ES2864861T3 - Composiciones que comprenden una proteína tipo anticuerpo de la región V doble - Google Patents

Abstract

Una solución que comprende: - 100 mg/ml de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13, - 6,3 mmol/l de fosfato sódico monobásico, - 3,7 mmol/l de trometamina, - 5% (peso/volumen) de sacarosa, - 3% (peso/volumen) de prolina, - 0,2% (peso/volumen) de polisorbato 80, y - agua, en donde el pH de dicha solución es de 7,0 y en donde la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende (i) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las CDRs de las secuencias SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 y (ii) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las CDRs de las secuencias SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13, (iii) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las CDRs de las secuencias SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 y (iv) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las CDRs de las secuencias SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19 o las CDRs de las secuencias SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, en donde dicha solución comprende de 10 mg a 300 mg de dicha proteína tipo anticuerpo de la región V doble o su fragmento.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones que comprenden una proteína tipo anticuerpo de la región V doble

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La interleucina-4 (IL-4) es una citocina pleotrópica que tiene un amplio espectro de efectos sobre células B y T linfoides, y muchas células no linfoides incluyendo monocitos, células endoteliales y fibroblastos. Por ejemplo, IL-4 estimula la proliferación de varias líneas celulares dependientes de IL-2 e IL-3, induce la expresión de moléculas del complejo de histocompatibilidad principal clase II sobre células B en reposo y mejora la secreción de IgG4 e IgE por células B humanas. IL-4 está asociada con una respuesta inmunitaria tipo Th2, y se produce mediante y promueve la diferenciación de células Th2. IL-4 se ha relacionado con un número de trastornos, tales como alergia y asma.

IL-13 es una citocina recientemente identificada (Minty, A. y cols., Nature, 1993, 362, 248-250, y McKenzie, A. N. y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1993, 90, 3735-3739) de 112 aminoácidos secretada por los linfocitos T activados, los linfocitos B y los mastocitos después de la activación. En virtud de sus numerosas propiedades biológicas compartidas con IL-4, IL-13 se ha descrito como una citocina tipo IL-4. Sus actividades son en efecto similares a las de iL-4 sobre las células B (Defrance, T. y cols., J. Exp. Med., 1994, 179, 135-143, Punnonen, J. y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1993, 90, 3730-3734, Fior, R. y cols., Eur. Cytokine Network, 1994, 5, 593-600), los monocitos (Muzio, M. R. F. y cols., Blood, 1994, 83, 1738-1743, De Waal Malefyt, R. y cols., J. Immunol, 1993, 151, 6370­ 6381, Doyle, A. y cols., Eur. J. Immunol. 1994, 24, 1441-1445, Montaner, L. J. y cols., J. Exp. Med., 1993, 178, 743­ 747, Sozzani, P. y cols., J. Biol. Chem., 1995, 270, 5084-5088) y otras células no hematopoyéticas (Herbert, J. M. y cols., Febs Lett., 1993, 328, 268-270, y Derocq, J. M. y cols., Febs Lett. 1994, 343, 32-36). Por otra parte, al contrario que IL-4, no ejerce un efecto específico sobre células T en reposo o activadas (Zurawuki, G. y cols., Immunol. Today, 1994, 15, 19-26).

Diversas actividades biológicas de IL-13 sobre los monocitos/macrófagos, los linfocitos B y ciertos precursores hematopoyéticos han sido descritas con detalle por A. J. Minty así como en artículos de revisión sobre IL-13. Varios datos indican, además, que esta citocina tiene un efecto pleotrópico sobre otros tipos de células. Estas células no hematopoyéticas que están directamente afectadas por IL-13 son células endoteliales y microgliales, queratinocitos y carcinomas renales y de colon.

Una de las fases en el análisis de la señal trasmitida por una molécula biológica dentro de una célula consiste en identificar su receptor membranario. Los estudios de investigación llevados a cabo a este fin sobre el receptor de IL-13 han mostrado que IL-13 e IL-4 tienen un receptor común, o por lo menos alguno de los componentes de un complejo receptor común, así como elementos de transducción de señales comunes (Zurawski S. M. y cols., Embo Journal, 1993, 12, 2663-2670, Aversa, G. y cols., J. Exp. Med., 1993, 178, 2213-2218, Vita, N. y cols., Biol. Chem., 1995, 270, 3512-3517, Lefort, S. y cols., Febs Lett., 1995, 366, 122-126). Este receptor está presente en la superficie de diversos tipos de células, en un número variable según el tipo de célula considerado. La distribución comparativa de los receptores de IL-13 e IL-4 ha sido indicada por A. J. Minty (Interleukin-13 for Cytokines in Health and Disease. Eds D. G. Remick and J. S. Frie, Marcel Decker, N.Y. 1996).

Los receptores y los complejos receptores de la superficie celular se unen a IL-4 y/o IL-13 con diferentes afinidades. Los principales componentes de receptores y complejos receptores que se unen a IL-4 y/o IL-13 son IL-4Ra, IL-13Ral e IL-13Ra2. Estas cadenas se expresan sobre la superficie de células como monómeros o heterodímeros de IL-4Ra/IL-13Ral (IL-4R tipo II) o IL-4Ra/ c (IL-4R tipo I). El monómero IL-4Ra y el heterodímero IL-4R / c se unen a IL-4, pero no a IL-13. Los monómeros IL-13Ra1 e IL-13Ra2 se unen a IL-13, pero no se unen a IL-4. El heterodímero IL-4Ra/IL-13Ra1 se une tanto a IL-4 como a IL-13 (Murata y cols., Int. J. Hematol., 1999, 69, 13-20).

Las respuestas inmunitarias tipo Th2 promueven la producción de anticuerpos y la inmunidad humoral, y se elaboran para luchar contra patógenos extracelulares. Las células Th2 son mediadores de la producción de Ig (inmunidad humoral) y producen IL-4, IL-5, IL-6, IL- 9, IL-10 e IL-13 (Tanaka y cols., Cytokine Regulation of Humoral Immunity, 251- 272, Snapper, ed., John Wiley and Sons, Nueva York (1996)). Las respuestas inmunitarias tipo Th2 se caracterizan por la generación de ciertas citocinas (p. ej., IL-4, IL-13) y tipos específicos de anticuerpos (IgE, IgG4) y son típicas de reacciones alérgicas, que pueden dar como resultado ojos llorosos y síntomas asmáticos, tales como inflamación de las vías respiratorias y contracción de las células de los músculos de las vías respiratorias en los pulmones.

Tanto IL-4 como IL-13 son citocinas terapéuticamente importantes basándose en sus funciones biológicas y representan papeles críticos en muchas enfermedades, incluyendo el asma (Curr Opin Allergy Clin Immunol 2005, Vo.

5, 161-166). Se ha observado que IL-4 es capaz de inhibir una enfermedad autoinmunitaria e IL-4 e IL-13 han mostrado ambas el potencial de mejorar respuestas inmunitarias antitumorales. Las elevaciones en IL-4 e IL-13 y sus receptores se han relacionado con la patogénesis de la fibrosis pulmonar idiopática (IPF) (Jakubzick C. y cols., Am J Pathol.

2004:164(6):1989-2001; Murray LA y cols. Int J Biochem Cell Biol. 2008:40(10):2174-82. La evidencia de la bibliografía demuestra que las citocinas TH2 IL-4 e IL-13 representan múltiples papeles en la patogénesis de IPF como mediadores de esta remodelación y fibrosis del tejido pulmonar. Aunque las células t CD4+ tipo Th2 en el pulmón son probablemente las fuentes predominantes de IL-4 e IL-13, y están relacionadas como reguladores importantes de la remodelación de la matriz extracelular (Wynn, TA, Naat. Rev. Immunol, 4:583-594, 2004), otros tipos de células incluyendo mastocitos, basófilos, eosinófilos, macrófagos y células epiteliales también pueden ser fuentes potenciales de estas citocinas (Gordon S y Martínez FO, Immunity Rev. 32:593-604, 2010). En pacientes con IPF, los niveles de IL-13 e IL-4 en fluido de lavado alveolar bronquial son elevados en comparación con controles normales. Esta evidencia sugiere que las terapias capaces de suprimir o neutralizar estas citocinas tienen el potencial de retardar la progresión de la fibrosis en pacientes con IPF. Puesto que ambas citocinas están implicadas en la patogénesis de enfermedades alérgicas o enfermedades fibróticas, los inhibidores de estas citocinas podrían proporcionar beneficios terapéuticos.

Según esto, existe una necesidad de agentes mejorados que inhiban IL-4, inhiban IL-13, y agentes únicos que inhiban tanto IL-4 como IL-13 que sean inmunogénicos y seguros para el uso en seres humanos. Previamente, los presentes inventores presentaron un péptido de unión tipo anticuerpo de la región V doble que tiene cuatro sitios de unión que se unen específicamente a IL-4 e IL-13 (documento WO2009/052081 (PCT/US2008/079787).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención se define en las reivindicaciones.

La solicitud divulga una dosis terapéutica segura máxima de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13 para un ser humano que tiene una superficie bajo la curva de concentración en plasma frente al tiempo calculada usando el método trapezoidal desde tiempo cero hasta tiempo real (AUC^última) de aproximadamente 433 ug h/ml a aproximadamente 14200 ugh/ml. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la dosis terapéutica segura es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la dosis terapéutica segura se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga una dosis terapéutica segura máxima de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13 para un sujeto humano que tiene una superficie bajo la curva de concentración en plasma frente al tiempo extrapolada hasta el infinito (AUC) de aproximadamente 459 ug h/ml a aproximadamente 670014500 ug h/ml. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la dosis terapéutica segura es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la dosis terapéutica segura se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga una dosis terapéutica segura máxima de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13 para un sujeto humano que tiene una concentración en plasma máxima observada (C^máx) de aproximadamente 0,717 ug/ml a aproximadamente 28,7 ug/ml. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la dosis terapéutica segura es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la dosis terapéutica segura se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga una dosis terapéutica segura máxima de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13 para un sujeto humano que tiene un primer tiempo para alcanzar una concentración en plasma máxima (t^máx) de aproximadamente 96 h a 168 h. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la dosis terapéutica segura es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la dosis terapéutica segura se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga una dosis terapéutica segura máxima de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13 para un sujeto humano que tiene t^último de aproximadamente 1679 h a aproximadamente 2020 h. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la dosis terapéutica segura es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la dosis terapéutica segura se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga una dosis terapéutica segura máxima de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13 para un sujeto humano que tiene t^1/2Z de aproximadamente 244 h a aproximadamente 536 h. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la dosis terapéutica segura es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la dosis terapéutica segura se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga una dosis terapéutica segura máxima de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13 para un sujeto humano que tiene Vss/F de aproximadamente 6830 ml a aproximadamente 18770 ml. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la dosis terapéutica segura es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la dosis terapéutica segura se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga una dosis terapéutica segura máxima de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13 para un sujeto humano que tiene CL/F de aproximadamente 12,1 ml/h a aproximadamente 38,4 ml/h. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la dosis terapéutica segura es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la dosis terapéutica segura se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga un método para identificar o comprobar la presencia de una dosis terapéutica segura de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13 que se ha administrado a un sujeto humano, comprendiendo dicho método (a) administrar una dosis de dicha proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble a dicho sujeto humano; (b) medir uno o más casos seleccionados del grupo que consiste en tratamiento intensivo en un servicio de urgencias o a domicilio de broncoespasmo alérgico, discrasias sanguíneas, convulsiones, alanina aminotransferasa (ALT) >3 x del límite superior del intervalo normal (ULN) asociada con bilirrubina total >2 x ULN, incremento de ALT asintomático >10 x ULN, desarrollo de dependencia de fármacos o abuso de fármacos, incremento de ALT >2 x ULN, hsCRP >10 mg/l durante >72 horas, troponina cardíaca I (cTnl) >2 x ULN, un tiempo de despolarización y repolarización ventricular (QT) en un electrocardiógrafo (ECG) en donde el QT es corregido automáticamente por el ECG (QTc) que es QTc >500 ms y reacciones cutáneas intensas locales en la zona de inyección IP; y (c) determinar que uno o más de dichos casos que se miden en (b) no se ha producido, en donde dicha dosis se identifica como dicha dosis terapéutica segura que se ha administrado a dicho sujeto humano. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SeQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la dosis terapéutica segura es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la dosis terapéutica segura se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga un método que comprueba si una dosis terapéutica de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13 administrada a un sujeto humano es segura, comprendiendo dicho método (a) administrar dicha dosis terapéutica de dicha proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble a dicho sujeto humano; (b) medir uno o más casos seleccionados del grupo que consiste en tratamiento intensivo en un servicio de urgencias o a domicilio de broncoespasmo alérgico, discrasias sanguíneas, convulsiones, alanina aminotransferasa (ALT) >3 x del límite superior del intervalo normal (ULN) asociada con bilirrubina total >2 x ULN, incremento de ALT asintomático >10 x ULN, desarrollo de dependencia de fármacos o abuso de fármacos, incremento de ALT >2 x ULN, hsCRP >10 mg/l durante >72 hours, troponina cardíaca I (cTnl) >2 x ULN, un tiempo de despolarización y repolarización ventricular (QT) en un electrocardiógrafo (ECG) en donde el QT es corregido automáticamente por el ECG (QTc) que es QTc >500 ms y reacciones cutáneas intensas locales en la zona de inyección IP; y (c) determinar que se ha producido uno o más de dichos casos que se miden en (b), en donde dicha dosis se identifica como no segura y la dosis terapéutica se interrumpe o disminuye. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la dosis terapéutica es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la dosis terapéutica se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga un método para seleccionar una dosis terapéutica segura o para comprobar el uso seguro de una dosis terapéutica de proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13 para un sujeto humano, comprendiendo dicho método (a) administrar una dosis de dicha proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble a dicho sujeto humano; (b) medir un nivel de proteína C reactiva (CRP) en una muestra de sangre procedente de dicho sujeto humano; y (c) determinar que dicho nivel de proteína C reactiva (CRP) es menor de 20 mg/l según se mide en (b), en donde dicha dosis se selecciona como dicha dosis terapéutica segura para ser administrada a dicho sujeto humano. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la dosis terapéutica segura es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la dosis terapéutica segura se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga un método para seleccionar una dosis terapéutica segura o para comprobar el uso seguro de una dosis terapéutica de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13 para un sujeto humano, comprendiendo dicho método (a) administrar una dosis de dicha proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble a dicho sujeto humano; (b) medir un tiempo de despolarización y repolarización ventricular (QT) en un electrocardiógrafo (ECG) en donde el QT es corregido automáticamente por el ECG (QTc) de dicho sujeto humano; y (c) determinar si dicho QTC es menor de 500 ms según se mide en (b), en donde dicha dosis se selecciona como dicha dosis terapéutica segura para ser administrada a dicho sujeto humano. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la dosis terapéutica segura es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la dosis terapéutica segura se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga un método para determinar si una dosis terapéutica de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble es segura y tolerable para la administración a seres humanos, comprendiendo el método (a) realizar un estudio no inmunogénico en un primate no humano; y (b) determinar una dosis terapéutica segura en un paciente humano basándose en el estudio no inmunogénico en el primate no humano. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la dosis terapéutica es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la dosis terapéutica se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga un método para medir la cantidad total de anticuerpo humano en una muestra de ensayo, comprendiendo el método (a) proporcionar un anticuerpo monoclonal anti-cadena kappa humana; (b) añadir una muestra de ensayo al anticuerpo monoclonal anti-cadena kappa humana; (c) añadir anticuerpo contra globulinas humanas marcado con etiqueta sulfo al anticuerpo monoclonal anti-cadena kappa humana y la muestra; y (d) cuantificar la cantidad del anticuerpo contra globulinas humanas marcado con etiqueta que está unida a la muestra, en donde la cantidad del anticuerpo contra globulinas humanas marcado con etiqueta unida a la muestra de prueba determina la cantidad total de anticuerpo humano en la muestra de prueba. En una realización divulgada adicional de la invención, el anticuerpo anti-cadena kappa humana está ligado a un dispositivo de captura.

La solicitud divulga un método para medir una proporción de anticuerpo biespecífico capaz de unirse a IL-4 e IL13 presentes en una muestra de prueba, comprendiendo el método (a) proporcionar un anticuerpo anti-IL-14 humana; (b) añadir IL-4 humana al anticuerpo anti-IL-14 humana; (c) añadir una muestra de prueba que comprende un anticuerpo biespecífico capaz de unirse a IL-4 e IL-13 a la IL-4 humana y el anticuerpo anti-IL-4 humana; (d) añadir IL-13 humana a la muestra de prueba que comprende un anticuerpo biespecífico capaz de unirse a IL-4 e IL-13 y la IL-4 humana y el anticuerpo anti-IL-4 humana; (e) añadir anticuerpo anti-IL-13 humana biotinilado a la muestra de prueba que comprende un anticuerpo biespecífico capaz de unirse a IL-4 e IL-13 y la IL-4 humana y el anticuerpo anti-IL-4 humana; y (f) añadir estreptavidina marcada con etiqueta al anticuerpo anti-IL-13 humana biotinilado y la muestra de prueba que comprende un anticuerpo biespecífico capaz de unirse a IL-4 e IL-13 y la IL-4 humana y el anticuerpo anti-IL-4 humana; y (g) cuantificar la cantidad de la estreptavidina marcada con etiqueta que está unida al anticuerpo anti-IL-13 humana biotinilado, en donde la cantidad de la estreptavidina marcada con etiqueta unida determina la proporción de anticuerpo biespecífico capaz de unirse a IL-4 e IL13 presentes en la muestra de prueba. En una realización divulgada adicional, el anticuerpo anti-IL-4 humana está ligado a un dispositivo de captura. En una realización divulgada adicional, el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y s Eq ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SeQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6.

La solicitud divulga un método para medir una proporción de anticuerpo biespecífico capaz de unirse a IL-4 e IL13 presentes en una muestra de prueba, comprendiendo el método: (a) proporcionar un anticuerpo anti-IL-13 humana; (b) añadir IL-13 humana al anticuerpo anti-IL-13 humana; (c) añadir una muestra de prueba que comprende un anticuerpo biespecífico capaz de unirse a IL-4 e IL-13 a la IL-13 humana y el anticuerpo anti-IL-13 humana; (d) añadir IL-4 humana a la muestra de prueba que comprende un anticuerpo biespecífico capaz de unirse a IL-4 e IL-13 y la IL-13 humana y el anticuerpo anti-IL-13 humana; (e) añadir anticuerpo anti-IL-4 humana biotinilado a la muestra de prueba que comprende un anticuerpo biespecífico capaz de unirse a IL-4 e IL-13 y la IL-13 humana y el anticuerpo anti-IL-13 humana; y (f) añadir estreptavidina marcada con etiqueta al anticuerpo anti-IL-4 humana biotinilado y la muestra de prueba que comprende un anticuerpo biespecífico capaz de unirse a IL-4 e IL-13 y la IL-13 humana y el anticuerpo anti-IL-13 humana; y (g) cuantificar la cantidad de la estreptavidina marcada con etiqueta que está unida a anticuerpo anti-IL-4 humana biotinilado, en donde la cantidad de estreptavidina marcada con etiqueta unida determina la proporción de anticuerpo biespecífico capaz de unirse a IL-4 e IL13 presentes en la muestra de prueba. En una realización divulgada adicional de la invención, el anticuerpo anti-IL-13 humana está ligado a un dispositivo de captura. En una realización divulgada adicional, el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6.

La solicitud divulga un método para medir anticuerpos contra fármaco en una muestra de prueba, comprendiendo el método (a) combinar una muestra de prueba con un anticuerpo biespecífico biotinilado capaz de unirse a IL-4 e IL-13 y un anticuerpo biespecífico marcado con etiqueta capaz de unirse a IL-4 e IL-13; (b) añadir estreptavidina a la muestra de prueba y el anticuerpo biespecífico biotinilado capaz de unirse a IL-4 e IL-13 y el anticuerpo biespecífico marcado con etiqueta capaz de unirse a IL-4 e IL-13; y (c) cuantificar la cantidad del anticuerpo biespecífico marcado con etiqueta capaz de unirse a IL-4 e IL-13 que está unida, en donde la cantidad del anticuerpo biespecífico marcado con etiqueta capaz de unirse a IL-4 e IL-13 unida determina la cantidad de anticuerpos contra fármaco-anticuerpo humano en la muestra de prueba. En una realización divulgada adicional, la estreptavidina está ligada a un dispositivo de captura.

La solicitud divulga un método para cuantificar o comprobar una cantidad de anticuerpos contra fármaco en suero sanguíneo de un sujeto humano o un primate no humano después de la administración de fármaco, en donde el fármaco es una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13, comprendiendo dicho método: (a) administrar una dosis de dicha proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble a dicho sujeto humano o dicho primate no humano; (b) obtener una muestra de dicho suero sanguíneo de dicho sujeto humano o dicho primate no humano; y (b) determinar la cantidad de anticuerpos contra fármaco en dicha muestra de suero. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SeQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6.

La solicitud divulga un método para cuantificar o comprobar una cantidad de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13 en suero sanguíneo de un sujeto humano o un primate no humano, comprendiendo dicho método (a) administrar una dosis de dicha proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble a dicho sujeto humano o dicho primate no humano; (b) obtener una muestra de dicho suero sanguíneo procedente de dicho sujeto humano o dicho primate no humano; y (c) determinar dicha cantidad total de dicha proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble en dicha muestra. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SeQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6.

La solicitud divulga un método para cuantificar o comprobar una proporción de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13 que está funcionalmente disponible para unirse a IL-4 e IL-13 en suero sanguíneo de un sujeto humano o un primate no humano, comprendiendo dicho método (a) administrar una dosis de dicha proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble a dicho sujeto humano o dicho primate no humano; (b) obtener una muestra de dicho suero sanguíneo de dicho humano o dicho primate no humano; y (c) determinar dicha proporción de dicha proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que está funcionalmente disponible para unirse a IL-4 e IL-13 en dicha muestra. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SeQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6.

La solicitud divulga un método para tratar el asma en un mamífero que comprende la etapa de administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la cantidad terapéuticamente eficaz es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la cantidad terapéuticamente eficaz se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga un método para tratar fibrosis pulmonar idiopática en un mamífero, que comprende la etapa de administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SeQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la cantidad terapéuticamente eficaz es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la cantidad terapéuticamente eficaz se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga un método para tratar una enfermedad mediada por IL-4 o IL-13 o la fosforilación de STAT6 inducida por IL-4 e IL-13 en un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la cantidad terapéuticamente eficaz es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la cantidad terapéuticamente eficaz se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga un método para tratar una enfermedad mediada por IL-4 o IL-13 o la liberación de IL-6 inducida por IL-4 e IL-13 en un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la cantidad terapéuticamente eficaz es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la cantidad terapéuticamente eficaz se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga un método para tratar una enfermedad mediada por IL-4 o IL-13 o la liberación de eotaxina inducida por IL-4 e IL-13 en un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13. En una realización divulgada adicional, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la cantidad terapéuticamente eficaz es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la cantidad terapéuticamente eficaz se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga un método para tratar una enfermedad mediada por IL-4 o IL-13 o la expresión de LOX inducida por IL-4 e IL-13 en un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13. En una realización divulgada adicional de la invención, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SeQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la cantidad terapéuticamente eficaz es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la cantidad terapéuticamente eficaz se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

La solicitud divulga un método para tratar una enfermedad mediada por IL-4 o IL-13 o la proliferación de eritrocitos inducida por IL-4 e IL-13 en un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13. En una realización divulgada adicional de la invención, la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. En una realización divulgada adicional, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 están ligadas entre sí con un ligador peptídico y SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 están ligadas entre sí con el ligador peptídico. En una realización divulgada adicional, el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6. En otra realización divulgada, la cantidad terapéuticamente eficaz es igual a o menor de aproximadamente 300 mg. En una realización divulgada adicional, la cantidad terapéuticamente eficaz se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra los efectos de huTBTI3_2_1 sobre la fosforilación de Stat6 inducida por IL-4 o inducida por IL-13 en monocitos estimulados con IL-4 o IL-13.

La Figura 2 muestra los efectos de huTBTI3_2_1 sobre la liberación de IL-6 y eotaxina estimulada con IL-4 e IL-13-desde fibroblastos pulmonares humanos procedentes de una paciente con fibrosis pulmonar idiopática.

La Figura 3 muestra los efectos de huTBTI3_2_1 sobre la expresión de LOX inducida por IL-4 e IL-13 en fibroblastos pulmonares de fibrosis pulmonar idiopática.

La Figura 4 muestra los efectos de huTBTI3_2_1 sobre la hipersensibilidad de las vías respiratorias inducida por antígeno frente a asma aguda inducida por alérgenos en macacos cangrejeros. Los datos se representan como media ± s.e.m. *p<0,05, **p<0,01 en comparación con el grupo tratado con anticuerpo de control.

La Figura 5 muestra los efectos de huTBTI3_2_1 sobre la acumulación inducida por antígeno de leucocitos totales en las vías respiratorias frente a asma aguda inducida por alérgenos en macacos cangrejeros. Los datos se representan como media ± s.e.m. *p<0,05, **p<0,01 en comparación con el grupo tratado con anticuerpo de control.

La Figura 6 muestra los efectos de huTBTI3_2_1 sobre la acumulación inducida por antígeno de eosinófilos en las vías respiratorias frente a asma agua inducida por alérgenos en macacos cangrejeros. Los datos se representan como media ± s.e.m. *p<0,05, **p<0,01 en comparación con el grupo tratado con anticuerpo de control.

La Figura 7 muestra los efectos de huTBTI3_2_1 sobre el título de IgE en suero a partir de asma agua inducida por alérgenos en macacos cangrejeros. Los datos se representan como media ± s.e.m. *p<0,05, **p<0,01 en comparación con el grupo tratado con anticuerpo de control.

La Figura 8 muestra los efectos de SAR156597 sobre la liberación de TGFB mediada por IL-4 e IL-13 desde células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBE; cuadro izquierdo) y células epiteliales de vías respiratorias humanas pequeñas (SAEC; cuadro derecho).

La Figura 9 muestra una representación diagramática de ensayos para medir la cantidad total de anticuerpo humano en suero al medir la concentración de cadena k ligera humana (cuadro A); para medir la proporción de anticuerpos funcionales para IL-4 e IL-13 (cuadro B); y para medir anticuerpos contra fármaco (ADA).

La Figura 10 muestra una representación gráfica del tiempo (cuadro A) de la concentración en suero media de huTBTI3_2_1 funcional después de una administración por perfusión intravenosa de una sola dosis de 2,5 mg/kg de huTBTI3_2_1 (Lote n° LP08045) en PBS a un macaco cangrejero el día 0, 14, 21 28 y 35; la tabla (cuadro B) resume parámetros farmacocinéticos después de la 1a dosis y la 5a dosis de 2,5 mg/kg de huTBTI3_2_1 (Lote n° LP08059) en PBS en monos.

La Figura 11 muestra la media de concentraciones en plasma de SAR156597 después de una sola dosis subcutánea de 10 a 300 mg a partir de TDU11325.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto normal en la especialidad a la que pertenece esta invención.

Se apunta aquí que, según se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno(a)" y "el/la" incluyen la referencia plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa.

Por otra parte, según la presente invención se pueden emplear biología molecular convencional, microbiología y técnicas de ADN recombinante dentro de la experiencia de la especialidad. Estas técnicas se explican a fondo en la bibliografía. Véanse, p. ej., Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (en la presente "Sambrook y cols., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J.Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel y cols. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Las siguientes definiciones limitativas de algunos términos y expresiones se proporcionan para guiar al experto.

"Interleucina-4" (IL-4) se refiere a las proteínas de IL-4 de mamífero presentes en la naturaleza o endógenas y a proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que es la misma que la de una proteína de IL-4 de mamífero correspondiente presente en la naturaleza o endógena {p. ej., proteínas recombinantes, proteínas sintéticas (es decir, producidas usando los métodos de la química orgánica sintética)). Según esto, según se define en la presente, el término incluye proteína de IL-4 madura, variantes polimórficas o alélicas, y otras isoformas de una IL-4 y formas modificadas o no modificadas de las precedentes (p. ej., lipidadas, glicosiladas). IL-4 presente en la naturaleza o endógena incluye proteínas silvestres tales como IL-4 madura, variantes polimórficas o alélicas y otras isoformas y formas mutantes que se presentan en la naturaleza en mamíferos (p. ej., seres humanos, primates no humanos). Estas proteínas se pueden recuperar o aislar de una fuente que produce naturalmente IL-4, por ejemplo. Estas proteínas y proteínas que tienen la misma secuencia de aminoácidos que una IL-4 correspondiente presente en la naturaleza o endógena se denominan por el nombre del mamífero correspondiente. Por ejemplo, cuando el mamífero correspondiente es un ser humano, la proteína se denomina IL-4 humana. Se conocen en la técnica varias proteínas de IL-4 mutantes, tales como las divulgadas en el documento WO 03/038041.

"Interleucina-13" (IL-13) se refiere a proteínas de IL-13 de mamífero presentes en la naturaleza o endógenas y a proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que es la misma que la de una proteína de IL-13 de mamífero correspondiente presente en la naturaleza o endógena (p. ej., proteínas recombinantes, proteínas sintéticas (es decir, producidas usando los métodos de la química orgánica sintética)). Según esto, según se define en la presente, el término incluye proteína de IL-13 madura, variantes polimórficas o alélicas y otras isoformas de IL-13 (p. ej., producidas mediante empalme alternativo u otros procedimientos celulares), y formas modificadas o no modificadas de las precedentes (p. ej., lipidadas, glicosiladas). IL-13 presente en la naturaleza o endógena incluye proteínas silvestres tales como IL-13 madura, variantes polimórficas o alélicas y otras isoformas y formas mutantes que se presentan en la naturaleza en mamíferos (p. ej., seres humanos, primates no humanos). Por ejemplo, según se usa en la presente, IL-13 abarca la variante de IL-13 humana en la que Arg en la posición 110 de IL-13 humana madura se reemplaza por Gln (la position 110 de IL-13 madura corresponde a la posición 130 de la proteína precursora) que está asociada con el asma (asma atópica y no atópica) y otras variantes de IL-13. (Heinzmann y cols., Hum Mol Genet. 9:549-559 (2000)). Estas proteínas se pueden recuperar o aislar de una fuente que produce naturalmente IL-13, por ejemplo. Estas proteínas y proteínas que tienen la misma secuencia de aminoácidos que una IL-13 correspondiente presente en la naturaleza o endógena se denominan por el nombre del mamífero correspondiente. Por ejemplo, cuando el mamífero correspondiente es un ser humano, la proteína se denomina IL-13 humana. Se conocen en la técnica varias proteínas de IL-13 mutantes, tales como las divulgadas en el documento WO 03/035847.

La expresión "sustancialmente idéntica" con respecto a una secuencia polipeptídica de cadena de anticuerpo se puede considerar una cadena de anticuerpo que exhibe al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la secuencia polipeptídica de referencia. El término con respecto a una secuencia de ácido nucleico se puede considerar una secuencia de nucleótidos que exhibe al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de referencia. La identidad se puede determinar al usar cualquier herramienta bioinformática disponible para un experto en la especialidad. Por ejemplo, Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) se emplea comúnmente para determinar la identidad de secuencia (Altschul y cols., Journal of Molecular Biology 215(3):403-410, 1990).

Los términos, "identidad" u "homología" pueden significar el porcentaje de bases nucleotídicas o residuos de aminoácido en la posible secuencia que sean idénticos con el residuo de una secuencia correspondiente con la que se compara, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para alcanzar el porcentaje de identidad máximo para toda la secuencia, y no considerando ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. Se debe considerar que ni las extensiones ni las inserciones N-terminales o C-terminales reducen la identidad o la homología. Métodos y programas informáticos para el alineamiento están disponibles y son muy conocidos en la especialidad. La identidad de secuencia de puede medir usando un programa de análisis de secuencias.

Las expresiones y los términos "fragmento, variante, derivado o análogo funcional" y similares, así como sus formas, de un anticuerpo o antígeno es un compuesto o una molécula que tiene actividad biológica cualitativa en común con un anticuerpo o antígeno de longitud completa de interés. Por ejemplo, un fragmento o análogo funcional de un anticuerpo anti-IL-4 es uno que se puede unir a una molécula de IL-4 o uno que puede prevenir o reducir sustancialmente la capacidad de un ligando, o un anticuerpo agonista o antagonista, para unirse a IL-4.

Variantes "de sustitución" son las que tienen al menos un residuo de aminoácido en una secuencia natural retirada y reemplazada por un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición. Las sustituciones pueden ser individuales, donde solo se sustituye un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, donde se sustituyen dos o más aminoácidos en la misma molécula. Las sustituciones plurales pueden ser en sitios consecutivos. Además, un aminoácido se puede reemplazar por varios residuos, en cuyo caso esta variante comprende tanto una sustitución como una inserción. Variantes de "inserción" son aquellas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición particular en una secuencia natural. Inmediatamente adyacente a un aminoácido significa conectado al grupo bien a-carboxilo- o bien a-aminofuncional del aminoácido. Las variantes "de eliminación" son aquellas con uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos natural retirados. Normalmente, las variantes de eliminación tendrán uno o dos aminoácidos eliminados en una región particular de la molécula.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio, y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos), fragmentos de anticuerpo o polipéptidos sintéticos que soportan una o más CDR o secuencias derivadas de CDR con la condición de que los polipéptidos exhiban la actividad biológica deseada. Los anticuerpos (Abs) y las inmunoglobulinas (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Generalmente, los anticuerpos se consideran Igs con una especificidad definida o reconocida. Así, mientras que los anticuerpos exhiben especificidad de unión a una diana específica, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas de tipo anticuerpo que carecen de especificidad para la diana. Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier clase (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, etc.), o subclase (p. ej., IgG¹, IgG², IgG^2a, IgG³, IgG⁴, IgA¹, IgA², etc.) ("tipo" y "clases", y "subtipo" y ""subclase" se usan intercambiablemente en la presente). Los anticuerpos y las inmunoglobulinas naturales o silvestres, esto es, obtenidos a partir de un miembro no manipulado artificialmente de una población, son habitualmente glicoproteínas heterotetrámeras de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V^h) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V^l) y un dominio constante en el otro extremo. Por "no manipulado artificialmente" se entiende no tratado para contener o expresar una molécula de unión a antígeno extraña. Silvestre se puede referir al alelo o la especie más predominante encontrados en una población o al anticuerpo obtenido de un animal no manipulado, en comparación con un alelo o polimorfismo, o una variante o un derivado obtenido mediante una forma de manipulación, tal como mutagénesis, el uso de métodos recombinantes, etc., para cambiar un aminoácido de la molécula que se une a antígeno.

Según se usa en la presente, "anticuerpo anti-IL-4" significa un anticuerpo o polipéptido derivado del mismo (un derivado) que se une específicamente a IL-4 según se define en la presente, incluyendo, pero no limitado a, moléculas que inhiben o reducen sustancialmente la unión de IL-4 a su receptor o inhiben la actividad de IL-4.

Según se usa en la presente, "anticuerpo anti-IL-13" significa un anticuerpo o polipéptido derivado del mismo (un derivado) que se une específicamente a IL-13 según se define en la presente, incluyendo, pero no limitado a, moléculas que inhiben o reducen sustancialmente la unión de IL-13 a su receptor o inhiben la actividad de IL-13.

El término "variable" en el contexto de un dominio variable de anticuerpos se refiere a ciertas porciones de la molécula pertinente que difieren a fondo en la secuencia entre y en los anticuerpos y se usan en el reconocimiento y la unión específicos de un anticuerpo particular para su diana particular. Sin embargo, la variabilidad no está uniformemente distribuida a través de los dominios variables de los anticuerpos. La variabilidad se concentra en tres segmentos llamados regiones determinantes de la complementariedad (CDRs; es decir, CDR1, CDR2 y CDR3) también conocidas como regiones hipervariables, en los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de dominios variables se denominan las regiones o secuencias marco (FR). Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran parte una configuración de lámina p, conectadas por tres CDRs, que forman bucles que conectan, y en algunos casos que forman parte de, la estructura de lámina p. Las CDRs en cada cadena se mantienen unidas a menudo en proximidad por las regiones FR y, con las CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión diana (epítopo o determinante) de anticuerpos (véase Kabat y cols. Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD (1987)). Según se usa en la presente, la numeración de residuos de aminoácido de inmunoglobulinas se realiza según el sistema de numeración de residuos de aminoácido de inmunoglobulinas de Kabat y cols., a menos que se indique otra cosa. Una CDR puede tener la capacidad de unirse específicamente al epítopo cognado.

El término "bisagra" o "región de bisagra", según se usa en la presente invención, se refiere al polipéptido flexible que comprende los aminoácidos entre los dominios constantes primero y segundo de un anticuerpo.

El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de una cadena intacta o de longitud completa o un anticuerpo, generalmente la región de unión a diana o variable. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmentos F^ab, F^ab', F^(ab')2 y F^v . Un "fragmento funcional" o "análogo de un anticuerpo anti-IL-4 y/o IL13" es uno que puede anular o reducir sustancialmente la capacidad del receptor para unirse a un ligando o para iniciar la señalización. Según se usa en la presente, fragmento funcional generalmente es sinónimo con "fragmento de anticuerpo" y, con respecto a los anticuerpos, se puede referir a fragmentos, tales como F^v, F^ab, F^(ab')2, etc. que pueden anular o reducir sustancialmente la capacidad del receptor para unirse a un ligando o para iniciar la señalización. Un fragmento "F^v" consiste en un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y una cadena ligera en una asociación no covalente (dímero V^h-V^l ). En esa configuración, las tres CDRs de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a una diana sobre la superficie del dímero V^h-V^l , como en un anticuerpo intacto. Colectivamente, las seis CDRs confieren especificidad de unión a diana sobre el anticuerpo intacto. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un F^v que comprende solamente tres CDRs específicas para una diana) puede tener la capacidad de reconocer y unirse a una diana.

Los fragmentos de anticuerpo "F^v monocatenario", "sF^v" o "scAb" comprenden los dominios V^h y V^l de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido de F^v comprende además un ligador polipeptídico, a menudo una molécula flexible, entre los dominios V^h y V^l , que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a la diana.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que pueden comprender un dominio variable de la cadena pesada (V^h) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (V^l) en la misma cadena polipeptídica. Al usar un ligador que sea demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios variables en la misma cadena, los dominios de diacuerpo son forzados a aparearse con los dominios de unión de otra cadena para crear dos sitios de unión antigénica.

El fragmento F^ab contiene los dominios variables y constantes de la cadena ligera y el dominio variable y el primero constante (C^{h 1}) de la cadena pesada. Los fragmentos F^ab' difieren de los fragmentos F^ab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo del dominio C^{h 1} para incluir una o más cisteínas procedentes de la región de bisagra del anticuerpo. Los fragmentos F^ab' se pueden producir mediante la escisión del enlace disulfuro en las cisteínas de bisagra del producto de digestión con pepsina de F^(ab)2. Tratamientos enzimáticos y químicos adicionales de anticuerpos pueden dar otros fragmentos funcionales de interés.

El término "Fab lineal" se refiere a un anticuerpo tetravalente según se describe por Miller y cols. (2003), J Immunol.

170: 4854-4861. El "Fab lineal" está compuesto por un tándem del mismo dominio CH1-VH, apareado con la cadena ligera idéntica en cada posición de CH1-VH. Estas moléculas se han desarrollado para incrementar la valencia de un anticuerpo para mejorar su afinidad funcional a través del efecto de avidez, pero son monoespecíficas.

El término "anticuerpos biespecíficos (BsAbs)" se refiere a moléculas que combinan los sitios de unión antigénica de dos anticuerpos dentro de una sola molécula. Así, un anticuerpo biespecífico es capaz de unirse a dos antígenos diferentes simultáneamente. Además de las aplicaciones con propósitos de diagnóstico, los BsAbs allanan el camino para nuevas aplicaciones terapéuticas al redirigir sistemas efectores potentes a zonas enfermas o al incrementar las actividades neutralizadoras o estimulantes de los anticuerpos.

Los anticuerpos monoclonales incluyen específicamente en la presente anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase (tipo o subtipo) de anticuerpo particular, siendo el resto de la cadena o cadenas idénticas con u homólogas a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de estos anticuerpos, con la condición de que exhiban la actividad biológica deseada de unión a IL-4 y/o IL-13 o impacten en la actividad o el metabolismo de IL-4 y/o IL-13 (Pat. EE. UU. N° 4.816.567; y Morrison y cols., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984)). Así, las CDRs procedentes de una clase de anticuerpo se pueden injertar en el FR de un anticuerpo de diferente clase o subclase.

Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, dirigiéndose contra un solo sitio diana, epítopo o determinante. Por otra parte, en contraste con preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) de un antígeno, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante sobre la diana. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajoso al ser sintetizados por una célula hospedadora, no estar contaminados por otras inmunoglobulinas, y proporciona la clonación del gen pertinente y ARNm que codifica el anticuerpo de sus cadenas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo según se obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se considera que requiera la producción del anticuerpo mediante ningún medio particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para el uso con la presente invención se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando técnicas muy conocidas o se pueden purificar de una preparación policlonal. Los anticuerpos monoclonales originales para ser usados según la presente invención se pueden elaborar mediante el método del hibridoma descrito por Kohler y cols., Nature 256:495 (1975), o se pueden elaborar por métodos recombinantes muy conocidos en la técnica.

El término "anticuerpo polivalente" según se usa en la presente invención se refiere a un anticuerpo que comprende dos o más sitios de unión antigénica, siendo así capaz de unirse a dos o más antígenos, que pueden tener la misma estructura o una diferente, simultáneamente. El término "bivalente" significa que el anticuerpo comprende dos sitios de unión antigénica. El término "tetravalente" significa que el anticuerpo comprende cuatro sitios de unión antigénica.

El término "sitio de unión antigénica" según se usa en la presente invención se refiere a la parte del anticuerpo que comprende la superficie que se une específicamente a y es complementaria a parte o la totalidad de un antígeno. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo puede unirse solamente a una parte particular del antígeno, parte que se denomina un epítopo. Un dominio de unión antigénica puede ser proporcionado por uno o más dominios variables de anticuerpo. Preferiblemente, un dominio de unión antigénica está formado por la asociación de un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH).

El término "antígeno" según se usa en la presente invención se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de unirse con los anticuerpos de la presente invención. Un antígeno puede tener uno o más de un epítopo. Ejemplos de antígenos reconocidos por los anticuerpos divulgados incluyen, pero no se limitan a, proteínas séricas, p. ej. citocinas tales como IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13, péptidos bioactivos, moléculas de la superficie celular, p. ej. receptores, transportadores, canales iónicos, proteínas virales y bacterianas.

El término "monoespecífico" según se usa en la presente solicitud significa que el anticuerpo polivalente divulgado reconoce solamente un antígeno, siendo idénticos todos los sitios de unión antigénica.

El término "biespecífico" según se usa en la presente invención significa que el anticuerpo polivalente de la presente invención reconoce dos epítopos diferentes sobre los mismos antígenos o dos diferentes.

Ha sido de interés producir anticuerpos biespecíficos (BsAbs) que combinen los sitios de unión antigénica de dos anticuerpos dentro de una sola molécula. Así, esta molécula sería capaz de unirse a dos antígenos diferentes simultáneamente. Además de las aplicaciones con propósitos de diagnóstico, allanan el camino para nuevas aplicaciones terapéuticas, p. ej. al redirigir potentes sistemas efectores a zonas enfermas (donde las células cancerosas a menudo desarrollan mecanismos para suprimir respuestas inmunitarias normales desencadenadas por anticuerpos monoclonales, como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)), o al incrementar las actividades neutralizadoras o estimulantes de los anticuerpos. Intentos iniciales de acoplar las especificidades de unión de dos anticuerpos enteros contra diferentes antígenos diana con propósitos terapéuticos utilizaban moléculas de heteroconjugado fusionadas químicamente (Staerz y cols.(1985), Nature 314: 628-631).

Los anticuerpos biespecíficos se elaboraron originalmente al fusionar dos hibridomas, cada uno capaz de producir una inmunoglobulina diferente (Milstein y Cuello, 1983, 1984), pero la complejidad de las especies (hasta diez especies diferentes) producidas en cultivo celular hace difícil y costosa la purificación (George y Huston, 1997). A pesar de los resultados prometedores obtenidos usando heteroconjugados o anticuerpos biespecíficos producidos a partir de fusiones celulares según se cita anteriormente, varios factores los hacen poco prácticos para aplicaciones terapéuticas a gran escala. Estos factores incluyen: depuración rápida de heteroconjugados in vivo, las técnicas de laboratorio intensivas requeridas para generar cualquier tipo de molécula, la necesidad de purificación intensiva de heteroconjugados de los homoconjugados o anticuerpos monoespecíficos y rendimientos generalmente bajos.

La manipulación genética se ha usado con frecuencia creciente para diseñar, modificar y producir anticuerpos o derivados de anticuerpos con un conjunto deseado de propiedades de unión y funciones efectoras. Se ha desarrollado una variedad de métodos recombinantes para la producción eficaz de BsAbs, tanto como fragmentos de anticuerpo (Carter y cols. (1995), J. Hematotherapy 4: 463-470; Pluckthun y cols. (1997) Immunotechology 3: 83-105; Todorovska y cols. (2001) J. Immunol. Methods 248: 47-66) como con formatos de IgG de longitud completa (Carter (2001) J. Immunol. Methods 248: 7-15).

Abbott describió en la patente de EE. UU. US7612181 un anticuerpo biespecífico para IgG de dominio variable doble (DVD-IgG) murino, que se basa en el formato de Fv doble descrito en la patente de Unilever (documento US5989830). Un formato biespecífico humanizado se describió en el documento WO2009/052081 (TBTI). La adición de dominios constantes a cadenas respectivas del Fv doble (CH1-Fc para la cadena pesada y un dominio constante kappa o lambda para la cadena ligera) conducía a proteínas de unión de tipo anticuerpo de región V doble biespecífico funcional.

La solicitud divulga un anticuerpo biespecífico que se ha manipulado para comprender una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o uno de sus fragmentos que se une específicamente a dos epítopos diferentes sobre el mismo o sobre dos antígenos diferentes. Una realización divulgada es un anticuerpo biespecífico o fragmento de anticuerpo biespecífico del mismo que se une específicamente a IL-13 e IL-4, en donde dicho anticuerpo biespecífico o fragmento de anticuerpo biespecífico del mismo comprende un dominio de cadena ligera variable y un dominio de cadena pesada variable, en donde dicho dominio de cadena ligera variable comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3. Una realización divulgada adicional es un anticuerpo biespecífico o fragmento de anticuerpo biespecífico del mismo que se une específicamente a IL-13 e IL-4, en donde dicho anticuerpo biespecífico o fragmento de anticuerpo biespecífico del mismo comprende un dominio de cadena ligera variable y un dominio de cadena pesada variable, en donde dicho dominio de cadena pesada variable comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:5. Otra realización divulgada es un anticuerpo biespecífico o fragmento de anticuerpo biespecífico del mismo que se une específicamente a IL-13 e IL-4, en donde dicho anticuerpo biespecífico o fragmento de anticuerpo biespecífico del mismo comprende un dominio de cadena ligera variable y un dominio de cadena pesada variable, en donde dicho dominio de cadena pesada variable comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4. Una realización divulgada es un anticuerpo biespecífico o fragmento de anticuerpo biespecífico del mismo que se une específicamente a IL-13 e IL-4, en donde dicho anticuerpo biespecífico o fragmento de anticuerpo biespecífico del mismo comprende un dominio de cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3, y un dominio de cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4. Una realización divulgada adicional es un anticuerpo biespecífico o fragmento de anticuerpo biespecífico del mismo que se une específicamente a IL-13 e IL-4, en donde dicho anticuerpo biespecífico o fragmento de anticuerpo biespecífico del mismo comprende un dominio de cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3, y un dominio de cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4, en donde un ligador peptídico liga SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:3, y un ligador peptídico liga SEQ ID No :2 a SEQ ID NO:4. Una realización divulgada es huTBTI3_2_1 o SAR156597 que comprende un anticuerpo biespecífico o fragmento de anticuerpo biespecífico del mismo que se une específicamente a IL-13 e IL-4, que comprende (a) un dominio de cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3; (b) un dominio de cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos de s Eq ID NO:2 y SeQ ID NO:4; (c) un ligador peptídico que liga SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:3, y un ligador peptídico que liga SEQ ID NO:2 a SEQ ID NO:4, en donde el ligador peptídico tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO:6; y (d) dominios de región constante.

El término "multiespecífico" según se usa en la presente invención significa que el anticuerpo polivalente de la presente invención reconoce múltiples epítopos diferentes sobre el mismo antígeno o sobre múltiples antígenos diferentes.

El término "ligador" según se usa en la presente invención se refiere a un péptido adaptado para conectar los dominios variables de las construcciones de anticuerpo de la presente invención. El ligador peptídico puede contener cualesquiera aminoácidos, prefiriéndose los aminoácidos glicina (G) y serina (S). Los ligadores pueden ser iguales o diferentes entre sí entre y dentro del polipéptido de la cadena pesada y el polipéptido de la cadena ligera. Poe otra parte, el ligador puede tener una longitud de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos. Una unidad ligadora peptídica preferida para los dominios de la cadena pesada como para los dominios de la cadena ligera es GGGGS. Los números de unidades ligadoras de la cadena pesada y de la cadena ligera pueden ser iguales (orden simétrico) o diferentes entre sí (orden asimétrico).

Preferiblemente, un ligador peptídico es suficientemente largo para proporcionar un grado adecuado de flexibilidad para evitar que los restos de anticuerpo interfieran con la actividad mutua, por ejemplo por impedimento estérico, para permitir un plegamiento proteínico apropiado y, si es necesario, para permitir que las moléculas de anticuerpo interactúen con dos o más receptores, posiblemente ampliamente espaciados, sobre la misma célula; y no obstante preferiblemente es suficientemente corto para permitir que los restos de anticuerpo permanezcan estables en la célula.

Por lo tanto, la longitud, la composición y/o la conformación de los ligadores peptídicos pueden ser fácilmente seleccionadas por un experto en la técnica, a fin de optimizar las propiedades deseadas del anticuerpo polivalente.

Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) son inmunoglobulinas, cadenas inmunoglobulínicas o sus fragmentos quiméricos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab^')2 u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen a la diana) que contienen secuencias derivadas de inmunoglobulina no humana, en comparación con un anticuerpo humano. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones FR son las de una secuencia de plantilla de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de la plantilla de inmunoglobulina humana. En general, el objetivo es tener una molécula de anticuerpo que sea mínimamente inmunogénica en un ser humano. Así, es posible que uno o más aminoácidos en una o más CDRs también se puedan cambiar por uno que sea menos inmunogénico para un hospedador humano, sin minimizar sustancialmente la función de unión específica de la una o más CDRs a IL-4 y/o IL-13. Alternativamente, la FR puede ser no humana pero los aminoácidos más inmunogénicos se reemplazan por unos menos inmunogénicos. No obstante, el injerto de CDR, según se analiza anteriormente, no es el único modo de obtener un anticuerpo humanizado. Por ejemplo, modificar solo las regiones CDR puede ser insuficiente ya que no es extraño que los residuos marco tengan un papel en la determinación de la estructura tridimensional de los bucles de CDR y la afinidad global del anticuerpo para su ligando. De ahí que se pueda poner en práctica cualquier medio de modo que la molécula de anticuerpo original no humano esté modificada para que sea menos inmunogénica para un ser humano, y la identidad de secuencia global con un anticuerpo humano no siempre es una necesidad. Así, la humanización también se puede alcanzar, por ejemplo, mediante la mera sustitución de solo unos pocos residuos, particularmente aquellos que están expuestos sobre la molécula de anticuerpo y no enterrados dentro de la molécula, y de ahí, no fácilmente accesibles para el sistema inmunitario del hospedador. Este método se muestra en la presente con respecto a sustituir residuos "móviles" o "flexibles" sobre la molécula de anticuerpo, siendo el objetivo reducir o moderar la inmunogenicidad de la molécula resultante sin comprender la especificidad del anticuerpo para su epítopo o determinante. Véanse, por ejemplo, Studnicka y cois., Prot Eng 7(6)805-814, 1994; Mol Imm 44:1986-1988, 2007; Sims y cois., J Immunol 151:2296 (1993); Chothia y cois., J Mol Biol 196:901 (1987); Cárter y cois., Proc Nati Acad Sci USA 89:4285 (1992); Presta y cois., J Immunol 151:2623 (1993), el documento WO 2006/042333 y la Pat. EE. UU. N25.869.619.

"Homólogo de anticuerpo" u "homólogo" se refiere a cualquier molécula que se una específicamente a IL-4 y/o IL-13 según se muestra en la presente. Así, un homólogo de anticuerpo incluye un anticuerpo natural o recombinante, ya sea modificado o no, porciones de anticuerpos que retienen las propiedades biológicas de interés, tales como unión a IL-4 o IL-13, tal como una molécula de F^ab o F^v, un anticuerpo monocatenario, un polipéptido que soporta una o más regiones CDR, etc. La secuencia de aminoácidos del homólogo no necesita ser idéntica a la del anticuerpo presente en la naturaleza sino que puede estar alterada o modificada para soportar aminoácidos sustituidos, aminoácidos insertados, aminoácidos eliminados, aminoácidos distintos a los veinte normalmente encontrados en proteínas, etc., para obtener un polipéptido con propiedades mejoradas u otras beneficiosas.

Anticuerpos con secuencias homólogas son los anticuerpos con secuencias de aminoácidos que tienen homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo para IL-4, IL-13 o IL-4/IL-13 biespecífico divulgado en la presente. Preferiblemente, la homología es con la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de un anticuerpo de la presente invención. "Homología de secuencia" según se aplica a una secuencia de aminoácidos de la presente se define como una secuencia con al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de homología de secuencia con otra secuencia de aminoácidos, según se determina, por ejemplo, por el método de búsqueda FASTA según Pearson & Lipman, Proc Nati Acad Sci USA 85, 2444-2448 (1988).

Un anticuerpo quimérico es uno con diferentes porciones de un anticuerpo derivado de diferentes fuentes, tales como diferentes anticuerpos, diferentes clases de anticuerpo, diferentes especies de animal, por ejemplo, un anticuerpo que tiene una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino apareada con una región constante de inmunoglobulina humana, etc. Así, un anticuerpo humanizado es una especie de anticuerpo quimérico. Métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la especialidad, véanse, p. ej., Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi y cois., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies y cois., 1989, J Immunol Methods 125:191-202; y las Pat. de EE. UU. N25.807.715, 4.816.567 y 4.816.397.

Anticuerpos artificiales incluyen fragmentos scFv, anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y mru (véanse las revisiones de Winter & Milstein, 1991, Nature 349:293-299; y Hudson, 1999, Curr Opin Imm 11:548-557), cada una con capacidad de unión antigénica y unión epitópica. En el fragmento F^v monocatenario (scF^v), los dominios V^h y V^l de un anticuerpo están ligados por un péptido flexible. Típicamente, el ligador es un péptido de aproximadamente 15 aminoácidos. Si el ligador es mucho más pequeño, por ejemplo, 5 aminoácidos, se forman diacuerpos. La unidad de unión más pequeña de un anticuerpo es una CDR, típicamente la CDR2 de la cadena pesada que tiene reconocimiento específico y capacidad de unión suficientes. Este fragmento se denomina una unidad de reconocimiento molecular o mru. Varias de estas mrus se pueden ligar entre sí con péptidos ligadores cortos, formando de ese modo una proteína de unión artificial con avidez superior que una sola mru.

También se divulgan en la presente equivalentes funcionales de un anticuerpo de interés. El término "equivalentes funcionales" incluye anticuerpos con secuencias homólogas, homólogos de anticuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos artificiales y anticuerpos modificados, por ejemplo, en donde cada equivalente funcional se define por la capacidad para unirse a IL-4 y/o IL-13, inhibir la capacidad de señalización o la función de IL-4 y/o IL-13, o inhibir la unión de IL-4 y/o IL-13 a su receptor. El experto entenderá que hay un solapamiento en el grupo de moléculas denominadas "fragmentos de anticuerpo" y el grupo denominado "equivalentes funcionales". Métodos para producir equivalentes funcionales que retienen capacidad de unión a IL-4 y/o IL-13 son conocidos por el experto en la especialidad y se divulgan, por ejemplo, en el documento WO 93/21319, EPO N° Ser. 239.400, el documento WO 89/09622, EPO N2 Ser. 338.745 y EPO N2 Ser. 332.424.

Los equivalentes funcionales de la presente solicitud también incluyen anticuerpos modificados, p. ej., anticuerpos modificados mediante el enlace covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo. Por ejemplo, anticuerpos modificados incluyen anticuerpos que se han modificado, p. ej., mediante glicosilación, acetilación, pegilación, desamidación, fosforilación, amidación, derivación mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, ligación a un ligando celular, ligación a una toxina o resto citotóxico u otra proteína, etc. El enlace covalente no necesita dar un anticuerpo que sea inmune de la generación de una respuesta antiidiotípica. Las modificaciones se pueden conseguir mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero no limitadas a, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica, etc. Adicionalmente, los anticuerpos modificados pueden contener uno o más aminoácidos no clásicos.

"Mamífero", para propósitos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo un ser humano, animales domésticos y de granja, primates no humanos y animales de zoológico, deportivos o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc.

El término "tratamiento", "dosis terapéutica" o "administración de una cantidad terapéuticamente eficaz" según se usa en la presente invención se refiere tanto a un tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas como un ciclo de terapia. Se refiere a prevenir, curar, invertir, atenuar, aliviar, minimizar, suprimir o detener efectos perjudiciales de un estado patológico, la progresión de la enfermedad, el agente causal de la enfermedad (p. ej., bacterias o virus) u otra condición anormal.

Una realización de la invención es el tratamiento del asma y la fibrosis pulmonar idiopática. IL-4 e IL-13 son citocinas terapéuticamente importantes basadas en sus funciones biológicas y representan papeles críticos en muchas enfermedades, incluyendo asma (Curr Opin Allergy Clin Immunol 2005, Vo. 5, 161 -166). Se ha observado que IL-4 es capaz de inhibir una enfermedad autoinmunitaria e IL-4 e IL-13 han mostrado ambas el potencial de mejorar respuestas inmunitarias antitumorales. Las elevaciones en IL-4 e IL-13 y sus receptores se han relacionado con la patogénesis de la fibrosis pulmonar idiopática (IPF) (Jakubzick C. y cols., Am J Pathol. 2004:164(6):1989-2001; Murray LA y cols. Int J Biochem Cell Biol. 2008:40(10):2174-82. La evidencia en la bibliografía demuestra que las citocinas TH2 IL-4 e IL-13 representan múltiples papeles en la patogénesis de la IPF como mediadores de esta remodelación y fibrosis del tejido pulmonar (Wynn, TA, Naat. Rev. Immunol, 4:583-594, 2004) y otros tipos de células incluyendo mastocitos, basófilos, eosinófilos, macrófagos y células epiteliales también pueden ser fuentes potenciales de estas citocinas (Gordon S y Martínez FO, Immunity Rev. 32:593-604, 2010). En pacientes con IPF, los niveles de IL-13 e IL-4 en fluido de lavado alveolar bronquial son elevados en comparación con controles normales. Esta evidencia sugiere que las terapias capaces de suprimir o neutralizar estas citocinas tienen el potencial de retrasar la progresión de la fibrosis en pacientes con IPF. Puesto que ambas citocinas están implicadas en la patogénesis de enfermedades alérgicas o enfermedades fibróticas, los inhibidores de estas citocinas podrían proporcionar beneficios terapéuticos.

Un anticuerpo "aislado" o "purificado" está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente o el medio de células o tejidos de los que se deriva la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetice químicamente. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de cualquier anticuerpo en las que el polipéptido/la proteína está separado de componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce recombinantemente el mismo. Así, un anticuerpo que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones del anticuerpo que tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5%, 2,5% o 1%, (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando el anticuerpo se produce recombinantemente, preferiblemente también está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, 10%, 5%, 2,5% o 1% del volumen de la preparación de proteína. Cuando el anticuerpo se produce mediante síntesis químicas, preferiblemente está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos y reactivos, es decir, el anticuerpo de interés se separa de precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. Según esto, estas preparaciones del anticuerpo tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% o 1% (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos al anticuerpo de interés. En una realización preferida de la presente invención, los anticuerpos se aíslan o purifican.

Según se usan en la presente, los términos "agente terapéutico" y "agentes terapéuticos" se refieren a cualquier agente o agentes que se puedan usar en el tratamiento, el manejo o la mejora de una enfermedad, un trastorno, una dolencia y similares asociados con el metabolismo y la actividad aberrantes de IL-4 y/o IL-13.

Según se usa en la presente, "dosis terapéutica" se refiere a la cantidad de cualquier agente o agentes que se puedan usar en el tratamiento, el manejo o la mejora de una enfermedad, un trastorno, una dolencia y similares asociados con el metabolismo y la actividad aberrantes de IL-4 y/o IL-13.

Según se usa en la presente, "dosis terapéutica segura" se refiere a cualquier agente o agentes o dosis de cualquier agente o agentes que se puedan usar en el tratamiento, el manejo o la mejora de una enfermedad, un trastorno, una dolencia y similares asociados con el metabolismo y la actividad aberrantes de IL-4 y/o IL-13, mientras se mantiene un perfil beneficio/riesgo clínicamente aceptable. Una dosis terapéutica segura se selecciona del grupo que consiste en 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 150 mg y 300 mg. Una realización de una dosis terapéutica segura es de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 300 mg. Una realización adicional de una dosis terapéutica segura es cualquier dosis que sea aproximadamente 300 mg o menos de aproximadamente 300 mg.

La solicitud divulga la identificación o la comprobación de una dosis terapéutica segura al medir uno o más casos seleccionados del grupo que consiste en tratamiento intensivo en un servicio de urgencias o a domicilio de broncoespasmo alérgico, discrasias sanguíneas, convulsiones, alanina aminotransferasa (ALT) >3 x del límite superior del intervalo normal (ULN) asociada con bilirrubina total >2 x ULN, incremento de ALT asintomático >10 x ULN, desarrollo de dependencia de fármacos o abuso de fármacos, incremento de ALT >2 x ULN, hsCRP >10 mg/l durante >72 horas, troponina cardíaca I (cTnl) >2 x ULN, un tiempo de despolarización y repolarización ventricular (QT) en un electrocardiógrafo (ECG) en donde el QT es corregido automáticamente por el ECG (QTc) que es QTc >500 ms, reacciones cutáneas intensas locales en la zona de inyección IP y un nivel de proteína C reactiva (CRP) es menor de 20 mg/l. Los métodos usados para calcular los susodichos casos se analizan con detalle en los ejemplos presentados posteriormente. Métodos usados para calcular los susodichos casos son conocidos comúnmente por los expertos en la técnica.

La señalización intracelular después de la ligación de IL-4 e IL-13 con sus receptores de la superficie celular está mediada en parte por la fosforilación del transductor de señales de la molécula de señalización y el activador de la transcripción 6 (Stat6). Por lo tanto, la inhibición de la fosforilación de Stat6 (pStat6) se puede usar para probar la capacidad de una molécula para inhibir la activación de los receptores de IL-4 e IL-13.

IL-4 e IL-13 estimulan la liberación de IL-6 y eotaxina de fibroblastos pulmonares con fibrosis pulmonar idiopática de ser humano. Por lo tanto, la inhibición de la liberación de IL-6 y eotaxina se puede usar para probar la capacidad de una molécula para inhibir la activación de los receptores de IL-4 e IL-13.

La solicitud divulga un anticuerpo que inhibe la fosforilación de STAT6 inducida por IL-4 o IL-13, la liberación de IL-6 o la eotaxina con una IC50 de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 100 nM. Una realización divulgada adicional abarca una IC50 de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 10 nM. Una realización divulgada adicional abarca una IC50 de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 10 nM. Realizaciones divulgadas adicionales son valores de IC50 de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4

1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,2., 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1,3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1,5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1,8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1,9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7,

9,8, 9,9 o 10,0 nM.

Se entiende que el término "aproximadamente", cuando se usa en relación con un valor numérico, abarca valores numéricos dentro de un intervalo que tiene un límite inferior que es 5%, 10% o 15% menor que el valor numérico indicado y que tiene un límite superior que es 5%, 10% o 15% mayor que el valor numérico indicado.

La solicitud divulga métodos de detección para medir niveles de anticuerpos humanos totales o la proporción de un anticuerpo específico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico) o medir anticuerpos contra fármaco en una muestra de prueba. La muestra de prueba puede ser cualquier muestra corporal procedente de un mamífero. Ejemplos no limitativos incluyen muestras de sangre, muestras de suero o muestras de tejidos. Los métodos de detección pueden implicar usar un "dispositivo de captura" en el que uno o más anticuerpos están enlazados al dispositivo de captura.

Ejemplos no limitativos de "dispositivos de captura" incluyen pocillos de una placa, en donde la placa puede incluir cualquier número de pocillos tal como una placa de 12 pocillos o una placa de 96 pocillos. Sin embargo, los dispositivos de captura no se limitan a placas sino que pueden incluir cualquier sustrato al que se pueda enlazar un anticuerpo, por ejemplo, una columna de elución. Una realización divulgada utiliza anticuerpos marcados con etiqueta. La etiqueta puede ser cualquier etiqueta capaz de detección. Ejemplos no limitativos incluyen etiquetas fluorescentes tales como rodamina, etiquetas enzimáticas tales como luciferasa o etiquetas sulfo.

EJEMPLOS

La solicitud se puede entender mejor mediante referencia a los siguientes Ejemplos no limitativos, que son ejemplares de la solicitud. No se debe considerar de ningún modo que los Ejemplos presentados posteriormente limiten el amplio alcance de la invención.

Los términos "huTBTI3_2_1" y "SAR156597" son intercambiables y se refieren a la misma proteína tipo anticuerpo de la región V doble que comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID

NO:1 y SEQ ID NO:3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y

SEQ ID NO:4.

Ejemplo 1: Clonación y Generación de Anticuerpos Biespecíficos Anti-IL-4/IL-13 Humanizados

La clonación y la generación de anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/IL-13 humanizados se describe en el documento WO2009/052081 (PCT/US2008/079787). Para facilitar la referencia, sigue una breve descripción.

El formato usado para la expresión de anticuerpos biespecíficos (BsAb) es una variante de IgG del formato de doble cabeza del dominio doble descrito en el documento US 5.989.830. En este formato, una molécula de IgG se alarga en su extremo N en las cadenas pesada y ligera correspondientes, mediante un dominio variable adicional de un segundo anticuerpo. Así, la molécula de IgG resultante es un heterotetrámero compuesto por dos cadenas pesadas y dos ligeras. Las cadenas pesadas consisten en dos dominios pesados variables (VH1-VH2) que derivan de dos anticuerpos diferentes empalmados entre sí por un ligador compuesto por diez aminoácidos (G4S)² y fusionados al dominio constante de IgG4. Las cadenas ligeras consisten en dos dominios ligeros variables (VL1-VL2) que derivan de dos anticuerpos diferentes empalmados entre sí por un ligador compuesto por diez aminoácidos (G4S)² y fusionados a la región kappa constante.

Se generaron secuencias para los dominios pesados y ligeros variables de las variantes 8D4-8 (8D4-8; clon de anticuerpo monoclonal de ratón anti-IL-4 8D4-8 de Biozol diagnostica Vertrieb GmbH, Eching Alemania; Biozol es el distribuidor alemán de BioLegend, San Diego, CA, EE. UU. de A.) mediante PCR que introduce un sitio de restricción BamHI (GGA TCC) en sus respectivos extremos 5' que codifican una parte del (G4S)^?-(GGA TCC)-8D4-8. La secuencia 3' de la VH de las variantes humanizadas 8D4-8 terminaba con un sitio de restricción Apal (que codifica los primeros aminoácidos del dominio CH1) para una fusión posterior a la secuencia IGHG4 (Q569F4, con eliminación de la Lys terminal y una mutación doble S241P y L248E). El extremo 3' del VL8D4-8 terminaba con un sitio de restricción BsiWI que codifica los dos primeros aminoácidos de la cadena kappa constante para una fusión posterior a IGKC (Número de Registro del Gene Bank Q502W4).

Se generaron secuencias para los dominios pesados y ligeros variables de las variantes B-B13 (B-B13; clon de anticuerpo monoclonal de ratón anti-IL-13 B-B13 de Cell Sciences, Inc., Canton, MA EE. UU. de A.) mediante PCR que introduce un sitio de restricción BamHI en sus respectivos extremos 3' que codifican una parte del (G4S)2-(B-B13)-(GGA GGC GGA GGG TCC GGA GGC GGA GGA TCC (SEQ ID NO: 7)). Ambas secuencias para la VH y la VL de las variantes B-B13 se generaron con un sitio de restricción Nhel en sus extremos 5' respectivos, seguido por un codón de inicio ATG y una secuencia codificante de péptido líder.

Las VH de B-B13 y 8D4-8 se fusionaron entre sí a través de sus sitios BamHI dentro del ligador (G4S)2. Las VL de B-B13 y 8D4-8 se fusionaron entre sí a través de sus sitios BamHI dentro del ligador (G4S)2. De ahí que los tándems de cadenas pesadas y ligeras generados tuvieran la siguiente composición.

Cadena pesada del anticuerpo biespecífico: Nhel- Péptido líder-VH-B-B13 - (G4S)2 - VH 8D4-8-Apal.

Cadena ligera del anticuerpo biespecífico: Nhel- Péptido líder-VL-B-B13 - (G4S)2 - VL 8D4-8- BsiWI.

Todos los fragmentos de PCR intermedios se clonaron en el pCR®4-TOPO usando el estuche de clonación TOPO TA de Invitrogen (N° Cat: 45-0641) y se secuenciaron usando los cebadores directo M13 e inverso M13.

Después de la validación de la secuencia, los tándems de cadenas pesadas se fusionaron a través de su sitio Apal a la secuencia IGHG4 y los tándems de cadenas ligeras variables se fusionaron a través de su sitio BsiWI a IGKC. La cadena pesada y la cadena ligera de doble dominio creadas se digirieron con Nhel e Hindlll y cada una se ligó en los sitios NheI/HindIII del vector de expresión episómico pXL, creando los plásmidos para la expresión en mamíferos de las cadenas pesada y ligera de TBTI, respectivamente.

Se generaron cuatro construcciones anti-IL-4/anti-IL-13 biespecíficas humanizadas basándose en las siguientes combinaciones de versiones de VH y VL humanizadas de B-B13 y 8D4-8 según se muestra en la Tabla 1. Las secuencias de las cadenas ligeras y pesadas correspondientes se muestran en la Tabla 2.

Tabla 1. Anticuerpos anti-IL-4/anti-IL-13 Biespecíficos

Tabla 2. Secuencias de Dominios Variables Humanizados y Secuencia del Ligador

Anti-IL13 hB-B13 VL3 (SEQ ID NO: 1):

DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISC R A SESV D SYGQSYMHWY QQKAGQPPKL

l i y L A S N L E S g v p a r f s g s g s r t d f t l t id pv q a e d a a t y y cQQNAEDSR

T f g g g t k l e i k

Anti-IL13 hB-B13 VH2 (SEQ ID NO: 2):

EVQLKESGPG LVAPGGSLSI TC TV SG FSLT DSSINW VRQP PGKGLEWLGM

IW GDGRIDYA d a l k s r l s i s k d s s k s q v f l e m t s l r t d d t ATYYCARDGY

FPYAMDFWGQ GTSVTVSS

Anti-IL4 h8D4-8 VL1 (SEQ ID NO: 3):

DIQMTQSPAS LSVSVGDTIT LTCHASQNID VWLSWFQQKP GNIPKLLIYK

ASNLHTGVPS RFSGSGSGTG FTLTISSLQP EDIATYYCQQ AHSYPFTFGG

GTKLEIKR

Anti-IL4 h8D4-8 VH1 (SEQ ID NO: 4):

QVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYSFT SYWIHWIKQR PGQGLEWIGM

IDPSDG ETRL ^{n q r f q g r a t l t v d e s t s t a y m q l r s p t s e d} SAVYYCTRLK EYGNYDSFYF DVWGAGTLVT VSSA

Anti-IL4 h8D4-8 VH2 (SEQ ID NO: 5):

QVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYSFT SYWIHWIKQR PGQGLEWIGM

IDASDGETRL NQRFQGRATL TVDESTSTAY MQLRSPTSED SAVYYCTRLK

EYGNYDSFYF DVWGAGTLVT VSSA

Secuencia del Ligador (SEQ ID NO: 6)

GGGGSGGGGS

El subrayado indica cambios de aminoácidos realizados para la humanización o para retirar residuos sometidos a modificación o labilidad a los ácidos. La negrita indica la CDR

Ejemplo 2: Efecto de huTBTI3_2_1 sobre la fosforilación de STAT6 inducida por IL-4 o IL-13 en monocitos humanos de sangre entera

Se obtuvo sangre entera humana anticoagulada con citrato sódico a partir de un grupo de donantes normales in situ. Se usaron los números de donante 245, 217, 229 y 002.

Se generó huTBTI3_2_1 en Sanofi-Aventis, lote n° LP08059, suministrado en 5,63 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se almacenó a 4°C.

IL-13 humana recombinante (liofilizada) de R&D Systems, n° catálogo 213-IL, se reconstituyó con PBS que contenía 0,2% de albúmina sérica bovina en 10 pg/ml. La concentración final de IL-13 usada en el ensayo era 3 ng/ml en medio RPMI completo. IL-4 humana recombinante (liofilizada) de AMS Biotechnology LTD, n° catálogo 111-40-134, se reconstituyó con PBS que contenía 0,2% de albúmina sérica bovina en 20 pg/ml. La concentración final de IL-4 usada era 1 ng/ml en medio RPMI completo.

huTBTI3_2_1 se diluyó en serie con medio RPMI completo para elaborar soluciones de 10x, y se mezcló con 100 pl de sangre periférica humana normal por pocillo en una placa de 96 pocillos profundos para alcanzar concentraciones finales de huTBTI3_2_1 en 100 nM, 33,33 nM, 11,11 nM, 3,70 nM, 1,24 nM, 0,41 nM, 0,14 nM, 0,05 nM, 0,02 nM y 0,005 nM para los números de donante 245, 217 y 002. Para el número de donante 229, las concentraciones finales de huTBTI3_2_1 probadas eran 100 nM, 33,33 nM, 11,11 nM, 3,70 nM, 1,24 nM, 0,41 nM y 0,14 nM.

La placa se incubó en CO² al 5% a 37°C durante de 15 a 30 minutos. A continuación, se añadieron IL-4 (1 ng/ml) o IL-13 (3 ng/ml) humanas recombinantes a cada pocillo, y la placa se incubó adicionalmente en CO² al 5% a 37°C durante 15 minutos. A continuación, las células sanguíneas se sometieron a lisis/fijaron con tampón de lisis/fijación durante 10 minutos a 37°C, se centrifugaron a 300x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se retiraron y la pella celular restante se lavó una vez con solución salina tamponada con fosfato. Las células se permeabilizaron con metanol preenfriado durante 30 minutos a 4°C y a continuación se lavaron una vez con tampón de tinción de FACS (BD, n° catálogo 554656). Se añadieron a las células anticuerpos marcados fluorescentemente (anti-fosfo-Stat6-Alexa Fluor 647 con una dilución final 1:5, y anti-CD33-FITC con una dilución final 1:10) y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. Después del lavado con tampón de tinción de FACS, las células se adquirieron a través de un citómetro de flujo FACS Calibur™ para generar datos de FACS.

Los datos de FACS se analizaron al usar el programa CellQuest™ (BD, versión 5.2). Se crearon gráficas de puntos usando tinción con CD33 (isotiocianato de fluoresceína) frente a tinción con pStat6 (Alexa Fluor 647) (véase la Figura 1). Los monocitos totales se clasificaron basándose en su dispersión lateral frente a la dispersión directa. Los monocitos positivos a la fosforilación de Stat6 con tinción con CD33+ se clasificaron basándose en la intensidad de fluorescencia entre el control de referencia y muestras estimuladas con IL-4 o IL-13 en ausencia de huTBTI3_2_1. El porcentaje de monocitos positivos a pStat6 entre los monocitos totales se obtuvo a partir de estadística regional basada en el programa CellQuest (BD, versión 5.2).

Los efectos de huTBTI3_2_1 sobre la fosforilación de Stat6 inducida por IL-4 o IL-13 se determinaron usando el porcentaje de inhibición de la respuesta máxima (fosforilación de Stat6) en monocitos estimulados con IL-4 o IL-13.

La respuesta máxima se definió como el porcentaje de células pStat6+ generadas mediante estimulación con IL-4 o IL-13 en ausencia de huTBTI3_2_1. El porcentaje de células pStat6+ generada a partir de monocitos no estimulados se usó como señal de referencia. El porcentaje de respuesta máxima se calculó usando la siguiente ecuación:

% p S t a t 6 s AR1S6S97 % p S t a t 6 ! e%erencia

Porcentaje (%) de respuesta máxima x 100%

% P S t a t 6 resp u esta m áxim a % p S t a t 6 re%erencia

Las curvas de respuesta a la dosis se representaron como Y: % de respuesta máxima frente a X: concentraciones (nM) de huTBTI3_2_1 mediante SPEED v2.0-LTS para calcular la concentración que da 50% de respuesta máxima (IC⁵⁰).

La curva de respuesta a la dosis se modeló mediante el modelo logístico de cuatro parámetros:

d - c

% Respuesta máxima c

1 exp{b(log(dosis) - log(e)}

Los parámetros c y d son los límites inferior y superior, b negativo es la pendiente relativa alrededor de e, y el parámetro e es IC⁵⁰ y es la dosis que produce una respuesta a medio camino entre el límite superior, D, y el límite inferior, c. Los cuatro parámetros (b,c,d,e) se estimaron mediante el método de mínimos cuadrados no lineal. Se usó el procedimiento SAS NLIN en el sistema SAS edición 8.2 para Sun solaris a través del programa interno SPEED v2.0-LTS. Después de obtener la estimación de IC⁵⁰ de cada una de las tres curvas, se calculó la media geométrica de los 3 valores de IC⁵⁰.

huTBTI3_2_1 inhibía la fosforilación de Stat6 inducida por IL-4 en los donantes 245, 229 y 217 con IC50s de 1,32 nM, 0,73 nM y 0,78 nM, respectivamente. huTBTI3_2_1 inhibía la fosforilación de Stat6 inducida por IL-13 en los donantes 245, 229 y 002 con ICsos de 2,65 nM, 3,68 nM y 1,32 nM, respectivamente.

Las ICaos medias geométricas de huTBTI3_2_1 para inhibir la fosforilación de Stat6 inducida por IL-13 o IL-4 a partir de 3 experimentos separados eran 2,34 nM y 0,91 nM, respectivamente (Tabla 3).

Tabla 3. Valores de IC⁵⁰ de huTBTI3_2_1 para inhibir la fosforilación __________ de Stat6 inducida por IL-13 o IL-4 en monocitos de sangre humana.__________

Donante de sangre n° IC50 (nM) IC⁵⁰ (nM)

Inhibición de IL- 13 Inhibición de IL-4

245 2,65 1,32

229 3,68 0,73

217 * 0,78

002 1,32 **

Media Geométrica (95%CI) 2,34 (0,64 a 8,61) 0,91 (0,41 a 2.04) * Para el donante 217, solo se probó IL-4

** Para el donante 002, solo se probó IL-13

95% CI= intervalo de confianza de 95%

Ejemplo 3: Efecto de huTBTI3_2_1 sobre la liberación de IL-6 y la liberación de eotaxina inducidas por IL-4- o IL-13 desde fibroblastos pulmonares con IPF humana

Fibroblastos pulmonares humanos de un paciente con fibrosis pulmonar idiopática (IPF), denominación LL97A (AIMy), artículo número CCL-191, medio F-12K (modificación de Kaighn de medio F-12 de Ham) y suero bovino fetal (FBS) procedían de the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). La albúmina procedente de suero bovino (BSA) procedía de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). La IL-13 humana recombinante (rhIL-13) procedía de PeproTech (Rocky Hill, NJ); la IL-4 humana recombinante (rhIL-4) procedía de R&D SYSTEMS (Minneapolis, MN).El sistema de desarrollo de ELISA DuoSet para CCL11/Eotaxina e IL-6 humanas procedían ambos de R&D SYSTEMS.

Las células LL97A en el pase 7 se sembraron en una placa de cultivo celular de 96 pocillos a 20.000 células por pocillo en medio F-12K con 15% de FBS y se incubaron a 37°C, CO² al 5% en una incubadora humidificada durante 24 horas. A continuación, el medio se reemplazó por medio F-12K con 0,1% de BSA y la placa se incubó durante la noche a 37°C, CO² al 5% en una incubadora humidificada para el agotamiento de suero. A continuación, las células se trataron durante la noche a 37°C, CO² al 5% en una incubadora humidificada con una dilución en serie de 3 veces, 8 puntos de concentración de huTBTI3_2_1 con una combinación de 15 ng/ml (1,2 nM) de rhIL-13 más 5 ng/ml (0,36 nM) de rhlL-4 en un volumen total de 200 pl por pocillo. Cada tratamiento se realizó por triplicado. A continuación, se recogieron 150 pl por pocillo del sobrenadante de cultivo celular y se diluyeron en 300 pl de medio F-12K con 0,1% de BSA (dilución triple) para ELISA de eotaxina e IL-6.

Los ELISAs se llevaron a cabo según las instrucciones del sistema de desarrollo de ELISA DuoSet para CCL11/Eotaxina e IL-6 humanas de R&D SYSTEMS. Las placas de ELISA se leyeron en un lector de placas SPECTRA^{m a x}340PC (Molecular Devices) para una densidad óptica (OD) a 450 nm y 540 nm. Los valores de OD a 540 nm se sustrajeron de la OD a 450 nm antes del cálculo.

Los niveles de CCL11 (eotaxina) e IL-6 en los sobrenadantes se derivaron con una curva estándar de 4 parámetros en SOFTmax. El promedio de la muestra sin estimulación con rhIL-13/rhIL-4 (nivel basal) se sustrajo de cada muestra y cada muestra se comparó a continuación con el promedio de la muestra de estimulación con rhIL-13/rhIL-4 sin huTBTI3_2_1 (fijado como 100% positivo) para % de control positivo. Las barras de error representan el error estándar de la media de muestras biológicas por triplicado (tratamiento celular). huTBTI3_2_1 suprimía la liberación de IL-6 estimulada por IL-4/IL-13 con una IC50=7,8 nM y suprimía la liberación de eotaxina estimulada por IL-4/IL-13 con una IC50=3,8 nM (Figura 2).

Ejemplo 4: Efecto de huTBTI3_2_1 sobre la expresión de LOX inducida por IL-4 o IL-13 en fibroblastos pulmonares con IPF

Para valorar los efectos de huTBTI3_2_1 sobre la expresión estimulada con IL-4 e IL-13 de enzimas profibróticas, se midieron los niveles de ARNm de lisil oxidasa (LOX) en un experimento similar al mostrado en el Ejemplo 3. La expresión del gen de LOX se determinó mediante Taqman y se normalizó para el gen constitutivo GAPDH.

Se usaron métodos Taqman estándar. Brevemente, se prepararon lisados celulares con el estuche Cells-to-Ct (ABI, N° Catálogo AM1729). 20X Conjunto de cebadores/sondas de control endógeno TaqMan para GAPDH humana: Applied Biosystems, Número de artículo 4310884E, Colorante de la sonda: VIC-TAMRA. 20X conjuntos de cebadores y sondas humanos (sondas marcadas con colorante FAM en el extremo 5' y desactivador no fluorescente en el extremo 3') era LOX humana: AOD de Applied Biosystems, Nombre del gen: lisil oxidasa; Id. ensayo: Hs00184700_m1. Se realizó transcripción inversa (RT) en un PELTIER THERMAL CYCLER con un montaje de 4 bloques, Modelo PTC 225, de MJ RESEARCH. El instrumento Taqman era un sistema de PCR rápida en tiempo real 7900HT, Applied Biosystems, Número de artículo: 4330966; Número de serie: 279001674. Se añadieron 20 ul de lisado celular por muestra (o agua para el control de la plantilla) a 80 ul de mezcla madre para RT (50 ul 2X tampón de RT, 5 ul 20X mezcla de enzimas para RT, 25 ul de agua libre de RNasa). Secuencia de RT: transcripción inversa a 37°C durante 60 minutos, Inactivación de RT a 95°C durante 5 minutos, mantenimiento a 4°C definitivamente. Para la PCR en tiempo real Taqman, se preparó un cóctel de PCR como sigue: 10 ul de mezcla madre de expresión génica Taqman (2X), 1 ul de ensayo de expresión génica Taqman (20x), 1 ul de control endógeno de GAPDH humana (20x), 3 ul de agua, añádanse 5 ul de ADN. Condiciones de ciclación Taqman: el mantenimiento de la incubación de UDG era 1 rep a 50°C durante 2 minutos, la activación enzimática era 1 rep a 95°C durante 10 minutos, y el ciclo de PCR era 40 rep. a 95°C durante 15 segundos seguido por 60°C durante 1 minuto.

La actividad de LOX da como resultado la reticulación de colágeno y elastina extracelulares, dando como resultado la estabilización de la matriz extracelular, y su regulación al alza se ha relacionado con la fibrosis pulmonar experimental (Rodríguez, C. y cols., Drug News Perspect. 21:218-224, 2008).

IL-4 e IL-13 inducían la expresión del gen de LOX, y esta expresión era inhibida por huTBTI3_2_1 de un modo dependiente de la dosis, con una IC50 de 3 - 6 nM (Figura 4). Este efecto se ha observado en fibroblastos pulmonares procedentes de al menos 3 pacientes con IPF. IL-4 e IL-13 no inducían genes para fibronectina y factores de crecimiento insulínico (IGF; datos no mostrados). Estos datos demuestran que fibroblastos pulmonares procedentes de sujetos con IPF expresan receptores de IL-4/IL-13 funcionales cuya activación por IL-4 e IL-13 da como resultado efectos profibróticos directos e indirectos. La activación de los efectos profibróticos de fibroblastos pulmonares procedentes de pacientes con IPF con las citocinas IL-4 e IL-13 es inhibida por huTBTI3_2_1.

Ejemplo 5: Efecto de huTBTI3_2_1 contra asma aguda inducida por alérgenos en macacos cangrejeros Puesto que huTBTI3_2_1 no se une a IL-4 o IL-13 de roedor, no se pudo probar la molécula con respecto a los efectos protectores en modelos de fibrosis pulmonar en roedores. Aunque huTBTI3_2_1 se une a IL-4 e IL-13 de macaco cangrejero, no hay modelos de fibrosis pulmonar disponibles en esta especie. Por lo tanto, para probar la capacidad de huTBTI3_2_1 para inhibir efectos de IL-4 e IL-13 en el compartimento pulmonar, se investigaron sus efectos protectores en un modelo de asma aguda en una especie de primate no humano (macacos cangrejeros). El estudio usaba macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) macho que estaban sensibilizados naturalmente para alérgenos de Ascaris suum.

Para inducir hipersensibilidad de las vías respiratorias e inflamación de las vías respiratorias, los monos se estimularon con extracto de Ascaris suum inhalado. Seis días antes de la estimulación con antígeno, los monos recibían huTBTI3_2_1 (2,5 mg/kg IV), o la misma dosis de un anticuerpo comparativo (anti-IL-13, IMA638) o un anticuerpo de control (el anticuerpo de control no se une a IL-4 o IL-13).

Las respuestas broncoconstrictoras (incrementos en la resistencia pulmonar) a dosis ascendentes de metacolina inhalada se midieron usando un analizador respiratorio MI². Las medidas se realizaron al menos 24 horas antes de la estimulación, y de nuevo 24 horas después de la estimulación. La sensibilidad de las vías respiratorias se calculó como la concentración de provocación de metacolina requerida para provocar un incremento de 100% en la resistencia pulmonar (PC¹⁰⁰). Inmediatamente después de la medida de la sensibilidad de las vías respiratorias, se realizó un lavado broncoalveolar para permitir recuentos de leucocitos y eosinófilos totales en las vías respiratorias. Los recuentos celulares se expresaron como números de células por ml de fluido de lavado. Se calcularon las diferencias ( ) en valores de PC¹⁰⁰ de metacolina y los números de células de las vías respiratorias antes y después de la estimulación con antígeno.

Se recogieron muestras de sangre 24 horas antes de la estimulación con antígeno, y de nuevo 7 días después de la estimulación, para permitir el ensayo de títulos de inmunoglobulina E (IgE) total. Se calculó el porcentaje de cambio en el título de IgE.

La estimulación con antígeno provocaba la hipersensibilidad de las vías respiratorias (es decir, una PC100 de metacolina disminuida (Figura 4) y una acumulación de leucocitos y eosinófilos totales en las vías respiratorias (Figura 5 y 6). Cuando se compara con el anticuerpo de control, el tratamiento profiláctico bien con huTBTI3_2_1 (2,5 mg/kg) o bien con IMA638 (2,5 mg/kg) suprimía significativamente el desarrollo de hipersensibilidad de las vías respiratorias. IMA638, pero no huTBTI3_2_1, reducía significativamente la acumulación inducida por antígeno de leucocitos totales en las vías respiratorias (Figura 5 y 6). huTBTI3_2_1 o IMA638 no tenían efectos significativos sobre la acumulación de eosinófilos. huTBTI3_2_1, pero no IMA638, reducía significativamente el título de IgE (Figura 7).

Ejemplo 6: Efectos de huTBTI3_2_1 contra la proliferación de células TF-1 inducida por IL-4 e IL-13 humana y de macaco cangrejero recombinantes in vitro

Como un estudio adicional de la capacidad de huTBTI3_2_1 para inhibir la activación celular inducida por IL-4 e IL-13, se determinaron los valores de IC⁵⁰ para la inhibición de la proliferación de células TF-1 (una línea de eritrocitos humanos) inducida por IL-4 (hIL-4) e IL-13 (hIL-13) humanas recombinantes. La proliferación de células TF-1 inducida por IL-4 o IL-13 se usa comúnmente en la bibliografía como un ensayo para las bioactividades de estas citocinas.

Las células TF-1 se incubaron durante 72 horas con huTBTI3_2_1 a un intervalo de concentraciones junto con bien hIL-4 (5 ng/ml), bien hIL-13 (15 ng/ml), bien cIL-4 (5 ng/ml) o bien cIL-13 (30 ng/ml). Se añadió bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio durante las 3 horas finales como un marcador de la proliferación celular. A continuación, se registraron valores de densidad óptica a 490 nm.

huTBTI3_2_1 inhibía marcadamente la proliferación de células TF-1 inducida por hIL-4, cIL-4, hIL-13 y cIL-13 de un modo dependiente de la concentración y con potencias comparables. Los valores medios geométricos de IC⁵⁰ eran 2,03 nM y 0,53 nM, respectivamente, contra la proliferación inducida por hIL-4 y cIL-4, y 3,02 nM y 0,45 nM, respectivamente, contra la proliferación inducida por hIL-13 y cIL-13 se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4 - Efectos inhibidores de huTBTI3_2_1 contra la proliferación de células TF-1 inducida por IL-4 e IL-13 humanas y de macaco cangrejero recombinantes

IC⁵⁰ media, nM

Inhibición de IL-4 humana 2,03

Inhibición de IL-13 humana 3,02

Inhibición de IL-4 de cynomolgus 0,53 Inhibición de IL-13 de cynomolgus 0,45 IC⁵⁰ = Concentración de SAR156597 que inhibe la proliferación en 50%.

n=3 (triplicados experimentales).

IC⁵⁰ media, nM

Los resultados de este estudio demuestran que huTBTI3_2_1 neutraliza las actividades biológicas de IL-4 e IL-13 según se muestra por la proliferación celular disminuida de células TF-1 después de la estimulación mediante estas citocinas. De ahí que la elección como diana de estas citocinas con huTBTI3_2_1 ofrezca un enfoque terapéutico que puede interrumpir el proceso fibrótico en pacientes con IPF.

Ejemplo 7: Efectos de SAR156597 sobre la liberación de TGFB mediada por IL-4 e IL-13

Se ha observado que IL-4 e IL-13 estimulan la liberación de TGFp desde células epiteliales pulmonares humanas. Se determinó el efecto de SAR156597 sobre la liberación de esta citocina profibrótica desde células epiteliales de vías respiratorias pequeñas (SAEC) humanas y células epiteliales bronquiales (NHBE) humanas. Las SAEC se pusieron sobre placas de 12 pocillos en 50.000 células por pocillo en medio de cultivo de células epiteliales de vías respiratorias pequeñas (Lonza) y se cultivaron durante 3 días. Las células NHBE se cultivaron en 75.000 células por pocillo en placas de 12 pocillos en BMEM (Lonza) durante 3 días. Las células se sometieron a inanición con medio basal que contenía 5 pg/ml de insulina y 5 pg/ml de transferrina durante la noche y a continuación se trataron con una combinación de 15 ng/ml (1,2 nM) de rhlL-13 más 5 ng/ml (0, 36 nM) de rhlL-4 en presencia de un intervalo de concentraciones de SAR156597. El TGFp2 en sobrenadantes celulares se determinó mediante ELISA (E-biosciences, n° cat. BMS254). SAR156597 inhibía la liberación de TGFB2 estimulada por IL-4 e IL-3 a partir de células NHBE y SAEC de un modo dependiente de la dosis (Figura 8).

Ejemplo 8: Estudio farmacocinético después de infusiones intravenosas repetidas de 5 minutos de 2,5 mg/kg de anticuerpo monoclonal anti-IL-4/IL-13 biespecífico humanizado (huTBTI3_2_1) para macacos cangrejeros

En este estudio, se midieron las propiedades farmacocinéticas de huTBTI3_2_1, un anticuerpo monoclonal biespecífico (BsAb) humanizado para IL-4/IL-13, después de la administración de dosis repetidas. El objetivo era demostrar que había una acumulación de huTBTI3_2_1 a lo largo del tiempo y comprobar la producción por el animal de anticuerpos contra fármaco.

Se obtuvieron Macaca fascicularis macho (6-8 kg) de Charles River, Houston, Tx. La vía de administración era la perfusión i/v en 5 minutos. Se administraron cinco dosis en serie. Se tomaron muestras de sangre (1 ml) en los siguientes momentos: (primera dosis) 0 h, 0,5 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h, 168 h, 240 h; (segunda, tercera y cuarta dosis) 0 h, 0,5 h, 2 h, 24 h; (quinta dosis) 0 h, 0,5 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h, 168 h, 240 h, 336 h, 504 h, 672 h, 840 h, 1008 h (h=hora).

Las muestras de suero se almacenaron a -20°C hasta el análisis. Se usaron dos ensayos separados que usan ensayos de electroquimioluminiscencia mejorada (EECL) con tecnología de descubrimiento a mesoescala (MSD) para determinar los niveles de huTBTI3_2_1 en suero (Figura 9). Se desarrolló un tercer ensayo para evaluar la respuesta del anticuerpo contra fármaco (ADA), es decir, anticuerpos de mono antibiespecíficos.

El primer ensayo (representado en el cuadro A de la Figura 9) se diseño, para detectar la cantidad total de anticuerpo humano en el suero al medir la concentración de cadena kappa ligera humana). En este ensayo, placas de unión fuerte de MSD se revistieron durante la noche con 1 pg/ml de anticuerpo monoclonal de ratón anti-cadena kappa humana (clon 4G7; Abcam; n° ab1936) diluido en PBS. Después de una incubación durante la noche a 4°C con muestras de suero diluidas 1:1000 y 1:5000, anticuerpo caprino contra inmunoglobulinas humanas marcado con etiqueta sulfo (MSD; n° R32AJ-1) a una concentración de 1 pg/ml se añadió y se detectó usando una placa de MSD Sector Imager 6000.

El segundo ensayo (representado en el cuadro B de la Figura 9) se diseñó para medir la proporción de anticuerpo biespecífico en el suero capaz de unirse a IL-4 e IL-13 (medida de la cantidad de anticuerpo funcional). En este ensayo, placas de alta unión de MSD se incubaron durante la noche a 4°C secuencialmente con 2 pg/ml de un anticuerpo de ratón anti-IL-4 humana (clon 4D9; Ancell; n° ANC-396), a continuación con 200 ng/ml de IL-4 humana recombinante (eBioscience, n° 34-8049) y finalmente con sueros de mono diluidos 1:1000 y 1:5000. Los anticuerpos biespecíficos unidos se revelaron mediante incubación secuencial con 200 ng/ml de IL-13 humana recombinante (eBioscience; n° 34-8139, a continuación con 200 ng/ml de anticuerpo policlonal de conejo contra IL-13 humana biotinilado (eBioscience; n° 13-7138) y finalmente con estreptavidina etiquetada con sulfo (MSD; n° R32AA-1) a una concentración de 1 pg/ml.

En tercer lugar, se detectaron ADAs con un ensayo de puenteo (representado en el cuadro C de la Figura 8). En resumen, sueros diluidos 1:10 se incubaron durante la noche a 4°C con una mezcla de huTBTI3_2_1 biotinilado y etiquetado con sulfo (2 pg/ml de cada uno final). A continuación, los complejos se atraparon en placas revestidas con estreptavidina (MSD; n° L11SA-1) mediante incubación durante 4 horas a temperatura ambiente y se revelaron usando una placa de MSD Sector Imager 6000.

Se prepararon concentraciones de muestra estándar en PBS que contenía 0,5% de BSA según se indica en la siguiente tabla. Para el ensayo para detectar la cantidad total de huTBTI3_2_1, no había una diferencia significativa si las muestras de calibración se preparaban en PBS que contenía 0,5% de BSA, 0,1% de plasma de mono o PBS que contenía 0,5% de BSA solamente. Para el ensayo para detectar la fracción de huTBTI3_2_1 específica para IL-4 e IL-13, no había diferencia significativa si las muestras de calibración se preparaban en PBS que contenía 0,5% de BSA, 1% de plasma de mono o PBS que contenía 0,5% de BSA solamente. Ambas curvas de calibración se ponderaban por 1/x2 usando una regresión lineal y se mostraba que eran lineales dentro de todos los puntos de calibración (R2>0,98).

Tabla 5. Concentraciones de Muestras Estándar

En paralelo con las medidas de ADA a partir de sueros, se obtuvo una curva de validación de datos al mezclar diluciones de ADA simulado con huTBTI3_2_1 biotinilado y etiquetado con sulfo. Ese anticuerpo era un anticuerpo de ratón anti-IgG4 humana (Abcam; n° ab1950-1) y mostraba la mejor relación de señal a ruido de varios anticuerpos probados.

Tabla 6. Concentraciones de Muestra Estándar para ADA

Los límites inferiores de cuantificación (LLOQ) de huTBTI3_2_1 eran 70 ng/ml y 5 ng/ml para un ensayo total y un ensayo específico, respectivamente. La determinación de la respuesta de ADA no es cuantitativa sino que es cualitativa en comparación con la respuesta de ADA simulado.

Los parámetros farmacocinéticos se calcularon a partir de la media aritmética de las concentraciones en suero/los animales individuales después de la 5a dosis usando el programa WinNonLin 5.2., modelo no compartimental 202.

Tabla 7. Concentraciones totales de anticuerpos biespecíficos (BsAb) en sueros de mono después de infusiones intravenosas repetidas de 5 minutos de 2,5 mg/kg de huTBTI3_2_1 (lote n° LP08059) en PBS. Para cada momento, los valores son concentraciones medias de tres medidas independientes realizadas por triplicado.

Tabla 8. Concentraciones de anticuerpos biespecíficos (BsAb) reactivos con IL-4 e IL-13 en monosueros después de infusiones intravenosas repetidas de 5 minutos de 2,5 mg/kg de huTBTI3_2_1 (lote n° LP08059) en PBS. Para cada momento, los valores son concentraciones medias de tres medidas independientes realizadas por triplicado.

Tabla 9. Parámetros farmacocinéticos de huTBTI3_2_1 después de infusiones intravenosas repetidas de 5 minutos de 2,5 mg/kg de huTBTI3_2_1 (Lote n° LP08059) en PBS en monos. Los parámetros se obtuvieron después del análisis de los valores de concentración de BsAb funcional con WinNonLin 5.2, modelo no compartimental 202.

Tabla 10. Respuesta de anticuerpo anti-fármaco a huTBTI3_2_1 después de infusiones intravenosas repetidas de 5 minutos de 2,5 mg/kg de huTBTI3_2_1 (Lote n° LP08059) en PBS en monos.

La exposición de suero del anticuerpo biespecífico huTBTI3_2_1 a IL-13/IL-4 se midió en macacos cangrejeros macho para establecer parámetros farmacocinéticos de dosis repetidas

Se administró huTBTI3_2_1, en una dosis de 2,5 mg/kg, repetidamente a macacos cangrejeros a través de infusiones intravenosas en un paradigma de dilución en serie. El anticuerpo muestra acumulación desde la 1a a la 5a dosis. C^máx y AUC^o-336h parcial se incrementan desde 128.000 ng/ml hasta 220.000 ng/ml y desde 18.000.000 ng.h/ml hasta 42.000. 000 ng.h/ml, respectivamente. Después de la 5a dosis hay una buena exposición al anticuerpo con AUC^ü-inf de 81.000. 000 ng.h/ml (véase la Figura 10). El anticuerpo muestra una depuración del suero de 0,000032 l/h-kg y un volumen de distribución de 0,014 l/kg. Se encuentra que la semivida de eliminación terminal es 330 horas.

Un mono del estudio muestra una respuesta de anticuerpo anti-fármaco (ADA) transitoria, que alcanza un máximo los días 5-7. El nivel de ADA se devuelve al nivel de fondo para el día de la segunda infusión. No hay un aumento significativo de los niveles de ADA posteriormente. El otro mono no presenta niveles significativos de ADA en ningún momento.

No se observó un signo clínico particular ni pérdida de peso durante o después de la administración.

Ejemplo 9: Resumen del diseño de estudio para un estudio aleatorizado, doblemente enmascarado, controlado por placebo de la seguridad, la tolerabilidad y la farmacocinética de dosis subcutáneas individuales ascendentes de huTBTI3_2_1 en varones jóvenes sanos

Esta es la primera investigación de huTBTI3_2_1 en seres humanos e implica el cuidadoso aumento a escala de la dosis en sujetos sanos para obtener información inicial de la seguridad, la tolerabilidad y la farmacocinética (PK) de dosis subcutáneas (SC) individuales. El aumento a escala de la dosis se efectuó en cohortes de varones jóvenes sanos (de 18 a 45 años de edad, peso corporal entre 50,0 y 95 kg, índice de masa corporal entre 18,0 y 30,0 kg/m² ; certificados como sanos mediante una evaluación clínica exhaustiva; ritmo cardíaco y presión sanguínea normales después de 10 minutos de reposo en posición supina: 95 mm Hg < presión sanguínea sistólica < 140 mm Hg; 45 mm Hg < presión sanguínea diastólica < 90 mm Hg; 40 bpm < ritmo cardíaco < 100 bpm; ECG de 12 terminales estándar normal después de 10 minutos de reposo en posición supina; 120 ms < PR < 220 ms; QRS < 120 ms; QTc < 430 ms; parámetros de laboratorio dentro del intervalo normal; la proteína C reactiva no debe superar 3 mg/l (usando un método de medida de alta sensibilidad); la troponina cardíaca I no debe superar la norma de laboratorio superior.)

Este era un estudio de dosis SC individuales ascendente monocéntrico, aleatorizado, con doble enmascaramiento, controlado por placebo en cuatro cohortes secuenciales de varones jóvenes sanos. Cada cohorte/grupo de dosis se diseñó para consistir en 8 sujetos (6 que recibían huTBTI3_2_1 y 2 que recibían placebo). Este diseño de aumento de dosis por etapas era típico para la introducción de una nueva entidad terapéutica en seres humanos.

El período de observación de 85 días (~12 semanas) después de la dosificación para episodios adversos que surgen del tratamiento (TEAEs) y análisis PK era apropiado teniendo en cuenta una semivida de eliminación típica para un anticuerpo monoclonal de aproximadamente 15 días. Si los ADA o anticuerpos de autoinmunidad (factor reumatoide [RF], anticuerpos antinucleares [ANA] o anticuerpos citoplásmicos antineutrofílicos [ANCA]) medidos a las 12 semanas después de la dosificación se incrementaban desde el valor de referencia, entonces se debía producir una visita de seguimiento adicional a los 6 meses después de la dosificación para documentar la resolución o la persistencia a largo plazo. Si, al final del aumento a escala de la dosis en cuatro cohortes de dosis secuenciales, se necesitaba información adicional a dosis por debajo de la dosis administrada más alta, entonces una quinta cohorte de 8 sujetos era dosificada y evaluada.

Dado el mecanismo de acción inmunomodulador de huTBTI3_2_1, se ejecutaron varias pruebas de laboratorio específicas relacionadas con la inflamación.

Proteína C reactiva (CRP):

La inflamación está asociada con elevaciones en proteínas de la fase aguda tales como CRP. Usando metodología de alta sensibilidad, se fija ahora a menudo que el límite superior de la normalidad (ULN) para proteína C reactiva de alta sensibilidad (hsCRP) sea 3 mg/l con el propósito de valorar el riesgo cardiovascular; sin embargo, aproximadamente un tercio de los sujetos sanos en los Estados Unidos tienen valores de CRP entre 3 y 10 mg/l, con elevaciones espurias ocasionales entre 10 y 15 mg/l (Kushner I., y cols. Am J Med 2006;119(2):166.e17-28; Ridker, PM, y cols., Circulation 2003:107(3):391-7; Pearson Ta , y cols, Circulation 2003:107(3):499-511; Ridker PM y cols, 2000:342(12):836-43; Unek, IT y cols., Clin Med Res. 2010; 8(2)89-95). Usando un muestreo en serie a partir de sujetos sanos, se ha presentado que la diferencia crítica para valores secuenciales significativos a P <0,05 (es decir, el menor porcentaje de cambio improbable que se deba a variabilidad analítica o variabilidad normal dentro del sujeto) es 118% (Macy eM y cols, Clin Chem 1997:43(1):52-8). Típicamente, los valores de proteína C reactiva se consideran clínicamente significativos a niveles por encima de 10 mg/l, y las elevaciones sostenidas por encima de este nivel pueden causar preocupación. Durante respuestas inflamatorias agudas, se pueden observar valores que superan 100 mg/l (Clin B and OlshakerJS, J. Emerg Med. 1999: 17(6)1019-25). Una elevación en la CRP se ha presentado coherentemente para afecciones de vasculitis activa (Konttinen YT y cols, Ind J Rheumatol 2007:2(3):100-4Hesselink DA y cols., Scand J Rheumatol 2003:32(3)151-5). Para este protocolo, se usó hsCRP, junto con observaciones clínicas, como el principal instrumento para la detección de la inflamación relacionada con fármacos y la posible vasculitis. Una elevación sostenida en hsCRP por encima de 10 mg/l durante al menos 72 horas se observó como una posible evidencia temprana de vasculitis. En general, la vasculitis inducida por fármacos es reversible al interrumpir el tratamiento, y marcadores de la inflamación tales como hsCRP deben volver a valores normales o de referencia (Wiik, A, Curr Opin Rheumatol 2008:20(1)35-9; Calabrese LH and DunaGF, Curr Opin Rheumatol 1996; 8(1)34-40). Además, elevaciones consecutivas por encima de 20 mg/l después de la administración del fármaco se pueden observar como una evidencia de un posible estímulo inflamatorio relacionado con fármacos y, después de excluir otras causas de inflamación tales como infecciones agudas, una posible razón para la interrupción de una dosificación adicional.

Troponina cardíaca I:

Se comprobó la troponina cardíaca I (cTnl) en suero para detectar la lesión miocárdica provocada por vasculitis coronaria potencial (Kim M y Kim K, Pediatr Cardiol, 1999:20(3): 184-8). La interpretación de cTnl en el estudio se realizó en el contexto de los signos clínicos, los síntomas, el ECG y la hsCRP, ya que las elevaciones de cTnI pueden estar provocadas por factores distintos a la lesión miocárdica (incluyendo ejercicio agotador) (Wu AH, y cols. Clin Chem. 2007;53(12):2086-96).

Pruebas complementarias para la vasculitis:

Para caracterizar adicionalmente la inflamación asociada con elevaciones sostenidas en hsCRP en sujetos individuales, se realizaron pruebas de laboratorio adicionales relacionadas con la vasculitis, incluyendo pruebas para el complemento (C3, C4 y CH⁵⁰), crioglobulina, ANCA (inmunofluorescencia para ANCA perinucleares y citoplásmicos e inmunoensayos confirmatorios para anti-proteasa 3 [PR3] y anti-mieloperoxidasa), RF y ANA. Se establecieron valores de referencia antes de la dosificación para todos los sujetos; se realizó un ensayo adicional para estas pruebas complementarias para la vasculitis para sujetos individuales que mostraban una elevación sostenida en hsCRP (>10 mg/l durante al menos 72 horas), en cuyo caso las pruebas complementarias se realizaban inmediatamente (tan pronto como fuera practicable) y en varias visitas posteriores.

La serie propuesta de pruebas complementarias proporcionaba una visión del mecanismo de la vasculitis, si se produce. ANCA es un nuevo criterio de clasificación (Sunderkotter C y Sindrilaru A. Eur J Dermatol. 2006;16(2):114-24; Watts R y cols., Ann Rheum Dis. 2007;66(2):222-7;Watts RA y cols., Rheumatology (Oxford). 2010 Jul 20: 1-3).

Los ANCA se clasifican según los patrones de inmunofluorescencia indirectos (IIF) que producen sobre neutrófilos normales y según sus antígenos diana (Pollock W y cols. J Immunol Methods. 2009;347(1-2):19-23; De Rosa FG y Agnello V. J Rheumatol. 2009;36(9):1953-5; Clin Sci (Lond). 2005;108(2):101-12) Si ANCA para mieloperoxidasa es positivo, se pueden sospechar síndrome de Churg-Strauss o poliarteritis microscópica. Si ANCA para PR3 es positivo, lo más probable es una granulomatosis de Wegener. Sin la prueba de ANCA es negativa y la prueba de crioglobulina es positiva, se debe sospechar vasculitis crioglobulinémica y se deben descartar sus enfermedades subyacentes, particularmente hepatitis C y B, lupus eritematoso sistémico (SLE) y síndrome de Sjogren. C3 y C4 en suero a menudo se consumen en la crioglobulinemia, pero habitualmente son normales en la poliarteritis nudosa así como la vasculitis por ANCA. ANCA puede ser positivo en presencia de otras enfermedades incluyendo infección, enteropatía inflamatoria y otra enfermedad del tejido conectivo (p. ej., artritis reumatoide). En estos casos, ANCA son positivos pero son negativos para PR3 y mieloperoxidasa.

Biomarcadores de activación endotelial vascular:

El desarrollo de lesiones vasculíticas está asociado con la activación de células endoteliales y neutrófilos (Tesfamariam B y DeFelice AF. Vascul Pharmacol. 2007;46(4):229-37; Toxicol Appl Pharmacol. 2005;207(2 Supl):441-5). La expresión incrementada de moléculas de adhesión tales como e-selectina promueve la interacción del endotelio con células inflamatorias circulatorias. Diversos marcadores de la activación endotelial tales como endotelina-1 y trombomodulina son supuestamente elevados durante la vasculitis. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) puede alterar la permeabilidad vascular y es elevado en suero procedente de pacientes con enfermedad de Behget, poliangiitis microscópica, poliarteritis nudosa, arteritis de células gigantes y vasculitis sistémica (Cekmen M y cols., Int J Dermatol. 2003;42(11):870-5). Si se apreciaban inflamación que surge del tratamiento (p. ej., elevaciones de hsCRP sostenidas) o cambios en los valores de laboratorio coherentes con vasculitis en múltiples sujetos, entonces se ensayaban muestras de suero y plasma de archivo (recogidas antes y periódicamente después de la administración del fármaco) con respecto a diversos biomarcadores exploratorios asociados con la activación endotelial vascular para caracterizar adicionalmente la naturaleza de la inflamación.

Subconjuntos de linfocitos:

Para asegurar que los subtipos específicos de linfocitos humanos no se ven afectados selectivamente por huTBTI3_2_1, se evaluaron subconjuntos de linfocitos usando citometría de flujo. Esto incluirá células T totales, células cooperadoras T (CD4), células supresoras T (CD8) y células B totales (CD19) expresadas como números absolutos y como un porcentaje de linfocitos totales, así como la relación CD4/CD8.

Inmunogenicidad

La administración sistémica de anticuerpos monoclonales está asociada con la generación de ADA que puede alterar la PK y/o la actividad de los anticuerpos terapéuticos (Hansel TT y cols. Nat Rev Drug Discov. 2010;9(4):325-38). La inmunogenicidad se evaluó usando un ensayo de inmunoadsorción con enzimas ligadas (ELISA) con respecto a anticuerpos anti-huTBTI3_2_1; un ensayo funcional para la evaluación de la neutralización con anticuerpos de huTBTI3_2_1 se puede emplear durante futuros estudios.

Albúmina urinaria:

La aparición de proteína en la orina es una indicación de un incremento de la permeabilidad de los glomérulos renales y, durante experimentos farmacológicos clínicos, una evidencia de posible lesión renal. Un ensayo de tira estándar en orina se usa típicamente con este propósito. Sin embargo, la metodología de la tira puede no detectar los cambios más sutiles en la función glomerular como podría ocurrir durante las fases tempranas de vasculitis. Por lo tanto, se usó un ensayo más sensible para la albúmina urinaria durante estudios clínicos iniciales de huTBTI3_2_1. Se usó una recogida puntual de primera orina de la mañana para comprobar la aparición potencial de microalbuminuria y se presentó como la relación de albúmina/creatinina para corregir fluctuaciones en el grado de dilución de soluto en la orina. La aparición después del tratamiento de microalbuminuria se definió como una observación de una relación de albúmina/creatinina >30 pg/mg en 2 de 3 recogidas de orina consecutivas, como se recomendaba para la comprobación de pacientes con diabetes mellitus (American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes--2009. Diabetes Care. 2009;32 Supl 1 :S13-61). Puesto que el ejercicio puede elevar transitoriamente la albúmina urinaria, el ejercicio físico vigoroso se debe restringir antes de la recogida de orina (Heathcote KL y cols., Clin Invest Med. 2009;32(4):E261-5). Los resultados de albúmina urinaria obtenidos en menos de 24 horas desde un ejercicio físico vigoroso se deben excluir de la consideración con el propósito de definir la microalbuminuria. Una observación de una relación de albúmina/creatinina >300 pg/mg en 2 de 3 recogidas de orina consecutivas se evaluó como una evidencia de macroalbuminuria (American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes--2009. Diabetes Care. 2009;32 Supl 1 :S13-61).

Tolerabilidad en la zona de inyección del producto de investigación (IP):

El grado de molestias y reacción tisular en la zona de inyección de IP se comprobó durante hasta 2 semanas después de la dosificación, incluyendo evaluaciones tanto cualitativas como cuantitativas estándar para el dolor presente (escala verbal) (Melzack R. The McGill Pain Questionnaire: major properties and scoring methods. Pain 1975; 1:277-299) y para eritema e hinchazón/induración/edema (Guidance for industry: toxicity grading scale for healthy adult and adolescent volunteers enrolled in preventive vaccine clinical trials, US Dept of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Biologics Evaluation and Research, septiembre de 2007).

Las etapas de aumento a escala de la dosis para TDU11325 se proporcionan en la Tabla 11. La relación de aumento a escala de la dosis es 2 veces en cada etapa de aumento a escala. Este incremento en serie en la dosis es típico para experimentos clínicos iniciales de anticuerpos monoclonales terapéuticos y está apoyado por la comprobación cuidadosa de señales de seguridad potenciales.

Tabla 11. Dosis subcutáneas secuenciales de huTBTI3 2 1

Cohortes de Volumen total inyectado Dosis en mg/kg suponiendo Incremento

dosis subcutáneamente un peso corporal de 60 kg incremental

10 mg 0,1 mL 0,17 mg/kg

20 mg 0,2 mL 0,33 mg/kg 2

40 mg 0,4 mL 0,67 mg/kg 2

80 mg 0,8 mL 1,33 mg/kg 2

150mg 1,5 ml 2,50 mg/kg 1,9

300 mg 3,0 ml 5,0 mg/kg 2

Se podrían probar dosis superiores de huTBTI3_2_1 dependiendo de los resultados de las dosis inferiores. Dosis superiores podrían incluir cualquier dosis menor de, igual a o superior a una cohorte de 300 mg. Cohortes de dosis adicionales contempladas incluyen, pero no se limitan a, 175 mg, 200 mg, 225 mg, 250 mg, 275 mg y 300 mg. Cohortes de dosis adicionales podrían ser además 300 mg, 350 mg, 400 mg o superiores.

Se administró huTBTI3_2_1 o placebo como inyecciones SC periumbilicales en un estado en ayunas en una zona de 4 a 10 cm a la derecha o la izquierda del ombligo y por encima de la cintura. Las cohortes de dosis en TDU11325 se iniciaron obligatoriamente como subgrupos menores como una precaución de seguridad. Para cada cohorte de dosis, 2 sujetos fueron dosificados el primer día. Los sujetos restantes en la cohorte fueron dosificados no antes de 2 días (~48 horas) más tarde, con no más de 2 sujetos dosificados cada día.

Una decisión de avanzar desde la dosis "n" hasta la siguiente dosis "n+1" superior fue tomada conjuntamente por el patrocinador y el investigador basándose en un informe de seguridad preliminar proporcionado por el investigador que incluye datos de seguridad con enmascaramiento durante al menos 21 después de la dosis (Día 22) de al menos 6 de 8 sujetos de la cohorte de nivel de dosis "n". Así, teniendo en cuenta la dosificación escalonada dentro de una cohorte, se inició una nueva cohorte de dosis aproximadamente cada 4 semanas. Los datos pertinentes para esta decisión deben ser al menos: episodios adversos, hematología, subconjuntos de linfocitos, coagulación, análisis de orina, bioquímica sérica (incluyendo hsCRP y cTnI), ECG, presión sanguínea, ritmo cardíaco y temperatura corporal. Los datos PK disponibles también se revisaron durante el avance del estudio.

Además de la evaluación clásica de episodios adversos intensos de la presencia/potencia de otros episodios adversos por el patrocinador y el investigador, después de explorar factores confusos potenciales, se consideraron los siguientes criterios como guía para la decisión de detener la dosificación:

• Más de 1 episodio adverso (idéntico) de intensidad grave para el que la relación con el tratamiento no se puede excluir razonablemente. La definición de intensidad "grave" para un episodio adverso es la que impide actividades diarias y requiere tratamiento sintomático;

• QTc >500 ms;

• hsCRP >20 mg/l sostenidos durante 2 recogidas se sangre consecutivas separadas >24 horas

Nota: Si hsCRP es >20 mg/l en un momento de recogida programado, se debe recoger una muestra de sangre adicional 24 horas más tarde (o tan pronto como sea posible posteriormente) para probar de nuevo.

huTBTI3_2_1 en forma liofilizada para la preparación de una solución para dosis SC con cada vial que contiene 185 mg de huTBTI3_2_1 más excipientes y almacenada entre 2°C y 8°C (36°F y 46°F). Para ser reconstituida la mañana de la dosificación (no más de 1 hora antes de la inyección SC) con 1,7 ml de agua destilada apirogénica estéril a temperatura ambiente. Las concentraciones de los constituyentes en solución después de la reconstitución para inyección eran: 100 mg/ml de huTBTI3_2_1 en 6,3 mmol/l de fosfato sódico monobásico, 3,7 mmol/l de trometamina, 5% (peso/volumen) de sacarosa, 3% (p/v) de prolina y 0,2% (p/v) de polisorbato 80 con un pH final de 7,0. Para el placebo, cada vial contendrá 2 ml de líquido que consiste en los mismos excipientes a las mismas concentraciones que para la formulación de huTBTI3_2_1 reconstituida.

Tabla 12 - Administración subcutánea de huTBTI3_2_1 planeada Grupo Dosis (mg) Volumen total inyectado

1 10 0,1 mL

2 20 0,2 mL

3 40 0,4 mL

4 80 0,8 mL

5 150 1,5 mL

6 300 3,0 ml (dos inyecciones de 1,5 ml)

Un período de ayuno antes de la dosificación comenzaba al menos 10 horas antes de la dosificación y continuaba durante 2 horas después de la dosificación.

Las investigaciones se seguridad y tolerabilidad en el punto de referencia y durante el estudio consistían en:

• Examen físico (incluye al menos: auscultación cardíaca y respiratoria; pulso arterial periférico en ambos brazos y ambas piernas; reflejos de la pupila, la rodilla, el talón de Aquiles y plantares; nódulos linfáticos periféricos y examen abdominal; inspección de la piel, las manos y los pies);

• Peso corporal (kg);

• Rayos X torácicos posteroanteriores (solamente en el cribado a menos que esté clínicamente indicado después de la dosificación)

• Temperatura corporal (bien oral o timpánica pero coherentemente el mismo método a lo largo del estudio para todos los sujetos);

• Ritmo cardíaco y presión sanguínea sistólica y diastólica medidos después de 10 minutos en posición supina en reposo y después de 3 minutos en posición erguida);

• Pruebas de laboratorio (todas las muestras de sangre recogidas por la mañana bajo condiciones de ayunas, es decir, solo agua durante al menos 10 horas antes, a menos que se especifique otra cosa):

- Hematología: recuento de glóbulos rojos (RBC), hematocrito (Hct), hemoglobina (Hb), recuento de glóbulos blancos (WBC) con fórmula leucocítica (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos y linfocitos), plaquetas;

- Coagulación: tiempo de protrombina (PT), relación normalizada internacional (INR), fibrinógeno y tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT);

- Bioquímica sérica:

Electrolitos: sodio, potasio, cloruro, calcio;

Función hepática: AST, ALT, fosfatasa alcalina, gamma-glutamil transferasa (GGT), bilirrubina total y conjugada; Función renal: urea, creatinina;

Metabolismo: glucosa, albúmina, proteína total, colesterol total, triglicéridos;

Toxicidad muscular potencial: creatina cinasa (CK);

Toxicidad cardíaca potencial: cTnl;

Biomarcador de inflamación: CRP de alta sensibilidad (hsCRP);

- Subconjuntos de linfocitos:

Células T totales (CD3), células T cooperadoras (CD4), células supresoras T (CD8) y células B totales (CD19) mediante citometría de flujo, expresadas como números absolutos y como porcentaje de linfocitos totales, así como la relación CD4/CD8.

- Inmunogenicidad: anticuerpos anti-huTBTI3_2_1;

- Pruebas complementarias para la vasculitis (en el punto de referencia y a continuación después de la dosis solamente para sujetos que exhiban hsCRP >10 mg/l durante >72 horas):

Ensayos del complemento: C3, C4, CH⁵⁰ ;

Crioglobulina;

Factor reumatoide (RF);

Anticuerpos antinucleares (ANA): HEp2 IIF (título y patrón);

Autoanticuerpos citoplásmicos antineutrofílicos (ANCA): inmunofluorescencia para ANCA perinucleares y citoplásmicos e inmunoensayos confirmatorios para antiproteasa 3 y antimieloperoxidasa.

• Pruebas serológicas: HBsAg, anticuerpo nuclear de hepatitis B, anticuerpos anti-HCV, anticuerpos anti-HIV1 y anti-HIV2;

• Muestras sanguíneas de archivo: Se prepararon muestras se suero y plasma y se almacenaron para un ensayo futuro de parámetros de laboratorio necesarios para apoyar la evaluación de seguridad. En particular, una observación de inflamación sostenida (p. ej., hsCRP >10 mg/l durante al menos 72 horas) o aparición de marcadores que surgen del tratamiento de vasculitis en múltiples sujetos puede conducir a un ensayo de biomarcadores exploratorios de la activación endotelial vascular.

Para el suero, se recogieron 10 ml de una muestra de sangre en un tubo seco con tapón rojo y, en menos de 15 minutos desde la recogida, se centrifugaron a aproximadamente 1500 g durante 10 minutos a 4°C; a continuación el suero se transfirió en partes alícuotas aproximadamente iguales (usando una pipeta de transferencia de plástico) a 3 tubos de almacenamiento, que inmediatamente se taparon y se congelaron en una posición vertical a -20°C o menos; Para el plasma, se recogieron 10 ml de una muestra de sangre en ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en un tubo con la parte superior púrpura y, en menos de 15 minutos desde la recogida, se centrifugaron a aproximadamente 1500 g durante 10 minutos a 4°C; a continuación el plasma se transfirió en partes alícuotas aproximadamente iguales (usando una pipeta de transferencia de plástico) a 3 tubos de almacenamiento, que inmediatamente se taparon y se congelaron en una posición vertical a -20°C o menos;

• Análisis de orina:

- Se recogió un espécimen de orina en medio de la micción y se sometió a los siguientes análisis.

- Un análisis con tiras reactivas para la detección de proteína, glucosa, sangre (heme), leucocitos, cuerpos cetónicos y pH. Un resultado de glucosa positivo se debe confirmar con una metodología alternativa para la glucosa según los procedimientos de trabajo estándar de los laboratorios clínicos locales. Tras la detección inicial de proteína, glucosa o sangre en la orina de un sujeto, se debe recoger un espécimen de orina adicional y someter a análisis de orina para la confirmación.

- El sedimento de la orina se debe examinar para, como mínimo, los siguientes elementos formados: glóbulos rojos, glóbulos rojos dismórficos, glóbulos blancos, células epiteliales renales, cilindros (hialinos, RBC, WBC, granulares, cerosos, grasos, de células renales), bacterias, levaduras y tricomonas. La abundancia de cada uno de estos elementos se debe puntuar usando terminología de laboratorio estándar y unidades en uso en el laboratorio local (p. ej., número de células por campo de alta potencia, pocas, abundantes). Cualesquiera observaciones inusuales adicionales se deben apuntar en los informes.

- Microalbúmina en orina: ensayo cuantitativo de albúmina y creatinina y cálculo de la relación albúmina/creatinina (pg/mg).

• Cribado de fármacos en orina: anfetaminas/metanfetaminas, barbituratos, benzodiacepinas, cannabinoides, cocaína, opiáceos;

• Prueba de alcoholemia en aliento o sangre;

• Efectos adversos, presentados espontáneamente por el sujeto u observados por el investigador, se comprobaron para la definición de los episodios adversos y las respuestas relacionadas);

• ECGs de 12 terminales estándar.

Cuando se programaban signos vitales, ECG y muestras sanguíneas al mismo tiempo que una administración de un producto de investigación y/o una comida, se realizaron antes de la toma del IP y/o la comida. Siempre que coincidieran las medidas de signos vitales, ECG y muestreo de sangre para la PK o la seguridad, se respetaba el siguiente orden: ECG, signos vitales, muestras para PK y muestras para seguridad.

Se registraron ECGs de doce terminales después de al menos 10 minutos en posición supina usando un dispositivo electrocardiográfico. Los electrodos se colocaron en el mismo lugar para cada registro de ECG a lo largo del estudio (los sitios de unión de los terminales se marcarán con rotulador indeleble).

Cada ECG consistía en un registro de 10 segundos de los 12 terminales simultáneamente, conduciendo a:

- Una sola impresión de ECG de 12 terminales (25 mm/s, 10 mm/mV) con ritmo cardíaco, PR, QRS, QT, evaluación de la corrección automática de QTc, incluyendo fecha, tiempo, iniciales y número del sujeto, firma del médico investigador y al menos 3 complejos para cada terminal. La opinión médica del investigador y los valores automáticos se registraron en el eCRF. Esta impresión se mantuvo en el centro. Como una excepción, se obtuvieron registros por triplicado el Día 1 antes de la dosificación.

La piel alrededor de la zona periumbilical se examinó con respecto a reacciones potenciales a la inyección SC. El diámetro máximo de eritema e hinchazón (incluyendo induración y/o edema) se midió separadamente en milímetros y se registró. El eritema y la hinchazón se graduaban separadamente como sigue de un modo similar a la guía de la FDA sobre la evaluación de vacunas. Si no había un cambio que surge del tratamiento en un parámetro en el momento de la observación, se registraba un valor de 0.

Tabla 13 - Escala de graduación de toxicidad para la tolerabilidad local

Leve Moderada Grave Potencialmente letal Eritema/Enrojecimiento 2,5 - 5,0 cm 5,1 - 10,0 cm >10,0 cm Necrosis o dermatitis exfoliativa Hinchazón/Induración/Edema 2,5 - 5,0 cm y no 5,1 - 10,0 cm o >10,0 cm o Necrosis interfiere con la interfiere con la impide la

actividad actividad actividad diaria

Además, cada uno del grado de picazón y la aparición de pápulas, pústulas y vesiculación se puntuó usando la siguiente escala de graduación:

0 = Nada; 1 = Poco perceptible; 2 = Leve; 3 = Moderada; 4 = Grave

Las reacciones cutáneas de intensidad moderada o peores se presentaron como episodios adversos. La presencia o la ausencia de los siguientes síntomas u observaciones superficiales se registraron sin graduación: erosión, sequedad, descamación, agrietamiento, formación de costras y glaseado.

Además, la intensidad del dolor presente se registró usando la siguiente escala de valoración numérica verbal (autoevaluación por el sujeto de estudio) basada en un subconjunto del Cuestionario de dolor de McGill. Una puntuación del dolor evaluada por el sujeto de >3 se presentará como un episodio adverso.

0 = Sin dolor; 1 = Leve; 2 = Incómodo; 3 = Angustioso; 4 = Horrible; 5 = Insoportable

Farmacocinética

Todas las recogidas de sangre para el análisis PK de huTBTI3_2_1 PK se programaron para que se produjeran dentro de ±15% de los tiempos de muestreo. El número de muestras de plasma por sujeto y el número total de muestras para el estudio se dan en la Tabla 14.

Tabla 14. Parte TDU - número de muestras de plasma recogidas para ensayos de huTBTI3_2_1

Total por sujeto 17

Total para el estudio (32 sujetos)a 544

a Cuatro (4) grupos de dosis de 8 sujetos; sin incluir el 5° grupo de dosis opcional

Tabla 15. Resumen de procedimientos de manejo de muestras para ensayos de huTBTI3_2_1

Volumen de la Muestra de Sangre 4 ml

Anticoagulante Citrato sódico

Separación de Partes Alícuotas de Plasma Sí

Condiciones de Almacenamiento del Plasma <-20°C

Condiciones de Transporte del Plasma Sobre hielo seco

Se usó un ELISA para la cuantificación de huTBTI3_2_1 en plasma humano. Se usa IL-4 biotinilada revestida sobre una placa de estreptavidina para capturar huTBTI3_2_1, que a continuación se detecta mediante IL-13 con etiqueta sulfo. Este formato, que usa detección electroquimioluminiscente, es capaz de detectar huTBTI3_2_1 que retiene al menos 1 sitio de unión desocupado para IL-4 y 1 sitio de unión desocupado para IL-13. Puesto que las concentraciones en plasma de huTBTI3_2_1 estaban presentes típicamente en un gran exceso molar en comparación con las concentraciones de IL-4 e IL-13, el ensayo reflejaba concentraciones totales de huTBTI3_2_1.

La interferencia potencial de ADA con medidas de huTBTI3_2_1 se tuvo en cuenta cuando se ensayaban muestras clínicas.

Tabla 16. Resumen del método bioanalítico para huTBTI3_2_1

Analito huTBTI3_2_1

Matriz Plasma

Técnica Analítica ELISA

Límite Inferior de Cuantificación 50 ng/ml (a confirmar al final de la validación)

Analito huTBTI3_2_1

Volumen de ensayo 100 pl

Lugar del Bioanálisis Bertin Pharma (CRO) Saclay, Francia

Referencia del Método DOH0850 (validación en proceso)

ELISA = ensayo de inmunoadsorción con enzimas ligadas

Para el análisis de anticuerpos anti-huTBTI3_2_1 (ADA) potenciales en plasma humano, se usó un ELISA cualitativo de puenteo usando detección electroquimioluminiscente. Un corte que proporcione un grado de 5% de falsos positivos, por encima del cual una muestra de plasma se consideraba potencialmente positiva para anticuerpo antihuTBTI3_2_1, se usó en cada ensayo de cribado.

A continuación, las muestras positivas en el ensayo de cribado se probaron en un ensayo confirmatorio (competición con huTBTI3_2_1) a fin de demostrar la presencia de anticuerpos y eliminar resultados positivos falsos generados a partir del ensayo de cribado inicial. La interferencia de huTBTI3_2_1 en el ensayo de ADA estaba documentada de modo que se conocía la concentración de fármaco más alta que no afectaba al límite de detección de ADA y la interpretación de la inmunogenicidad tenía en cuenta este parámetro.

Tabla 17. Resumen del método bioanalítico para anticuerpos anti-huTBTI3_2_1

Analito Anticuerpos anti-huTBTI3_2_1

Matriz Plasma

Técnica Analítica ELISA (ensayos de cribado y confirmación)

Sensibilidad <100 ng/ml

Volumen de ensayo 100 pl

Lugar del Bioanálisis Montpellier, Francia

Referencia del Método DOH0851

ELISA = ensayo de inmunoadsorción con enzimas ligadas

Las concentraciones en plasma se usaron para determinar los parámetros PK de huTBTI3_2_1 listados en la Tabla 18 usando técnicas no compartimentales estándar.

Tabla 18 - Lista de parámetros farmacocinéticos para huTBTI3_2_1 plasmático y definiciones

Parámetros _________________________ Definición/Cálculo_________________________

Cmáx Concentración en plasma máxima observada

tmáx Primer tiempo para alcanzar Cmáx

AUCúltima Superficie bajo la curva de concentración en plasma frente al tiempo calculada

usando el método trapezoidal desde tiempo cero hasta tiempo real

AUC Superficie bajo la curva de concentración en plasma frente al tiempo

extrapolada al infinito según la siguiente ecuación:

CCu ltim a

A U C - A U C últim a

CZ

túltimo Tiempo correspondiente a la última concentración por encima del límite de

cuantificación, Cúltima

t1/2z Semivida terminal asociada con la pendiente terminal (Az) determinada según

la siguiente ecuación:

0.693

x\nz ~ :

donde Az es la pendiente de la línea de regresión de la fase terminal de la

curva de concentración en plasma frente al tiempo, a escala semilogarítmica.

La semivida se calcula al tomar la regresión de al menos 3 puntos.

CL/F Depuración corporal total aparente de un fármaco desde el plasma calculada

usando la siguiente ecuación:

CL D o s i s

~F = A U C

Vss/F Volumen aparente de distribución en estado estacionario después de ausencia

de administración intravenosa

Vss/F=CL/F *MRT

Tabla 19. Volumen de sangre muestreado

Tipo Volumen por muestra Número de muestras Total Pruebas serológicas 5 mL 1 5 mL Hematología 3 mL 13a 39 mL Bioquímica sérica con hsCRP y cTnI 10 mL 13a 130 mL Coagulación (PT, INR, fibrinógeno y aPTT) 3 mL 13a 39 mL Subconjuntos de linfocitos 4 mL 6 24 mL Farmacogenética para ADN almacenado 6 mL 1 6 mL Farmacocinética huTBTI3_2_1 4 mL 17 68 mL Inmunogenicidad de huTBTI3_2_1 (ADA) 4 mL 5 20 mL Muestra de archivo - suero 10 mL 5 50 mL Muestra de archivo - plasma en EDTA 10 mL 5 50 mL Pruebas de vasculitis complementarias (suero 10 mL 6b 60 mL congelado)

Crioglobulina (suero a temperatura ambiente) 10 mL 6b 60 mL TOTAL 551 mL a Incluye visita opcional cada 6 meses

b Incluye 5 muestras adicionales (más allá del punto de referencia el Día -1) para ser recogidas solo si se observan elevaciones en hsCRP >10 mg/l durante >72 horas.

Abreviaturas: ADA = anticuerpos contra fármaco; aPTT = tiempo de tromboplastina parcial activado; cTnI = troponina cardíaca I; EDTA = ácido etilendiaminotetraacético; hsCRP = proteína C reactiva de alta sensibilidad; INR = relación normalizada internacional; PT = tiempo de protrombina.

Para Cmáx, AUCúltima, AUC, la proporcionalidad de la dosis se evaluó usando el modelo de potencia empírica (Parámetro PK = a x dosisP), junto con una interpretación "estimada", según las recomendaciones de Gough y cols Pharmacokinetics UK Joint Working Group Drug Infor J 1995:29:1039-1048.

El modelo de potencia de ajustará a la escala transformada logarítmicamente:

log(parámetro) = log(a) Bxlog(dosis) Error

Una falta de ajuste modélica se evaluó mediante gráficas residuales, y mediante una prueba de la F del cuadrado de la media residual frente al cuadrado de la media residual del error puro. Si el ajuste modélico es adecuado, se obtenían estimaciones con intervalos de confianza de 90% para p, y se usaba además para obtener estimaciones e intervalos de confianza de 90% para el incremento del parámetro PK asociado con un incremento de r veces (r = 2 y r = dosis alta/dosis baja) en la dosis, al exponer r a las potencias de la estimación de p ("b") y límites de confianza:

, b ± t x SE(b)

Si hay evidencia de una falta de ajuste modélica, entonces se realizaron intentos de ajustar el modelo a lo largo de un intervalo de dosis reducido (p. ej., exclúyase el nivel de dosis extremo 1). De otro modo, se usaba un modelo de efecto fijado, con un término fijado para la dosis, usando logaritmos de los parámetros PK pertinentes. Se obtuvieron estimaciones con intervalos de confianza de 90% para los incrementos del parámetro asociados con incrementos de dosis por pares al computar en primer lugar estimaciones con intervalos de confianza para las diferencias entre grupos de dosis por pares en el marco del modelo de efectos fijados, y a continuación convertir en relaciones usando la transformación antilogarítmica.

Para t ¹/²z, el efecto de la dosis se evaluará con un modelo de efectos fijos lineal,

Log(t^1/2z) = Dosis Error

La estimación puntual y el intervalo de confianza de 90% para la media geométrica de t¹/²z se proporcionaron reunidos a través de niveles de dosis y separadamente para cada grupo de dosis. La distribución de los valores de tmáx se representó mediante gráficas de histograma para cada nivel de dosis.

Definición de Episodio Adverso y Episodio Adverso Grave

Un episodio adverso es cualquier presencia médica inconveniente en un sujeto al que se ha administrado un producto farmacéutico y que no tiene que tener necesariamente una relación causal con este tratamiento.

Un episodio adverso grave es cualquier presencia médica inconveniente que en cualquier dosis:

• Da como resultado la muerte o

Es potencialmente mortal o

- Nota: El término "potencialmente mortal" en la definición de "grave" se refiere a un episodio en el que el sujeto tenía riesgo de muerte en el momento del episodio; no se refiere a un episodio que hipotéticamente podría haber causado la muerte si fuera más grave.

Requiere hospitalización del paciente o prolongación de una hospitalización existente, o

Da como resultado discapacidad/incapacidad persistente o significativa, o

Es una anormalidad congénita/un defecto de nacimiento, o

Es un episodio médicamente importante:

- Se debe ejercer el juicio médico y científico para decidir si un informe acelerado es apropiado en otras situaciones, tales como episodios médicos importantes que pueden no ser inmediatamente potencialmente mortales o dar como resultado la muerte o la hospitalización pero pueden poner en peligro al sujeto o pueden requerir una intervención para evitar 1 de los otros resultados listados en la definición anterior.

Nota: Como guía para determinar qué condiciones son médicamente importantes, se proporcionan los siguientes ejemplos, aunque no pretenden ser exhaustivos:

tratamiento intensivo en un servicio de urgencias o a domicilio de broncoespasmo alérgico;

discrasias sanguíneas tales como agranulocitosis, anemia aplástica, aplasia de la médula ósea, mielodisplasia, pancitopenia;

convulsiones;

alanina aminotransferasa (ALT) >3 x del límite superior del intervalo normal (ULN) asociada con bilirrubina total >2 x ULN; incremento de ALT asintomático >10 x ULN; o

desarrollo de dependencia de fármacos o abuso de fármacos.

Episodios adversos que requieren que el patrocinador sea informado inmediatamente:

• incremento de ALT >2 x ULN

hsCRP >10 mg/l durante >72 horas

troponina cardíaca I (cTnI) >2 x ULN

Si se observa cTnI >2 x ULN, los valores de cTnI, creatina cinasa (CK) y fracción B miocárdica de creatina cinasa (CK-MB) se deben rastrear en serie (con un mínimo en una recogida de sangre adicional inmediata y al día siguiente), junto con registros de ECG adicionales, hasta que los resultados de la prueba vuelven a la normalidad. Se debe considerar la consulta de un cardiólogo de inmediato si persisten elevaciones en cTnI, la relación de CK-MB/CK es elevada y/o se observan anormalidades que surgen del tratamiento en registros de ECG.

QTc >500 ms

En presencias de una prolongación de una medida automática de QTc >500 ms, confirmada por una lectura manual por el investigador, o un médico delegado por el investigador, usando la fórmula de Fridericia para corregir QT, el sujeto se debe poner bajo supervisión en un entorno especializado. Se recogerán muestras de sangre apropiadas (p. ej. para cTnI). La comprobación posterior por ECG del sujeto se debe realizar a continuación sobre una base regular y clínicamente sensible hasta que el intervalo de QTc vuelva a un valor seguro según se determina por el investigador de acuerdo con el patrocinador.

• Reacciones cutáneas intensas locales a la zona de inyección de IP

• Sobredosis sintomática con IP

- Una sobredosis (accidental o intencionada) con el IP es un episodio sospechado por el investigador o notificado espontáneamente por el sujeto (no basado en un recuento sistemático de viales de IP) y se define como al menos dos veces de la dosis pretendida.

Anormalidades de laboratorio incluyen:

• Neutropenia,

- Definida como recuento en sangre de neutrófilos <1500/mm3 (pero <1000/mm3 en sujetos de descendencia africana)

• Trombocitopenia,

- Definida como recuento de plaquetas <100000/mm3

• Insuficiencia renal aguda

- Incremento rápido en creatinina en suero por encima de 150 gmol/l (1,7 mg/dl)

• Sospecha de rabdomiolisis

Ejemplo 10: Resultados procedentes del estudio aleatorizado, con doble enmascaramiento, controlado por placebo, de la seguridad, la tolerabilidad y la farmacocinética de dosis subcutáneas individuales ascendentes de SAR1 56597 en varones jóvenes sanos (TDU11325)

Las siguientes Tablas, Tablas 20 - 35, resumen los datos procedentes del estudio de TDU11325.

Tabla 20 : Disposición de los sujetos

SAR156597

Placebo 10 mg 20 mg 40 mg 80 mg 150 mg 300 mg Aleatorizados y tratados 12 6 6 6 6 6 6 PGM=PRODOPS/SAR156597/TDU11325/CSR/REPORT/PGM/dis dsover s t.sas OUT=REPORT/OUTPUT/dis_dsover_s_t_i.rtf (08MAR2012 - 15:31)

Tabla 21: Población de análisis

SAR156597

Placebo 10 mg 20 mg 40 mg 80 mg 150 mg 300 mg Todos Población de seguridad 12 6 6 6 6 6 6 48 Población farmacocinética 0 6 6 5 6 6 6 35 Población farmacodinámica 12 6 6 6 6 6 6 48 PGM=PRODOPS/SAR156597/TDU11325/CSR/REPORT/PGM/dis_popover_a_t.sas OUT=REPORT/OUTPUT/dis_popover_a_t_i.rtf (08MAR2012 - 15:31)_____________

Tabla 22. Demografía y características de los sujetos

en el punto de referencia - población de seguridad

SAR156597

Placebo 10 mg 20 mg 40 mg 80 mg 150 mg 300 mg (N=6) Todos (N=12) (N=6) (N=6) (N=6) (N=6) (N=6) (N=48) Edad (años)

Número 12 6 6 6 6 6 6 48

29,5 30,5 33,0 30,6 Media (SD) 31,7 (8,7) (5,7) 29,0 (7,4) (7,3) (6,7) 30,0 (7,8) 29,3 (7,4) (7,2) Mediana 30,0 29,5 25,0 33,0 34,5 29,0 27,5 30,0 Mín : Máx 22 : 44 22 : 39 24 : 42 19 : 37 21 : 41 21 : 41 21 : 40 19 : 44

Sexo [n (%)]

Número 12 6 6 6 6 6 6 48

6 6 48 Varón 12 (100%) (100%) 6 (100%) 6 (100%) (100%) 6 (100%) 6 (100%) (100%) Raza [n (%)]

Número 12 6 6 6 6 6 6 48

4 5 4 35 Caucasiana/Blanca 9 (75,0%) (66,7%) 5 (83,3%) (83,3%) (66,7%) 4 (66,7%) 4 (66,7%) (72,9%)

1 4 Negra 1 (8,3%) 0 0 0 (16,7%) 0 2 (33,3%) (8,3%)

1 2 Asiática/Oriental 1 (8,3%) 0 0 0 (16,7%) 0 0 (4,2%)

2 1 7 Otras 1 (8,3%) (33,3%) 1 (16,7%) (16,7%) 0 2 (33,3%) 0 (14,6%) Peso (kg)

Número 12 6 6 6 6 6 6 48

76,23 78,55 71,67 79,85 79,30 77,92 80,32 77,51 Median (SD) (9,56) (10,50) (8,57) (8,95) (11,33) (8,39) (15,89) (10,22) Mediana 76,80 78,80 70,40 82,60 81,50 76,20 83,80 76,80 Mín : Máx 60,3 : 93,1 67,5: 62,2: 87,0 64,4: 59,8 : 67,6: 91,3 53,0 : 95,0 53.0 :

88,7 89,7 94,1 95.0

PGM=PRODOPS/SAR156597/TDU11325/CSR/REPORT/PGM/dem_dmsc_s_t.sas OUT=REPORT/OUTPUT/dem_dmsc_s_t_i.rtf (08MAR2012 - 15:32)_____________

Tabla 23. Visión general del perfil de episodios adversos: episodios adversos

que surgen del tratamiento - población de seguridad

n(%) Placebo SAR156597

(N=12) _{10 mg} 20 mg 40 mg 80 mg 150 mg 300 mg (N=6) (N=6) (N=6) (N=6) (N=6) (N=6) Sujetos con algún TEAE 11 (91,7%) 3 (50,0%) 4 (66,7%) 4 (66,7%) 4 (66,7%) 5 (83,3%) 3 (50,0%) Sujetos con algún TEAE grave 1 (8,3%) 0 0 0 0 0 0 Sujetos con algún SAE derivado

del tratamiento 0 0 0 0 0 1 (16,7%) 0 Sujetos con algún TEAE que na conduce a la interrupción

permanente del tratamiento na na na na na na

EAE: Episodio adverso que surge del tratamiento, SAE: Episodio adverso grave

na = no aplicable

N = Número de sujetos tratados con cada grupo, n (%) = número y % de sujetos con al menos un TEAE en cada categoría

Nota: Un episodio adverso se considera derivado del tratamiento si se produce desde el momento de la primera administración del producto de investigación (IP) hasta el final de la visita de estudio (incluida).

PGM=PRODOPS/SAR156597/TDU11325/CSR/REPORT/PGM/ae_aeover_s_t.sas OUT=REPORT/OUTPUT/ae_aeover_s_t_i.rtf (08MAR2012 -15:31)_____________

Tabla 24. Número (%) de sujetos con TEAE(s) mediante SOC Primario y PT - población de seguridad

Clase de órgano del sistema Placebo SAR156597

primario (N=12) - 10 mg 20 mg 40 mg 80 mg 150 mg 300 mg Termino preferido [n (%)] (N=6) (N=6) (N=6) (N=6) (N=6) (N=6)

3

Cualquier clase 11 (91,7%) (50,0%) 4 (66,7%) 4(66,7%) 4 (66,7%) 5 (83,3%) 3 (50,0%)

2

Infecciones e infestaciones 2 (16,7%) (33,3%) 1 (16,7%) 1(16,7%) 2 (33,3%) 1 (16,7%) 2 (33,3%) Mononucleosis infecciosa 0 0 0 0 0 0 1 (16,7%) Infección del tracto respiratorio 1

superior 2 (16,7%) (16,7%) 0 1 (16,7%) 0 0 1 (16,7%) Bronquitis 0 0 0 0 0 1 (16,7%) 0 Conjuntivitis infectiva 0 0 0 0 1 (16,7%) 0 0

1

Gastroenteritis 0 (16,7%) 0 0 0 0 0 Impétigo 0 0 0 0 1 (16,7%) 0 0

1

Faringitis 0 (16,7%) 1 (16,7%) 0 0 0 0

Trastornos de la sangre y el

sistema linfático 0 0 0 1 (16,7%) 0 0 1 (16,7%) Neutropenia 0 0 0 0 0 0 1 (16,7%) Eosinofilia 0 0 0 1 (16,7%) 0 0 0

Trastornos del metabolismo y la

nutrición 0 0 1 (16,7%) 0 0 0 0 Disminución del apetito 0 0 1 (16,7%) 0 0 0 0 Clase de órgano del sistema Placebo SAR156597

primario (N=12) _{10 mg} 20 mg 40 mg 80 mg 150 mg 300 mg Termino preferido [n (%)] (N=6) (N=6) (N=6) (N=6) (N=6) (N=6)

1

Trastornos del sistema nervioso 4 (33,3%) (16,7%) 0 2 (33,3%) 2 (33,3%) 2 (33,3%) 0 Amnesia 0 0 0 1 (16,7%) 0 0 0 Mareo 1 (8,3%) 0 0 0 0 1 (16,7%) 0

1

Cefalea 3 (25,0%) (16,7%) 0 2 (33,3%) 2 (33,3%) 2 (33,3%) 0 Contracciones musculares

involuntarias 1 (8,3%) 0 0 0 0 0 0 Presíncope 1 (8,3%) 0 0 0 0 0 0 Cefalea sinusal 0 0 0 1 (16,7%) 0 0 0 Trastornos cardíacos 0 1 0 0 0 0 0

(16,7%)

Palpitaciones 0 1 0 0 0 0 0

(16,7%)

Trastornos vasculares 0 1 0 0 0 1 (16,7%) 0

(16,7%)

Trombosis venosa profunda 0 0 0 0 0 1 (16,7%) 0 Hipotensión ortostática 0 1 0 0 0 0 0

(16,7%)

Trastornos respiratorios, 2 (16,7%) 2 1 (16,7%) 1 (16,7%) 0 2 (33,3%) 1 (16,7%) torácicos y mediastinales (33,3%)

Tos 1 (8,3%) 0 0 0 0 0 1 (16,7%) Disnea 1 (8,3%) 1 0 0 0 0 0

(16,7%)

Congestión nasal 0 1 1(16,7%) 1(16,7%) 0 1 (16,7%) 0

(16,7%)

Dolor orofaríngeo 0 0 0 0 0 1 (16,7%) 0 Neumotórax 0 0 0 0 0 1 (16,7%) 0

Trastornos gastrointestinales 3 (25,0%) 0 0 0 2 (33,3%) 3 (50,0%) 1 (16,7%) Estreñimiento 0 0 0 0 0 1 (16,7%) 1 (16,7%) Diarrea 1 (8,3%) 0 0 0 0 0 1 (16,7%) Dolor abdominal 0 0 0 0 1 (16,7%) 0 0 Dispepsia 1 (8,3%) 0 0 0 0 0 0 Hernia inguinal 1 (8,3%) 0 0 0 0 0 0 Nauseas 1 (8,3%) 0 0 0 0 2 (33,3%) 0 Dolor de muelas 0 0 0 0 1 (16,7%) 0 0 Vómitos 0 0 0 0 0 1 (16,7%) 0

Trastornos de la piel y el tejido 2 (16,7%) 0 0 1 (16,7%) 0 1 (16,7%) 0 subcutáneo

Dermatitis de contacto 2 (16,7%) 0 0 1 (16,7%) 0 1 (16,7%) 0 Pápula 0 0 0 0 0 1 (16,7%) 0

Trastornos del tejido 2 (16,7%) 0 2 (33,3%) 1 (16,7%) 1 (16,7%) 0 1 (16,7%) musculoesquelético y conectivo

Dorsalgia 0 0 1 (16,7%) 1 (16,7%) 0 0 1 (16,7%) Clase de órgano del sistema Placebo SAR156597

primario (N=12) _{10 mg} 20 mg 40 mg 80 mg 150 mg 300 mg Termino preferido [n (%)] (N=6) (N=6) (N=6) (N=6) (N=6) (N=6) Rigidez musculoesquelética 0 0 0 0 0 0 1 (16,7%) Mialgia 1 (8,3%) 0 1 (16,7%) 0 1 (16,7%) 0 0 Miosotis 1 (8,3%) 0 0 0 0 0 0 Dolor de cuello 0 0 1 (16,7%) 1(16,7%) 0 0 0

Trastornos renales y urinarios 0 0 1 (16,7%) 0 0 0 0 Hematuria 0 0 1 (16,7%) 0 0 0 0

Trastornos generales y afecciones 2 (16,7%) 1 1 (16,7%) 0 1 (16,7%) 0 0 en la zona de administración (16,7%)

Fatiga 1 (8,3%) 0 0 0 1 (16,7%) 0 0 Dolor gripal 1 (8,3%) 0 0 0 0 0 0 Eritema en la zona de inyección 1 (8,3%) 0 1 0 0 0 0 0 Pirexia 0 (16,7%) 1 (16,7%) 0 0 0 0

Investigaciones 2 (16,7%) 0 1 (16,7%) 0 0 0 2 (33,3%) Incremento de aspartato 0 0 0 0 0 0 1 (16,7%) aminotransferasa

Incremento de creatina 1 (8,3%) 0 1(16,7%) 0 0 0 1 (16,7%) fosfocinasa en sangre

Incremento de proteína C reactiva 0 0 0 0 0 0 1 (16,7%) Prueba de función hepática 0 0 0 0 0 0 1 (16,7%) anormal

Tiempo de tromboplastina parcial 1 (8,3%) 0 0 0 0 0 0 activado prolongado

Incremento de transaminasas 1 (8, 3%) 0 0 0 0 0 0

Lesión, envenenamiento y 3 (25,0%) 0 1 (16,7%) 0 1 (16,7%) 3( 50,0%) 0 complicaciones del procedimiento

Picadura de artrópodos 1 (8,3%) 0 0 0 0 1 (16,7%) 0 Contusión 0 0 1 (16,7%) 0 1(16,7%) 0 0 Excoriación 1 (8,3%) 0 1(16,7%) 0 0 2(33,3%) 0 Laceración 1 (8,3%) 0 0 0 0 0 0 Fracturas múltiples 0 0 0 0 0 1 (16,7%) 0 Distensión muscular 0 0 0 0 0 1 (16,7%) 0 Accidente de tráfico 0 0 1 (16,7%) 0 0 1 (16,7%) 0

TEAE: Episodio adverso derivado del tratamiento, SOC: Clasificación por órganos y sistemas, PT: Término preferido MedDRA 14.1

N = Número de sujetos tratados dentro de cada grupo, n (%) = número y % de sujetos con al menos un TEAE en cada categoría

Nota: Tabla clasificadas por SOC internacionalmente de acuerdo con el orden y la frecuencia decreciente de PT en el grupo de 300 mg de SAR156597

Nota: Un episodio adverso se considera derivado del tratamiento si se produce desde el momento de la primera administración del producto de investigación (IP) hasta el final de la visita de estudio (incluida).

PGM=PRODOPS/SAR156597/TDU11325/CSR/REPORT/PGM/ae_iaeteae_s_t.sas OUT=REPORT/OUTPUT/ae_iaeteae_s_t_i.rtf (08MAR2012 - 15:32)

Tabla 27. Listado de sujetos con PCSAs combinados

para la función hepática - población de seguridad

Sin presencia

PCSA: Anormalidades potencialmente clínicamente significativas (Versión de 14-SEP-2009)

ULN = Límite superior del intervalo normal, r = valores revisados nuevamente, B = Valor de referencia

* = ALT > 3 ULN y Bilirrubina total > 2 ULN durante el estudio, siendo con al menos uno de ellos después de la dosificación

n° = Bilirrubina conjugada > 35% de Bilirrubina total y Bilirrubina total > 1,5 ULN en la misma muestra después de la dosificación

+/++ = Valor anormal que alcanza un 12/22 límite de PCSA superior

Nota: Se considera que un PCSA es durante el tratamiento si se produce desde el momento de la primera administración del producto de investigación (IP) hasta el final de la visita de estudio (incluida).

PGM=PRODOPS/SAR156597/TDU11325/CSR/REPORT/PGM/lab_lbhep_s_l.sas OUT=REPORT/OUTPUT/lab_lbhep_s_l_i.rtf (08MAR2012 - 15:33)___________________________________________

Tabla 28. Listado de hsCRP > 10 mg/l durante al menos 72 horas

Grupo de tratamiento Sujeto Visita Tiempo teór. Muestra Código lab. hsCRP (mg/l)

Fecha Hora

SAR156597 150 mg 840001039 D-1 2011-06-07 09:57 840000276 0,8B D1 T8H 2011-06-08 16:25 840000276 0,5 D2 T24H 2011-06-09 08:25 840000276 0,5 D3 T48H 2011-06-10 08:25 840000276 0,5 D4 T72H 2011-06-11 08:38 840000276 0,7 D5 2011-06-12 08:14 840000276 0,7 D8 2011-06-15 08:53 840000276 0,8 D15 2011-06-22 09:00 840000276 1,6 D29 2011-07-06 10:10 840000276 18,8H+ r 2011-07-14 11:44 840000276 13,9H+ D57 2011-08-03 10:13 840000276 1,2 EOS 2011-08-31 10:25 840000276 0,9 r 2011-10-13 10:36 840000276 2,2 FUP 2011-12-01 10:56 840000276 1,3 r 2012-02-06 10:59 840000276 0,8 SAR156597300 mg 840001046 D-1 2011-11-15 08:05 840000276 0,4B D1 T8H 2011-11-16 17:35 840000276 0,4 D2 T24H 2011-11-17 09:35 840000276 0,3 D3 T48H 2011-11-18 09:35 840000276 0,2 D4 T72H 2011-11-19 09:35 840000276 0,6 D5 2011-11-20 09:35 840000276 0,6 D8 2011-11-23 08:14 840000276 0,3 D15 2011-11-30 08:21 840000276 0,3 D29 2011-12-14 08:21 840000276 0,7 D57 2012-01-11 08:25 840000276 0,3 EOS 2012-02-08 08:32 840000276 37,0H+ r 2012-02-10 07:55 840000276 91,5H+ r 2012-02-13 08:17 840000276 23,6H+ r 2012-02-27 08:07 840000276 0,5 L o H : Valor anormal < LLN o > ULN, -/-- o /++ : Valor anormal que alcanza un límite de PCSA inferior 12/22 o uno superior 12/22

PCSA: Anormalidades potencialmente clínicamente significativas (Versión de 14-SEP-2009) LLN/ULN = Límite inferior/superior del intervalo normal, r = valores revisados nuevamente, B = Valor de referencia

La referencia es el Día-1

PGM=PRODOPS/SAR156597/TDU11325/CSR/REPORT/PGM/lab hscrp s .sas OUT=REPORT/OUTPUT/lab_hscrp_s_l_1_i.rtf (08MAR2012 - 15:34)

Tabla 29. Listado de sujetos con hsCRP > 20 mg/l durante 2 recogidas de sangre consecutivas separadas >=

24 horas

Grupo de tratamiento Sujeto Visita Tiempo teór. Muestra Código lab. hsCRP (mg/l)

Fecha Hora

SAR156597300 mg 840001046 D-1 2011-11-15 08:05 840000276 0,4B

D1 T8H 2011-11-16 17:35 840000276 0,4

D2 T24H 2011-11-17 09:35 840000276 0,3

D3 T48H 2011-11-18 09:35 840000276 0,2

D4 T72H 2011-11-19 09:35 840000276 0,6

D5 2011-11-20 09:35 840000276 0,6

D8 2011-11-23 08:14 840000276 0,3

D15 2011-11-30 08:21 840000276 0,3

D29 2011-12-14 08:21 840000276 0,7

D57 2012-01-11 08:25 840000276 0,3

EOS 2012-02-08 08:32 840000276 37,0H+

r 2012-02-10 07:55 840000276 91,5H+ r 2012-02-13 08:17 840000276 23,6H+ r 2012-02-27 08:07 840000276 0,5

PGM=PRODOPS/SAR156597/TDU11325/CSR/REPORT/PGM/lab_hscrp_s_l.sas OUT=REPORT/OUTPUT/lab_hscrp_s_l_2_i.rtf (08MAR2012 - 15:34)

Tabla 30. Listado de sujetos con cTnI > 2ULN

Sin presencia

L o H : Valor anormal < LLN o > ULN, -/-- o /++ : Valor anormal que alcanza un límite de PCSA inferior 12/22 o uno superior 12/22

cTnI = Troponina cardíaca PGM=PRODOPS/SAR156 OUT=REPORT/OUTPUT/l

Tabla 31. Signos vitales - Número de sujetos con anormalidades (PCSA) durante el período de TEAE - población de seguridad

Parámetro de Placebo SAR156597

signos vitales (N=12) 10 mg 20 mg 40 mg 80 mg (N=6) 150 mg (N=6) 300 mg (N=6) (N=6) (N=6) (N=6)

Criterios de PCSA

n/N1

Presión sanguínea

sistólica

< 95 mm Hg y

dism. desde B > 20

mm Hg 0/12 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 > 140 mm Hg e

incr. desde B > 20

mm Hg 0/12 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 1/6 Presión sanguínea

diastólica

Parámetro de Placebo SAR156597

signos vitales (N=12) _{10 mg} 20 mg 40 mg 80 mg (N=6) 150 mg (N=6) 300 mg (N=6) (N=6) (N=6) (N=6)

Criterios de PCSA

n/N1

< 45 mmHg y

dism. desde B > 10

mm Hg 0/12 1/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

> 90 mm Hg e incr.

desde B > 10 mm Hg 0/12 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

Presión sanguínea

sistólica ortostática

< -20 mmHg 0/12 1/6 1/6 1/6 0/6 1/6 1/6

Presión sanguínea

diastólica ortostática

< -10 mm Hg 0/12 1/6 1/6 1/6 1/6 1/6 1/6

Ritmo cardíaco

< 40 bpm y dism.

desde B > 20 bpm 0/12 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

> 100 bpm e incr.

desde B > 20 bpm 0/12 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

Peso

> 5% dism, desde

B 2/12 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

> 5% incr. desde B 0/12 0/6 0/6 0/6 2/6 0/6 0/6

PCSA: Anormalidades potencialmente clínicamente significativas (Versión de 14-SEP-2009)

dism./incr. = disminución/incremento, B = Referencia

n/N1 = número de sujetos que cumplen los criterios al menos una vez / número de sujetos dentro de cada grupo que tenían ese parámetro determinado

Nota: Se considera que un PCSA es durante el tratamiento si se produce desde el momento de la primera administración del producto de investigación (IP) hasta el final de la visita de estudio (incluida).

Ortostática = erguida después de 3 minutos - supina después de 10 minutos

PGM=PRODOPS/SAR156597/TDU11325/CSR/REPORT/PGM/osa_vspcsa_s_t.sas

OUT=REPORT/OUTPUT/osa_vspcsa_s_t_i.rtf (08MAR2012-15:34)

Tabla 32. ECG - Número de sujetos con anormalidades (PCSA)

durante el período de TEAE - población de seguridad

Parámetro de ECG Placebo SAR156597

(lectura automática) *510 (N=12) 10 mg 20 mg 40 mg 80 mg 150 mg 300 mg (N=6) (N=6) (N=6) (N=6) (N=6) (N=6)

Criterios de PCSA n/N1

Ritmo cardíaco

< 40 bpm y dism. desde B

> 20 bpm 0/12 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

> 100 bpm e incr. desde

B > 20 bpm 0/12 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

Intervalo de PR

> 220 ms 1/12 1/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

Intervalo de QRS

> 120 ms 1/12 0/6 2/6 0/6 0/6 0/6 0/6

Intervalo de QTc

Límite: 431-450 ms

(Varón);

451-470 ms (Mujer) 3/12 0/6 0/6 2/6 1/6 3/6 0/6

Prolongado: > 450 ms

(Varón); >

470 ms (Mujer) 0/12 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

> 500 ms 0/12 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

Intervalo de QTc - cambio

desde el valor de referencia

Límite: Incr. desde B 30­

60 ms 2/12 2/6 1/6 1/6 1/6 0/6 0/6

Prolongado: Incr. desde

B > 60 ms 0/12 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

PCSA: Anormalidades potencialmente clínicamente significativas (Versión de 14-SEP-2009)

dism./incr. = disminución/incremento, B = Referencia

n/N1 = número de sujetos que cumplen los criterios al menos una vez / número de sujetos dentro de cada grupo que tenían ese parámetro determinado

Nota: Se considera que un PCSA es durante el tratamiento si se produce desde el momento de la primera administración del producto de investigación (IP) hasta el final de la visita de estudio (incluida).

PGM=PRODOPS/SAR156597/TDU11325/CSR/REPORT/PGM/osa_egpcsa_s_t.sas

OUT=REPORT/OUTPUT/osa_egpcsa_s_t_i.rtf (08MAR2012 - 15:33)_________________________________________ Tabla 33. Listado de sujetos con QTc y/o delta QTc prolongado >60 ms

(lectura automática) - población de seguridad

Sin presencia

PCSA: Anormalidades potencialmente clínicamente significativas (Versión de 14-SEP-2009)

B = Referencia, Delta = cambio desde el valor de referencia (B), r = valores revisados de nuevo

- o /++ : Valor anormal que alcanza el límite de PCSA inferior o uno superior 12/22

Nota: La referencia se define como la media de triplicados D1 antes de la dosificación

Nota: Se considera que un PCSA es durante el tratamiento si se produce desde el momento de la primera administración del producto de investigación (IP) hasta el final de la visita de estudio (incluida).

PGM=PRODOPS/SAR156597/TDU11325/CSR/REPORT/PGM/osa_egauprol_s_l.sas OUT=REPORT/OUTPUT/osa_egauprol_s_l_i.rtf (08MAR2012 - 15:33)

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Una solución que comprende:

- 100 mg/ml de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13,

- 6,3 mmol/l de fosfato sódico monobásico,

- 3,7 mmol/l de trometamina,

- 5% (peso/volumen) de sacarosa,

- 3% (peso/volumen) de prolina,

- 0,2% (peso/volumen) de polisorbato 80, y

- agua,

en donde el pH de dicha solución es de 7,0 y

en donde la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende (i) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las CDRs de las secuencias SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 y (ii) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las CDRs de las secuencias SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13, (iii) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las CDRs de las secuencias SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 y (iv) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las CDRs de las secuencias SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19 o las CDRs de las secuencias SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22,

en donde dicha solución comprende de 10 mg a 300 mg de dicha proteína tipo anticuerpo de la región V doble o su fragmento.

2. La solución según la reivindicación 1, en la que la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 2 y s Eq ID NO: 4.

3. La solución según la reivindicación 2, en la que la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende un ligador peptídico de modo que SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 estén ligadas entre sí con el ligador peptídico y SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4 estén ligadas entre sí con el ligador peptídico.

4. La solución según la reivindicación 3, en la que el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6.

5. Una solución para el uso como un medicamento para tratar el asma o la fibrosis pulmonar idiopática en un ser humano,

en donde dicha solución comprende:

- 100 mg/ml de una proteína tipo anticuerpo de la región V doble o un fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble que se une específicamente a IL-4 e IL-13,

- 6,3 mmol/l de fosfato sódico monobásico,

- 3,7 mmol/l de trometamina,

- 5% (peso/volumen) de sacarosa,

- 3% (peso/volumen) de prolina,

- 0,2% (peso/volumen) de polisorbato 80, y

- agua,

en donde el pH de dicha solución es de 7,0,

en donde la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende (i) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las CDRs de las secuencias SEQ ID NO: 8, SEQ Id NO: 9 y SEQ ID NO: 10, (ii) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las CDRs de las secuencias SEQ ID NO: 11, SEQ ID n O: 12 y SEQ ID NO: 13, (iii) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las CDRs de las secuencias SEQ ID NO: 14, SEQ iD n O: 15 y SEQ ID NO: 16 y (iv) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las CDRs de las secuencias SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19 o las CDRs de las secuencias SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, y

en donde dicha solución se administra subcutáneamente en una dosis terapéutica segura de proteína tipo anticuerpo de la región V doble o su fragmento de 10 mg a 300 mg.

6. La solución para el uso según la reivindicación 5, en la que la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende una cadena ligera variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4.

7. La solución para el uso según la reivindicación 6, en la que la proteína tipo anticuerpo de la región V doble o el fragmento de una región tipo anticuerpo de la región V doble comprende un ligador peptídico de modo que SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 estén ligadas entre sí con el ligador peptídico y SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4 estén ligadas entre sí con el ligador peptídico.

8. La solución para el uso según la reivindicación 7, en la que el ligador peptídico consiste en SEQ ID NO: 6.