ES2849730T3 - Formulaciones liposómicas estables de rapamicina y derivados de rapamicina para tratar el cáncer - Google Patents

Formulaciones liposómicas estables de rapamicina y derivados de rapamicina para tratar el cáncer Download PDF

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Abstract

Una formulación liposómica estable, formulación estable que comprende un liposoma que contiene al menos una bicapa lipídica formada por una fosfatidilcolina seleccionada del grupo que consiste en palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) o mezclas de las mismas; y un fármaco encapsulado en el liposoma, en donde el fármaco es sirolimus, umirolimus o everolimus y el liposoma tiene un diámetro de 50 nm a 2 μm y está exento de colesterol.

Description

DESCRIPCIÓN
Formulaciones liposómicas estables de rapamicina y derivados de rapamicina para tratar el cáncer
Campo
La solicitud se refiere al campo de los fármacos anticancerígenos, en particular, a métodos para cargar fármacos anticancerígenos hidrófobos en liposomas y para el tratamiento de cánceres con liposomas.
Antecedentes
La rapamicina, también conocida como sirolimus, es un antibiótico macrólido desarrollado inicialmente para su uso como inmunosupresor en pacientes trasplantados. Posteriormente, se utilizó como recubrimiento de fármacos para los stents de arterias coronarias, donde funciona reduciendo la restenosis después de una angioplastia al inhibir la proliferación de células de músculo liso.
También se ha descubierto que el sirolimus y los derivados de este fármaco son eficaces para tratar ciertos cánceres. Por ejemplo, sirolimus tiene actividad antitumoral. Véase la Patente de EE.UU. 4.885.171. Everolimus, el 40-O-(2-hidroxietil) derivado de sirolimus, ha sido aprobado para el tratamiento de cáncer de riñón avanzado, cáncer de mama avanzado con receptor hormonal positivo/HER2 negativo y tumores neuroendocrinos pancreáticos.
Se ha demostrado que el umirolimus, es decir, 40-alcoxialquil-rapamicina, y las micelas poliméricas cargadas con umirolimus pueden inhibir el crecimiento de células cancerosas in vitro y las micelas son eficaces para ralentizar el crecimiento de tumores experimentales in vivo. Véase la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU.
2014/0154305. La encapsulación de micelas poliméricas de umirolimus mejora significativamente la solubilidad y estabilidad de este fármaco y da como resultado su administración sostenida.
Como alternativa a las micelas poliméricas, se han empleado liposomas para mejorar la administración de fármacos de sirolimus y sus derivados. Por ejemplo, sirolimus, everolimus y tacrolimus se han encapsulado en liposomas utilizando dos métodos de carga pasiva, a saber, hidratación de película fina e inyección de etanol. Sin embargo, debido a la baja solubilidad e hidrofobicidad de estos fármacos, la cantidad de fármaco encapsulado y la eficacia de encapsulación del fármaco es particularmente baja, es decir, < 0,5 mg/mL y < 90%, respectivamente. La fuga de fármaco de los liposomas también ocurre con técnicas de carga pasiva.
Se ha utilizado una técnica de carga de película remota que requiere pasos de disolución del fármaco y eliminación del disolvente para atrapar el sirolimus en liposomas preformados.
Aunque el método da como resultado una alta eficacia de encapsulación del fármaco, existen riesgos potenciales para la estabilidad del fármaco durante el procedimiento de carga.
Por tanto, existe la necesidad de desarrollar nuevos métodos de carga de liposomas para fármacos hidrófobos para mejorar el contenido de fármaco, la relación fármaco a lípido y la eficacia de encapsulación del fármaco. Dichos métodos deben formar liposomas cargados con fármacos que tengan un índice terapéutico más alto en comparación con los liposomas existentes, particularmente para umirolimus y otros derivados de rapamicina.
Sumario
Para satisfacer esta necesidad, se proporciona una formulación liposómica estable para tratar el cáncer. La formulación estable incluye un liposoma que contiene al menos una bicapa lipídica formada por una o más fosfatidilcolinas seleccionadas entre palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y dioleoilfosfatidilcolina (DOPC). El liposoma tiene un diámetro de 50 nm a 2 pm y está exento de colesterol. Encapsulado en el liposoma hay un fármaco anticancerígeno seleccionado entre sirolimus, umirolimus y everolimus.
También se proporciona un método para cargar un fármaco hidrófobo en liposomas. El método incluye las etapas de (i) obtener liposomas sin colesterol que tengan al menos una bicapa lipídica, (ii) añadir los liposomas sin colesterol a una solución acuosa para formar una suspensión de modo que no exista sustancialmente potencial transmembrana a través de la bicapa lipídica, (iii) añadir un fármaco hidrófobo en ausencia de un potenciador de solubilidad a la suspensión para formar una mezcla, y (iv) agitar la mezcla durante 4 a 48 horas a temperatura ambiente. El método da como resultado la carga de al menos el 80% del fármaco hidrófobo en los liposomas. En una realización, el método consiste en las etapas establecidas en este párrafo.
Además, se describe un método para preparar un fármaco hidrófobo encapsulado en un liposoma sin colesterol. El método se lleva a cabo (i) suspendiendo uno o más de POPC, DMPC y DOPC en un tampón acuoso para formar una suspensión lipídica, (ii) agitando la suspensión lipídica durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente para formar vesículas multilaminares ( MLV), (iii) extruyendo las MLVs para formar vesículas unilaminares grandes (LUVs) que tienen un diámetro de 50 nm a 2 pm, (iv) agregando las LUVs a una solución acuosa para formar una suspensión de modo que no exista sustancialmente potencial transmembrana a través de las LUVs, (v) agregando un fármaco hidrófobo a la suspensión en ausencia de un potenciador de solubilidad para formar una mezcla, (vi) agitando la mezcla durante 4 a 48 horas a temperatura ambiente para formar una suspensión de liposomas cargada con fármaco, y (vii) filtrando la suspensión de liposomas cargada con fármaco para eliminar el fármaco hidrófobo no encapsulado. El método permite la encapsulación de al menos el 80% del fármaco hidrófobo añadido. En otra realización, el método consiste en las etapas expuestas en este párrafo.
También se describe un método para tratar el cáncer. El método requiere las etapas de administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de las formulaciones liposómicas estables descritas anteriormente. La cantidad eficaz es suficiente para inhibir el crecimiento de células cancerosas en el sujeto.
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en la descripción, en los dibujos y en los ejemplos siguientes. Otras características, objetos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada, los dibujos y también de las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La descripción de la invención a continuación se refiere a los dibujos adjuntos, de los cuales:
La Fig. 1 es un gráfico del perfil de liberación de fármaco in vitro de umirolimus (URL) y umirolimus liposómico (LipoURL);
La Fig. 2 es un gráfico del perfil de liberación de fármaco in vitro de everolimus (ERL) y everolimus liposómico (LipoERL); y
La Fig. 3 es un gráfico del perfil de liberación de fármaco in vitro de sirolimus (SRL) y sirolimus liposómico (LipoSRL).
Descripción detallada
Como se mencionó anteriormente, se describe una formulación liposómica estable para tratar el cáncer. En la formulación, los liposomas contienen al menos una bicapa lipídica formada por una fosfatidilcolina seleccionada entre POPC, DMPC y DOPC, o mezclas de estas tres fosfatidilcolinas, y están exentos de colesterol. En un aspecto particular, los liposomas contienen una bicapa lipídica. En otro aspecto, los liposomas contienen solo POPC, DMPC o DOPC. En una realización preferida, los liposomas contienen solo POPC.
Alternativamente, la bicapa lipídica de los liposomas incluye la fosfatidilcolina junto con un fosfolípido conjugado con un resto polietilenglicol (PEG). El fosfolípido conjugado con PEG puede ser 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino (PEG)](DSPE-PEG); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(PEG)](DOPE-PEG); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(PEG)](DPPE-PEG); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(PEG)](DMPE-PEG); o mezclas de los mismos. En una realización particular, el fosfolípido conjugado con PEG es DSPE-PEG.
Cuando el liposoma incluye tanto la fosfatidilcolina como el fosfolípido conjugado con PEG, la relación en peso entre ellos puede ser de 5:1 a 100:1, por ej., 5:1,7,5:1, 10:1, 15:1,20:1,30:1,40:1,50:1,60:1,70:1,80:1,90:1 y 100:1. Una proporción preferida es 10:1. El peso molecular del resto de PEG que se conjuga con el fosfolípido puede ser de 150 a 3000 g/mol, por ejemplo, 150, 200, 250, 300, 350, 500, 750, 1000, 1250 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000 g/mol. En una realización preferida, el peso molecular del resto de PEG es 2000 g/mol.
Los liposomas pueden tener un diámetro de 50 nm a 2 gm (por ej., 50 nm, 100 nm, 150 nm, 200 nm, 250 nm, 500 nm, 1 gm, 1,5 gm y 2 gm). En una realización, los liposomas tienen un diámetro de 50 nm a 500 nm. En una realización preferida, el diámetro es de 100 nm.
Los liposomas en la formulación liposómica estable encapsulan un fármaco hidrófobo para tratar el cáncer. El fármaco hidrófobo puede ser un fármaco antiproliferante, por ej., sirolimus, umirolimus o everolimus. En una formulación particular, el fármaco hidrófobo es umirolimus.
La relación en peso entre el fármaco hidrófobo y el componente fosfatidilcolina de los liposomas puede ser de 1:5 a 1:100 (p. ej., 1: 5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:75 y 1:100). En una realización, la relación en peso de fármaco a fosfatidilcolina es 1:10. En otra realización particular, la relación en peso es 1:20.
La concentración del fármaco hidrófobo en la formulación liposómica estable puede ser de 0,01 mg/mL a 10 mg/mL. Por ejemplo, la concentración de fármaco en la formulación puede ser de 0,01 mg/mL, 0,05 mg/mL, 0,5 mg/mL, 1,0 mg/mL, 2,5 mg/mL, 5,0 mg/mL y 10 mg/mL. En una realización particular, la concentración de fármaco es de 1 mg/mL.
Además, la formulación liposómica estable puede tener un pH de 6,0 a 8,0.
En una realización preferida, el pH es 7,4. En un aspecto particular, la formulación liposómica estable para el tratamiento del cáncer incluye liposomas formados únicamente por POPC y DSPE-PEG 2000, teniendo los liposomas umirolimus encapsulados en ellos. Los liposomas no contienen colesterol, tienen un diámetro de aproximadamente 100 nm y la relación en peso entre el umirolimus y el POPC es 1:20. Esta formulación específica contiene 1 mg/mL de umirolimus y tiene un pH de 7,4.
La formulación liposómica estable también mejora la estabilidad del fármaco hidrófobo en solución. Por ejemplo, el fármaco hidrófobo en la formulación puede ser estable durante 7-14 días cuando se almacena a 5 °C en comparación con el fármaco en suspensión acuosa. En este contexto, la estabilidad se define como una pérdida de no más que 5% de la cantidad inicial de fármaco en la formulación.
Ventajosamente, el fármaco hidrófobo puede liberarse de los liposomas en la formulación durante un período de tiempo prolongado después de la administración. Es decir, la formulación es una formulación de liberación sostenida. Por ejemplo, el fármaco hidrófobo se puede liberar de los liposomas después de la administración de la formulación de forma continua durante un período de hasta 3 meses, por ej., 7, 14, 21 días y 1,2 y 3 meses.
También mencionado anteriormente, se proporciona un método para cargar un fármaco hidrófobo en liposomas. El método es una técnica mejorada de carga remota de la película en la que se obtienen primero los liposomas y luego se carga el fármaco hidrófobo en los liposomas.
Los liposomas para usar en el método de carga no tienen colesterol, tienen al menos una bicapa lipídica que contiene uno o más de POPC, DMPC y DOPC, y tienen un diámetro de 50 nm a 2 pm. En una realización, los liposomas contienen solo POPC.
Alternativamente, los liposomas exentos de colesterol tienen al menos una bicapa lipídica que contiene uno o más de POPC, DMPC y DOPC y también contiene un fosfolípido conjugado con PEG seleccionado entre DSPE-PEG, DOPE-PEG, DPPE-PEG y DMPE-PEG.
El peso molecular del resto de PEG que está conjugado con el fosfolípido puede ser de 150 a 3000 g/mol, por ej., 150, 200, 250, 300, 350, 500, 750, 1000, 1250 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000 g/mol. En una realización preferida, el peso molecular del resto de PEG es 2000 g/mol.
En un aspecto particular, los liposomas contienen solo POPC. En otra realización, los liposomas contienen solo POPC y DSPE-PEG2000.
Los liposomas se pueden obtener formando MLVs que contienen uno o más de POPC, DMPC, DOPC y, opcionalmente, DSPE-PEG2000, y extruyendo las MLVs para obtener liposomas sin colesterol que tienen un diámetro de 50 nm a 2 pm. Más específicamente, se suspenden uno o más de POPC, DMPC, DOPC y, opcionalmente, DSPE-PEG2000 en un tampón acuoso para formar una suspensión de lípidos, la suspensión se agita durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente para formar MLVs.
Las MLVs se convierten en grandes vesículas unilaminares (LUVs) mediante un procedimiento de extrusión. Por ejemplo, las MLVs pueden extruirse a través de un filtro de policarbonato de 3 capas de 3 a 20 veces. En un procedimiento de extrusión preferido, las MLVs se extruyen 10 veces.
El filtro de policarbonato puede tener un tamaño de poro de 50 nm a 200 nm. En una realización particular, el tamaño de poro es de 100 nm. Nuevamente, los LUVs resultantes, es decir, los liposomas, pueden tener un diámetro de 50 nm a 2 pm.
Los liposomas exentos de colesterol descritos anteriormente se añaden luego a una solución acuosa para formar una suspensión. Es importante destacar que la solución acuosa empleada debe ser la misma solución o similar a la utilizada para producir los liposomas sin colesterol de manera que sustancialmente no haya ningún potencial transmembrana a través de la bicapa lipídica de los liposomas. Por ejemplo, la fuerza iónica, el pH y la osmolaridad deben coincidir estrechamente de manera que no haya gradiente iónico, gradiente de pH o gradiente osmótico a través de la membrana liposómica. Esto se puede asegurar, por ej., usando PBS para formar los liposomas exentos de colesterol y también diluyéndolos en PBS para formar la suspensión.
En este contexto, la frase "sustancialmente ningún potencial transmembrana" significa un nivel de potencial transmembrana por debajo del cual un fármaco no se cargaría activamente en el liposoma. Por ejemplo, véase Akbarzadeh et al., Nanoscale Research Letters 2013, 8: 102.
Se añade un fármaco hidrófobo a la suspensión de liposomas en la solución acuosa para formar una mezcla. El fármaco hidrófobo puede ser sirolimus, umirolimus o everolimus. En un método particular, el fármaco es umirolimus. El método de carga en esta etapa no requiere el uso de un potenciador de solubilidad, p. ej., una ciclodextrina, para solubilizar el fármaco hidrófobo en la solución acuosa. De hecho, esto no es necesario ni deseable.
Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que el fármaco hidrófobo, al añadirse a los liposomas suspendidos en la solución acuosa, interactúa fuertemente con las colas lipídicas de los liposomas debido a la naturaleza hidrófoba del fármaco, lo que lleva a su encapsulación en la bicapa lipídica del liposoma.
La mezcla de liposomas y fármaco hidrófobo se agita durante 4 a 48 horas a temperatura ambiente, lo que da como resultado al menos 80% (por ej., 80%, 85%, 90%, 95% y 100%) del fármaco hidrófobo añadido cargado en los liposomas sin colesterol.
También dentro del alcance de la solicitud se encuentra un método para tratar el cáncer utilizando las formulaciones liposómicas estables descritas anteriormente. El método requiere administrar a un paciente con cáncer una cantidad eficaz de la formulación liposómica estable que contiene un fármaco anticanceroso seleccionado entre sirolimus, umirolimus o everolimus. La cantidad eficaz inhibe el crecimiento de células cancerosas en el paciente.
Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad eficaz de la formulación liposómica estable que debe administrarse al paciente con cáncer. Por ejemplo, la respuesta a la dosis del fármaco a lo largo del tiempo se puede seguir midiendo el tamaño del tumor mediante escaneado por MRI o CT.
Las formulaciones liposómicas estables se pueden administrar a un paciente con cáncer mediante cualquier método convencional, incluyendo, pero sin limitarse a, inyección intraperitoneal, inyección intravenosa, inyección directa en un tumor, inyección en la circulación arterial aguas arriba de un tumor e inhalación nasal. Las formulaciones liposómicas estables descritas anteriormente también se pueden formar en una píldora o una cápsula para administración oral.
Los tipos de cáncer que se pueden tratar mediante la administración de las formulaciones liposómicas estables descritas anteriormente incluyen, pero no se limitan a, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, cáncer suprarrenal, sarcoma de tejido blando en adultos, cáncer anal, anemia aplásica, cáncer de piel de células basales y escamosas, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, tumores cerebrales/del SNC, cáncer de mama, cáncer de mama en el hombre, cáncer en los niños, cáncer primario desconocido, enfermedad de Castleman, cáncer de cuello uterino, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, leucemia mielomonocítica crónica, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, tumores de la familia Ewing, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, enfermedad trofoblástica gestacional, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe e hipofaringe, leucemia en niños, cáncer de hígado, cáncer de pulmón-células no pequeñas, cáncer de pulmón-células pequeñas, tumor carcinoide de pulmón, mesotelioma maligno, cáncer de piel melanoma, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, cáncer de cavidad nasal y seno paranasal, cáncer de nasofaringe, neuroblastoma, linfoma no de Hodgkin, cáncer de la cavidad oral y orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pene, tumores pituitarios, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, linfoma de piel, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de timo, cáncer de tiroides, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms.
Sin más elaboración, se cree que un experto en la técnica puede, basándose en la descripción de este documento, utilizar la presente invención en su máxima extensión. Los siguientes ejemplos específicos, por lo tanto, deben interpretarse como meramente descriptivos y no limitantes del resto de la divulgación de ninguna manera.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de liposomas cargados con umirolimus
Se prepararon cuatro lotes de 200 mL de liposomas, cada uno de los cuales contenía una fosfatidilcolina diferente, a saber, EggPC, POPC, DMPC o DOPC. Brevemente, se añadieron 6000 mg de cada fosfatidilcolina a 200 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en botellas de vidrio despirogenadas de 500 mL separadas. Las mezclas se agitaron a temperatura ambiente durante al menos 30 min para formar vesículas multilaminares (MLVs). Los tamaños de las MLVs se redujeron mediante extrusión a través de un módulo de 3 membranas de filtro de policarbonato (tamaño de poro de 100 nm) utilizando una extrusora de mesa (Northern Lipids Inc., Canadá). Después de 10 pasadas de extrusión, se obtuvieron grandes vesículas unilaminares (LUVs) con un tamaño medio de ~100 nm.
Para cargar umirolimus en las LUVs, se agregaron 50 mg del fármaco a cada uno de cuatro frascos de vidrio despirogenados de 50 mL junto con 10 mL de una de las cuatro preparaciones de LUVs por frasco. El frasco de vidrio se tapó y se colocó en un baño de agua a una temperatura de 25°C. La mezcla se agitó durante 24 horas. La solución resultante de liposomas cargados con umirolimus se filtró a través de un filtro de jeringa de difluoruro de polivinilideno (PVDF) que tenía un tamaño de poro de 0,2 pm para eliminar el umirolimus no encapsulado.
El contenido de umirolimus de las soluciones liposómicas después de la carga se determinó mediante HPLC de fase inversa. Los liposomas se rompieron mezclando muestras de 50 pL de cada solución liposómica con 1,0 mL de acetonitrilo. Se preparó una solución estándar de umirolimus en una concentración de 0,05 mg/mL en metanol. Las muestras se analizaron por HPLC y se compararon con la solución estándar para cuantificar la cantidad de umirolimus en el liposoma.
El diámetro medio de intensidad de los liposomas y el índice de polidispersidad (PDI) de la distribución se determinaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) utilizando un instrumento Zetasizer Nano (Malvern Instruments, Gran Bretaña). Cada muestra analizada se diluyó 1:25 en una solución de cloruro de sodio al 0,9%. Las mediciones del tamaño de partícula a un ángulo de dispersión de 172° se llevaron a cabo utilizando un barrido de al menos 5 min con los siguientes parámetros: viscosidad = 1,0183 cp, índice de refracción = 1,332, temperatura = 23°C. El tamaño de los liposomas se midió y registró antes y después de la carga de umirolimus. Los resultados de la carga de fármaco se resumen en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1. Carga de umirolimus en liposomas
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La cantidad de umirolimus cargada en liposomas formados por DMPC, POPC y DOPC fue superior a 2,7 mg/mL. Inesperadamente, la cantidad de umirolimus cargada en estos tres liposomas fue mayor que la cargada en liposomas formados por EggPC.
Ejemplo 2: Preparación de liposomas cargados con umirolimus que contienen un fosfolípido conjugado con polietilenglicol
Se prepararon liposomas que contenían un fosfolípido conjugado con polietilenglicol (PEGilado) combinando 1800 mg de POPC y 200 mg de DSPE PEG-2000 en 200 mL de PBS en una botella de vidrio despirogenada de 500 mL. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante al menos 30 min para formar MLVs. Los tamaños de las MLVs se redujeron mediante extrusión a través de un módulo de 3 membranas de filtro de policarbonato (tamaño de poro de 100 nm) utilizando una extrusora de mesa (Northern Lipids Inc., Canadá). Después de 10 pasadas de extrusión, se obtuvieron LUVs PEGiladas con un tamaño medio de aproximadamente 100 nm.
Para cargar umirolimus en las LUVs PEGiladas, se agregaron 50 mg del fármaco a una botella de vidrio despirogenada de 500 mL junto con 50 mL de las LUVs. La botella de vidrio se tapó y se colocó en un baño de agua a una temperatura de 25°C. La mezcla se agitó durante hasta 24 horas. Se recogieron muestras de 1 mL 1,2, 3, 4, 5, 6 y 24 h después del inicio de la agitación para evaluar la carga de umirolimus en los liposomas PEGilados. Cada muestra se filtró a través de un filtro de jeringa de difluoruro de polivinilideno (PVDF) que tenía un tamaño de poro de 0,2 pm para eliminar el umirolimus no encapsulado. El contenido de umirolimus de cada muestra se evaluó mediante HPLC como se describe anteriormente en el Ejemplo 1.
Los resultados indicaron que el porcentaje de umirolimus incorporado en los liposomas PEGilados después de agitar durante 1,2, 3, 4, 5, 6 y 24 h fue 59%, 67%, 77%, 82%, 87%, 91%, y 102%, respectivamente, basado en la cantidad inicial de umirolimus utilizada para la carga. La realización del método de carga anteriormente descrito resultó inesperadamente en la carga de esencialmente todo el umirolimus en los liposomas PEGilados en 24 h.
La estabilidad de la formulación de liposomas PEGilados cargados con umirolimus se evaluó durante el almacenamiento en viales de vidrio transparente a 5°C ± 3°C. La temperatura de la muestra se monitorizó y registró continuamente para asegurar condiciones de temperatura constante. Se analizó la solución en cuanto al contenido de umirolimus, tamaño de vesícula y PDI como se describió anteriormente en el Ejemplo 1 después de almacenamiento durante 2, 3, 4, 6 y 8 semanas. Los resultados de estabilidad se muestran en la Tabla 2 a continuación.
Tabla 2. Estabilidad de las formulaciones de liposomas PEGilados cargados con umirolimus
Figure imgf000006_0002
Los resultados indican que la solución de liposomas PEGilados cargados con umirolimus es estable durante al menos 8 semanas cuando se almacena a 5°C.
Ejemplo 3: Medición de la eficacia de encapsulación de fármacos de formulaciones de liposomas cargadas con umirolimus
Se desarrolló un ensayo para caracterizar la eficacia de la encapsulación de umirolimus por los liposomas utilizando una técnica de filtración por gel para separar el fármaco libre de la solución de liposomas. La proporción de fármaco a lípido de las formulaciones liposómicas se determinó antes y después de pasarlas por una columna de desalación de gel de dextrano reticulado PD-1O (SEPHADEX® G-25) utilizando la siguiente ecuación:
Encapsulación del fármaco % = Relación final de fármaco:lípido (muestras pasadas por una columna PD-10) x 100/ Relación inicial de fármaco:lípido (muestras antes de la separación por PD-10)
Se prepararon liposomas POPC cargados con umirolimus y liposomas POPC PEGilados cargados con umirolimus como se describió anteriormente en el Ejemplo 1 y Ejemplo 2, respectivamente. Las eficacias de encapsulación de fármacos se muestran en la Tabla 3 a continuación.
Tabla 3. Eficacia de la encapsulación del fármaco umirolimus
Figure imgf000007_0001
Sorprendentemente, la eficacia de encapsulación tanto de los liposomas POPC cargados con umirolimus como de los liposomas POPC PEGilados cargados con umirolimus fue superior al 95%.
Ejemplo 4: Preparación de liposomas cargados con sirolimus y everolimus
Se prepararon LUVs de POPC como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. Se agregaron 50 mg de sirolimus o everolimus a un frasco de vidrio despirogenado de 50 mL junto con 10 mL de las LUVs de POPC. El frasco de vidrio se tapó y se colocó en un baño de agua a una temperatura de 25°C. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. La solución de liposomas cargada con fármaco se filtró a través de un filtro de jeringa de PVDF de 0,2 gm para eliminar el fármaco no encapsulado.
Para ambas formulaciones liposómicas, el contenido de fármaco después de la encapsulación, el diámetro medio de intensidad de los liposomas y el PDI se determinaron como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 4 a continuación.
Tabla 4. Carga de fármaco de sirolimus y everolimus in liposomas POPC
Figure imgf000007_0002
Los resultados indicaron que sirolimus y everolimus fueron encapsulados con éxito en liposomas POPC con altas eficacias.
Ejemplo 5: Estudio de liberación de fármacos in vitro
Se utilizó un ensayo de liberación de fármacos in vitro para determinar los perfiles de liberación de umirolimus, sirolimus y everolimus. Se prepararon liposomas cargados con umirolimus como se describió anteriormente en el Ejemplo 1, y se prepararon liposomas cargados con sirolimus y cargados con everolimus como se describió anteriormente en el Ejemplo 4.
Para cada fármaco, se preparó una formulación de control que contenía 1,0 mg de fármaco en 5 mL de una solución que contenía acetonitrilo al 15% y agua al 85%. Se cargaron 5 mL de las formulaciones de control y las formulaciones liposómicas para cada fármaco en tubos de diálisis separados que tenían un peso molecular de corte 50 kDa.
Cada tubo de diálisis cargado se colocó en un tubo individual de 50 mL que contenía 40 mL de medio de liberación (acetonitrilo al 15% y SDS al 0,5%). Se tomaron muestras del medio de liberación en cada tubo después de 1,2, 5, 7, 24, 30 y 48 h y se determinó la concentración de fármaco en el medio de liberación mediante HPLC como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. El porcentaje de liberación de fármaco acumulativo versus liberación se representó el tiempo para todas las muestras.
Los resultados se muestran en las Figuras 1,2 y 3 para umirolimus, everolimus y sirolimus, respectivamente.
Los resultados indicaron que, respectivamente, 67%, 100% y 84% de las cantidades iniciales de umirolimus, everolimus y sirolimus se difundieron fuera del tubo de diálisis en 48 h.
Por el contrario, los fármacos encapsulados en liposomas se difundieron fuera del tubo de diálisis a un ritmo más lento. La liberación acumulada de umirolimus, everolimus y sirolimus encapsulados después de 48 h fue del 67%, 59% y 54%, respectivamente, de la cantidad inicial de fármaco.
Los resultados indicaron que las formulaciones liposómicas de umirolimus, everolimus y sirolimus son eficaces para la administración sostenida de fármacos.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una formulación liposómica estable, formulación estable que comprende un liposoma que contiene al menos una bicapa lipídica formada por una fosfatidilcolina seleccionada del grupo que consiste en palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) o mezclas de las mismas; y un fármaco encapsulado en el liposoma, en donde el fármaco es sirolimus, umirolimus o everolimus y el liposoma tiene un diámetro de 50 nm a 2 pm y está exento de colesterol.
2. La formulación liposómica estable según la reivindicación 1, en la que la al menos una bicapa lipídica incluye además un fosfolípido conjugado con un resto polietilenglicol (PEG).
3. La formulación liposómica estable según la reivindicación 2, en la que el fosfolípido es diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) y el resto de PEG tiene un peso molecular de 150 a 3000 g/mol.
4. La formulación liposómica estable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la relación en peso entre el fármaco y la fosfatidilcolina es de 1:5 a 1:100.
5. La formulación liposómica estable según la reivindicación 4, en la que la formulación contiene de 0,01 mg/mL a 10 mg/mL del fármaco.
6. La formulación liposómica estable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la formulación tiene un pH de 6 a 8.
7. La formulación liposómica estable según la reivindicación 6, en la que la fosfatidilcolina es POPC, el fármaco es umirolimus, la relación en peso entre el umirolimus y la fosfatidilcolina es 1:20 y la formulación contiene 1 mg/mL de umirolimus.
8. Un método para cargar un fármaco hidrófobo en liposomas, método que comprende:
Obtener liposomas exentos de colesterol que tienen al menos una bicapa lipídica,
Añadir los liposomas exentos de colesterol a una solución acuosa para formar una suspensión tal que sustancialmente no haya ningún potencial transmembrana a través de la al menos una bicapa lipídica, Añadir a la suspensión un fármaco hidrófobo en ausencia de un potenciador de la solubilidad para formar una mezcla, y
Agitar la mezcla durante 4 a 48 horas a temperatura ambiente,
Mediante el cual al menos el 80% del fármaco hidrófobo añadido se carga en el liposoma exento colesterol, en donde el fármaco hidrófobo es sirolimus, umirolimus o everolimus y en donde los liposomas exentos de colesterol tienen un diámetro de 80 nm a 2 pm y se obtienen formando vesículas multilaminares (MLVs) que contienen uno o más de palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC); y extruir las MLVs, obteniendo así los liposomas exentos de colesterol que tienen un diámetro de 50 nm a 2 pm.
9. El método según la reivindicación 8, en el que las MLVs también contienen diestearoilfosfatidiletanolamina conjugada con polietilenglicol (DSPE-PEG).
10. Un método para preparar un fármaco hidrófobo encapsulado en un liposoma exento de colesterol, método que comprende:
Suspender uno o más de palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) en un tampón acuoso para formar una suspensión de lípidos,
Agitar la suspensión de lípidos durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente para formar vesículas multilaminares (MLV),
Extruir las MLVs para formar grandes vesículas unilaminares (LUV) que tienen un diámetro de 50 nm a 2 pm, Añadir las LUVs a una solución acuosa para formar una suspensión de modo que no exista sustancialmente ningún potencial transmembrana a través de las LUVs,
Añadir un fármaco hidrófobo a la suspensión en ausencia de un potenciador de la solubilidad para formar una mezcla,
Agitar la mezcla durante 4 a 48 horas a temperatura ambiente para formar una suspensión de liposomas cargada con fármaco, y
Filtrar la suspensión de liposomas cargada con fármaco para eliminar el fármaco hidrófobo no encapsulado, Mediante el cual al menos el 80% del fármaco hidrófobo añadido se encapsula en los liposomas exentos de colesterol, en donde el fármaco hidrófobo es sirolimus, umirolimus o everolimus.
11. El método según la reivindicación 10, en el que la diestearoilfosfatidiletanolamina conjugada con polietilenglicol (DSPE-PEG) también se suspende en el tampón acuoso en la etapa de suspensión.
12. La formulación liposómica estable según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde preferiblemente la formulación liposómica estable inhibe el crecimiento de células cancerosas.
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