ES2881870T3 - Métodos de cribado de compuestos para el tratamiento o la prevención de una infección viral o una afección relacionada con un virus - Google Patents
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Abstract
Un método de cribado de un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una infección viral o afección relacionada con un virus en un individuo, que comprende las etapas de: a) determinar la capacidad de un compuesto candidato para promover la interacción entre CBP20 y CBP80 en una muestra, y b) seleccionar el compuesto candidato que se determina que promueve dicha interacción en la etapa a).
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos de cribado de compuestos para el tratamiento o la prevención de una infección viral o una afección relacionada con un virus
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere al campo de los métodos de cribado de compuestos que son útiles para el tratamiento o la prevención de una infección viral o una afección relacionada con un virus. Los compuestos que se han seleccionado con los métodos anteriormente mencionados pueden proporcionar un control duradero del rebote viral y/o un gran espectro de acción con efectos secundarios limitados.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La replicación viral se refiere a la formación de virus durante el proceso de infección en las células hospedadoras diana, que incluye la traducción de ARN virales por la maquinaria endógena. En particular, muchos ARN virales se traducen y eventualmente procesan a través de modificaciones postraduccionales antes de ser expuestos fuera del núcleo.
La identificación de compuestos para el tratamiento o la prevención de una infección viral o una afección relacionada con un virus en un individuo ha conducido al desarrollo de terapias novedosas.
Entre las afecciones relacionadas con un virus, el sida se ha convertido en una pandemia mundial. Las terapias actuales han tenido éxito en controlar la enfermedad, pero el uso a largo plazo de terapia antirretroviral (ART), que es una combinación de 3TC, raltegravir y tenofovir, está limitado por problemas de resistencia a fármaco y efectos secundarios.
Además, esos compuestos no inhiben necesariamente la replicación de las cepas virales que tienen mutaciones, que es propensa a conferir el desarrollo de cepas resistentes.
En particular, para infecciones por el VIH, los actuales fármacos de ART necesitan ser tomados durante toda la vida y solo atenúan la enfermedad sin curarla. Un motivo es que las terapias para el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) reducen la carga viral durante el tratamiento, pero los títulos se recuperan después de que se interrumpa el tratamiento, que es una de las consecuencias de la latencia del virus.
El acceso a la terapia antirretroviral de gran actividad (HAART), basada en la combinación de proteasa del VIH e inhibidores de la transcriptasa inversa, ha cambiado espectacularmente el pronóstico de la infección por el VIH. Como resultado, se considera que el VIH es una enfermedad crónica en los países desarrollados. Sin embargo, el uso a largo plazo de HAART está limitado por problemas de resistencia a fármaco y efectos secundarios.
Por ejemplo, ya se ha observado resistencia a las nuevas clases de fármacos anti-VIH/sida, tales como Raltegravir® (inhibidor de las integrasas) y Enfuvirtide® (inhibidor de la entrada).
Por tanto, se han propuesto alternativas a la ART, que incluyen por ejemplo una combinación de 3TC-Tenofovir-Raltegravir y AZT (HAART).
Se descubrió un derivado de indol (IDC16) que interfería con la actividad de potenciador del corte y empalme del factor de corte y empalme de la proteína SR SRSF1 (véase como referencia Tazi et al. Alternative splicing: regulation of HIV-1 multiplication as a target for therapeutic action. FEBS J. 277, 867-876 (2010)). IDC16 es un compuesto de indol tetracíclico fusionado. Este compuesto suprime la producción de proteínas virales clave, comprometiendo así la posterior síntesis de pre-ARNm del VIH-1 de longitud completa y el ensamblaje de partículas infecciosas.
Con el fin de minimizar el riesgo de que estos derivados de indol se intercalen entre las bases de ADN, se han desarrollado compuestos alternativos, que son particularmente eficaces en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el proceso de corte y empalme, pero que, en un modo de supresión, tienen una toxicidad celular que es claramente inferior a la de los derivados de indol de la técnica anterior.
El documento de patente WO2010/143169 informa de compuestos que se ha encontrado que son eficaces en el tratamiento del sida y otras enfermedades resultantes de cambios en los procesos de corte y empalme.
Dichas moléculas, y en particular aquellas en las que el núcleo poliaromático se sustituye además por una cadena lateral positivamente cargada (aminoalquilo protonado), se han estudiado como posibles agentes antineoplásicos (véase también el documento de patente WO2010/143168). El principio rector es que intercalan ADN y presentan efectos citotóxicos que interfieren con la función de las enzimas de procesamiento de ADN, tales como la topoisomerasa I y II. Desafortunadamente, este mecanismo de acción todavía puede conducir a efectos secundarios adversos.
Por lo tanto, existe una necesidad continua de nuevos compuestos, en particular de aquellos que actúen por mecanismo de acción nuevos y aún sin explorar, para el tratamiento o la prevención de infecciones virales, y más particularmente para lograr la cura de la infección por el VIH.
También existe la necesidad de compuestos que proporcionen una reducción de larga duración de la carga viral después de la finalización del tratamiento, en particular para el tratamiento de infecciones por virus que estén asociadas con tratamiento crónico, y/o para la modificación de reservorios de virus latentes.
También sigue existiendo la necesidad de compuestos con un gran espectro de acción, pero que no sean propensos a conferir el desarrollo de cepas resistentes, y/o que no conduzcan a efectos adversos.
También sigue existiendo la necesidad de compuestos que puedan ser administrados menos frecuentemente durante un periodo más corto, o a mayores intervalos, que los tratamientos habituales, que proporcionen el potencial de reducir los costes sanitarios y ofrezcan un acceso más amplio al tratamiento.
Se ha informado en la técnica de métodos de cribado de compuestos que son eficaces para el tratamiento o la prevención de infecciones virales y afecciones relacionadas con un virus.
Recientemente, Taniguchi et al. (HIV-1 Rev protein specifies the viral RNA export pathway by suppressing TAP/NXF1 recruitment. Nucleic Acids Res. 42, 6645-6658 (2014)) han supuesto que se podría usar la actividad remodeladora de las proteínas virales Rev y Rex como diana para la terapia antirretroviral, respectivamente para el VIH y para el virus linfotrópico T humano (HTLV). Sin embargo, este documento no identificó compuestos útiles para terapia o prevención. Así, sigue existiendo una necesidad de métodos novedosos de cribado de compuestos para el tratamiento o la prevención de una infección viral o una afección relacionada con un virus en un individuo.
En particular, sigue existiendo la necesidad de métodos novedosos para la erradicación de una infección viral o una afección relacionada con un virus en un individuo, que incluya la erradicación del VIH y/o como una cura para el VIH. SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método de cribado de un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una infección viral o afección relacionada con un virus en un individuo, que comprende las etapas de:
a) determinar la capacidad de un compuesto candidato para promover la interacción entre CBP20 y CBP80 en una muestra, y
b) seleccionar el compuesto candidato que se ha determinado en la etapa a) que promueve dicha interacción. La presente invención también se refiere a un método de cribado de un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una infección viral o afección relacionada con un virus en un individuo, que comprende las etapas de:
a) determinar la capacidad de un compuesto candidato para interactuar con CBP20 que se une a CBP80, o para interactuar con un fragmento de CBP80 que se une con CBP20, o para interactuar con un complejo que se una a la caperuza (CBC) en una muestra, y
b) seleccionar el compuesto candidato que se determina que interactúa con dicho fragmento de CBP20, dicho fragmento de CBP80, o dicho complejo CBC en la etapa a).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Ejemplos de candidatos a derivados de quinolina para el tratamiento o la prevención de la producción de VIH-1 en CMSP y células infectadas por macrófagos. Dibujo de 10-cloro-2,6-dimetil-2H-pirido[3',4':4,5]pirrolo[2,3-g]isoquinolina (IDC16), 8-cloro-N-(4-(trifluorometoxi) fenil)quinolin-2-amina (Compuesto 1) y 8-cloro-N-glucurónido-N-(4-(trifluorometoxi)fenil)quinolin-2-amina (Compuesto 1-N-glucurónido).
Figura 2. El Compuesto 1 interactúa con el complejo CBC. Se incubaron las proteínas recombinantes purificadas CBP20 y CBP80 con concentraciones crecientes del Compuesto 1 (panel izquierdo) o el Compuesto 1-N-glucurónido (panel derecho, Gluc) y se trataron durante 30 minutos con luz UV. Las proteínas se revelaron por transferencia Western usando anticuerpos contra CBP20 y CBP80. Panel izquierdo: de izquierda a derecha, incubación con 0,1 (carril 1), 1 (carril 2), 10 (carril 3) y 50 pM (carril 4) del Compuesto 1. Panel derecho: de izquierda a derecha, incubación con 1 (carril 1), 10 (carril 2), 50 (carril 3), 100 pM (carril 4) y 200 pM (carril 5) del Compuesto 1-N-glucurónido.
Figura 3. El Compuesto 1 promueve la interacción de CBP20 con CBP80. A) Se incubaron las proteínas recombinantes purificadas CBP20 y CBP80 con las concentraciones indicadas del Compuesto 1-N-glucurónido y o bien no se trataron (carriles 1-3), se trataron durante 15 min (carriles 4-6) o 30 min (carriles 7-9) con luz UV. Las proteínas se analizaron por SDS-PAGE y se tiñeron con azul de Coomassie. El Compuesto 1 y el
Compuesto 1-W-glucurónido promueven la reticulación UV de CBP20 y CBP80. B) Se incubó CBC humano recombinante con el Compuesto 1-W-glucurónido y se trató con UV durante 15 min. Después de la reticulación, las proteínas se resolvieron en SDS-PAGE y se tiñeron con azul de Coomassie (panel izquierdo). Se digirieron las proteínas teñidas (banda 4, banda 5 y banda 7) con tripsina y se analizaron por espectrometría de masas.
Figura 4. A diferencia de la estructura de caperuza de m7GpppG, ni el Compuesto 1 ni el Compuesto 1-N-glucurónido interfieren con la unión del ARN con caperuza con el complejo CBC. Se incubó CBC humano recombinante con un sustrato de ARN con caperuza y se analizó por electroforesis en gel nativo con el fin de resolver los diferentes complejos de ARN y de ARN-proteína: ARN libre (carril 1), y complejos de CBC-ARN (carriles 2-10) en presencia de 12 mM de m7GppG (carriles 10) o 5 pM, 10 pM o 50 pM del Compuesto 1 (carriles 2-4, respectivamente) o 5 pM, 10 pM, 50 pM o 100 pM del Compuesto 1-N-glucurónido (carriles 5-9, respectivamente).
Figura 5. Potencia de los derivados de indol para inhibir la producción de VIH-1 en CMSP y células infectadas por macrófagos. A) Se usó la cepa del VIH-1 Ada-MR5 para infectar por triplicado CMSP activadas de diferentes donantes (estimuladas durante dos días con PHA e IL2) en ausencia o presencia de concentraciones crecientes del Compuesto 1. Se recogió el sobrenadante 6 días después de la infección (pi) y se cuantificó el antígeno de la proteína de la cápside viral p24 usando un protocolo de ELISA habitual. Cada punto representa 6 donantes. B) Se usó la cepa del VIH-1 YU2 para infectar por triplicado macrófagos derivados de monocitos de donantes diferentes en ausencia o presencia de concentraciones crecientes del Compuesto 1. Se recogió el sobrenadante 8 días pi y se cuantificó el antígeno de la proteína de la cápside viral p24 usando un protocolo de ELISA habitual. Cada punto representa 8 donantes.
Figura 6. Inhibición de p24 del VIH del Compuesto 1 de diferentes cepas del VIH-1. A) Se usaron diferentes cepas del VIH-1 (clado B, clado C y clados recombinantes) para infectar CMSP de tres donantes diferentes en ausencia o presencia de 5 pM del Compuesto 1. Se recogió el sobrenadante 6 días pi y se cuantificó el antígeno de la proteína de la cápside viral p24 usando un protocolo de ELISA habitual. B) Se midió la actividad de la RT (cpm) en CMSP humanas infectadas con diferentes mutantes resistentes de la cepa NL4.3 (K103N, K65R y M184V) y se trataron con el Compuesto 1 o 3TC.
Figura 7. Eficacia del Compuesto 1 para inhibir la replicación viral en ratones humanizados. A) Se infectaron ratones SCID reconstituidos con la cepa del VIH-1 JRCSF por inyección intraperitoneal. El grupo de control recibió por sonda nasogástrica Labrafil y 5 % de DMSO (n=15) y el grupo tratado 20mg/kg b.i.d del Compuesto 1 en Labrafil y 5 % de DMSO (n=14) durante 15 días. Se hicieron dos experimentos independientes con 5 y 10 ratones reconstituidos para cada grupo. Se evaluó la carga viral midiendo el ARN viral usando Amplicor HIV-1 Monitor de Roche. B) Se hizo análisis de FACS en el lavado peritoneal en el día 15 después del tratamiento para evaluar la relación CD8/CD4. C) Se trataron ratones humanizados NSG injertados por sonda nasogástrica oral con el Compuesto 1 en o bien 20 mg o bien 40 mg/kg una vez al día durante 30 días y se monitorizaron las poblaciones de linfocitos indicadas (CD45+; CD4+ y CD8+) por análisis de FACS. D) Se infectaron ratones humanizados NSG con el virus YU2 del VIH-1 y se trataron o bien por sonda nasogástrica oral con el Compuesto 1 en 40 mg/kg una vez al día durante 30 días o por HAART (3TC-Tenofovir-Raltegravir y AZT). Para HAART, se prepararon gránulos de comida mezclando 2,5 g de cada uno de 3TC, TDF y AZT y 5 g de RTV con 5 kg de alimento molido rico en proteínas y fortalecido en vitaminas (Nafag 3432, Provimi Kliba AG, Suiza) que se conformó posteriormente en gránulos de alimento y se esterilizó por irradiación gamma con 25 kGy. Se evaluó la carga viral midiendo el ARN viral usando Amplicor HIV-1 Monitor de Roche.
Figura 8. El Compuesto 1 influye en la biogénesis y exportación del ARN del VIH mediada por Rev. A) Representación esquemática del gen indicador del VIH-1 B) Visualización de ARN unido a GFP-MS2-en células HeLa que expresan tat, MS2-GFP y transcritos indicadores del VIH en células no transfectadas o transfectadas con Rev. Las células transfectadas con Rev no se trataron (DMSO) o se trataron con el Compuesto 1. La flecha indica el sitio de transcripción. C) Cuantificación de imágenes correspondientes a no tratados (DMSO) o tratados (Compuesto 1) en (B), en términos de: GFP total (panel superior) expresado en RFU o unidades relativas de fluorescencia; en el nucleoplasma (panel central) expresado en número de focos en células transfectadas con Rev; o en el sitio inicial (panel inferior) expresado como un porcentaje de núcleos con un punto de inicio de la transcripción. Los diagramas de cajas muestran la intensidad de GFP promedio (números de focos o números de puntos de inicio de la transcripción) de las células HeLa transfectadas con Rev para cada condición. Los bigotes corresponden al mínimo y al máximo, las cajas a los percentiles del 25-75 y la banda dentro de la caja, a la mediana. Se hicieron análisis estadísticos en al menos 15 núcleos de células positivas para Rev usando una prueba de la t para datos independientes.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención tiene el fin de cumplir las necesidades anteriormente mencionadas.
El complejo de unión a la caperuza (CBC) desempeña una función clave en varios mecanismos de expresión génica, que incluyen la transcripción, el corte y empalme, la exportación y la traducción de transcritos. Está compuesto
principalmente por las subunidades de las proteínas de unión a la caperuza CBP20 (CBC20) y CBP80 (CBC80). El complejo CBC se une de forma cotranscripcional con la caperuza de 5' de pre-ARNm.
La caperuza de 5' de los transcritos de ARN premaduro endógenos es una modificación postraduccional que es esencial para la eficiente expresión génica, la estabilidad del ARN y la exportación de ARN en eucariotas (véase Hocine et al.; "RNA Processing and Export"; Cold Spring Harb Perspect Biol.; 2010. Véase también Schoenberg et al.; "Re-capping the message"; Trends Biochem Sci.; 2009).
Se ha encontrado ahora que el complejo de unión a la caperuza (CBC) es una diana para la identificación de compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una infección viral o una afección relacionada con un virus. En particular, se ha encontrado ahora una conexión entre (i) la capacidad de un compuesto para unirse al complejo CBC, que incluye las subunidades CBP20 y CBP80, y (ii) la capacidad de dicho compuesto para el tratamiento o la prevención de una infección viral o una afección relacionada con un virus, en particular infección por el VIH o sida en un animal o en un organismo humano, como se detallará aún más en la presente memoria descriptiva.
Estos resultados sorprendentes han permitido a los inventores el diseño de métodos de cribado de un compuesto candidato para su capacidad para el tratamiento o la prevención de una infección viral o una afección relacionada con un virus, métodos que comprenden (i) una etapa en donde se determina la capacidad de dicho compuesto candidato para interactuar con las subunidades CBP20 o CBP80 o (ii) una etapa en donde se determina la capacidad de dicho compuesto candidato para promover la interacción entre CBP20 y CBP80. Se muestran en el presente documento que los compuestos que interactúan con las subunidades CBP20 o CBP80, así como los compuestos que promueven la interacción entre CBP20 y CBP80, son activos contra la infección de un individuo con un virus, que incluye un retrovirus, y especialmente un virus VIH-1.
Como se muestra en los ejemplos en el presente documento, se ha seleccionado una pluralidad de compuestos que son capaces de modular in vitro la interacción entre CBP20 y CBP80 recombinante en el complejo CBC. Usando proteólisis limitada, los inventores han mostrado que un pequeño fragmento de CBP20 empezando desde el aminoácido en la posición 37 hasta el aminoácido en la posición 66 puede desempeñar una función importante en la interacción de CBP20 con CBP80 dentro del complejo CBC.
Como referencia, la secuencia de aminoácidos de CBP20 humano es SEQ ID N° 1 (subunidad 2 de la proteína de unión a la caperuza nuclear de Homo sapiens).
El fragmento de CBP20 desde la posición 37 hasta la posición 66 es el péptido de SEQ ID N° 2.
La secuencia de aminoácidos de CBP80 se desvela como SEQ ID N° 3.
Como se muestra en los ejemplos en el presente documento, los compuestos que se determina que interactúan con CBP20 o CBP80, así como los compuestos que se determina que promueven la formación del complejo CBP20/CBP80, son útiles para la prevención o el tratamiento de infecciones de un individuo con un virus, que incluye un retrovirus, y especialmente un virus VIH-1.
Como se usa en el presente documento, el término "individuo" engloba tanto humanos como animales.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método de cribado de un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una infección viral o afección relacionada con un virus en un individuo, en particular una infección por el VIH o sida, que comprende las etapas de:
a) determinar la capacidad de un compuesto candidato para promover la interacción entre CBP20 y CBP80 en una muestra, y
b) seleccionar el compuesto candidato que se determina en la etapa a) que promueve dicha interacción.
El método descrito anteriormente también se puede denominar "primer método de cribado" en el presente documento.
La presente invención también se refiere a un método de cribado de un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una infección viral o afección relacionada con un virus en un individuo, en particular una infección por el VIH o sida, que comprende las etapas de:
a) determinar la capacidad de un compuesto candidato para interactuar con CBP20 que se une a CBP80, o para interactuar con un fragmento de CBP80 que se une con CBP20, o para interactuar con una complejo que se una a la caperuza (CBC) en una muestra, y
b) seleccionar el compuesto candidato que se ha determinado que interactúa con dicho fragmento de CBP20, dicho fragmento de CBP80, o dicho complejo CBC en la etapa a).
El método descrito anteriormente también se puede denominar "segundo método de cribado" en el presente documento.
Se muestra en los ejemplos en el presente documento que un compuesto que se selecciona en la etapa b) de cualquiera del primer método de cribado o el segundo método de cribado descritos anteriormente (i) reduce la replicación intracelular del virus, (ii) reduce la replicación del virus en una mamífero infectado por un virus.
Más específicamente, se muestra en el presente documento que un compuesto que se selecciona en la etapa b) de cualquiera del primer método de cribado o el segundo método de cribado descritos anteriormente (i) reduce la replicación del VIH-1 en células de mamífero infectadas, (ii) reduce la carga viral de VIH-1 en mamíferos infectados por el VIH-1 y (iii) mantiene o restaura un alto nivel de recuento de linfocitos CD4+ en mamíferos infectados por el VIH-1.
Como se usa en el presente documento, los términos «interacción» o «interactuar», como se aplican a una interacción de proteínas o péptidos, engloban tanto la interacción directa como la indirecta de una proteína o péptido con otra proteína o péptido; sin embargo, estos términos se refieren preferentemente a una interacción directa de una proteína o péptido con otra proteína o péptido. Las interacciones proteína-proteína pueden englobar interacciones estables, fuertes, transitorias o débiles.
Como se usa en el presente documento, una «interacción directa» tiene el mismo significado que «unión», y engloba en particular la unión de una proteína o un péptido con otra proteína o péptido mediante puentes salinos, enlace de hidrógeno, interacción electrostática, interacción hidrófoba, interacción de Van der Waals y acoplamiento covalente.
Como se usa en el presente documento, «promover una interacción» engloba aumentar la probabilidad de que ocurra una interacción, y/o estabilizar una interacción existente, ya sea directa o indirectamente. En particular, y basándose en los ejemplos, la expresión «promover una interacción» engloba aumentar la cantidad de un complejo de proteína que comprende CBP20 y CBP80, empezando a partir de una cantidad predeterminada de CBP20 y CBP80 monomérico.
Los inventores también proporcionan pruebas de que, modulando la formación del complejo CBC, y más particularmente promoviendo la interacción de CBP20 y CBP80, es posible alterar específicamente el corte y empalme y la exportación de ARNm virales, pero no otros ARNm no virales, o al menos a un menor grado. Por tanto, el complejo CBC es una diana particularmente prometedora para identificar compuestos novedosos que tienen citotoxicidad reducida, eficiencia a largo plazo, gran espectro de acción y que no seleccionan cepas de virus mutantes.
Se ha mostrado además que los compuestos que se seleccionan en la etapa b) del primer método de cribado o del segundo método de cribado descritos en el presente documento son eficaces en la inhibición de la replicación viral modulando la maquinaria de corte y empalme, y/o previniendo la exportación de transcritos viral sin cortar ni empalmar. El ARN viral retenido es cortado y empalmado a gran escala, pero sobre todo el corte y empalme celular normal no se ve afectado por los compuestos cribados, que incluyen el Compuesto 1 y su derivado glucuronidado, el Compuesto 1-N-glucurónido.
Sin desear quedar ligado a teoría particular alguna, se cree que el fragmento de CBP20 desde la posición 37 hasta 66 engloba un sitio que es crítico para la actividad del complejo CBC, que incluye la interacción de CBP20 con CBP80.
Como se usa en el presente documento, «determinar» también engloba "medir".
Como se usa en el presente documento, «cribar» también engloba "evaluar".
Como se usa en el presente documento, «prevenir» también engloba «reducir la probabilidad de aparición» o «reducir la probabilidad de reaparición».
Como se usa en el presente documento, «muestra» engloba cualquier muestra biológica o no biológica, que incluye cualquier muestra de biopsia, muestra derivada de la sangre o de orina, saliva, líquido cefalorraquídeo, muestra pulmonar, nasal, vaginal, ocular, peritoneal, de la garganta, uretral, de células o de tejido, cultivo celular y/o fracción de las mismas. La muestra puede haber sido previamente recogida del individuo para el que se va a determinar la eficiencia del compuesto candidato, o de otro individuo, y/o grupo de individuos.
Como se usa en el presente documento, una "muestra no biológica" engloba una muestra que contiene CBP20 o CBP80, o tanto CBP20 como CBP80, dependiendo del método de cribado de la invención que se realiza, muestra que no ha sido previamente recogida de un individuo. Ilustrativamente, una muestra no biológica engloba muestras que comprenden CBP20 recombinante o sintético, CBP20 nativo o fragmento modificado, CBP80 recombinante o sintético, CBP80 nativo o fragmento modificado, o una combinación de CBP20 recombinante o sintético y CBP80 recombinante o sintético.
Como se usa en el presente documento, una "muestra biológica" consiste en, o deriva de, una muestra que ha sido previamente recogida de un individuo. Una muestra biológica deriva de una muestra que ha sido previamente recogida de un individuo cuando dichas muestras previamente recogidas se han sometido a una o más etapas de pretratamiento (es decir, concentración, extracción, estabilización, etc.), con el fin de obtener la muestra biológica que se usa en el método de cribado descrito en el presente documento.
Una muestra biológica previamente recogida de un individuo se usa preferentemente con el fin de seleccionar compuestos relevantes que son preventivamente o terapéuticamente activos en dicho individuo.
Como se usa en el presente documento, una muestra biológica consiste en, o deriva de, una muestra recogida en un individuo, concretamente un mamífero, que engloba un mamífero humano y un mamífero no humano.
Como se usa en el presente documento, "seleccionar el compuesto candidato" engloba determinar que el compuesto candidato es un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una infección viral o una afección relacionada con un virus.
Claramente, en el presente documento se describe una pluralidad de compuestos (i) que interactúan con CBP20, (ii) que interactúan con CBP80 y (iii) que promueven la interacción entre CBP20 y CBP80.
Como consecuencia, dichos compuestos ilustrativos (i) se pueden seleccionar según el primer método de cribado descrito en el presente documento, (ii) también se pueden seleccionar según el segundo método de cribado descrito en el presente documento, en donde la capacidad de dichos compuestos para interactuar con CBP20 se determina en la etapa a) y (iii) se pueden seleccionar igualmente según el segundo método de cribado descrito en el presente documento, en donde la capacidad de dichos compuestos para interactuar con CBP80 se determina en la etapa a).
Por lo tanto, según otro aspecto, la presente invención también se refiere a un método de cribado de un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una infección viral o afección relacionada con un virus en un individuo, en particular una infección por el VIH o sida, que comprende las etapas de:
a1) determinar la capacidad de un compuesto candidato para promover la interacción entre CBP20 y CBP80 en una primera muestra, y
a2) determinar la capacidad del compuesto candidato para interactuar con CBP20 o CBP80 en una segunda muestra, y
b) seleccionar el compuesto candidato que se ha determinado que promueve dicha interacción entre CBP20 y CBP80, o alternativamente que se ha determinado que interactúa con CBP20 o CBP80; en donde la etapa a1) y la etapa a2) ocurren en ese orden o en el inverso, siendo la primera y la segunda muestra la misma muestra o muestras distintas.
Según algunas realizaciones, el compuesto candidato se selecciona cuando se ha determinado que (i) tanto promueve la interacción entre CBP20 y CBP80 en la etapa a1), como (ii) interactúa con CBP20 o CBP80.
Como se usa en el presente documento, un compuesto que interactúa con CBP20 o CBP80 engloba un compuesto que tanto (i) interactúa con CBP20 como (ii) interactúa con CBP80.
Como se usa en el presente documento, "determinar la capacidad de un compuesto candidato"engloba (i) determinar la capacidad del compuesto candidato a partir de los datos de interacción previamente medidos; y (ii) medir la capacidad del compuesto candidato.
Los métodos anteriormente mencionados pueden comprender todos al menos una etapa de medir la capacidad de un compuesto candidato para promover la interacción entre CBP20 y CBP80 en dicha muestra de interés.
Por lo tanto, según dicho primer aspecto, la invención se refiere a un método de cribado de un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una infección viral o afección relacionada con un virus en un individuo, en particular una infección por el VIH o sida, que comprende las etapas de:
a) medir la capacidad de un compuesto candidato para promover la interacción entre CBP20 y CBP80 en una muestra, y
b) seleccionar el compuesto candidato que promueve dicha interacción.
Por tanto, los métodos anteriormente mencionados pueden comprender todos al menos una etapa de medir la capacidad de un compuesto candidato para interactuar con CBP20 o CBP80 en dicha muestra.
Por lo tanto, según dicho segundo aspecto, la invención se refiere a un método de cribado de un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una infección viral o afección relacionada con un virus en un individuo, en particular una infección por el VIH o sida, que comprende las etapas de:
a) medir la capacidad de un compuesto candidato para interactuar con CBP20 que se une a CBP80, o para interactuar con un fragmento de CBP80 que se une con CBP20, o para interactuar con un complejo que se una a la caperuza (CBC) en una muestra, y
b) seleccionar el compuesto candidato que se determina que interactúa con dicho fragmento de CBP20, dicho fragmento de CBP80, o dicho complejo CBC en la etapa a).
En particular, los métodos anteriormente mencionados pueden comprender todos una etapa de determinar la capacidad del compuesto para interactuar con CBP20 en una muestra.
Según algunas realizaciones, los métodos anteriormente mencionados pueden comprender todos una etapa a0) de proporcionar una muestra.
Por lo tanto, la invención también se refiere a un método de cribado de un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una infección viral o afección relacionada con un virus en un individuo, en particular una infección por el VIH o sida, que comprende las etapas de:
a0) proporcionar una muestra,
a1) medir la capacidad de un compuesto candidato para promover la interacción entre CBP20 y CBP80 en dicha muestra, y
b) seleccionar el compuesto candidato que promueve dicha interacción.
Por lo tanto, la invención también se refiere a un método de cribado de un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una infección viral o afección relacionada con un virus en un individuo, en particular una infección por el VIH o sida, que comprende las etapas de:
a0) proporcionar una muestra,
a1) medir la capacidad de un compuesto candidato para interactuar con CBP20 o CBP80 en dicha muestra, y
b) seleccionar el compuesto candidato que interactúa con CBP20 o CBP80.
Más particularmente, los métodos anteriormente mencionados pueden comprender todos una etapa de determinar o medir la capacidad del compuesto candidato para interactuar con un fragmento de CBP20 que se une a CBP80.
Alternativamente, los métodos anteriormente mencionados pueden comprender todos una etapa de determinar o medir la capacidad del compuesto candidato para interactuar con un fragmento de CBP80 que se une a CBP20.
Se conocen en la técnica los restos críticos de CBP20 que se ha encontrado que participan en la interacción con CBP80. Como referencia, Mazza et al. (Crystal structure of the human nuclear cap binding complex. Mol. Cell 8, 383 396 (2001) informa de la estructura cristalina (PDB: 1H6K) del complejo CBP20/CBP80 moderadamente tripsinado e identifica restos críticos que participan en la interacción entre CBP80 y CBP20, ya sea mediante puentes salinos o mediante enlaces de hidrógeno.
Preferentemente, el fragmento de CBP20 que se une a CBP80 incluye la posición de aminoácido 20 a la posición de aminoácido 110 de CBP20, en donde CBP se establece como referencia como SEQ ID N° 1; e incluye más preferentemente la posición de aminoácido 38 a la posición de aminoácido 119 de SEQ ID N° 4, que incluye la posición de aminoácido 38 a la posición de aminoácido 67 de SEQ ID N° 2.
Los métodos anteriormente mencionados pueden comprender además una etapa de determinar o medir la capacidad del compuesto candidato para no interactuar con el sitio de unión a la caperuza de CBP20, y seleccionar el compuesto candidato que no interactúa con dicho sitio de unión a la caperuza de CBP20.
De hecho, la evidencia experimental (véase el Ejemplo 1) muestra que el Compuesto 1 cribado no interactúa con el sitio de unión a la caperuza de CBP20, y no inhibe la unión del ARN con la caperuza a CBP20. Sin desear quedar ligado a teoría particular alguna, se cree que esta propiedad favorece además una selección de compuestos que tienen mejor especificidad por la exportación de ARN viral, con respecto a la exportación de ARN no viral.
Los métodos de determinación o medición de la capacidad del compuesto candidato para no inhibir la unión del ARN con caperuza al complejo CBC, que incluye CBP20, o incluso para no interactuar con el sitio de unión a la caperuza de CBP20 Se desvelan en los ejemplos, y en Mazza et al. (Crystal structure of the human nuclear cap binding complex. Mol. Cell 8, 383-396 (2001)) y en Mazza (2) et al. (Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21,5548-5557 (2002)).
Como referencia, un fragmento de CBP20 que engloba el sitio de unión a la caperuza es de la secuencia SEQ ID N° 4, que incluye la posición de aminoácido 38 a la posición de aminoácido 119.
Según una realización a modo de ejemplo, la capacidad del compuesto candidato para no inhibir la unión de ARN con caperuza al complejo CBC se puede determinar por un ensayo de competencia, que puede comprender una etapa de hacer competir el complejo formado entre CBC y ARN con caperuza con un análogo de caperuza, tal como m7GpppG y compararlo con un valor de referencia.
Los métodos de la invención son particularmente flexibles para estudios de alto rendimiento, que incluyen estudios de alto rendimiento in vitro.
Según una realización, CBP20 y/o CBP80 son polipéptidos sintéticos y/o recombinantes; o fragmentos de los mismos. En el sentido de la invención, "polipéptidos recombinantes" engloba polipéptidos que se produjeron a partir de un organismo que no produce naturalmente dichos polipéptidos.
Según una realización, CBP20 y/o CBP80 son polipéptidos purificados; o fragmentos de los mismos.
En el sentido de la invención, "polipéptidos purificados"engloba polipéptidos que están presentes en una muestra en una forma aislada.
Según una realización, la muestra comprende CBP20 recombinante purificado y/o CBP80 recombinante purificado. Exportación mediada por Rev de ARN virales.
Rev (también denominada p19) es una proteína del VIH que desempeña una función clave en la replicación del virus, en particular promoviendo la exportación al citoplasma de ARN sin cortar ni empalmar o individualmente cortados y empalmados. Como consecuencia, Rev también promueve la expresión de proteínas del VIH.
Sin desear quedar ligado a teoría particular alguna, los inventores creen que los compuestos que se seleccionan en la etapa b) del primer método de cribado o del segundo método de cribado descritos en el presente documento también son particularmente útiles para la modulación de la actividad de Rev, en particular para disminuir la actividad de Rev, que incluye la exportación mediada por Rev de ARN virales.
Sin desear quedar ligado a teoría particular alguna, los inventores creen que al menos algunos de los compuestos que se seleccionan en la etapa b) del primer método de cribado o del segundo método de cribado descritos en el presente documento pueden también interactuar directa o indirectamente con Rev, debido a la capacidad del Compuesto 1 cribado para 1) prevenir la exportación mediada por Rev de ARN virales y 2) prevenir el corte y empalme de ARN in vivo; y también debido a que Rev interactúa con el complejo CBC.
La exportación mediada por Rev de los ARN virales se refiere a la exportación al citoplasma de ARN sin cortar ni empalmar o individualmente cortados y empalmados que se asocia con la presencia y/o expresión de Rev en dicha muestra.
Según algunas realizaciones, los métodos in vivo, in vitro o in silico de la invención pueden así comprender las etapas de:
(i) determinar la capacidad de un compuesto candidato para interactuar con Rev; y
(ii) seleccionar el compuesto candidato que se determina en la etapa (i) que interactúa con Rev.
Según algunas realizaciones, los métodos in vivo, in vitro o in silico de la invención pueden comprender las etapas de:
(i) determinar la capacidad de un compuesto candidato para modular, y preferentemente disminuir, la actividad de Rev en una muestra; y
(ii) seleccionar el compuesto candidato que se determina en la etapa (i) que modula, preferentemente disminuye, dicha actividad.
Según algunas realizaciones, los métodos in vivo, in vitro o in silico de la invención pueden así comprender las etapas de:
(i) determinar la capacidad del compuesto candidato para interactuar con Rev; y/o para disminuir la actividad de Rev;
(ii) seleccionar el compuesto candidato que se ha determinado que interactúa con Rev y/o que disminuye la actividad de Rev en la etapa (i):
En el sentido de la invención, la "actividad de R ev"engloba (i) promover la exportación de ARN virales; y (ii) prevenir el corte y empalme de ARN.
La determinación de la actividad de Rev en una muestra puede entonces englobar:
(1) determinar la concentración de Rev;
(2) determinar la expresión de Rev;
(3) determinar la interacción de Rev con CBC, que incluye la interacción de Rev con CBP20 o CBP80;
(4) determinar la interacción de Rev con factores de corte y empalme, que incluyen ASF1/SF2 (factor 1 de corte y empalme rico en serina/arginina o SFRS1);
(5) determinar la interacción de Rev con una secuencia de elemento de respuesta a Rev (RRE);
(6) determinar la exportación mediada por Rev de ARN virales;
(7) determinar la inhibición mediada por Rev del corte y empalme de ARN;
(8) determinar la localización de Rev; y/o
(9) determinar la interacción de Rev con el receptor de NES CRM1.
Otros ejemplos de factores de corte y empalme que se conoce que interactúan con Rev incluyen: hnRNP A1 y el factor de corte y empalme p32.
En el sentido de la invención, "determinar la expresión de Rev", engloba determinar la concentración de un ácido nucleico que codifica Rev.
En el sentido de la invención, "mediado por Rev", tal como en "exportación mediada por Rev" o "inhibición mediada por Rev" significa que está asociado con la presencia de Rev. Por consiguiente, se conoce en la técnica establecer si Rev está asociado con la exportación de ARN virales, y/o la inhibición del corte y empalme de ARN, y se puede basar, por ejemplo, en una etapa de comparar la actividad del compuesto candidato con un valor de referencia que se determina en una muestra que no comprende y/o expresa Rev.
Por consiguiente, la determinación de la capacidad de un compuesto candidato para disminuir la actividad de Rev en una muestra engloba determinar la capacidad de dicho compuesto candidato para:
(1) disminuir la concentración de Rev en dicha muestra;
(2) disminuir la expresión de Rev en dicha muestra;
(3) promover la interacción de Rev con CBC, que incluye la interacción de Rev con CBP20 o CBP80 en dicha muestra;
(4) promover la interacción de Rev con factores de corte y empalme, que incluyen ASF1/SF2 (factor 1 de corte y empalme rico en serina/arginina o SFRS1) en dicha muestra;
(5) disminuir la interacción de Rev con la secuencia de RRE en dicha muestra;
(6) disminuir la exportación mediada por Rev de ARN virales en dicha muestra;
(7) disminuir la inhibición mediada por Rev del corte y empalme de ARN en dicha muestra;
(8) disminuir la interacción de Rev con el receptor de NES CRM1; y/o
(9) modular la localización de Rev.
Como referencia, una secuencia de ácidos nucleicos de ADN correspondiente a un elemento de respuesta a Rev (RRE) es un ácido nucleico de la secuencia SEQ ID N° 5.
Como referencia, la secuencia de un ácido nucleico que codifica Rev es SEQ ID N° 6.
Se conocen en la técnica los métodos de determinación de una concentración o una expresión de una proteína en una muestra. También se conocen en la técnica los métodos de determinación de interacciones proteína-proteína o interacciones proteína-ácido nucleico, como se detallan en lo sucesivo y en los ejemplos.
Según una realización a modo de ejemplo, la exportación mediada por Rev de los ARN virales se evalúa usando un sistema indicador de VIH, que comprende:
- Repeticiones terminales largas (LTR) del VIH en 5' y 3';
- uno o más elementos RRE
- uno o más sitios de unión a MS2.
Los ejemplos de dichos sistemas indicadores del VIH se desvelan en la Figura 8A, en el Ejemplo 4 y en Nawroth et al. (Stable assembly of HIV-1 export complexes occurs cotranscriptionally, RNA, 20, 1-8 (2014). Según dicha realización a modo de ejemplo, el sistema indicador del VIH se transfecta entonces en una célula que expresa la proteína del VIH Tat y MS2, ya sea en una forma nativa o recombinante que sea adecuada para la visualización (es decir, MS2 acoplada con una proteína fluorescente tal como GFP).
Según otra realización a modo de ejemplo, la inhibición mediada por Rev del corte y empalme de ARN se evalúa por RT-PCR, y/o secuenciación profunda como se muestra en el Ejemplo 5.
Los métodos anteriormente mencionados, que incluyen una etapa de determinar la capacidad de un compuesto para modular la actividad de Rev, también se pueden usar como métodos de cribado independientes de un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una infección viral o una afección relacionada con un virus en un individuo.
Virus
Los métodos de la invención son adecuados para el cribado de compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una infección viral o una afección relacionada con un virus.
En un modo no limitante, los ejemplos de virus que son considerados por la invención incluyen virus con envoltura y desnudos, que incluyen virus de ADN, virus de ARN y retrovirus, que incluyen virus de ADNbc, virus de ADNmc, virus de ARNbc, virus de ARNmc(+), virus de ARNmc(-), virus de ARNmc-RT y virus de ARNbc-RT, que incluyen oncovirus, lentivirus y espumavirus.
Los ejemplos de virus incluyen virus latentes y/o virus asociados con infección crónica y/o retrovirus.
Los oncovirus se llaman así debido a que se pueden asociar con cánceres e infecciones malignas. Se pueden mencionar, por ejemplo, virus leucemógenos (tales como el virus de la leucemia aviar (ALV), el virus de la leucemia murina (MULV), también denominado el virus de Moloney, el virus de la leucemia felina (FELV), los virus de la leucemia humana (HTLV), tales como HTLV1 y HTLV2, los virus de la leucemia de los simios o STLV, el virus de la leucemia bovina BLV, los oncovirus de tipo D de primate, los oncovirus de tipo B que son inductores de tumores mamarios, o los oncovirus que causan un cáncer rápido (tales como el virus del sarcoma de Rous o RSV).
Los espumavirus manifiestan especificidad bastante baja por un tipo de célula dado o una especie dada, y se asocian algunas veces con fenómenos inmunosupresores; esto es el caso, por ejemplo, para el virus espumoso de los simios (o SFV).
Los lentivirus, tales como el VIH, se llaman así debido a que son responsables de las afecciones patológicas de progresión lenta que implican muy frecuentemente a fenómenos inmunosupresores, que incluyen el sida.
Los virus, y en particular los retrovirus, tales como el VIH, HTLV-I y HTLV-II, son conocidos por basarse en el corte y empalme de ARN y la regulación del corte y empalme con el fin de extenderse y diseminar en el interior de las células y los tejidos de un individuo infectado. Otros virus de interés son virus patógenos para el ser humano, que incluyen, pero no se limitan a, virus de la familia de HSV (que incluyen 1, 2, 6), CMV, VZV, HBV, HCV, virus de la hepatitis E, virus del papiloma, RSV, rinovirus, virus de la gripe, adenovirus, EBV, virus del Ébola, de Nipah, y otros arbovirus, virus del dengue, Chikungunya, del Nilo occidental, virus del Valle del Rift, virus de la encefalitis japonesa, SRAS, otros coronavirus, parvovirus, enterovirus.
Otros virus de interés son virus patógenos para los animales, que incluyen, pero no se limitan a, gripe, FLV, pestivirus, hantavirus y lisavirus.
En particular, los virus y las afecciones relacionadas con un virus que se consideran incluyen virus cuya replicación viral requiere el corte y el empalme de ARN, y/o la exportación de ARN viral del núcleo al citoplasma.
Los virus que se consideran más particularmente son virus de ARN y retrovirus, que incluyen lentivirus, y preferentemente el VIH. Por consiguiente, las afecciones relacionadas con un virus que se consideran más particularmente están asociadas con un virus de ARN o un retrovirus, y preferentemente el VIH.
El VIH puede incluir VIH-1, VIH-2 y todos los subtipos del mismo, que incluyen las cepas del VIH-1 que pertenecen al subtipo B del VIH-1, el subtipo C del VIH-1, y recombinantes del VIH-1. Los ejemplos incluyen las cepas del VIH-1 seleccionadas de Ad8, AdaM, cepa aislada B, cepa aislada C, CRF01, CRF02 y c Rf06.
Ventajosamente, los virus pueden incluir cepas del VIH que han desarrollado resistencias para los tratamientos actuales.
Según una realización preferida, la afección relacionada con un virus es el sida.
Métodos de determinación de las interacciones proteína-proteína
Los métodos anteriormente mencionados incluyen una etapa de:
(i) determinar o medir la capacidad de un compuesto candidato para promover la interacción entre CBP20 y CBP80 en una muestra, y/o
(ii) determinar o medir la capacidad de un compuesto candidato para interactuar con CBP20 o CBP80 en una muestra.
Según algunas realizaciones, los métodos incluyen una etapa de determinar o medir una variación de la interacción entre CBP20 y CBP80, bien en presencia o en ausencia del compuesto candidato.
Según algunas realizaciones, los métodos incluyen una etapa de determinar o medir una variación de la interacción entre CBP20 y el compuesto candidato.
Según algunas realizaciones, los métodos incluyen una etapa de determinar o medir la interacción entre CBP80 y el compuesto candidato.
Las realizaciones anteriormente mencionadas se pueden combinar además en un único método.
Se pueden determinar y/o medir interacciones proteína-proteína, ya sea cualitativa o cuantitativamente.
La determinación o la medición cualitativa de las interacciones proteína-proteína puede entonces comprender o consistir en detectar la aparición de una interacción.
En un modo no limitante, la determinación o la medición cuantitativa de las interacciones proteína-proteína puede entonces comprender o consistir en la determinación o la medición de una constante de disociación (Kd), una constante de asociación (Ka), una constante de tasa de asociación (ka) y/o una constante de tasa de disociación (kd), ya sea en presencia o en ausencia del compuesto candidato.
Alternativamente, la determinación o la medición de una interacción proteína-proteína puede incluir una etapa de determinar o medir la concentración de un complejo formado por dichas proteínas, ya sea en presencia o en ausencia del compuesto candidato.
Así, los métodos de cribado se pueden basar en métodos de determinación de las interacciones proteína-proteína, tales como métodos in vivo o in vitro o in silico; que incluyen métodos en donde la interacción se determina por al menos una técnica seleccionada de: proteólisis limitada, co-inmunoprecipitación, complementación bimolecular de la fluorescencia (BiFC), transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), radioinmunoensayo, ELISA, doble híbrido en levadura (Y2H) y ensayo de complementación de fragmentos de proteínas(PCA), electroforesis de afinidad o ensayo de cambio de la movilidad en gel, cromatografía de afinidad, ensayo de captura, coinmunoprecipitación, presentación en fagos, reticulación química, purificación por afinidad en tándem (TAP), termoforesis a microescala (MST), resonancia de plasmones superficiales (SPR), anisotropía de fluorescencia, calorimetría de titulación isotérmica (ITC), espectrometría de masas, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear (RMN), microscopía electrónica y acoplamiento de proteínas.
En el sentido de la invención, "acoplamiento de proteínas", engloba la predicción asistida por ordenador del fármaco o compuesto con la proteína, e interacciones proteína-proteína.
Todos aquellos métodos son conocidos en la técnica, y se pueden usar ya sea para la determinación de la presencia o la ausencia de una interacción entre una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos.
Según realizaciones preferidas, la interacción se determina o se mide por al menos una técnica seleccionada de: proteólisis limitada, co-inmunoprecipitación, ensayo de captura, reticulación química, resonancia de plasmones superficiales (SPR), anisotropía de fluorescencia, calorimetría de titulación isotérmica (ITC) y acoplamiento de proteínas.
Según realizaciones a modo de ejemplo, la interacción se determina por al menos una técnica seleccionada de: proteólisis limitada, electroforesis de afinidad o ensayo de cambio de la movilidad en gel, reticulación química y espectrometría de masas.
Según algunas realizaciones, la electroforesis de afinidad y el ensayo de cambio de la movilidad en gel se pueden lograr en condiciones nativas o desnaturalizantes, que incluyen electroforesis PAGE y SDS-PAGE.
Los ejemplos de protocolos adecuados para los ensayos de proteólisis limitada y de cambio de la movilidad en gel se describen en los ejemplos, y en Mazza et al. (Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21,5548-5557 (2002)).
Compuestos candidatos
Los métodos anteriormente mencionados son particularmente adecuados para la selección de compuestos candidatos para el tratamiento o la prevención de una infección viral o una afección relacionada con un virus.
Por tanto, los métodos anteriormente mencionados son particularmente adecuados para la selección de compuestos candidatos que tienen un gran espectro de acción, pero que no son propensos a conferir el desarrollo de cepas resistentes, y/o que no conducen a efectos adversos.
Por tanto, los métodos anteriormente mencionados son particularmente adecuados para la selección de compuestos candidatos que pueden ser administrados con menor frecuencia y/o durante un periodo de tiempo más corto que los tratamientos habituales.
Por tanto, los métodos anteriormente mencionados son particularmente adecuados para la selección de compuestos candidatos para aumentar el recuento de linfocitos CD4+ y/o disminuir la carga viral en un individuo infectado por el VIH/sida, y/o para disminuir o incluso suprimir la replicación del VIH en un individuo infectado por el VIH/sida.
Por tanto, los métodos anteriormente mencionados son particularmente adecuados para la selección de compuestos candidatos para tratar una infección por un virus latente en un individuo, en particular para tratar una infección por el VIH latente.
Por tanto, los métodos anteriormente mencionados son particularmente adecuados para la selección de compuestos candidatos para erradicar una infección viral o una afección relacionada con un virus en un individuo, que incluye la erradicación del VIH y/o como una cura para el VIH.
Por tanto, los métodos anteriormente mencionados son particularmente adecuados para la selección de compuestos candidatos para tratar o prevenir una infección viral o una afección relacionada con un virus en individuos resistentes al tratamiento, especialmente individuos infectados por una cepa del VIH resistente, que incluyen individuos resistentes a HAART y resistentes a ART.
Por tanto, los métodos anteriormente mencionados son particularmente adecuados para la selección de compuestos candidatos para el tratamiento o la prevención de una infección viral o una afección relacionada con un virus en individuos resistentes al tratamiento, en particular seleccionados de: Individuos resistentes a lamivudina (3TC), resistentes a tenofovir, resistentes a raltegravir y resistentes a azidotimidina (AZT).
Los compuestos candidatos pueden ser compuestos artificiales (es decir, no existen de forma natural) o naturales.
Fijando como objetivo específicamente una biblioteca finita de compuestos candidatos, es posible mejorar la escalabilidad de los métodos de cribado, particularmente en el contexto de procedimientos de cribado de alta resolución.
Las bibliotecas de compuestos candidatos que se desvelan en lo sucesivo también son particularmente útiles para métodos que incluyen una etapa de determinar la capacidad de un compuesto candidato para modular la actividad de Rev.
Por tanto, en lo sucesivo se desvelan los compuestos candidatos, y sus sales farmacéuticamente aceptables, que son particularmente útiles en los métodos de cribado de la invención.
Los compuestos candidatos son preferentemente derivados de quinolina seleccionados de los compuestos desvelados en las siguientes solicitudes: WO2010/143169, WO2012080953, EP14306164 y EP14306166.
Según una realización general, los compuestos candidatos que se van a cribar son derivados de quinolina seleccionados de uno cualquiera de los compuestos de la fórmula:
en donde:
z representa N o C,
significa un anillo aromático en donde V es C o N y cuando V es N, V está en orto, meta o para de z, es decir, forma respectivamente un grupo piridazina, pirimidina o pirazina,
R representa independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo elegido entre un grupo -CN, un grupo hidroxilo, un grupo -COOR1, un grupo fluoroalquilo (C1-C3), un grupo fluoroalcoxi (C1-C3), un grupo cicloalquilo (C3-C6), un grupo -NO2, un grupo -NR1R2, un grupo alcoxi (C1-C4), un grupo fenoxi, un grupo NR1 SO2 NR1R2, un grupo -NR1 SO2 R1, un grupo n R1C(=O)R1, un grupo NR1C(=O)-n R1R2 , un grupo SO2 NR1R2, un grupo SO3H, un grupo O-SO2-OR3, un grupo OP(=O)(OR3)(OR4), un grupo -O-CH2-COOR3 y un grupo alquilo (C1-C3), estando dicho alquilo opcionalmente monosustituido con un grupo hidroxilo,
Q es N u O, siempre que R'' no exista cuando Q es O,
R1 y R2 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C3),
R3 y R4 representan independientemente un átomo de hidrógeno, Li+, Na+, K+, N+(Ra)4 o un grupo bencilo, n es 1, 2 o 3,
n' es 1, 2 o 3,
R' representan independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo elegido entre un grupo alquilo (C1-C3), un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, un grupo -COOR1, un grupo -NO2, un grupo NR1R2, un grupo morfolinilo o morfolino, un grupo N-metilpiperazinilo, un grupo fluoroalquilo (C1-C3), un grupo alcoxi (C1-C4) y un grupo -CN, y puede ser además un grupo elegido entre:
A es un enlace covalente, un átomo de oxígeno o NH,
B es un enlace covalente o NH,
m es 1, 2, 3, 4 o 5,
p es 1, 2 o 3,
Ra y Rb representan independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo (C1-C5) o un grupo cicloalquilo (C3-C6),
Ra y Rb pueden formar junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos un heterociclo de 5 o 6 miembros saturado que contiene opcionalmente otro heteroátomo elegido entre N, O y S, estando dicho heterociclo opcionalmente sustituido con uno o más Ra, siempre que cuando R' sea un grupo (IIa) o (IIIa), n' pueda ser 2 o 3 solo si otros grupos R' son diferentes de dicho grupo (IIa) o (IIIa),
R" es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo (C1-C4) o es un grupo (IIa) como se definió anteriormente, o cualquiera de su sal farmacéuticamente aceptable;
o alternativamente en donde el compuesto candidato es de la fórmula:
en donde:
significa un anillo aromático en donde V es C o N y cuando V es N, V está en orto, meta o para de z, es decir, forma respectivamente un grupo piridazina, pirimidina o pirazina,
R representan independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo elegido entre un grupo -CN, un grupo hidroxilo, un grupo -COOR1, un grupo fluoroalquilo (C1-C3), un grupo fluoroalcoxi (C1-C3), un grupo -NO2, un grupo -NR1R2, un grupo alcoxi (C1-C4), un grupo fenoxi y un grupo alquilo (C1-C3), estando dicho alquilo opcionalmente monosustituido con un grupo hidroxilo,
R1 y R2 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C3),
n es 1, 2 o 3,
n' es 1 o 2,
R' es un átomo de hidrógeno o un grupo elegido entre un grupo alquilo (C1-C3), un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, un grupo -COOR1, un grupo -NO2, un grupo -NR1R2, un grupo morfolinilo o morfolino, un grupo N-metilpiperazinilo, un grupo fluoroalquilo (C1-C3), un grupo alcoxi (C1-C4) y un grupo -CN,
R" es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C4),
Z es N o C,
Y es N o C,
X es N o C,
W es N o C,
T es N o C,
U es N o C,
y en donde como máximo cuatro de los grupos V, T, U, Z, Y, X y W son N,
y en donde al menos uno de los grupos T, U, Y, X y W es N,
o cualquiera de sus sales farmacéuticamente aceptables y/o metabolitos.
Según otra realización general, los compuestos candidatos que se van a cribar son derivados de quinolina seleccionados de uno cualquiera de los compuestos de la fórmula (I):
en donde:
z representa N o C,
significa un anillo aromático en donde V es C o N y cuando V es N, V está en orto, meta o para de z, es decir, forma respectivamente un grupo piridazina, pirimidina o pirazina,
R representa independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo elegido entre un grupo -CN, un grupo hidroxilo, un grupo -COOR1, un grupo fluoroalquilo (C1-C3), un grupo fluoroalcoxi (C1-C3), un grupo cicloalquilo (C3-C6), un grupo -NO2, un grupo -NR1R2, un grupo alcoxi (C1-C4), un grupo fenoxi, un grupo -NR1-SO2-NR1R2, un grupo -NR1-SO2-R1, un grupo -NR1-C(=O)R1, un grupo -NR1-C(=O)-NR1R2, un grupo -SO2-NR1R2, un grupo -SO3H, un grupo -O-SO2-OR3, un grupo -O-P(=O)-(OR3)(OR4), un grupo -O-CH2-COOR3 y un grupo alquilo (C1-C3), estando dicho alquilo opcionalmente monosustituido con un grupo hidroxilo,
Q es N u O, siempre que R'' no exista cuando Q es O,
R1 y R2 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C3),
R3 y R4 representan independientemente un átomo de hidrógeno, Li+, Na+, K+, N+(Ra)4 o un grupo bencilo, n es 1,2 o 3,
n' es 1,2 o 3,
R' representan independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo elegido entre un grupo alquilo (C1-C3), un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, un grupo -COOR1, un grupo -NO2, un grupo -NR1R2, un grupo morfolinilo o morfolino, un grupo N-metilpiperazinilo, un grupo fluoroalquilo (C1-C3), un grupo alcoxi (C1-C4) y un grupo -CN, y puede ser además un grupo elegido entre:
A es un enlace covalente, un átomo de oxígeno o NH,
B es un enlace covalente o NH,
m es 1,2, 3, 4 o 5,
p es 1, 2 o 3,
Ra y Rb representan independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo (C1-C5) o un grupo cicloalquilo (C3-C6),
Ra y Rb pueden formar junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos un heterociclo de 5 o 6 miembros saturado que contiene opcionalmente otro heteroátomo elegido entre N, O y S, estando dicho heterociclo opcionalmente sustituido con uno o más Ra, siempre que cuando R' sea un grupo (IIa) o (IIIa), n' pueda ser 2 o 3 solo si otros grupos R' son diferentes de dicho grupo (IIa) o (IIIa),
R" es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo (C1-C4) o es un grupo (IIa) como se definió anteriormente, o cualquiera de sus sales farmacéuticamente aceptables y/o metabolitos.
La presente invención también se refiere al cribado de compuestos seleccionados de los metabolitos activos de los compuestos definidos anteriormente en el presente documento de la fórmula (I) o cualquiera de las fórmulas (Ia), (Ib); (Ic), (Id) y (Ie) como se define posteriormente en el presente documento, más particularmente metabolitos humanos, por ejemplo metabolitos de N-glucurónido de los mismos. En particular, el uso del N-glucurónido o una de sus sales farmacéuticamente aceptables también está englobado dentro de la estructura de la materia reivindicada. Dicho metabolito de N-glucurónido (o Compuesto 1- N-glucurónido o "Gluc") tiene la siguiente fórmula
Se muestra en el presente documento que esos metabolitos muestran una actividad antiviral y más particularmente una actividad anti-VIH. Se pueden administrar y ellos mismos como principios activos.
El N-glucurónido como se describe más particularmente anteriormente se puede preparar según la ruta de síntesis que se describe en la solicitud de patente EP15305274.
Según una realización preferida, Q es N.
Según otra realización preferida, n es 1 o 2.
Según otra realización preferida, n' es 1 o 2.
Según otra realización preferida, R" es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo (C1-C4) o un grupo
en donde m es 2 o 3 y X i es O, CH2 o N-CH3.
Según otra realización preferida, R representa independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, un grupo metoxi, un grupo trifluorometilo, un átomo de halógeno y más particularmente un átomo de flúor o cloro, un grupo trifluorometoxi y un grupo amino.
Según otra realización preferida, R' representa independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno y más particularmente un átomo de flúor o cloro, un grupo amino, un grupo metilo o un grupo
en donde A es O o NH, m es 2 o 3 y X1 es O, CH2 o N-CH3, siempre que cuando R' sea dicho grupo, n' sea 1 o 2, y cuando n' sea 2, el otro grupo R' sea diferente de dicho grupo.
Según un aspecto de dicha realización preferida, R' representa independientemente alternativamente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno y más particularmente un átomo de flúor o cloro, un grupo metilo o un grupo
en donde A es O o NH, m es 2 y X1 es O, CH2 o N-CH3, siempre que cuando R' sea dicho grupo, n' sea 1 o 2, y cuando n' sea 2, el otro grupo R' sea diferente de dicho grupo.
Por supuesto, todas las realizaciones particulares previas y sucesivas se pueden combinar juntas y formar parte de la invención.
Los compuestos de la fórmula (I) incluyen compuestos de la fórmula (Ia), (Ib), (Ic), (Id) y (Ie), como se definen en lo sucesivo.
Según una realización particular, un derivado de quinolina de la fórmula (I) puede ser un compuesto de la fórmula (Ia)
en donde R, R', R", n y n' son como se definen anteriormente.
Según un aspecto de dicha realización preferida, n es 1 o 2.
Según un aspecto de dicha realización preferida, n' es 1 o 2.
Según un aspecto de dicha realización preferida, R representan independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo elegido entre un grupo hidroxilo, un grupo fluoroalquilo (C1-C3), un grupo fluoroalcoxi (C1-C3), un grupo -NR1R2, un grupo alcoxi (C1-C4) y un grupo alquilo (C1-C3).
Según un aspecto de dicha realización preferida, R' representan independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo elegido entre un grupo alquilo (C1-C3), un grupo hidroxilo, un grupo -NR1R2 o un grupo
en donde A es O o NH, m es 2 o 3 y X1 es O, CH2 o N-CH3, siempre que cuando R' sea dicho grupo, n' sea 1 o 2, y cuando n' sea 2, el otro grupo R' sea diferente de dicho grupo.
Según un aspecto de dicha realización preferida, R" es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo (C1-C4) o un grupo
en donde m es 2 o 3 y Xi es O, CH2 o N-CH3, y preferentemente R" es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo. Según una realización particular, un derivado de quinolina de la fórmula (I) puede ser un compuesto de la fórmula (Ib)
en donde R, R', R", n y n' son como se definen anteriormente.
Según un aspecto de dicha realización preferida, n es 1 o 2.
Según un aspecto de dicha realización preferida, n' es 1, 2 o 3.
Según un aspecto de dicha realización preferida, R representan independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo elegido entre un grupo hidroxilo, un grupo fluoroalquilo (C1-C3), un grupo fluoroalcoxi (C1-C3), un grupo -NR1R2, un grupo alcoxi (C1-C4) y un grupo alquilo (C1-C3).
Según un aspecto de dicha realización preferida, R' representan independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo elegido entre un grupo alquilo (C1-C3), un grupo hidroxilo, un grupo -NR1R2 o un grupo
1
en donde A es O o NH, m es 2 o 3 y X1 es O, CH2 o N-CH3, siempre que cuando R' sea dicho grupo, n' es 1 o 2, y cuando n' sea 2, el otro grupo R' sea diferente de dicho grupo.
Según un aspecto de dicha realización preferida, R' representan independientemente alternativamente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo elegido entre un grupo alquilo (C1-C3), un grupo hidroxilo o un grupo -NR1R2.
Según un aspecto de dicha realización preferida, R" es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo (C1-C4) o un grupo
en donde m es 2 o 3 y X1 es O, CH2 o N-CH3, y preferentemente R" es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo. Según una realización particular, un derivado de quinolina de la fórmula (I) puede ser un compuesto de la fórmula (Ic)
en donde R, R', R", n y n' son como se definen anteriormente.
Según un aspecto de dicha realización preferida, n es 1.
Según un aspecto de dicha realización preferida, n' es 1.
Según un aspecto de dicha realización preferida, R representan independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo elegido entre un grupo hidroxilo, un grupo fluoroalquilo (C1-C3), un grupo fluoroalcoxi (C1-C3), un grupo -NR1R2, un grupo alcoxi (C1-C4) y un grupo alquilo (C1-C3).
Según un aspecto de dicha realización preferida, R representan independientemente alternativamente un átomo de hidrógeno o un átomo de halógeno.
Según un aspecto de dicha realización preferida, R' representan independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo elegido entre un grupo alquilo (C1-C3), un grupo hidroxilo, un grupo -NR1R2 o un grupo
1
en donde A es O o NH, m es 2 o 3 y X1 es O, CH2 o N-CH3, siempre que cuando R' sea dicho grupo, n' sea 1 o 2, y cuando n' sea 2, el otro grupo R' sea diferente de dicho grupo.
Según un aspecto de dicha realización preferida, R' representan independientemente alternativamente un átomo de hidrógeno o un átomo de halógeno.
Según un aspecto de dicha realización preferida, R" es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo (C1-C4) o un grupo
en donde m es 2 o 3 y X1 es O, CH2 o N-CH3, y preferentemente R" es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo. Según una realización particular, un derivado de quinolina de la fórmula (I) puede ser un compuesto de la fórmula (Id)
en donde R, R', n y n' son como se definen anteriormente.
Según un aspecto de dicha realización preferida, n es 1.
Según un aspecto de dicha realización preferida, n' es 1.
Según un aspecto de dicha realización preferida, R representan independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo elegido entre un grupo hidroxilo, un grupo fluoroalquilo (C1-C3), un grupo fluoroalcoxi (C1-C3), un grupo -NR1R2, un grupo alcoxi (C1-C4) y un grupo alquilo (C1-C3).
Según un aspecto de dicha realización preferida, R representan independientemente alternativamente un átomo de hidrógeno, un grupo fluoroalquilo (C1-C3), un grupo fluoroalcoxi (C1-C3) o un átomo de halógeno.
Según un aspecto de dicha realización preferida, R' representan independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo elegido entre un grupo alquilo (C1-C3), un grupo hidroxilo, un grupo -NR1R2 o un grupo
en donde A es O o NH, m es 2 o 3 y X1 es O, CH2 o N-CH3, siempre que cuando R' sea dicho grupo, n' es 1 o 2, y cuando n' sea 2, el otro grupo R' sea diferente de dicho grupo.
Según un aspecto de dicha realización preferida, R' representan independientemente alternativamente un átomo de hidrógeno o un átomo de halógeno.
Según un aspecto de dicha realización preferida, R" es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo (C1-C4) o un grupo
en donde m es 2 o 3 y X1 es O, CH2 o N-CH3, y preferentemente R" es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo.
Según una realización particular, un derivado de quinolina de la fórmula (I) puede ser un compuesto de la fórmula (Ie)
en donde R, R', n y n' son como se definen anteriormente.
Según un aspecto de dicha realización preferida, n es 1.
Según un aspecto de dicha realización preferida, n' es 1.
Según un aspecto de dicha realización preferida, R representan independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo elegido entre un grupo hidroxilo, un grupo fluoroalquilo (C1-C3), un grupo fluoroalcoxi (C1-C3), un grupo -NR1R2, un grupo alcoxi (C1-C4) y un grupo alquilo (C1-C3).
Según un aspecto de dicha realización preferida, R representan independientemente alternativamente un átomo de hidrógeno, un grupo fluoroalquilo (C1-C3), un grupo fluoroalcoxi (C1-C3) o un átomo de halógeno.
Según un aspecto de dicha realización preferida, R' representan independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo elegido entre un grupo alquilo (C1-C3), un grupo hidroxilo, un grupo -NR1R2 o un grupo
1
en donde A es O o NH, m es 2 o 3 y X1 es O, CH2 o N-CH3, siempre que cuando R' sea dicho grupo, n' es 1 o 2, y cuando n' sea 2, el otro grupo R' sea diferente de dicho grupo.
Según un aspecto de dicha realización preferida, R' representan independientemente alternativamente un átomo de hidrógeno o un átomo de halógeno.
Según un aspecto de dicha realización preferida, R" es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo (C1-C4) o un grupo
en donde m es 2 o 3 y X1 es O, CH2 o N-CH3, y preferentemente R" es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo. Los compuestos de la invención pueden existir en forma de bases libres o de sales de adición con ácidos farmacéuticamente aceptables.
Las sales de adición de ácido fisiológicamente aceptables adecuadas de los compuestos de la fórmula (I) incluyen bromhidrato, tartrato, citrato, trifluoroacetato, ascorbato, clorhidrato, tartrato, triflato, maleato, mesilato, formiato, acetato y fumarato.
Los compuestos de la fórmula (I) y o sales de los mismos pueden formar solvatos o hidratos y la invención incluye todos aquellos solvatos e hidratos.
Los términos "hidratos" y "solvatos" significan simplemente que los compuestos (I) según la invención pueden estar en forma de un hidrato o solvato, es decir, combinados o asociados con una o más moléculas de agua o de disolvente. Esto es solo una característica química de dichos compuestos, que se puede aplicar a todos los compuestos orgánicos de este tipo.
Los compuestos de la fórmula (I) pueden comprender uno o más átomos de carbono asimétricos. Así, pueden existir en forma de enantiómeros o de diaestereoisómeros. Estos enantiómeros, diaestereoisómeros y sus mezclas, que incluyen las mezclas racémicas, están englobados dentro del alcance de la presente invención.
En el contexto de la presente invención, el término:
- "halógeno" se entiende que significa cloro, flúor, bromo o yodo, y en particular indica cloro, flúor o bromo, - "alquilo (C1-C5)", como se usa en el presente documento, se refiere respectivamente a un hidrocarburo C1-C5 saturado normal, secundario o terciario. Los ejemplos son, pero no se limitan a, metilo, etilo, 1 -propilo, 2-propilo, butilo, pentilo,
- "cicloalquilo (C3-C6)", como se usa en el presente documento, se refiere a hidrocarburo saturado cíclico. Los ejemplos son, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo,
- "alcoxi (C1-C4)", como se usa en el presente documento, se refiere respectivamente a un resto alquilo O-(C1-C4), en donde alquilo es como se define anteriormente. Los ejemplos son, pero no se limitan a, metoxi, etoxi, 1-propoxi, 2-propoxi, butoxi,
- "grupo fluoroalquilo" y "grupo fluoroalcoxi" se refieren respectivamente a grupo alquilo y grupo alcoxi como se define anteriormente, estando dichos grupos sustituidos con al menos un átomo de flúor. Los ejemplos son grupos perfluoroalquilo, tales como trifluorometilo o perfluoropropilo,
- "heterociclo saturado de 5 o 6 miembros", como se usa en el presente documento, se refiere respectivamente a un ciclo saturado que comprende al menos un heteroátomo. Los ejemplos son, pero no se limitan a, morfolina, piperazina, tiomorfolina, piperidina y pirrolidina.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: El Compuesto 1 interactúa directamente con el complejo CBC y promueve la interacción de CBP20 con CBP80.
1. Material y métodos
A. Preparación del complejo CBC recombinante para estudios in vitro.
Se prepara el complejo CBC recombinante, que comprende CBP20 y CBP80, según el protocolo que se ha descrito en Worch, R. et al. (Specificity of recognition of mRNA 5' cap by human nuclear cap-binding complex. RNA 11, 1355 1363 (2005)).
B. Inducción del puente covalente dependiente de la dosis con el complejo CBC.
El Compuesto 1 puede formar un enlace covalente con el complejo CBC purificado después de 15 min de irradiación con luz UV a 365 nm.
C. Ensayo de cambio de la movilidad en gel
Se ha establecido el ensayo de cambio de la movilidad en gel en presencia de un análogo de la caperuza de m(7)GpppG según el protocolo descrito en Mazza et al. (Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21,5548-5557 (2002)).
D. Proteólisis limitada en el complejo CBC.
Se ha establecido la proteólisis limitada en el complejo CBC según el protocolo descrito en Mazza et al. (Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21 ,5548 5557 (2002)).
E. Análisis de espectrometría de masas
Se ha establecido el análisis de espectrometría de masas del complejo CBC según el protocolo descrito en Schirle et al. (Mass spectrometry-based proteomics in preclinical drug discovery. Chem Biol., 19 :72-84 (2012)).
Se separaron las proteínas en geles de SDS-PAGE (4-15 % de poliacrilamida, Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Gels, Bio-Rad, Hercules, EE. UU.) y se tiñeron con Page Blue Stain (Fermentas). Se cortaron carriles de gel en 3 trozos de gel y se destiñeron con tres lavados en 50 % de acetonitrilo y TEABC 50 mM (bicarbonato de trietilamonio). Después de la reducción de proteínas (con ditiotreitol 10 mM en TEABC 50 mM a 56 °C durante 45 min) y alquilación (yodoacetamida 55 mM TEABC a temperatura ambiente durante 30 min), las proteínas se digirieron en gel usando tripsina (1 pg/banda, Gold, Promega, Madison, EE: UU.) como se describió previamente en Shevchenko et al. (Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 1996, 68 (5), 850-8; 1996). Los productos digeridos se deshidrataron en una centrifugadora a vacío y se redujeron a 4 pl.
Se analizaron en línea los péptidos generados usando HPLC nanoflow-ionización por nanoelectropulverización en un espectrómetro de masas Q-Exactive (ThermoScientific, Waltham, EE. UU.) acoplado con un aparato Ultimate 3000 RSLC (Thermo Fisher Scientific). Se realizaron en línea la desalación y la preconcentración de las muestras en una precolumna Pepmap® (0,3 mm x 10 mm). Se usó un gradiente que consistía en 0-55 % de B durante 35 min y 90 % de B durante 10 min (A = 0,1 % de ácido fórmico en agua; B = 0,1 % de ácido fórmico, 80 % de acetonitrilo en agua) a 300 nl/min para eluir los péptidos de la columna de fase inversa capilar (0,075 mm x 150 mm) (Acclaim PepMap® RSLC, Thermo Fisher Scientific), provista de un emisor PicoTip de sílice sin recubrir (NewOjective, Woburn, EE. UU.). Se sometieron a electropulverización en línea los péptidos eluidos a un voltaje de 1,9 kV en un espectrómetro de masas Q-Exactive. Se adquirieron los espectros EM (m/z, 400-2,000) usando el software Xcalibur (v 3.0, Thermo Fisher Scientific) en el modo de ion positivo con una resolución de 70.000 para el barrido de iones precursores. Para
todas las mediciones de barrido completo con el detector Orbitrap se usó un ion de masa conocida (m/z 445,120024) como calibrador interno como se describe en Olsen et al. (Parts per million mass accuracy on an Orbitrap mass spectrometer via lock mass injection into a C-trap. Mol. Cell. Proteomics 4, 2010-2021; 2005). Se adquirieron espectros de EM/EM en el modo de adquisición dependiente de datos, en el que los 10 iones precursores más abundantes con el tiempo de integración máximo de 250 ms y un valor objetivo de 3 * 106 iones. La fragmentación de péptidos se realizó por disociación colisional de energía superior establecida en 26 V de energía de colisión normalizada. Se adquirieron espectros de EM/EM a una resolución de 17.500, con un valor objetivo de 1 * 105 iones y un tiempo de integración máximo de 120 ms.
Se hizo una búsqueda por comparación con la base de datos CPS de Homo sapiens (85.895 secuencias y secuencias específicas de CBP80-CBC20, edición septiembre de 2014, http://www.uniprot.org/) de todos los espectros de EM/EM usando el software Proteome Discoverer v1.4 (Thermo Fisher Scientific) y el algoritmo Mascot v2.5 (http://www.matrixscience.com/) con especificidad de la enzima tripsina y una escisión fallida de una tripsina. Se estableció la carbamidometilación como una modificación de cisteína fija y se estableció la oxidación como una modificación de metionina variable para las búsquedas. Se establecieron las tolerancias de masas en EM y EM/EM en 5 ppm y 0,5 Da, respectivamente. Se realizaron el tratamiento y la validación de los datos de espectrometría de masas usando el software Proteome Discoverer (umbral de significancia de Mascot p<0,05, con un mínimo de un péptido por proteína).
Además de las identificaciones proteína / péptido, se usó el software Skyline v2.6. (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) para procesar los cromatogramas de intensidad de los iones de péptidos específicos a partir de los datos de espectros de masas de barrido completo (MS1) adquiridos durante los experimentos proteómicos de EM/EM con HPLC, como se describió en MacLean et al. (Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Anal Chem 82, 10116-10124; 2010).
F. Cuantificación de la unión del complejo CBC a un análogo de caperuza de m(7)GpppG.
Se incubó CBC humana recombinante con un sustrato de ARN con caperuza y se analizó por electroforesis en gel nativo con el fin de resolver los diferentes complejos de ARN y de ARN-proteína según Mazza et al. (Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21 ,5548 5557 (2002).
2. Resultados
Usando un derivado del Compuesto 1 que tiene un resto fotoactivable y competencia con el Compuesto 1 sobre CBP20 y CBP80 recombinantes purificados (CBC), se descubrió que el Compuesto 1 en sí es capaz de inducir un puente covalente dependiente de la dosis entre CBP20 y CBP80, después de la irradiación UV y este complejo se puede resolver por SDS-PAGE (Fig. 2 y 3).
El análisis de espectrometría de masas de CBP20, CBP80 y el complejo CBC (80 y 20) purificado en gel mostró que la digestión con tripsina del complejo CBC (CBP80 y CBP20) dio lugar a todos los péptidos predichos, excepto al péptido en la posición 37-66 de CBP20 que estaba reproduciblemente ausente infrarrepresentado o ausente. Sin embargo, la digestión individual con tripsina de cualquiera de CBP20 o CBP80 de la misma muestra dio lugar a todos los péptidos predichos. Notablemente, el péptido 37-66 en la estructura cristalina de CBC (Mazza et al.; Crystal structure of the human nuclear cap binding complex. Mol. Cell 8, 383-396 (2001)) se corresponde con la interfase entre CBP20 y CBP80, que podría englobar un sitio de interacción entre el Compuesto 1 y el complejo CBC (Fig. 3).
Sin embargo, el Compuesto 1 no afecta la unión del complejo CBC con la sonda de ARN con caperuza en un ensayo de cambio de la movilidad en gel. Aunque el complejo entre CBC y el ARN con caperuza se completó por el m7GpppG, no se observó competencia con el Compuesto 1 en ninguna concentración probada, que confirma que el Compuesto 1 no interactúa con el sitio de unión a la caperuza de CBP20 (Fig. 4).
Estos resultados respaldan así completamente el uso de CBP20, CBP80 y del complejo CBP20/CBP80 como un método de cribado de compuestos eficientes para el tratamiento o la prevención de una infección viral o una afección relacionada con un virus en un individuo.
Estos resultados también respaldan que el Compuesto 1 se une directamente con el complejo CBC, pero no interfiere con la unión a la caperuza ni la exportación de la mayor parte de los transcritos de pol II.
Ejemplo 2: Potencia del Compuesto 1 para inhibir la producción de VIH-1 en CMSP y células infectadas por macrófagos.
1. Material y métodos
A. Cultivo celular e infección
Se obtuvieron capas leucocíticas de los individuos VIH negativos del centro de donación de sangre local en Zúrich, Suiza (http://www.blutspendezurich.ch/) y del Centre de transfusion sanguine de Montpellier. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humanas por centrifugación en gradiente de Ficoll (Axis-Shield PoC AS). Las células se cultivaron a 37 °C, 5 % de CO2 hasta una densidad de 1x106 células/ml en medio RPMI Glutamax (Ref. de Life Technologies 61870-010) complementado con 10 % de suero de ternero fetal (FCS) (Ref. de Thermo Fischer SV30160.03), 1000 U/ml de IL2 (Ref. de Peprotech 200-02) y 5 pg/ml de PHA (Ref. de Roche 1249738) para su activación. Tres días después, las células se reunieron y se resuspendieron hasta una densidad de 1x106 células/ml en medio RPMI Glutamax complementado con 10 % de suero de ternero fetal (FCS) 1000 U/ml de IL-2 para infección. La infección por el VIH-1 se ha realizado con 10 pg de la cepa del VIH Ada-M R5 por ml de células durante 4 horas. Se centrifugaron las células y se resuspendieron hasta una densidad de 1x106 células/ml en medio complementado con fármaco solubilizado en DMSO diluido (Ref. de Sigma D4818) según una concentración final de 0,05 % de DMSO. Las células se trataron durante 6 días con un cambio de medio parcial en el día 3. Se realizó la valoración de p24 del VIH del sobrenadante de cultivo celular por ELISA con el kit Innotest de Ingen (Ref. de Ingen 80564) según las instrucciones del fabricante.
Para generar macrófagos derivados de monocitos (MDM), se aislaron monocitos usando microperlas de CD14 (catálogo N.° 130-050-201; Miltenyi) y se cultivó en medio X-VIVO10 (Lonza) complementado con GM-CSF 1000 U/ml y M-CSF 100 ng/ml durante 6 días. Los monocitos se sembraron en un recuento celular de 50.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. Después de 6 días, se sustituyó el medio con X-VIVO10 sin citocinas. Después de 2 días, los macrófagos se trataron con el Compuesto 1 durante la noche y se infectaron al día siguiente con el virus Yu-2 durante 6 horas, se lavaron con PBS y se cultivaron en medio que contenía los compuestos durante 12 días. El sobrenadante para el ELISA de p24 se recogió 2 veces a la semana.
Se han cultivado células HeLa de ATCC a 37 °C, 5 % de CO2 en medio DMEM Glutamax (Ref. de Life Technologies 31966-021) complementado con 10 % de suero de ternero fetal (FCS) (Ref. de Thermo Fischer SV30160.03). Se realizó transfección transitoria de pAPSP (2 pg por 400.000 células) por el reactivo JetPEI (Ref. de PolyPlus 101 -10N) según la instrucción del fabricante.
B. Monitorización de los niveles de antígeno p24.
Se trataron las células con 0,01 pM hasta 30 pM y se monitorizaron los niveles de antígeno p24 en sobrenadante de cultivo durante un periodo de 12 días. Se realizó la valoración de p24 del VIH del sobrenadante de cultivo celular por ELISA con el kit Innotest de Ingen (Ref. de Ingen 80564) según las instrucciones del fabricante.
2. Resultados
El primer cribado funcional de los nuevos compuestos se basó en el uso de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humanas recién aisladas de donantes sanos. Estas células se infectaron por la cepa de laboratorio del VIH Ada-MR5.
La Figura 5 muestra la inhibición dependiente de la dosis de la replicación del VIH-1 en CMSP estimuladas de 7 donantes diferentes. De forma interesante, el tratamiento con el Compuesto 1 no alteró las diferentes poblaciones de linfocitos presentes en CMSP.
Para generalizar el efecto del Compuesto 1 sobre la replicación del VIH-1 en otras células primarias, se repitió el mismo protocolo usando macrófagos infectados, que actúan de reservorios virales. Se trataron las células con 0,01 pM hasta 30 pM y se monitorizaron los niveles de antígeno p24 en sobrenadante de cultivo durante un periodo de 12 días. (Figure 5). De forma interesante, el Compuesto 1 bloqueó eficientemente la replicación del virus y en un modo dependiente de la dosis que alcanzó niveles de inhibición de hasta el 90 % en macrófagos primarios a 0,1 pM. Sin embargo, la viabilidad celular no disminuyó con el tratamiento con el Compuesto 1 (datos no mostrados).
Estos resultados demuestran la evidencia de que el método de cribado es adecuado para la selección de compuestos que tienen baja toxicidad, pero que siguen siendo adecuados para la inhibición de la replicación del VIH-1, en CMSP y macrófagos.
Como todos los experimentos previos se realizaron con células humanas primarias infectadas con cepas trópicas para los macrófagos (R5) (Ada-MR5 y YU2), se cambió a un sistema in vitro que puede ser más relevante para la situación clínica ya que implica infectar las células primarias con cepas aisladas del VIH-1 de pacientes. Como se muestra en la Figura 6, el Compuesto 1 tuvo un fuerte efecto inhibidor para todos los subtipos del VIH-1 probados, que incluyeron el subtipo B, C y virus recombinantes. En particular, el Compuesto 1 inhibe muy eficientemente la replicación de cepas virales que llevan mutaciones que confieren resistencia a diferentes agentes terapéuticos in vitro, y no se detectaron mutaciones inductoras de resistencia después del tratamiento con el Compuesto 1 durante al menos 24 semanas.
Estos resultados proporcionan evidencia de que los compuestos cribados no seleccionan mutaciones específicas del VIH y no son genotóxicos.
Ejemplo 3: Eficacia del Compuesto 1 para inhibir la replicación viral en ratones humanizados.
1. Material y métodos
A. Generación de modelos de ratón humanizado
Se reconstituyeron ratones SCID con PBL humanos recién recogidos durante dos semanas y se estimaron las tasas de reconstitución por valoración de IgG humana según Denton et al. (Humanized mouse models of HIV infection. AIDS Rev 13, 135-148 (2011)) y Berges et al. (The utility of the new generation of humanized mice to study HIV-1 infection: transmission, prevention, pathogenesis, and treatment. Retrovirology 8, 65 (2011)).
Se infectaron ratones SCID reconstituidos con la cepa del VIH-1 JRCSF por inyección intraperitoneal. El grupo de control recibió por sonda nasogástrica Labrafil y 5 % de DMSO (n=15) y el grupo tratado 20mg/kg b.i.d del Compuesto 1 en Labrafil y 5 % de DMSO (n=14) durante 15 días.
Se criaron ratones NOD.scid.IL2R -/-(NSG) y se mantuvieron en jaulas ventiladas individuales y se alimentaron con comida esterilizada en autoclave y agua. Se generaron ratones con un sistema inmunitario humano (NSG-HIS) como se describe en Nischang et al. (Humanized mice recapitulate key features of HIV-1 infection: a novel concept using long-acting anti-retroviral drugs for treating HIV-1. PLoS ONE 7, e38853 (2012).
Brevemente, ratones NSG recién nacidos (<5 días de edad) recibieron una irradiación de cuerpo total subletal (1 Gy) con una fuente de Cs, y luego recibieron 2x 105 HSC humanas CD34+ transducidas o sin transducir usando una jeringa de Hamilton de 50 pl por vía intrahepática (i.h.). Todas las manipulaciones en los ratones NSG-HIS se realizaron en flujo laminar. Se realizó diariamente la alimentación por sonda nasogástrica de los ratones con una aguja para sonda nasogástrica de acero inoxidable (recta de 22 de calibre, 1,4 pulgadas de longitud (3,6 cm)). Se disolvió el Compuesto 1 en DMSO (Sigma), y luego se diluyó hasta el 5 % o menos según la dosis requerida en un vehículo adecuado (Labrafil M 1944 CS; COOPER INDUSTRIE, Place Lucien Auvert 77020 MELUN c Ed EX 20). Los ratones no recibieron más de 150 pl de volumen por día. Se supervisaron los ratones tres veces a la semana para los síntomas o signos de acontecimientos adversos, según una hoja de puntuaciones habitual.
B. Reserva de virus VIH e infección de ratones
Se obtuvieron reservas virales por transfección mediada por polietilenimina (PEI) (Polysciences) de células 293T con un plásmido pYU-2 (R5 trópico) proporcionado por el NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. 48 horas después de la transfección. el virus se recogió, se filtró (0,45 pm) y se congeló a -80 °C. Se determinaron los títulos virales como se describe en McDougal et al. (Immunoassay for the detection and quantitation of infectious human retrovirus, lymphadenopathy-associated virus (LAV). J. Immunol. Methods 76, 171-183 (1985)).
Brevemente, se determinó TCID50 (dosis infecciosa de cultivo de tejido al 50 %) infectando células mononucleares de sangre periférica (CMSP) empobrecidas en linfocitos T CD8+ humanos de tres donantes que se estimularon por la adición de IL-2, PHA y perlas anti-CD3 (Dynal 11131D, Life Technologies). Entonces, se ajustaron las reservas virales a 1x106 TCID50/ml, se dividieron en alícuotas y se congelaron a -80 °C antes de uso. Se infectaron por vía intraperitoneal i.p. ratones con HIV YU-2, 1x106 TCID50 por ratón. Se midieron los niveles de ARN del VIH por RT-PCR (prueba del VIH-1 de AmpliPrep/COBAS TaqMan, Roche) varias veces después de la infección.
C. Citometría de flujo
Se marcaron suspensiones de células con anticuerpos monoclonales anti-humanos (mAb) que se dirigían a los siguientes marcadores de la superficie celular: CD45-FITC, CD3-PE, CD4-Pe Cy7, CD8-BV421 y CD19-APC (todos de Biolegend). Se hicieron el lavado y las diluciones de reactivos con tampón FACS (PBS que contiene 2 % de suero de ternero fetal y 0,05 % de azida de sodio (NaN3). Todas las adquisiciones se hicieron en un citómetro de flujo Cyan ADP (Beckman Coulter). Los datos se analizaron con el software FlowJo (Ashland, OR). Se excluyeron los residuos celulares y las células muertas por sus características de dispersión de la luz.
2. Resultados
Se reconstituyeron ratones humanizados con células humanas linfoides, que proporcionaron sistemas experimentales rápidos, fiables y reproducibles para la prueba de la eficacia del Compuesto 1 in vivo 32,33. En el contexto inicial, los ratones SCID se reconstituyeron con CMSP y luego se infectaron con la cepa del VIH-1 JR-CSF 33,34. Se trataron los ratones por sonda nasogástrica oral con el Compuesto 1 en un nivel de dosis de 20 mg/kg dos veces al día durante 15 días. Las mediciones de ARN viral mostraron que el tratamiento oral con el Compuesto 1 fue capaz de reducir significativamente la carga viral durante un periodo de 15 días de tratamiento (Fig. 7A). El análisis de FACS de muestras de sangre mostró que el tratamiento con el Compuesto 1 previene el agotamiento de las células CD4+ tras la infección de los ratones reconstituidos y así restaura la relación CD8+/CD4+ a la de los ratones no infectados (Fig. 7B).
Para probar el efecto a largo plazo del Compuesto 1 sobre el sistema inmunitario y la replicación viral en ratones humanizados infectados, se trasplantaron ratones NOG recién nacidos con células progenitoras hematopoyéticas CD34+ aisladas de sangre del cordón umbilical (véase Nischang et al.; Humanized mice recapitulate key features of HIV-1 infection: a novel concept using long-acting anti-retroviral drugs for treating HIV-1. PLoS ONE 7, e38853;2012).
Se había mostrado previamente que este modelo de ratón humanizado era valioso para la exploración de la potencia antiviral de los nuevos compuestos que se dirigen a los reservorios del VIH latentes 35. El tratamiento de ratones humanizados NOG durante un mes con 20 mg/kg o 40 mg/kg del Compuesto 1 ni altera los valores de injerto de las células CD45+ ni la relación CD8+/CD4+ en comparación con los controles sin tratamiento (Fig. 7C). En este estudio, se infectaron ratones humanizados NOG con el virus del VIH-1 YU2 y se alimentaron diariamente durante 30 días con 40 mg/kg del Compuesto 1 o con HAART (3TC-Tenofovir-Raltegravir y AZT) y se midieron las cargas virales como antes. El Compuesto 1 redujo la carga viral durante un periodo de 30 días de tratamiento, pero lo que es más importante es que la carga viral siguió siendo baja durante al menos 50 días después de la finalización del tratamiento (Fig. 7D). Por el contrario, se observó el rebote hasta niveles comparables a la infección inicial en el grupo de HAART (Fig. 7D).
Por lo tanto, estos resultados muestran que el Compuesto 1 cribado es el primer fármaco robusto contra el VIH capaz de suprim ir la carga viral de forma sostenible después del cese del tratamiento.
Ejemplo 4: El Compuesto 1 influye en la biogénesis del ARN del VIH mediada por Rev.
1. Material y métodos
A. Cultivo celular e infección
Se mantuvieron células HeLa 128*MS2-GFP (amable donación de E. Bertrand, IGMM Montpellier, Francia) en medio DMEM Glutamax (Ref. de Life Technologies 31966-021) que contenía 10 % de suero bovino fetal (Hyclone), penicilina/estreptomicina (10 U/ml) en una incubadora con 5 % de CO2 a 37 °C. Las células se transfectaron con el plásmido pSG-FlagRev (amable donación de P. Jalinot, ENS Lyon, Francia) durante 24 horas con el reactivo JetPEI (PolyPlus Ref 101-10N) según las instrucciones del fabricante.
B Análisis de inmunofluorescencia
Se fijaron células dispuestas sobre cubreobjetos durante 10 min en 3,7 % de formaldehído (en PBS), seguido por una permeabilización de 2 min con 0,1 % de Triton X-100 (en PBS) e incubación en PBS que contenía 0,1 de % albúmina de suero bovino. Se reveló la proteína Rev usando anticuerpo contra la proteína Rev del VIH-1 (Santa Cruz) y los núcleos se tiñeron usando Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich). Las células se levaron en PBS montado con medio de montaje DAKO y se observaron bajo el microscopio de fluorescencia.
Se realizó la obtención de imágenes de células con una Leica DM6000 (Leica, Wetzlar, Alemania) con objetivo de aceite de calidad PL APO x 63. Las imágenes se capturaron en una cámara Coolsnap HQ2 (Roper Scientific Inc.) manejada por Metamorph (Molecular Devices) y se procesaron usando el software FiJi y la intensidad de fluorescencia de GFP se determinó usando el módulo de medición de FiJi.
2. Resultados
Para probar el efecto del Compuesto 1 sobre el corte y empalme y la exportación de ARN viral, se usó un sistema indicador del VIH para visualizar las moléculas de ARN del VIH en células vivas. Se basa en un sistema indicador del VIH que contiene los LTR de 5' y 3' que alojan el promotor y los sitios de poliA, respectivamente, secuencias de encapsidación y elementos de r Re , además de 128 sitios de unión a MS2 que se insertaron entre el sitio del VIH-1 del donante principal (SD1) y el último aceptor de corte y empalme (SA7) (véase la Fig. 8a).
El indicador se introdujo en las células HeLa que expresan establemente Tat y MS2-GFP, usando el sistema Flp-In para crear células que llevan el transgén de una sola copia. La expresión estable de la proteína MS2-GFP permitió la excelente visualización del sitio de transcripción y moléculas individuales de pre-ARNm (Fig. 8b) y no alteraron la tasa de corte y empalme (datos no mostrados).
Para ensayar la exportación de ARN, estas células se transfectaron con construcciones que expresaban la proteína Rev que se unirá al RRE y facilitará la exportación del ARN viral sin cortar ni empalmar, a la vez que lo protegen de la maquinaria de corte y empalme. La expresión de Rev condujo a una señal de GFP reducida en tanto el sitio de transcripción como el nucleoplasma (Fig. 8b). Se espera este resultado, ya que después de la asociación con Rev con el "sitio de nucleación" de RRE de alta afinidad, moléculas de Rev adicionales pueden polimerizar a lo largo de la longitud del RRE en un modo escalonado a través de tanto las interacciones proteína-proteína como las interacciones proteína-ARN, eliminando así MS2-GFP de sus secuencias diana.
La exportación de ARN mediada por Rev conduce a una reducción del ARN sin cortar ni empalmar en el núcleo y la intensidad de GFP en el núcleo. Significativamente, el Compuesto 1 interfiere con ambas actividades de Rev preservando la señal de GFP tanto en el sitio de transcripción como en el nucleoplasma de células que expresan Rev (Fig. 8b y c). Sin embargo, el Compuesto 1 no muestra efecto sobre las células indicadoras en ausencia de Rev (datos no mostrados).
Por lo tanto, estos resultados muestran que el Compuesto 1 cribado previene específicamente la exportación mediada por Rev del ARN viral.
Ejemplo 5: El Compuesto 1 aumenta los niveles de ARN del VIH cortado y empalmado.
1. Material y métodos
Cuantificación del corte y empalme de ARN viral y no viral
La cuantificación del corte y empalme de ARN viral se logra usando los protocolos detallados en Bakkour et al. (Smallmolecule inhibition of HIV pre-mRNA splicing as a novel antiretroviral therapy to overcome drug resistance. PLoS Pathog. 3, 1530-1539 (2007).
La cuantificación del corte y empalme de ARN no viral se logra usando los protocolos detallados en Klinck et al. (Multiple alternative splicing markers for ovarian cancer. Cancer Res. 68, 657-663 (2008)) y Venables et al. (Cancerassociated regulation of alternative splicing. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 670-676 (2009)).
Otros protocolos son como se describen previamente.
2. Resultados
Se evaluó la eficiencia del Compuesto 1 usando el plásmido pAPSP que contenía el genoma proviral del VIH-1 delecionado entre los nucleótidos 1511 y 4550 que recapitula todos los eventos de corte y empalme del pre-ARNm del VIH-1 en células HeLa transfectadas.
Se analizaron luego los ARNm producidos por corte y empalme por RT-PCR usando cebadores directos e inversos que amplifican varias isoformas de corte y empalme que codifican las proteínas virales Nef, Rev y Tat. El Compuesto 1 usado en una concentración de 5 uM o 10 uM no alteró el perfil de corte y empalme.
Con el fin de verificar que el Compuesto 1 no afectó significativamente los acontecimientos de corte y empalme de los genes endógenos, que podría conducir posiblemente a ciertos efectos adversos, se probó el efecto del Compuesto 1 por análisis por RT-PCR del corte y empalme alternativo global en 382 acontecimientos de corte y empalme alternativo. Estos 382 acontecimientos de corte y empalme alternativo (ASE) representan una imagen aleatoria de alta resolución de las alteraciones globales del corte y empalme alternativo. Se realizó el análisis de PCR de alto rendimiento de estos 382 ASE (esencialmente aleatorios) en múltiples muestras de CMSP, ya fuera a partir de (células) no tratadas o tratadas con DMSO, el Compuesto 1 o con el fármaco antiviral de control (Darunavir). El análisis de los datos permitió controles de calidad más rigurosos; los ASE solo se consideraron si >75 % de los productos migraron en las movilidades esperadas (es decir, si las reacciones fueron puras) y si la concentración de PCR esperada total era más alta de 20 nM (es decir, las reacciones fueron fuertes), que condujeron a 264 ASE restantes.
Los perfiles de corte y empalme de las 12 muestras de CMSP muestran que hay poca diferencia en los perfiles de corte y empalme de las muestras de CMSP tratadas con fármaco, ya que forman uno de los tres polos separados con las células madre y sus fibroblastos derivados. Coherente con esto, el porcentaje de células sin tratar y las células tratadas con el Compuesto 1 cortadas y empalmadas en valores para estos 264 ASE tuvieron una correlación de R=0,89, mientras que las células madre y los fibroblastos derivados solo se correlacionaron en R=0,59 (datos no mostrados). Tomados juntos estos datos muestran que el Compuesto 1 no tiene efecto global sobre el corte y empalme pre-ARNm.
Para probar si el Compuesto 1 influye en el corte y empalme del ARN del VIH en células infectadas, se realizó una captura de secuencia basada en matriz usando sondas de bibliotecas personalizadas que se dirigen a las secuencias del VIH para librarse del ARN celular. Las sondas se usaron para capturar los ADNc preparados a partir de las CMSP tratadas y sin tratar infectadas. Después de la captura doble, se prepararon bibliotecas y se secuenciaron usando pirosecuenciación 454 (según el manual del método de GS Junior). El tamaño promedio de las lecturas alrededor de los 400 pb permitió el ensamblaje inequívoco del genoma viral de la muestra sin tratar (después de 3 y 6 días de infección) usando lecturas que no se cartografiaron con el genoma humano (hg 19). Todos los datos de secuenciación se analizaron usando gsnap, como se detalla en Wu et al. (Fast and SNP-tolerant detection of complex variants and splicing in short reads. Bioinformatics 26, 873-881 (2010)).
Después de 3 días después de la infección, se obtuvo una mayor cobertura del genoma viral para la muestra de DMSO sin tratar (32.289 lecturas) en comparación con la muestra tratada con el Compuesto 1 (4149 lecturas). Sorprendentemente, 3 días después de la infección, el 17,4 % de las lecturas de la muestra tratada se correspondió con las uniones de corte y empalme, frente al 0,93 % en la muestra sin tratar. Mientras que el número de lecturas de las muestras tratadas y sin tratar fue similar 6 días después de la infección (20.585 y 27.984, respectivamente), la fracción correspondiente a las uniones de corte y empalme fue de nuevo mayor en la muestra tratada (13,3 %) en comparación con la muestra sin tratar (1,93 %).
Basándose en estos resultados, se puede llegar a la conclusión de que el Compuesto 1 favorece el ARN del VIH cortado y empalmado en CMSP infectadas, comprometiendo así la posterior síntesis del pre-ARNm del VIH-1 de longitud completa de las partículas infecciosas.
LISTADO DE SECUENCIAS
Claims (15)
1. Un método de cribado de un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una infección viral o afección relacionada con un virus en un individuo, que comprende las etapas de:
a) determinar la capacidad de un compuesto candidato para promover la interacción entre CBP20 y CBP80 en una muestra, y
b) seleccionar el compuesto candidato que se determina que promueve dicha interacción en la etapa a).
2. Un método de cribado de un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una infección viral o afección relacionada con un virus en un individuo, que comprende las etapas de:
a) determinar la capacidad de un compuesto candidato para interactuar con un fragmento de CBP20 que se une a CBP80, o para interactuar con un fragmento de CBP80 que se une con CBP20, o de interactuar con un complejo que se una a la caperuza (CBC) en una muestra, y
b) seleccionar el compuesto candidato que se determina que interactúa con dicho fragmento de CBP20, dicho fragmento de CBP80, o dicho complejo CBC en la etapa a).
3. El método según la reivindicación 1, que comprende al menos la etapa de a1) medir la capacidad de un compuesto candidato para promover la interacción entre CBP20 y CBP80 en dicha muestra.
4. El método según la reivindicación 2, que comprende al menos la etapa de a1) medir la capacidad de un compuesto candidato para interactuar con CBP20 o CBP80 en dicha muestra.
5. El método según una de las reivindicaciones precedentes, que comprende una etapa de determinar la capacidad del compuesto para interactuar con CBP20 en una muestra.
6. El método según una de las reivindicaciones precedentes, que comprende una etapa de determinar la capacidad del compuesto para interactuar con un fragmento de CBP20 que se une a CBP80.
7. El método según la reivindicación precedente, en donde el fragmento de CBP20 incluye SEQ ID N°2.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además una etapa de determinar la capacidad del compuesto candidato para no interactuar con el sitio de unión a la caperuza de CBP20, y seleccionar el compuesto candidato que no interactúa con dicho sitio de unión a la caperuza de CBP20.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el método comprende además (i) determinar la capacidad del compuesto candidato para interactuar con Rev; y/o para disminuir la actividad de Rev;
(ii) seleccionar el compuesto candidato que se ha determinado que interactúa con Rev y/o que disminuye la actividad de Rev en la etapa (i):
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde CBP20 y/o CBP80 son polipéptidos recombinantes; polipéptidos sintéticos o fragmentos de los mismos.
11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el virus se selecciona de virus de ADN, virus de ARN y retrovirus, que incluye virus de ADNbc, virus de ADNmc, virus de ARNbc, virus de ARNmc(+), virus de ARNmc(-), ARNmc-RT y virus de ADN-RTbc.
12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el virus es un virus de ARN o un retrovirus, y más particularmente el VIH.
13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la afección relacionada con un virus es el sida.
14. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde (1) la interacción entre CBP20 y CBP80 o (2) la interacción entre el compuesto candidato y el fragmento de CBP20 o CBP80 se determina por al menos una técnica seleccionada de: proteólisis limitada, co-inmunoprecipitación, complementación bimolecular de la fluorescencia (BiFC), transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), radioinmunoensayo, ELISA, doble híbrido en levadura (Y2H) y ensayo de complementación de fragmentos de proteínas (PCA), electroforesis de afinidad o ensayo de cambio de la movilidad en gel, cromatografía de afinidad, ensayo de captura, coinmunoprecipitación, presentación en fagos, reticulación química, purificación por afinidad en tándem (TAP), termoforesis a microescala (MST), resonancia de plasmones superficiales (SPR), anisotropía de fluorescencia, calorimetría de titulación isotérmica (ITC), espectrometría de masas, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear (RMN), microscopía electrónica y acoplamiento de proteínas.
15. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el compuesto candidato es de la fórmula:
en donde:
z representa N o C,
significa un anillo aromático en donde V es C o N y cuando V es N, V está en orto, meta o para de z, es decir, forma respectivamente un grupo piridazina, pirimidina o pirazina,
R representa independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo elegido entre un grupo -CN, un grupo hidroxilo, un grupo -COOR1, un grupo fluoroalquilo (C1-C3), un grupo fluoroalcoxi (C1- C3), un grupo cicloalquilo (C3-C6), un grupo -NO2 , un grupo -NR1R2 , un grupo alcoxi (C1-C4), un grupo fenoxi, un grupo NR1 SO2 NR1R2 , un grupo -NR1 SO2 R1, un grupo NR1C(=O)R1, un grupo NR1C(=O )-N R ^2 , un grupo SO2 NR1R2 , un grupo SO3H, un grupo O-SO2-OR3 , un grupo OP(=O)(OR3)(OR4), un grupo -O-CH2-COOR3 y un grupo alquilo (C1-C3), estando dicho alquilo opcionalmente monosustituido con un grupo hidroxilo,
Q es N u O, siempre que R'' no exista cuando Q es O,
R1 y R2 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C3),
R3 y R4 representan independientemente un átomo de hidrógeno, Li+, Na+, K+, N+(Ra)4 o un grupo bencilo, n es 1,2 o 3,
n' es 1, 2 o 3,
R' representan independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo elegido entre un grupo alquilo (C1-C3), un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, un grupo -COOR1, un grupo -NO2, un grupo NR1 R2 , un grupo morfolinilo o morfolino, un grupo N-metilpiperazinilo, un grupo fluoroalquilo (C1-C3), un grupo alcoxi (C1-C4) y un grupo -CN, y puede ser además un grupo elegido entre:
A es un enlace
B es un enlace covalente o NH,
m es 1, 2, 3, 4 o 5,
p es 1, 2 o 3,
Ra y Rb representan independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo (C1-C5) o un grupo cicloalquilo (C3-C6),
Ra y Rb pueden formar junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos un heterociclo de 5 o 6 miembros saturado que contiene opcionalmente otro heteroátomo elegido entre N, O y S, estando dicho heterociclo opcionalmente sustituido con uno o más Ra, siempre que cuando R' sea un grupo (IIa) o (IIIa), n' pueda ser 2 o 3 solo si otros grupos R' son diferentes de dicho grupo (IIa) o (IIIa),
R" es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo (C1-C4) o es un grupo (IIa) como se definió anteriormente,
o cualquiera de su sal farmacéuticamente aceptable;
rnativamente en donde el compuesto candidato es de la fórmula:
en donde:
significa un anillo aromático en donde V es C o N y cuando V es N, V está en orto, meta o para de z, es decir, forma respectivamente un grupo piridazina, pirimidina o pirazina,
R representan independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo elegido entre un grupo -CN, un grupo hidroxilo, un grupo -COOR1, un grupo fluoroalquilo (C1-C3), un grupo fluoroalcoxi (C1-C3), un grupo -NO2 , un grupo -NR1R2 , un grupo alcoxi (C1-C4), un grupo fenoxi y un grupo alquilo (C1-C3), estando dicho alquilo opcionalmente monosustituido con un grupo hidroxilo,
R1 y R2 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C3),
n es 1, 2 o 3,
n' es 1 o 2,
R' es un átomo de hidrógeno o un grupo elegido entre un grupo alquilo (C1-C3), un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, un grupo -COOR1, un grupo -NO2 , un grupo -NR1R2 , un grupo morfolinilo o morfolino, un grupo N-metilpiperazinilo, un grupo fluoroalquilo (C1-C3), un grupo alcoxi (C1-C4) y un grupo -CN, R" es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C4),
Z es N o C,
Y es N o C,
X es N o C,
W es N o C,
T es N o C,
U es N o C,
y en donde como máximo cuatro de los grupos V, T, U, Z, Y, X y W son N,
y en donde al menos uno de los grupos T, U, Y, X y W es N,
o cualquiera de sus sales farmacéuticamente aceptables o cualquiera de sus metabolitos.
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