ES2855701T3 - Composiciones que comprenden cepas bacterianas - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende una cepa bacteriana del género Parabacteroides, para su uso en un método de tratamiento o prevención de un trastorno neurodegenerativo seleccionado del grupo que consiste de: enfermedad de Parkinson, incluyendo parálisis supranuclear progresiva, parálisis supranuclear progresiva, síndrome de Steele- Richardson-Olszewski, hidrocefalia de presión normal, parkinsonismo vascular o arterioesclerótico y parkinsonismo inducido por fármacos; enfermedad de Alzheimer, incluyendo el síndrome de Benson; enfermedad de Huntington; esclerosis lateral amiotrófica; enfermedad de Lou Gehrig; enfermedad de las neuronas motoras; enfermedad por priones; ataxia espinocerebelosa; atrofia muscular espinal; demencia, incluyendo la demencia con cuerpos de Lewy, vascular y frontotemporal; afasia progresiva primaria; deterioro cognitivo leve; deterioro cognitivo relacionado con el VIH y degeneración corticobasal.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones que comprenden cepas bacterianas
CAMPO TÉCNICO
Esta invención se encuentra en el campo de las composiciones que comprenden cepas bacterianas aisladas del tracto digestivo de mamíferos y el uso de tales composiciones en el tratamiento de enfermedades. ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Se piensa que el intestino humano es estéril en el útero, pero está expuesto a una gran variedad de microbios maternos y ambientales inmediatamente después del nacimiento. A partir de entonces, se produce un período dinámico de colonización y sucesión microbiana, que está influenciado por factores como el modo de parto, el medio ambiente, la dieta y el genotipo del huésped, todos los cuales afectan la composición de la microbiota intestinal, particularmente durante la vida temprana. Posteriormente, la microbiota se estabiliza y se vuelve adulta [1]. La microbiota intestinal humana contiene más de 500-1000 filotipos diferentes que pertenecen esencialmente a dos divisiones bacterianas principales, Bacteroidetes y Firmicutes [2]. Las relaciones simbióticas exitosas que surgen de la colonización bacteriana del intestino humano han producido una amplia variedad de funciones metabólicas, estructurales, protectoras y otras funciones beneficiosas. Las actividades metabólicas mejoradas del intestino colonizado aseguran que los componentes de la dieta que de otro modo no serían digeribles se degraden con la liberación de subproductos que proporcionan una importante fuente de nutrientes para el huésped. De manera similar, la importancia inmunológica de la microbiota intestinal está bien reconocida y se ejemplifica en animales libres de gérmenes que tienen un sistema inmunológico deteriorado que se reconstituye funcionalmente después de la introducción de bacterias comensales [3-5].
Se han documentado cambios drásticos en la composición de la microbiota en trastornos gastrointestinales como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). Por ejemplo, los niveles de la bacteria Clostridium cluster XIVa se reducen en pacientes con EII mientras que el número de E. coli aumenta, lo que sugiere un cambio en el equilibrio de simbiontes y patobiontes dentro del intestino [6-9].
En reconocimiento del posible efecto positivo que pueden tener ciertas cepas bacterianas sobre el intestino del animal, se han propuesto varias cepas para su uso en el tratamiento de diversas enfermedades (ver, por ejemplo, [10-13]). Además, se han propuesto ciertas cepas, incluyendo principalmente cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium, para su uso en el tratamiento de varias enfermedades inflamatorias y autoinmunes que no están directamente relacionadas con los intestinos (ver [14] y [15] para revisiones). Sin embargo, la relación entre diferentes enfermedades y diferentes cepas bacterianas, y los efectos precisos de cepas bacterianas particulares sobre el intestino y a nivel sistémico y sobre cualquier tipo particular de enfermedad, están pobremente caracterizados, particularmente para los trastornos neurodegenerativos.
Recientemente, ha aumentado el interés en la técnica con respecto a las alteraciones en el microbioma intestinal que pueden desempeñar un papel fisiopatológico en las enfermedades del cerebro humano [16]. La evidencia preclínica y clínica sugiere fuertemente un vínculo entre el desarrollo del cerebro y la microbiota [17]. Un cuerpo creciente de la bibliografía preclínica ha demostrado la señalización bidireccional entre el cerebro y el microbioma intestinal, que implica múltiples sistemas de señalización neurocrina y endocrina. De hecho, los niveles aumentados de especies de Clostridium en el microbioma se ha relacionado con trastornos cerebrales [18], y un desequilibrio de los filos de Bacteroidetes y Finnicutes también se ha relacionado con trastornos en el desarrollo del cerebro [19]. Sugerencias de que los niveles alterados de comensales intestinales, incluidos los de los géneros Bifidobacterium, Lactobacillus, Sutterella, Prevotella y Ruminococcus y de la familia Alcaligenaceae están implicados en trastornos inmunomediados del sistema nervioso central (SNC), son cuestionados por estudios que sugieren una falta de alteración de la microbiota entre pacientes y sujetos sanos [10]. Parabacteroides distasonis se ha propuesto para el tratamiento de una variedad de trastornos que incluyen asma, artritis reumatoide y esclerosis múltiple [20].
Al igual que el asma y la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple está mediada principalmente por el sistema inmunológico. El sistema inmunológico ataca los axones mielinizados en el sistema nervioso central, destruyendo la mielina llamada placas o lesiones. La desmielinización se produce en particular en los nervios ópticos, médula espinal subpial, tronco cerebral, cerebelo y regiones de la sustancia blanca yuxtacortical y periventricular.
Como tal, la esclerosis múltiple tiene una patología diferente a otras enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer o la demencia. Por ejemplo, la esclerosis múltiple se diagnostica comúnmente en pacientes de entre 20 y 30 años, mientras que muchas otras enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson, el Alzheimer y la demencia, se diagnostican predominantemente en pacientes mayores de 65 años.
La enfermedad de Parkinson, como muchas enfermedades neurodegenerativas, está mediada principalmente por la acumulación de proteínas mal plegadas. La enfermedad de Parkinson es una sinucleinopatología que implica la acumulación de a-sinucleína, que se agrega como fibrillas insolubles en cuerpos de Lewy dentro del citoplasma del cuerpo neuronal. La acumulación de a-sinucleína es tóxica y altera las funciones de las mitocondrias, los lisosomas y el retículo endoplásmico, e interfiere con el transporte de microtúbulos.
Se ha probado la eficacia de los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), como el ibuprofeno, en el tratamiento de una variedad de enfermedades neurológicas, pero el impacto clínico de los AINE sobre las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson sigue sin estar claro. Aunque algunos estudios mostraron que el uso crónico de AINE protege contra la enfermedad de Parkinson, otros estudios no pudieron confirmar la existencia de una relación significativa. Un metaanálisis reciente indicó que el uso de AINE sin aspirina, en particular ibuprofeno, reduce el riesgo de EP en un 15%, mientras que el uso de aspirina no mostró ningún efecto [21].
En la actualidad, el efecto práctico del vínculo entre el microbioma y las enfermedades del cerebro humano está pobremente caracterizado. En consecuencia, se requieren estudios analíticos más directos para identificar el impacto terapéutico de la alteración del microbioma sobre los trastornos neurodegenerativos.
Hay un requisito en la técnica de nuevos métodos para tratar trastornos neurodegenerativos. También hay un requisito de caracterizar los efectos potenciales de las bacterias intestinales para poder desarrollar nuevas terapias que usen bacterias intestinales.
La WO2016/203220 describen composiciones que comprenden una cepa bacteriana del género Parabacteroides para su uso en un método de tratamiento o prevención de enfermedades inflamatorias y autoinmunes mediadas por IL-17 o la vía de ThI7. Yang Fang et al. (Int J Clin Exp Med 2016;9(9):17946-17951) describen niveles más altos de citoquinas en la sangre periférica de pacientes con enfermedad de Parkinson en comparación con un grupo de control sano. Waisman Ari et al. (Acta Neuropathol 2015; 129:625-637) describen IL-17 y su papel en el sistema nervioso central.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Los inventores han desarrollado nuevas terapias para tratar y prevenir trastornos neurodegenerativos. Los inventores han identificado que las cepas bacterianas del género Parabacteroides pueden ser eficaces para tratar enfermedades neurodegenerativas. Como se describe en los ejemplos, la administración de composiciones que comprenden Parabacteroides distasonis puede proteger contra especies reactivas de oxígeno y prevenir la inflamación, actuando así como neuroprotector. Los inventores también han identificado que el tratamiento con Parabacteroides distasonis puede reducir la activación de moléculas proinflamatorias, como NFkB e IL-6, por LPS y a-sinucleína A53T mutante. Los inventores han identificado que el tratamiento con Parabacteroides distasonis puede reducir la actividad de desacetilación de histonas y la peroxidación de lípidos in vitro, lo que puede ayudar a reducir la muerte celular y la apoptosis. Los inventores también han identificado que Parabacteroides distasonis puede producir indol que puede atenuar la inflamación y el estrés oxidativo. Además, los inventores han demostrado que el tratamiento con Parabacteroides distasonis puede aumentar los niveles de quinurenina.
Los inventores también han descubierto que el tratamiento con Parabacteroides distasonis aumenta la activación de BDNF. El BDNF es un factor de crecimiento neurotrófico que se ha demostrado que mejora la diferenciación y la supervivencia neuronal. Por tanto, las composiciones de la invención pueden usarse en un método para mejorar la supervivencia de las células nerviosas en el tratamiento o la prevención de enfermedades neurodegenerativas.
La invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Parabacteroides, para su uso en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste de: enfermedad de Parkinson, que incluye parálisis supranuclear progresiva, parálisis supranuclear progresiva, síndrome de Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalia de presión normal, parkinsonismo vascular o arterioesclerótico y parkinsonismo inducido por fármacos; enfermedad de Alzheimer, incluyendo el síndrome de Benson; enfermedad de Huntington; esclerosis lateral amiotrófica; enfermedad de Lou Gehrig; enfermedad de las neuronas motoras; enfermedad por priones; ataxia espinocerebelosa; atrofia muscular espinal; demencia, incluyendo la demencia con cuerpos de Lewy, vascular y frontotemporal; afasia progresiva primaria; deterioro cognitivo leve; deterioro cognitivo relacionado con el VIH y degeneración corticobasal.
En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Parabacteroides, para su uso en un método de tratamiento o prevención de la enfermedad de Parkinson, como Parkinson ambiental, familiar o asociada con un estado inflamatorio general. Los inventores han identificado que el tratamiento con cepas de Parabacteroides puede reducir la activación de moléculas proinflamatorias, como NFkB e IL-6, por LPS y a-sinucleína A53T mutante en modelos in vitro de Parkinson ambiental y familiar. En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Parabacteroides distasonis, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Las composiciones que usan Parabacteroides distasonis pueden ser particularmente eficaces para tratar el Parkinson.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en un método para tratar o prevenir una enfermedad neurodegenerativa de aparición temprana. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en un método para prevenir o retrasar la aparición o progresión de un trastorno neurodegenerativo.
En realizaciones preferidas de la invención, la cepa bacteriana en la composición es de Parabacteroides distasonis. También pueden usarse cepas estrechamente relacionadas, como cepas bacterianas que tienen una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la secuencia de ARNr 16S de un cepa bacteriana de Parabacteroides distasonis. Preferiblemente, la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 78 o 9. Preferiblemente, la identidad de secuencia es con la SEQ ID NO: 9. Preferiblemente, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene la secuencia de ARNr 16S representada por la SEQ ID NO: 9.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención es para administración oral. La administración oral de las cepas de la invención puede ser eficaz para los trastornos neurodegenerativos. Además, la administración oral es conveniente para pacientes y practicantes médicos y permite la administración y/o la colonización parcial o total del intestino.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención comprende uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención comprende una cepa bacteriana que ha sido liofilizada. La liofilización es una técnica eficaz y conveniente para preparar composiciones estables que permiten la administración de bacterias.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona un producto alimenticio que comprende la composición descrita anteriormente.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición de vacuna que comprende la composición descrita anteriormente.
En ciertas realizaciones de la invención, la composición es para su uso en el tratamiento de lesiones cerebrales. La actividad neuroprotectora de las composiciones de la invención y su capacidad para reducir los niveles de actividad de la histona desacetilasa (HDAC) puede hacerlas útiles para tratar lesiones cerebrales. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de un derrame cerebral, como el tratamiento de una lesión cerebral resultante de un derrame cerebral.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1: Viabilidad celular de las células de neuroblastoma
Figura 2A: Regulación por disminución de la secreción de IL-6; Figura 2B: Regulación por disminución de la secreción de IL-8
Figura 3: Inhibición de secreción de IL-8 y de IL-6 por a-sinucleína
Figura 4: Inhibición de la activación del promotor de NFkB inducida por a-sinucleína
Figura 5: Inhibición de la activación del promotor de NFkB inducida por LPS
Figura 6: Cambio en la capacidad antioxidante
Figura 7: Cambio en la capacidad antioxidante total (oxidación de lípidos)
Figura 8: Cambio en la actividad de la histona desacetilatasa (HDAC)
Figura 9: Nivel de producción de indol
Figura 10: Nivel de producción de quirunenina
Figura 11: Neuroprotección - viabilidad celular. La Figura 11 muestra los mismos datos que Figura 1.
Figura 12: Niveles de producción de metabolitos - neurotransmisores en el cerebro.
Figura 13: Niveles de producción de metabolitos - ácidos orgánicos en el sobrenadante.
Figura 14: Efecto sobre la función de barrera intestinal.
Figura 15: Nivel de producción de BDNF
Figura 16: Cambio en los niveles de ROS en (A) células U373; (B) células SH-SY5Y
Figura 17: Producción de neurotransmisores en el cerebro.
Figura 18: Cambios en la expresión del receptor del hipocampo - A) Receptor de oxitocina, B) Receptor de vasopresina, C) Receptor de glucocorticoides y D) Receptor de mineralocorticoides
Figura 19: Cambios en la expresión del hipocampo de A) Hormona liberadora de corticotropina (CRH), B) Expresión BDNF y C) TLR4
Figura 20: A) Cambios en la expresión del receptor 1 de la hormona liberadora de corticotropina (CRFR1) del hipocampo, B) Expresión del receptor 2 de la hormona liberadora de corticotropina (CRFR2)
Figura 21: Cambios en la expresión del hipocampo de A) Factor de necrosis tumoral, B) Interleucina 1b y C) IL-6
Figura 22: A) Cambios en la expresión de integrina alfa M (CD11b) del hipocampo. B) Cambios en la expresión del receptor de serotonina 1A (receptor 5-HT1A) del hipocampo
Figura 23: A) Cambios en la subunidad 2A tipo NMDA del receptor ionotrópico del glutamato (Grin2A) del hipocampo y 3B) Expresión de la subunidad 2B tipo NMDA receptor ionotrópico de glutamato (Grin2B) Figura 24: Cambios en la expresión del hipocampo de A) Receptor 2 del ácido gamma-aminobutírico A (GABA A2), B) Receptor 1 de ácido gamma-aminobutírico B (g AbA BR1) y C) Receptor de dopamina 1 (DRD1)
Figura 25: Cambios en la expresión del receptor de amígdala - A) Receptor de oxitocina, B) Receptor de vasopresina, C) Receptor de glucocorticoides y D) Receptor de mineralocorticoides
Figura 26: Cambios en la expresión de la amígdala de A) Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), B) Receptor tipo Toll 4 (TLR-4), C) Receptor 1 de la hormona liberadora de corticotropina (CRFR1) y D) Receptor 2 de la hormona liberadora de corticotropina (CRFR2)
Figura 27: Cambios en la expresión de la amígdala de A) Integrina Alfa M (CD11b), B) Interleucina-6 (IL-6), C) Subunidad 2A tipo NMDA del receptor ionotrópico de glutamato (Grin2A) y D) Subunidad 2B tipo NMDA del receptor ionotrópico de glutamato (Grin2B)
Figura 28: Cambios en la expresión de la amígdala de A) Subunidad alfa 2 del receptor de GABA-A (GABRA2), B) Subunidad del Receptor 1 de GABA-A Tipo B (GABBR1) y C) Receptor de dopamina 1 (DRD1) Figura 29: Cambios en la expresión de la corteza prefrontal de A) Receptor de oxitocina, B) Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), C) Receptor de mineralocorticoides y D) Receptor de glucocorticoides
Figura 30: Cambios en la expresión de la corteza prefrontal de A) Receptor 4 tipo Toll (TLR-4), B) Receptor 1 de la hormona liberadora de corticotropina (CRFR1), C) Receptor 2 de hormona liberadora de corticotropina (CRFR2) y D) Integrina Alfa M (CD11b)
Figura 31: Cambios en la expresión de la corteza prefrontal de A) Interleucina-6 (IL-6), B) Subunidad 2A tipo NMDA del receptor ionotrópico de glutamato (Grin2A), C) Subunidad 2B tipo NMDA del receptor ionotrópico de glutamato (Grin2B) y D) Subunidad alfa 2 del receptor de GABA-A (GABRA2)
Figura 32: Cambios en la expresión de la corteza prefrontal de A) Subunidad 1 del receptor tipo B del receptor de GABA-A (GABBR1) y B) Receptor de dopamina 1 (DRD1)
Figura 33: Cambios en la expresión de colon de A) Triptófano hidroxilasa-1 (Tph1) y B) Indolamina2,3-Dioxigenasa-1 (IDO1)
Figura 34: Cambios en la expresión de íleon de A) Triptófano hidroxilasa-1 (Tph1) y B) Indolamina2,3-Dioxigenasa-1 (IDO1)
Figura 35: Cambios en los niveles del metabolito del triptófano circulantes A) Quinurenina, B) Triptófano y C) Índice de metabolismo de quinurenina/triptófano
Figura 36: Efecto sobre la producción de interferón-Y a de esplenocitos de ratón de ratones alimentados con MRx0005 y MRx0029
Figura 37: Efecto sobre la producción de interleucina-1p de esplenocitos
Figura 38: Efecto sobre la producción de interleucina-6 de esplenocitos
Figura 39: Efecto sobre la producción de factor de necrosis tumoral de esplenocitos
Figura 40: Efecto sobre la producción de interleucina-10 de esplenocitos
Figura 41: Efecto sobre la producción de quimioatrayentes CXCL1 de esplenocitos
Figura 42: Cambios en los niveles de ácidos grasos de cadena corta cecal
Figura 43: Cambios inducidos por MRx0029 y MRX005 en los niveles de expresión génica de Actina, Villina, Ocludina TJP1, TJP2, MAP2, DRD2, GABRB3, SYP, PINK1, PARK7 y NSE.
Figura 44: Diferenciación celular de SHSYSY inducida por MRx0005 y MRx0029. (A-C) Imágenes representativas de células inmunomarcadas con Phalloidin y MAP2. (D-F) Imágenes de A-C fusionadas con imágenes DAPI. (G-I) Células inmunomarcadas con p3 tubulina. (J-L) fusionadas con imágenes DAPI. Ampliación x630. J-K) Análisis de transferencia Western de los efectos del tratamiento con MRx0005 y MRx0029 en células SHSYSY. Las membranas de transferencia Western se sondaron con anticuerpos contra MAP2 (M) y tubulina b3 (N). Se usó actina como control de carga. Paneles inferiores: transferencias representativas de uno de seis experimentos separados; paneles superiores: intensidad densitométrica relativa.
DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN
Cepas bacterianas
Las composiciones de la invención comprenden una cepa bacteriana del género Parabacteroides. Los ejemplos demuestran que las bacterias de este género son útiles para tratar o prevenir trastornos neurodegenerativos. Las cepas bacterianas preferidas son de la especie Parabacteroides distasonis.
Los ejemplos de especies de Parabacteroides para su uso en la invención incluyen Parabacteroides distasonis, Parabacteroides goldsteinii, Parabacteroides merdae y Parabacteroides johnsonii. Los Parabacteroides se parecen a los Bacteroides y son gramnegativos, estrictamente anaeróbicos, no formadores de esporas, no motiles y con forma de bastoncillo, y tienen un tamaño de 0,8-1,6 x 1,2-12 pm. La Parabacteroides distasonis es una de las especies más comunes en las heces humanas. La cepa tipo de P. distasonis es JCM 5825T (=CCUG 4941T= DSM 20701T=ATCC 8503t ) Los números de registro de GenBank/EMBL/DDBJ para las secuencias génicas de ARNr 16S de las cepas de P. distasonis JCM 5825T, JCM 13400, JCM 13401, JCM 13402, JCM 13403 y JCM 13404 y las cepas de P. merdae JCM 9497T y JCM 13405 son AB238922-AB238929, respectivamente (divulgadas en la presente como las SEQ ID NO: 1-8). También se describen cepas ejemplares en [22].
La bacteria Parabacteroides distasonis depositada con el número de registro NCIMB 42382 se probó en los Ejemplos y también se denomina en la presente como cepa 755 o MRx0005. En la SEQ ID NO: 9 se proporciona una secuencia de ARNr 16S para la cepa 755 que se probó. La cepa 755 se depositó en la autoridad depositaria internacional NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia) por GT Biologics Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB252ZS, Escocia) el 12 de marzo de 2015 como “Parabacteroides sp 755” y se le asignó el número de registro NCIMB 42382. GT Biologics Ltd. posteriormente cambió su nombre a 4D Pharma Research Limited.
La WO 2016/203220 describe la administración de la cepa 755 a ratones y muestra que puede afectar a los procesos de enfermedades fuera del intestino (como el asma y la artritis). La cepa 755 también afecta a los procesos de enfermedades fuera del intestino en el tratamiento de los trastornos neurodegenerativos descritos en la presente.
Una secuencia del genoma para la cepa 755 se proporciona en la SEQ ID NO: 10. Esta secuencia se generó usando la plataforma PacBio RS II.
También se espera que las cepas bacterianas estrechamente relacionadas con la cepa probada en los ejemplos sean eficaces para tratar o prevenir trastornos neurodegenerativos. En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la secuencia de ARNr 16S de una cepa bacteriana de Parabacteroides distasonis. Preferiblemente, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16s que es por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9. Preferiblemente, la identidad de secuencia es con la SEQ ID NO: 9. Preferiblemente, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene la secuencia de ARNr 16s representada por la SEQ ID NO: 9.
También se espera que las cepas bacterianas que son biotipos de la bacteria depositada con el número de registro 42382 sean eficaces para tratar o prevenir trastornos neurodegenerativos. Un biotipo es una cepa estrechamente relacionada que tiene las mismas características fisiológicas y bioquímicas o unas muy similares.
Las cepas que son biotipos de la bacteria depositada con el número de registro NCIMB 42382 y que son adecuadas para su uso en la invención pueden identificarse mediante la secuenciación de otras secuencias de nucleótidos para la bacteria depositada con el número de registro NCIMB 42382. Por ejemplo, puede secuenciarse sustancialmente todo el genoma y una cepa de biotipo para su uso en la invención puede tener por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia en por lo menos un 80% de todo su genoma (por ejemplo, en por lo menos un 85 %, 90%, 95% o 99%, o en todo su genoma). Otras secuencias adecuadas para su uso en la identificación de cepas de biotipo pueden incluir hsp60 o secuencias repetitivas como BOX, ERIC, (GTG)s, o REP o [23]. Las cepas de biotipo pueden tener secuencias con por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia con la secuencia correspondiente de la bacteria depositada con el número de registro NCIMB 42382.
En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene un genoma con identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10 de la WO2018229189. En realizaciones preferidas, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene un genoma con por lo menos un 90% de identidad de secuencia (por ejemplo, por lo menos un 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de secuencia identidad) con la SEQ ID NO: 10 de la WO2018229189 en por lo menos el 60% (por ejemplo, por lo menos el 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%) de la SEQ ID NO: 10 de la WO2018229189. Por ejemplo, la cepa bacteriana para su uso en la invención puede tener un genoma con por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10 de la WO2018229189 en el 70% de la SEQ ID NO: 10 de la WO2018229189, o por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10 de la WO 2018229189 en el 80% de la SEQ ID NO: 10 de la WO2018229189, o por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10 de la WO 2018229189 en el 90% de la SEQ ID NO: 10 de la WO2018229189, o por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10 de la WO 2018229189 en el 100% de la SEQ ID NO: 10 de la WO2018229189, o por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10 de la WO 2018229189 en el 70% de la SEQ ID NO: 10 de la WO2018229189, o por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10 de la WO 2018229189 en el 80% de la SEQ ID NO: 10 de la WO2018229189, o por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10 de la WO 2018229189 en el 90% de la SEQ ID NO: 10 de la WO2018229189, o por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10 de la WO 2018229189 en el 100% de la SEQ ID NO: 10 de la WO2018229189, o por lo menos un 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10 de la WO 2018229189 en el 70% de la SEQ ID NO: 10 de la WO2018229189, o por lo menos un 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10 de la WO 2018229189 en el 78% de la SEQ ID NO: 10 de la WO2018229189, o por lo menos un 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10 de la WO 2018229189 en el 90% de la SEQ ID NO: 10 de la WO2018229189, o por lo menos un 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10 de la WO 2018229189 en el 100% de la SEQ ID NO: 10 de la WO2018229189.
Alternativamente, las cepas que son biotipos de la bacteria depositada con el número de registro NCIMB 42382 y que son adecuadas para su uso en la invención pueden identificarse usando el número de registro NCIMB 42382 análisis de fragmentos de restricción y depósito y/o análisis por PCR, por ejemplo, usando polimorfismo de longitud de fragmento amplificado fluorescente (FAFLP) y obtención de huellas por elemento de ADN repetitivo (rep)-PCR, o realización de perfiles de proteínas, o secuenciación parcial de ADNr 16S o 23S. En realizaciones preferidas, tales técnicas pueden usarse para identificar otras cepas de Parabacteroides distasonis.
En ciertas realizaciones, las cepas que son biotipos de la bacteria depositada con el número de registro NCIMB 42382 y que son adecuadas para su uso en la invención son cepas que proporcionan el mismo patrón que la bacteria depositada con el número de registro NCIMB 42382 cuando se analizan mediante análisis de restricción de ADN ribosómico amplificado (ARDRA), por ejemplo cuando se usa la enzima de restricción Sau3AI (para métodos ejemplares y orientación, ver, por ejemplo, [24]). Alternativamente, las cepas de biotipo se identifican como cepas que tienen los mismos patrones de fermentación de carbohidratos que la bacteria depositada con el número de registro NCIMB 42382.
Otras cepas de parabacteroideslas que son útiles en las composiciones y métodos de la invención, tales como biotipos de bacterias depositadas con el número de registro NCIMB 42382, pueden identificarse usando cualquier método o estrategia apropiados, incluyendo los ensayos descritos en los ejemplos. Por ejemplo, las cepas para su uso en la invención pueden identificarse cultivando con células de neuroblastoma y luego evaluando los niveles de citoquinas y los niveles de neuroprotección o neuroproliferación. En particular, las cepas bacterianas que tienen patrones de crecimiento, tipo metabólico y/o antígenos de superficie similares a la bacteria depositada con el número de registro NCIMB 42382 pueden ser útiles en la invención. Una cepa útil tendrá una actividad inmunomoduladora comparable a la cepa NCIMB 42382. En particular, una cepa de biotipo provocará efectos comparables sobre los modelos de enfermedades neurodegenerativas y efectos comparables sobre los niveles de citoquinas a los efectos mostrados en los Ejemplos, que pueden identificarse usando los protocolos de cultivo y administración descritos en los Ejemplos.
Una cepa particularmente preferida de la invención es la cepa Parabacteroides distasonis depositada con el número de registro NCIMB 42382. Esta es la cepa ejemplar 755 probada en los ejemplos y que ha demostrado ser eficaz para tratar enfermedades. Por tanto, la divulgación proporciona una célula, como una célula aislada, de la cepa Parabacteroides distasonis depositada con el número de registro NCIMB 42382, o un derivado de la misma. La divulgación también proporciona una composición que comprende una célula de la cepa Parabacteroides distasonis depositada con el número de registro NCIMB 42382, o un derivado de la misma. La divulgación también proporciona un cultivo biológicamente puro de Parabacteroides distasoniscepa depositada con el número de registro NCIMB 42382. La invención también proporciona una célula de la cepa de Parabacteroides distasonis depositada con el número de registro NCIMB 42382 para uso en terapia para las enfermedades descritas en la presente.
Un derivado de la cepa depositada con el número de registro NCIMB 42382 puede ser una cepa hija (progenie) o una cepa cultivada (subclonada) de la original. Un derivado de una cepa de la invención puede modificarse, por ejemplo a nivel genético, sin eliminar la actividad biológica. En particular, una cepa derivada de la invención es terapéuticamente activa. Una cepa derivada tendrá una actividad inmunomoduladora comparable a la cepa NCIMB 42382 original. En particular, una cepa derivada provocará efectos comparables sobre los modelos de enfermedades neurodegenerativas y efectos comparables sobre los niveles de citoquinas a los efectos mostrados en los Ejemplos, que pueden identificarse usando los protocolos de cultivo y administración descritos en los Ejemplos. Un derivado de la cepa NCIMB 42382 será generalmente un biotipo de la cepa NCIMB 42382.
Las referencias a células de la cepa de Parabacteroides distasonis depositada con el número de registro NCIMB 42382 abarcan cualquier célula que tenga las mismas características de seguridad y eficacia terapéutica que las cepas depositadas con el número de registro NCIMB 42382, y tales células están incluidas en la invención.
En realizaciones preferidas, las cepas bacterianas en las composiciones de la invención son viables y capaces de colonizar parcial o totalmente el intestino.
Los inventores han descubierto que las cepas de Parabacteroides distasonis reducen la secreción de citoquinas proinflamatorias como IL-6 e IL-8. La IL-8 se ha implicado en la formación de vainas de mielina. La inflamación crónica inducida por IL-6 puede llevar en última instancia a la muerte celular. Por lo tanto, las cepas bacterianas de la invención son particularmente útiles en el tratamiento o prevención de trastornos neurodegenerativos. En algunas realizaciones, las cepas bacterianas son útiles en el tratamiento de afecciones caracterizadas por la activación mejorada de IL-6. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades neurodegenerativas caracterizadas por desmielinización. Muchas enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por la desmielinización. La desmielinización impide la propagación de los potenciales de acción dentro de las neuronas, afectando a la comunicación eficaz dentro del sistema nervioso. Se ha demostrado que la IL-8 contribuye positivamente a la formación y reparación de la vaina de mielina. MRx0029 aumenta per se la secreción de IL-8. Por lo tanto, las composiciones de la invención son particularmente beneficiosas en el tratamiento o prevención de trastornos neurodegenerativos caracterizados por desmielinización.
Los inventores también han descubierto que las cepas bacterianas de la invención aumentan la activación de BDNF. El BDNF es un factor de crecimiento neurotrófico que se ha demostrado que mejora la diferenciación y la supervivencia neuronal. Por tanto, las composiciones de la invención pueden usarse en un método para mejorar la supervivencia de las células nerviosas en el tratamiento o la prevención de enfermedades neurodegenerativas.
Una bacteria adicional que puede usarse en las composiciones de la invención es la especie Megasphaera massiliensis. Los ejemplos demuestran que Parabacteroides distasonis y Megasphaera massiliensis tienen ambas actividades neuroprotectoras, pero producen diferentes metabolitos y pueden tener diferentes mecanismos de acción y actividades neuroprotectoras específicas. Por lo tanto, estas especies pueden ser particularmente eficaces cuando se usan en combinación. En realizaciones preferidas, la composición comprende una cepa de la especie Parabacteroides distasonis y una cepa de la especie Megasphaera massiliensis.
La bacteria Parabacteroides distasonis depositada con el número de registro NCIMB 42382 se probó en los Ejemplos y también se denomina en la presente cepa MRx0005. MRX0005, MRX005, MRx005 y MRx0005 se usan en la presente indistintamente. En la SEQ ID NO: 9 se proporciona una secuencia de ARNr 16S para la cepa MRx0005 que se probó. La cepa MRx0005 fue depositada en la autoridad depositaria internacional NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia) por GT Biologics Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB252ZS, Escocia) el 12 de marzo de 2015 como “ Parabacteroides sp 755” y se le asignó el número de registro NCIMB 42382. GT Biologics Ltd. cambió posteriormente su nombre a 4D Pharma Research Limited.
La cepa de Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787 es la cepa MRx0029 ejemplar probada en los ejemplos y que ha demostrado ser eficaz para tratar enfermedades. La cepa NCIMB 42787 fue depositada en la autoridad depositaria internacional NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia) por 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Escocia) el 26 de julio de 2017 como “Megasphaera massihensis MRx0029” y se le asignó el número de registro NCIMB 42787. Por lo tanto, la divulgación proporciona una célula, como una célula aislada, de la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787, o un derivado de la misma. La divulgación también proporciona una composición que comprende una célula de la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787, o un derivado de la misma. La divulgación también proporciona un cultivo biológicamente puro de la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787. La divulgación también proporciona una célula de la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787, o un derivado de la misma, para uso en terapia, en particular para las enfermedades descritas en la presente.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona una composición que comprende la cepa depositada en la NCIMB con el número de registro NCIMB 42787, o un derivado o biotipo de la misma, y la cepa depositada en NCIMB con el número de registro NCIMB 42382, o un derivado o biotipo de la misma, preferiblemente para su uso en terapia, preferiblemente para su uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa como la enfermedad de Parkinson.
Usos terapéuticos
Como se demuestra en los ejemplos, las composiciones bacterianas de la invención son eficaces para tratar trastornos neurodegenerativos. En particular, el tratamiento con composiciones de la invención aumenta la neuroproliferación y actúa como neuroprotector contra agentes que destruyen las neuronas dopaminérgicas. Por tanto, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir trastornos neurodegenerativos que son el resultado de la muerte neuronal.
Las composiciones de la invención pueden disminuir la activación del promotor de NFkB, que activa la producción de citoquinas, por ejemplo IL-1p, IL-1a, IL-18, TNFa e IL-6. El tratamiento de células con a-sinucleína mutante es un modelo para el Parkinson familiar. Una mutación puntual en la posición 53 de adenina a treonina lleva a un plegamiento incorrecto de la a-sinucleína. La a-sinucleína plegada incorrectamente se agrega posteriormente en fibrillas insolubles que forman cuerpos de Lewy. Por tanto, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir trastornos neurodegenerativos que son el resultado de neuroinflamación, plegamiento incorrecto de proteínas y/o exposición ambiental. Las composiciones de la invención pueden usarse para el tratamiento del Parkinson familiar. La activación del promotor de NFkB está mediada por el ligando TLR4. Se sabe que TL4 media la muerte celular en el modelo de ratón MPTP, que simula la enfermedad de Parkinson. Las composiciones de la invención pueden usarse para inhibir la capacidad de la señalización de TLR4 para activar el promotor de NFkB. De particular relevancia para la EP, se descubrió que tanto TLR2 como TLR4 estaban regulados por incremento en el cerebro de los pacientes con EP [25]. Además, a-syn se ha descrito como un ligando para TLR2 [26] y hemos demostrado que a-syn también es un ligando para TLR4 usando células HEK-TLR4.
Las composiciones de la invención disminuyen la secreción de citoquinas proinflamatorias como IL-6, que pueden ser inducidas por lipopolisacárido (LPS). El tratamiento de las células con LPS simula el Parkinson provocado por factores ambientales. Las composiciones de la invención pueden usarse para disminuir la secreción de IL-6. Las composiciones de la invención pueden usarse para el tratamiento del Parkinson ambiental.
Se ha postulado que las quimiocinas tienen funciones importantes en el sistema nervioso central (SNC), además de su papel principal de migración direccional de leucocitos. En una línea celular similar a un precursor de oligodendrocitos murina, la quimiocina MCP-1 no aumentó la proliferación del precursor de oligodendrocitos. En cultivos de mielinización primaria, MCP-1 no potenció la formación de segmentos de mielina en este sistema. Los inventores han descubierto que MRx0005 promueve los niveles de MCP-1. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el aumento de los niveles de MCP-1 en el tratamiento de enfermedades.
Las enfermedades neurodegenerativas a tratar mediante composiciones de la invención incluyen: enfermedad de Parkinson, incluyendo parálisis supranuclear progresiva, parálisis supranuclear progresiva, síndrome de Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalia de presión normal, parkinsonismo vascular o arteriosclerótico y parkinsonismo inducido por fármacos; enfermedad de Alzheimer, incluyendo el síndrome de Benson; enfermedad de Huntington; esclerosis lateral amiotrófica; enfermedad de Lou Gehrig; enfermedad de las neuronas motoras; enfermedad por priones; ataxia espinocerebelosa; atrofia muscular espinal; demencia, incluyendo la demencia con cuerpos de Lewy, vascular y frontotemporal; afasia progresiva primaria; defecto cognitivo leve; deterioro cognitivo relacionado con el VIH y degeneración corticobasal. Una enfermedad neurodegenerativa a tratar con las composiciones divulgadas en la presente es la neuropatía inflamatoria progresiva.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden ser eficaces para tratar trastornos neurodegenerativos que se producen en pacientes de edad avanzada. Los ejemplos muestran que las composiciones de la invención pueden tratar la enfermedad de Parkinson que se diagnostica predominantemente en pacientes mayores de 65 años. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para el tratamiento de pacientes de 65 años o más. En otras ciertas realizaciones, los pacientes tienen entre 40 y 65 años. En otras realizaciones, los pacientes tienen más de 40 años. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se usan para tratar una enfermedad asociada con la vejez, por ejemplo, una enfermedad diagnosticada después de los 50 años.
En ciertas realizaciones, las composiciones divulgadas en la presente son para su uso en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo mediado o caracterizado por la acumulación de proteína, en particular proteína mal plegada.
En ciertas realizaciones, las composiciones divulgadas en la presente son para su uso en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo asociado con la pérdida neuronal de la materia gris. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para tratar un trastorno neurodegenerativo que no está asociado con lesiones de la sustancia blanca.
En ciertas realizaciones, las composiciones divulgadas en la presente son para su uso en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo asociado con síntomas permanentes.
En ciertas realizaciones, las composiciones divulgadas en la presente son para su uso en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo que no es un trastorno autoinmune. En ciertas realizaciones, las composiciones divulgadas en la presente son para su uso en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo que no es esclerosis múltiple.
En ciertas realizaciones, las composiciones divulgadas en la presente son para su uso en la reducción de la muerte neuronal, en particular, en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos. En ciertas realizaciones, las composiciones divulgadas en la presente son para su uso en la protección de neuronas, en particular en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos.
Las propiedades neuroprotectoras de las composiciones de la invención, como se muestra en los ejemplos, significan que las composiciones pueden ser particularmente eficaces para prevenir o retrasar la aparición o progresión de trastornos neurodegenerativos. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en retrasar la aparición o progresión de trastornos neurodegenerativos.
Las composiciones de la invención pueden aumentar la secreción de IL-8. Se ha demostrado que la IL-8 desempeña un papel en la mielinización de las neuronas. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención pueden usarse para aumentar la secreción de IL-8.
Las composiciones terapéuticas de la invención pueden incrementar la activación de BDNF. El BDNF actúa sobre ciertas neuronas del sistema nervioso central para apoyar la supervivencia de las neuronas existentes y ayudar al crecimiento y desarrollo de nuevas neuronas y sinapsis. El BDNF está activo en el hipocampo, la corteza y el prosencéfalo basal, y es importante para la memoria a largo plazo. Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden usarse para aumentar la secreción de BDNF. Por lo tanto, las composiciones pueden usarse en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas asociadas con el deterioro de la memoria a largo plazo. Las composiciones de la invención pueden usarse para mejorar la memoria a largo plazo, en particular para mejorar la memoria a largo plazo que se ve afectada por una enfermedad neurodegenerativa.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención aumentan la actividad metabólica de las mitocondrias en las células neuronales.
Modulación del eje microbiota-intestino-cerebro
La comunicación entre el intestino y el cerebro (eje microbiota-intestino-cerebro) se produce a través de un sistema de comunicación neurohumoral bidireccional. La evidencia reciente muestra que la microbiota que reside en el intestino puede modular el desarrollo del cerebro y producir fenotipos de comportamiento a través del eje microbiota-intestino-cerebro. De hecho, una serie de revisiones sugieren un papel del eje microbiota-intestinocerebro en el mantenimiento de la funcionalidad del sistema nervioso central e implican la disfunción del eje microbiota-intestino-cerebro en el desarrollo de trastornos y afecciones del sistema nervioso central [16-27].
La comunicación bidireccional entre el cerebro y el intestino (es decir, el eje intestino-cerebro) incluye el sistema nervioso central, los sistemas neuroendocrino y neuroinmunológico, incluyendo el eje hipotálamo-pituitariaadrenal (HPA), brazos simpático y parasimpático del sistema nervioso autónomo (SNA), incluyendo el sistema nervioso entérico (SNE) y el nervio vago, y la microbiota intestinal.
Como se demuestra en los ejemplos, las composiciones de la presente invención pueden modular el eje microbiota-intestino-cerebro y reducir la muerte celular asociada con trastornos neurodegenerativos. Por consiguiente, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir trastornos neurodegenerativos, en particular aquellos trastornos y afecciones asociadas con la disfunción del eje microbiotaintestino-cerebro.
Las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste de: enfermedad de Parkinson, incluyendo parálisis supranuclear progresiva, parálisis supranuclear progresiva, síndrome de Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalia de presión normal, parkinsonismo vascular o arterioesclerótico y parkinsonismo inducido por fármacos; enfermedad de Alzheimer, incluyendo el síndrome de Benson; enfermedad de Huntington; esclerosis lateral amiotrófica; enfermedad de Lou Gehrig; enfermedad de las neuronas motoras; enfermedad por priones; ataxia espinocerebelosa; atrofia muscular espinal; demencia; incluyendo cuerpo de Lewy; demencia vascular y frontotemporal; afasia progresiva primaria; deterioro cognitivo leve; deterioro cognitivo relacionado con el VIH y degeneración corticobasal.
Las composiciones de la invención pueden ser particularmente útiles para tratar o prevenir enfermedades crónicas, tratar o prevenir enfermedades en pacientes que no han respondido a otras terapias (como tratamiento con Levodopa, agonistas de dopamina, inhibidores de MAO-B, inhibidores de COMT, antagonistas de glutamato, y/o anticolinérgicos), y/o tratar o prevenir el daño tisular y los síntomas asociados con la disfunción del eje microbiotaintestino-cerebro.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el SNC. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el sistema nervioso autónomo (SNA). En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el sistema nervioso entérico (SNE). En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el eje hipotalámico, pituitario, suprarrenal (HPA). En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la vía neuroendocrina. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la vía neuroinmune. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el SNC, el SNA, el SNE, el eje HPA y/o las vías neuroendocrinas y neuroinmunes. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de metabolitos comensales y/o la permeabilidad gastrointestinal de un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden usarse para modular el sistema dopaminérgico.
La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por sistemas neuronales. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la señalización en los sistemas neurales. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la señalización del sistema nervioso central. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la señalización en neuronas sensoriales. En otras realizaciones, las composiciones de la invención modulan la señalización en las neuronas motoras. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la señalización en el SNA. En algunas realizaciones, el SNA es el sistema nervioso parasimpático. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención modulan la señalización del nervio vago. En otras realizaciones, el SNA es el sistema nervioso simpático. En otras realizaciones, las composiciones de la invención modulan la señalización en el sistema nervioso entérico. En ciertas realizaciones, la señalización de neuronas del SNA y SNE responde directamente al contenido luminal del tracto gastrointestinal. En otras realizaciones, la señalización de neuronas del SNA y SNE responde indirectamente a neuroquímicos producidos por bacterias luminales. En otras realizaciones, la señalización de neuronas del SNA y SNE responde a neuroquímicos producidos por bacterias luminales o células enteroendocrinas. En ciertas realizaciones preferidas, las neuronas del SNE activan aferentes vagales que influyen en las funciones del SNC. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención regulan la actividad de las células enterocromafines.
Enfermedades neurodegenerativas
Las tauopatías son enfermedades neurodegenerativas asociadas con la agregación patológica de la proteína tau en los ovillos neurofibrilares o gliofibrilares del cerebro humano. La enfermedad de Alzheimer es un ejemplo de tauopatología. Las sinucleinopatías (también llamadas a-sinucleinopatías) son enfermedades neurodegenerativas caracterizadas por la acumulación anormal de agregados de a-sinucleína en neuronas, fibras nerviosas o células gliales. La enfermedad de Parkinson es un ejemplo de sinucleinopatología.
Hay una superposición clínica y patológica entre estas dos patologías. Los pacientes con enfermedad de Parkinson con frecuencia tienen demencia y los pacientes con enfermedad de Alzheimer a menudo manifiestan parkinsonismo [28]. Por ejemplo, la parálisis supranuclear progresiva (también conocida como síndrome de Steele-Richardson-Olszewski) tiene una tauopatología, pero también lleva a parkinsonismo prominente [29]. Las mutaciones en LRRK2 que se sabe que provocan parkinsonismo están asociadas con la acumulación de sinucleína, tau, ninguna o ambas proteínas [30].
La enfermedad de cuerpos de Lewy (LBD) es una enfermedad neurodegenerativa que es una de las causas más comunes de demencia en los ancianos. La LBD ejemplifica la existencia de un continuo entre patologías de tau y sinucleína. La LBD comparte características clínicas y patológicas con la enfermedad de Parkinson, la demencia de la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer [28].
En realizaciones particulares, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir tauopatías y/o sinucleinopatías. En realizaciones particulares, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir tauopatías. En realizaciones particulares, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir sinucleinopatías. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste de: enfermedad de Parkinson, incluyendo parálisis supranuclear progresiva, parálisis supranuclear progresiva, síndrome de Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalia de presión normal, parkinsonismo vascular o arterioesclerótico y parkinsonismo inducido por fármacos; enfermedad de Alzheimer, incluyendo el síndrome de Benson; y demencia; incluyendo cuerpos de Lewy; demencia vascular y frontotemporal.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir la enfermedad de Parkinson, incluyendo parálisis supranuclear progresiva, parálisis supranuclear progresiva, síndrome de Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalia de presión normal, parkinsonismo vascular o arteriosclerótico y parkinsonismo inducido por fármacos. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer, incluyendo el síndrome de Benson. En realizaciones preferidas adicionales, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir la demencia; incluyendo cuerpos de Lewy; demencia vascular y frontotemporal.
Enfermedad de Parkinson
La enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa común caracterizada neuropatológicamente por la degeneración de poblaciones heterogéneas de células neurales (células productoras de dopamina). El diagnóstico clínico de la enfermedad de Parkinson requiere bradicinesia y por lo menos uno de los siguientes síntomas centrales: temblor en reposo; rigidez muscular y deterioro de los reflejos posturales. Otros signos y síntomas que pueden estar presentes o desarrollarse durante la progresión de la enfermedad son alteraciones autonómicas (sialorrea, seborrea, estreñimiento, alteraciones de la micción, funcionamiento sexual, hipotensión ortostática, hiperhidrosis), alteraciones del sueño y alteraciones en el sentido del olfato o del sentido del sueño. temperatura. La enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa que puede desarrollarse o persistir debido a una disfunción del eje microbiota-intestino-cerebro. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de la enfermedad de Parkinson en un sujeto.
En realizaciones preferidas adicionales, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Parabacteroides, para su uso en un método de tratamiento o prevención de la enfermedad de Parkinson. Las composiciones que comprenden una cepa bacteriana del género Parabacteroides pueden mejorar las funciones motoras y cognitivas en modelos de la enfermedad de Parkinson. El tratamiento con cepas de Parabacteroides puede modular la señalización en los sistemas nerviosos central, autónomo y entérico; puede modular la actividad de la vía del eje HPA; puede modular las vías neuroendocrinas y/o neuroinmunes; y puede modular los niveles de metabolitos comensales, marcadores inflamatorios y/o la permeabilidad gastrointestinal de un sujeto, todos los cuales están implicados en la neuropatología de la enfermedad de Parkinson. En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Parabacteroides distasonis para su uso en un método de tratamiento o prevención de la enfermedad de Parkinson. Las composiciones que usan Parabacteroides distasonis pueden ser particularmente eficaces para tratar la enfermedad de Parkinson.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian uno o más de los síntomas de la enfermedad de Parkinson en un sujeto. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian uno o más síntomas centrales de la enfermedad de Parkinson en un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la bradicinesia en un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian el temblor en reposo; la rigidez muscular y/o el deterioro del reflejo postural en un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian uno o más síntomas asociados con la progresión de la enfermedad de Parkinson seleccionados entre alteraciones autonómicas (sialorrea, seborrea, estreñimiento, alteraciones de la micción, funcionamiento sexual, hipotensión ortostática, hiperhidrosis), alteraciones del sueño y alteraciones del sentido del olfato o la temperatura.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian los síntomas depresivos comórbidos con la enfermedad de Parkinson. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la memoria verbal y/o las funciones ejecutivas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la atención, la memoria de trabajo, la fluidez verbal y/o la ansiedad.
En otras realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian las disfunciones cognitivas comórbidas con la enfermedad de Parkinson.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la progresión de la enfermedad de Parkinson. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian las complicaciones motoras posteriores. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian las fluctuaciones motoras tardías. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la pérdida neuronal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran los síntomas de la demencia de la enfermedad de Parkinson (DEP). En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian el deterioro de la función ejecutiva, la atención y/o la memoria de trabajo. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la neurotransmisión dopaminérgica. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la neurotransmisión dopaminérgica alterada.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran los síntomas de la enfermedad de Parkinson de acuerdo con una escala sintomática o de diagnóstico. En ciertas realizaciones, las pruebas para evaluar la mejora sintomática de la función motora en la enfermedad de Parkinson es la Escala Unificada de Valoración de la Enfermedad de Parkinson. En particular, la UPDRS II considera la actividad de la vida diaria y la UPDRS III considera el examen motor.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran los síntomas asociados a la DEP según una prueba y/o escala sintomática o diagnóstica. En ciertas realizaciones, la prueba o escala se selecciona de la Prueba de aprendizaje verbal de Hopkins - Revisada (HVLT-R); la prueba de interferencia de palabras y colores del sistema de funciones ejecutivas Delis-Kaplan (D-KEFS); la Escala de calificación de depresión de Hamilton (HAM-D 17; depresión); la Escala de calificación de ansiedad de Hamilton (HAM-A; ansiedad) y la Escala de calificación de la enfermedad de Parkinson Unificada (UPDRS; gravedad de los síntomas de la EP).
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la escala de Impresión Clínica Global - Mejora Global (CGI-I) para evaluar trastornos psiquiátricos y neurológicos. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención muestran un efecto positivo sobre el deterioro social y ocupacional global del sujeto con la enfermedad de Parkinson.
Enfermedad de Alzheimer y demencia
En el DSM-5, el término demencia fue reemplazado por los términos trastorno neurocognitivo mayor y trastorno neurocognitivo leve. El trastorno neurocognitivo es una clase heterogénea de enfermedades psiquiátricas. El trastorno neurocognitivo más común es la enfermedad de Alzheimer, seguida de demencias vasculares o formas mixtas de las dos. Otras formas de trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, enfermedad con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, demencia de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Huntington y síndrome de Wernicke-Korsakoff) vienen acompañadas de demencia.
La enfermedad de Alzheimer y la demencia también se caracterizan por la pérdida neuronal, por lo que los efectos neuroprotectores y neuroproliferativos mostrados en los ejemplos de las composiciones de la invención indican que pueden ser útiles para tratar o prevenir estas afecciones.
Los criterios sintomáticos para la demencia según el DSM-5 son evidencia de un deterioro cognitivo significativo de un nivel previo de rendimiento en uno o más dominios cognitivos seleccionados de: aprendizaje y memoria; idioma; función ejecutiva; atención compleja; cognición perceptivo-motora y social. Los déficits cognitivos deben interferir con la independencia en las actividades cotidianas. Además, los déficits cognitivos no se producen exclusivamente en el contexto de un delirio y no se explican mejor por otro trastorno mental (por ejemplo, MDD o esquizofrenia).
Además del síntoma principal, los sujetos con trastornos neurodegenerativos muestran síntomas conductuales y psiquiátricos que incluyen agitación, agresión, depresión, ansiedad, apatía, psicosis y alteraciones del ciclo sueño-vigilia.
Los trastornos neurodegenerativos pueden desarrollarse o persistir debido a la disfunción del eje microbiota-intestino-cerebro. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de trastornos neurodegenerativos en un sujeto. En realizaciones preferidas, el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer. En otras realizaciones, el trastorno neurodegenerativo se selecciona de demencias vasculares; forma mixta de enfermedad de Alzheimer y demencia vascular; enfermedad de cuerpos de Lewy; demencia frontotemporal; demencia de Parkinson; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; enfermedad de Huntington; y síndrome de Wernicke-Korsakoff.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian uno o más de los síntomas de los trastornos neurodegenerativos en un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la aparición de deterioro cognitivo en un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran el nivel de rendimiento de un sujeto con trastornos neurodegenerativos en uno o más dominios cognitivos seleccionados de: aprendizaje y memoria; idioma; función ejecutiva; atención compleja; cognición perceptivo-motora y social. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la aparición de uno o más síntomas conductuales y psiquiátricos asociados con trastornos neurodegenerativos seleccionados de agitación, agresión, depresión, ansiedad, apatía, psicosis y alteraciones del ciclo sueño-vigilia.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la enfermedad sintomática mediante la intervención en mecanismos patogénicos sospechosos en una etapa preclínica. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la modificación de la enfermedad, con ralentización o detención de la progresión de los síntomas. En algunas realizaciones, la ralentización o la detención de la progresión de los síntomas se correlaciona con la evidencia del retraso del proceso neuropatológico subyacente. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención mejoran los síntomas de los trastornos neurodegenerativos que comprenden una mejora cognitiva y funcional mejorada. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención mejoran los síntomas conductuales y psiquiátricos de la demencia (BPSD).
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención mejoran la capacidad de un sujeto con trastorno neurodegenerativo de acometer actividades cotidianas.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención mejoran tanto la cognición como el funcionamiento en un sujeto con enfermedad de Alzheimer. En algunas realizaciones, la composición de la invención mejora el criterio de valoración cognitivo en un sujeto con enfermedad de Alzheimer. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran el criterio de valoración funcional en un sujeto con enfermedad de Alzheimer. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención mejoran el criterio de valoración cognitivo y funcional en un sujeto con enfermedad de Alzheimer. En otras realizaciones preferidas más, las composiciones de la invención mejoran la respuesta clínica global (el criterio de valoración global) en un sujeto con enfermedad de Alzheimer.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran los síntomas de los trastornos neurodegenerativos de acuerdo con una prueba sintomática o de diagnóstico. En ciertas realizaciones, las pruebas para evaluar la mejoría sintomática de la enfermedad de Alzheimer (y otros trastornos neurodegenerativos) se seleccionan de pruebas cognitivas objetivas, de actividades de la vida cotidiana, de evaluación global del cambio, de calidad de vida relacionadas con la salud y pruebas que evalúan síntomas conductuales y psiquiátricos de trastornos neurodegenerativos.
En ciertas realizaciones, las pruebas cognitivas objetivas para la evaluación de la mejora sintomática uszan la subescala cognitiva de la Escala de evaluación de la enfermedad de Alzheimer (ADAS-cog) y la escala ADAS clásica. En ciertas realizaciones, la mejora sintomática de la cognición se evalúa usando la batería de pruebas neurofisiológicas para uso en la enfermedad de Alzheimer (NTB).
En algunas realizaciones, la prueba de evaluación global del cambio usa la escala de Impresión Clínica Global - Mejora Global (CGI-I) para evaluar trastornos psiquiátricos y neurológicos. En algunas realizaciones, la escala global es la Impresión basada en entrevistas del médico de cambio plus (CIBIC-plus). En algunas realizaciones, la escala global es la Impresión Global de Cambio del Médico de la Unidad de Estudio Cooperativo de la Enfermedad de Alzheimer (ADCS-CGIC).
En ciertas realizaciones, las medidas de calidad de vida relacionadas con la salud son la QOL relacionada con la enfermedad de Alzheimer (ADRQL) y la QOL-enfermedad de Alzheimer (QOL-AD).
En ciertas realizaciones, las pruebas que evalúan síntomas conductuales y psiquiátricos de trastornos neurodegenerativos se seleccionan de la Escala de valoración de patología conductual en la enfermedad de Alzheimer (BEHAVE-AD); la Escala de Evaluación del Comportamiento para la Demencia (BRSD); el Inventario Neuropsiquiátrico (NPI); y el Inventario de Agitación de Cohen-Mansfield (CMAI).
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son particularmente eficaces para prevenir, reducir o aliviar los trastornos neurodegenerativos cuando se usan en combinación con otra terapia para tratar los trastornos neurodegenerativos. En ciertas realizaciones, tales terapias incluyen inhibidores de acetilcolinesterasa que incluyen donepezil (Aricept®), galantamina (Razadyne®) y rivastigmina (Exelon®) y memantina.
Factores neuroquímicos, neuropéptidos y neurotransmisores y el eje microbiota-intestino-cerebro
Como se ha indicado anteriormente, el eje microbiota-intestino-cerebro está modulado por una serie de sistemas fisiológicos diferentes. El eje microbiota-intestino-cerebro está modulado por una serie de moléculas de señalización. Las alteraciones en los niveles de estas moléculas de señalización dan como resultado enfermedades neurodegenerativas. Los experimentos realizados por los inventores indican que la administración de especies de Parabacteroides, y en particular Parabacteroides distasonis, puede modular los niveles de indol y quinurenina. La desregulación de estos metabolitos puede provocar enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de monoaminas cerebrales y metabolitos de las mismas. En realizaciones preferidas, el metabolito es quinurenina. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la quinurenina, que es la vía principal del metabolismo del triptófano, que sirve como vía para la producción de dinucleótidos de nicotinamida adenina (NAD+). La quinurenina puede metabolizarse a compuestos neuroactivos como el ácido quinurénico (KYNA) y 3-hidroxi-1-quinurenina (3-OH-1-KYN), y en pasos posteriores a ácido quinolínico (QUIN). La desregulación de la vía de la quinurenina puede llevar a la activación del sistema inmunológico y la acumulación de compuestos potencialmente neurotóxicos. Las alteraciones en el metabolismo de la quinurenina pueden estar implicadas en el desarrollo de la enfermedad de Parkinson. Se ha demostrado que los niveles de quinurenina están disminuidos en la corteza frontal, el putamen y la sustancia negra pars compacta de los pacientes con EP [31]. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se usan para aumentar los niveles de quinurenina en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
En ciertas realizaciones de la invención, las composiciones de la invención pueden incrementar los niveles de quinurenina. Se ha demostrado que niveles elevados de quinurenina atenúan la muerte de células neuronales inducida por MPP+ in vitro en una línea celular de neuroblastoma dopaminérgico humano [32]. En ciertas realizaciones, la quinurenina y el ácido quinurénico pueden activar el receptor de hidrocarburo de arilo GI (Ahr) y los receptores de GPR35. La activación del receptor de Ahr induce la producción de IL-22, que puede inhibir la inflamación local. La activación de GPR35 induce la producción de trifosfato de inositol y movilización de Ca2+.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de indol. En realizaciones preferidas, el metabolito es quinurenina. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan las vías de quinurenina, que es la vía principal del metabolismo del triptófano.
La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por niveles de factores neuroquímicos, neuropéptidos y neurotransmisores. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de factores neuroquímicos, neuropéptidos y neurotransmisores. Por consiguiente, en ciertas realizaciones preferidas, las composiciones de la invención alteran directamente la bioquímica del SNC.
La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por los niveles de ácido Y-aminobutírico (GABA). Por consiguiente, en realizaciones preferidas, las composiciones de la invención modulan los niveles de GABA. GABA es un neurotransmisor inhibidor que reduce la excitabilidad neuronal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención aumentan los niveles de GABA. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención disminuyen los niveles de GABA. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención alteran la neurotransmisión GABAérgica. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el nivel de transcripción de GABA en diferentes regiones del sistema nervioso central. En ciertas realizaciones, el GABA derivado de comensal cruza la barrera hematoencefálica y afecta directamente a la neurotransmisión. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención llevan a una reducción de GABA en el hipocampo, amígdala y/o locus coeruleus. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención llevan a un aumento de GABA en las regiones corticales.
Respuesta inmune
La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por alteraciones en la respuesta inmune y factores y marcadores inflamatorios. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden modular la respuesta inmune. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles sistémicos de moléculas de señalización neuroinmunes circulantes. En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones de la invención modulan la producción e inflamación de citoquinas proinflamatorias. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el estado inflamatorio. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención disminuyen la producción y secreción de IL-6. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención disminuyen la activación del promotor de NFkB. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son capaces de modular la activación de la producción de IL-6 por el potente lipopolisacárido de endotoxina proinflamatorio (LPS). En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son capaces de modular la activación del promotor de NFkB por LPS y proteínas mutantes de a-sinucleína como A53T. Los niveles circulantes aumentados de citoquinas están estrechamente asociados con varios trastornos neurodegenerativos, incluyendo el Parkinson, la demencia y el Alzheimer. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se usan para reducir los niveles de IL-6 y/o NFkB en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención aumentan la secreción de IL-8. Se ha demostrado que IL-8 induce la formación de vainas de mielina y restaura o conserva la comunicación neuronal eficaz. Por tanto, en algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la inducción de la formación de vainas de mielina en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la restauración de la comunicación neuronal. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la conservación de la comunicación neuronal.
La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por niveles de metabolitos comensales. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles sistémicos de metabolitos de la microbiota. En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones de la invención modulan el nivel de ácidos grasos de cadena corta (SCFA). En ciertas realizaciones, el nivel de SCFA se aumenta o se disminuye. En algunas realizaciones, el SCFA es ácido butírico (BA) (o butirato). En algunas realizaciones, el SCFA es ácido propiónico (PPA). En algunas realizaciones, el SCFA es ácido acético. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la capacidad de los SCFA para cruzar la barrera hematoencefálica.
La acetilación y desacetilación de histonas son importantes reguladores epigenéticos de la expresión génica. Un desequilibrio en la acetilación y desacetilación de histonas puede dar como resultado la apoptosis. La desregulación de tales histonas acetiltransferasas se ha implicado en la patogénesis asociada con enfermedades neurodegenerativas asociadas a la edad, como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica y el deterioro cognitivo [33]. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden modular la actividad de la histona desacetilatasa. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden reducir la actividad de la histona desacetilatasa. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden reducir la actividad de la histona acetilatasa.
Los pacientes con enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis lateral amiotrófica, presentan niveles elevados de peroxidación lipídica. Los lípidos son vulnerables a la oxidación por especies reactivas de oxígeno y el cerebro es rico en ácidos grasos poliinsaturados. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden modular la peroxidación lipídica. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden reducir la peroxidación lipídica. La reducción del daño oxidativo provocado por las especies reactivas del oxígeno puede usarse para dirigirse a las etapas tempranas de las enfermedades neurodegenerativas. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de la neurodegeneración en etapa temprana. También por consigueinte, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la prevención del desarrollo de un trastorno neurodegenerativo. En tales realizaciones, las composiciones de la invención pueden usarse en un paciente al que se la ha identificado que tiene riesgo de desarrollar un trastorno neurodegenerativo.
La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por niveles de la permeabilidad gastrointestinal. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las composiciones de la invención alteran la integridad del epitelio del tracto gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la permeabilidad del tracto gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la función de la barrera y la integridad del tracto gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la motilidad del tracto gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la translocación de metabolitos comensales y moléculas de señalización inflamatoria al torrente sanguíneo desde la luz del tracto gastrointestinal.
La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por la composición del microbioma en el tracto gastrointestinal. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la composición del microbioma del tracto gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen la disbiosis del microbioma y los aumentos asociados de metabolitos tóxicos (por ejemplo, LPS). En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de Clostridium en el tracto gastrointestinal. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención reducen el nivel de Clostridium en el tracto gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen los niveles de Campylobacter jejuni. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la proliferación de bacterias anaeróbicas dañinas y la producción de neurotoxinas producidas por estas bacterias. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de microbioma de Lactobacillus y/o Bifidobacterium. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de microbioma de los géneros Sutterella, Prevotella, Ruminococcus y/o la familia Alcaligenaceae. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención aumentan el nivel de Lactobacillus plantarum y/o Saccharomyces boulardii.
Daño cerebral
Los ejemplos demuestran que las composiciones de la invención son neuroprotectoras y tienen actividad inhibidora de HDAC. HDAC2 es un objetivo crucial para la recuperación funcional de un derrame cerebral [34] y la inhibición de HDAC puede prevenir el daño a la sustancia blanca [35], por lo que las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento del daño cerebral.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de daño cerebral. En algunas realizaciones, el daño cerebral es un daño cerebral traumático. En algunas realizaciones, el daño cerebral es un daño cerebral adquirido. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de daño cerebral resultante de un trauma. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de daño cerebral resultante de un tumor. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de un daño cerebral resultante de un derrame cerebral. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de daño cerebral resultante de una hemorragia cerebral. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de daño cerebral resultante de encefalitis. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de daño cerebral resultante de hipoxia cerebral. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de daño cerebral resultante de anoxia cerebral.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de derrames cerebrales. Los efectos mostrados en los ejemplos son particularmente relevantes para el tratamiento del derrame cerebral. El derrame cerebral se produce cuando se interrumpe el flujo de sangre a por lo menos una parte del cerebro. Sin un suministro adecuado de sangre para proporcionar oxígeno y nutrientes al tejido cerebral y eliminar los productos de desecho del tejido cerebral, las células cerebrales comienzan a morir rápidamente. Los síntomas del derrame cerebral dependen de la región del cerebro afectada por el flujo sanguíneo inadecuado. Los síntomas incluyen parálisis, entumecimiento o debilidad de los músculos, pérdida del equilibrio, mareos, dolores de cabeza intensos repentinos, problemas del habla, pérdida de la memoria, pérdida de la capacidad de razonamiento, confusión repentina, deterioro de la visión, coma o incluso la muerte. Un derrame cerebral también se conoce como un ataque cerebral o accidente cerebrovascular (ACV). Los síntomas de un derrame cerebral pueden ser breves si se restablece el flujo sanguíneo adecuado en un período corto de tiempo. Sin embargo, si el flujo sanguíneo inadecuado continúa durante un período de tiempo significativo, los síntomas pueden ser permanentes.
En algunas realizaciones, el derrame cerebral es isquemia cerebral. La isquemia cerebral se produce cuando hay un flujo sanguíneo insuficiente a los tejidos del cerebro para satisfacer la demanda metabólica. En algunas realizaciones, la isquemia cerebral es una isquemia cerebral focal, es decir, confinada a una región específica del cerebro. En algunas realizaciones, la isquemia cerebral es una isquemia cerebral global, es decir, que abarca un área amplia del tejido cerebral. La isquemia cerebral focal se produce comúnmente cuando se bloquea un vaso cerebral, ya sea parcial o completamente, reduciendo el flujo de sangre a una región específica del cerebro. En algunas realizaciones, la isquemia cerebral focal es un derrame cerebral isquémico. En algunas realizaciones, el derrame cerebral isquémico es trombótico, es decir, está provocado por un trombo o coágulo de sangre, que se desarrolla en un vaso cerebral y restringe o bloquea el flujo sanguíneo. En algunas realizaciones, el derrame cerebral isquémico es un derrame cerebral trombótico. En algunas realizaciones, el derrame cerebral isquémico es embólico, es decir, provocado por una embolia o una masa no adherida que se desplaza a través del torrente sanguíneo y restringe o bloquea el flujo sanguíneo en un sitio distante de su punto de origen. En algunas realizaciones el derrame cerebral isquémico es un derrame cerebral embólico. La isquemia cerebral global se produce comúnmente cuando el flujo sanguíneo al cerebro en su conjunto se bloquea o se reduce. En algunas realizaciones, la isquemia cerebral global está provocada por hipoperfusión, es decir, debido a un shock. En algunas realizaciones, la isquemia cerebral global es el resultado de un paro cardíaco.
En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con daño cerebral ha sufrido isquemia cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con daño cerebral ha sufrido isquemia cerebral focal. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con daño cerebral ha sufrido un derrame cerebral isquémico. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con daño cerebral ha sufrido un derrame cerebral trombótico. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con daño cerebral ha sufrido un derrame cerebral embólico. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con daño cerebral ha sufrido isquemia cerebral global. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con daño cerebral ha sufrido hipoperfusión. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con daño cerebral ha sufrido un paro cardíaco.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se utilizan en el tratamiento de la isquemia cerebral. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se utilizan en el tratamiento de la isquemia cerebral focal. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se utilizan para tratar el derrame cerebral isquémico. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se utilizan en el tratamiento de accidentes cerebrovasculares trombóticos. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se utilizan en el tratamiento de la apoplejía embólica. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se utilizan en el tratamiento de la isquemia cerebral global. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se utilizan en el tratamiento de la hipoperfusión.
En algunas realizaciones, el derrame cerebral es un derrame cerebral hemorrágico. El derrame cerebral hemorrágico está provocado por una hemorragia en el cerebro o alrededor de él, lo que provoca hinchazón, presión y daño a las células y tejidos del cerebro. El derrame cerebral hemorrágico es comúnmente el resultado de un vaso sanguíneo debilitado que se rompe y sangra en el cerebro circundante. En algunas realizaciones, el derrame cerebral hemorrágico es una hemorragia intracerebral, es decir, provocado por hemorragia dentro del propio tejido cerebral. En algunas realizaciones, la hemorragia intracerebral está provocada por una hemorragia intraparenquimatosa. En algunas realizaciones, la hemorragia intracerebral está provocada por una hemorragia intraventricular. En algunas realizaciones, el derrame cerebral hemorrágico es una hemorragia subaracnoidea, es decir, la hemorragia que se produce fuera del tejido cerebral pero todavía dentro del cráneo. En algunas realizaciones, el derrame cerebral hemorrágico es el resultado de una angiopatía amiloide cerebral. En algunas realizaciones, el derrame cerebral hemorrágico es el resultado de un aneurisma cerebral. En algunas realizaciones, el derrame cerebral hemorrágico es el resultado de una malformación arteriovenosa cerebral (MVA).
En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido un derrame cerebral hemorrágico. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido una hemorragia intracerebral. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido una hemorragia intraparenquimatosa. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido una hemorragia intraventricular. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido una hemorragia subaracnoidea. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido angiopatía amiloide cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido un aneurisma cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido MVA cerebral.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de un derrame cerebral hemorrágico. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de una hemorragia intracerebral. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de una hemorragia intraparenquimatosa. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de una hemorragia intraventricular. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de una hemorragia subaracnoidea. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de una angiopatía amiloide cerebral. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de un aneurisma cerebral. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de MVA cerebral.
La restauración del flujo sanguíneo adecuado al cerebro después de un período de interrupción, aunque es eficaz para aliviar los síntomas asociados con el derrame cerebral, puede dar como resultado paradójicamente más daño al tejido cerebral. Durante el período de interrupción, el tejido afectado sufre de falta de oxígeno y nutrientes, y la restauración repentina del flujo sanguíneo puede dar como resultado inflamación y daño oxidativo a través de la inducción de estrés oxidativo. Esto se conoce como lesión por reperfusión y está bien documentado no solo después de un derrame cerebral, sino también después de un ataque cardíaco u otro daño tisular cuando el suministro de sangre regresa al tejido después de un período de isquemia o falta de oxígeno. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido una lesión por reperfusión como resultado de un derrame cerebral. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de una lesión por reperfusión como resultado de un derrame cerebral.
Un ataque isquémico transitorio (AIT), a menudo denominado mini derrame cerebral, es una señal de advertencia reconocida de un derrame cerebral más grave. Por tanto, los sujetos que han sufrido uno o más AIT tienen por lo tanto mayor riesgo de sufrir un derrame cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido un AIT. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de un TIA. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de una lesión cerebral en un sujeto que ha sufrido un TIA.
La presión arterial alta, colesterol alto en sangre, antecedentes familiares de derrame cerebral, enfermedad cardíaca, diabetes, aneurismas cerebrales, malformaciones arteriovenosas, enfermedad de células falciformes, vasculitis, trastornos hemorrágicos, uso de antiinflamatorios no esteroideos (AINE), fumar tabaco, beber grandes cantidades de alcohol, el uso de drogas ilegales, la obesidad, la falta de actividad física y una dieta poco saludable se consideran todos factores de riesgo de derrame cerebral. En particular, se ha demostrado de manera concluyente que la disminución de la presión sanguínea previene los derrames cerebrales tanto isquémicos como hemorrágicos [36, 37]. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de una lesión cerebral en un sujeto que tiene por lo menos un factor de riesgo de derrame cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto tiene dos factores de riesgo de derrame cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto tiene tres factores de riesgo de derrame cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cuatro factores de riesgo de derrame cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto tiene más de cuatro factores de riesgo de derrame cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto tiene presión sanguínea alta. En algunas realizaciones, el sujeto tiene colesterol en sangre alto. En algunas realizaciones, el sujeto tiene antecedentes familiares de derrame cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una enfermedad cardíaca. En algunas realizaciones, el sujeto tiene diabetes. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un aneurisma cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto tiene malformaciones arteriovenosas. En algunas realizaciones, el sujeto tiene vasculitis. En algunas realizaciones, el sujeto tiene enfermedad de células falciformes. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un trastorno hemorrágico. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un historial de uso de fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). En algunas realizaciones, el sujeto fuma tabaco. En algunas realizaciones, el sujeto bebe grandes cantidades de alcohol. En algunas realizaciones, el sujeto usa drogas ilegales. En algunas realizaciones, el sujeto es obeso. En algunas realizaciones, el sujeto tiene sobrepeso. En algunas realizaciones, el sujeto carece de actividad física. En algunas formas de realización, el sujeto tiene una dieta poco saludable.
Los ejemplos indican que las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar daño cerebral y ayudar a la recuperación cuando se administran antes de que se produzca la lesión. Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden ser particularmente útiles para tratar daño cerebral cuando se administran a sujetos con riesgo de daño cerebral, como apoplejía.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se usan para reducir el daño provocado por un posible daño cerebral, preferiblemente un derrame cerebral. Las composiciones pueden reducir el daño provocado cuando se administran antes de que se produzca el posible daño cerebral, en particular cuando se administran a un paciente identificado en riesgo de daño cerebral.
Los ejemplos indican que las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar daño cerebral y ayudar a la recuperación cuando se administran después de que se haya producido la lesión. Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden ser particularmente útiles para tratar daño cerebral cuando se administran a sujetos después de una lesión cerebral, como un derrame cerebral.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención tratan el daño cerebral reduciendo el daño motor. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención tratan el daño cerebral mejorando la función motora. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención tratan el daño cerebral mejorando la fuerza muscular. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención tratan el daño cerebral mejorando la memoria. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención tratan el daño cerebral mejorando el reconocimiento social. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención tratan el daño cerebral mejorando la función neurológica.
El tratamiento del daño cerebral puede referirse, por ejemplo, al alivio de la gravedad de los síntomas. El tratamiento del daño cerebral también puede referirse a reducir las insuficiencias neurológicas que siguen a un derrame cerebral. Las composiciones de la invención para su uso en el tratamiento de un derrame cerebral pueden proporcionarse al sujeto antes del inicio del derrame cerebral, por ejemplo, en un paciente identificado con riesgo de derrame cerebral. Las composiciones de la invención para su uso en el tratamiento de un derrame cerebral pueden proporcionarse después de que se ha producido un derrame cerebral, por ejemplo, durante la recuperación. Las composiciones de la invención para su uso en el tratamiento de un derrame cerebral pueden proporcionarse durante la fase aguda de recuperación (es decir, hasta una semana después del derrame cerebral). Las composiciones de la invención para su uso en el tratamiento de un derrame cerebral pueden proporcionarse durante la fase subaguda de recuperación (es decir, desde una semana hasta tres meses después del derrame cerebral). Las composiciones de la invención para su uso en el tratamiento de un derrame cerebral pueden proporcionarse durante la fase crónica de la recuperación (es decir, desde tres meses después del derrame cerebral).
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en combinación con un agente activo secundario. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en combinación con aspirina o activador de plasminógeno tisular (tPA). Otros agentes secundarios incluyen otros antiplaquetarios (como clopidogrel), anticoagulantes (como heparinas, warfarina, apixabán, dabigatrán, edoxabán o rivaroxabán), antihipertensivos (como diuréticos, inhibidores de la ACE, bloqueadores de los canales de calcio, betabloqueantes o alfabloqueantes) o estatinas. Las composiciones de la invención pueden mejorar la respuesta del paciente al agente activo secundario.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen el efecto de la isquemia en los tejidos. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen la cantidad de daño a los tejidos provocado por la isquemia. En ciertas realizaciones, los tejidos dañados por isquemia son los tejidos cerebrales. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen la necrosis o el número de células necróticas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen la apoptosis o el número de células apoptóticas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen el número de células necróticas y apoptóticas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen la muerte celular por necrosis y/o apoptosis. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen la muerte celular por necrosis y/o apoptosis provocada por isquemia. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la recuperación del tejido dañado por isquemia. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la velocidad de depuración de células necróticas y/o apoptóticas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la eficacia de la depuración de células necróticas y/o células apoptóticas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la sustitución y/o regeneración de células dentro de los tejidos. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la sustitución y/o regeneración de células dentro de tejidos dañados por isquemia. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la histología general del tejido (por ejemplo, tras una biopsia).
Modos de administración
Preferiblemente, las composiciones de la invención son para su administración al tracto gastrointestinal para permitir la administración y/o la colonización parcial o total del intestino con la cepa bacteriana de la invención. Generalmente, las composiciones de la invención se administran por vía oral, pero pueden administrarse por vía rectal, intranasal o por vía bucal o sublingual.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden administrarse como una espuma, spray o gel.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden administrarse como un supositorio, como un supositorio rectal, por ejemplo en forma de aceite de teobroma (manteca de cacao), grasa dura sintética (por ejemplo, suppocire, witepsol), glicerogelatina, polietilenglicol o composición de glicerina de jabón.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención se administra al tracto gastrointestinal a través de un tubo, como un tubo nasogástrico, un tubo orogástrico, un tubo gástrico, un tubo de yeyunostomía (tubo en J), una gastrostomía endoscópica percutánea (PEG) o un puerto, como como un puerto de la pared torácica que proporciona acceso al estómago, yeyuno y otros puertos de acceso adecuados.
Las composiciones de la invención pueden administrarse una vez o pueden administrarse secuencialmente como parte de un régimen de tratamiento. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención deben administrarse diariamente.
En ciertas realizaciones de la invención, el tratamiento de acuerdo con la invención se acompaña de la evaluación de la microbiota intestinal del paciente. El tratamiento puede repetirse si no se logra la administración y/o la colonización parcial o total con la cepa de la invención de tal manera que no se observa eficacia, o el tratamiento puede interrumpirse si la administración y/o la colonización parcial o total tienen éxito y se observa eficacia.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención puede administrarse a un animal preñado, por ejemplo, un mamífero como un humano para prevenir el desarrollo de una enfermedad inflamatoria o autoinmune en su hijo en el útero y/o después de su nacimiento.
Las composiciones de la invención pueden administrarse a un paciente que ha sido diagnosticado con una enfermedad neurodegenerativa o al que se le ha identificado que tiene riesgo de una enfermedad neurodegenerativa. Las composiciones también pueden administrarse como medida profiláctica para prevenir el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas en un paciente sano.
Las composiciones de la invención pueden administrarse a un paciente que ha sido identificado con una microbiota intestinal anormal. Por ejemplo, el paciente puede tener una colonización reducida o ausente por Parabacteroides, y en particular Parabacteroides distasonis.
Las composiciones de la invención pueden administrarse como un producto alimenticio, como un suplemento nutricional.
Generalmente, las composiciones de la invención son para el tratamiento de humanos, aunque pueden usarse para tratar animales, incluyendo mamíferos monogástricos como aves de corral, cerdos, gatos, perros, caballos o conejos. Las composiciones de la invención pueden ser útiles para mejorar el crecimiento y el rendimiento de los animales. Si se administra a animales, puede usarse alimentación forzada oral.
Composiciones
Generalmente, la composición de la invención comprende bacterias. En realizaciones preferidas de la invención, la composición se formula en forma liofilizada. Por ejemplo, la composición de la invención puede comprender gránulos o cápsulas de gelatina, por ejemplo cápsulas de gelatina dura, que comprenden una cepa bacteriana de la invención.
Preferiblemente, la composición de la invención comprende bacterias liofilizadas. La liofilización de bacterias es un procedimiento bien establecido y las guías pertinentes están disponibles, por ejemplo, en las referencias [38-40].
Alternativamente, la composición de la invención puede comprender un cultivo bacteriano activo vivo. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención no ha sido inactivada, por ejemplo, no ha sido inactivada por calor. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención no ha sido destruida, por ejemplo, no ha sido destruida por calor. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención no ha sido atenuada, por ejemplo, no ha sido atenuada por calor. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención no ha sido destruida, inactivada y/o atenuada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención está viva. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención es viable. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención es capaz de colonizar parcial o totalmente el intestino. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención es viable y capaz de colonizar parcial o totalmente el intestino.
En algunas realizaciones, la composición comprende una mezcla de cepas bacterianas vivas y cepas bacterianas que han sido destruidas.
En realizaciones preferidas, la composición de la invención se encapsula para permitir la administración de la cepa bacteriana al intestino. La encapsulación protege la composición de la degradación hasta la administración en la localización objetivo a través de, por ejemplo, ruptura con estímulos químicos o físicos como presión, actividad enzimática o disgregación física, que pueden desencadenarse por cambios en el pH. Puede usarse cualquier método de encapsulación apropiado. Las técnicas de encapsulación ejemplares incluyen atrapamiento dentro de una matriz porosa, unión o adsorción sobre superficies sólidas del portador, autoagregación por floculación o con agentes de reticulación y contención mecánica detrás de una membrana microporosa o una microcápsula. Orientación sobre encapsulación que puede ser útil para preparar composiciones de la invención está disponible, por ejemplo, en las referencias [41] y [42].
La composición puede administrarse por vía oral y puede estar en forma de comprimido, cápsula o polvo. Se prefieren los productos encapsulados porque los parabacteroides son anaerobios. Pueden incluirse otros ingredientes (como vitamina C, por ejemplo) como captadores de oxígeno y sustratos prebióticos para mejorar la administración y/o la colonización parcial o total y la supervivencia in vivo. Alternativamente, la composición probiótica de la invención puede administrarse por vía oral como alimento o producto nutricional, como leche o producto lácteo fermentado a base de suero, o como un producto farmacéutico.
La composición puede formularse como un probiótico.
Una composición de la invención incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de una cepa bacteriana de la invención. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una cepa bacteriana es suficiente para ejercer un efecto beneficioso sobre un paciente. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una cepa bacteriana puede ser suficiente para dar como resultado la administración y/o la colonización parcial o total del intestino del paciente.
Una dosis diaria adecuada de la bacteria, por ejemplo para un humano adulto, puede ser de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias (CFU); por ejemplo, de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1010 CFU; en otro ejemplo, de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1010 CFU.
En ciertas realizaciones, la composición contiene la cepa bacteriana en una cantidad de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1011 CFU/g, con respecto al peso de la composición; por ejemplo, de aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1010 CFU/g. La dosis puede ser, por ejemplo, 1 g, 3 g, 5 g y 10 g.
Típicamente, un probiótico, como la composición de la invención, se combina opcionalmente con por lo menos un compuesto prebiótico adecuado. Un compuesto prebiótico suele ser un carbohidrato no digerible, como un oligo- o polisacárido, o un alcohol de azúcar, que no se degrada ni se absorbe en el tracto digestivo superior. Los prebióticos conocidos incluyen productos comerciales como inulina y transgalacto-oligosacáridos.
En ciertas realizaciones, la composición probiótica de la presente invención incluye un compuesto prebiótico en una cantidad de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 30% en peso, con respecto al peso total de la composición (por ejemplo, del 5 al 20% en peso). Los carbohidratos pueden seleccionarse del grupo que consiste de: fructo-oligosacáridos (o FOS), fructo-oligosacáridos de cadena corta, inulina, isomalt-oligosacáridos, pectinas, xilo-oligosacáridos (o XOS), quitosano-oligosacáridos (o COS), beta-glucanos, almidones resistentes y modificados con goma de cultivo, polidextrosa, D-tagatosa, fibras de acacia, algarroba, avena y fibras de cítricos. En un aspecto, los prebióticos son fructo-oligosacáridos de cadena corta (por simplicidad mostrados a continuación en la presente como FOSs-c.c); dichos FOSs-c.c. son carbohidratos no digeribles, obtenidos generalmente por la conversión del azúcar de remolacha y que incluyen una molécula de sacarosa a la que se unen tres moléculas de glucosa.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se usan en combinación con otro compuesto terapéutico para tratar o prevenir el trastorno neurodegenerativo. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se administran con suplementos nutricionales que modulan la neuroprotección o la neuroproliferación. En realizaciones preferidas, los suplementos nutricionales comprenden o consisten de vitaminas nutricionales. En ciertas realizaciones, las vitaminas son vitamina B6, magnesio, dimetilglicina (vitamina B16) y vitamina C. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se administran en combinación con otro probiótico.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se usan para potenciar el efecto de un segundo agente sobre una enfermedad neurodegenerativa. Los efectos inmunomoduladores de las composiciones de la invención pueden hacer que el cerebro sea más susceptible a terapias convencionales como Levodopa, agonistas de dopamina, inhibidores de MAO-B, inhibidores de COMT, antagonistas de glutamato o anticolinérgicos, que son agentes secundarios ejemplares para administrar en combinación (secuencial o contemporáneamente) con las composiciones de la invención.
Las composiciones de la invención pueden comprender excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de tales excipientes adecuados pueden encontrarse en la referencia [43]. Los portadores o diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en la referencia [44]. Los ejemplos de portadores adecuados incluyen lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol, sorbitol y similares. Los ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerol y agua. La elección del portador, excipiente o diluyente farmacéutico puede seleccionarse con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como, o además de, el portador, excipiente o diluyente cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión adecuado, agente de recubrimiento, agente solubilizante. Ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol. Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares. En la composición farmacéutica pueden proporcionarse conservantes, estabilizadores, colorantes e incluso agentes aromatizantes. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. También pueden usarse antioxidantes y agentes de suspensión.
Las composiciones de la invención pueden formularse como un producto alimenticio. Por ejemplo, un producto alimenticio puede proporcionar un beneficio nutricional además del efecto terapéutico de la invención, como en un suplemento nutricional. De manera similar, puede formularse un producto alimenticio para mejorar el sabor de la composición de la invención o para hacer que la composición sea más atractiva para consumir al ser más similar a un artículo alimenticio común que a una composición farmacéutica. En ciertas realizaciones, la composición de la invención se formula como un producto a base de leche. El término "producto a base de leche" significa cualquier producto a base de leche o suero líquido o semisólido que tiene un contenido de grasa variable. El producto a base de leche puede ser, por ejemplo, leche de vaca, leche de cabra, leche de oveja, leche desnatada, leche entera, leche recombinada a partir de leche en polvo y suero sin ningún procesamiento, o un producto procesado, como yogur, leche cuajada, cuajada, leche agria, leche entera agria, leche de mantequilla y otros productos lácteos agrios. Otro grupo importante incluye las bebidas lácteas, como las bebidas de suero, leches fermentadas, leches condensadas, leches para lactantes o bebés; leches aromatizadas, helados; alimentos que contienen leche, como dulces.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden una o más cepas bacterianas del género Parabacteroides y no contienen bacterias de ningún otro género, o que comprenden sólo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otros géneros. Por tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una o más cepas bacterianas del género Parabacteroides, que no contiene bacterias de ningún otro género o que comprende solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otros géneros, para su uso en terapia.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden una o más cepas bacterianas de la especie Parabacteroides distasonis y no contienen bacterias de ninguna otra especie, o que comprenden sólo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra especie. Por tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una o más cepas bacterianas de la especie Parabacteroides distasonis, que no contiene bacterias de ninguna otra especie o que comprende solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra especie, para su uso en terapia.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden una o más cepas bacterianas de la especie Parabacteroides distasonis y no contienen bacterias de ninguna otra especie de Parabacteroides, o que comprenden solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra especie de Parabacteroides. Por tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una o más cepas bacterianas de la especie Parabacteroides distasonis, que no contiene bacterias de ninguna otra especie de Parabacteroides o que comprende solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra especie de Parabacteroides, para su uso en terapia.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención contienen una única cepa o especie bacteriana y no contienen ninguna otra cepa o especie bacteriana. Tales composiciones pueden comprender solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de otras cepas o especies bacterianas. Tales composiciones pueden ser un cultivo sustancialmente libre de otras especies de organismos.
En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una única cepa bacteriana del género Parabacteroides, que no contiene bacterias de ninguna otra cepa o que comprende solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra cepa para su uso en terapia.
En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una única cepa bacteriana de la especie Parabacteroides distasonis, que no contiene bacterias de ninguna otra cepa o que comprende solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra cepa para su uso en terapia.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden más de una cepa bacteriana. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden más de una cepa de la misma especie (por ejemplo, más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 45 cepas) y, opcionalmente, no contienen bacterias de ninguna otra especie. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden menos de 50 cepas de la misma especie (por ejemplo, menos de 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 cepas) y, opcionalmente, no contienen bacterias de ninguna otra especie. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden 1-40, 1-30, 1-20, 1-19, 1-18, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6- 30, 6-15, 16-25, o 31-50 cepas de la misma especie y, opcionalmente, no contienen bacterias de ninguna otra especie. La invención comprende cualquier combinación de los anteriores.
En algunas realizaciones, la composición comprende un consorcio microbiano. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición comprende la cepa bacteriana Parabacteroides como parte de un consorcio microbiano. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana de Parabacteroides está presente en combinación con una o más (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 15 o 20) de otras cepas bacterianas de otros géneros con las que puede vivir simbióticamente in vivo en el intestino. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición comprende una cepa bacteriana de Parabacteroides en combinación con una cepa bacteriana de un género diferente. En algunas realizaciones, el consorcio microbiano comprende dos o más cepas bacterianas obtenidas de una muestra de heces de un único organismo, por ejemplo, un humano. En algunas realizaciones, el consorcio microbiano no se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el consorcio microbiano comprende cepas bacterianas obtenidas de muestras de heces de por lo menos dos organismos diferentes. En algunas realizaciones, los dos organismos diferentes son de la misma especie, por ejemplo, dos humanos diferentes. En algunas realizaciones, los dos organismos diferentes son un humano infante y un humano adulto. En algunas realizaciones, los dos organismos diferentes son un mamífero humano y uno no humano.
En algunas realizaciones, la composición de la invención comprende adicionalmente una cepa bacteriana que tiene las mismas características de seguridad y eficacia terapéutica que la cepa MRX005, pero que no es MRx0005, o que no es una Parabacteroides distasonis.
En algunas realizaciones en las que la composición de la invención comprende más de una cepa, especie o género bacteriano, las cepas, especies o géneros bacterianos individuales pueden ser para administración separada, simultánea o secuencial. Por ejemplo, la composición puede comprender todas las más de una cepa, especie o género bacteriano, o las cepas, especies o géneros bacterianos pueden almacenarse por separado y administrarse por separado, simultánea o secuencialmente. En algunas realizaciones, las más de una cepa, especie o género bacteriana se almacenan por separado pero se mezclan antes de su uso.
En algunas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención se obtiene de heces de adultos humanos. En algunas realizaciones en las que la composición de la invención comprende más de una cepa bacteriana, todas las cepas bacterianas se obtienen de heces humanas adultas o si están presentes otras cepas bacterianas, están presentes sólo en cantidades mínimas. Las bacterias pueden haber sido cultivadas después de haberlas obtenido de las heces de adultos humanos y haber sido usadas en una composición de la invención.
En algunas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención se obtiene de heces de infantes humanos. En algunas realizaciones en las que la composición de la invención comprende más de una cepa bacteriana, todas las cepas bacterianas se obtienen de heces de infantes humanos o, si están presentes otras cepas bacterianas, sólo lo están en cantidades mínimas. Las bacterias pueden haber sido cultivadas después de ser obtenidas de las heces de infantes humanos y haber sido usadas en una composición de la invención.
Como se ha mencionado anteriormente, en algunas realizaciones, una o más cepas bacterianas de Parabacteroides es/son el único agente o agentes terapéuticamente activos en una composición de la invención. En algunas realizaciones, la cepa o cepas bacterianas en la composición es/son el único agente o agentes terapéuticamente activos en una composición de la invención.
Las composiciones para su uso de acuerdo con la invención pueden requerir o no aprobación de comercialización.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde dicha cepa bacteriana está liofilizada. En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde dicha cepa bacteriana se seca por pulverización. En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la cepa bacteriana se liofiliza o se seca por pulverización y en donde está viva. En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la cepa bacteriana se liofiliza o se seca por pulverización y en donde es viable. En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la cepa bacteriana se liofiliza o se seca por pulverización y en donde es capaz de colonizar parcial o totalmente el intestino. En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la cepa bacteriana se liofiliza o se seca por pulverización y en donde es viable y capaz de colonizar parcial o totalmente el intestino
En algunos casos, la cepa bacteriana liofilizada se reconstituye antes de la administración. En algunos casos, la reconstitución se realiza mediante el uso de un diluyente descrito en la presente.
Las composiciones de la invención pueden comprender excipientes, diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: una cepa bacteriana de la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde la cepa bacteriana está en una cantidad suficiente para tratar un trastorno neurodegenerativo cuando se administra a un sujeto con necesidad de ello.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: una cepa bacteriana de la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde la cepa bacteriana está en una cantidad suficiente para tratar o prevenir un trastorno neurodegenerativo.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la cantidad de cepa bacteriana es de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias por gramo con respecto al peso de la composición.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la composición se administra en una dosis de 1 g, 3 g, 5 g o 10 g.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la composición se administra mediante un método seleccionado del grupo que consiste de oral, rectal, subcutáneo, nasal, bucal y sublingual.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un portador seleccionado del grupo que consiste de lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol y sorbitol.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un diluyente seleccionado del grupo que consiste de etanol, glicerol y agua.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un excipiente seleccionado del grupo que consiste de almidón, gelatina, glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorante de maíz, goma arábiga, tragacanto, alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio y cloruro de sodio.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende además por lo menos uno de un conservante, un antioxidante y un estabilizante.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un conservante seleccionado del grupo que consiste de benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido phidroxibenzoico.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde dicha cepa bacteriana está liofilizada.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde cuando la composición se almacena en un recipiente sellado a aproximadamente 4° C o aproximadamente 25° C y el recipiente se coloca en una atmósfera que tiene un 50% de humedad relativa, por lo menos un 80% de la cepa bacteriana medido en unidades formadoras de colonias, permanece después de un período de por lo menos aproximadamente: 1 mes, 3 meses, 6 meses, 1 año, 1,5 años, 2 años, 2,5 años o 3 años.
En algunas realizaciones, la composición de la invención se proporciona en un recipiente sellado que comprende una composición como se describe en la presente. En algunas realizaciones, el recipiente sellado es una bolsita o una botella. En algunas realizaciones, la composición de la invención se proporciona en una jeringuilla que comprende una composición como se describe en la presente.
La composición de la presente invención puede, en algunas realizaciones, proporcionarse como una formulación farmacéutica. Por ejemplo, la composición puede proporcionarse en forma de comprimido o cápsula. En algunas realizaciones, la cápsula es una cápsula de gelatina ("gel-cap").
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se administran por vía oral. La administración oral puede implicar la deglución, de tal manera que el compuesto se introduzca al tracto gastrointestinal y/o la administración bucal, lingual o sublingual mediante la cual el compuesto se introduce en el torrente sanguíneo directamente desde la boca.
Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral incluyen tapones sólidos, microparticulados sólidos, semisólidos y líquidos (incluyendo sistemas de múltiples fases o dispersos) como comprimidos; cápsulas blandas o duras que contienen múlti- o nanoparticulados, líquidos (por ejemplo, soluciones acuosas), emulsiones o polvos; pastillas para chupar (incluso rellenas de líquido); gomas de mascar; geles; formas de dosificación de dispersión rápida; películas; óvulos; espráis y parches bucales/mucoadhesivos.
En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica es una formulación entérica, es decir, una formulación gastrorresistente (por ejemplo, resistente al pH gástrico) que es adecuada para la administración de la composición de la invención al intestino por administración oral. Las formulaciones entéricas pueden ser particularmente útiles cuando la bacteria u otro componente de la composición es sensible a los ácidos, por ejemplo, propenso a degradarse en condiciones gástricas.
En algunas realizaciones, la formulación entérica comprende un recubrimiento entérico. En algunas realizaciones, la formulación es una forma de dosificación con recubrimiento entérico. Por ejemplo, la formulación puede ser un comprimido con recubrimiento entérico o una cápsula con recubrimiento entérico o similares. El recubrimiento entérico puede ser un recubrimiento entérico convencional, por ejemplo, un recubrimiento convencional para un comprimido, cápsula o similar para administración oral. La formulación puede comprender un recubrimiento de película, por ejemplo, una capa de película delgada de un polímero entérico, por ejemplo, un polímero insoluble en ácido.
En algunas realizaciones, la formulación entérica es intrínsecamente entérica, por ejemplo, gastrorresistente sin la necesidad de un recubrimiento entérico. Por tanto, en algunas realizaciones, la formulación es una formulación entérica que no comprende un recubrimiento entérico. En algunas realizaciones, la formulación es una cápsula hecha de un material termogelificante. En algunas realizaciones, el material termogelificante es un material celulósico, como metilcelulosa, hidroximetilcelulosa o hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). En algunas realizaciones, la cápsula comprende una cubierta que no contiene ningún polímero formador de película. En algunas realizaciones, la cápsula comprende una cubierta y la cubierta comprende hidroxipropilmetilcelulosa y no comprende ningún polímero formador de película (ver por ejemplo [45]). En algunas realizaciones, la formulación es una cápsula intrínsecamente entérica (por ejemplo, Vcaps® de Capsugel).
En algunas realizaciones, la formulación es una cápsula blanda. Las cápsulas blandas son cápsulas que, debido a la adición de ablandadores como, por ejemplo, glicerol, sorbitol, maltitol y polietilenglicoles, presentes en la cubierta de la cápsula, pueden tener una cierta elasticidad y suavidad. Las cápsulas blandas pueden producirse, por ejemplo, a base de gelatina o almidón. Las cápsulas blandas a base de gelatina están disponibles comercialmente de varios proveedores. Dependiendo del método de administración, como por ejemplo por vía oral o rectal, las cápsulas blandas pueden tener varias formas, pueden ser, por ejemplo, redondas, ovaladas, oblongas o con forma de torpedo. Las cápsulas blandas se pueden producir mediante procesos convencionales como, por ejemplo, mediante el proceso de Scherer, el proceso Accogel o el proceso de gotitas o soplado.
Métodos de cultivo
Las cepas bacterianas para su uso en la presente invención pueden cultivarse usando técnicas microbiológicas estándar como se detalla, por ejemplo, en las referencias [46-48].
El medio sólido o líquido usado para el cultivo puede ser agar YCFA o medio YCFA. El medio YCFA puede incluir (por 100 ml, valores aproximados): Casitone (1,0 g), extracto de levadura (0,25 g), NaHCO3 (0,4 g), cisteína (0,1 g), K2HPO4 (0,045 g), KH2PO4 (0,045 g), NaCl (0,09 g), (NH4)2SO4 (0,09 g), MgSO4'7H2O (0,009 g), CaCh (0,009 g), resazurina (0,1 mg), hemina (1 mg), biotina (1 |jg), cobalamina (1 |jg), ácido p-aminobenzoico (3 |jg), ácido fólico (5 jg ) y piridoxamina (15 jg).
Cepas bacterianas para su uso en composiciones de vacunas
Los inventores han identificado que las cepas bacterianas de la invención son útiles para tratar o prevenir trastornos neurodegenerativos. Es probable que esto sea el resultado del efecto que las cepas bacterianas de la invención tienen sobre el sistema inmunológico del huésped. Por lo tanto, las composiciones de la invención también pueden ser útiles para prevenir trastornos neurodegenerativos cuando se administran como composiciones de vacuna. En ciertas de tales realizaciones, las cepas bacterianas de la invención pueden matarse, inactivarse o atenuarse. En ciertas de tales realizaciones, las composiciones pueden comprender un adyuvante de vacuna. En ciertas realizaciones, las composiciones son para administración mediante inyección, como mediante inyección subcutánea.
General
La puesta en práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de los conocimientos de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Ver, por ejemplo, las referencias [49] y [50-56], etc.
El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.
El término "aproximadamente" con respecto a un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x ±10%.
La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.
Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos significan que, cuando se alinean, ese porcentaje de nucleótidos es el mismo al comparar las dos secuencias. Este alineamiento y el porcentaje de homología o identidad de secuencia pueden determinarse usando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la sección 7.7.18 de la ref. [57]. Una alineación preferida se determina mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de huecos afines con una penalización de apertura de hueco de 12 y una penalización de extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se describe en la ref. [58].
A menos que se indique específicamente, un proceso o método que comprende numerosos pasos puede comprender pasos adicionales al principio o al final del método, o puede comprender pasos intermedios adicionales. Además, los pasos pueden combinarse, omitirse o realizarse en un orden alternativo, si es apropiado.
En la presente se describen varias realizaciones de la invención. Se apreciará que las características especificadas en cada realización pueden combinarse con otras características especificadas, para proporcionar realizaciones adicionales. En particular, las realizaciones destacadas en la presente como adecuadas, típicas o preferidas pueden combinarse entre sí (excepto cuando son mutuamente excluyentes).
MODOS DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN
Ejemplo 1 - eficacia de los inóculos bacterianos para actuar como neuroprotector
Resumen
Se trataron células de neuroblastoma con composiciones que comprenden cepas bacterianas según la invención. Las células de neuroblastoma SH-SY5Y usadas son productoras de dopamina y están bien establecidas como modelo in vitro para el estudio de enfermedades neurodegenerativas. Se observó la capacidad de las cepas bacterianas para aumentar la neuroproliferación. Las células del neuroblastoma se trataron también con1-metil-4 fenilpiridinio (MPP) tratado con neurotoxina dopaminérgica, que induce síntomas permanentes de la enfermedad de Parkinson en las células del neuroblastoma. Se investigó la capacidad de las cepas bacterianas para actuar como neuroprotector contra MPP.
Material y métodos
Cepa bacteriana
755: Parabacteroides distasonis, Megasphaera massiliensis MRx0029
Línea celular
Se adquirieron células de neuroblastoma SH-SY5Y de ECCACC (N° de cat.: 94030304) y se cultivaron en MEM (Sigma Aldrich, N° de cat. M2279) suplementado con la mezcla de nutrientes F-12 Ham (Sigma Aldrich, N° de cat. N4888).
Método
Una vez desarrolladas, las células de neuroblastoma SH-SY5Y se colocaron en placas de 96 pocillos a 11.000 células/pocillo y se incubaron durante 2 días. Luego, las células se transfirieron a medio de diferenciación (que contiene FBS al 1%) y ácido retinoico 10 uM (Sigma Aldrich, N° de cat. R2625-100MG). El medio de diferenciación se reemplazó cada dos días y las células se recogieron a los 7 días de la diferenciación. Las células se pretrataron con o sin MPP (Sigma Aldrich, N° de cat. D048-1G) durante 8 horas. Posteriormente, las células se trataron con sobrenadante bacteriano al 10% y se incubaron durante la noche. La viabilidad celular se midió usando reactivo CCK-8 (Sigma Aldrich, Cell Counting Kit-8, N° de cat. 96992-3000TESTS-F) y se leyó a una longitud de onda de 450 nm.
Resultados
Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 1. El tratamiento de las células de neuroblastoma con MRx0005 o MRx0029 llevó a un aumento de la proliferación de neuronas. Las células de neuroblastoma que se trataron con MPP junto con la cepa bacteriana tenían una viabilidad celular aumentada en comparación con las células tratadas con MPP solo (que tenían una viabilidad disminuida). Estos datos muestran que las cepas bacterianas pueden actuar como neuroprotectores.
Ejemplo 2A - Eficacia de los inóculos bacterianos para reducir la secreción de IL-6
Resumen
La activación de citoquinas proinflamatorias se ha asociado con daño neuronal en enfermedades neurodegenerativas. El lipopolisacárido (LPS) es un estimulador conocido de la citoquina proinflamatoria IL-6. Se trataron células de astrocitoma de glioblastoma humano con composiciones que comprenden cepas bacterianas de acuerdo con la invención en combinación con LPS para observar su capacidad para modular los niveles de IL-6. Material y métodos
Cepa bacteriana
755: Parabacteroides distasonis
Línea celular
MG U373 es un astrocitoma de glioblastoma humano derivado de un tumor maligno y se adquirió de Sigma-Aldrich (N° de cat. 08061901-1VL). Se cultivaron células de astrocitoma de glioblastoma humano MG U373 en MEM (Sigma Aldrich, N° de cat. M-2279) suplementado con FBS al 10%, Pen Strep al 1%, L-Glut 4 mM, solución de aminoácidos no esenciales IX MEM y piruvato de sodio IX.
Método
Una vez desarrolladas, las células MG U373 se colocaron en placas de 24 pocillos a 100.000 células/pocillo. Las células se trataron con LPS (1 ug/ml) solo o con un 10% de sobrenadante de bacterias de MRx0005 durante 24 h. También se realizó un control en el que las células se incubaron en medio sin tratar. Posteriormente, se recogieron los sobrenadantes libres de células, se centrifugaron a 10.000 g durante 3 min a 4° C. Se midió IL-6 usando el kit ELISA de IL-6 humana de Peprotech (N° de cat. 900-K16) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Resultados
Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 2A. El tratamiento de las células de neuroblastoma con LPS y la cepa de bacterias llevó a una disminución del nivel de IL-6 secretada.
Ejemplo 2B - Eficacia de los inóculos bacterianos para modular la secreción de IL-8
Resumen
Como la neuroinflamación desempeña un papel fundamental en las enfermedades neurodegenerativas y se ha demostrado que IL-8 tiene efectos neuro-positivos, se evaluó el efecto de las composiciones que comprenden cepas bacterianas de la invención y LPS sobre la activación de IL-8. Se trataron células de astrocitoma de glioblastoma humano con composiciones que comprenden cepas bacterianas de acuerdo con la invención en combinación con LPS para observar su capacidad para modular los niveles de IL-8.
Material y métodos
Cepas bacterianas
Megasphaera massiliensis MRX0029; Parabacteroides distasonis MRX0005
Línea celular
MG U373 es un astrocitoma de glioblastoma humano derivado de un tumor maligno y se adquirió de Sigma-Aldrich (N° de cat. 08061901-1VL). Se cultivaron células de astrocitoma de glioblastoma humano MG U373 en MEM (Sigma Aldrich, N° de cat. M-2279) suplementado con FBS al 10%, Pen Strep al 1%, L-Glut 4 mM, solución de aminoácidos no esenciales IX MEM y piruvato de sodio IX.
Método
Una vez desarrolladas, las células MG U373 se colocaron en placas de 24 pocillos a 100.000 células/pocillo. Las células se trataron con LPS (1 ug/ml) solo o con un 10% de sobrenadante de bacterias de MRX0029 durante 24 h. Posteriormente, se recogieron los sobrenadantes libres de células, se centrifugaron a 10.000 g durante 3 min a 4° C. Se midió IL-8 usando el kit ELISA de IL-8 humana de Peprotech (N° de cat. 900-K18) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Resultados
Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 2B.
Ejemplo 2C - Eficacia de los inóculos bacterianos para reducir la inflamación inducida por a-sinucleína Resumen
La neuroinflamación desempeña un papel fundamental en la enfermedad de Parkinson y se ha demostrado que la a-sinucleína induce la neuroinflamación in vivo. Por lo tanto, se evaluó la capacidad de las cepas de bacterias de la invención para inhibir la neuroinflamación inducida por a-sinucleína. Se expuso un cocultivo de células de astrocitoma de glioblastoma humano y células de neuroblastoma a a-sinucleína de tipo salvaje y las isoformas mutantes E46K y A53T y se trataron con composiciones que comprenden cepas bacterianas de acuerdo con la invención. Luego, se probó la capacidad de las cepas de bacterias para inhibir la secreción de IL-6 inducida por asinucleína.
Material y métodos
Cepas bacterianas
Megasphaera massiliensis MRX0029; Parabacteroides distasonis MRX0005
Línea celular
MG U373 es un astrocitoma de glioblastoma humano derivado de un tumor maligno y se adquirió de Sigma-Aldrich (N° de cat. 08061901-1VL). Se cultivaron células de astrocitoma de glioblastoma humano MG U373 en MEM (Sigma Aldrich, N° de cat. M-2279) suplementado con FBS al 10%, Pen Strep al 1%, L-Glut 4 mM, solución de aminoácidos no esenciales IX MEM y piruvato de sodio IX.
SH-SY5Y es una línea celular de neurobastoma humano derivada de un neuroblastoma maligno y puede adquirirse de Sigma-Aldrich (N° de cat. 94030304-1VL). Las células se cultivaron en medio MEM al 50% y mezcla de nutrientes F-12 Ham al 50% suplementado con L-glutamina 2 mM, FBS inactivado por calor al 10%, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 pg/ml. Las células en medio de crecimiento se colocaron en placas de 96 pocillos a 11.000 células/pocillo y se colocaron en la incubadora. Después de 2 días, el medio se reemplazó con medio de diferenciación (medio de crecimiento que contenía FBS al 1%) y ácido retinoico 10 pM. El medio de diferenciación se reemplazó cada dos días y las células se usaron después de 7 días de diferenciación.
Método
Las células SHSYSY se colocaron en placas de 12 pocillos a una densidad de 50.000 células/pocillo. Las células se cultivaron en medio MEM al 50% y mezcla de nutrientes F-12 Ham al 50% suplementado con L-glutamina 2 mM, FBS inactivado por calor al 10%, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 pg/ml. Las células en medio de crecimiento se colocaron en placas de 96 pocillos a 11.000 células/pocillo y se colocaron en la incubadora. Después de 2 días, el medio se reemplazó con medio de diferenciación (medio de crecimiento que contenía FBS al 1%) y ácido retinoico 10 pM. El medio de diferenciación se reemplazó cada dos días y las células se usaron después de 7 días de diferenciación. Se colocaron U373 en placas de 12 transwell (membrana de poliéster de 0,4 pm, Costar) a una densidad de 50.000 células/pocillo durante 72 h. Las células se co-cultivaron durante 24 horas antes del tratamiento en medio de diferenciación (medio de crecimiento que contenía FBS al 1% sin ácido retinoico).
Posteriormente, las células se trataron con 25 pg/ml de a-sinucleína (Wt, A53T, E46K) en presencia o ausencia de sobrenadante de bacterias al 10% durante 48 h. Se recogieron los sobrenadantes libres de células, se centrifugaron a 10000 g durante 3 min a 4° C, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80° C. Se midieron IL-6 e IL-8 humanas como se ha descrito anteriormente.
Resultados
Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 3. El tratamiento de células con asinucleína de tipo salvaje y las isoformas mutantes E46K y A53T indujo una secreción moderada de IL-6. La secreción de IL-6 inducida por a-syn se inhibió en células tratadas con las cepas de bacterias.
Ejemplo 3 - Eficacia de los inóculos bacterianos para reducir la activación de NFkB
Resumen
La activación del promotor de NFkB lleva a la producción de citoquinas proinflamatorias que incluyen IL-1p, IL-1a, IL-18, TNFa e IL-6. El promotor de NFkB puede ser activado por a-sinucleína y LPS estimulando el ligando TLR4. Las mutaciones en la a-sinucleína, como la a-sinucleína A53T, están implicadas en el Parkinson familiar. El tratamiento de las células neuronales con LPS simula el Parkinson provocado por factores ambientales. Se investigó la capacidad de las composiciones que comprenden cepas bacterianas de acuerdo con la invención para inhibir la activación del promotor de NFkB.
Material y métodos
Cepa bacteriana
755: Parabacteroides distasonis
Línea celular
Se adquirieron TLR4 azul Hek humanas de InvivoGen (N° de cat. Hkb-htlr4). Se cultivaron TLR4 azu1Hek humanas en d Me M con alto contenido de glucosa (Sigma Aldrich, N° de cat. D-6171) suplementado con FBS al 10%, Pen Strep al 1%, L-Glut 4 mM, Normocina y solución de selección azul IX HEK.
Método
Una vez que se desarrollaron, las células de azul Hek humanas se colocaron en placas de 96 pocillos a 25.000 células/pocillo en 4 repeticiones. Un conjunto de células se trató con a-sinucleína A53T (1 ug/ml) solo o con un 10% de sobrenadante de bacterias de MRx0005 durante 22 h. El segundo conjunto de células se trató con LPS (10 ng/ml, de Salmonella enterica serotipo Typhimurium, Sigma Aldrich, N° de cat. L6143) solo o con 10% de sobrenadante de bacterias de MRx0005 durante 22 h. Posteriormente, se centrifugaron las células y se mezclaron 20 ul del sobrenadante con 200 ul de reactivo Quanti Blue (InvivoGen, N° de cat. Rep-qb2), se incubaron durante 2 hy se leyó la absorbancia a 655 nm.
Resultados
Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 4 y 5. La Figura 4 muestra que la activación del promotor de NFkB por a-sinucleína es inhibida por MRx0005. La Figura 5 muestra que la activación del promotor de NfkB por LPS es inhibida por MRx0005.
Ejemplo 4 - Eficacia de los inóculos bacterianos para alterar la capacidad antioxidante
Resumen
La capacidad de las composiciones que comprenden cepas bacterianas según la invención para alterar la capacidad antioxidante. La capacidad antioxidante de la cepa bacteriana se estableció usando el ensayo bien conocido ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)).
Cepa bacteriana
755: Parabacteroides distasonis
Método
Se recogieron y centrifugaron células bacterianas (106 o más). Se volvieron a suspender en tampón de ensayo (usando tres veces el volumen del sedimento). La suspensión se sonicó en hielo durante 5 minutos y luego se centrifugó a 12.000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se eliminó y se midió usando el kit de ensayo ABTS producido por Sigma Aldrich (código CS0790), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Resultados
Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 6. La Figura 6 muestra que MRx0005 tiene una capacidad antioxidante de aproximadamente 0,5 mM en comparación con Trolox.
Ejemplo 5 - Eficacia de los inóculos bacterianos para alterar los niveles de peroxidación de lípidos Resumen
Se investigó la capacidad de las composiciones que comprenden cepas bacterianas de acuerdo con la invención para alterar los niveles de peroxidación de lípidos. Se usó el ensayo de sustancias reactivas tiobarbitúricas (TBAR) para medir los subproductos de la peroxidación lipídica.
Material y métodos
Cepa bacteriana
755: Parabacteroides distasonis
Método
Se recogieron y centrifugaron células bacterianas (106 o más), se realizó un paso de lavado con solución salina isotónica antes de que el sedimento se volviera a suspender en tampón de ensayo de cloruro de potasio. La suspensión se sonicó en hielo durante 10 minutos y luego se centrifugó a 10.000 x g durante 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se evaluó el nivel de peroxidación lipídica usando el ensayo de sustancias reactivas tiobarbitúricas.
Resultados
Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 7. La Figura 7 muestra que MRx0005 es capaz de inhibir la peroxidación de lípidos en aproximadamente un 20%, que es una capacidad antioxidante mayor que el control positivo, hidroxitolueno butilado (1% p/v).
Ejemplo 6 - Eficacia de los inóculos bacterianos sobre la actividad de histona desacetilatasa
Resumen
Se investigó la capacidad de las composiciones que comprenden cepas bacterianas de acuerdo con la invención para alterar la actividad de la histona desacetilatasa. La desregulación de la histona desacetilatasa se ha relacionado con la patogénesis asociada con las enfermedades neurodegenerativas asociadas con la edad.
Material y métodos
Cepa bacteriana
755: Parabacteroides distasonis
Línea celular
Se usó la línea celular HT-29 porque hay histona desacetilasa.
Método
Se aislaron los sobrenadantes libres de células de cultivos bacterianos en fase estacionaria mediante centrifugación y filtración en un filtro de 0,22 pM. Las células HT-29 se usaron 3 días después de la confluencia y se redujeron escalonadamente en 1 ml de DTS 24 horas antes del comienzo del experimento. Las células HT-29 se desafiaron con sobrenadante libre de células al 10% diluido en DTS y esto se dejó incubar durante 48 horas. A Luego se extrajeron las proteínas nucleasa usando el kit de extracción Sigma Aldrich Nuclease y las muestras se congelaron rápidamente antes de la medición de la actividad de HDAC. La actividad de HDAC se evaluó fluorométricamente usando el kit Sigma Aldrich (Reino Unido).
Resultados
Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 8. La Figura 8 muestra que MRx0005 puede reducir los niveles de la actividad de histona desacetilasa.
Ejemplo 7 - Nivel de producción de indol en bacterias
Resumen
Se investigó la capacidad de las bacterias de la invención para producir indol. El indol se ha relacionado con la atenuación de la inflamación y el estrés oxidativo.
Material y métodos
Cepa bacteriana
755: Parabacteroides distasonis
ATCC 11775 es una cepa bacteriana de referencia que se sabe que produce indol.
Método
Se incubaron células bacterianas intactas en fase estacionaria con triptófano 6 mM durante 48 horas. Las especies bacterianas que poseen la enzima triptofanasa utilizarán triptófano como sustrato para producir indol. Después del período de incubación de 48 horas, se eliminó el sobrenadante y se añadió al reactivo de Kovac para la cuantificación del indol. Los estándares, las soluciones madre y los reactivos se prepararon usando métodos estandarizados validados internamente.
Resultados
Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 9. La Figura 9 muestra que MRx0005 tiene la capacidad de producir indol a partir de triptófano, en concentraciones de aproximadamente 0,2 mM.
Ejemplo 8 - Nivel de producción de quinurenina en bacterias
Resumen
Se investigó la capacidad de las bacterias de la invención para producir quinurenina. La desregulación de la vía de la quinurenina puede provocar la activación del sistema inmunológico y la acumulación de compuestos potencialmente neurotóxicos. Las alteraciones en el metabolismo de la quinurenina pueden estar implicadas en el desarrollo de la enfermedad de Parkinson.
Cepa bacteriana
755: Parabacteroides distasonis
DSM 17136 es una cepa de Bacteroides copricola que se sabe que produce quinurenina.
Método
Los sobrenadantes libres de células de cultivos bacterianos en fase estacionaria se aislaron mediante centrifugación y filtración en un filtro de 0,22 uM y se congelaron hasta su uso. Los estándares de quinurenina, las soluciones madre y los reactivos se prepararon usando métodos estandarizados validados internamente. Las muestras se trataron con ácido tricloroacético y se centrifugaron a 10.000 x g durante 10 minutos a 4° C. Se recogió el sobrenadante y se dispensó en una placa de 96 pocillos. Se usó reactivo de Ehrlich para la detección de quinurenina y se añadió en una proporción de 1:1.
Resultados
Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 10. La Figura 10 muestra que MRx0005 tiene la capacidad de producir quinurenina a una concentración de aproximadamente 70 pM.
Ejemplo 9 - Neuroprotección
Se trataron células SHSY-5Y diferenciadas con RA con MPP+, el metabolito activo de MPTP, una sustancia química ampliamente usada para imitar in vitro e in vivo algunas de las características de la patología de la EP. La viabilidad celular se midió como la tasa de respiración de las mitocondrias (Figura 11). Tanto MRx0005 como MRx0029 mostraron efectos significativos y promueven per se un aumento de la actividad metabólica de las mitocondrias en las células SHSY-5Y. La protección de MRx0005 fue de aproximadamente el 20% en comparación con la muestra tratada con YCFA-MPP+, aproximadamente la misma observada para el control positivo de quercetina (Fig. 11).
Ejemplo 10 - Producción de metabolitos - Metabolitos en el cerebro
Antecedentes
Los metabolitos presentes en los sobrenadantes de bacterias pueden influir directamente en la respuesta del huésped al estrés oxidativo, la comunicación de célula a célula y la neuroprotección. Los metabolitos que desempeñan un papel clave en los procesos neurológicos se midieron durante el cribado ex vivo en tejido cerebral de ratones alimentados con MRx0005 y MRx0029.
Métodos
Animales
Se alojaron en grupo ratones macho adultos BALBc (Envigo, Reino Unido) en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h; Se dispuso de comida y agua estándar para roedores a voluntad. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices europeas tras la aprobación por el Comité de Experimentación de Ética Animal del University College Cork. Los animales tenían 8 semanas al comienzo del experimento.
Diseño del estudio
Se permitió que los animales se habituaran a su sala de espera durante una semana después de su llegada a la unidad animal. Reciben alimentación por alimentación forzada oral (dosis de 200 pl) de bioterapéuticos vivos a una dosis de 1 x 109 CFU durante 6 días consecutivos entre las 15:00 y las 17:00. El día 7, los animales se decapitan y los tejidos se recogen para experimentación.
Recogida de tejidos
Los animales se sacrificaron de forma aleatoria con respecto al tratamiento y las condiciones de prueba; el muestreo se realizó entre las 9:00 am y la 1:00 pm Se recogió sangre del tronco en tubos con EDTA potásico (ácido etilendiaminotetraacético) y se centrifugó durante 15 min a 4000 g. El plasma se aisló y se almacenó a -80° C para su análisis posterior. El cerebro se extirpó rápidamente, se diseccionó y cada región del cerebro se congeló instantáneamente en hielo seco y se almacenó a -80° C para análisis adicionales. El bazo se extrajo y procesó inmediatamente después de los sacrificios para la estimulación inmune ex vivo. El tejido intestinal (se extirparon segmentos de 2 cm de íleon y colon más cercanos al ciego, y se usó el 1 cm más alejado de tejido del ciego) se montaron en las cámaras de Ussing para el ensayo de permeabilidad intestinal. Se extrajo el ciego, se pesó y se almacenó a -80° C para el análisis de SCFA.
Análisis de monoaminas
Se analizó la concentración de neurotransmisores mediante HPLC en muestras del tallo cerebral. Brevemente, el tejido del tallo cerebral se sonicó en 500 j l de fase móvil enfriada enriquecida con 4 ng/40 j l de N-Metil 5-HT (Sigma Chemical Co., Reino Unido) como estándar interno. La fase móvil contenía ácido cítrico 0,1 M, ácido octano-1-sulfónico (Sigma) 5,6 mM, dihidrogenofosfato de sodio 0,1 M, EDTA 0,01 mM (Alkem/Reagecon, Cork) y metanol al 9% (v/v) (Alkem/Reagecon) y se ajustó a pH 2,8 usando hidróxido de sodio 4 N (Alkem/Reagecon). Luego se centrifugaron los homogeneizados durante 15 min a 22.000 x g a 4° C y se inyectaron 40 j l del sobrenadante en el sistema de HPLC que consistía en un controlador del sistema SCL 10-Avp, un detector electroquímico LECD 6A (Shimadzu), una bomba LC-10AS, un horno CTO-10A, un autoinyector SIL-10A (con enfriador de muestras mantenido a 40 C) y un desgasificador Gastorr en línea (ISS, Reino Unido). En la separación se empleó una columna de fase inversa (Kinetex 2,6 u C18100 x 4,6 mm, Phenomenex) mantenida a 30° C (caudal 0,9 ml/min). El electrodo de trabajo de carbón vítreo combinado con un electrodo de referencia de Ag/AgCl (Shimdazu) operó a 0,8 V y los cromatogramas generados se analizaron usando el software Class-VP 5 (Shimadzu). Los neurotransmisores se identificaron por sus tiempos de retención característicos, determinados por inyecciones estándar, que se ejecutan a intervalos regulares durante el análisis de la muestra. Se midieron las proporciones de alturas máximas de analito frente al estándar interno y se compararon con la inyección estándar. Los resultados se expresaron como ng de neurotransmisor por g de peso fresco de tejido.
Análisis de metabolitos
Para el análisis de metabolitos por GC, se derivatizaron muestras de sobrenadantes bacterianos con cloroformiato de metilo usando una versión ligeramente modificada del protocolo descrito por Smart et al. (DOI: 10.1038/nprot.2010.108). Todas las muestras se analizaron en orden aleatorio. El análisis se realizó usando GC (7890B, Agilent) acoplado con un detector de cuadropolo (59977B, Agilent). El sistema fue controlado mediante ChemStation (Agilent). Los datos brutos se convirtieron al formato netCDF usando Chemstation (Agilent), antes de que los datos fueran importados y procesados en Matlab R2014b (Mathworks, Inc.) usando el software PARADISe descrito por Johnsen et. al (DOI: 10.1016/j.chroma.2017.04.052).
Para el análisis de ácidos grasos, las muestras se acidificaron usando ácido clorhídrico y se añadieron estándares internos marcados con deuterio. Todas las muestras se analizaron en orden aleatorio. El análisis se realizó usando una columna de alta polaridad (Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. Columna de 30 m x 0,25 mm x 0,25 jm ) instalada en un GC (7890B, Agilent) acoplada con un detector de cuadropolo (59977B, Agilent). El sistema se controló mediante ChemStation (Agilent). Los datos brutos se convirtieron al formato netCDF usando Chemstation (Agilent), antes de que los datos fueran importados y procesados en Matlab R2014b (Mathworks, Inc.) usando el software PARADISe descrito por Johnsen et al (DOI: 10.1016/j.chroma.2017.04.052).
Resultados - producción de neurotransmisores
Los resultados se muestran en la Figura 12, lo que demuestra que en cerebros de ratones alimentados con MRx0029, se aumentan los niveles de noradrenalina (p=0,0507), acompañados de un ligero aumento de serotonina y 5-HIAA. Estos datos respaldan el análisis de metabolitos que se expone a continuación, sugiriendo que MRx00029 es un importante productor de ácido 4-hidroxifenilacético, un antioxidante conocido (Weon et al, 2016). Más importante aún, el ácido 4-hidroxifenilacético es un producto intermedio sintético de dopamina y norepinefrina y una molécula bioactiva importante (Huot et al, Parkinson's Disease 2015). De hecho, en la EP, los cambios degenerativos se extienden más allá del sistema dopaminérgico, afectando igualmente a los sistemas serotoninérgico y noradrenérgico, lo que a su vez lleva a niveles reducidos de serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) y noradrenalina (norepinefrina) tanto en las estructuras estriatales como en las extra-estriatales (Scatton B, Javoy-Agid F, Rouquier L, Dubois B, Agid Y Brain Res. 26 de septiembre de 1983; 275(2):321-8). La L-DOPA se dirige principalmente a las características de la EP relacionadas con la dopamina, sin embargo, no aborda las disminuciones tanto de 5-HT como de noradrenalina. A esto se suma que cuanto mayor es la duración del tratamiento con L-DOPA, más visibles son una serie de complicaciones motoras y no motoras (por ejemplo, discinesia, síntomas psiquiátricos) (Helv MA, Morris JG, Reid WG, Trafficante R, Mov Disord. febrero de 2005; 20(2): 190-9). Por lo tanto, estos datos demuestran que las bacterias que producen ácidos orgánicos, como el ácido 4-hidroxifenilacético o el ácido succínico, pueden ser útiles en terapia, en particular en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
Resultados - producción de metabolitos
Los metabolitos presentes en los sobrenadantes de las bacterias pueden influir directamente en la respuesta del huésped al estrés oxidativo, la comunicación de célula a célula y la neuroprotección en específico. Se analizaron los metabolitos en el sobrenadante de cultivos de MRX0029 y MRX0005 y los resultados se muestran en la Figura 13.
Unos pocos metabolitos mostraron una notable diferencia entre las dos cepas analizadas. La concentración de ácido succínico fue particularmente elevada en MRx0005. Curiosamente, la relación muestra/medio para el ácido 4-hidroxifenilacético fue significativamente mayor en MRx0029 (Fig. 13).
El análisis de ácidos grasos en los sobrenadantes reveló una interesante dicotomía en las dos cepas: MRx0005 produjo principalmente ácido acético y propanoico, mientras que MRx0029 produjo ácido butanoico, pentanoico y hexanoico, tanto en forma lineal como ramificada (Fig. 14B). Las dos cepas parecían muy diferentes y, en particular, la producción de ácido succínico y ácido 4-hidroxifenilacético por MRx0005 y MRx0029 respectivamente fue notable (Figura 14A). Además, MRx0005 parece producir más ácidos grasos de cadena corta C2 y C3, mientras que MRx00029 produjo más C4 (butirato) y ácidos grasos de cadena media tanto lineales como ramificados, incluyendo ácido hexanoico.
El ácido succínico es un metabolito del ciclo de Krebs involucrado en la fosforilación oxidativa. El complejo de fosforilación oxidativa es un paso clave para el tráfico sináptico de proteínas y vesículas a las regiones proximales y distales (Budd SL y Nichols, 1998). Se ha informado de su disfunción en trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la ataxia espinocerebelosa tipo 1 (Manczak M et al.
2004; Ebadi et al, 2001). Estos descubrimientos son particularmente interesantes ya que el ácido succínico puede aumentar la actividad mitocondrial y apoyar a las neuronas vulnerables en enfermedades neurodegenerativas relacionadas con proteínas mal plegadas, incluyendo la EP (Ferro et. Al., Plos one, 2017). El BDNF y el ácido succínico tienen ambos una actividad protectora similar no solo en la neurodegeneración sino también en trastornos mentales como la depresión y la ansiedad, que son bastante comunes entre pacientes diagnosticados con EP o EA.
La Figura 14B también demuestra que MRX0029 es un productor de butirato (ácido butanoico). Esto puede ser significativo ya que el butirato tiene un papel conocido en la reducción de la impermeabilidad de la barrera hematoencefálica, que tiene un efecto neuroprotector [59]. Esta propiedad de MRx0029 (y otras bacterias neuroprotectoras) puede contribuir a su eficacia.
Ejemplo 11 - Modulación de la expresión de ARNm de proteínas de unión estrecha
Como la evidencia reciente sugiere que la disfunción e inflamación intestinal es un síntoma no motor asociado con la EP, se investigó la capacidad de las cepas bacterianas de la invención para provocar cualquier disfunción de la barrera intestinal. Se usaron monocapas de células productoras de mucina, epiteliales HT29-mtx (Gagnon et al, J Microbiological Methods, 2013) como modelo in vitro para evaluar la alteración de la barrera intestinal y la estimulación inmune después del tratamiento con MRx0005 y MRx0029. Las células HT29-mtx diferenciadas expuestas a 12-miristato-13-acetato de forbol (PMA) secretaron una cantidad significativa de IL-8; por el contrario, el tratamiento durante 24 h con sobrenadantes bacterianos de MRx005 y MRx0029, indujo una secreción aún menor de IL-8 en comparación con las células tratadas con YCFA y sin tratar (Fig. 14A).
Luego, se investigó la capacidad de MRx0005 y MRx0029 para regular la permeabilidad epitelial modificando la transducción de señales intracelulares implicadas en la expresión y localización de proteínas implicadas en la formación de la barrera intestinal.
Se aisló ARN y se realizó un análisis de RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) para caracterizar los cambios en la expresión génica de las proteínas de unión estrecha durante la incubación con MRx0005 y MRx0029. La administración de MRx0029 mejoró la expresión de ARNm de Ocludina, Vlillina, Proteína de Unión Estrecha 1 y 2 (respectivamente TJP1 y TJP2) después de 2 h de incubación (Fig. 14B). Por el contrario, la exposición a MRx0005 no alteró la expresión génica de las proteínas de unión estrecha, lo que indica que las dos cepas actúan diferencialmente sobre la barrera intestinal.
Los resultados in vitro se compararon con los datos del análisis paralelo ex vivo en el intestino de ratones alimentados con MRx0005 y MRx0029. Se cuantificó la expresión génica de TJP2 y ocludina en el colon y el íleon. Los datos ex vivo reflejan perfectamente los datos in vitro ya que MRx0029 fue capaz de regular por incremento significativamente TJP1 y Ocludina (p=0,073) en la región del colon del intestino murino (Fig. 14C+14D). MRx0029 también fue capaz de disminuir la función de permeabilidad en el colon de los mismos ratones (Fig. 14E+14F). Materiales y métodos - Extracción de ARN y análisis de qPCR
El ARN total se extrajo usando el mini kit RNeasy (Qiagen, Manchester, JUK) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y la concentración de ARN se determinó mediante absorbancia a 260/280 nm usando un espectrofotómetro (nano-Drop ND-1000; Thermo Scientific, Wilmington, DE). Para el análisis de la expresión de ARNm, se preparó ADNc a partir de 2000 ng de ARN total usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Thermo Fisher, Loughborough) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de transcripción inversa se realizaron en un termociclador (Biometra, Alemania) a 25° C durante 10 min, 37° C durante 120 min y 85° C durante 5 min. El ADNc resultante se amplificó por duplicado mediante el ensayo de PCR SYBR-Green y los productos se detectaron en la máquina de PCR en tiempo real QuantStudio 7 (Applied Biosystems, Reino Unido) usando un perfil estandarizado (desnaturalización inicial de 95° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 10 segundos de desnaturalización a 95° C y 30 segundos de apareamiento/extensión a 60°C). Se añadió una etapa de disociación después de los 40 ciclos para generar una curva de fusión. El análisis se realizó usando el software de PCR en tiempo real QuantStudio de Applied Biosystems v1.2. Las secuencias de cebadores para Actina, Villina, Ocludina TJP1 y TJP2 se proporcionan en el listado de secuencias.
Ejemplo 12 - Nivel de secreción de BDNF en células SHSY-5Y
Antecedentes
El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) es una molécula ubicua en el cerebro asociada con el desarrollo neuronal, la neuroprotección y la neuroregeneración. El BDNF no solo protege contra la neurodegeneración, sino también contra los trastornos mentales como la depresión y la ansiedad, que son bastante comunes entre los pacientes diagnosticados con EP o EA.
Métodos
Se colocaron en placas SH-SY5-SY en placas de 24 pocillos a una densidad de 60.000 células/pocillo y se colocaron en la incubadora. Después de 24 h, los medios se reemplazaron con medio de diferenciación (medio de crecimiento que contenía FBS al 1%) y ácido retinoico 10 pM. El medio de diferenciación se reemplazó cada dos días y las células se usaron el día 10 de diferenciación. Para el tratamiento, se retiró el medio de diferenciación y se reemplazó con 450 pl de medio de crecimiento completo y se añadieron 50 pl de bacterias SN a los pocillos tratados o se añadió YCFA+ como control negativo.
Resultados
Los resultados se muestran en la Figura 15, que muestra que la administración de MRX0005 en combinación con ácido retinoico aumenta la secreción de BDNF de células de neuroblastoma diferenciadas.
Ejemplo 13 - Eficacia de los inóculos bacterianos para reducir los niveles oxidativos en las células Antecedentes
La generación de especies reactivas de oxígeno contribuye a la patología de las enfermedades neurodegenerativas. Se investigó la capacidad de las cepas bacterianas para proteger las células SHSY-5Y y U373 diferenciadas de las especies reactivas de oxígeno (ROS) generadas por el tratamiento con peróxido de hidrógeno de terc-butilo (TBHP).
Material y métodos
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRX0029
Método
Se colocaron en placas células SHSY-5Y en placas de 96 pocillos de fondo plano negro a una densidad de 5000 células/pocillo y se colocaron en la incubadora de CO2. Después de 24 h, los medios se reemplazaron con medio de diferenciación (medio de crecimiento que contenía FBS al 1%) y ácido retinoico 10 pM. El medio de diferenciación se reemplazó cada dos días. El día 10 se retiró el medio de diferenciación y las células se lavaron con PBS precalentado y se tiñeron con sonda molecular de DCFDA 10 uM durante 20 minutos en medio de crecimiento que contenía FBS al 1%. Luego, las células se lavaron de nuevo con PBS precalentado y se trataron con TBHP 100 uM en presencia o ausencia de sobrenadante de bacterias al 10% durante 2 h. La intensidad de la fluorescencia se midió usando un lector de placas TECAN a Ex/Em 485/530 nm.
Resultados
Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 16. La Figura 16b muestra que MRX0005 es capaz de inhibir la producción de ROS en células de neuroblastoma SHSY-5Y diferenciadas. MRX0005 también reduce la generación de ROS en células de astroglioblastoma (Figura 16a). Esto muestra que MRX0005 tiene actividad antioxidante general.
Ejemplo 14 - Prueba de estabilidad
Una composición descrita en la presente que contiene por lo menos una cepa bacteriana descrita en la presente se almacena en un recipiente sellado a 25° C o 4° C y el recipiente se coloca en una atmósfera que tenga un 30%, 40%, 50%, 60%, 70 %, 75%, 80%, 90% o 95% de humedad relativa. Después de 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 año, 1,5 años, 2 años, 2,5 años o 3 años, quedará por lo menos un 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de la cepa bacteriana medido en unidades formadoras de colonias determinado por protocolos estándar.
Ejemplo 15
Métodos
Animales
Los animales y el diseño de estudio utilizados fueron los mismos que en el Ejemplo 10.
Cepas bacterianas
• 755: Parabacteroides distasonis (MRX005)
• Megasphaera massiliensis (MRX0029)
Recogida de tejidos
Los animales se sacrificaron de manera aleatoria con respecto al tratamiento y las condiciones de prueba; el muestreo se realizó entre las 9:00 am y las 2:30 pm Se recogió sangre del tronco en tubos con EDTA de potasio (ácido etilendiaminotetraacético) y se centrifugó durante 15 min a 4000 g. El plasma se aisló y se almacenó a -80° C para su análisis posterior. El cerebro se extirpó rápidamente, se diseccionó y cada región del cerebro se congeló instantáneamente en hielo seco y se almacenó a -80° C para análisis posterior. Se extrajo el bazo, se recogió en 5 ml de medio RPMI (con L-glutamina y bicarbonato de sodio, R8758 Sigma FBS al 10% (F7524, Sigma) Pen/Strep al 1% (P4333, Sigma)) y se procesó inmediatamente después de la eliminación para estimulación inmune ex-vivo. Se montó tejido intestinal (se extirparon 2 segmentos de 3 cm de íleon y colon más cercanos al ciego, y se usaron 2 cm de tejido más alejados de 1 cm del ciego) se montaron en las cámaras de Ussing para el ensayo de permeabilidad intestinal. Se extrajo el ciego, se pesó y se almacenó a -80° C para el análisis de los SCFA.
Análisis de monoaminas
La concentración de neurotransmisores se analizó como se describe en el Ejemplo 10.
Ensayo de citoquinas del bazo
Los bazos se recogieron inmediatamente en 5 ml de medio RPMI después del sacrificio y se cultivaron inmediatamente. Las células del bazo se homogeneizaron primero en este medio RPMI, seguido de 5 minutos de incubación con 1 ml de tampón de lisis de RBC (11814389001 ROCHE, Sigma). Se añadieron 10 ml adicionales de medio RPMI, seguido de centrifugación a 200 G durante 5 minutos. Luego, se filtró el sobrenadante a través de un colador de 40 pm. Las células se contaron y se sembraron (medio de 4.000.000/ml). Después de 2,5 h de adaptación, las células se estimularon con lipopolisacárido (LPS-2 pg/ml) o concanavalina A (ConA-2,5 pg/ml) durante 24 h. Después de la estimulación, se recogieron los sobrenadantes para evaluar la liberación de citoquinas usando el kit V-PLEX Proinflammination Panel 1 (ratón) (Meso Scale Discovery, Maryland, USA) Para TNFa, IL-10, IL-1p, interferón y, CXCL2 e IL6. Los análisis se realizaron usando MESO QuickPlex SQ 120, SECTOR Imager 2400, SECTOR Imager 6000, SECTOR S 600.
Análisis de expresión génica
Se extrajo ARN total con el kit de aislamiento de ARNmi mirVana™ (Ambion/Llife technologies, Paisley, Reino Unido) y se trató con DNasa (Turbo DNA-free, Ambion/life technologies) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes. El ARN se cuantificó usando un espectrofotómetro NanoDrop™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, Delaware, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad del ARN se evaluó usando el bioanalizador Agilent (Agilent, Stockport, Reino Unido) de acuerdo con el procedimiento del fabricante y se calculó un número de integridad del ARN (RIN). Se usó ARN con un valor de RIN >7 para experimentos posteriores. El ARN se transcribió de manera inversa a ADNc usando el kit de ADNc de alta capacidad de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadió transcriptasa inversa Multiscribe (50 U/pl) (1)(2)(1)(10) como parte de una mezcla maestra RT, se incubó a 25° C durante 10 minutos, 37° C durante 2 h, 85° C durante 5 minutos y se almacenó a 4° C. La PCR cuantitativa se llevó a cabo usando sondas (6 carboxi fluoresceína - FAM) diseñadas por Applied Biosystems para genes objetivo específicos de ratón, mientras se usaba p-actina como un control endógeno. Las reacciones de amplificación contenían ADNC 1 pl, 5 pl de la mezcla maestra de PCR 2X (Roche), 900 nM de cada cebador y se llevaron a un total de 10 pl mediante la adición de agua libre de RNasa. Todas las reacciones se realizaron por triplicado usando placas de 96 pocillos en el sistema LightCycler®480. Las condiciones de ciclado térmico fueron las recomendadas por el fabricante (Roche) durante 55 ciclos. Para comprobar la contaminación de amplicones, cada ejecución no contenía controles de plantilla por triplicado para cada sonda usada. Se registraron los valores de umbral de ciclo (Ct). Los datos se normalizaron usando p-actina y se transformaron usando el método 2-AACT y se presentaron como veces de cambio frente al grupo de control.
Análisis de ácidos grasos de cadena corta en el contenido cecal
El contenido del ciego se mezcló y se agitó con vórtex con agua MilliQ y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min. Los sobrenadantes se obtuvieron por centrifugación (10000 g, 5 min, 4° C) para sedimentar bacterias y otros sólidos y filtrar por 0,2 pm. Se transfirió a un vial GC transparente y se usó ácido 2-etilbutírico (Sigma) como estándar interno. Se analizó la concentración de SCFA usando un sistema de ionización de llama Varian 3500 GC, equipado con una columna ZB-FFAP (30 m x 0,32 mm x 0,25 mm; Phenomenex). Se construyó una curva estándar con diferentes concentraciones de una mezcla estándar que contiene acetato, propionato, isobutirato, n-butirato, isovalerato y valerato (Sigma). Los picos se integraron usando el software Varian Star Chromatography Workstation versión 6.0. Todos los datos de SCFA se expresan como pmol/g.
Análisis estadístico
Los datos distribuidos normalmente se presentan como media ± SEM; Los conjuntos de datos no paramétricos se presentan como mediana con rango intercuartil. Se aplicó la prueba t de dos colas no apareada para analizar los datos paramétricos y se usó la prueba de Mann-Whitney para los no paramétricos. Se empleó el coeficiente de correlación de rango de Spearman para el análisis de correlación en los conjuntos de datos agrupados. Un valor de p <0,05 se consideró significativo en todos los casos.
Resultados - Producción de neurotransmisores
Los resultados en la Figura 17 muestran el efecto del tratamiento con MRx005 sobre la concentración de neurotransmisores en el cerebro de ratones. En particular, el tratamiento con MRx005 lleva a una disminución de la dopamina.
Resultados - Expresión génica
Se analizaron la expresión de genes para receptores de neurotransmisores [receptor de serotonina 1a(5-HTR1a), receptor de dopamina D1, subunidad B1 del receptor de GABA, receptor de Ga b Aa , receptor de NMDa 2a (Grin2A) y NMDA2B (Grin2b)], marcadores inflamatorios [IL-1p, IL6, CD11b, TNFa y TLR4], y marcadores endocrinos [factor de liberación de corticosterona (CRF), receptores 1 y 2 del factor de liberación de corticosterona (CRFR1, CRFR2), factor de neurotrofina derivado del cerebro (BDNF), receptor de vasopresina, receptor de oxitocina, receptor de glucocorticoides y receptor de mineralocorticoides] en tejido cerebral del hipocampo, la amígdala y la corteza prefrontal.
Las Figuras 18-32 muestran los cambios en la expresión génica después del tratamiento con MRX005 o MRX0029 en el hipocampo, la amígdala y la corteza prefrontal. El tratamiento con MRx0029 dio lugar a un aumento de la expresión del receptor de glucocorticoides en la amígdala (Figura 25C). La Figura 26A muestra que MRx005 aumentó significativamente la expresión de BDNF en la amígdala, mientras que el tratamiento con MRx0029 aumentó significativamente la expresión de TLR4 en la amígdala (Figura 26B).
Tanto MRx005 como MRx0029 pueden aumentar la expresión de CD11b en la amígdala (Figura 27A), mientras que la expresión de IL-6, Grin2a y Grin2b se reduce después del tratamiento con MRx005 (Figuras 27B-D). Además, MRx005 y MRx0029 aumentaron significativamente la expresión de GABRA2 y aumentaron la expresión de GABBR1 en la amígdala.
El tratamiento con MRx005 llevó a un aumento significativo en la expresión de BDNF en la corteza prefrontal (Figura 29B).
Análisis
La administración de MRx005 y MRx0029 provocó cambios en la expresión génica, especialmente en la amígdala.
Resultados - Efecto sobre la expresión de Tph1 e IDO-1
La Figura 33 muestra que MRx0029 puede aumentar significativamente la expresión de triptófano hidroxilasa-1 (Tph1) en el colon y que el tratamiento con MRX005 puede aumentar la expresión de IDO-1 en el colon. El tratamiento con MRX005 aumentó la expresión de Tph1 e IDO1 en el íleon, mientras que MRX029 no tuvo ningún efecto sobre la expresión de estos genes en el íleon (Figura 34).
Indolamina-pirrol 2,3-dioxigenasa-1 (IDO-1), la primera enzima que limita la velocidad en la vía triptófano/quinurenina, mientras que la triptófano hidroxilasa 1 (Tph1), una isoterma de la enzima triptófano hidroxilasa, responsable de la síntesis de serotonina. Estos datos sugieren que MRx0029 y MRx005 pueden afectar a los niveles de serotonina y la vía triptófano/quinurenina.
Resultados - Efecto sobre los niveles de metabolito del triptófano
La Figura 35 muestra el efecto del tratamiento con MRx005 sobre los niveles de quinurenina y triptófano circulantes.
Resultados - Efecto sobre la expresión de citoquinas de los esplenocitos
El ensayo de esplenocitos ex vivo implica desafiar los esplenocitos (células aisladas del bazo, un órgano principal involucrado en la defensa inmunológica), con un desafío bacterio- o viral-mimético.
MRX005 redujo significativamente los niveles de interferón-Y en esplenocitos después de un desafío con LPS (Figura 36). Además, MRX005 redujo los niveles de interleucina-6 y factor de necrosis tumoral después de un desafío con LPS (Figuras 38 y 39, respectivamente). El tratamiento con MRx0029 llevó a una reducción de interferón-Y, interleucina-1p e interleucina-6 después de un desafío con LPS (Figuras 36, 37 y 38, respectivamente).
El tratamiento con MRx005 y MRx0029 llevó a un aumento en los niveles de CXCL1 quimioatrayente (Figura 41).
Resultados - Efecto sobre los niveles de ácidos grasos de cadena corta cecales
Los ácidos grasos de cadena corta (SCFA) se producen cuando las fibras no digeribles de la dieta son fermentadas por bacterias en el intestino. Los efectos de la administración de MRX005 se muestran en la Figura 42. Ejemplo 16- Análisis adicional de los cambios de MRX029 y MRX005 en los niveles de expresión genética Métodos
Línea celular
Células SH-SY5Y
Cepas bacterianas
• 755: Parabacteroides distasonis (MRX005)
• Megasphaera massiliensis (MRX0029)
qPCR
Se colocaron en placas SH-SY5Y en placas de Petri de 10 cm con una densidad de 2x106 células. Después de 24 h, las células se trataron en medio de diferenciación (medio de crecimiento que contenía FBS al 1% sin RA) con sobrenadantes de bacterias al 10% o YCFA+, RA 10 uM, ácido hexanoico 200 uM o ácido valproico 200 uM, durante 17 h. Posteriormente, se tomaron imágenes representativas usando un microscopio central EVOS XL de contraste de fase con un aumento de 40X/0,65. Se recogieron las células y se aisló el ARN total de acuerdo con el protocolo del RNeasy mini kit (Qiagen). Los ADNc se elaboraron usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). La expresión génica se midió usando qPCR. Se usó GAPDH como control interno. Las veces de cambio se calcularon de acuerdo con el método 2(-ññct). Las secuencias de cebadores para MAP2, DRD2, GABRB3, SYP, PINK1, PARK7 y NSE se proporcionan en el listado de secuencias.
Inmunomarcado e imagenología celular
Las células se sembraron en portaobjetos de cámara de 8 pocillos (Marienfeld Laboratory Glassware) a 5x104 células/pocillo durante la noche y se trataron con sobrenadante bacteriano al 10% durante 24 h. Para la diferenciación, las células se trataron con AR 10 nM durante 5 días antes de tratar con sobrenadante bacteriano libre de células durante 24 h. Posteriormente, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT). Las células fijadas se lavaron con PBS y se permeabilizaron con Triton X-100 al 1% en PBS durante 10 minutos. Después del lavado con PBS, los portaobjetos se incubaron con tampón de bloqueo (BSA/PBS al 4%) durante 1 h a RT antes de añadir anticuerpo anti-MAP2 o p3-tubulina (sc-74421 y sc-80005 respectivamente, Santa Cruz Biotechnology Inc) diluido en BSA/PBS al 1% durante 12 h a 4° C. Luego, se lavaron dos veces con PBS, seguido de incubación con anti-ratón conjugado Alexa Flour 488 (Molecular Probes Inc) y faloidina conjugada Alexa Flour 594 (ab176757, Abcam) durante 1 h a RT. Después de lavar 3 veces con PBS, los portaobjetos se tiñeron con DAPI y se montaron con Vectashield® (Vector Laboratories). Los portaobjetos se observaron usando un microscopio Axioskop 50 (Zeiss) equipado con un objetivo Korr de 63x/1,2 W y se usaron conjuntos de filtros adecuados para la detección de los fluorocromos. Los tiempos de exposición manual para la adquisición digital de imágenes inmunomarcadas con MAP-2 se mantuvieron constantes permitiendo la comparación entre diferentes pocillos y tratamientos. Los tiempos de exposición a faloidina (F-actina) y DAPI variaron para adaptarse al campo de visión. Los campos de visión aleatorizados se adquirieron usando una cámara QImaging controlada por el software Image Pro Plus. Las imágenes se guardaron como archivos TIFF y se abrieron en Adobe Photoshop CC 2015.1.2. Las imágenes de MAP-2, DAPI y Phalloidin se superpusieron y fusionaron. Se seleccionaron imágenes representativas para ilustrar las diferencias en la abundancia y localización de las proteínas examinadas.
Inmunotransferencia
Se cultivaron células SH-SY5Y en las condiciones indicadas descritas anteriormente, se trataron con MRx0005 y MRx0029 durante 24 horas y luego se lisaron en tampón RIPA que contiene un cóctel de inhibidores de proteasas (Roche Diagnostics, Reino Unido). La concentración de proteína se estimó usando el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), se separó por SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de PVDF. Luego se bloquearon las membranas con leche en polvo desnatada al 5% o BSA al 5% y se incubaron durante la noche a 4° C con los anticuerpos primarios (respectivamente MAP2 y p3-tubulina). Luego se incubaron las transferencias con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) apropiado, y las proteínas se detectaron mediante un kit de detección de quimioluminiscencia (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Tanto para MAP2 como para p3-tubulina, la p-actina sirvió como un control para monitorizar la variabilidad de carga de proteína entre muestras.
Resultados y análisis
Expresión génica
La Figura 43 muestra los cambios inducidos por MRx0029 y MRX005 en los niveles de expresión de actina, villina, ocludina TJP1, TJP2, MAP2, DRD2, GABRB3, SYP, PINK1, PARK7 y NSE.
Resultados - Microscopía e inmunotransferencia
La Figura 44 muestra el cambio en el nivel de expresión de MAP2 en células SHSYSY según lo determinado por microscopía confocal. Los niveles de expresión de MAP2 y B3-tubulina también se cuantificaron mediante análisis de inmunotransferencia. Los resultados mostrados en la Figura 44M y N indican que MRX029 induce un aumento en el nivel de expresión de MAP2.
Secuencias
Cebadores adicionales usados en qPCR (con la SEQ ID NO entre paréntesis)
ID del gen Secuencia directa Secuencia inversa
NSE CCCTGTATCGTAAGAACGGT (30) GCCACCATTGATCACGTTGA(31)
PINK1 CCCAAGCAACTAGCCCCTC (32) GGCAGCACATCAGGGTAGTC (33)
PARK7 GTAGCCGTGATGTGGTCATTT (34) CTGTGCGCCCAGATTACCT (35)
SYP CTCGGCTTTGTGAAGGTGCT (36) GGCTTCATGGCATCAACTTCA(37) Secuencias
SEQ IS NO: 1 (Gen de Parabacteroides distanosis para ARN ribosómico 16S, secuencia parcial, cepa: JCM 5825- AB238922)
1 agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcgacaggc ttaacacatg caagtcgagg 61 ggcagcgggg tgtagcaata caccgccggc gaccggcgca cgggtgagta acgcgtatgc 121 aacttgccta tcagaggggg ataacccggc gaaagtcgga ctaataccgc atgaagcagg 181 gatcccgcat gggaatattt gctaaagatt catcgctgat agataggcat gcgttccatt 241 aggcagttgg cggggtaacg gcccaccaaa ccgacgatgg ataggggttc tgagaggaag 301 gtcccccaca ttggtactga gacacggacc aaactcctac gggaggcagc agtgaggaat 361 attggtcaat gggcgtaagc ctgaaccagc caagtcgcgt gagggatgaa ggttctatgg 421 atcgtaaacc tcttttataa gggaataaag tgcgggacgt gtcccgtttt gtatgtacct 481 tatgaataag gatcggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taatacggag gatccgagcg 541 ttatccggat ttattgggtt taaagggtgc gtaggcggcc ttttaagtca gcggtgaaag 601 tctgtggctc aaccatagaa ttgccgttga aactgggggg cttgagtatg tttgaggcag 661 gcggaatgcg tggtgtagcg gtgaaatgca tagatatcac gcagaacccc gattgcgaag 721 gcagcctgcc aagccattac tgacgctgat gcacgaaagc gtggggatca aacaggatta 781 gataccctgg tagtccacgc agtaaacgat gatcactagc tgtttgcgat acactgtaag 841 cggcacagcg aaagcgttaa gtgatccacc tggggagtac gccggcaacg gtgaaactca 901 aaggaattga cgggggcccg cacaagcgga ggaacatgtg gtttaattcg atgatacgcg
961 aggaacctta cccgggtttg aacgcattcg gaccgaggtg gaaacacctt ttctagcaat 1021 agccgtttgc gaggtgctgc atggttgtcg tcagctcgtg ccgtgaggtg tcggcttaag 1081 tgccataacg agcgcaaccc ttgccactag ttactaacag gttaggctga ggactctggt 1141 gggactgcca gcgtaagctg cgaggaaggc ggggatgacg tcaaatcagc acggccctta 1201 catccggggc gacacacgtg ttacaatggc gtggacaaag ggaggccacc tggcgacagg 1261 gagcgaatcc ccaaaccacg tctcagttcg gatcggagtc tgcaacccga ctccgtgaag 1321 ctggattcgc tagtaatcgc gcatcagcca tggcgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1381 acacaccgcc cgtcaagcca tgggagccgg gggtacctga agtccgtaac cgaaaggatc 1441 ggcctagggt aaaactggtg actggggcta agtcgtaaca aggtaacc
SEQ ID NO: 2 (Gen de Parabacteroides distasonis para ARN ribosómico 16S, secuencia parcial, cepa: JCM 13400-AB238923)
1 agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcgacaggc ttaacacatg caagtcgagg 61 ggcagcacag gtagcaatac cgggtggcga ccggcgcacg ggtgagtaac gcgtatgcaa 121 cttacctatc agagggggat aacccggcga aagtcggact aataccgcat gaagcagggg 181 ccccgcatgg ggatatttgc taaagattca tcgctgatag ataggcatgc gttccattag 241 gcagttggcg gggtaacggc ccaccaaacc gacgatggat aggggttctg agaggaaggt 301 cccccacatt ggtactgaga cacggaccaa actcctacgg gaggcagcag tgaggaatat 361 tggtcaatgg gcgtaagcct gaaccagcca agtcgcgtga gggatgaagg ttctatggat 421 cgtaaacctc ttttataagg gaataaagtg cgggacgtgt cctgttttgt atgtacctta 481 tgaataagga tcggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggagga tccgagcgtt 541 atccggattt attgggttta aagggtgcgt aggcggcctt ttaagtcagc ggtgaaagtc 601 tgtggctcaa ccatagaatt gccgttgaaa ctggggggct tgagtatgtt tgaggcaggc 661 ggaatgcgtg gtgtagcggt gaaatgctta gatatcacgc agaaccccga ttgcgaaggc 721 agcctgccaa gccatgactg acgctgatgc acgaaagcgt ggggatcaaa caggattaga 781 taccctggta gtccacgcag taaacgatga tcactagctg tttgcgatac agtgtaagcg 841 gcacagcgaa agcgttaagt gatccacctg gggagtacgc cggcaacggt gaaactcaaa 901 ggaattgacg ggggcccgca caagcggagg aacatgtggt ttaattcgat gatacgcgag 961 gaaccttacc cgggtttgaa cgcattcgga ccgaggtgga aacacctttt ctagcaatag 1021 ccgtttgcga ggtgctgcat ggttgtcgtc agctcgtgcc gtgaggtgtc ggcttaagtg 1081 ccataacgag cgcaaccctt gccactagtt actaacaggt aaagctgagg actctggtgg 1141 gactgccagc gtaagctgcg aggaaggcgg ggatgacgtc aaatcagcac ggcccttaca 1201 tccggggcga cacacgtgtt acaatggcgt ggacaaaggg aagccacctg gcgacaggga 1261 gcgaatcccc aaaccacgtc tcagttcgga tcggagtctg caacccgact ccgtgaagct 1321 ggattcgcta gtaatcgcgc atcagccatg gcgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1381 acaccgcccg tcaagccatg ggagcegggg gtacctgaag tccgtaaccg aaaggatcgg 1441 cctagggtaa aactggtgac tggggctaag tcgtaacaag gtaacc
SEQ ID NO:3 (Gen de Parabacteroides distasonis para ARN ribosómico 16S, secuencia parcial, cepa: 13401 - AB238924)
1 agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcgacaggc ttaacacatg caagtcgagg 61 ggcagcacag gtagcaatac ccgccggcga ccggcgcacg ggtgagtaac gcgtatgcaa 121 cttgcctatc agagggggat aacccggcga aagtcggact aataccgcat gaagcagggg 181 ccccgcatgg ggatatttgc taaagattca tcgctgatag ataggcatgc gttccattag 241 gcagttggcg gggtaacggc ccaccaaacc gacgatggat aggggttctg agaggaaggt 301 cccccacatt ggtactgaga cacggaccaa actcctacgg gaggcagcag tgaggaatat 361 tggtcaatgg gcgtaagcct gaaccagcca agtcgcgtga gggatgaagg ttctatggat 421 cgtaaacctc ttttataagg gaataaagtg tgggacgtgt cctgttttgt atgtacctta 481 tgaataagga tcggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggagga tccgagcgtt 541 atccggattt attgggttta aagggtgcgt aggcggcctt ttaagtcagc ggtgaaagtc 601 tgtggctcaa ccatagaatt gccgttgaaa ctgggaggct tgagtatgtt tgaggcaggc 661 ggaatgcgtg gtgtagcggt gaaatgctta gatatcacgc agaaccccga ttgcgaaggc 721 agcctgccaa gccatgactg acgctgatgc acgaaagcgt ggggatcaaa caggattaga 781 taccctggta gtccacgcag taaacgatga tcactagctg tttgcgatac actgtaagcg 841 gcacagcgaa agcgttaagt gatccacctg gggagtacgc cggcaacggt gaaactcaaa 901 ggaattgacg ggggcccgca caagcggagg aacatgtggt ttaattcgat gatacgcgag 961 gaaccttacc cgggtttgaa cgcattcgga ccgaggtgga aacacctttt ctagcaatag 1021 ccgtttgcga ggtgctgcat ggttgtcgtc agctcgtgcc gtgaggtgtc ggcttaagtg 1081 ccataacgag cgcaaccctt gccactagtt actaacaggt gatgctgagg actctggtgg 1141 gactgccagc gtaagctgcg aggaaggcgg ggatgacgtc aaatcagcac ggcccttaca 1201 tccggggcga cacacgtgtt acaatggcgt ggacaaaggg atgccacctg gcgacaggga 1261 gcgaatcccc aaaccacgtc tcagttcgga tcggagtctg caacccgact ccgtgaagct 1321 ggattcgcta gtaatcgcgc atcagccatg gcgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1381 acaccgcccg tcaagccatg ggagccgggg gtacctgaag tccgtaaccg aaaggatcgg 1441 cctagggtaa aactggtgac tggggctaag tcgtaacaag gtaacc
SEQ ID NO:4 (Gen de Parabacteroides distasonis para ARN ribosómico 16S, secuencia parcial, cepa: 13402-AB238925)
1 agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcgacaggc ttaacacatg caagtcgagg 61 ggcagcacag gtagcaatac cgggtggcga ccggcgcacg ggtgagtaac gcgtatgcaa 121 cttacctatc agagggggat aacccggcga aagtcggact aataccgcat gaagcagggg 181 ccccgcatgg ggatatttgc taaagattca tcgctgatag ataggcatgc gttccattag 241 gcagttggcg gggtaacggc ccaccaaacc gacgatggat aggggttctg agaggaaggt 301 cccccacatt ggtactgaga cacggaccaa actcctacgg gaggcagcag tgaggaatat 361 tggtcaatgg gcgtaagcct gaaccagcca agtcgcgtga gggatgaagg ttctatggat 421 cgtaaacctc ttttataagg gaataaagtg cgggacgtgt cccgttttgt atgtacctta 481 tgaataagga tcggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggagga tccgagcgtt 541 atccggattt attgggttta aagggtgcgt aggcggcctt ttaagtcagc ggtgaaagtc 601 tgtggctcaa ccatagaatt gccgttgaaa ctgggaggct tgagtatgtt tgaggcaggc 661 ggaatgcgtg gtgtagcggt gaaatgctta gatatcacgc agaaccccga ttgcgaaggc 721 agcctgccaa gccatgactg acgctgatgc acgaaagcgt ggggatcaaa caggattaga 781 taccctggta gtccacgcag taaacgatga tcactagctg tttgcgatac actgtaagcg 841 gcacagcgaa agcgttaagt gatccacctg gggagtacgc cggcaacggt gaaactcaaa 901 ggaattgacg ggggcccgca caagcggagg aacatgtggt ttaattcgat gatacgcgag 961 gaaccttacc cgggtttgaa cgcattcgga ccgaggtgga aacacctttt ctagcaatag 1021 ccgtttgcga ggtgctgcat ggttgtcgtc agctcgtgcc gtgaggtgtc ggcttaagtg 1081 ccataacgag cgcaaccctt gccactagtt actaacaggt aaagctgagg actctggtgg 1141 gactgccagc gtaagctgcg aggaaggcgg ggatgacgtc aaatcagcac ggcccttaca 1201 tccggggcga cacacgtgtt acaatggcgt ggacaaaggg aggccacctg gcgacaggga 1261 gcgaatcccc aaaccacgtc tcagttcgga tcggagtctg caacccgact ccgtgaagct 1321 ggattcgcta gtaatcgcgc atcagccatg gcgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1381 acaccgcccg tcaagccatg ggagccgggg gtacctgaag tccgtaaccg aaaggatcgg 1441 cctagggtaa aactggtgac tggggctaag tcgtaacaag gtaacc
SEQ IDNO:5 (Gen de Parabacteroides distasonis paraARN ribosómico 16S, secuencia parcial, cepa: 13403 -AB238926)
1 agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcgacaggc ttaacacatg caagtcgagg 61 ggcagcacag gtagcaatac cgggtggcga ccggcgcacg ggtgagtaac gcgtatgcaa 121 cttacctatc agagggggat aacccggcga aagtcggact aataccgcat gaagcagggg 181 ccccgcatgg ggatatttgc taaagattca tcgctgatag ataggcatgc gttccattag 241 gcagttggcg gggtaacggc ccaccaaacc gacgatggat aggggttctg agaggaaggt 301 cccccacatt ggtactgaga cacggaccaa actcctacgg gaggcagcag tgaggaatat 361 tggtcaatgg gcgtaagcct gaaccagcca agtcgcgtga gggatgaagg ttctatggat 421 cgtaaacctc ttttataagg gaataaagtg tgggacgtgt cccgttttgt atgtacctta 481 tgaataagga tcggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggagga tccgagcgtt 541 atccggattt attgggttta aagggtgcgt aggcggcctt ttaagtcagc ggtgaaagtc 601 tgtggctcaa ccatagaatt gccgttgaaa ctgggaggct tgagtatgtt tgaggcaggc 661 ggaatgcgtg gtgtagcggt gaaatgctta gatatcacgc agaaccccga ttgcgaaggc 721 agcctgccaa gccatgactg acgctgatgc acgaaagcgt ggggatcaaa caggattaga 781 taccctggta gtccacgcag taaacgatga tcactagctg tttgcgatac attgtaagcg 841 gcacagcgaa agcgttaagt gatccacctg gggagtacgc cggcaacggt gaaactcaaa 901 ggaattgacg ggggcccgca caagcggagg aacatgtggt ttaattcgat gatacgcgag 961 gaaccttacc cgggtttgaa cgcattcgga ccgaggtgga aacacctttt ctagcaatag 1021 ccgtttgcga ggtgctgcat ggttgtcgtc agctcgtgcc gtgaggtgtc ggcttaagtg 1081 ccataacgag cgcaaccctt gccactagtt actaacaggt aaagctgagg actctggtgg 1141 gactgccagc gtaagctgcg aggaaggcgg ggatgacgtc aaatcagcac ggcccttaca 1201 tccggggcga cacacgtgtt acaatggcgt ggacaaaggg aggccacctg gcgacaggga 1261 gcgaatcccc aaaccacgtc tcagttcgga tcggagtctg caacccgact ccgtgaagct 1321 ggattcgcta gtaatcgcgc atcagccatg gcgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1381 acaccgcccg tcaagccatg ggagccgggg gtacctgaag tccgtaaccg aaaggatcgg 1441 cctagggtaa aactggtgac tggggctaag tcgtaacaag gtaacc
SEQ ID NO:6 (Gen de Parabacteroides distasonis paraARN ribosómico 16S, secuencia parcial, cepa: 13404-AB238927)
1 agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcgacaggc ttaacacatg caagtcgagg 61 ggcagcacag gtagcaatac cgggtggcga ccggcgcacg ggtgagtaac gcgtatgcaa 121 cttacctatc agagggggat aacccggcga aagtcggact aataccgcat gaagcagggg 181 ccccgcatgg ggatatttgc taaagattca tcgctgatag ataggcatgc gttccattag 241 gcagttggcg gggtaacggc ccaccaaacc gacgatggat aggggttctg agaggaaggt 301 cccccacatt ggtactgaga cacggaccaa actcctacgg gaggcagcag tgaggaatat 361 tggtcaatgg gcgtaagcct gaaccagcca agtcgcgtga gggatgaagg ttctatggat 421 cgtaaacctc ttttataagg gaataaagtg tgggacgtgt cccgttttgt atgtacctta 481 tgaataagga tcggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggagga tccgagcgtt 541 atccggattt attgggttta aagggtgcgt aggcggcctt ttaagtcagc ggtgaaagtc 601 tgtggctcaa ccatagaatt gccgttgaaa ctgggaggct tgagtatgtt tgaggcaggc 661 ggaatgcgtg gtgtagcggt gaaatgctta gatatcacgc agaaccccga ttgcgaaggc 721 agcctgccaa gccatgactg acgctgatgc acgaaagcgt ggggatcaaa caggattaga 781 taccctggta gtccacgcag taaacgatga tcactagctg tttgcgatac attgtaagcg 841 gcacagcgaa agcgttaagt gatccacctg gggagtacgc cggcaacggt gaaactcaaa 901 ggaattgacg ggggcccgca caagcggagg aacatgtggt ttaattcgat gatacgcgag 961 gaaccttacc cgggtttgaa cgcattcgga ccgaggtgga aacacctttt ctagcaatag 1021 ccgtttgcga ggtgctgcat ggttgtcgtc agctcgtgcc gtgaggtgtc ggcttaagtg 1081 ccataacgag cgcaaccctt gccactagtt actaacaggt aaagctgagg actctggtgg 1141 gactgccagc gtaagctgcg aggaaggcgg ggatgacgtc aaatcagcac ggcccttaca 1201 tccggggcga cacacgtgtt acaatggcgt ggacaaaggg aggccacctg gcgacaggga 1261 gcgaatcccc aaaccacgtc tcagttcgga tcggagtctg caacccgact ccgtgaagct 1321 ggattcgcta gtaatcgcgc atcagccatg gcgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1381 acaccgcccg tcaagccatg ggagccgggg gtacctgaag tccgtaaccg aaaggatcgg 1441 cctagggtaa aactggtgac tggggctaag tcgtaacaag gtaacc
SEQ ID NO:7 (Gen de Parabacteroides distasonis para ARN ribosómico 16S, secuencia parcial, cepa: 9497 - AB238928)
1 agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcgacaggc ttaacacatg caagtcgagg 61 ggcagcatga tttgtagcaa tacagattga tggcgaccgg cgcacgggtg agtaacgcgt 121 atgcaactta cctatcagag ggggatagcc cggcgaaagt cggattaata ccccataaaa 181 caggggtccc gcatgggaat atttgttaaa gattcatcgc tgatagatag gcatgcgttc 241 cattaggcag ttggcggggt aacggeccac caaaccgacg atggataggg gttctgagag 301 gaaggtcccc cacattggta ctgagacacg gaccaaactc ctacgggagg cagcagtgag 361 gaatattggt caatggccga gaggctgaac cagccaagtc gcgtgaagga agaaggatct 421 atggtttgta aacttctttt ataggggaat aaagtggagg acgtgtcctt ttttgtatgt 481 accctatgaa taagcatcgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggaggatgcg 541 agcgttatcc ggatttattg ggtttaaagg gtgcgtaggt ggtgatttaa gtcagcggtg 601 aaagtttgtg gctcaaccat aaaattgccg ttgaaactgg gttacttgag tgtgtttgag 661 gtaggcggaa tgcgtggtgt agcggtgaaa tgcatagata tcacgcagaa ctccgattgc 721 gaaggcagct tactaaacca taactgacac tgaagcacga aagcgtgggg atcaaacagg 781 attagatacc ctggtagtcc acgcagtaaa cgatgattac taggagtttg cgatacaatg 841 taagctctac agcgaaagcg ttaagtaatc cacctgggga gtacgccggc aacggtgaaa 901 ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggaggaaca tgtggtttaa ttcgatgata 961 cgcgaggaac cttacccggg tttgaacgta gtctgaccgg agtggaaaca ctccttctag 1021 caatagcaga ttacgaggtg ctgcatggtt gtcgtcagct cgtgccgtga ggtgtcggct 1081 taagtgccat aacgagcgca acccttatca ctagttacta acaggtgaag ctgaggactc 1141 tggtgagact gccagcgtaa gctgtgagga aggtggggat gacgtcaaat cagcacggcc 1201 cttacatccg gggcgacaca cgtgttacaa tggcatggac aaagggcagc tacctggcga 1261 caggatgcta atctccaaac catgtctcag ttcggatcgg agtctgcaac tcgactccgt 1321 gaagctggat tcgctagtaa tcgcgcatca gccatggcgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1381 ttgtacacac cgcccgtcaa gccatgggag ccgggggtac ctgaagtccg taaccgcaag 1441 gatcggccta gggtaaaact ggtgactggg gctaagtcgt aacaaggtaa cc
SEQ ID NO:8 (Gen de Parabacteroides merdae para ARN ribosómico 16S, secuencia parcial, cepa: 13405 -AB238929) *
1 agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcgacaggc ttaacacatg caagtcgagg 61 ggcagcatga tttgtagcaa tacagattga tggcgaccgg cgcacgggtg agtaacgcgt 121 atgcaactta cctatcagag ggggatagcc cggcgaaagt cggattaata ccccataaaa 181 caggggttcc gcatgggaat atttgttaaa gattcatcgc tgatagatag gcatgcgttc 241 cattaggcag ttggcggggt aacggcccac caaaccgacg atggataggg gttctgagag 301 gaaggtcccc cacattggta ctgagacacg gaccaaactc ctacgggagg cagcagtgag 361 gaatattggt caatggccga gaggctgaac cagccaagtc gcgtgaagga agaaggatct 421 atggtttgta aacttctttt ataggggaat aaagtggagg acgtgtcctt ttttgtatgt 481 accctatgaa taagcatcgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggaggatgcg 541 agcgttatcc ggatttattg ggtttaaagg gtgcgtaggt ggtgatttaa gtcagcggtg 601 aaagtttgtg gctcaaccat aaaattgccg ttgaaactgg gttacttgag tgtgtttgag 661 gtaggcggaa tgcgtggtgt agcggtgaaa tgcatagata tcacgcagaa ctccgattgc 721 gaaggcagct tactaaacca taactgacac tgaagcacga aagcgtgggg atcaaacagg 781 attagatacc ctggtagtcc acgcagtaaa cgatgattac taggagtttg cgatacaatg 841 taagctctac agcgaaagcg ttaagtaatc cacctgggga gtacgccggc aacggtgaaa 901 ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggaggaaca tgtggtttaa ttcgatgata 961 cgcgaggaac cttacccggg tttgaacgta gtctgaccgg agtggaaaca ctccttctag 1021 caatagcaga ttacgaggtg ctgcatggtt gtcgtcagct cgtgccgtga ggtgtcggct 1081 taagtgccat aacgagcgca acccttatca ctagttacta acaggtgaag ctgaggactc 1141 tggtgagact gccagcgtaa gctgtgagga aggtggggat gacgtcaaat cagcacggcc 1201 cttacatccg gggcgacaca cgtgttacaa tggcatggac aaagggcagc tacctggcga 1261 caggatgcta atctccaaac catgtctcag ttcggatcgg agtctgcaac tcgactccgt 1321 gaagctggat tcgctagtaa tcgcgcatca gccatggcgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1381 ttgtacacac cgcccgtcaa gccatgggag ccgggggtac ctgaagtccg taaccgcaag 1441 gatcggccta gggtaaaact ggtgactggg gctaagtcgt aacaaggtaa cc
SEQ ID NO:9 (secuencia de ARNr 16S de consenso para la cepa de Parabacteroides distasonis 755)
AMCCGGGTGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACGCGTATGCAACTTGCCTATCAGAGGGGGATAACCCGGCGAAAGT CGGACTAATACCGCATGAAGCAGGGATCCCGCATGGGAATATTTGCTAAAGATTCATCGCTGATAGATAGGCATGCG TTCCATTAGGCAGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAACCGACGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACA TTGGTACTGAGACACGGACCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGTGAGCCTGAACC AGCCAAGTCGCGTGAGGGATGAAGGTTCTATGGATCGTAAACCTCTTTTATAAGGGAATAAAGTGCGGGACGTGTCC CGTTTTGTATGTACCTTATGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCGAGCGT TATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTGCGTAGGCGGCCTTTTAAGTCAGCGGTGAAAGTCTGTGGCTCAACCATAG AATTGCCGTTGAAACTGGGAGGCTTGAGTATGTTTGAGGCAGGCGGAATGCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCATAGAT ATCACGCAGAACCCCGATTGCGAAGGCAGCCTGCCAAGCCATTACTGACGCTGATGCACGAAAGCGTGGGGATCAAA CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCAGTAAACGATGATCACTAGCTGTTTGCGATACACTGTAAGCGGCACAGC GAAAGCGTTAAGTGATCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAG CGGAGGAACATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGTTTGAACGCATTCGGACMGAKGTGGAA ACACATTTTCTAGCAATAGCCATTTGCGAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCGGCTTAAG TGCCATAACGAGCGCAACCCTTGCCACTAGTTACTAACAGGTAAAGCTGAGGACTCTGGTGGGACTGCCAGCGTAAG CTGCGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACATCCGGGGCGACACACGTGTTACAATGGCGTGG ACAAAGGGAAGCCACCTGGCGACAGGGAGCGAATCCCCAAACCACGTCTCAGTTCGGATCGGAGTCTGCAACCCGAC TCCGTGAAGCTGGATTCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCATGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCG CCCGTCAAGCCATGGGAGCCGGGGGTACCTGAAGTCCGTAACCGCGAGGATCGGCCTAGGGTAAAACTGGTGACTGG GGCTAAGTCGTACGGGG SEQ ID NO: 10 (secuencia del genoma de la cepa 755) - ver listado de secuencias electrónico de la WO2018229189.
SEQ ID NO: 11 (Secuencia de ARNr 16S de consenso para la cepa de Megasphaera massiliensis MRX0029) TGAGAAGCTTGCTTCTTATCGATTCTAGTGGCAAACGGGTGAGTAACGCGTAAGCAACCTGCCCTTCAGATGGGGAC AACAGCTGGAAACGGCTGCTAATACCGAATACGTTCTTTCCGCCGCATGACGGGAAGAAGAAAGGGAGGCCTTCGGG CTTTCGCTGGAGGAGGGGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGAGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCC GGTCTGAGAGGATGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTT CCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAAGTTCTGTTATATG GGACGAACAGGACATCGGTTAATACCCGGTGTCTTTGACGGTACCGTAAGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAG CAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCGCGCAGGCGGCATCGCAAGT CGGTCTTAAAAGTGCGGGGCTTAACCCCGTGAGGGGACCGAAACTGTGAAGCTCGAGTGTCGGAGAGGAAAGCGGAA TTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTTTCTGGACGACAACTGA CGCTGAGGCGCGAAAGCCAGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCTGGCCGTAAACGATGGATACTAGG TGTAGGAGGTATCGACTCCTTCTGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTG AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACGTTA CCAAGCCTTGACATTGATTGCTACGGAAAGAGATTTCCGGTTCTTCTTCGGAAGACAAGAAAACAGGTGGTGCACGG CTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCTTCTGTTGCCAGCACC TCGGGTGGGGACTCAGAAGAGACTGCCGCAGACAATGCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTT ATGGCTTGGGCTACACACGTACTACAATGGCTCTTAATAGAGGGAAGCGAAGGAGCGATCCGGAGCAAACCCCAAAA ACAGAGTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCAGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATA CTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAAAGTCATTCACACCCGAAGCCGGTGA GGCAACCGCAAG
Cebadores usados para qPCR (con SEQ ID NO entre paréntesis)
Figure imgf000047_0001
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende una cepa bacteriana del género Parabacteroides, para su uso en un método de tratamiento o prevención de un trastorno neurodegenerativo seleccionado del grupo que consiste de: enfermedad de Parkinson, incluyendo parálisis supranuclear progresiva, parálisis supranuclear progresiva, síndrome de Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalia de presión normal, parkinsonismo vascular o arterioesclerótico y parkinsonismo inducido por fármacos; enfermedad de Alzheimer, incluyendo el síndrome de Benson; enfermedad de Huntington; esclerosis lateral amiotrófica; enfermedad de Lou Gehrig; enfermedad de las neuronas motoras; enfermedad por priones; ataxia espinocerebelosa; atrofia muscular espinal; demencia, incluyendo la demencia con cuerpos de Lewy, vascular y frontotemporal; afasia progresiva primaria; deterioro cognitivo leve; deterioro cognitivo relacionado con el VIH y degeneración corticobasal.
2. La composición para el uso de la reivindicación 1, en donde la composición es para su uso en un método de tratamiento o prevención de la enfermedad de Parkinson.
3. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde la composición es para su uso en un método de tratamiento o prevención de enfermedad neurodegenerativa de aparición temprana.
4. La composición para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde la composición es para su uso en un método de prevención o para retrasar la aparición o progresión de un trastorno neurodegenerativo.
5. Una composición que comprende una cepa bacteriana del género Parabacteroides, para su uso en un método de tratamiento de daño cerebral.
6. La composición para el uso de la reivindicación 5, en donde el daño cerebral es derrame cerebral como isquemia cerebral, isquemia cerebral focal, derrame cerebral isquémico o derrame cerebral hemorrágico.
7. La composición para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde la cepa bacteriana es de Parabacteroides distasonis.
8. La composición para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la secuencia de ARNr 16S de una cepa bacteriana de Parabacteroides distasonis.
9. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 78 o 9.
10. La composición para el uso de la reivindicación 9, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la SEQ ID NO: 9, o en donde la cepa bacteriana tiene la secuencia de ARNr 16s representada por la SEQ ID NO: 9.
11. La composición para el uso de la reivindicación 1, en donde la composición comprende una cepa bacteriana de la especie Parabacteroides distasonis, para su uso en un método para tratar o prevenir la enfermedad de Parkinson.
12. La composición para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde la composición es para administración oral; y/o en donde la composición comprende uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables; y/o en donde la cepa bacteriana está liofilizada.
13. Un producto alimenticio que comprende la composición de cualquier reivindicación anterior, para el uso de cualquier reivindicación anterior.
14. Una célula de la cepa Parabacteroides distasonis depositada con el número de registro NCIMB 42382, para su uso en el tratamiento o prevención de un trastorno neurodegenerativo, en donde la célula es para su uso en un método definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
15. La célula de la reivindicación 14, en donde el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Parkinson.
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