dar el compuesto del título en bruto (585 mg, 71 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 345 (M+H).

Preparación 16

N-butil-N'-(4-hidroxitetrahidropiran-3-il)oxamida

Esquema 2, etapa A: Añadir 2-(butilamino)-2-oxo-acetato de etilo (2,5 g., 128 mmol) y TEA (4,5 ml, 32 mmol) a 3-aminotetrahidropiran-4-ol (1,5 g, 12,8 mmol) en EtOH (25 ml). Calentar la solución a 80 °C durante 4 h. Enfriar a TA, recoger los sólidos resultantes por filtración, lavar con EtOH y secar al vacío durante 4 h para dar el compuesto del título (1,86 g, 59 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 245 (M+H)

Preparación 17

N-butil-N'-(4-oxotetrahidropiran-3-il)oxamida

Esquema 2, etapa B: Disolver N-butil-N'-(4-hidroxitetrahidropiran-3-il)oxamida (1,7 g, 7,2 mmol) en DCM (200 ml). Enfriar la solución a 0 °C en un baño de hielo y añadir peryodinano de Dess-Martin (3,4 g, 7,9 mmol) en porciones. Calentar a TA y agitar la mezcla durante 3 d. Inactivar con Na2S2O3 acuoso saturado seguido de NaHCO3 acuoso con agitación vigorosa durante 30 min. Separar las capas y extraer la capa acuosa con DCM. Lavar los extractos orgánicos combinados con NaCl acuoso saturado, secar sobre MgSO4 anhidro, filtrar, concentrar a presión reducida y secar al vacío. Suspender el residuo resultante en Na2S2O3 acuoso saturado y NaHCO3 acuoso saturado durante una noche. Extraer con EtOAc, lavar con NaOH 1 N seguido de NaCl acuoso saturado, secar sobre MgSO4 anhidro, filtrar, concentrar a presión reducida y secar al vacío durante una noche para dar el compuesto del título (1,54 g, 88 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 243 (M+H)

Preparación 18

1-butil-4,5,7,8-tetrahidropirano[3,4-b]pirazin-2,3-diona

Esquema 2, etapa C: Disolver N-butil-N'-(4-oxotetrahidropiran-3-il)oxamida (1,53 g, 6,32 mmol) en AcOH (6,5 ml), añadir TFA (530 |jl, 7 mmol) y TFAA (1 ml, 7,1 mmol) y calentar a 75 °C durante una noche. Verter la reacción sobre un mínimo y diluir con DCM. Añadir NaHCO3 sólido con agitación para ajustar el pH a ~ 5-6. Separar las capas y extraer la capa acuosa con DCM. Lavar los extractos orgánicos combinados con NaCl acuoso saturado, secar sobre MgSO4 anhidro, filtrar y concentrar a presión reducida para dar el compuesto del título en bruto (1,3 g, 85 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 225 (M+H).

Preparación 19

1-butil-3-hidrazino-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-2-ona

Esquema 2, etapa D: Combinar 1-butil-4,5,7,8-tetrahidropirano[3,4-b]pirazin-2,3-diona (1,3 g, 5,4 mmol) e hidrazina hidrato (10 ml) e irradiar en un microondas a 130 °C durante 4 h. Verter la reacción sobre hielo y diluir con agua. Extraer la capa acuosa con CHCh/IPA 3:1. Combinar las capas orgánicas, lavar con NaCl acuoso saturado, secar sobre MgSO4 anhidro, filtrar y concentrar a presión reducida para obtener el compuesto del título en bruto (694 mg, 43 % de rendimiento) que es adecuado para su uso sin más purificación. ES/MS (m/z): 239 (M+H).

Preparación 20

N'-(1-butil-2-oxo-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-3-il)-1-ciclopropil-ciclopropanocarbohidrazida

Esquema 2, etapa E: Disolver 1-butil-3-hidrazino-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-2-ona (694 mg, 2,9 mmol), ácido 1-ciclopropilciclopropanocarboxílico (551 mg, 4,4 mmol), HOBT (643 mg, 4,7 mmol) y EDCl (893 mg, 4,7 mmol) en DMF (6 ml) que contiene TEA (1,35 ml, 9,7 mmol). Agitar a TA durante una noche. Diluir con agua y extraer con EtOAc. Lavar los extractos orgánicos combinados con LiCl acuoso al 10 % seguido de NaCl acuoso saturado, secar sobre MgSO4 anhidro, filtrar y concentrar a presión reducida para dar el compuesto del título en bruto (832 mg, 66 %) adecuado para su uso sin más purificación. ES/MS (m/z): 347 (M+H).

Preparación 21

2-aminocicloheptanol

Esquema 4, etapa A: Añadir 8-oxabiciclo[5.1,0]octano (3,3 g, 27,9 mmol) a una mezcla de NH4OH acuoso al 28 % (120 ml), EtOH (20 ml) y THF (10 ml). Cerrar herméticamente la mezcla de reacción en un autoclave, purgar la mezcla de reacción con N2 y calentar a 160 °C durante 14 h. Enfriar a TA y concentrar a presión reducida para obtener el compuesto del título en forma de un sólido suave de color pardo (3,2 g, 85 % de rendimiento). GCMS: (m/z): 129,1 (M+).

Preparación 22

2-(ciclobutilmetilamino)-2-oxo-acetato de etilo

Añadir una solución de oxalil cloruro de etilo (1,95 ml, 17,4 mmol) en DCM (50 ml) a una mezcla de TEA (3,6 ml, 26 mmol) y cilcobutilmetanamina (1,51 g, 17,2 mmol) en DCM (50 ml) a 0 °C durante 15 min. Calentar la mezcla a TA mientras termina el baño de hielo. Diluir con agua y lavar con HCl 0,5 N seguido de NaHCO3 acuoso saturado. Secar la capa orgánica sobre MgSO4 anhidro, filtrar y concentrar a presión reducida para dar el compuesto del título (2,45 g, 77 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 186 (M+H).

Preparación 23

N-(ciclobutilmetil)-N'-(4-hidroxitetrahidropiran-3-il)oxamida

Esquema 2, etapa A: Calentar una mezcla de 3-aminotetrahidropiran-4-ol (1,55 g, 13,2 mmol), 2-(ciclobutilmetilamino)-2-oxo-acetato de etilo (2,4 g, 13,2 mmol) y TEA (2,0 ml, 14 mmol) en EtOH (25 ml) a 80 °C durante 4 h. Enfriar a TA y recoger los sólidos resultantes por filtración. Secar al vacío durante 3 d para dar el compuesto del título (1,7 g, 51 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 257 (M+H).

Preparación 24

N-(ciclobutilmetil)-N'-(4-oxotetrahidropiran-3-il)oxamida

Esquema 2, etapa B: Disolver N-(ciclobutilmetil)-N'-(4-hidroxitetrahidropiran-3-il)oxamida (1,8 g, 6,9 mmol) en DCM (150 ml) y enfriar en un baño de hielo. Añadir peryodinano de Dess-Martin (3,8 g, 9,0 mmol) en porciones. Calentar a TA durante una noche mientras termina el baño de hielo. Inactivar la reacción con Na2S2O3 acuoso saturado seguido de NaHCO3 acuoso con agitación vigorosa durante 30 min. Extraer con DCM, lavar los extractos orgánicos con NaOH 2 N, secar sobre MgSO4 anhidro, filtrar, concentrar a presión reducida y secar al vacío para dar el compuesto del título (1,81 g, 93 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 255 (M+H).

Preparación 25

1-(ciclobutilmetil)-4,5,7,8-tetrahidropirano[3,4-b]pirazin-2,3-diona

Esquema 2, etapa C: Disolver N-(cidobutilmetil)-N'-(4-oxotetrahidropiran-3-il)oxamida (1,8 g, 6,4 mmol), TFA (533 |jl, 7 mmol) y TFAA (2,7 ml, 19 mmol) en AcOH (6,4 ml) en un recipiente para microondas. Calentar la mezcla resultante a 75 °C durante una noche. Verter sobre un mínimo de hielo y diluir con DCM. Añadir NaHCO3 sólido con agitación hasta que el pH sea ~ 5-6. Separar las capas y extraer con diclorometano. Combinar los extractos orgánicos, lavar con NaCl acuoso saturado, secar sobre MgSO4 anhidro, filtrar y concentrar a presión reducida. Secar el aceite oscuro resultante al vacío y triturar el residuo resultante con ferc-butil metil éter. Recoger el sólido resultante por filtración, lavar con ferc-butil metil éter, para dar compuesto del título en bruto (1,0 g, 60 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 237 (M+H).

Preparación 26

1-(ciclobutilmetil)-3-hidrazino-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-2-ona

Esquema 2, etapa D: Añadir 1-(ciclobutilmetil)-4,5,7,8-tetrahidropirano[3,4-b]pirazin-2,3-diona (482 mg, 1,8 mmol) a hidrazina hidrato (0,5 ml, 10 mmol) e irradiar a 130 °C en el microondas durante 5 h. Enfriar a TA y diluir con agua; extraer la capa acuosa con CHCb/IPA 3:1. Lavar los extractos orgánicos combinados con NaCl acuoso saturado, secar sobre MgSO4 anhidro, filtrar, concentrar a presión reducida y volver a secar al vacío durante una noche para obtener el compuesto del título en bruto (275 mg, 51 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 251 (M+H).

Preparación 27

N-[1-(ciclobutilmetil)-2-oxo-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-3-il]-1-ciclopropil-ciclopropanocarbohidrazida

Esquema 2, etapa E: Disolver 1-(ciclobutilmetil)-3-hidrazino-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-2-ona (275 mg, 0,9 mmol), ácido 1-ciclopropilciclopropanocarboxílico (178 mg, 1,4 mmol), HOBT (206 mg, 1,5 mmol), EDCI (286 mg, 1,5 mmol) y TEA (433 jl, 3,1 mmol) en DMF (4 ml). Agitar la mezcla a TA durante una noche. Diluir con agua y extraer con EtOAc. Lavar los extractos orgánicos combinados con LiCl acuoso al 10 % seguido de NaCl acuoso saturado, secar sobre MgSO4 anhidro, filtrar, concentrar a presión reducida y secar al vacío durante una noche para dar el compuesto del título en bruto (334 mg, 85 %) suficiente para su uso sin más purificación. ES/MS (m/z): 359 (M+H). Preparación 28

N-(ciclopropilmetil)-N'-(3-hidroxitetrahidropiran-4-il)oxamida

Esquema 3, etapa A: Añadir TEA (3,9 ml, 28 mmol) a una suspensión en agitación de 4-aminotetrahidropiran-3-ol (3,0 g, 26 mmol) y 2-(ddopropilmetilamino)-2-oxo-acetato de etilo (4,4 g, 26 mmol) en EtOH (70 ml) a TA y calentar la mezcla de reacción resultante a reflujo durante 2,5 h. Enfriar la mezcla de reacción a TA y dejar en reposo durante una noche. Recoger los sólidos resultantes por filtración, suspender en DCM y lavar la mezcla con agua. Extraer la capa acuosa con DCM y lavar los extractos orgánicos combinados con NaCl acuoso saturado, secar sobre Na2SO4, filtrar y concentrar a presión reducida para dar el compuesto del título (3,3 g, 53 % de rendimiento). RMN 1H (DMSO-ds): 50,18-0,14 (m, 2H), 0,38-0,34 (m, 2H), 0,98-0,91 (m, 1H), 1,66-1,52 (m, 2H), 2,98-2,91 (m, 3H), 3,27-3,21 (m, 1H), 3,51-3,44 (m, 1H), 3,62-3,54 (m, 1H), 3,75-3,68 (m, 2H), 4,89 (d, 1H), 8,53 (d, 1H), 8,76 (t a, 1H).

Preparación 29

N-(ciclopropilmetil)-N'-(3-oxotetrahidropiran-4-il)oxamida

Esquema 3, etapa B: Agitar juntos N-(ciclopropilmetil)-N'-(3-hidroxitetrahidropiran-4-il)oxamida (3,1 g, 12,8 mmol) y NaHcO3 (15,3 g, 173 mmol) en DCM (200 ml) y THF (30 ml) a 0 °C. Añadir lentamente peryodinano de Dess-Martin (6 g, 14 mmol), agitar la mezcla a TA durante una noche. Añadir Na2S2O3 acuoso saturado y NaHCO3 acuoso saturado y agitar la mezcla de reacción resultante durante 2 h a TA. Separar las capas, recoger la capa orgánica y volver a extraer la capa acuosa con DCM. Combinar los extractos orgánicos, secar sobre Na2SO4 y concentrar a presión reducida. Purificar el residuo resultante por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con hexanos/acetona. Combinar las fracciones puras de la cromatografía y concentrar a presión reducida para obtener el compuesto del título (1,9 g, 63 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 241 (M+H).

Preparación 30

4-(ciclopropilmetil)-1,5,7,8-tetrahidropirano[3,4-b]pirazin-2,3-diona

Esquema 3, etapa C: Añadir TFAA (1,25 ml, 8,9 mmol) y TFA (0,68 ml, 9,0 mmol) a una solución en agitación de N-(ciclopropilmetil)-N'-(3-oxotetrahidropiran-4-il)oxamida (1,9 g, 8 mmol) en AcOH (8 ml, 139,6 mmol) y calentar la solución homogénea resultante a 100 °C durante 15 h. Diluir la mezcla de reacción con agua y extraer con DCM (3x) seguido de CHCh/IPA 3:1 (3x). Combinar los extractos orgánicos, lavar con NaCl acuoso saturado, secar sobre Na2SO4, filtrar y concentrar el filtrado a presión reducida. Purificar el residuo resultante por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con MeOH/DCM. Combinar las fracciones puras de la cromatografía y concentrar a presión reducida para obtener el compuesto del título, (948,6 mg, 52,9 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 223 (M+H).

Preparación 31

2-cloro-4-(ciclopropilmetil)-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-3-ona

Esquema 3, etapa D: Agitar juntos 4-(cidopropilmetil)-1,5,7,8-tetrahidropirano[3,4-b]pirazin-2,3-diona (948,6 mg, 4,3 mmol) y POCb (0,48 ml, 5,2 mmol) en DCE (11 ml) a 75 °C durante 6 h, enfriar a TA y agitar durante 3 d. Diluir la mezcla de reacción con DCM e inactivar con solución acuosa saturada de NaHCO3 con agitación vigorosa durante 2 h. Separar las capas resultantes, extraer la capa acuosa con DCM (2x), combinar los extractos orgánicos y lavar con NaCl acuoso saturado, secar sobre Na2SO4, filtrar y concentrar a presión reducida para proporcionar el compuesto del título en bruto (652,3 mg, 44,5 % de rendimiento) adecuado para su uso sin más purificación. ES/MS (m/z): 241 (M+H). Preparación 32

4-(ciclopropilmetil)-2-hidrazino-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-3-ona

Esquema 3, etapa E: Calentar una solución de 2-cloro-4-(ciclopropilmetil)-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-3-ona (652,3 mg, 1,9 mmol) e hidrazina (0,5 ml) en agua (0,5 ml) en EtOH (10 ml) a 78 °C durante una noche. Diluir la mezcla de reacción con agua y extraer con DCM (3x). Combinar los extractos orgánicos y lavar con NaCl acuoso saturado, secar sobre Na2SO4 y concentrar a presión reducida para dar el compuesto del título (389 mg, 86,8 % de rendimiento) adecuado para su uso sin más purificación. ES/MS (m/z): 241 (M+h ).

Preparación 33

1-ciclopropil-N'-[4-(ciclopropilmetil)-3-oxo-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-2-il]ciclopropanocarbohidrazida

Esquema 3, etapa F: Enfriar una solución de ácido 1-ciclopropilciclopropanocarboxílico (313 mg, 2,4 mmol), EDCI (507 mg, 2,6 mmol), HOBT (365 mg, 2,6 mmol) y TEA (0,8 ml, 6 mmol) en DMF (5,5 ml) a 0 °C en un baño de hielo y añadir una solución de 4-(ciclopropilmetil)-2-hidrazino-7,8-dihidro-5h-pirano[3,4-b]pirazin-3-ona (389 mg, 1,6 mmol) en DMF (5,5 ml). Calentar la mezcla resultante a TA con agitación durante una noche. Diluir la mezcla de reacción con agua y extraer con EtOAc (3x). Lavar los extractos orgánicos combinados con solución acuosa al 5 % de LiCl (2x) seguido de NaCl acuoso saturado y secar los extractos orgánicos sobre Na2SO4. Concentrar los extractos orgánicos a presión reducida para obtener el compuesto del título (571,7 mg, 90,7 % de rendimiento) adecuado para su uso sin más purificación. ES/MS (m/z): 345 (M+H).

Preparación 34

N-butil-N'-(3 -hidroxitetrahidropiran-4-il)oxamida

Esquema 3, etapa A: Añadir TEA (3,93 ml, 28,2 mmol) a una suspensión de 4-aminotetrahidropiran-3-ol (3 g, 25,6 mmol) y 2-(butilamino)-2-oxo-acetato de etilo (4,4 g, 25 mmol) en EtOH (50 ml) a TA. Agitar la mezcla resultante a reflujo durante 1 h y enfriar a TA. Filtrar y recoger el sólido resultante, lavar con EtOAc y secar al aire durante 1 h para dar el compuesto del título en bruto (4,7 g, 71 % de rendimiento) adecuado para su uso sin más purificación. ES/MS (m/z): 245 (M+H).

Preparación 35

N-butil-N'-(3-oxotetrahidropiran-4-il)oxamida

Esquema 3, etapa B: Agitar N-butil-N'-(3-hidroxitetrahidropiran-4-il)oxamida (4,7 g, 19 mmol) y NaHCO3 (5,1 g, 58 mmol) en una mezcla de DCM (96 ml) y THF (32 ml) a 0 °C. Añadir lentamente peryodinano de Dess-Martin (10 g, 23,3 mmol) y agitar la mezcla de reacción a TA durante una noche. Añadir Na2S2O3 acuoso saturado y agitar durante 1 h. Separar las capas y extraer la fase acuosa con DCM. Lavar los extractos orgánicos combinados con NaHCO3 acuoso saturado seguido de NaCl acuoso saturado, secar los extractos sobre Na2SO4 anhidro, filtrar y concentrar a presión reducida para dar el compuesto del título en bruto (4,94 g, 85 % de rendimiento) adecuado para su uso sin más purificación. ES/MS (m/z): 243 (M+H).

Preparación 36

4-butil-1,5,7,8-tetrahidropirano[3,4-b]pirazin-2,3-diona

Esquema 3, etapa C: Disolver N-butil-N'-(3-oxotetrahidropiran-4-il)oxamida (4,9 g, 20,4 mmol) en AcOH (20 ml) y añadir TFA (1,7 ml, 22 mmol) y TFAA (8,6 ml, 61 mmol). Purgar el recipiente de reacción con N2 y calentar a 75 °C durante 7 h. Añadir más TFAA (8,6 ml, 61 mmol) y agitar la reacción a 75 °C durante una noche. Enfriar a TA y verter sobre un mínimo de hielo. Añadir NaHCO3 sólido con agitación para ajustar a pH ~ 5-6. Diluir con DCM y separar las capas. Extraer la capa acuosa con DCM, combinar los extractos orgánicos, secar sobre Na2SO4, filtrar y concentrar a presión reducida. Disolver el residuo resultante en DCM y filtrar sobre un lecho de tierra de diatomeas, lavando con DCM. Volver a extraer la capa acuosa con CHCb/IPA 3:1. Combinar los extractos orgánicos con el filtrado, secar sobre Na2SO4 anhidro, filtrar y concentrar a presión reducida para dar el compuesto del título en bruto (3,52 g, 69 % de rendimiento) adecuado para su uso sin más purificación. ES/MS (m/z): 225 (M+H).

Preparación 37

4-butil-2-cloro-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-3-ona

Esquema 3, etapa D: Añadir 4-butil-1,5,7,8-tetrahidropirano[3,4-b]pirazin-2,3-diona (235 mg, 1,0 mmol) a SOCh (3,5 ml, 48 mmol) y añadir DMF (0,1 ml, 1 mmol) a TA. Agitar la mezcla resultante a TA durante 2 h. La reacción se combina con una serie más (reacción a escala de 35 mg) y se elimina el disolvente a presión reducida, azeotropando con DCM. Secar el residuo resultante al vacío durante una noche para dar el compuesto del título en bruto (421 mg, 86 % de rendimiento). Adecuado para su uso sin más purificación. ES/MS (m/z): 243 (M+H).

Preparación 38

N'-(4-butil-3-oxo-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-2-il)-1-ciclopropil-ciclopropanocarbohidrazida

Esquema 3, etapa G: Irradiar 4-butil-2-cloro-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-3-ona (320 mg, 1,3 mmol) y clorhidrato de 1-ciclopropilciclopropanocarbohidrazida (222 mg, 1,3 mmol) en ACN (4,4 ml) en el microondas a 100 °C durante 1 h. Combinar la solución de reacción con una serie más (escala de 100 mg) e inactivar con agua. Concentrar parcialmente la mezcla a presión reducida y extraer con EtOAc. Combinar los extractos orgánicos, lavar con NaCl acuoso saturado, secar sobre Na2SO4 y concentrar a presión reducida para dar el compuesto del título en bruto (250 mg, 33 % de rendimiento) adecuado para su uso sin más purificación. ES/MS (m/z): 347 (M+H).

Preparación 39

N-(ciclopropilmetil)-N'-(2-hidroxicicloheptil)oxamida

Esquema 4, etapa B: Añadir TEA (2,85 ml, 20,4 mmol) a una solución de 2-(ciclopropilmetilamino)-2-oxoacetato de etilo (1,7 g, 10,2 mmol) y 2-aminocicloheptanol (1,5 g, 10,8 mmol) en EtOH (20 ml) y calentar a 80 °C durante 2 h. Enfriar a TA y filtrar. Lavar la torta de filtro con EtOH y recoger como el producto. Concentrar el filtrado y purificar el residuo resultante por cromatografía ultrarrápida sobre sílice, eluyendo con DCM/MeOH. Combinar las fracciones puras de la cromatografía con la torta de filtro y concentrar a presión reducida para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco (1,95 g, 75 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 255,0 (M+H).

Preparación 40

N-(ciclopropilmetil)-N'-(2-oxocicloheptil)oxamida

Esquema 4, etapa C: Añadir peryodinano de Dess-Martin (3,6 g, 8,4 mmol) a una suspensión de N-(ciclopropilmetil)-N'-(2-hidroxicidoheptil)oxamida (1,95 g, 7,7 mmol) y NaHCO³ (8,4 g, 99,8 mmol) en d Cm (38 ml) y THF (13 ml) a t A. Después de 2,5 horas, añadir Na²S²O³ (2,5 g, 15,6 mmol) y agua (38 ml) y agitar la mezcla resultante durante 15 minutos más. Añadir más agua y extraer con DCM. Lavar los extractos combinados con NaCl acuoso saturado, secar los extractos sobre MgSO⁴, filtrar, concentrar a presión reducida y purificar el residuo resultante por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con Dc M/MTBE. Combinar las fracciones puras de la cromatografía y concentrar a presión reducida para obtener el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco (1,7 g, 87 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 253,0 (M+H).

Preparación 41

4-(ciclopropilmetil)-1,5,6,7,8,9-hexahidrociclohepta[b]pirazin-2,3-diona

Esquema 4, etapa D: Desgasificar una solución de N-(ciclopropilmetil)-N'-(2-oxocicloheptil)oxamida (1,7 g, 6,6 mmol) en AcOH (8,3 ml). Añadir TFA (0,55 ml, 7,3 mmol) y t Fa A (1,0 ml, 7,3 mmol), cerrar herméticamente un recipiente de reacción y calentar a 100 °C durante una noche. Enfriar a TA, concentrar a mezcla de reacción a presión reducida y purificar el residuo resultante por cromatografía ultrarrápida sobre sílice, eluyendo con DCM/MeOH. Combinar las fracciones puras de la cromatografía y concentrar a presión reducida para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco (1,1 g, 72 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 235,0 (M+H).

Preparación 42

4-(ciclopropilmetil)-2-hidrazino-6,7,8,9-tetrahidro-5H-ciclohepta[b]pirazin-3-ona

Esquema 4, etapa E: Añadir hidrazina (0,69 ml, 21 mmol) a una suspensión de 4-(ciclopropilmetil)-1,5,6,7,8,9-hexahidrociclohepta[b]pirazin-2,3-diona (0,25 g, 1,1 mmol) en EtOH (4,3 ml). Cerrar herméticamente la reacción y calentar a 100 °C durante una noche. Enfriar la reacción a TA, concentrar a presión reducida y purificar el residuo resultante por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con DCM/MeOH. Combinar las fracciones puras de la cromatografía y concentrar a presión reducida para obtener el compuesto del título en forma de una película pegajosa de color amarillo (113 mg, 42 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 249,2 (M+H).

Preparación 43

1-ciclopropil-N'-[4-(ciclopropilmetil)-3-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-5H-ciclohepta[b]pirazin-2-il]ciclopropanocarbohidrazida

Esquema 4, etapa F: Añadir TEA (0,22 ml, 1,6 mmol) a una suspensión de 4-(ciclopropilmetil)-2-hidrazino-6,7,8,9-tetrahidro-5H-ciclohepta[b]pirazin-3-ona (112 mg, 0,4 mmol), ácido 1-ddopropilddopropanocarboxíNco (68 mg, 0,5 mmol), HOBT (91 mg, 0,7 mmol) y EDCI (137 mg, 0,7 mmol) en THF (4,5 ml) y agitar la mezcla resultante a TA durante una noche. Añadir una pequeña cantidad de agua a la mezcla de reacción y diluir con EtOAc. Filtrar la mezcla resultante a través de un lecho de tierra de diatomeas y lavar la torta de filtro con EtOAc. Concentrar el filtrado y purificar por cromatografía ultrarrápida sobre sílice, eluyendo con DCM/MeOH. Combinar las fracciones puras de la cromatografía y concentrar a presión reducida para obtener el compuesto del título en forma de una película de color pardo rojizo (113 mg, 70 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 357,22 (M+H); 355,0 (M-H).

Ejemplo 1

1-([1,1'-bi(ciclopropan)]-1-il)-5-propil-6,7,8,9-tetrahidro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4(5H)-ona

Esquema 1, etapa J: Humedecer RaNi (0,1 g) con EtOAc (1 ml) y burbujear la suspensión con N2. Añadir 5-alil-1-(1-ciclopropilciclopropil)-6,7,8,9-tetrahidro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4-ona (201,0 mg, 0,65 mmol) y acetato de etilo (9 ml) a la suspensión y agitar la mezcla en atmósfera de hidrógeno (temperatura ambiente, 413,685 kPa (60 psi), 1 hora). Filtrar la mezcla y concentrar el filtrado a presión reducida. Purificar el residuo resultante por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con EtOAc (100 %), para dar el compuesto del título (116,6 mg, 58 %) en forma de un sólido de color amarillo claro. ES/MS (m/z): 313,2 (M+H).

Ejemplo 2

1-([1,1'-bi(ciclopropan)]-1-il)-5-butil-6,7,8,9-tetrahidro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4(5H)-ona

Esquema 1, etapa I: Añadir LHMDS (2,0 g, 2,2 mmol) a una solución de 1-(1-ciclopropilciclopropil)-6,7,8,9-tetrahidro-5H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4-ona (202,2 mg, 748,0 pmol) en DMF (5 ml). Después de agitar la mezcla durante 1 hora a temperatura ambiente, añadir yoduro de N-butilo (412,9 mg, 2,2 mmol) y agitar la mezcla a temperatura ambiente durante 2 días. Diluir la mezcla con EtOAc y lavar con NaCl acuoso saturado. Secar sobre Na2SO4, filtrar y concentrar a presión reducida para dar un aceite de color amarillo. Purificar por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con EtOAc (100 %), para proporcionar el compuesto del título (98,2 mg, 40 %) en forma de un sólido de color castaño. ES/MS (m/z): 327,2 (M+H).

Ejemplo 3

1-([1,1'-bi(ciclopropan)]-1-il)-5-(ciclopropilmetil)-5,6,7,9-tetrahidro-4H-pirano[4,3-e][1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-4-ona

Esquema 2, etapa F: Combinar 1-ciclopropil-N-[1-(ciclopropilmetil)-2-oxo-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-3-il]ciclopropanocarbohidrazida (344 mg, 0,8 mmol), DBU (38 |jl, 0,26 mmol) y HMDS (4 ml) y calentar a 120 °C. Después de 7 h, transferir la mezcla de reacción a un matraz que contenía MeOH y calentar a 50 °C durante 1,5 h. Concentrar a presión reducida. Purificar el residuo resultante por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con EtOAc/DCM 1:1 a EtOAc/(DCM/MeOH 4:1) 1:1. Combinar las fracciones puras de la cromatografía y concentrar a presión reducida. Combinar las fracciones impuras por separado y concentrar a presión reducida. Disolver el aceite resultante de las fracciones impuras en EtOAc y someter a sonicación. Enfriar la mezcla a 0 °C durante 1 h, recoger los sólidos resultantes por filtración y combinar con las fracciones puras evaporadas. Disolver los sólidos en ACN/MeOH, evaporar a sequedad y volver a secar en horno de vacío durante una noche para obtener el compuesto del título (155 mg, 58 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 327 (M+H).

Ejemplo 4

1-([1,1'-bi(ciclopropan)]-1-il)-5-butil-5,6,7,9-tetrahidro-4H-pirano[4,3-e][1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-4-ona

Esquema 2, etapa F: Combinar N'-(1-butil-2-oxo-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-3-il)-1-ciclopropilciclopropanocarbohidrazida (832 mg, 1,9 mmol), DBU (58 jl, 0,4 mmol) y HMDS (5 ml) y calentar a 120 °C durante una noche. T ransferir a un matraz que contiene MeOH y calentar a 50 °C durante 1,5 h. Concentrar a presión reducida y purificar el residuo resultante por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con EtOAc/DCM 1:1 a EtOAc/(DCM/MeOH 90:10) 1:1. Combinar las fracciones que contienen el producto y concentrar a presión reducida. El residuo resultante se purifica por cromatografía ultrarrápida de fase inversa sobre C18, eluyendo con 10-70 % de ACN en NaHCO3 al 10 %/agua. Combinar las fracciones puras de la cromatografía y concentrar a presión reducida. Disolver el residuo resultante en MeOH, concentrar a presión reducida y secar en horno de vacío durante 2 h para obtener el compuesto del título (265 mg, 42 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 329 (M+H).

Ejemplo 5

1-([1,1'-bi(ciclopropan)]-1-il)-5-(ciclobutilmetil)-5,6,7,9-tetrahidro-4H-pirano[4,3-e][1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-4-ona

Esquema 2, etapa F: Combinar N-[1-(ciclobutilmetil)-2-oxo-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-3-il]-1-ciclopropilddopropanocarbohidrazida (334 mg, 0,8 mmol), DBU (24 pl, 0,16 mmol) y Hm Ds (2,6 ml) y calentar a 120 °C en un recipiente para microondas durante una noche. Enfriar a TA y transferir la mezcla de reacción a un matraz que contiene MeOH; calentar a 50 °C durante 1,5 h. Concentrar la mezcla de reacción a presión reducida y purificar el residuo resultante por cromatografía ultrarrápida sobre sílice, eluyendo con EtOAc/DeM 1:1 a EtOAc/(DCM/MeOH 90:10) 1:1. Combinar las fracciones puras de la cromatografía, concentrar a presión reducida y secar al vacío durante una noche para obtener el compuesto del título (82 mg, 30 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 341 (M+H).

Ejemplo 6

1-(1-ciclopropilciclopropil)-5-(ciclopropilmetil)-3-oxo-7,8-dihidro-5H-pirano-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4-ona

Esquema 3, etapa H: Disolver 1-ciclopropil-N-[4-(ciclopropilmetil)-3-oxo-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-2-il]ciclopropanocarbohidrazida (571,7 mg, 1,4 mmol) en AcOH (10 ml) y calentar en el microondas durante 3 h a 130 °C. Neutralizar la mezcla de reacción con NaOH 2 N y extraer con EtOAc (3x). Lavar los extractos orgánicos combinados con NaCl acuoso saturado, secar sobre Na2SO4 y concentrar a presión reducida. Purificar el residuo resultante por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con DCM/EtOAc/MeOH. Combinar las fracciones puras de la cromatografía y concentrar a presión reducida para obtener el compuesto del título (119 mg, 23,9 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 327 (M+H).

Ejemplo 7

1-([1,1'-bi(ciclopropan)]-1-il)-5-butil-8,9-dihidro-6H-pirano[3,4-e][1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-4(5H)-ona

Esquema 3, etapa H: Agitar una mezcla de N'-(4-butil-3-oxo-7,8-dihidro-5H-pirano[3,4-b]pirazin-2-il)-1-ciclopropilciclopropanocarbohidrazida (250 mg, 0,7 mmol) en HMDS (2,5 ml) a 120 °C durante una noche. Enfriar la mezcla de reacción a TA y agitar con metanol a 50 °C durante 1 h. Concentrar la mezcla de reacción a presión reducida. Purificar el residuo resultante por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con 0-10 % de MeOH en DCM para obtener el compuesto del título en bruto. Volver a purificar el compuesto del título en bruto por cromatografía ultrarrápida de fase inversa en C18, eluyendo con 10-50 % de ACN en H2O para dar el compuesto del título (75 mg, 30 % de rendimiento) después de la evaporación del disolvente de las fracciones puras. ES/MS (m/z): 329 (M+H).

Ejemplo 8

1-([1,1'-bi(ciclopropan)]-1-il)-5-(ciclopropilmetil)-5,6,7,8,9,10-hexahidro-4H-ciclohepta[e][1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-4-ona

Esquema 4, etapa G: Añadir HMDS (1,0 ml, 4,8 mmol) a una solución de 1-ciclopropil-N'-[4-(ciclopropilmetil)-3-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-5H-ciclohepta[b]pirazin-2-il]ciclopropanocarbohidrazida (0,111 g, 0,311 mmol) en THF (1,0 ml) y calentar a 120 °C durante una noche. Añadir más HMDS (2,2 ml, 11 mmol) y continuar el calentamiento a 120 °C durante otro día. Enfriar la mezcla de reacción a TA, añadir lentamente MeOH (1,0 ml) y calentar la mezcla subsiguiente a 50 °C durante 15 min. Concentrar la mezcla a presión reducida y purificar el residuo resultante por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con DCM/MeOH. Combinar las fracciones puras de la cromatografía y concentra a presión reducida para dar el compuesto del título en forma de una espuma de color castaño (0,04 g, 39 % de rendimiento). ES/MS (m/z): 339,2 (M+H).

Generación de proteínas PDE

Las secuencias de nucleótidos que codifican PDE1A (NP_001003683.1) y PDE1C (NP_005011.1) humanas de longitud completa se insertan en el vector pFastBacl (Invitrogen) con una etiqueta HIS N-terminal. Las secuencias de nucleótidos que codifican la PDE4D humana de longitud completa (NP_006194.2) y el dominio catalítico (restos 641­ 1141) de PDE3A (NP_000912.3) se insertan en el vector pFastBacl (Invitrogen) con una etiqueta HIS C-terminal. Las secuencias de nucleótidos que codifican la PDE6A humana de longitud completa (Np_000431.2) y PDE6B (AAH00249.1) se insertan en el vector pFastBacDual (Invitrogen) con una etiqueta HIS N-terminal y una etiqueta Flag N-terminal, respectivamente, para la producción del dímero PDE6A/6B. La generación de baculovirus y la expresión de proteínas en células Sf9 se llevan a cabo de acuerdo con el protocolo del sistema de expresión de baculovirus Bacto-Bac (Invitrogen). La secuencia de nucleótidos que codifica PDE1B (NP _000915.1) humana de longitud completa se inserta en pIEX4 (Novagen) con una etiqueta h Is C-terminal y ambas producciones de proteínas en células Sf9 se llevan a cabo de acuerdo con el protocolo del vendedor (Novagen). Las proteínas PDE etiquetadas con His se purifican usando agarosa Ni-NTA (Qiagen) seguido de cromatografía de exclusión por tamaño en una columna SUPERDEX® 200 (GE Healthcare) en tampón de almacenamiento (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Glicerol al 10 %). Las proteínas PDE etiquetadas con Flag incluyendo PDE6A/6B se purifican usando anti-Flag M2-agarosa (Sigma), después de la purificación a través de cromatografía en columna NiNTA y se eluyen en tampón de almacenamiento (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Glicerol al 10 %, péptido Flag 0,1 mg/ml). Todas las proteínas purificadas se almacenan a -80 °C en pequeñas alícuotas.

Ensayos enzimáticos de fosfodiesterasa

Todas las actividades de la enzima fosfodiesterasa de nucleótido cíclico 3', 5' (PDE) se miden con un ensayo enzimático radiométrico basado en el sistema de detección de SPA (ensayo de proximidad de centelleo). Los compuestos a probar se diluyen en dimetilsulfóxido puro (DMSO) usando curvas de respuesta de concentración de diez puntos. La concentración máxima de compuesto en la mezcla de reacción es 10 o bien 100 pM. Los compuestos a la concentración apropiada se preincuban con cualquiera de las enzimas PDE durante 30 minutos antes de que comience la reacción mediante la adición de sustrato. Se deja que las reacciones se produzcan durante 60 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las reacciones se detienen mediante la adición de perlas SPA. Las muestras se leen 12 horas después en un contador MICROBETA™ TRILUX®. "CI50" se refiere a la concentración del compuesto que produce el 50 % de la respuesta inhibidora máxima posible para ese compuesto. Los valores de CI50 se calculan representando los datos normalizados frente a log [compuesto] y ajustando los datos usando una ecuación logística de cuatro parámetros.

Ensayos enzimáticos de PDE dependiente de Ca2+-calmodulina

PDE1B, PDE1A y PDE1C se clonan y se purifican siguiendo procedimientos de generación de proteínas convencionales. El tampón de ensayo se prepara para dar una concentración final en el ensayo de Tris-HCl 50 mM, MgCl2 50 mM, CaCl2 4 mM, Albúmina de suero bovino al 0,1 % y Calmodulina 6 U/ml en agua, a pH 7,5. La concentración enzimática final es 0,25, 0,074 y 0,0012 nM, para p De 1A, PDE1B y PDE1C, respectivamente. Las reacciones se inician mediante la adición del sustrato, [³H]AMPc, para dar una concentración final de 47 nM.

T l 1: P n i in vir l E m l 1 nr l PDE1A PDE1B PDE1 h m n .

Los datos de la Tabla 1 demuestran que los compuestos de los Ejemplos 1 a 8 inhiben las actividades enzimáticas de PDE1A, PDE1B y PDE1C humanas in vitro.

Ensayos enzimáticos de PDE usando [³H]AMPc como sustrato

Las siguientes actividades fosfodiesterasa se miden usando [³H]AMPc como sustrato de reacción: PDE3A humana (dominio catalítico) y PDE4D humana. Ambas enzimas se clonan y se purifican siguiendo procedimientos convencionales. El tampón de ensayo se prepara para dar una concentración final en el ensayo de Tris-HCl 50 mM, MgCl28,3 mM, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1,7 mM y Albúmina de suero bovino al 0,1 % a pH 7,5. Las concentraciones enzimáticas finales son 0,008 y 0,021 nM para PDE3A y PDE4D, respectivamente. Las reacciones se inician mediante la adición del sustrato, [³H]AMPc, para dar una concentración final de 47 nM.

T l 2: P n i in vir l E m l 1 nr l PDE A mini líi PDE4D h m n .

Ensayos enzimáticos de PDE usando [3H]GMPc como sustrato

Las siguientes actividades fosfodiesterasa se miden usando [3H]GMPc como sustrato de reacción: PDE6A/6B humana. La forma catalítica activa de PDE6 humana es un dímero compuesto por una subunidad a (PDE6A humana) y una subunidad p (PDE6B humana). El dímero de PDE6A/6B humanas se produce mediante la estrategia de expresión y purificación, usando dos etapas de purificación, es decir, cromatografía NiNTA y anti-FLAG Sepharose. El tampón de ensayo se prepara para dar una concentración final en el ensayo de Tris-HCl 50 mM, MgCb 8,3 mM, EDTA 1,7 mM y Albúmina de suero bovino al 0,1 % a pH 7,5. La concentración final de enzima es 5 nM. Las reacciones se inician mediante la adición del sustrato, [3H]GMPc, para dar una concentración final de 80 nM.

T l : P n i in vir l E m l 1 nr PDE AB.

(continuación)

Los datos en las Tablas 1, 2 y 3 demuestran que los compuestos de los Ejemplos 1 a 8 son inhibidores selectivos de PDE1A, PDE1B y PDE1C humanas con respecto a PDE3A, PDE4D y PDE6AB humanas in vitro.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de fórmula:

en donde X es CH2CH2, CH2CH2CH2, OCH2 o CH2O; y

R es etilo, n-propilo, ciclopropilo o ciclobutilo;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

con la condición de que cuando X es CH2CH2, entonces R es distinto de ciclopropilo.

2. El compuesto o la sal de acuerdo con la reivindicación 1 en donde X es OCH2.

3. El compuesto o la sal de acuerdo con la reivindicación 1 en donde X es CH2O.

4. El compuesto o la sal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde R es ciclopropilo.

5. El compuesto o la sal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde R es n-propilo.

6. El compuesto o la sal de acuerdo con la reivindicación 1 que es:

7. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 6 que es:

8. El compuesto o la sal de acuerdo con la reivindicación 1 que es:

9. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 8 que es:

10. Un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para uso en terapia.

11. Un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para uso en el tratamiento de enfermedad renal crónica.

12. Un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para uso en el tratamiento de una enfermedad renal diabética.

13. Una composición farmacéutica, que comprende un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

14. Un procedimiento para preparar una composición farmacéutica, que comprende mezclar un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.