ES2886977T3 - Profilaxis y tratamiento de la infección ocular por Neisseria gonorrhoeae - Google Patents

Abstract

Un compuesto que es un ácido graso o un éster de un ácido graso, o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, seleccionado de entre ácido miristoleico C14:1cΔ9, ácido palmitoleico C16:1cΔ9 y monoglicérido de ácido cáprico C10:0 (monocaprina C10), para su uso en el tratamiento ocular o la profilaxis de una infección del ojo causada por Neisseria gonorrhoeae en un animal de sangre caliente.

Description

DESCRIPCIÓN

Profilaxis y tratamiento de la infección ocular por Neisseria gonorrhoeae

La presente invención se refiere a una profilaxis o un tratamiento nuevos contra la infección por Neisseria gonorrhoeae.

Cuando un bebé nace de una madre infectada con gonorrea, una enfermedad de transmisión sexual, causada por la bacteria Neisseria gonorrhoeae, hasta un 48 % desarrollarán oftalmia neonatal y hasta un 10 % de los que reciben profilaxis desarrollarán una infección. Las bacterias causan ulceración de la córnea, perforación e inflamación (Int. Ophthalmol. 35:135, 2015; BMJ.Clin.Evid. Systematic review 704, 2012). Esta infección puede provocar una pérdida de visión significativa o ceguera, incluso con tratamiento. Hasta el 80 % de las mujeres infectadas no saben que están infectadas, ya que pueden no presentar síntomas. De hecho, más del 50 % de las mujeres que acuden a clínicas de medicina genitourinaria, buscando tratamiento por un problema de salud reproductiva, no tenía síntomas de la infección (Sex.Transm.Infect. 85:317, 2009). Esto significa que las mujeres corren el riesgo de tener una infección por gonorrea no diagnosticada durante el embarazo y transmitir esa infección a su hijo durante el parto.

La conjuntivitis que se produce dentro de los primeros 28 días de vida se conoce como oftalmia neonatal o conjuntivitis neonatal (J. Antimicrob. Chemother. 14: 209, 1984) e incluye hinchazón e inflamación de los párpados del niño recién nacido, así como secreción amarillenta purulenta del ojo cerrado. A menudo, la infección comenzará en un ojo y se extenderá al otro ojo durante el curso de la infección. La principal forma en que los bebés se infectan es mediante la transferencia de un agente infeccioso, tal como la bacteria Neisseria gonorrhoeae, de la madre a los ojos del niño durante el proceso de parto. Las dos causas más comunes de oftalmia neonatal son Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis, siendo la primera la que tiene un inicio más rápido y generalmente más agresivo (J. Midwif. & Womens Health 55: 319, 2010). Si la oftalmia neonatal por Neisseria gonorrhoeae no se trata, o se trata sin éxito, puede producir cicatrices en la córnea o perforación de la córnea que pueden provocar ceguera permanente (Fanaroff and Martin's Neonatal-Perinatal Medicine: Diseases of the Fetus and Infant. Elsevier Health Sciences. pp. 737). La infección puede extenderse desde los ojos y causar septicemia y meningitis, que son potencialmente mortales, y artritis (Int. J. Infect. Dis. 5:139-43, 2001). Los bebés también pueden infectarse en el útero; incluso los bebés nacidos por cesárea están en riesgo (Sex.Transm. Dis. 6:77, 1979).

La infección ocular oftalmia neonatal, que puede causar ceguera permanente, normalmente se trataría con antibióticos. La profilaxis actualmente incluye la aplicación de una pomada oftálmica de tetraciclina al 1 % o eritromicina al 0,5 % poco después del nacimiento, sin embargo, el uso de pomadas oftálmicas a base de tetraciclina está disminuyendo debido a problemas relacionados con las resistencias a los antibacterianos. Históricamente, se ha utilizado nitrato de plata acuoso al 1-2 %, pero se produjo una incidencia muy alta de conjuntivitis inducida por el tratamiento (Int. J. Infect. Dis. 5: 139, 2001) y posibilidades de toxicidad (Bull World Health Organ. 67: 471, 1989) que se consideraron inaceptables y médicamente cuestionables. Ningún tratamiento profiláctico, incluidos el nitrato de plata y los antibióticos, resulta óptimo en el análisis de riesgo-beneficio y ninguno se recomienda para un uso generalizado (J. Matern. Fetal Neonatal Med. 24:769, 2011). De forma adicional, la profilaxis tiene una eficacia de solo un 80-90 % (N. Engl. J. Med. 318:653, 1988 y Bull. World Health Organ. 67: 471, 1989), y requiere tratamiento con antibióticos, a menudo ceftriaxona (Antimicrob. Agents Chemother. 43:2790, 1999). Para muchas N. gonorrhoeae multirresistentes, este es el último antibiótico disponible y recientemente se han presentado casos completamente resistentes (Antimicrob. Agents Chemother. 55: 3538, 2011 y Emerg. Infect. Dis. 17: 148, 2011), lo que requiere un cambio a la terapia dual porque un solo antibiótico ya no es efectivo. Persiste la preocupación sobre cómo implementar correctamente un tratamiento profiláctico o elegir el tratamiento correcto, especialmente debido a que la resistencia a los antimicrobianos, incluida la resistencia a múltiples fármacos (Curr. Opin. Infect. Dis. 27: 282, 2014), está aumentando.

En el Reino Unido no se ha realizado profilaxis desde la década de 1950 y actualmente solo se utiliza el cribado prenatal mediante la evaluación de los factores de riesgo (Bull. World Health Organ. 79:262, 2001). Los esfuerzos para reducir la transmisión de las infecciones por gonorrea de madre a hijo a menudo incluyen cribados prenatales, pero esto depende de varios factores en un sistema ideal. Como medidas de ahorro de costes, no todos los hospitales y autoridades sanitarias realizarán un cribado a todas las mujeres embarazadas bajo su cuidado, y elegirán realizar el cribado únicamente a aquellas que consideran que presentan "el riesgo" más alto (Nurs.Womens Health 18: 67, 2014). En un estudio en el que se analizó el cumplimiento de los estándares de las pruebas de detección de infecciones de transmisión sexual durante el embarazo, a más del 40 % de las mujeres embarazadas que deberían haber sido evaluadas no se les realizó ninguna prueba para detectar la gonorrea durante el embarazo. Dado que una mujer tiene hasta un 80 % de probabilidades de ser asintomática y un varón puede ser asintomático en hasta un 20 % de los casos, puede ser que la mujer embarazada no conozca sus verdaderos factores de riesgo. Esto es particularmente cierto si su pareja participa en actividades sexuales de alto riesgo que ella desconoce. Esto podría significar, además, que un cribado precoz podría resultar negativo, pero que la mujer podría ser positiva para N. gonorrhoeae más adelante en el embarazo. En realidad, en un estudio se ha explorado la percepción del riesgo de la salud sexual del varón incluyendo cribado de parejas masculinas en los programas de cribado prenatal, y ha proporcionado reacciones bastante curiosas de algunos de los participantes que antes no consideraban su papel en la potencial transmisión de una infección a los hijos no natos (Midwifery 29:351, 2013).

Como complicación adicional para reducir la transmisión de la infección por gonorrea mediante el cribado de las futuras mamás, no todas las mujeres forman parte de los programas de cribado prenatal. Una encuesta sobre las pautas internacionales de cribado ha revisado las prácticas de cuatro países, incluidas cinco pautas generales de práctica clínica prenatal y 20 pautas específicas de enfermedades; los abordajes a la atención prenatal son muy diferentes (Int. J. Based Healthc. 12:50, 2014). Las pautas clínicas NICE del Reino Unido (http://www.nice.org.uk/guidance/cg62/documents/antenatal-care-full-guideline2) no proporcionan recomendaciones para la gonorrea y el Real Colegio de Obstetras y Ginecólogos del Reino Unido no ofrece pautas para la gonorrea (Int. J. Based Healthc. 12:50, 2014). Incluso en las zonas en las que el cribado prenatal de gonorrea es habitual para todas las mujeres embarazadas, para algunas mujeres su primer contacto con el sistema médico, por una razón u otra, se produce en el momento del parto del niño. El cumplimiento de los cuidados prenatales no es obligatorio y es una situación compleja y, a menudo, personal, de desentrañar.

Si bien ha sido habitual la existencia de casos de queratitis gonocócica en neonatos, los adultos también son susceptibles. En la bibliografía aparecen cada vez más informes de infecciones oculares en adultos debido al estado de resistencia a antibióticos a múltiples fármacos de N. gonorrhoeae. Mientras que anteriormente un antibiótico de amplio espectro habría tratado con éxito una infección ocular en un adulto antes de que fuera identificada mediante cultivo como un gonococo, ahora esos tratamientos fallan, como en el caso de un varón malayo de 41 años: incluso después del tratamiento con ceftriaxona intravenosa y gotas de ceftazidima cada hora, la mejor agudeza visual corregida del paciente siete meses después del tratamiento fue 6/9 3 OD y 6/24 OS y su corrección refractiva fue 1,25/-1,50x160 OD y plano OS. Los autores de este caso señalan que la refracción había sido difícil de obtener debido a la cicatrización que invadía el eje visual del ojo izquierdo (Med. J. Malaysia 61: 366, 2006). Un artículo de 2015 describe el caso de un varón de 39 años en el que un ciclo de cuatro días de cloranfenicol no logró tratar una infección ocular. Cuando se presentó a un departamento de urgencias oculares, el ojo derecho solo podía detectar movimientos de la mano, los párpados superior e inferior estaban hinchados, había material purulento dentro y alrededor del ojo, se había producido lisis estromal de la córnea y la córnea se había perforado. Aunque la infección del varón se identificó como N. gonorrhoeae y se le administró ciprofloxacino y ceftriaxona por vía intravenosa y ofloxacino y eritromicina tópicas cada hora, todavía requirió múltiples injertos para reparar el daño producido en la córnea. Dos meses después de estas operaciones, su mejor agudeza visual fue 6/36 en un gráfico de Snellen (Int. Ophthalmol.

35:135, 2015). Otro caso de la literatura presenta una situación muy similar: un varón de 25 años, que acudió a un servicio de urgencias después de tres días de sufrir secreciones y recibió un tratamiento infructuoso, así que regresó en siete días con un caso muy avanzado. El ojo estaba cubierto de una secreción purulenta, tenía lisis estromal de la córnea y sufría una perforación que finalmente requirió un injerto. Su agudeza visual, sin ayuda, una vez que la cirugía lo había resuelto diez meses después, era 6/18 (Sex. Transm. Infect. 86:447, 2010). Estos autores demandaron pautas específicas del Reino Unido para el tratamiento de esta enfermedad, especialmente ante los crecientes problemas de resistencia a los antibióticos; este aislamiento fue resistente a ciprofloxacino y ácido nalidíxico.

Los mecanismos moleculares y genéticos que subyacen a la patogenia de las infecciones oculares gonocócicas no se conocen bien. Gran parte del centro de la investigación gonocócica está en la infección de transmisión sexual y su impacto sobre la salud reproductiva. Con el aumento de la resistencia a los antibióticos de múltiples fármacos, nos enfrentamos a un futuro de gonorrea intratable (Curr. Opin. Infect. Dis. 27:282, 2014). En 1880, la era anterior a los antibióticos, hasta el 79 % de los niños en instituciones para ciegos habían sido ciegos desde su nacimiento debido a oftalmia neonatal gonocócica (Bull. World Health Organ. 67:471, 1989). Sin un tratamiento eficaz, los bebés y los adultos se enfrentan a un futuro similar a la época anterior a los antibióticos.

Los diagnósticos de casos de gonorrea se han duplicado entre 2008 y 2013, con 29.291 casos nuevos en 2013 en Inglaterra (Public Health England, 2014). A lo largo de los años, Neisseria gonorrhoeae ha desarrollado resistencia a los antibióticos utilizados contra ella, de modo que ahora no se recomienda ningún antibiótico. En cambio, las cefalosporinas de tercera generación, los primeros antimicrobianos de elección recomendados, se utilizan en combinación con azitromicina, porque en 2011 se comunicaron los primeros aislamientos resistentes en Japón (Curr. Opin. Infect. Dis. 27:282, 2014; Antimicrob. Agents Chemother. 55:3538, 2011). Desde entonces, se han notificado aislamientos resistentes en América del Norte y Europa (Curr. Opin. Infect. Dis. 27:62,2014; Eurosurveillance 16: 14, 2011; The Lancet Infect. Dis. 14: 220, 2014). El aumento de la resistencia a los antimicrobianos en esta especie requiere opciones de tratamiento alternativas.

Todos los años desde la introducción de la penicilina, N. gonorrhoeae ha encontrado una forma de evitar múltiples intentos de tratarla (Clin. Microbiol. Rev. 27:587, 2014). Los seres humanos no pueden montar una memoria inmunológica contra estas bacterias; los pacientes que son tratados con éxito por la infección de transmisión sexual pueden volver a infectarse con la misma cepa de parejas no tratadas (J. Immunol. 188:4008, 2012). No existe una vacuna contra N. gonorrhoeae.

Para prevenir y/o tratar la oftalmia neonatal, la intervención dentro de las primeras horas después del nacimiento de los recién nacidos puede evitar que se establezcan infecciones. Una vez que se ha establecido una infección, como suele ser el caso en los adultos, es necesario tratar las infecciones para evitar que provoquen ceguera y/o daños en los ojos.

La profilaxis y/o el tratamiento posnatal pueden ser en forma de gotas oculares, pomada ocular, hidrogel u otro método de administración apropiado. El Grupo de Trabajo de Servicios Preventivos de Estados Unidos clasifica la profilaxis de la oftalmia neonatal como "Grado A", lo que significa que el beneficio neto es sustancial y recomienda que todos los recién nacidos reciban profilaxis dentro de las 24 horas posteriores al nacimiento (Final Evidence Review: Ocular Prophylaxis for Gonococcal Ophthalmia Neonatorum: Preventive Medication. U.S. Preventive Services Task Force, 2012).

Las propiedades antimicrobianas de ciertos ácidos grasos y derivados de ácidos grasos se conocen desde hace algún tiempo (revisadas en Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 7:111, 2012 y Appl. Microbiol. Biotechnol. 85:1629, 2010). Se ha publicado una investigación sobre los efectos antimicrobianos de los ácidos grasos en N. gonorrhoeae (Antimicrob. Agents Chemother. 43:2790, 1999). También hay evidencia de actividad antigonorrea de varios remedios caseros que contienen productos naturales. La administración oral de una preparación de Termitomyces microcarpus (un hongo) mezclado con la pulpa de la calabaza Cucúrbita pepo y las hojas del arbusto de vela Senna alata (Evidence-Based Compl. Alt. Med. 2013:620451,2013) se ha comunicado que cura infecciones de transmisión sexual (ITS) por gonorrea en Nigeria y otras partes de África. Las hojas de Gallesia gorazema se utilizan como remedio contra las ITS por gonorrea en muchas áreas de Brasil (J. Ethnopharmacol. 150:595, 2013), lo que está avalado por informes de otros estudios etnomedicinales del uso de plantas para el tratamiento de la gonorrea en Paraná, Brazil (J. Ethnopharmacol. 161:1, 2015). Se ha demostrado que una fracción extraída de las hojas de G. gorazema contenía tetradecanal (una forma reducida del ácido graso ácido mirístico), ácido palmítico (un ácido graso), octadecanal (un aldehido de cadena larga), Y-sitosterol (similar al colesterol), p-amirina y a-amirina (que se encuentran a menudo en plantas) y tres componentes principales que no pudieron identificarse (J. Ethnopharmacol. 150:595, 2013). La Azadirachta indica, conocido como Neem, también se utiliza para tratar las ITS por gonorrea (Int. J. Antimicrob. Agents.

33:86, 2009; J. Biol. Sci. 14: 110, 2014) y se ha demostrado que contiene ácidos grasos, incluidos ácido esteárico, ácido oleico y ácido linoleico en altos porcentajes (Biochem. Soc.Trans. 28:800, 2000). Se cree que el modo de acción de las propiedades antibacterianas de los ácidos grasos es la acción sobre la membrana de las células bacterianas y/o las proteínas y/o componentes asociados a la membrana (Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 7:111, 2012). Los documentos WO2009/072097A1 y EP0530861A2 describen formulaciones que utilizan combinaciones de dos o más ácidos grasos y/o derivados, pero no demuestran su actividad contra N. gonorrhoeae ni la eficacia de estas formulaciones en el ojo. A pesar de que los efectos antigonocócicos de los ácidos grasos y sus derivados se conocen desde hace 40 años (Infect. Immun. 17(2): 303-312, 1977), no se ha sugerido ni contemplado en la literatura un uso eficaz de ácidos grasos o sus derivados para tratar infecciones oculares.

Existe una clara necesidad de identificar tratamientos adicionales contra la infección ocular por N. gonorrhoeae. La presente invención propone superar esto con una profilaxis y/o tratamiento que no esté basada en antibióticos. Se sabe que N. gonorrhoeae es resistente a algunos ácidos grasos y que los ácidos grasos no tienden a ser antimicrobianos frente a bacterias Gramnegativas; tal conocimiento puede haber contribuido a la falta de investigación sobre el uso de ácidos grasos como agentes antigonocócicos. Algunos ácidos grasos son sustratos de los sistemas de bombas de eflujo que confieren resistencia a los antibióticos, ácidos grasos, detergentes, sales biliares y péptidos antimicrobianos (J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3:219, 2001). Sin embargo, este repertorio no abarca a todos los ácidos grasos. Adoptando un enfoque multidisciplinar, los inventores han podido abordar la preocupación de la Organización Mundial de la Salud acerca de la gonorrea intratable.

La presente invención ofrece una alternativa a las profilaxis y tratamientos actuales frente a la creciente resistencia a los antibióticos, proporcionando una profilaxis ocular o un tratamiento ocular para la prevención de la oftalmia neonatal a base de un ácido graso o un derivado de ácido graso.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto que es un ácido graso o un éster de un ácido graso, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento ocular o profilaxis de una infección del ojo causada por Neisseria gonorrhoeae en un animal de sangre caliente.

En particular, el compuesto de ácido graso se selecciona de entre ácido miristoleico C14:1cA9, ácido palmitoleico C16:1cA9 y monoglicérido de ácido cáprico C10:0 (monocaprina C10).

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "compuesto de ácido graso" se usa colectivamente para hacer referencia a ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos, o a sus sales farmacéuticamente aceptables.

En una realización preferida, el compuesto de ácido graso es ácido miristoleico C14:1cA9 o monoglicérido de ácido cáprico C10:0 (monocaprina C10).

En una realización mucho más preferida, el compuesto de ácido graso es monoglicérido de ácido cáprico C10:0 (monocaprina C10).

En una realización preferida más, el compuesto de ácido graso está en una formulación oftálmica que contiene un agente quelante, preferentemente, un agente quelante de ion calcio (Ca2+).

En una realización preferida más, el uso es para una infección ocular causada por Neisseria gonorrhoeae en un ser humano.

En una realización preferida más, el uso es para una infección ocular causada por Neisseria gonorrhoeae en un recién nacido.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una formulación oftálmica que comprende un compuesto de ácido graso como se ha definido anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para su uso en el tratamiento ocular o profilaxis de una infección del ojo causada por Neisseria gonorrhoeae.

En una realización preferida, la formulación está en forma de colirio líquido, una pomada o un hidrogel.

En una realización adicional, la formulación comprende además un agente quelante.

El compuesto de ácido graso puede formularse en cualquier forma adecuada para su administración al ojo, junto con vehículos adecuados conocidos farmacéuticamente aceptables, aditivos y/o excipientes, por ejemplo como líquido para colirios, una pomada, un hidrogel, o en cualquier otra forma adecuada para su aplicación en el ojo. Algunos ejemplos de vehículos adecuados, aditivos y/o excipientes se conocen en la técnica. Por ejemplo, para colirios o un hidrogel, estos pueden incluir uno o más de un transportador o vehículo (habitualmente agua), un agente tamponador (para mantener el pH), un modificador de la tenacidad (tal como cloruro sódico y dextrosa), un modificador de la viscosidad (tal como derivados de celulosa, dextrano, alcohol polivinílico) y un conservante. Por ejemplo, para una pomada ocular, estos pueden incluir uno o más de un hidrocarburo (tal como vaselina, lanolina, vasolina) y un dispersante y/o tensioactivo a baja concentración.

En una realización preferida, un colirio espesado contendría el compuesto de ácido graso (tal como monocaprina), un tensioactivo no iónico (tal como polisorbato 20), un disolvente (tal como propan-1,2-diol) y un polímero (tal como HPMC o CMC).

En una realización preferida, la formulación es un colirio espesado, que contiene HPMC (hidroxipropilmetilcelulosa), CMC (carboximetilcelulosa) u otro agente espesante a base de polímero o celulosa adecuado. Dichos componentes de las formulaciones oculares contribuyen a la estabilidad y la solubilidad.

En una realización preferida, la formulación contiene un emulsionante, tal como polisorbato 20, Tween 20. Por ejemplo, para el uso de monocaprina desde al 0,068 % al 0,125 %, se utilizaría una concentración de polisorbato 20 al 0,2 %, y para monocaprina del 0,188 % al 0,25 %, una concentración de polisorbato 20 al 0,5 %.

En una realización preferida, la formulación contiene el disolvente propano-1,2-diol.

Se ha demostrado que las formulaciones descritas en el presente documento conservan la actividad antigonocócica durante al menos 9 meses después de su creación, cuando se almacenan a temperatura ambiente.

En los casos en los que sea necesario o se desee, el compuesto de ácido graso puede usarse o formularse junto con un agente quelante, por ejemplo, un agente quelante de iones de calcio (Ca2+). Puede incluirse un agente quelante, por ejemplo, para reducir o prevenir cualquier inhibición, en caso de que la hubiera, de la actividad antibacteriana del compuesto de ácido graso causada por iones de calcio (Ca2+) u otros iones metálicos presentes en el fluido lagrimal natural. Los ejemplos de agentes quelantes adecuados que pueden usarse incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA), edetato cálcico disódico hidrato, edetato disódico dihidrato, deferoxamina y penicilamina, en particular EDTA. Los ejemplos de otros medios para proteger los compuestos de la inhibición incluyen la modificación química de los ácidos grasos, tal como la esterificación de los ácidos grasos, para hacer que los ácidos grasos sean menos susceptibles a la fuerza iónica del fluido lagrimal.

Las infecciones de oftalmia neonatal de los bebés poco después del nacimiento, es la infección ocular más común causada por N. gonorrhoeae, sin embargo, la profilaxis o el tratamiento potencial de infecciones oculares de seres humanos a cualquier edad están dentro del alcance de la presente invención.

La presente invención es útil para atacar infecciones oculares causadas por Neisseria gonorrhoeae, pero también puede ser eficaz contra otras infecciones oculares. En particular, la monocaprina a la concentración utilizada para la formulación ocular antigonocócica es bactericida para Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Streptococcus pneumoniae (M. Christodoulides, comunicación personal).

Se pueden incluir uno o más de los compuestos de ácidos grasos en las formulaciones. De manera adicional, se pueden incluir uno o más de otros principios activos en las formulaciones.

La dosificación, los principios activos incluidos en las formulaciones y el método de administración de los principios activos pueden ajustarse, dependiendo de las necesidades de tratamiento. La epidemiología puede sugerir, con el tiempo, que uno o más de los tratamientos pueden resultar más eficaces que otros y esto puede variar según el país o la región. Un intervalo de dosificación adecuado para los compuestos de ácidos grasos en la formulación ocular es de 0,07 mM a 10 mM, preferentemente de 0,125 mM a 5 mM, en particular de 0,25 nm a 4 mM.

En una realización preferida, el compuesto de ácido graso se ha solubilizado en un disolvente, tal como propan-1,2-diol, con un tensioactivo no iónico, tal como polisorbato 20, y con un polímero, tal como HPMC o CMC, en un colirio espesado; por ejemplo, una formulación preferida para la administración ocular sería HPMC al 1 %, monocaprina al 0,188 %, polisorbato 20 al 0,5 %, en el que la monocaprina se solubiliza en propan-1,2-diol.

La invención ha demostrado propiedades bacteriostáticas, es decir, la capacidad para reducir o prevenir el crecimiento de N. gonorrhoeae, así como propiedades bactericidas, es decir, la capacidad para matar N. gonorrhoeae. Con una concentración suficiente, los compuestos pueden prevenir el crecimiento de las bacterias y reducir el número de bacterias viables. Además, la invención ha demostrado que los compuestos de ácidos grasos son ventajosamente no irritantes para el ojo y, por tanto, adecuados para la administración ocular.

Los compuestos se pueden administrar en forma de profármaco que se descompone en el cuerpo humano o animal para dar el compuesto original. Los profármacos serían procesados por el huésped o las bacterias para generar los ácidos grasos del principio activo o sus derivados. En la presente invención, se puede seleccionar un profármaco que se descompondrá en la superficie del ojo de manera que libere uno de los compuestos de ácidos grasos antimicrobianos activos.

El ácido láurico (C12: 0) también se conoce como ácido dodecanoico, ácido n-dodecanoico, ácido dodecílico, ácido dodecoico, ácido lauroesteárico, ácido vúlvico, ácido 1-undecanocarboxílico y ácido duodecílico.

El ácido tridecanoico (C13:0) también se conoce como ácido tridecílico.

El ácido miristoleico (C14:1cA9) también se conoce como ácido (Z)-tetradec-9-enoico, ácido 9-tetradecenoico, ácido 9-cis-tetradecenoico, ácido cis-A9-tetradecenoico, ácido miristolénico y ácido oleomirístico.

El ácido palmitoleico (C16:1cA9) también se conoce como ácido (9Z)-hexadec-9-enoico, ácido cis-palmitoleico y ácido 9-cis-hexadecenoico.

El ácido linolénico (C18: 3cA9,12,15) en el presente documento se refiere a ácido a-linolénico.

La monocaprina (C10) es un monoglicérido de ácido cáprico (C10:0). El ácido cáprico también se conoce como ácido decanoico, ácido n-cáprico, ácido n-decanoico, ácido decílico y ácido n-decílico.

El dodecanoato sódico también se conoce como sal de sodio del ácido dodecanoico, sal de sodio de ácido láurico y laurato sódico.

El preferido como compuesto de ácido graso para su uso de acuerdo con la invención es ácido miristoleico C14:1cA9, ácido palmitoleico Cl6:1cA9 o monoglicérido de ácido cáprico C10:0 (monocaprina C10). El más preferido como compuesto de ácido graso es monoglicérido de ácido cáprico C10:0 (monocaprina C10).

A continuación, la invención se describirá únicamente a modo de ejemplo y con referencia a los dibujos adjuntos en los que se demuestra que los compuestos de ácidos grasos son eficaces y útiles de acuerdo con la invención para reducir o prevenir el crecimiento y/o para matar N. gonorrhoeae, no son irritantes para los ojos y son activos cuando se formulan en formulaciones de administración de fármacos oftálmicos.

La figura 1 representa la estructura del ácido láurico (C12:0).

La figura 2 representa la estructura del ácido tridecanoico (C13:0).

La figura 3 representa la estructura del ácido miristoleico (C14:1cA9).

La figura 4 representa la estructura del ácido palmitoleico (C16:1cA9).

La figura 5 representa la estructura del ácido linolénico (C18:3cA9,12,15).

La figura 6 representa la estructura de la monocaprina (C10).

La figura 7 representa la estructura de dodecanoato sódico.

La figura 8 muestra un gráfico que compara la actividad antigonocócica contra N. gonorrhoeae, de compuestos de ácidos grasos formulados en fluido de lágrima artificial que incluye cloruro de calcio.

La figura 9 muestra un gráfico que compara la actividad antigonocócica contra N. gonorrhoeae, de compuestos de ácidos grasos formulados en fluido de lágrima artificial sin cloruro de calcio.

La figura 10 muestra un gráfico de la reducción logarítmica de N. gonorrhoeae unida a las células epiteliales de la córnea humana cuando se añadió monocaprina (C10) inmediatamente después de las bacterias o 90 minutos después de la infección. Las medias trazadas y las barras de error representan desviaciones estándar (n = 3).

Ejemplos

Ejemplo 1

Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

La cepa de N. gonorrhoeae bien caracterizada NCCP11945 (Chung GT et al. (2008) Complete genome sequence of Neisseria gonorrhoeae NCCP11945. Journal of Bacteriology 190: 6035-6036) se usó en la etapa de cribado de este experimento. En los ensayos de reducción logarítmica se utilizaron ocho aislamientos que se obtuvieron de Public Health England de varios lugares europeos. Todos los aislamientos se cultivaron por primera vez durante 24 horas antes del ensayo mediante siembra en placa con medio sólido GC (Oxoid Limited, Hampshire, Reino Unido) con suplementos de Kellogg e incubando a 37 °C, CO² al 5 % (Kellogg DS, Jr., et al., (1963), J Bacteriol 85: 1274-1279).

Productos químicos

Una lista completa de todos los ácidos orgánicos analizados en este estudio se encuentra en la Tabla 1. Los compuestos analizados incluyen ácidos grasos saturados e insaturados, monoglicéridos, ácidos dicarboxílicos y sales de sodio de ácidos grasos. Todos los compuestos investigados se resuspendieron a una concentración de 100 mM en etanol a menos que se indique. Todos los productos químicos se obtuvieron en Sigma-Aldrich (Poole, Dorset, Reino Unido).

Medición de la acción bactericida de ácidos grasos seleccionados

Las reducciones logarítmicas se realizaron utilizando el mismo método que en Bergsson et al., (1999), Antimicrob Agents Chemother 43: 2790-2792. Resumiendo, las células se suspendieron en caldo GC (18 g/l GC Base (Oxiod, Limited) con suplementos definidos añadidos) hasta una densidad óptica de 0,3 a 520 nm que es aproximadamente equivalente a 107-108 células por mililitro (Macfarlane DE et al.(1980) Improved media for the culture of Neisseria gonorrhoeae. J Med Microbiol 13: 597-607). A continuación, se añadieron quinientos microlitros de la suspensión a 5 |jl de las soluciones madre 100 mM para dar una concentración final de 1 mM. También se realizó un control negativo para calcular la reducción del título bacteriano mediante la adición de 500 j l a 5 j l de etanol. A continuación, los tubos se mezclaron a temperatura ambiente durante dos minutos y se diluyeron inmediatamente en una serie de diluciones de 10 veces hasta 10-4. Las diluciones se sembraron extendiendo 10 j l en un cuarto de placa y también se sembraron 100 j l de la solución pura. Las placas se incubaron a 37 °C durante 48 horas. Todas las muestras se sembraron por duplicado. Una reducción en el recuento de células viables en más de 4 log10 se consideró bactericida y se seleccionó para una investigación adicional. A continuación se analizaron los compuestos bactericidas a concentraciones de 0,75, 0,5 y 0,25 mM (también se usó 0,125 mM en algunos compuestos potentes) para encontrar la concentración bactericida mínima. También se realizaron ensayos adicionales a concentraciones más bajas en los ocho aislamientos clínicos de origen europeo.

Como se muestra en los resultados de la Tabla 1, el ácido láurico (C12:0), el ácido tridecanoico (13:0), el ácido miristoleico (14:1cA9), el ácido palmitoleico (16:1cA9), el ácido linolénico (C18:3cA9,12,15), la monocaprina (C10) y el dodecanoato sódico pueden inhibir el crecimiento de la cepa NCCP11945 de Neisseria gonorrhoeae in vitro a una concentración de 1 mM. Otros ácidos orgánicos también fueron activos a esta concentración, como se indica en la Tabla 1.

T l 1

continuación

Como se muestra en los resultados de la Tabla 2, el ácido láurico (C12:0), el ácido tridecanoico (C13:0), el ácido miristoleico (C14:1cA9), el ácido palmitoleico (C16:1cA9), el ácido linolénico (C18:3cA9,12,15), la monocaprina (C10) y el dodecanoato sódico pueden producir una reducción logarítmica en las bacterias viables de la cepa NCCP11945 de Neisseria gonorrhoeae a una concentración de 1 mM 2 minutos.

Como muestran los resultados de la Tabla 3, que presenta datos de las reducciones logarítmicas de los recuentos de células bacterianas, contra un panel de nueve aislamientos de N. gonorrhoeae (cepa NCCP11945 y ocho aislamientos de Public Health England), el ácido miristoleico (C14:1cA9), ácido palmitoleico (C16:1cA9), ácido linolénico (C18:3cA9,12,15) y monocaprina (C10) tienen una concentración bactericida mínima, definida como la concentración más baja analizada para dar un promedio de 4 reducción log10 en el recuento bacteriano tras una exposición de dos minutos, de 0,5 mM. Contra un panel de nueve aislamientos de N. gonorrhoeae, el ácido láurico (C12:0), el ácido tridecanoico (C13:0), y el dodecanoato sódico tienen una concentración bactericida mínima de 0,75 mM.

T l

Ejemplo 2

Ensayo de opacidad y permeabilidad corneal bovina (BCOP)

Se recolectaron ojos de bóvidos de un matadero local (ABP, Guildford, Surrey, Reino Unido) y se transportaron en solución salina fría para realizar ensayos en el laboratorio. Cada ojo se examinó primero en busca de signos de daños antes de su uso. El ensayo se realizó de acuerdo con Abdelkader et al., (2012), Int J Pharm 432: 1-10. El tiempo de exposición de las sustancias de ensayo fue de 30 segundos. Los compuestos bactericidas seleccionados se analizaron a una concentración de 1 mM en solución salina. En conjunto, la concentración de etanol remanente de la solución madre de los ácidos orgánicos fue, por tanto, del 1 %. Un control negativo de solución salina con etanol al 1 %, un control irritante de acetona al 100 % y un control irritante fuerte de hidróxido sódico 0,5 M, se analizaron todos en cada experimento. A continuación, se lavó el área de ensayo de la córnea con 10 ml de solución salina.

El daño de la córnea en el área de ensayo se evaluó mediante tinción con fluoresceína y se examinó con un filtro de azul cobalto. La puntuación patológica basada en la opacidad, la integridad epitelial y el desprendimiento epitelial se realizó de acuerdo con la publicación anterior (Vanerp YHM et al., (1990), Toxicology in Vitro 4: 267-269). Cada uno de los siete candidatos se analizó por triplicado, cada prueba se realizó en un día separado de un lote diferente de globos oculares. La histología corneal se realizó según Abdelkader et al., (2012), Int J Pharm 432: 1-10 mediante la evaluación del daño a la capa epitelial y al estroma de la córnea después de la tinción con hematoxilina y eosina.

Como se muestra en los resultados de la Tabla 4, el ensayo de BCOP predice que el ácido láurico (C12:0), el ácido tridecanoico (13:0), el ácido miristoleico (14:1cA9), el ácido palmitoleico (16:1cA9), el ácido linolénico (C18:3cA9,12,15), la monocaprina (C10) y el dodecanoato sódico no producirán irritación en el ojo humano. Estos no producen un daño significativo en la superficie de la córnea, según se pone de manifiesto mediante la tinción con fluoresceína y exploración histológica tres veces distintas en el ensayo de BCOP.

T l 4

Ejemplo 3

Ensayo de huevo de gallina - Membrana corioalantoidea (HET-CAM)

El HET-CAM se realizó según Alany et al., (2006), J Control Release 111: 145-152. Los huevos blancos de gallinas leghorn fertilizados se compraron a Henry Stewart & Co. Ltd (Fakenham, Norfolk, Reino Unido) y se entregaron a la Universidad de Kingston. Todos los huevos se revisaron en busca de daños y se incubaron a 37 °C con 60-70 % de humedad relativa. El día 4, los huevos se sacaron de sus cáscaras y se colocaron en cámaras de incubación. El día 9, se analizaron las CAM. Esto se realizó aplicando 200 pl del material de ensayo y registrando los resultados a los 30, 120 y 300 segundos. En cada uno de estos puntos de tiempo, se evaluó el efecto de la sustancia sobre la CAM evaluándolos contra el sistema de puntuación (Vanerp YHM, et al., (1990), Toxicology in Vitro 4: 267-269).

Como se muestra en los resultados de la Tabla 5, el ensayo (HET-CAM) predice que el ácido láurico (C12: 0), el ácido tridecanoico (13:0), el ácido miristoleico (14:1cA9), el ácido palmitoleico (16:1cA9), el ácido linolénico (C18:3cA9,12,15), la monocaprina (C10) y el dodecanoato sódico no serán irritantes para el ojo humano. El hidróxido sódico se analizó a 0,1 M, como un control irritante fuerte. Los ácidos orgánicos se analizaron a concentraciones de 1 mg/ml, no mostraron signos de irritación en el ensayo HET-CAM. La concentración de ensayo HET-CAM de 1 mg/ml es más alta que la concentración bactericida de 1 mM. Esto daría un intervalo de 3,6 mM para el ácido linolénico a 5 mM para el ácido láurico. Como todos los candidatos eran totalmente bactericidas a una concentración de 1 mM, esta concentración analizada se utilizó para demostrar que estos candidatos serían totalmente seguros de usar.

Ejemplo 4

Ensayo de lisis de glóbulos rojos (RBC)

Se obtuvo sangre entera bovina de un matadero local (ABP, Guildford, Surrey, Reino Unido), añadiendo 90 ml de sangre a 10 ml de anticoagulante citrato trisódico 110 mM. Los glóbulos rojos se aislaron el mismo día. Los glóbulos rojos se lavaron mediante tres repeticiones de centrifugación (1.500 x g durante 10 minutos) y resuspensión en PBSG. Los ensayos se realizaron siguiendo las directrices del Laboratorio de Referencia de la Unión Europea para alternativas a las pruebas con animales (EURL-ECVAM) (Protocolo de Lewis RW (2010) DB-ALM N.° 99: Red blood cell (RBC) Test System. EURL ECVAM). Los ácidos orgánicos se prepararon en DMSO y se diluyeron hasta una concentración máxima de DMSO del 10% (v/v). Las muestras se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se centrifugaron a 10.000 rpm durante 2 minutos. Se tomó una alícuota de 750 |jl del sobrenadante y se probó la absorbancia a 451 nm.

Como se muestra en los resultados de la Tabla 6, el ensayo de lisis de glóbulos rojos predice que, a su concentración bactericida mínima, el ácido láurico (C12: 0), el ácido tridecanoico (13:0), el ácido miristoleico (14:1cA9), la monocaprina (C10) y el dodecanoato sódico no son irritantes.

Ejemplo 5

Ensayos en fluido lagrimal artificial

Se preparófluido de lágrima artificial como se indica en Mirejovsky et al., Optometry and Vision Science, (1991), 68: 858-864. Los candidatos a ácidos grasos se analizaron en fluido de lágrima artificial para demostrar que aún eran capaces de matar las bacterias en este entorno. En estos experimentos se utilizó la cepa NCCP11945 de Neisseria gonorrhoeae. Como las reducciones logarítmicas anteriores, se suspendieron 107 células en caldo GC. La suspensión celular se centrifugó para eliminar el medio de cultivo y las bacterias se resuspendieron en el fluido de lágrima. A continuación, se añadió a los candidatos de ácidos orgánicos concentrados. A continuación, las células se contaron de nuevo después de dos minutos de exposición para estimar cualquier reducción debida a la exposición al ácido graso.

En un primer experimento, la formulación de fluido de lágrima artificial incluye cloruro de calcio para imitar al calcio de las lágrimas naturales. Como lo demuestran los resultados mostrados en la figura 8, las propiedades antigonocócicas del ácido miristoleico (C14: 1cA9), el ácido palmitoleico (C16:1cA9), el ácido linolénico (C18: 3cA9,12,15) y la monocaprina (C10) se retienen en la formulación de fluido de lágrima artificial que contiene cloruro de calcio.

En un segundo experimento, se omitió el cloruro de calcio de la formulación de fluido de lágrima artificial. Los resultados de la figura 9 indican que las propiedades antigonocócicas del ácido láurico (C12:0), el ácido tridecanoico (C13:0) y el dodecanoato sódico se retenían en la formulación de fluido de lágrima artificial sin cloruro cálcico.

Estos resultados indican que el calcio puede reducir o prevenir la actividad antimicrobiana de algunos de los compuestos.

Ejemplo 6

Las profilaxis utilizadas anteriormente para la oftalmia neonatal se aplican en la primera hora después del nacimiento. Para su uso en profilaxis, el fármaco debe poder matar las células bacterianas después de que las bacterias hayan tenido tiempo suficiente para infectar a las células humanas. Se analizó uno: monocaprina.

Modelo de infección por cultivo celular

Las células epiteliales primarias de la córnea se obtuvieron de Life Technologies (Paisley, Glasgow, Reino Unido) y se cultivaron en medio sin suero de queratinocitos (Life Technologies), a 37 °C con CO² al 5 % hasta el 80 % de confluencia. A continuación, las células se trataron con tripsina, se lavaron, se añadieron a placas de 24 pocillos y se incubaron durante 24 horas más. El medio fue reemplazado y se añadió una suspensión recién preparada de células P+ Opa+ de la cepa NCCP11945 de N. gonorrhoeae (aproximadamente 107 UFC/ml) a las células para obtener una multiplicidad de infección de 10. Todas las muestras se realizaron por duplicado. Se añadió monocaprina (1 mM, 0,5 mM, 0,25 mM y 0,125 mM) bien directamente después de las bacterias o bien después de 90 minutos. Los controles sin infección mostraron la morfología de las células sanas, los controles tratados no infectados mostraron el efecto del fármaco sobre las HCEC, los controles de infección fueron controles positivos utilizados en reducciones logarítmicas para medir el efecto del fármaco y los controles de gentamicina compararon la acción de gentamicina y monocaprina. El tiempo total de la infección fue de tres horas. Las células se lavaron cinco veces con 1 ml de PBS para cada pocillo. Los pocillos se trataron con saponina al 1 % caliente en PBS y se incubaron durante 10 minutos a 37 °C. A continuación, se añadieron 900 j l de caldo GC y se calcularon las reducciones logarítmicas como se ha indicado anteriormente. Las UFC de los pocillos expuestos al fármaco se compararon con los recuentos de UFC de los controles de infección para estimar la reducción logarítmica causada por la acción de la monocaprina. Las comparaciones de las reducciones logarítmicas en diferentes momentos de administración del fármaco a concentraciones dadas se analizaron en una prueba t no pareada utilizando GraphPad Prism (versión 6.01).

Los pocillos de cultivo celular se procesaron alternativamente para microscopia y contenían cubreobjetos de vidrio redondos de 13 mm. Después de lavar en PBS 0,1 M, las células se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de lavarlas en PBS y bloquearlas con seroalbúmina bovina al 5 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron, cada uno con 1 ml de PBS cuatro veces. A cada pocillo, se añadieron 200 pl de anticuerpo anti-gonocócico IgG policlonal de conejo (Abcam plc., Cambridge, Reino Unido) a una dilución de 1/400 en BSA al 0,2 % y las placas se incubaron a 4 °C durante la noche. Los pocillos se lavaron de nuevo y se añadió una dilución 1/500 de IgG policlonal de cabra anti-IgG de conejo conjugada con Alexa Fluor 555 y una faloidina-Flúor 488 (Abcam plc.) 1/1000 en BSA al 0,2 % durante 1 hora y luego se lavaron antes de montar en un portaobjetos de vidrio con medio de montaje Fluoroshield con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Abcam plc.). Los portaobjetos se vieron con un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse i80 (Nikon UK Limited) y las imágenes se capturaron con filtros DAPI, TRITC y TRITC estándar que utilizan el software NIS-Elements BR 3.0 SP7 (Nikon UK Limited). Las imágenes se fusionaron posteriormente con ImageJ [Schneider CA, Rasband WS, Eliceiri KW: Nature methods, 2012, 9(7):671-675].

Tinción de vivas/muertas

Se utilizó el kit de viabilidad bacteriana LIVE/DEAD® BacLight™ para microscopia (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del curso de la infección, los pocillos se lavaron cinco veces con NaCl al 0,85% estéril para eliminar las células bacterianas no adheridas. Se añadió colorante a cada pocillo durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de lavar con una solución salina al 0,85 %. Los cubreobjetos de vidrio se montaron en aceite de montaje BacLight visualizado en una Nikon Eclipse i80 (Nikon UK Limited) con filtros FITC y TRITC estándar usando el software NIS-Elements BR 3.0 SP7 (Nikon UK Limited) y luego se fusionaron más tarde usando ImageJ.

Los resultados de la reducción logarítmica mostrados en la figura 10 indican que la monocaprina (C10) a una concentración de 1 mM es capaz de matar a Neisseria gonorrhoeae que ha infectado células epiteliales humanas durante 90 minutos.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que es un ácido graso o un éster de un ácido graso, o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, seleccionado de entre ácido miristoleico C14:1cA9, ácido palmitoleico C16:1cA9 y monoglicérido de ácido cáprico C10:0 (monocaprina C10), para su uso en el tratamiento ocular o la profilaxis de una infección del ojo causada por Neisseria gonorrhoeae en un animal de sangre caliente.

2. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compuesto es ácido miristoleico C14:1cA9 0 monoglicérido de ácido cáprico C10:0 (monocaprina C10) o un solvato del mismo.

3. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compuesto es monoglicérido de ácido cáprico C l0:0 (monocaprina C10).

4. El compuesto para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el compuesto es una formulación oftálmica que contiene un agente quelante.

5. El compuesto para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la infección ocular está en un ser humano.

6. El compuesto para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la infección ocular está en un recién nacido.

7. Una formulación oftálmica que comprende un compuesto tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para su uso en el tratamiento ocular o la profilaxis de una infección del ojo causada por Neisseria gonorrhoeae.

8. Una formulación para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en forma de colirio líquido, de pomada o de hidrogel.

9. Una formulación para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, que comprende además un agente quelante.