ES2859608T3 - Hidrolizado de pichia minuta - Google Patents
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Abstract
Principio activo cosmético caracterizado porque es un hidrolizado de Pichia minuta.
Description
DESCRIPCIÓN
Hidrolizado de pichia minuta
La presente invención se refiere a un principio activo cosmético particular obtenido por hidrólisis de una levadura y su uso para combatir la caída del cabello y promover su crecimiento.
En una sociedad que da un lugar privilegiado a la apariencia, el cabello es un símbolo de belleza y fuerza, cuyo estado tiene un impacto significativo en la autoestima y la imagen que uno refleja. La aceleración de la caída del cabello, científicamente conocida como alopecia, se considera un signo temprano de envejecimiento y puede afectar considerablemente la calidad de vida de las personas afectadas.
Es por ello que se ofrecen muchos productos cosméticos destinados a frenar la caída del cabello, con un incremento muy fuerte en los últimos diez años.
La alopecia es un problema frecuente cuya forma androgenética es la más común. Afecta hasta el 30 % de los hombres menores de 30 años y a más del 50 % de los hombres después de los 50. Este trastorno progresivo, que no es una enfermedad (Prie B. y otros, “Oxidative stress in androgenetic alopecia”, Journal of Medicine and Life Volumen 9, Número 1, enero-marzo 2016, páginas 79-83), se caracteriza por la aparición de cabellos más finos, más cortos y no pigmentados que forman una pelusa. Es el resultado de dos factores principales, genético y hormonal, que provocan hipersensibilidad a una hormona: la dihidrotestosterona (DHT). Este último es responsable de todos los cambios biológicos asociados con este trastorno. Además, ciertos parámetros ambientales también pueden favorecer la aparición de alopecia androgenética (AGA). Este es el caso del uso repetido de productos capilares agresivos (tintes y otros productos químicos), del tabaquismo o la exposición a los rayos UV.
Mantener el cabello denso es el resultado de equilibrar la pérdida y el recrecimiento del cabello. Su caída es un fenómeno natural ya que cada día un individuo pierde entre 50 y 125. Gracias a un proceso de regeneración, se asegura su renovación constante: hablamos del ciclo de vida del cabello o ciclo pilar. Este se divide en tres fases: • anágena (crecimiento);
• catágena (degeneración);
• telógena (latencia).
El pelo o folículo piloso se compone de dos elementos principales. La papila dérmica es la fuerza impulsora detrás de su crecimiento y se encuentra en la base del folículo. Está formada por fibroblastos capaces de emitir señales de crecimiento. Estas luego son captadas por las células de la matriz del cabello. Esta estructura que rodea a la papila alberga en particular los queratinocitos. En respuesta a estas señales, proliferarán para desencadenar la formación de un nuevo tallo de cabello.
El crecimiento del cabello es un proceso consumidor de energía que requiere que las células tengan mitocondrias funcionales, el estado morfológico de estos orgánulos dinámicos condiciona la producción de energía.
Otros factores reguladores juegan un papel importante en la regeneración del cabello y presentan un mal funcionamiento durante la alopecia androgenética:
• moléculas de "señal", que permiten que las células se comuniquen entre sí; dentro del folículo piloso, orquestan la acción de los fibroblastos en la papila y los queratinocitos en la matriz para asegurar el crecimiento del cabello; • la epigenética.
Actualmente, se usan dos moléculas químicas en el tratamiento de la alopecia androgenética: minoxidil y finasterida. Sin embargo, son eficaces en menos del 50 % de los casos y tienen efectos secundarios importantes (cabello graso, aparición de caspa, irritaciones de la piel, problemas de libido). Por tanto, existe una necesidad real de proponer un nuevo enfoque que permita promover el crecimiento del cabello evitando los inconvenientes mencionados anteriormente.
Para responder a esto, la invención proporciona un principio activo cosmético natural, derivado de una levadura, capaz de actuar sobre tres mecanismos de regulación del crecimiento del cabello.
Ya se usan en cosmética varios hidrolizados de levadura, como los hidrolizados de Saccharomyces cerevisiae, de Pichia anómala o de Torulaspora delbrueckii. Sin embargo, la invención se refiere a un hidrolizado obtenido de una levadura diferente a saber Pichia minuta, que está lejos de las levaduras ya conocidas y usadas en cosmética y que tiene características específicas.
En particular, la invención se refiere a un principio activo cosmético compuesto por un hidrolizado de Pichia minuta, en particular un hidrolizado de Pichia minuta que comprende al menos péptidos. Ventajosamente, tal principio activo es capaz tanto de estimular la dinámica mitocondrial a favor del crecimiento del cabello como de corregir los defectos de expresión que afectan a las moléculas "señal" y la epigenética asociada a la alopecia androgenética. El principio activo cosmético según la invención permite por tanto reactivar la papila dérmica y estimular el crecimiento del folículo piloso.
Por lo tanto, un objeto de la invención es también el uso cosmético no terapéutico de dicho principio activo, en la aplicación al cabello y/o al cuero cabelludo, para combatir la caída del cabello y activar su crecimiento.
La invención también está dirigida a composiciones cosméticas que comprendan al menos 0,05 % en peso del principio activo según la invención, así como a un método cosmético no terapéutico para combatir la caída del cabello y activar su crecimiento, consistente en aplicar sobre el cabello o el cuero cabelludo de tales composiciones. Otras características y ventajas surgirán de la descripción detallada de la invención que sigue, con referencia a las figuras adjuntas en las que:
• La Figura 1 muestra el perfil cromatográfico (HPLC /RI) de los péptidos del hidrolizado del Ejemplo 1,
• La Figura 2 muestra el aminograma de los péptidos del principio activo según la invención del Ejemplo 1, • La Figura 3 representa el cromatograma de las proteínas de los tres productos presentados en la prueba comparativa 1, obtenidos según el mismo proceso a partir de 3 levaduras diferentes: Pichia minuta, Pichia heedii y Saccharomyces cerevisiae,
• La Figura 4A muestra un medio de cultivo de agar en el que se sembró y se incubó durante 48 horas a 30 °C una biomasa de Pichia minuta,
• La Figura 4B muestra un medio de cultivo de agar en el que se sembró y se incubó durante 48 horas a 30 °C un hidrolizado de Pichia minuta,
• La Figura 5A muestra una foto ampliada de un cuero cabelludo antes de la aplicación de una composición según la invención.
• La Figura 5B muestra una foto ampliada de un cuero cabelludo después de 8 meses de la aplicación de una composición según la invención (punto II.1)
• La Figura 6A representa una foto de un cuero cabelludo antes de la aplicación de una composición según la invención.
• La Figura 6B representa una foto de un cuero cabelludo después de 8 meses de aplicación de una composición según la invención (punto II.1)
DEFINICIONES
Por "activo cosmético" o "principio activo cosmético" en el sentido de la invención se entiende al menos una molécula, preferentemente un conjunto de moléculas que actúan sobre las células del cabello y/o del cuero cabelludo, en particular sobre los fibroblastos de la papila dérmica y las células de la matriz del cabello.
Por "fracción proteica" o "compuestos peptídicos" del hidrolizado de Pichia minuta en el sentido de la invención se entienden todas las proteínas y péptidos presentes en el hidrolizado de Pichia minuta.
Por "hidrolizado de Pichia minuta " en el sentido de la invención, se entiende cualquier principio activo obtenido de la levadura Pichia minuta, obtenida por un proceso que comprende al menos una etapa de hidrólisis enzimática o química de Pichia minuta. El término hidrolizado de Pichia minuta excluye las moléculas producidas solo por fermentación de Pichia minuta.
Por " Pichia minuta" a los efectos de la invención, se entiende cualquier levadura de la familia de Saccharomycetaceae, del género Ogataea y la especie Pichia minuta. La levadura Pichia minuta ha sido registrada en varias colecciones de levadura, bajo los números ATCC 26176, CBS 6511, MUCL 27758, MUCL 29976, DSM-70275, NRRL Y-411, NRRL Y-7953, NRRL Y-10948, Y-172, Y-2081, Y-2516,NCYC-499, 3622T, 9442, 3615T, NBRC 1473, NBRC 0975T, NBRC 10402, NBRC 10746. También se le conoce con otros nombres: Candida methanolovescens, Ogataea minuta, Ogataea nonfermentans. Pichia minuta en particular, puede aislarse de la flor de azalea, Rhododendron indicum.
En el sentido de la invención, el término "soporte de pulverización" significa un adyuvante neutro añadido a una solución para producir un polvo durante el secado por pulverización.
Descripción detallada de la invención
Por tanto, la invención se refiere a un principio activo cosmético compuesto por un hidrolizado de Pichia minuta. El hidrolizado de Pichia minuta incluye al menos péptidos. Preferentemente el hidrolizado de Pichia minuta comprende péptidos que tienen un peso molecular de menos de 3500 Da, preferentemente entre 243 y 3500 Da. Estos péptidos juegan un papel importante en la eficacia del principio activo según la invención.
Preferentemente, los péptidos que tienen un peso molecular de menos de 3500 Da representan al menos el 50 % en peso de la fracción proteica del hidrolizado, incluso más preferentemente al menos el 80 %.
En el hidrolizado, la fracción proteica representa al menos 40 % en peso de materia seca del hidrolizado, preferentemente entre 40 y 90 %, incluso más preferentemente entre 50 y 70 %.
El contenido de compuestos peptídicos se determina preferentemente por el método LOWRY (Lowry y otros, Protein measurement with the folin reagent, J. Biol. Chem., 193, 265, 1951.).
Los aminoácidos presentes en más del 5 %, que constituyen los péptidos del hidrolizado (porcentaje relativo a todos los aminoácidos presentes en número) son preferentemente: alanina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, leucina, lisina, serina, treonina, valina.
El aminograma de los péptidos que constituyen el hidrolizado según la invención puede obtenerse mediante cromatografía de intercambio iónico después de la hidrólisis ácida de la muestra.
El hidrolizado también comprende preferentemente azúcares y/o minerales. Preferentemente, los azúcares representan al menos 5 % en peso de materia seca del hidrolizado, en particular entre 5 y 25 %, incluso más preferentemente entre 10 y 20 %. El contenido de azúcar en el hidrolizado puede determinarse mediante el método de DUBOIS (Dubois M. y otros, Analytical chemistry, 28, 3, 350-356, 1956).
Los minerales presentes en el hidrolizado son preferentemente en particular calcio, potasio, sodio, cloro, el fósforo. El análisis de los minerales que constituyen la ceniza del hidrolizado se realizó por espectrometría de emisión óptica (ICP/OES) y la determinación de los iones cloruro por titulación con nitrato de plata.
Preferentemente, el contenido de cenizas está entre 5 y 35 % en peso de materia seca del hidrolizado, incluso más preferentemente entre 20 y30 %.
El contenido de ceniza bruta puede determinarse pesando los residuos de la incineración de las muestras de hidrolizado a 550 °C en un horno de mufla eléctrico. El hidrolizado según la invención puede obtenerse mediante hidrólisis química (ácida o básica) o enzimática. Preferentemente, es un hidrolizado enzimático.
El principio activo según la invención puede estar en forma sólida o en forma líquida. Cuando se encuentra en forma líquida, el principio activo según la invención es preferentemente el hidrolizado como se describió anteriormente. Se presenta en forma de un líquido transparente, con un ligero olor y un color amarillo ligeramente naranja.
Cuando se encuentra en forma sólida, el principio activo según la invención está compuesto preferentemente por el hidrolizado de Pichia minuta como se describió anteriormente y con un soporte seleccionado de maltodextrina, goma arábiga, lecitina de soja o isomalt. Según una forma de realización especialmente adecuada, el hidrolizado representa entre 25 y 75 % en peso del principio activo, preferentemente entre 40 y 60 %.
En el caso de una forma sólida en la que el principio activo está asociado a un soporte, se modifican los contenidos de proteína, azúcar y cenizas del principio activo, el soporte generalmente consiste principalmente en azúcares. En el caso de que el soporte de pulverización sea maltodextrina, presente entre 25 y 75 %, preferentemente entre 40 y 60 %:
• los péptidos representan al menos 12 %, en particular entre 12 y 53 % en peso de materia seca del principio activo, preferentemente entre 20 y 42 %,
• los azúcares representan entre 32 y 80 % en peso de materia seca del ingrediente activo, preferentemente entre 46 y 68 %,
• la ceniza representa entre 5 y 23 % en peso de materia seca del principio activo, preferentemente entre 8 y 18 %.
El hidrolizado que constituye el principio activo según la invención puede obtenerse mediante cualquier proceso que comprenda al menos una etapa de hidrólisis de Pichia minuta, en particular una etapa de hidrólisis de proteínas. Preferentemente, se obtiene mediante un proceso que comprende una etapa de hidrólisis enzimática, en particular hidrólisis enzimática de proteínas, es decir, hidrólisis realizada enzimáticamente mediante enzimas proteolíticas. Pueden ser, por ejemplo, proteasas de origen vegetal o derivadas de microorganismos.
Con anterioridad al proceso de obtención del hidrolizado como tal, es necesario producir la biomasa de Pichia minuta. Esta etapa se realiza según el método de cultivo de las levaduras en un medio adecuado para su desarrollo, de manera convencional para los expertos en la técnica. Una vez obtenida la biomasa, se realiza la hidrólisis para obtener moléculas activas. Según una forma de realización especialmente adecuada, el principio activo se obtiene mediante la implementación de las siguientes etapas:
• solubilización de la biomasa de Pichia minuta en el agua
• hidrólisis de proteínas: las condiciones de hidrólisis se eligen para hidrolizar tanto las paredes de las levaduras como el medio intracelular de las levaduras, con el fin de promover el enriquecimiento de péptidos bioactivos; preferentemente la hidrólisis se realiza enzimáticamente usando enzimas proteolíticas, preferentemente de origen vegetal o derivadas de microorganismos;
• inactivación de la(s) enzima(s) preferentemente por tratamiento térmico: esta inactivación se lleva a cabo de acuerdo con la recomendación técnica del proveedor(es) de la(s) enzima (s);
• separación de las fases solubles e insolubles preferentemente por centrifugación, y recuperación de la fase soluble que contiene entre otros los péptidos y proteínas solubles,
• filtración para eliminar las partículas aún en suspensión,
• purificación por filtración para eliminar moléculas de alto peso molecular (enzimas y polímeros, etc.), preferentemente moléculas de peso molecular superior a 5000 Da,
• obtención de un filtrado, el hidrolizado de Pichia minuta, que constituye una primera forma del principio activo según la invención, que se encuentra en forma líquida.
El hidrolizado obtenido en esta etapa puede concentrarse y/o purificarse adicionalmente para seleccionar las fracciones de bajo peso molecular, preferentemente menos de 3500 kDa, o incluso posiblemente menos de 2000 kDa, mediante sucesivas etapas de ultrafiltración a través de filtros de diferente porosidad, manteniendo los filtrados en cada paso y/o por un método de tipo cromatográfico, para, por ejemplo, enriquecer específicamente el hidrolizado con estas moléculas.
A continuación, el hidrolizado puede secarse y combinarse con un soporte, para que esté en forma sólida. Esta fase puede lograrse implementando las siguientes etapas:
• se añade un soporte de pulverización, preferentemente maltodextrina, al hidrolizado de Pichia minuta, entre 25 y 75 % (en masa/volumen);
• esta solución se concentra luego al vacío;
• se lleva a cabo una debacterización mediante tratamiento térmico;
• la pulverización permite obtener un polvo.
Esta presentación del hidrolizado peptídico corresponde a una forma altamente concentrada en moléculas activas, en particular en péptidos.
Las etapas de los procesos descritos anteriormente, tomadas individualmente, son habituales en el campo de la extracción de ingredientes activos a partir de materias primas naturales y un experto en la técnica puede ajustar los parámetros de reacción en base a sus conocimientos generales.
El principio activo según la invención es particularmente eficaz para combatir la caída del cabello y activar su crecimiento. En particular, el hidrolizado de Pichia minuta según la invención, cuando se aplica sobre el cabello y/o el cuero cabelludo:
• promueve la dinámica mitocondrial, un elemento clave del crecimiento del cabello,
• corrige los cambios en la expresión de moléculas de "señal" que aparecen durante la alopecia androgenética, • controla los actores de la epigenética durante la alopecia androgenética, y
• mantiene la activación de la papila dérmica y el crecimiento del folículo piloso durante la alopecia androgenética.
El crecimiento del folículo piloso es un proceso que requiere mucha energía. Dentro de la célula, son las mitocondrias las que aseguran la producción de energía. Para ello, estos orgánulos son capaces de adaptar su morfología y bien su actividad: hablamos de dinámica mitocondrial. Esto se basa en dos fenómenos: la fisión y la fusión. La fisión se define por la separación de las mitocondrias que luego son más pequeñas y que producen menos energía. Por el contrario, la fusión corresponde a la agrupación de mitocondrias en forma de red. Se basa en particular en la intervención de la mitofusina 1 (MFN1), una proteína de membrana que participa en la fusión de las membranas externas de las mitocondrias. Este proceso les permite aumentar su metabolismo y producir más energía en forma de ATP.
La dinámica mitocondrial está involucrada en la biología del folículo piloso. En particular, se sabe que la morfología de las mitocondrias evoluciona hacia una forma fusionada en las células de la papila dérmica. Este fenómeno se acompaña de un aumento de la actividad enzimática mitocondrial y de la producción de ATP. Estos cambios mitocondriales permiten aportar la energía necesaria para el paso o mantenimiento en la fase de crecimiento del ciclo capilar (Mifude y otros "PDGF-AA-induced filamentous mitochondria benefit dermal papilla cells in cellular migration". International Journal of Cosmetic Science, 37, 266-271 (2015)).
Ventajosamente, el principio activo según la invención es capaz de estimular la síntesis de mitofusina 1 en los fibroblastos de la papila dérmica y, por tanto, de favorecer el crecimiento del folículo piloso.
Además, las moléculas de "señal" presentes en el microambiente de la papila dérmica son esenciales para el crecimiento del cabello. Tres de ellas se encuentran desreguladas en la alopecia androgenética:
• la IL-6 (interleucina 6), que bloquea la proliferación de las células de la matriz e inhibe el crecimiento del tallo del cabello;
• DKK1 (Dickkopf 1), un inhibidor de la vía Wnt /p-catenina, que provoca la apoptosis de los queratinocitos del folículo y así la entrada en la fase catágena (latencia) del ciclo del cabello;
• P16, un inhibidor del ciclo celular, responsable de la senescencia prematura de los fibroblastos en la papila dérmica.
En la alopecia androgenética, estas tres moléculas de "señal" están sobreexpresadas. De hecho, los fibroblastos de la papila dérmica de áreas alopécicas muestran un aumento en la expresión de P16 (Bahta AW y otros. "Premature Senescence of Balding Dermal Papilla Cells ln Vitro Is Associated with P16INK4a Expression" Journal of Investigative Dermatology, 128, 1088-1094 (2008)), de la secreción de IL-6 (Kwack MH y otros “Dihydrotestosterone-Inducible Dickkopf 1 from Balding Dermal Papilla Cells Causes Apoptosis in Follicular Keratinocytes” Journal of Investigative Dermatology, 128, 262-269 (2008)) y de la expresión de DKK1 (Fawzi MMT y otros "Assessment of tissue levels of dickkopf-1 in androgenetic alopecia and alopecia areata". Journal of Cosmetic Dermatology, 15, 10 15 (2015)). Estas desregulaciones también se observan tras el tratamiento con DHT y pueden incluso acentuarse tras la activación de la vía de señalización de andrógenos (Yang y otros "Androgen Receptor Accelerates Premature Senescence of Human Dermal Papilla Cells in Association with d Na Damage". Plos One, 8, 1-10 (2013)).
Ventajosamente, el principio activo según la invención es capaz de reducir la secreción de IL-6 y la expresión de DKK1 y de P16 en los fibroblastos de la papila dérmica. De este modo, permite corregir la expresión anormal de las moléculas de "señal" implicadas en la alopecia androgenética.
Según otro aspecto, la epigenética también juega un papel importante en la biología del cabello. La epigenética estudia los mecanismos capaces de regular la expresión génica en respuesta a determinados estreses ambientales, sin modificar la secuencia del ADN.
Todos los actores involucrados se agrupan bajo el nombre de epigenoma. Entre ellos, los miARN ocupan un lugar importante. Estas pequeñas moléculas de ARN son capaces de inactivar genes que dependen del entorno alterando la estabilidad de sus ARN mensajeros diana. Recientemente se ha demostrado que los miARN regulan diferentes procesos como la proliferación y diferenciación de fibroblastos en la papila dérmica y queratinocitos en la matriz capilar. Además, regulan la apoptosis durante la fase catágena (Andl y otros “MicroRNAs (miRNAs) in the control of HF development and cycling: the nextfrontiers in hair research” Experimental dermatology, 24, 821-826 (2015)).
En un contexto alopécico, los fibroblastos de la papila dérmica muestran un perfil de expresión de miARN desregulado. Estas modificaciones incluyen en particular la sobreexpresión de miR-3663-3p y de let-7a-3p (Lee y otros "Analysis of the microRNA expression profile of normal human dermal papilla cells treated with 5adihydrotestosterone" Molecular Medicine Reports, 12, 1205-1212 (2015)). Entre los genes diana de estos miARN, algunos están involucrados en la vía de señalización de Wnt /p-catenina, una vía esencial para el crecimiento del cabello. Se activa tras la unión de un ligando de la familia Wnt a su receptor específico y provoca la acumulación de p-catenina. Infinitamente, esto conduce a la proliferación de fibroblastos en la papila dérmica y a la inducción de la fase de crecimiento del cabello (Ouji y otros “Maintenance of Dermal Papilla Cells by Wnt-10b In Vitro” Methods in Molecular Biology, 1516, 269-277 (2016)).
Ventajosamente, el principio activo según la invención es capaz de limitar la expresión de miARN 3663-3p y let-7a-3p en los fibroblastos de la papila dérmica. Por tanto, atenúa las desregulaciones epigenéticas asociadas a la alopecia androgenética.
También se sabe que la papila dérmica es el centro del control del crecimiento del cabello. Los fibroblastos de la papila emiten señales destinadas a los queratinocitos de la matriz capilar para regular el desarrollo del cabello. En un contexto normal, esto se lleva a cabo según un ciclo formado por tres fases:
• anágena: fase de crecimiento del cabello que dura de 2 a 5 años;
• catágena: fase de degeneración que dura desde unos días hasta algunas semanas;
• telógena: fase de latencia que dura unos 3 meses.
En la alopecia androgenética, la alteración de la dinámica del ciclo del cabello constituye una gran desregulación. Da lugar a un aumento de la proporción de cabello en la fase telógena (latencia), cuya duración se mantiene o incluso se alarga. Esto se acompaña de un acortamiento progresivo de la fase anágena (crecimiento) marcado por una caída en la expresión de versican, una proteína específica de esta etapa (Soma y otros "Hair cycle-specific expression of versican in human hair follicles" Journal of Dermatological Science, 39, 147-154 (2005)). Todas estas desregulaciones están en el origen de una miniaturización del folículo piloso hasta tal punto que el cabello ya no llega a la superficie de la piel.
El principio activo según la invención es capaz de estimular la síntesis de versican en fibroblastos de la papila dérmica y así permite preservar la activación de la papila dérmica. Además, mejora el crecimiento de los folículos pilosos y ayuda a mantener una importante síntesis de versican y Ki-67. Así, el principio activo según la invención permite reducir el defecto de crecimiento asociado a la alopecia androgenética manteniendo los folículos pilosos en fase de crecimiento.
Por tanto, la invención se refiere al uso de un principio activo según la invención, en aplicación al cabello y/o cuero cabelludo, para combatir la caída del cabello y activar su crecimiento, en particular en personas con alopecia androgenética. Actúa sobre las anomalías moleculares asociadas a la alopecia androgenética corrigiendo las desregulaciones que afectan a las moléculas de "señal" y la epigenética y estimulando la dinámica mitocondrial. Por tanto, es eficaz en la normalización de dos parámetros esenciales para el desarrollo del cabello, a saber: la activación de la papila dérmica y la estimulación del crecimiento del folículo piloso.
El principio activo según la invención se usa preferentemente en composiciones, estas composiciones comprenden un medio cosméticamente aceptable. Se trata de composiciones en diferentes formas de dosificación, adecuadas para su aplicación en el cuero cabelludo y el cabello.
Estas composiciones pueden presentarse en particular en forma de emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, emulsiones múltiples (Agua /Aceite /Agua o Aceite /Agua /Aceite) que opcionalmente pueden ser microemulsiones o nanoemulsiones, o en forma de soluciones, suspensiones, hidrodispersiones, geles acuosos o polvos. Pueden ser más o menos fluidas y tener apariencia de loción, champú, crema o espuma.
Pueden ser composiciones que comprendan al menos 0,05 % de un hidrolizado de Pichia minuta según la presente invención, preferentemente entre 0,5 y 10 %.
Estas composiciones comprenden, además del agente activo, un medio fisiológicamente aceptable y preferentemente cosméticamente aceptable, es decir que no provoque sensaciones inaceptables de malestar al usuario como enrojecimiento, tirantez u hormigueo.
Las composiciones según la invención pueden contener como adyuvante al menos un compuesto seleccionado de:
• los aceites, que pueden elegirse en particular entre los aceites de silicona, lineales o cíclicos, volátiles o no volátiles;
las ceras, como la ozoquerita, la cera de polietileno, la cera de abejas o la cera de carnauba, los elastómeros de silicona,
los tensioactivos, preferentemente emulsionantes, ya sean no iónicos, aniónicos, catiónicos o anfóteros, los co-tensioactivos, como alcoholes grasos lineales,
los espesantes y/o gelificantes,
los humectantes, como polioles como la glicerina,
los colorantes, los conservantes, los rellenos,
los tensores,
los secuestradores,
los perfumes,
y mezclas de los mismos, sin que esta lista sea exhaustiva.
Ejemplos de tales adyuvantes se citan en particular en el Diccionario CTFA (International Cosmetic Ingrédient Dictionary and Handbook publicado por el Personal Care Product Council). Por supuesto, los expertos en la técnica se cuidarán de elegir los compuestos adicionales opcionales, activos o inactivos, y su cantidad, de modo que las propiedades ventajosas de la mezcla no se alteren, o no se alteren sustancialmente, por la adición prevista.
Estas composiciones están destinadas en particular a ser usadas para un efecto anticaída y de crecimiento del cabello.
Por tanto, la invención también se refiere a un proceso no terapéutico, a saber, un proceso cosmético no terapéutico para combatir la caída del cabello y activar su crecimiento, que consiste en aplicar al cabello y/o al cuero cabelludo una composición que comprende un principio activo según la invención, preferentemente al menos una vez al día durante al menos un mes. Preferentemente, la composición es una composición según la invención.
Con el fin de ilustrar estos efectos cosméticos en la lucha contra la caída del cabello y la activación del crecimiento del cabello, se presentan los siguientes ejemplos con sus resultados de prueba.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Principio activo según la invención en forma líquida
El principio activo según el Ejemplo 1 se obtiene realizando las siguientes etapas:
solubilización de la biomasa de Pichia minuta en agua a una taza de 50 g/l,
hidrólisis enzimática con una enzima proteolítica de origen bacteriano,
inactivación térmica a 80 °C de la actividad enzimática,
decantación por centrifugación para recuperar el sobrenadante,
filtración y recogida del filtrado,
filtración esterilizante sobre filtro de 0,22 p.
El hidrolizado obtenido se presenta en forma de un líquido transparente, de color amarillo ligeramente naranja, con un ligero olor.
Está compuesto por:
• 59 % de péptidos en peso de materia seca, (determinado por el método de LOWRY),
• 15 % de azúcares en peso de materia seca, (determinado por el método de DUBOIS),
• 26 % de cenizas en peso de materia seca, (determinado pesando los residuos resultantes de la incineración de las muestras del hidrolizado a 550 °C en un horno eléctrico de mufla).
Además, los péptidos se caracterizaron para determinar sus pesos moleculares y cuantificar las diversas fracciones de proteínas mediante cromatografía FPLC de exclusión por tamaño. El hidrolizado se analiza en las siguientes condiciones:
Bomba: FPLC AKTA (Pharmacia)
Columna: Péptidos Superdex TRICORN 10 /300 GL (Pharmacia)
Fase móvil: tampón de fosfato de potasio 20 mM, pH 7,2 con NaCl 0,25 M.
Detector: UV a 280 nm
Caudal: 0,5 mL/min
Volumen de inyección: 200 pL
Se construye una curva de calibración para los tiempos de retención de los marcadores en función de su masa molar (ajuste logarítmico). La Tabla 1 resume los tiempos de retención obtenidos para los diferentes marcadores.
Tabla 1. Tiempo de retención de los diferentes marcadores.
Gracias a la curva de calibración, se pudieron estimar los siguientes tiempos de retención:
• proteína de 10000
21,4 min
• proteína de 3500 Da: tr = 25,2 min
• proteína de 2000 Da: tr = 30,3 min
Luego, se construye un programa de fraccionamiento, en función de los tiempos de retención, con el objetivo de recolectar las siguientes fracciones (MM = peso molecular):
o fracción 1: 10000 Da <MM
o fracción 2: 3500 Da <MM <10000 Da
o fracción 3: 2000 Da < MM <3500 Da
o fracción 4: 243 Da < MM < 2000 Da
o fracción 5: MM < 243 Da
Las diferentes fracciones recogidas del hidrolizado se cuantifican mediante ensayo espectrofotométrico según el método de LOWRY (Lowry y otros, Protein measurement with the folin reagent, J. Biol. Chem., 193, 265, 1951.). El perfil cromatográfico y el fraccionamiento de los péptidos del hidrolizado se muestran en la Figura 1 y la distribución de cada fracción determinada por método espectrofotométrico se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2. Distribución y cuantificación de las proteínas del principio activo del Ejemplo 1
Más del 93 % de los péptidos del principio activo del Ejemplo 1 según la invención tienen masas molares comprendidas entre 243 y 3500 Da. La cantidad de proteínas superiores a 3500 Da representa menos del 5 % de las proteínas totales.
También se realizó un aminograma mediante cromatografía HPLC de la hidrólisis del producto (ácido clorhídrico concentrado durante 24 horas) con detección de ninhidrina y los resultados se presentan en la Tabla 3 y en la Figura 2.
Tabla 3. Aminograma producido en el hidrolizado del Ejemplo 1
Además, la distribución de las cenizas se determinó después de la incineración a 550 °C. El análisis de los minerales se realizó mediante espectrometría de emisión óptica (ICP/OES) y la determinación de iones cloruro mediante titulación con nitrato de plata.
Esta se presenta en la Tabla 4 a continuación:
Tabla 4. Distribución de la ceniza del hidrolizado del Ejemplo 1
Ejemplo 2: Principio activo según la invención en forma sólida (hidrolizado del Ejemplo 1 maltodextrina)
El principio activo del Ejemplo 1 se combina con maltodextrina para constituir el principio activo del Ejemplo 2.
Se obtiene implementando las siguientes etapas:
• introducción de 50 % de maltodextrina (masa) en el hidrolizado del Ejemplo 1,
• concentración hasta un factor de concentración de 5,
• debacterización 5 min a 95 °C,
• pulverización.
El principio activo se encuentra en forma de polvo con un tamaño de partícula inferior a 500 |_im, un olor débil y un color amarillo ligeramente naranja.
Está compuesto por (determinación según los mismos métodos que para el hidrolizado en el Ejemplo 1):
• 28 % de péptidos en peso de materia seca,
• 58 % de azúcares en peso de materia seca,
• 14 % de cenizas en peso de materia seca.
Como la maltodextrina se compone únicamente de azúcares inactivos, la composición de los péptidos, el aminograma y la composición de los minerales del principio activo son idénticos a los del Ejemplo 1.
Ejemplo 3: Suero para el recrecimiento del cabello
Un ejemplo de composición según la invención en forma de suero está compuesta por:
A. Agua csp 100 %
Conservante 0,7 %
Propilenglicol 30 %
B. Simulgel FL10 (Seppic) 0,5 %
DC200 (Dow Corning) 8 %
C. Ácido láctico csp pH 5
D. Principio activo EJEMPLO 2 0,3 %
El pH de la composición es de 5. Se presenta en forma de líquido opalescente, inodoro.
El suero del Ejemplo 3 tiene las siguientes características: loción pulverizable, aplicación fresca y sedosa, efecto deslizante, penetración inmediata, acabado suave y seco, efecto alisador sobre el cabello.
Puede obtenerse implementando las siguientes etapas:
• Mezclar A y calentar a baño de María a 50 °C, teniendo cuidado de dispersar bien el conservante,
• Dejar enfriar bajo agitación
• Agregar B, con agitación y ajustar el pH con C,
• Añadir D con agitación a 1500 rev/min y comprobar la completa homogeneización de la fórmula.
Ejemplo 4: Mascarilla para el crecimiento del cabello
Un ejemplo de composición según la invención en forma de mascarilla para el cabello, está compuesta por:
A. Agua csp 100 %
Conservante 0,7 %
Propilenglicol 20 %
Acetato de glucosa 6 %
B. Principio activo EJEMPLO 2 0,3 %
C. Simulquat HC305 (Seppic) 6 % El pH de la composición es de 4,5.
Se presenta en forma de gel blanco espeso y compacto.
La mascarilla del Ejemplo 3 tiene las siguientes características: agarre firme, fácil aplicación, efecto filmógeno, fácil aclarado, acabado suave y seco.
Puede obtenerse implementando las siguientes etapas:
• Mezclar A y calentar a baño de María a 50 °C, teniendo cuidado de dispersar bien el conservante,
• Añadir B con agitación y asegurar una buena homogeneización,
• Agregar C con agitación vigorosa (3000 rev/min) y dejar bajo agitación hasta que el gel esté completamente homogeneizado.
Ejemplo 5: Tratamiento de regeneración del cabello
Un ejemplo de composición según la invención en forma de cuidado del cabello, está compuesta por:
Agua - csp
A. 100 %
Conservante - 0,7 % Dub Diol (Stéarinerie DUBOIS) 20 %
B. Satiaxane CX930 (Cargill) 0,1 % Satialgine US551 (Cargill) 3 %
C. Principio activo EJEMPLO 1 0,7 %
D. GENUGEL carragenano CG-130 (CP Kelco) 2,5 % Lauroil lisina (Laboratoire HYTECH) 2 % D-pantenol (XINFU) 1 % Fitoescualano (Sophim) 1 %
El pH de la composición es de 6,1.
Se presenta en forma de gel crudo espeso y fluido, inodoro.
El tratamiento del Ejemplo 5 tiene las siguientes características: Agarre suave, aplicación suave y uniforme sobre la piel y el cabello, efecto fresco e hidratante, fácil aclarado, acabado suave y liso.
Puede obtenerse implementando las siguientes etapas:
• Mezclar A y calentar a baño de María a 50 °C, teniendo cuidado de dispersar bien el conservante,
• Agregar B, bajo agitación y asegurarse de que los geles estén bien homogeneizados,
• Agregue C y comprobar la buena dispersión del activo,
• Cuando esté frío, agregar D en el orden indicado y dejar bajo agitación (2500 rpm/min), hasta su completa homogeneización.
Ejemplo 6: Base limpiadora tratante
Un ejemplo de composición según la invención en forma de cuidado del cabello, está compuesta por:
A. Oramix LS30 (Seppic) 25 % Betadet S20 (Kao Corporation) 25 % Oramix NS20 (Seppic) 20 % Somepon T25 (Seppic) 4 %
B. Conservante - 1 % Carbopol Ultrez10 (Novéon) 0,1 %
C. PRINCIPIO ACTIVO EJEMPLO 1 0,7 %
D. NaOH - csp pH 4,8
E. Dub Grenn OD4 (Stéarinerie DUBOIS) 15 %
Aceite de Baobab (Sophim) 5 %
Biophytosebum (Sophim) 5 %
El pH de la composición es de 5.
Se presenta en forma de base de gel líquido, ligeramente blanquecino, inodoro.
La base de lavado del Ejemplo 6 tiene las siguientes características: fluidez, tacto suave, poder espumante extremadamente fuerte, buena dispersión en agua con creación de una espuma blanda, blanca y compacta, fácil aclarado, acabado suave muy ligeramente filmógeno, efecto hidratante.
Puede obtenerse implementando las siguientes etapas:
• Mezclar A sin agitar para evitar que se forme espuma,
• Agregue B, luego C y agitar delicadamente, asegurándose de que los polvos estén bien dispersos,
• Ajustar el pH con D y con agitación más fuerte (1000 rev/min), agregar la fase grasa y dejar en agitación hasta que el gel esté completamente homogeneizado.
Ejemplo 7: Loción tratante
Un ejemplo de composición según la invención en forma de loción para el cabello, está compuesta por:
A. Agua csp 100 %
Conservante 0,7 %
Propilenglicol 8 %
Principio activo del EJEMPLO 2 0,3 %
B. Glicerol 2,0 %
C. Alcohol 10,0 %
Se presenta en forma de loción etanólica, líquido transparentel
Puede obtenerse implementando las siguientes etapas:
• Mezclar A sin agitar para evitar que se forme espuma,
• Agregar B, luego C y agitar suavemente, asegurando una buena dispersión.
EVALUACIÓN DE LA EFICIENCIA COSMÉTICA SEGÚN LA INVENCIÓN
I. PRUEBAS IN VITRO
° 1. Efecto de un hidrolizado de Pichia minuta según la invención sobre la dinámica mitocondrial necesaria para el crecimiento del folículo piloso
El objetivo de este estudio es evaluar el efecto de un principio activo según la invención sobre la dinámica mitocondrial, elemento necesario para el crecimiento del folículo piloso.
Para ello, se evaluó la síntesis de mitofusina 1. La mitofusina 1 es un actor importante en la fusión mitocondrial en fibroblastos humanos de la papila dérmica. Cuando se promueve el crecimiento del cabello, se altera la dinámica de las mitocondrias. Esto da como resultado un aumento en la proporción de mitocondrias grandes fusionadas en comparación con pequeñas mitocondrias fisuradas en los fibroblastos de la papila dérmica. Este estado es favorable a la producción de energía.
El estudio se llevó a cabo mediante Western blot según el protocolo operativo que se describe a continuación.
En el D0, los fibroblastos humanos de la papila dérmica se siembran en medio de cultivo y se incuban a 37 °C. En el D3, las células se tratan: los fibroblastos se tratan con medio que contiene o no el principio activo al 0,02 % y al 0,04 % (V/V final).
En el D5, los extractos de células se recuperan y luego se almacenan a -80 °C mientras se espera el ensayo de transferencia Western de acuerdo con las siguientes características:
• la electroforesis se lleva a cabo en un gel prefabricado y las proteínas se transfieren luego a una membrana de PVDF.
• la inmunotinción se lleva a cabo usando un anticuerpo primario anti-mitofuscina 1,
• las bandas se visualizan, se semicuantifican por densitometría con una cámara CCD y luego se analizan con ayuda de un software.
Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 5:
Tabla 5. Efecto de un hidrolizado de Pichia minuta sobre la síntesis de mitofusina 1 por fibroblastos de la papila dérmica
Estos resultados muestran que probado al 0,04 %, un hidrolizado de Pichia minuta aumenta significativamente la síntesis de mitofusina 1 en 52 % en fibroblastos humanos de la papila dérmica. Así, actúa favorablemente sobre la dinámica mitocondrial, elemento clave para la producción de la energía necesaria para el crecimiento del folículo piloso.
° 2. Efecto de un hidrolizado de Pichia minuta según la invención sobre la regulación de moléculas "señal" descrita en la alopecia androgenética
El objetivo de este estudio es evaluar el efecto de un principio activo según la invención sobre la regulación de moléculas "señal" descritas en la alopecia androgenética.
Para ello, el estudio consistió en evaluar en fibroblastos de la papila dérmica tratados con una solución de DHT simulando alopecia:
• la IL-6 (interleucina 6), una citocina secretada por fibroblastos humanos en la papila dérmica que inhibe el crecimiento del cabello;
• DKK1 (Dickkopf 1), inhibidor de la vía Wnt /p-catenina, un actor importante en la alopecia;
• P16, proteína del ciclo celular, asociada a la senescencia prematura de fibroblastos de la papila dérmica de la zona alopécica.
Este estudio se llevó a cabo mediante ensayo ELISA y PCR cuantitativa, según el protocolo operativo que se describe a continuación.
En el D0, los fibroblastos humanos de la papila dérmica se siembran en medio de cultivo y se incuban a 37 °C. En el D3, los fibroblastos se tratan con una solución de DHT que contiene o no el principio activo al 0,02 % y al 0,04 % (V/V final).
En el D5, al final de la incubación, se recuperan los sobrenadantes celulares. El ensayo de IL-6 se realiza usando un kit de ensayo ELISA. Los ARN se sometieron a transcripción inversa y los ADN complementarios obtenidos se analizaron mediante la técnica de PCR cuantitativa.
También se estudió la expresión de ARNm de DKK1 y P16. En paralelo, se analizaron los ARNm de la proteína ribosómica S27 (RPS27), de la hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1), de la beta-glucuronidasa (GUSB) como controles de referencia internos para la normalización.
La cuantificación de la incorporación de fluorescencia (SYBR Green) se mide de forma continua usando un termociclador. El análisis de los Ct (cuantificación relativa) se realiza con ayuda de un software.
Los resultados se muestran en las Tablas 6 y 7.
Tabla 6. Efecto de un hidrolizado de Pichia minuta sobre la liberación de interleucina 6 por fibroblastos de la papila dérmica en un modelo normal o alopécico.
Tabla 7. Efecto de un hidrolizado de Pichia minuta sobre la expresión de DKK1 y P16 por fibroblastos de la papila dérmica en un modelo normal o alopécico.
Se observa que la DHT aumenta significativamente la secreción de IL-6 y la expresión de DKK1 y P16 por los fibroblastos humanos de la papila dérmica, imitando así la modificación de la expresión de moléculas de "señal" descritas en la alopecia androgenética.
Probado al 0,04 %, el principio activo según la invención permite limitar significativamente la secreción de IL-6 en un 97 % y las expresiones de DKK1 y P16 en un 91 % y 71 % respectivamente. Por tanto, corrige la producción anormal de moléculas de "señal" implicadas en la alopecia androgenética.
° 3. Efecto de un hidrolizado de Pichia minuta según la invención sobre las modificaciones epigenéticas asociadas a la alopecia androgenética
El objetivo de este estudio es evaluar el efecto de un principio activo según la invención sobre las modificaciones epigenéticas asociadas a la alopecia androgenética.
Para ello, se evaluó la expresión de miARN en un modelo de fibroblastos humanos de papila dérmica, tratados con una solución de dihidrotestosterona (DHT) (con el fin de imitar la alopecia). Este estudio se centra en dos miARN implicados en el crecimiento del cabello: 3663-3p y let-7a-3p cuyas expresiones son inducidas por DHT. Entre las rutas biológicas a las que se dirigen estos miARN, se encuentra en particular la ruta de señalización de Wnt /pcatenina, que es esencial para el crecimiento del cabello.
El estudio se realizó mediante PCR cuantitativa, según el siguiente protocolo operativo.
En el D0, los fibroblastos humanos de la papila dérmica se inoculan en medio de cultivo y se incuban a 37 °C en una atmósfera que contiene 5 % de CO2.
En el D3, los fibroblastos se tratan con una solución de DHT que contiene o no el principio activo según la invención al 0,02 % y al 0,04 % (V/V final).
En el D4, los ARN se sometieron a transcripción inversa y los ADN complementarios obtenidos se analizaron mediante la técnica de PCR cuantitativa.
La expresión de microARN: Se han estudiado 3663-3p y let-7a-3p.
Paralelamente, se analizó la caja 68 de ARN nucleolar pequeño C/D (SNORD68) como control de referencia interno para la normalización,
La cuantificación de la incorporación de fluorescencia se mide de forma continua usando un termociclador. El análisis de los Ct (cuantificación relativa) se realiza con ayuda de un software.
Los resultados se dan en la Tabla 8.
Tabla 8. Efecto de un hidrolizado de Pichia minuta sobre la expresión de miARN 3663-3p y let-7a-3p por fibroblastos de la papila dérmica en un modelo normal o alopécico.
La DHT induce la expresión de miARN 3663-3p y let-7a-3p en fibroblastos humanos de la papila dérmica, imitando así los cambios epigenéticos asociados con la alopecia androgenética.
Se encuentra que, probado al 0,04 %, un hidrolizado de Pichia minuta reduce significativamente la expresión de miARN 3663-3p y let-7a-3p en un 50 % y 89 %, respectivamente. Así, un principio activo según la invención permite limitar las modificaciones epigenéticas asociadas a la alopecia androgenética.
° 4. Efecto de un hidrolizado de Pichia minuta según la invención sobre la actividad de la papila dérmica en la alopecia androgenética
El objetivo de este estudio es evaluar el efecto de un principio activo según la invención sobre la activación de la papila dérmica.
Para ello, se midió la síntesis de versican. Es un proteoglicano específico para la fase de crecimiento. La evaluación se realizó en un modelo 3D de fibroblastos en forma de esferoides, tratados con una solución de DHT. Por tanto, este modelo imita la inactivación de la papila dérmica, un factor que contribuye al defecto de crecimiento asociado con la alopecia androgenética.
El estudio se realizó mediante marcaje inmunohistológico según el siguiente protocolo operativo.
En el D0, los fibroblastos humanos de la papila dérmica se siembran en medio de cultivo y se incuban a 37 °C.
En el D1, los esferoides formados se tratan con una solución de DHT que contiene o no el principio activo según la invención al 0,04 % (V/V final).
En el D4, los esferoides se recuperan y fijan.
Se realiza una tinción inmunohistológica de versican. La visualización se realiza en un microscopio confocal acoplado a un sistema de análisis de imágenes.
La síntesis de versican es proporcional a la intensidad de la fluorescencia (color verde) presente en los esferoides. Los núcleos de las células aparecen teñidos de azul.
Siendo los resultados cualitativos, hemos definido 3 niveles de síntesis de versican:
• Síntesis débil
• Síntesis promedio +
• Síntesis fuerte ++
Los resultados se dan en la Tabla 9.
Tabla 9. Efecto de un hidrolizado de Pichia minuta sobre la síntesis de versican en esferoides de fibroblastos de papila dérmica en un modelo alopécico.
La DHT induce una disminución en la síntesis de versican, en un modelo de fibroblastos de papila dérmica humana en forma de esferoides, imitando una inactivación de la papila dérmica inducida durante la alopecia androgenética. Se encuentra que ensayado al 0,04 %, el principio activo según la invención estimula la síntesis de versican en este modelo. Así, ayuda a mantener la actividad de la papila dérmica y su capacidad para inducir el crecimiento del folículo piloso.
° 5. Efecto de un hidrolizado de Pichia minuta según la invención sobre el crecimiento del folículo piloso en la alopecia androgenética
El objetivo de este estudio es evaluar la capacidad de un principio activo según la invención, para mantener el folículo piloso en una fase de crecimiento (fase anágena).
Para ello, realizamos un estudio sobre el modelo de cultivo de folículos pilosos. ex vivo desarrollado por Philpott y otros tratado con una solución de DHT para imitar la reducción del crecimiento asociada con la alopecia androgenética. Esta capacidad se evaluó midiendo:
• alargamiento del folículo piloso;
• la síntesis de versican y Ki-67, dos proteínas clave en el crecimiento del cabello.
La evaluación del alargamiento se realiza midiendo el tamaño de los folículos pilosos después de fotografías. Las síntesis de versican y Ki-67 se estudian mediante marcaje inmunohistológico. El protocolo de funcionamiento se describe a continuación.
En el D0, los folículos pilosos se obtienen a partir de fragmentos del cuero cabelludo y se incuban en medio de cultivo a 37 °C.
En el D1, los folículos se fotografían y miden en un microscopio acoplado a un sistema de análisis de imágenes.
A continuación, los folículos seleccionados (en fase anágena) se tratan con una solución de DHT que contiene o no el principio activo según la invención al 0,02 % y al 0,04 % (V/V final).
En D5 se realizan dos estudios: el estudio del alargamiento del folículo piloso y el estudio de la síntesis de versican y Ki-67.
- Estudio del alargamiento del folículo piloso
Los folículos se fotografían y miden en un microscopio acoplado a un sistema de análisis de imágenes. El alargamiento de cada folículo es igual a su crecimiento entre D0-D5.
Los folículos se tratan con una solución de DHT que contiene o no el principio activo al 0,02 % y al 0,04 % (V/Vfinal). - Estudio de la síntesis de versican y Ki-67
Los folículos se recuperan y se incluyen en Tissue-Tek® y luego se congelan. A continuación, se realizan secciones (4 |_im) usando un criostato. Se realiza una tinción inmunohistológica de versican y Ki-67. La visualización se realiza en un microscopio confocal acoplado a un sistema de análisis de imágenes.
La síntesis de versican es proporcional a la intensidad de la fluorescencia (color verde) presente en las secciones de los folículos pilosos.
La síntesis de Ki67 es proporcional a la intensidad de la fluorescencia (color amarillo) presente en las secciones de los folículos pilosos.
En el D7, los folículos se vuelven a fotografiar y a medir. El alargamiento de cada folículo es igual a su crecimiento entre D0-D7.
Los resultados del efecto sobre el alargamiento del folículo piloso se dan en la Tabla 10.
Tabla 10. Efecto de un hidrolizado de Pichia minuta sobre el crecimiento de los folículos pilosos ex vivo en un modelo alopécico.
Se observa que la DHT reduce significativamente el crecimiento de los folículos pilosos en D5 y D7, en -31 % y -37 % respectivamente. Por lo tanto, la DHT imita el defecto de crecimiento del cabello asociado con la alopecia androgenética.
Probado al 0,04 %, un principio activo según la invención permite aumentar significativamente el crecimiento de los folículos pilosos en D5 y D7, en 31 % y 37 % respectivamente.
Los resultados del efecto sobre la matriz del cabello del folículo piloso se dan en la Tabla 11.
Siendo los resultados cualitativos, se definieron 3 niveles de síntesis de versican y Ki-67:
• Síntesis débil
• Síntesis promedio +
• Síntesis fuerte ++
Tabla 11. Efecto de un hidrolizado de Pichia minuta sobre la síntesis de versican y Ki-67 por los folículos pilosos ex vivo en un modelo alopécico.
Se encuentra que la DHT reduce significativamente la síntesis de versican y Ki-67. Por tanto, la DHT imita las alteraciones metabólicas asociadas con la alopecia androgenética.
Probado al 0,04 %, un principio activo según la invención permite conservar una síntesis significativa de versican y el poder proliferativo de los queratinocitos.
Así, el uso según la invención permite limitar la reducción del crecimiento asociada a la alopecia androgenética y mantiene los folículos pilosos en fase anágena.
II. PRUEBAS IN VIVO
Los voluntarios que participaron en las pruebas in vivo fueron seleccionados de acuerdo con varios criterios. Se trata de hombres menores de 55 años, con alopecia leve a moderada y con un mínimo del 20 % de cabello en fase telógena.
° 1. Efecto de un hidrolizado de Pichia minuta según la invención sobre el crecimiento del cabello
El objetivo de este estudio fue evaluar, en vivo, el efecto anticaída de un principio activo según la invención (Ejemplo 2) formulado al 0,3 % en una loción (Ejemplo 7), en voluntarios con alopecia leve a moderada.
Este estudio se realizó en 22 voluntarios de entre 31 y 55 años (edad media 43 ± 8 años), habiéndose aplicado 1 mL de la loción según la invención por la mañana y por la noche durante 8 meses. El efecto anticaída se estudió mediante el método del fototricograma a partir de medidas tomadas en T0, 3, 6 y 8 meses después del inicio del tratamiento. Se analizaron los siguientes parámetros:
• densidad capilar,
• número de cabellos en la fase anágena: indicador del crecimiento del cabello;
• número de cabellos en fase telógena: indicador de caída del cabello;
• relación anágeno /telógeno: coeficiente de crecimiento del cabello.
En la Tabla 12 se muestra un resumen de los resultados de la densidad del cabello.
Tabla 12. Efecto de un hidrolizado de Pichia minuta formulado al 0,3 % sobre la densidad del cabello después de 3,
6 y 8 meses de aplicaciones dos veces al día.
Se observa que un principio activo según la invención, formulado al 0,3 % aumenta la densidad capilar a partir de los 3 meses de aplicación (+21,3 %). Este efecto se prolonga e intensifica a los 6 y 8 meses de tratamiento (+22,1 y 24,9 % respectivamente).
En la Tabla 13 se muestra un resumen de los resultados sobre el crecimiento del cabello.
Tabla 13. Efecto de un hidrolizado de Pichia minuta formulado al 0.3 % sobre el crecimiento del cabello después de 3, 6 y 8 meses de aplicaciones dos veces al día.
Se observa que el principio activo según la invención muestra una acción sobre el crecimiento del cabello, a partir de los 3 meses de aplicación, que se intensifica durante el tratamiento.
Esto da como resultado un aumento estadísticamente significativo en la proporción de cabells en la fase anágena. Además, hay un aumento significativo en la relación Anágeno /Telógeno.
En la Tabla 14 se presenta un resumen de los resultados sobre la disminución del número de cabellos en la fase telógena capilar. Este parámetro, característico de la reducción de la caída del cabello, se evaluó mediante fototricograma.
Tabla 13. Efecto de un hidrolizado de Pichia minuta formulado al 0,3 % sobre la reducción del cabello en fase telógena tras 3, 6 y 8 meses de aplicaciones dos veces al día.
En las condiciones de este estudio, el principio activo según la invención, formulado al 0,3 % en una loción, disminuye significativamente la proporción de cabello en fase telógena a partir de los 3 meses de aplicación (-14,0 %). Este efecto se intensifica a los 6 y 8 meses de tratamiento (-21,9 % y -26,1 % respectivamente).
Estos resultados diferentes se ilustran en las Figuras 5A /6A (en el D0 antes de la aplicación) y 5B /6B (después de 8 meses de aplicación). La ganancia total de cabello en el cuero cabelludo entre el D0 y D8 meses para esta ilustración es 74160 cabellos.
Estimulando el crecimiento del cabello (fase anágena) y reduciendo la proporción de cabello en fase telógena, el uso de un principio activo según la invención permite fortalecer y redensificar el cabello.
° 2. Efecto de un hidrolizado de Pichia minuta según la invención sobre la caída del cabello
El objetivo de este estudio fue evaluar, en vivo, la capacidad de un principio activo según la invención (Ejemplo 2) formulado al 0,3 % en loción (Ejemplo 7), para frenar la caída del cabello en voluntarios que presentan alopecia leve a moderada.
Este estudio se realizó en 22 voluntarios de entre 31 y 55 años (edad media 43 ± 8 años), habiéndose aplicado por la mañana y por la noche 1 mL de la loción según la invención.
La extensión de la caída del cabello se estudió mediante el método de prueba de lavado realizado antes, así como 3, 6 y 8 meses después del inicio del tratamiento.
En la Tabla 14 se presenta un resumen de los resultados correspondientes al efecto de un principio activo según la invención formulado al 0,3 % sobre la caída del cabello evaluada contando después de la prueba de lavado.
Tabla 14. Efecto de un hidrolizado de Pichia minuta formulado al 0,3% en loción para la caída del cabello después de 3, 6 y 8 meses de aplicaciones dos veces al día.
En las condiciones de este estudio, a partir de 3 meses de aplicaciones dos veces al día, la composición según la invención ralentiza la caída del cabello al reducir en un 21,2 % el número de cabellos recuperados tras el lavado con champú.
Este efecto se prolonga e intensifica después de 6 meses de tratamiento para alcanzar una disminución promedio de la caída del cabello del 30,9 %, siendo la disminución máxima del 81 %. Más de 8 de cada 10 voluntarios mostraron este efecto.
Finalmente, después de 8 meses de tratamiento, la invención estabiliza la caída del cabello limitando a 34,0 % el número de cabellos perdidos.
OMPARATIVAS: COMPARACIÓN DEL PRINCIPIO ACTIVO SEGÚN LA INVENCIÓN CON OTROS 
OS DE LEVADURAS
Ensayo comparativo 1
El objetivo de este ensayo es mostrar la importancia de la elección de la levadura.
Se implementó un proceso de hidrólisis enzimática idéntico en 3 biomasas:
• una biomasa de Pichia minuta
• una biomasa de Pichia heedii
• una biomasa de Saccharomyces cerevisiae
Este proceso consiste en la implementación de las siguientes etapas:
• solubilización de biomasa en agua a una tasa de 100 g /L,
• hidrólisis enzimática con ayuda de una proteasa,
• inactivación enzimática térmica a 80 °C durante 1 hora,
• decantación para eliminar la fase insoluble, recuperar el sobrenadante,
• filtración y recuperación del filtrado.
Las características analíticas de los productos obtenidos se presentan en la tabla más abajo:
Tabla 15. Características analíticas de los tres hidrolizados de levadura
Se observa que estos hidrolizados no presentan las mismas características analíticas, en particular en lo que se refiere a contenidos de proteínas que son muy diferentes para los 3 productos obtenidos de un mismo proceso pero de diferentes levaduras.
El tamaño de las proteínas también es diferente, como puede verse en el cromatograma de proteínas de los tres productos, como se muestra en la Figura 3.
A continuación, estos 3 hidrolizados se probaron para determinar su efecto sobre la expresión de P16, habiéndose realizado las pruebas de acuerdo con las condiciones y el protocolo descritos en el punto I.2 de la parte de evaluación del efecto cosmético de la presente solicitud.
Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 16.
Tabla 16. Capacidad de los tres hidrolizados para inhibir P16.
Estos resultados muestran claramente que la elección de la levadura es importante, ya que el mismo proceso de producción del ingrediente activo aplicado a 3 biomasas de levaduras de la misma familia, da como resultado tres productos diferentes, de los cuales solo uno es efectivo en un parámetro principal en la lucha contra la caída del cabello.
Ensayo comparativo 2
El objetivo de este ensayo es comparar la eficacia de un ingrediente activo cosmético, un hidrolizado de Pichia anómala descrito en la patente FR3016521, a la del principio activo según la invención para demostrar que un principio activo cosmético derivado de una levadura del tipo Pichia, no necesariamente funciona.
La caracterización analítica de los dos activos se presenta en la Tabla 17.
Tabla 17. Características analíticas de los dos hidrolizados
Se observa que estos hidrolizados tienen características analíticas similares, en particular en lo que respecta a los contenidos de proteína que son idénticos.
La caracterización de la fracción proteica se presenta en la Tabla 18.
Tabla 18. Caracterización de la fracción proteica de los dos hidrolizados
El tamaño de la proteína también es similar, ya que ambos hidrolizados contienen 59 % de proteína, de la cual más del 87 % tiene un peso molecular inferior a 5 kDa.
A continuación, estos 2 hidrolizados se probaron para determinar su efecto sobre la expresión de P16, habiéndose realizado las pruebas de acuerdo con las condiciones y el protocolo descritos en el punto I.2 de la parte de evaluación del efecto cosmético de la presente solicitud.
Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 19.
Tabla 19. Capacidad de los dos hidrolizados para inhibir P16.
Estos resultados muestran además que es obvio que la elección de la levadura es importante, ya que un hidrolizado de Pichia anómala de una levadura del género Pichia, además de tener el mismo contenido de proteínas que el hidrolizado de Pichia minuta con el que se compara, no tiene eficacia sobre el marcador de cabello elegido.
Ensayo comparativo 3
El objetivo de este ensayo es comparar la eficacia de un hidrolizado de Torulaspora delbrueckii, descrito en la patente FR2979541, al del principio activo según la invención del Ejemplo 1, para mostrar que un ingrediente activo cosmético derivado de una levadura que presenta una característica analítica similar, no necesariamente funciona.
La caracterización analítica de los dos activos se presenta en la Tabla 20.
Tabla 20. Características analíticas de los dos hidrolizados
Se observa que estos hidrolizados tienen características analíticas similares, en particular en lo que respecta a los contenidos de proteínas que son similares.
La caracterización de la fracción proteica se presenta en la Tabla 21.
Tabla 21. Caracterización de la fracción proteica de los dos hidrolizados
El tamaño de las proteínas también es similar, ya que los dos hidrolizados contienen más del 93 % y tienen un peso molecular inferior a 5 kDa.
A continuación, estos 2 hidrolizados se probaron para determinar su efecto sobre la expresión de P16, habiéndose realizado las pruebas de acuerdo con las condiciones y el protocolo descritos en el punto I.2 de la parte de evaluación del efecto cosmético de la presente solicitud.
Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 22.
Tabla 22. Capacidad de los dos hidrolizados para inhibir P16.
Estos resultados también muestran que la elección de la levadura es importante, ya que un hidrolizado de otra levadura que exhibe una caracterización analítica similar (contenido de proteína /ceniza /azúcar) y tamaños de proteína idénticos (93 % de proteínas <5000 Da), no exhibe eficacia sobre el marcador capilar elegido.
Ensayo comparativo 4
El propósito de este ensayo es demostrar que un hidrolizado de Pichia minuta, no tiene las mismas características analíticas y, por lo tanto, es diferente de una biomasa de Pichia minuta, tal como existe en la naturaleza.
En primer lugar, el hidrolizado no contiene levaduras vivas, mientras que la biomasa sí.
El método de cultivo de microorganismos en agar permite este control. Para el hidrolizado del Ejemplo 1 por un lado y para una biomasa de Pichia minuta de otra parte se implementó:
• Aislamiento por estrías en placas con asa de 1|_iL,
• Medio de cultivo: Sabouraud,
• Incubación 48 h a 30 °C
Los resultados se muestran en la Figura 4B para el hidrolizado y en la Figura 4A para la biomasa.
No se observa crecimiento (Figura 4B) en el agar con el hidrolizado del Ejemplo 1, mientras que por otro lado se constata (Figura 4A), el crecimiento de colonias grasas blancas, redondas, brillantes y con un diámetro menor de 0,5 mm en el agar con la biomasa de Pichia minuta.
La caracterización analítica del hidrolizado del Ejemplo 1 y de una biomasa de Pichia minuta se presenta además en la Tabla 23.
Tabla 23. Características analíticas del hidrolizado según la invención y de una biomasa de Pichia minuta
Estos resultados muestran claramente que existen importantes diferencias analíticas entre una biomasa y un hidrolizado de Pichia minuta. La biomasa constituye la materia prima natural a la que se aplica el proceso de hidrólisis enzimática para obtener el principio activo según la invención, el hidrolizado de Pichia minuta.
Claims (18)
1. Principio activo cosmético caracterizado porque es un hidrolizado de Pichia minuta.
2. Principio activo cosmético según la reivindicación 1, caracterizado porque el hidrolizado de Pichia minuta comprende al menos péptidos.
3. Principio activo cosmético según la reivindicación anterior, caracterizado porque al menos 50 % en peso de los compuestos peptídicos del hidrolizado está compuesto por péptidos que tienen un peso molecular inferior a 3500 Da.
4. Principio activo cosmético según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende péptidos con un peso molecular inferior a 3500 Da y porque estos péptidos con un peso molecular inferior a 3500 Da representan al menos 40 % en peso de la materia seca total del hidrolizado.
5. Principio activo cosmético según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el hidrolizado comprende azúcares y porque los azúcares representan al menos 5 % en peso de la materia seca total del hidrolizado.
6. Principio activo cosmético según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el hidrolizado también comprende minerales.
7. Principio activo cosmético según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se presenta en forma líquida.
8. Principio activo cosmético según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el hidrolizado es un hidrolizado enzimático o químico.
9. Principio activo cosmético según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se presenta en forma sólida y porque está compuesto por el hidrolizado de Pichia minuta y por un soporte de pulverización seleccionado de maltodextrina, goma arábiga, lecitina de soja o isomalt.
10. Principio activo cosmético según la reivindicación 9, caracterizado porque el hidrolizado Pichia minuta representa entre 25 y 75 % en peso del principio activo.
11. Uso no terapéutico de un principio activo según una de las reivindicaciones 1 a 10 por aplicación sobre el cabello y/o el cuero cabelludo, para luchar contra la caída del cabello y activar su crecimiento.
12. Principio activo según una de las reivindicaciones 1 a 10 destinado a ser usado en un método para tratar una alopecia androgenética.
13. Uso no terapéutico de un principio activo según la reivindicación 11 para estimular el crecimiento del folículo piloso.
14. Composición cosmética que comprende al menos 0,05 % en peso de un principio activo según una de las reivindicaciones 1 a 10.
15. Composición cosmética según la reivindicación 14, caracterizada porque se presenta en forma de loción, champú, crema o espuma.
16. Proceso cosmético no terapéutico para luchar contra la caída del cabello y activar su crecimiento, caracterizado porque consiste en aplicar sobre el cabello o el cuero cabelludo una composición según una de las reivindicaciones 14 o 15.
17. Proceso cosmético no terapéutico para luchar contra la caída del cabello y activar su crecimiento, caracterizado porque consiste en aplicar sobre el cabello o el cuero cabelludo al menos una vez al día durante al menos un mes una composición según una de las reivindicaciones 14 o 15.
18. Composición según una de las reivindicaciones 14 o 15 para su uso en un método de tratamiento de la alopecia androgenética.
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