ES2846907T3

ES2846907T3 - Tiolasas modificadas que pueden producir compuestos ramificados y usos de las mismas

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Publication number: ES2846907T3
Application number: ES16826360T
Authority: ES
Inventors: Sanchez Vicente Bernal; Salas Pamela Torres; De Leon Antonio Morreale; Burgos Víctor Barrera; Barroso María Del Mar Gonzalez; Gallego Fernando Lopez; Badenas Federico Gago; Murcia Pedro Alejandro Sanchez
Original assignee: Repsol SA
Current assignee: Repsol SA
Priority date: 2015-12-29
Filing date: 2016-12-29
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2036-12-29
Also published as: WO2017114897A1; US20200270653A1; CN108699537A; EP3397758A1; MX2018008206A; EP3397758B1

Abstract

Una tiolasa mutante que puede catalizar la formación de un compuesto de fórmula (I) **(Ver fórmula)** mediante la condensación de un compuesto de fórmula (II) **(Ver fórmula)** con un compuesto de formula (III) **(Ver fórmula)** en donde R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C6 lineal o ramificado, alquenilo C2-C6 lineal o ramificado, alquinilo C2-C6 lineal o ramificado, arilo, aril-alquilo y bencilo, y S-CoA es coenzima A, teniendo dicha tiolasa mutante al menos una sustitución de un amino ácido en una posición correspondiente a la posición 293 en el polipéptido de SEQ ID NO: 1 en donde la tiolasa muestra al menos un 75% de identidad de secuencia con una tiolasa seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2 o 3, con la condición de que dicha tiolasa no sea una tiolasa que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. y donde dicha tiolasa mutante muestra una actividad tiolasa específica de al menos 0,05 mU/mg para la catálisis de un producto ramificado de fórmula (I) cuando el compuesto de fórmula (II) es butiril-CoA y el compuesto de fórmula (III) es acetil-CoA.

Description

DESCRIPCIÓN

Tiolasas modificadas que pueden producir compuestos ramificados y usos de las mismas

CAMPO TÉCNICO

La invención se refiere al campo de la bioingeniería y particularmente a enzimas con actividad tiolasa que pueden generar precursores de compuestos derivados ramificados en la posición 2 para uso industrial.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las tiolasas son una superfamilia de enzimas que catalizan la transferencia de un grupo acilo distinto de aminoácido (por ejemplo un acetilo) por medio de una reacción de condensación de Claisen para formar un enlace carbonocarbono. El tioéster de un residuo de cisteína presente en el centro activo de las mismas interviene en el mecanismo de reacción en todos los casos. Estas enzimas están implicadas en varias rutas metabólicas, incluyendo rutas tanto de biosíntesis (anabólicas) como de degradación (catabólicas) en organismos eucariotas y procariotas.

La superfamilia de tiolasas se ha clasificado en tres familias según la funcionalidad: (a) □-cetoacil:proteína portadora de acilo sintasas (KAS), (b) policétido sintasas (PKS) y (c) la familia de tiolasas de síntesis y de degradación. Los dos primeros grupos están implicados en el metabolismo de ácidos grasos y de policétidos complejo, respectivamente. Estos dos grupos de proteínas dependen principalmente de proteína portadora de acilo e implican procesos de carboxilación para la activación del sustrato.

El tercer grupo se divide en dos familias: tiolasas de biosíntesis (EC 2.3.1.9) y tiolasas de degradación (EC 2.3.1.16), aunque ambos grupos de enzimas pueden catalizar las reacciones tanto directas como inversas en condiciones específicas.

Aunque su especificidad de sustrato es diferente, la superfamilia de tiolasas conserva un mismo tipo de plegamiento de tiolasa, en el que cada monómero está formado por dos mitades similares que tienen un motivo PaPaPaPP de tipo intercalado. En cuanto a su estructura cuaternaria, habitualmente se organizan como dímeros o dímeros de dímeros en medio biológico. En el último caso, son dímeros de dímeros que interaccionan a través de cuatro bucles P6/P7, uno para cada monómero, y en los que las interacciones son principalmente interacciones de tipo hidrófobo.

Las enzimas que pertenecen a la familia de tiolasas tienen aproximadamente 400 residuos con un bucle extenso de aproximadamente 20 residuos que conecta dos dominios similares en los extremos N y C-terminales con plegamiento PaPaPaPP. Precisamente es esta región la que se pliega hacia fuera desde el centro activo, formando una gran parte del sitio de interacción con ligando. Los residuos catalíticamente relevantes en estas enzimas están ubicados en los bucles contiguos de las denominadas hélices a-3 de dominios N y C-terminales respectivos (una histidina y dos cisteínas).

El mecanismo de reacción de biosíntesis general aceptado para tiolasas consiste en dos etapas consecutivas en las que se genera un producto intermedio de acilcisteína covalente (Cys(Ac)) (esquema 1). Por tanto, en una primera etapa se transfiere un grupo acilo (acetilo si el sustrato 1 es acetil-CoA) a la cisteína catalítica (aceptor). En una segunda etapa se produce una etapa de condensación de Claisen entre esta cisteína catalítica y un nuevo sustrato 2 para obtener este sustrato 2 acetilado en la posición 2.

El centro activo de las tiolasas está formado por dos agujeros de oxianiones (I y II) en los que las cargas negativas generadas se estabilizan a lo largo de todo el ciclo catalítico.

En comparación con productos lineales, los productos ramificados sirven como base para obtener una nueva familia de compuestos de interés industrial. En particular, los productos ramificados muestran ventajas como biocombustibles en comparación con los homólogos lineales. Sin embargo, la mayoría de las tiolasas no pueden sintetizar productos ramificados.

Las secuencias proporcionadas en la base de datos GeneSeq con los números de acceso GSP: AXV25528 y GSP: AXV25529 y en la base de datos UniProt con el número de acceso A0A0N0XYH7 corresponden a tiolasas mutantes capaces de utilizar productos ramificados como sustratos.

Por tanto, existe la necesidad de proporcionar tiolasas que puedan sintetizar productos ramificados para producir derivados de interés en la industria.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la invención se refiere a una tiolasa mutante que puede catalizar la formación de un compuesto de fórmula (I)

mediante la condensación de un compuesto de fórmula (II)

con un compuesto de fórmula (III)

(III)

en las que Ri y R²se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C¹-C⁶lineal o ramificado, alquenilo C²-C⁶lineal o ramificado, alquinilo C²-C⁶lineal o ramificado, arilo, aril-alquilo y bencilo, y S-CoA es coenzima A,

teniendo dicha tiolasa mutante al menos una sustitución de un amino ácido en una posición correspondientes a la posición 293 en el polipéptido de SEQ ID NO: 1, donde la tiolasa muestra al menos un 75% de identidad de secuencia con una tiolasa seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, con la condición de que dicha tiolasa no sea una tiolasa que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, y donde dicha tiolasa mutante muestra una actividad tiolasa específica de al menos 0,05 mU/mg para la catálisis de un producto ramificado de fórmula (I) cuando el compuesto de fórmula (II) es butiril-CoA y el compuesto de fórmula (III) es acetilo-CoA.

En un segundo aspecto la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica para una tiolasa según el primer aspecto de la invención, o a un vector que comprende un ácido nucleico que codifica la tiolasa según el primer aspecto de la invención, o a una célula huésped que comprende un vector que comprende el ácido nucleico que codifica la tiolasa según el primer aspecto de la invención.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de un compuesto de fórmula (I) que comprende poner en contacto un compuesto de fórmula (II) y un compuesto de fórmula (III) en presencia de una tiolasa mutante que puede catalizar la formación de un compuesto de fórmula (I)

mediante la condensación de un compuesto de fórmula (II)

con un compuesto de fórmula (III)

teniendo dicha tiolasa mutante al menos una sustitución de un amino ácido con respecto a la tiolasa que se produce de manera natural, en el que dicha sustitución de amino ácido está localizada en una posición correspondiente a la posiciones 293 en el polipéptido de SEQ ID NO: 1; en donde dicha tiolasa tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con una tiolasa seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2 o 3 y muestra una actividad tiolasa específica de al menos 0,05mU/mg para la catálisis de un producto de fórmula (I) cuando el compuesto de fórmula (II) es butiril-CoA y el compuesto de fórmula (III) es acetil-CoA y

en el que dicha puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la condensación de compuestos de fórmula (II) y (III) para dar un compuesto de fórmula (I).

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS FIGURA 1: Alineación de secuencias de aminoácidos de tiolasas de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 1, Erg10), Flavobacterium bacteriaceae (SEQ ID NO: 5, FbThl), Thermus thermophilus (SEQ ID NO: 4, TtTlh), Ralstonia eutropha (SEQ ID NO. : 2, BktB) y Escherichia coli (SEQ ID NO: 3, AtoB). Las regiones altamente conservadas están marcadas con un asterisco; el colon indica conservación entre grupos de propiedades muy similares; período indica conservación entre grupos de propiedades débilmente similares. Se enmarcan los aminoácidos con un papel clave en el ciclo catalítico

FIGURA 2: (A) Rendimiento de la reacción de reducción de acetoacetil-CoA y 3-ceto-2-etilbutiril-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA (3HB-CoA) y 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA (3H2EB-CoA), respectivamente , en función de la concentración de PpFadB2 (SEQ ID NO: 6). (B) Efecto de la concentración de PpFadB2 sobre la estereoselectividad de la reacción de reducción (expresada como relación [Pico2]/[Pico1]) y sobre la producción del principal isómero 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA “Pico2” (expresado como [Pico2]/([Pico1]+[Pico2])100). A la concentración de proteína más baja analizada (0,0001 mg/ml), solo se detectó el isómero Pico2.

FIGURA 3: Espectro de RMN de 1H de 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA.

FIGURA 4: Análisis de la capacidad de condensación acetil-CoA/butiril-CoA de tiolasas de Ralstonia eutropha (BktB). Cromatograma de iones totales (TIC) de (a) la mezcla estándar, (b) BktB de tipo salvaje y (c) BktB_Var10. Leyenda de picos: 1: 3H2EB-CoA Peak 1; 2: Pico 2 de 3H2EB-CoA; 3: 3h HB-CoA.

FIGURA 5. Comparación de los rendimientos de producción de 3HB-CoA de tiolasas de Saccharomyces cerevisiae (Erg10), Flavobacterium bacteriaceae (FbThl), Thermus thermophilus (TtTlhl), Ralstonia eutropha (BktB), Escherichia coli (AtoB) y sus correspondientes Var10 (mutantes triples). Las reacciones se llevaron a cabo a 37°C en tampón MES 100 mM pH 6,0 usando tiolasa purificada y FadB2 a una concentración de 0,19 y 0,15 mg/ml, respectivamente. La formación del producto se analizó después de 1 h y se cuantificó mediante HPLC-MS. A) Rendimiento de 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA, B) Rendimiento de 3-hidroxihexanoil-CoA C) Rendimiento de 3-hidroxibutiril-CoA. D) Selectividad de producto de variantes de tiolasa en ensayos de condensación de acetil-CoA / butiril-CoA.

FIGURA 6. Comparación de variantes de tiolasa Erg10 de Saccharomyces cerevisiae. (SEQ ID NO: 1) Las reacciones se llevaron a cabo a 37°C en tampón MES 100 mM pH 6,0 usando tiolasa purificada y PpFadB2 a una concentración de 0,19 y 0,15 mg/ml, respectivamente. La formación del producto se analizó y cuantificó mediante HPLC-MS después de 1 h de incubación de reacción.

FIGURA 7. Rendimientos de producto de tiolasas de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 1, Erg10) modificada en la posición F293. Las reacciones se realizaron a 37°C en tampón MES 100 mM pH 6,0 utilizando tiolasas purificadas y PpFadB2 a una concentración de 0,19 y 0,15 mg/ml, respectivamente. La formación del producto se analizó y cuantificó mediante HPLC-MS después de 1 h de incubación de reacción. (A) 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA (el inserto representa la selectividad del producto de mutantes seleccionados), (B) 3-hidroxibutiril-CoA, (C) 3-hidroxihexanoil-CoA.

FIGURA 8. Evolución temporal de la formación del producto usando (a) Erg10_F293D y (b) Erg10_F293A como biocatalizador. Las reacciones se realizaron a 37°C en tampón MES 100 mM pH 6,0 utilizando tiolasas purificadas y PpFadB2 a una concentración de 0,1 y 0,15 mg / ml, respectivamente. La formación de producto se cuantificó mediante HPLC-MS.

FIGURA 9. A) Análisis LC-MS de 3-hidroxi-pentanoil-CoA estándar (arriba), control libre de enzima (medio) y muestra de reacción Erg10-F293A (abajo). B) Análisis de EM del pico 2 y del pico 3.

FIGURA 10. Análisis LC-MS del control sin enzima (arriba) y muestra de reacción Erg10-F293D (abajo). En el inserto, análisis de MS del pico 4.

FIGURA 11. Rendimiento del producto de condensación de acetil-CoA/acetil-CoA de variantes de tiolasa Erg10 de Saccharomyces cerevisiae modificada en la posición F293. Las reacciones se realizaron a 37°C en tampón MES 100 mM pH 6,0 utilizando tiolasas purificadas y PpFadB2 a una concentración de 0,19 y 0,15 mg/ml, respectivamente. La formación del producto se analizó y cuantificó mediante HPLC-MS después de 1 h de incubación de reacción. Los rendimientos del producto 3-hidroxibutiril-CoA se normalizaron en comparación con el rendimiento del producto de Erg10 de tipo salvaje.

FIGURA 12. Efecto de la relación acetil-CoA: butiril-CoA sobre el perfil de producto de la variante Erg10_F293D como biocatalizador después de 1 h de reacción. Las reacciones se realizaron a 37°C en tampón MES 100 mM pH 6,0 utilizando tiolasas purificadas y PpFadB2 a una concentración de 0,19 y 0,15 mg/ml, respectivamente. Formación de producto cuantificada por HPLC-MS.

FIGURA 13. Comparación de variantes de tiolasa BktB de Ralstonia eutropha (SEQ ID NO: 2) Las reacciones se llevaron a cabo a 37°C en tampón MES 100 mM pH 6,0 usando tiolasa purificada y PpFadB2 a una concentración de 0,19 y 0,15 mg/ml, respectivamente. La formación del producto se analizó y cuantificó mediante HPLC-MS después de 1 h de incubación de reacción.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los inventores de la presente invención han identificado mutaciones en enzimas tiolasa que mejoran su actividad de biosíntesis y, más particularmente, pueden generar productos ramificados.

Basándose en estos hallazgos, los inventores han desarrollado los procedimientos de la presente invención en sus diferentes realizaciones que se describirán ahora en detalle.

TIOLASAS MUTANTES DE LA INVENCIÓN

mediante la condensación de un compuesto de fórmula (II)

con un compuesto de fórmula (III)

teniendo dicha tiolasa mutante al menos una sustitución de un amino ácido en una posición correspondiente a la posición 293 en el polipéptido de SEQ ID NO: 1 donde la tiolasa muestra al menos un 75% de identidad de secuencia con una tiolasa seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2 o 3, con la condición de que dicha tiolasa no sea una tiolasa que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, y donde dicha tiolasa mutante muestra una actividad tiolasa específica de al menos 0,05 mU / mg para la catálisis de un producto ramificado de fórmula (I) cuando el compuesto de fórmula (II) es butiril-CoA y el compuesto de fórmula (III) es acetil-CoA.

Tal como se usa en el presente documento, el término “tiolasa” se refiere a polipéptidos que pueden condensar 2 moléculas que comprenden acetil-CoA (AcCoA) para proporcionar moléculas que comprenden acetoacetil-CoA. El término incluye tanto las tiolasas que catalizan de manera natural la condensación, por ejemplo, de 2 moléculas de acetil-CoA (tiolasas de biosíntesis, también conocidas como acetoacetil-CoA tiolasa o acetil-CoA acetiltransferasa, con número de EC 2.3.1.9) como las tiolasas que catalizan de manera natural la formación de acetil-CoA a partir de acetoacetil-CoA y coenzima A (tiolasas de degradación, también conocidas como 3-cetoacil-CoA tiolasas o 3-oxoacil-CoA tiolasas, con número de EC 2.3.1.16), pero que pueden catalizar tanto las reacciones directas como las inversas en condiciones adecuadas. Las tiolasas preferidas según la presente invención incluyen, sin limitación, acetoacetil-CoA tiolasa de Saccharomyces cerevisiae acetoacetil-CoA tiolasa (Erg10, SEQ ID NO: 1), Ralstonia eutropha acetil-CoA acetiltransferasa (BktB, SEQ ID NO: 2), Escherichia coli acetoacetil-CoA tiolasa (AtoB, SEQ ID NO: 3) y la Thermus thermophilus acetoacetil-CoA tiolasa (TtThl, SEQ ID NO: 4).

Tal como se usa en el presente documento, el término “mutante” se refiere a cualquier variante de una tiolasa tal como se definió anteriormente que puede condensar dos moléculas que comprenden acetil-coenzima A (AcCoA) (con butiril-coenzima A (BuCoA) dando lugar a la formación de 3-ceto-etilbutiril-CoA) y que se diferencia de acetoacetil-CoA tiolasa debido a la presencia de una adición, sustitución o deleción de uno o más aminoácidosy que muestra una identidad de secuencia con la tiolasa nativa que es de al menos 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más con respecto a cualquiera de las secuencias definidas como SEQ ID NO: 1 a 4. En una realización preferida, la identidad de secuencia se determina a lo largo de toda la longitud de la secuencia. El experto en la técnica aprecia que hay muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos secuencias. La alineación de secuencias óptima para comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos (por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software GCG Wisconsin), o mediante inspección visual (véase de manera general, Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley and Sons, Inc., (suplemento de 1995)). Ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410 yAltschul et al., 1977, Nucleic Acids Res. 3389 3402, respectivamente así como el algoritmo BLASTP (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J., 1990, Mol. Biol. 215:403-410). El software para realizar análisis de BLAST está disponible para el público a través del sitio web del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencias con alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que o bien coinciden o bien satisfacen alguna puntuación umbral de valor positivo, T, cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se denomina umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul et al, citado anteriormente). Estas coincidencias de palabra vecinas iniciales actúan como simientes para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largas que las contienen. Entonces se extienden las coincidencias de palabras en ambos sentidos a lo largo de cada secuencia hasta donde pueda aumentarse la puntuación de alineación acumulada. Las puntuaciones acumuladas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre >0) y N (puntuación de penalización para residuos que no coinciden; siempre <0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de las coincidencias de palabra en cada sentido se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulada disminuye en la cantidad X desde su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos con puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 89:10915). La determinación a modo de ejemplo de la alineación de secuencias y el porcentaje de identidad de secuencia puede emplear los programas BESTFIT o GAP en el paquete de software GCG Wisconsin (Accelrys, Madison WI), usando los parámetros por defecto proporcionados, o el programa de alineación múltiple (disponible del Swiss Institute of Bioinformatics, Lausanne, Suiza), usando, en algunas realizaciones, los siguientes parámetros.

Para los fines de la presente divulgación, en algunas realizaciones, el grado de porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede obtenerse mediante análisis de alineación múltiple, contando el número de coincidencias idénticas en la alineación y dividiendo tal número de coincidencias idénticas entre la longitud de la secuencia de referencia, y usando los siguientes parámetros por defecto para lograr alineaciones óptimas por parejas lentas/precisas; formato de salida: Clustal sin números; desalinear secuencias de entrada: No; árbol de guía de agrupación de tipo MBED: sí; número de iteraciones combinadas: por defecto (0); iteraciones de árbol de guía máximas: por defecto; iteraciones de HMM máximas: por defecto; orden: alineado.

El experto en la técnica entenderá que los mutantes según la presente invención que muestran una actividad tiolasa tal como de condensación de acetil-coenzima A (AcCoA) con butiril-coenzima A (BuCoA) pueden tener actividad reducida de condensación de acetil-CoA con respecto a secuencias nativas, de tal manera que los mutantes según la presente invención pueden tener una actividad tiolasa de condensación de acetil-CoA que es del 99%, el 98%, el 97%, el 96%, el 95%, el 94%, el 93%, el 92%, el 91%, el 90%, el 85%, el 80%, el 75%, el 70%, el 65%, el 60%, el 55%, el 50%, el 45%, el 40%, el 35%, el 30%, el 25%, el 20%, el 15%, el 10% o menos con respecto a la actividad tiolasa nativa.

Los mutantes de tiolasa según la presente invención tienen actividad tiolasa específica de condensación de compuestos de fórmulas (II) y (III) que es de al menos 0,01, al menos 0,05, al menos 0,1, la menos 0,5, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55, al menos 60, al menos 65, al menos 70, al menos 75, al menos 80, al menos 85, al menos 90, al menos 95 o al menos 100 mU/mg cuando se usan los compuestos de fórmula (II), preferiblemente butiril-coenzima A (BuCoA), y los compuestos de fórmula (III), preferiblemente acetil-CoA, como sustratos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “grupo alquilo C¹-C⁶” se refiere a un hidrocarburo no cíclico, saturado, de cadena lineal o ramificada, que tiene de 1 a 6 átomos de carbono. Los grupos alquilo C¹-C⁶lineales representativos incluyen, sin limitación, metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo; mientras que los grupos alquilo C¹-C⁶ramificados incluyen, sin limitación, isopropilo, sec-butilo, isobutilo, tere-butilo, isopentilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 2,3-dimetilbutilo, 2,2-dimetilbutilo, 3,3-dimetilbutilo y similares. Los grupos alquilo incluidos en esta invención pueden estar opcionalmente modificados con uno o más sustituyentes.

Tal como se usa en el presente documento, el término “grupo alquilo C²-C⁶” se refiere a un hidrocarburo no cíclico, saturado, de cadena lineal o ramificada, que tiene de 2 a 6 átomos de carbono. Los grupos alquilo C²-C⁶lineales representativos incluyen, sin limitación, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo; mientras que los grupos alquilo C²-C⁶ramificados incluyen, sin limitación, isopropilo, sec-butilo, isobutilo, tere-butilo, isopentilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 2,3-dimetilbutilo, 2,2-dimetilbutilo, 3,3-dimetilbutilo y similares. Los grupos alquilo incluidos en esta invención pueden estar opcionalmente modificados con uno o más sustituyentes.

Tal como se usa en el presente documento, el término “grupo alquenilo C²-C⁶” se refiere a un hidrocarburo acíclico, de cadena lineal o ramificada, que tiene de 2 a 6 átomos de carbono y al menos un doble enlace carbonocarbono. Los grupos alquenilo C²-C⁶lineales y ramificados representativos incluyen, sin limitación, vinilo, alilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-1-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo, 1-hexenilo, 2-hexenilo, 3-hexenilo y similares. Los grupos alquenilo pueden estar opcionalmente modificados con uno o más sustituyentes.

Tal como se usa en el presente documento, el término “grupo alquinilo C²-C⁶” se refiere a un hidrocarburo acíclico, de cadena lineal o ramificada, que tiene de 2 a 6 átomos de carbono y al menos un triple enlace carbonocarbono. Los grupos alquinilo C²-C⁶lineales y ramificados representativos incluyen, sin limitación, etinilo, propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo y similares.

“Arilo” se refiere a grupos hidrocarbonados aromáticos tales como fenilo, naftilo o antracilo. El grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más grupos tales como hidroxilo, mercapto, halo, alquilo, fenilo, alcoxilo, haloalquilo, nitro, ciano, carboxilo, amino, dialquilamino, aminoalquilo, acilo y alcoxicarbonilo.

Tal como se usa en el presente documento, “aril-alquilo” se define como un grupo alquilo tal como se definió anteriormente asociado con un grupo arilo tal como se definió anteriormente.

Tal como se usa en el presente documento, “bencilo” se define como el grupo -CH²-fenilo, en el que el grupo fenilo puede estar sustituido o no sustituido.

En una realización particular y preferida de la invención, R¹es un grupo etilo. En otra realización particular y preferida de la invención, R²es un grupo metilo.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “posición correspondiente a la posición X en el polipéptido Y” se refiere a una posición en la secuencia de tiolasa que coincide con la posición X cuando dicha secuencia de tiolasa se solapa con la secuencia de polipéptido Y en una alineación de secuencias múltiple que incluye la secuencia de tiolasa mutante, la secuencia de polipéptido Y y un número variable de secuencias. En una realización preferida, la alineación de secuencias múltiple está formada por las secuencias de tiolasa mencionadas anteriormente (secuencias que tienen SEQ ID NO: 1 a 4). En una realización preferida, la alineación de secuencias múltiple se lleva a cabo usando al menos 10 secuencias de tiolasa, al menos 15 secuencias, al menos 20 secuencias, al menos 25 secuencias o más. La alineación de secuencias múltiple puede obtenerse usando cualquier método convencional para ese fin tal como se mencionó anteriormente y tal como se muestra en el ejemplo 1 de la presente solicitud de patente. En una realización preferida, la alineación de secuencias múltiple se lleva a cabo por medio del algoritmo implementado en el programa CLUSTALW2 (Larkin et al., Bioinformatics, 2007, 23:2947-2948) usando parámetros convencionales (tipo de alineación: lenta; matriz: Gonnet; apertura de hueco: 10; extensión de hueco: 0,1; KTUP: 1; longitud de ventana: 5; tipo de puntuación: porcentaje; mejores diagonales: 5 y hueco por parejas: 3). En otra realización preferida, la alineación de secuencias múltiple se lleva a cabo por medio del algoritmo implementado en el programa CLUSTAL OMEGA (Sievers F. et al., Biology 7 Article number: 539 doi:10.1038/msb.2011.75) usando parámetros convencionales (algoritmo HHalign con parámetros por defecto y la matriz de transición por defecto es Gonnet con una penalización por apertura de hueco de 6 bits y por extensión de hueco de 1 bit).

Según la presente invención, la tiolasa mutante tiene al menos una mutación con respecto a la tiolasa que se produce de manera natural en la que dicha mutación está localizada en una posición correspondiente a la posición 293 en el polipéptido de SEQ ID NO: 1 con la condición de que dicha tiolasa no sea una tiolasa que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

En una realización particular de la invención, la secuencia en dicha tiolasa correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00098 en la base de datos Prosite tiene una identidad de al menos el 35% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma en la tiolasa de SEQ ID NO: 1, la secuencia en dicha tiolasa correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00737 en la base de datos Prosite tiene una identidad de al menos el 50% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma en la tiolasa de SEQ ID NO: 1 y/o la secuencia en dicha tiolasa correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00099 en la base de datos Prosite tiene una identidad de al menos el 25% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma en la tiolasa de SEQ ID NO: 1.

La expresión “la secuencia en dicha tiolasa correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro X en la base de datos Prosite” se refiere a la secuencia de la tiolasa de la invención que coincide con la firma X en la base de datos Prosite en una alineación de secuencias que incluye la secuencia de tiolasa mutante de la invención (es decir la tiolasa que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1-4) y la firma que tiene el número de registro X en la base de datos Prosite. La identidad de secuencia puede determinarse usando cualquier algoritmo adecuado disponible para alinear dos secuencias anteriormente detallado.

La firma que tiene el número de registro PS00098 es una firma de tiolasa conservada que tiene el siguiente patrón consenso: [LIVM]-[NST]-{T}-x-C-[SAGLI]-[ST]-[SAG]-[LIVMFYNS]-x-[STAG]-[LIVM]-x(6)-[LIVM]. La secuencia correspondiente a la firma que tiene el número de registro PS00098 en la base de datos Prosite se encuentra en el polipéptido de SEQ ID NO: 1 en las posiciones 87 a 105 y corresponde a la subsecuencia

VNKVCASAMKAIILGAQSI

La firma que tiene el número de registro PS00737 es una firma de tiolasa conservada que tiene el siguiente patrón consenso: N-x(2)-G-G-x-[LIVM]-[SA]-x-G-H-P-x-[GAS]-x-[ST]-G. La secuencia correspondiente a la firma que tiene el número de registro PS00737 en la base de datos Prosite se encuentra en el polipéptido de SEQ ID NO: 1 en las posiciones 344 a 360 y corresponde a la subsecuencia

NVYGGAVALGHPLGCSG

La firma que tiene el número de registro PS00099 es una firma de tiolasa conservada que tiene el siguiente patrón consenso: [AG]-[LIVMA]-[STAGCLIVM]-[STAG]-[LIVMA]-C-{Q}-[AG]-x-[AG]-x-[AG]-x-[SAG] La secuencia correspondiente a la firma que tiene el número de registro PS00099 en la base de datos Prosite se encuentra en el polipéptido de SEQ ID NO: 1 en las posiciones 379 a 392 y corresponde a la subsecuencia

GVAAICNGGGGASS

Por tanto, según esta realización, la secuencia en la tiolasa de la invención correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00098 en la base de datos Prosite tiene una identidad de al menos el 35% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma de tiolasa de SEQ ID NO: 1. En una realización más particular, la secuencia en la tiolasa de la invención correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00098 en la base de datos Prosite tiene una identidad de al menos el 40% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma de tiolasa de SEQ ID NO: 1. En otra realización particular, dicha identidad es de al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 99% o al menos el 100%. En una realización preferida, dicha secuencia de la tiolasa de la invención correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00098 en la base de datos Prosite tiene una identidad de aproximadamente el 37% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma de tiolasa de SEQ ID NO: 1. En otra realización preferida, dicha secuencia de la tiolasa de la invención correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00098 en la base de datos Prosite tiene una identidad de aproximadamente el 47% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma de tiolasa de SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, dicha secuencia de la tiolasa de la invención correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00098 en la base de datos Prosite tiene una identidad de aproximadamente el 58% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma de tiolasa de SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, dicha secuencia de la tiolasa de la invención correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00098 en la base de datos Prosite tiene una identidad de aproximadamente el 63% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma de tiolasa de SEQ ID NO: 1.

Alternativa o adicionalmente, la secuencia de la tiolasa de la invención correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00737 en la base de datos Prosite tiene una identidad de al menos el 50% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma de tiolasa de SEQ ID NO: 1. Dicha firma que tiene el número de registro PS00737 es una firma de tiolasa conservada que tiene el siguiente patrón consenso: N-x(2)-G-G-x-[LIVM]-[SA]-x-G-H-P-x-[GAS]-x-[ST]-G. En una realización más particular, dicha secuencia de la tiolasa de la invención correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00737 en la base de datos Prosite tiene una identidad de al menos el 55% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma de tiolasa de SEQ ID NO: 1. En otra realización particular, dicha identidad es de al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 99% o al menos el 100%. En una realización preferida, dicha secuencia de la tiolasa de la invención correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00737 en la base de datos Prosite tiene una identidad de aproximadamente el 55% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma de tiolasa de SEQ ID NO: 1. En otra realización preferida, dicha secuencia de la tiolasa de la invención correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00737 en la base de datos Prosite tiene una identidad de aproximadamente el 76% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma de tiolasa de SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, dicha secuencia de la tiolasa de la invención correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00737 en la base de datos Prosite tiene una identidad de aproximadamente el 82% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma de tiolasa de SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, dicha secuencia de la tiolasa de la invención correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00737 en la base de datos Prosite tiene una identidad de aproximadamente el 86% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma de tiolasa de SEQ ID NO: 1.

Alternativa o adicionalmente, la secuencia de la tiolasa de la invención correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00099 en la base de datos Prosite tiene una identidad de al menos el 25% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma de tiolasa de SEQ ID NO: 1. Dicha firma es una firma de tiolasa conservada que tiene el siguiente patrón consenso: [AG]-[LIVMA]-[STAGCLIVM]-[STAG]-[LIVMA]-C-{Q}-[AG]-x-[AG]-x-[AG]-x-[SAG]. En una realización más particular, dicha secuencia de la tiolasa de la invención correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00099 en la base de datos Prosite tiene una identidad de al menos el 30% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma de tiolasa de SEQ ID NO: 1. En otra realización particular, dicha identidad es de al menos al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 99% o al menos el 100%. En una realización preferida, dicha secuencia de la tiolasa de la invención correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00099 en la base de datos Prosite tiene una identidad de aproximadamente el 35% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma de tiolasa de SEQ ID NO: 1. En otra realización preferida, dicha secuencia de la tiolasa de la invención correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00099 en la base de datos Prosite tiene una identidad de aproximadamente el 42% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma de tiolasa de SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, dicha secuencia de la tiolasa de la invención correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00099 en la base de datos Prosite tiene una identidad de aproximadamente el 82% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma de tiolasa de SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, dicha secuencia de la tiolasa de la invención correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00099 en la base de datos Prosite tiene una identidad de aproximadamente el 92% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma de tiolasa de SEQ ID NO: 1.

En una realización, la tiolasa mutante se selecciona del grupo que consiste en:

(i) El polipéptido de SEQ ID NO: 1, en el que al menos una mutación está localizada en la posición Phe293; (ii) El polipéptido de SEQ ID NO: 2 en el que al menos una mutación está localizada en la posición Met290, (iii) El polipéptido de SEQ ID NO: 3, en el que al menos una mutación está localizada en la posición Met289.

En otra realización, la tiolasa mutante se selecciona del grupo que consiste en:

(i) El polipéptido de SEQ ID NO: 1, en el que el residuo en la posición 293 no es Phe;

(ii) El polipéptido de SEQ ID NO: 2 en el que el residuo en la posición 290 no es Met,

(iii) El polipéptido de SEQ ID NO: 3, en el que el residuo en la posición 289 no es Met.

En otra realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1 en el que la al menos una mutación localiza en la posición Phe293 se selecciona del grupo que consiste en Phe293Asp, Phe293Ala, Phe293Ser, Phe293Gly y Phe293Glu.

En otra realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 2 en el que la al menos una mutación en la posición Met290 se selecciona del grupo que consiste en Met290Asp, Met290Ala, Met290Ser, Met290Gly y Met290Glu.

En otra realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 3, en el que al menos una mutación localizada en la posición Met289 se selecciona del grupo que consiste en Met289Asp, Met289Ala, Met289Ser, Met289Gly y Met289Glu.

En otra divulgación, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 4 en el que al menos una mutación localizada en la posición Met294 se selecciona del grupo que consiste en Met294Asp, Met294Ala, Met294Ser, Met294Gly y Met294Glu.

En otra realización, la tiolasa según la invención comprende además al menos una mutación adicional en una posición seleccionada del grupo que consiste en los residuos correspondientes a las posiciones 90 y 383 en el polipéptido de SEQ ID NO: 1.

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1, que contiene mutaciones en las posiciones Val90 y Phe293.

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1, que contiene mutaciones en las posiciones Phe293 e Ile383.

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1, que contiene mutaciones en las posiciones Val90, Phe293 e Ile383.

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1, que contiene mutaciones en las posiciones Val90 y Phe293, donde las mutaciones son tales que el aminoácido en la posición 90 no es Val y el aminoácido en la posición 293 no es Phe.

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1, que contiene mutaciones en las posiciones Phe293 e Ile383, en donde las mutaciones son tales que el aminoácido en la posición 293 no es Phe y el aminoácido en la posición 383 no lo es. Ile.

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1, que contiene mutaciones en las posiciones Val90, Phe293 e Ile383, donde las mutaciones son tales que el aminoácido en la posición 90 no es Val, el aminoácido en la posición 293 no es Phe y el aminoácido en la posición 383 no es Ile.

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1, que contiene mutaciones en las posiciones Val90 y Phe293, en donde la mutación localizada en la posición Phe293 se selecciona del grupo que consiste en Phe293Asp, Phe293Ala, Phe293Ser, Phe293Gly y Phe293Glu y / o en el que la mutación localizada en la posición Val90 es una mutación V90I.

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1, que contiene mutaciones en las posiciones Phe293 e Ile383 donde la mutación localizada en la posición Phe293 se selecciona del grupo que consiste en Phe293Asp, Phe293Ala, Phe293Ser, Phe293Gly y Phe293Glu y/o en el que la mutación localizada en la posición Ile383 es una mutación I383V.

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1, que contiene mutaciones en las posiciones Val90, Phe293 e Ile383, donde la mutación localizada en la posición Phe293 se selecciona del grupo que consiste en Phe293Asp, Phe293Ala, Phe293Ser, Phe293Gly y Phe293Glu , en donde la mutación localizada en la posición Val90 es una mutación V90I y / o en donde la mutación localizada en la posición Ile383 es una mutación I383V.

(i) El polipéptido de SEQ ID NO: 1 que contiene las mutaciones V90I y F293A,

(ii) El polipéptido de SEQ ID NO: 1 que contiene las mutaciones V90I y F293D,

(iii) El polipéptido de SEQ ID NO: 1 que contiene las mutaciones F293A e I383V,

(iv) El polipéptido de SEQ ID NO: 1 que contiene las mutaciones F293D e I383V,

(v) El polipéptido de SEQ ID NO: 1 que contiene las mutaciones V90I, F293D e I383V y

(vi) El polipéptido de SEQ ID NO: 1 que contiene las mutaciones V90I, F293A e I383V.

En otra realización, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 2 que contiene mutaciones en las posiciones Leu89 y Met290.

En otra realización, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 2 que contiene mutaciones en las posiciones Met290 y Met379.

En otra realización, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 2 que contiene mutaciones en las posiciones Leu89, Met290 y Met379.

En otra realización, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 2 que contiene mutaciones en las posiciones Leu89 y Met290, donde la mutación es tal que el aminoácido en la posición 89 no es Leu y / o el aminoácido en la posición 290 no es Met.

En otra realización, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 2 que contiene mutaciones en las posiciones Met290 y Met379, donde la mutación es tal que el aminoácido en la posición 290 no es Met y el aminoácido en la posición 379 no es Met.

En otra realización, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 2 que contiene mutaciones en las posiciones Leu89, Met290 y Met379, en donde la mutación es tal que el aminoácido en la posición 89 no es Leu, el aminoácido en la posición 290 no es Met y / o el aminoácido en la posición 379 no es Met.

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 2, que contiene mutaciones en las posiciones Leu89 y Met290, en donde la mutación localizada en la posición Met290 se selecciona del grupo que consiste en Met290Asp, Met290Ala, Met290Ser, Met290Gly y Met290Glu y / o la mutación en la posición Leu89 es una mutación L89I.

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 2, que contiene mutaciones en las posiciones Met290 y Met379, en donde la mutación localizada en la posición Met290 se selecciona del grupo que consiste en Met290Asp, Met290Ala, Met290Ser, Met290Gly y Met290Glu y / o la mutación en la posición Met379 es una mutación Met379Val.

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 2, que contiene mutaciones en las posiciones Leu89, Met290 y Met379, en donde la mutación localizada en la posición Met290 se selecciona del grupo que consiste en Met290Asp, Met290Ala, Met290Ser, Met290Gly y Met290Glu , la mutación en la posición Leu89 es una mutación Leu89Ile y / o la mutación en la posición Met379 es una mutación Met379Val.

En otra realización, la tiolasa mutante se selecciona del grupo que consiste en

(i) El polipéptido de SEQ ID NO: 2 que contiene las mutaciones L89I y M290A,

(ii) El polipéptido de SEQ ID NO: 2 que contiene las mutaciones L89I y M290D,

(iii) El polipéptido de SEQ ID NO: 2 que contiene las mutaciones M290d y M379V,

(iv) El polipéptido de SEQ ID NO: 2 que contiene las mutaciones M290A y M379V,

(v) El polipéptido de SEQ ID NO: 2 que contiene las mutaciones L89I, M290A y M379V y

(vi) El polipéptido de SEQ ID NO: 2 que contiene las mutaciones L89I, M290D y M379V.

En otra realización, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 3 que contiene mutaciones en las posiciones Val87 y Met289.

En otra realización, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 3 que contiene mutaciones en las posiciones Met289 y Leu378.

En otra realización, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 3 que contiene mutaciones en las posiciones Val87, Met289 y Leu378.

En otra realización, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 3 que contiene mutaciones en las posiciones Val87 y Met289, en donde la mutación es tal que el aminoácido en la posición 87 no es Val y / o el aminoácido en la posición 289 no lo es Met.

En otra realización, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 3 que contiene mutaciones en las posiciones Met289 y Leu378, en donde la mutación es tal que el aminoácido en la posición 289 no es Met y el aminoácido en la posición 378 no es Leu.

En otra realización, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 3 que contiene mutaciones en las posiciones Val87, Met289 y Met379, donde la mutación es tal que el aminoácido en la posición 87 no es Val, el aminoácido en la posición 289 no es Met y / o el aminoácido en la posición 379 no es Met.

En otra realización, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 3 que contiene mutaciones en las posiciones Val87 y Met289, en donde la mutación en la posición 289 es Met289Asp, Met289Ala, Met289Ser, Met289Gly y Met289Glu y / o donde la mutación en la posición Val87 es una mutación Val87Ile.

En otra realización, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 3 que contiene mutaciones en las posiciones Met289 y Leu378 donde la mutación en la posición 289 es Met289Asp, Met289Ala, Met289Ser, Met289Gly y Met289Glu y / o donde la mutación en la posición Leu378 es una Mutación Leu378Val.

En otra realización, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 3 que contiene mutaciones en las posiciones Val87, Met289 y Leu378, donde la mutación en la posición 289 es Met289Asp, Met289Ala, Met289Ser, Met289Gly y Met289Glu, donde la mutación en la posición Val87 es una mutación Val87Ile y en la que la mutación en la posición Leu378 es una mutación Leu378Val.

(i) El polipéptido de SEQ ID NO: 3 que contiene las mutaciones V87I, M289A y L378V y

(ii) el polipéptido de SEQ ID NO: 3 que contiene las mutaciones V87I, M289D y L378V.

En otra divulgación, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 4 que contiene mutaciones en las posiciones Leu88 y Met294.

En otra divulgación, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 4 que contiene mutaciones en las posiciones Met294 y Met385.

En otra divulgación, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 4 que contiene mutaciones en las posiciones Leu88, Met294 y Met385.

En otra divulgación, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 4 que contiene mutaciones en las posiciones Leu88 y Met294, donde la mutación es tal que el aminoácido en la posición 88 no es Leu y / o el aminoácido en la posición 294 no es Met.

En otra divulgación, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 4 que contiene mutaciones en las posiciones Met294 y Met385, en donde la mutación es tal que el aminoácido en la posición 294 no es Met y el aminoácido en la posición 385 no es Met.

En otra divulgación, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 4 que contiene mutaciones en las posiciones Leu88, Met294 y Met385, en donde la mutación es tal que el aminoácido en la posición 88 no es Leu, el aminoácido en la posición 294 no es Met y el aminoácido en la posición 385 no es Met.

En otra divulgación, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 4 que contiene mutaciones en las posiciones Leu88 y Met294, donde la mutación localizada en la posición Met294 se selecciona del grupo que consiste en Met294Asp, Met294Ala, Met294Ser, Met294Gly y Met294Glu y / o la mutación localizada en la posición Leu88 es una mutación Leu88Ile.

En otra divulgación, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 4 que contiene mutaciones en las posiciones Met294 y Met385, donde la mutación localizada en la posición Met294 se selecciona del grupo que consiste en Met294Asp, Met294Ala, Met294Ser, Met294Gly y Met294Glu y / o la mutación localizada en la posición Met385 es una mutación Met385Val.

En otra descripción, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 4 que contiene mutaciones en las posiciones Leu88, Met294 y Met385, en donde la mutación localizada en la posición Met294 se selecciona del grupo que consiste en Met294Asp, Met294Ala, Met294Ser, Met294Gly y Met294Glu , la mutación localizada en la posición Leu88 es una mutación Leu88Ile y / o la mutación localizada en la posición Met385 es una mutación Met385Val.

En otra divulgación, la tiolasa mutante se selecciona del grupo que consiste en

(i) El polipéptido de SEQ ID NO: 4 que contiene las mutaciones L88I, M294A y M385V,

(ii) El polipéptido de SEQ ID NO: 4 que contiene las mutaciones L88I, M294D y M385V.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica para una tiolasa según el primer aspecto de la invención o a un vector que comprende un ácido nucleico que codifica la tiolasa según el primer aspecto de la invención, o a una célula huésped que comprende el vector que comprende el ácido nucleico que codifica la tiolasa según el primer aspecto de la invención.

El término “ácido nucleico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma o bien mono o bien bicatenaria y, a menos que se limite de otro modo, abarca nucleótidos naturales y análogos de nucleótidos naturales que se hibridan con ácidos nucleicos de una manera similar a los nucleótidos que se producen de manera natural. El término “nucleótido” incluye, pero no se

limita a, un monómero que incluye una base (tal como una pirimidina, purina o análogos sintéticos de las mismas) unida a un azúcar (tal como ribosa, desoxirribosa o análogos sintéticos de las mismas), o una base unida a un aminoácido, como en un ácido nucleico peptídico (ANP). Un nucleótido es un monómero en un oligonucleótido o en un polinucleótido. Una “secuencia de nucleótidos” o “secuencia de ácido nucleico” se refiere a la secuencia de bases en un oligonucleótido o en un polinucleótido.

El término polinucleótido se refiere a una secuencia de al menos 10 nucleótidos, preferiblemente al menos 16 nucleótidos, preferiblemente al menos 20 nucleótidos, preferiblemente al menos 25 nucleótidos, preferiblemente al menos 100 nucleótidos o más, incluyendo tanto polirribonucleótidos como polidesoxirribonucleótidos o combinaciones de los mismos. El término “oligonucleótido” también se refiere a moléculas formadas por nucleótidos convencionales unidos mediante enlaces fosfodiéster convencionales así como a variantes de las mismas, incluyendo modificaciones en los residuos de purina o pirimidina y modificaciones en los residuos de ribosa o desoxirribosa diseñadas para aumentar la estabilidad biológica del oligonucleótido o para estabilizar la estabilidad física de la estructura con forma de horquilla. Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, nucleótidos que tienen en la posición 2' del azúcar un sustituyente seleccionado del grupo fluoro, hidroxilo, amino, azido, alquilo, alcoxilo, alcoxialquilo, metilo, etilo, propilo, butilo o un grupo alquilo funcionalizado tal como etilamino, propilamino y butilamino. Alternativamente, el grupo alcoxilo es metoxilo, etoxilo, propoxilo o un grupo alcoxilo funcionalizado según la fórmula -O(CH²)q-R, en la que q es de 2 a 4 y R es un grupo amino, metoxilo o etoxilo. Grupos alcoxialquilo adecuados son metoxietilo y etoxietilo. Oligonucleótidos en los que diferentes nucleótidos contienen diferentes modificaciones en la posición 2' también forman parte de la invención. Alternativa o adicionalmente, los oligonucleótidos de la invención pueden contener enlaces modificados tales como enlaces de tipo fosfodiéster, fosfotriéster, fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforamidato, metilfosfonato, boranofosfonato así como combinaciones de los mismos, o son ácidos nucleicos peptídicos (ANP), en los que los diferentes nucleótidos están unidos mediante enlaces amida.

El término “vector”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un constructo que puede suministrar, y preferiblemente expresar adicionalmente, uno o más polinucleótidos de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores de plásmido, cósmido o fago, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y determinadas células eucariotas, tales como células productoras. Este término también se refiere a constructos de direccionamiento que permiten la integración aleatoria o dirigida al sitio del constructo de direccionamiento en ADN genómico. Tales constructos de direccionamiento, comprenden, preferiblemente, ADN de longitud suficiente o bien para recombinación homóloga o bien para integración heteróloga.

La transformación de una célula huésped con ADN recombinante puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales que conocen bien los expertos habituales en la técnica. Cuando el huésped es procariota, tal como E. coli, pueden prepararse células competentes que pueden captar ADN a partir de células recogidas tras la fase de crecimiento exponencial y posteriormente tratadas mediante el método de CaCl²usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, puede usarse MgCh o RbCl. También puede realizarse la transformación tras formar un protoplasto de la célula huésped si se desea, o mediante electroporación.

Cuando el huésped es un eucariota, pueden usarse métodos de transfección de ADN tales como coprecipitados de fosfato de calcio, procedimientos mecánicos convencionales tales como microinyección, electroporación, inserción de un plásmido encerrado en liposomas, o vectores virales. También pueden transformarse conjuntamente células eucariotas con secuencias de polinucleótido que codifican para la tiolasa mutante de la invención, y una segunda molécula de ADN foráneo que codifica para un fenotipo seleccionable, tal como el gen de timidina cinasa del herpes simple. Otro método es usar un vector viral eucariota, tal como virus del simio 40 (VS40) o virus del papiloma bovino, para infectar o transformar de manera transitoria células eucariotas y expresar la proteína. Véase Gluzman Y, Ed., “Eukaryotic Viral Vectors” (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EE.UU., 1982).

PROCEDIMIENTO IN VITRO PARA LA PRODUCCIÓN DEL COMPUESTO DE FÓRMULA (I)

En un tercer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento, a continuación en el presente documento “el primer procedimiento de la invención”, para la producción de un compuesto de fórmula (I) que comprende poner en contacto un compuesto de fórmula (II) y un compuesto de fórmula (III) en presencia de una tiolasa mutante que puede catalizar la formación de un compuesto de fórmula (I)

mediante la condensación de un compuesto de fórmula (II)

con un compuesto de fórmula (III)

en las que R¹y R²se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C¹-C⁶lineal o ramificado, alquenilo C²-C⁶lineal o ramificado, alquinilo C²-C⁶lineal o ramificado, arilo, aril-alquilo y bencilo, y S-CoA es coenzima A,

teniendo dicha tiolasa mutante al menos una sustitución de un amino ácido con respecto a la tiolasa que se produce de manera natural, en el que dicha sustitución de amino ácido está localizada en una posición correspondiente a la posición 293 en el polipéptido de SEQ ID NO: 1, en el que dicha tiolasa tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con una tiolasa seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 1, 2 o 3 y muestra una actividad tiolasa específica de al menos 0,05 mU / mg para la catálisis de un producto ramificado de fórmula (I) cuando el compuesto de fórmula (II) es butiril-CoA y el compuesto de fórmula (III) es acetil-CoA y

Los términos “mutante”, “tiolasa”, “compuesto de fórmula I”, “compuesto de fórmula II” y “compuesto de fórmula III” y sus características particulares se definieron en el contexto de la primera realización de la invención.

En una realización particular del primer procedimiento de la invención, la secuencia en dicha tiolasa correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00098 en la base de datos Prosite tiene una identidad de al menos el 35% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma en la tiolasa de SEQ ID NO: 1, la secuencia en dicha tiolasa correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00737 en la base de datos Prosite tiene una identidad de al menos el 50% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma en la tiolasa de SEQ ID NO: 1 y/o la secuencia en dicha tiolasa correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00099 en la base de datos Prosite tiene una identidad de al menos el 25% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma en la tiolasa de SEQ ID NO: 1.

(i) El polipéptido de SEQ ID NO: 1, en el que al menos una mutación está localizada en la posición Phe293; (ii) El polipéptido de SEQ ID NO: 2 en el que al menos una mutación está localizada en la posición Met290, (iii) El polipéptido de SEQ ID NO: 3, en el que al menos una mutación está localizada en la posición Met289. En otra realización, la tiolasa mutante se selecciona del grupo que consiste en:

En otra realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1 en el que la al menos una mutación localizada en la posición Phe293 se selecciona del grupo que consiste en Phe293Asp, Phe293Ala, Phe293Ser, Phe293Gly y Phe293Glu.

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1, que contiene mutaciones en las posiciones Val90, Phe293 e Ile383

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1, que contiene mutaciones en las posiciones Val90 y Phe293, donde las mutaciones son tales que el aminoácido en la posición 90 no es Val y el aminoácido en la posición 293 no es Phe. .

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1, que contiene mutaciones en las posiciones Val90, Phe293 e Ile383, donde las mutaciones son tales que el aminoácido en la posición 90 no es Val, el aminoácido en la posición 293 es no es Phe y el aminoácido en la posición 383 no es Ile.

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1, que contiene mutaciones en las posiciones Val90 y Phe293, en donde la mutación localizada en la posición Phe293 se selecciona del grupo que consiste en Phe293Asp, Phe293Ala, Phe293Ser, Phe293Gly y Phe293Glu y / o en donde la mutación localizada en la posición Val90 es una mutación Val90Ile.

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1, que contiene mutaciones en las posiciones Phe293 e Ile383 donde la mutación localizada en la posición Phe293 se selecciona del grupo que consiste en Phe293Asp, Phe293Ala, Phe293Ser, Phe293Gly y Phe293Glu y/o en el que la mutación localizada en la posición Ile383 es una mutación leI383Val.

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1, que contiene mutaciones en las posiciones Val90, Phe293 e Ile383, donde la mutación localizada en la posición Phe293 se selecciona del grupo que consiste en Phe293Asp, Phe293Ala, Phe293Ser, Phe293Gly y Phe293Glu. , donde la mutación localizada en la posición Val90 es una mutación Val90Ile y / o donde la mutación localizada en la posición Ile383 es una mutación Ile383Val. En otra realización, la tiolasa mutante se selecciona del grupo que consiste en:

(i) El polipéptido de SEQ ID NO: 1 que contiene las mutaciones V90I y F293A,

(ii) El polipéptido de SEQ ID NO: 1 que contiene las mutaciones V90I y F293D,

(iv) El polipéptido de SEQ ID NO: 1 que contiene las mutaciones F293D e I383V,

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 2 que contiene mutaciones en las posiciones Leu89 y Met290, en donde la mutación localizada en la posición Met290 se selecciona del grupo que consiste en Met290Asp, Met290Ala, Met290Ser, Met290Gly y Met290Glu y / o la mutación en la posición Leu89 es una mutación Leu89Ile.

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 2 que contiene mutaciones en las posiciones Met290 y Met379, en donde la mutación localizada en la posición Met290 se selecciona del grupo que consiste en Met290Asp, Met290Ala, Met290Ser, Met290Gly y Met290Glu y / o la mutación en la posición Met379 es una mutación Met379Val.

En una realización, la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 2 que contiene mutaciones en las posiciones Leu89, Met290 y Met379, en donde la mutación localizada en la posición Met290 se selecciona del grupo que consiste en Met290Asp, Met290Ala, Met290Ser, Met290Gly y Met290Glu , la mutación en la posición Leu89 es una mutación Leu89Ile y / o la mutación en la posición Met379 es una mutación Met379Val.

(i) El polipéptido de SEQ ID NO: 2 que contiene las mutaciones L89I y M290A,

(ii) El polipéptido de SEQ ID NO: 2 que contiene las mutaciones L89I y M290D,

(iii) El polipéptido de SEQ ID NO: 2 que contiene las mutaciones M290^dy M379V,

(iv) El polipéptido de SEQ ID NO: 2 que contiene las mutaciones M290A y M379V,

En otra realización, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 3 que contiene mutaciones en las posiciones Val87 y Met289, en donde la mutación es tal que el aminoácido en la posición 87 no es Val y / o el aminoácido en la posición 289 no lo es. Met.

En otra divulgación, la tiolasa mutante es la tiolasa de SEQ ID NO: 4 que contiene mutaciones en las posiciones Leu88, Met294 y Met385, en la que la mutación localizada en la posición Met294 se selecciona del grupo que consiste en Met294Asp, Met294Ala, Met294Ser, Met294Gly y Met294Glu, la mutación localizadaa en la posición Leu88 es una mutación L88I y / o la mutación localizada en la posición Met385 es una mutación Met385Val.

En otra divulgación, la tiolasa mutante se selecciona del grupo que consiste en:

La expresión “poner en contacto un compuesto de fórmula (II) y un compuesto de fórmula (III) en presencia de una tiolasa”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la incubación de dicha tiolasa y dichos compuestos de fórmula (II) y (III) para la interacción entre dichos compuestos y dicha tiolasa; conduciendo así a la formación del compuesto de fórmula (I).

Las condiciones requeridas para que la tiolasa condense el compuesto de fórmula (II) y el compuesto de fórmula (III) produciendo el compuesto de fórmula (I) incluyen una razón apropiada entre la tiolasa y los sustratos en cuanto a la concentración y condiciones apropiadas de sales, cofactores, pH y temperatura así como un tiempo de reacción apropiado.

Las condiciones de sales adecuadas para llevar a cabo el primer procedimiento según la invención incluyen, sin limitación, cualquier tampón comúnmente conocido tal como tampón fosfato, un tampón bicarbonato, un tampón carbonato, un tampón Tris, un tampón borato, un tampón succinato, un tampón histidina, un tampón citrato o un tampón ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) a concentraciones de al menos 10 mM, al menos 20 mM, al menos 30 mM, al menos 40 mM, al menos 50 mM, al menos 60 mM, al menos 70 mM, al menos 80 mM, al menos 90 mM, al menos 100 mM, al menos 200 mM, al menos 300 mM o más. En una realización preferida, el procedimiento según la presente invención se lleva a cabo en tampón MES 100 mM.

Los valores de pH adecuados para llevar a cabo el primer procedimiento según la invención incluyen, sin limitación, valores de 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9 y 9,5. En una realización preferida, el procedimiento se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 6.

Las condiciones de temperatura adecuadas para llevar a cabo el primer procedimiento según la invención incluyen, sin limitación, aproximadamente 20°C, aproximadamente 25°C, aproximadamente 30°C, aproximadamente 35°C, aproximadamente 37°C. En una realización preferida, el procedimiento se lleva a cabo a 37°C.

Los tiempos de reacción adecuados para llevar a cabo el procedimiento según la invención incluyen, sin limitación, al menos 1 ms, al menos 1 s, al menos 15 s, al menos 30 s, al menos 1 min, al menos 2 min, al menos 3 min, al menos 4 min, al menos 5 min, al menos 6 min, al menos 7 min, al menos 8 min, al menos 9 min, al menos 10 min, al menos 15 min, al menos 20 min, al menos 25 min, al menos 30 min, al menos 35 min, al menos 40 min, al menos 45 min, al menos 50 min, al menos 55 min, al menos 1 h, al menos 2 h, al menos 3 h, al menos 4 h, al menos 5 h, al menos 6 h, al menos 7 h, al menos 8 h, al menos 9 h, al menos 10 h o más. En una realización preferida, el tiempo de reacción es de 1 hora.

La relación de concentración de los compuestos (II) y (III) en el primer proceso según la invención no es particularmente limitante. En consecuencia, las proporciones adecuadas de la concentración de compuestos (II) a compuestos (III) son 1000:1, 500:1, 100:1, 50:1, 40:1, 30:1,20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1: 3, 1:4, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:100, 1:500 o 1:1000. En una realización, ambos compuestos se utilizan a concentraciones equimolares.

Las concentraciones adecuadas de los compuestos (II) y (III) incluyen, sin limitación, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 20 nM, aproximadamente 30 nM, aproximadamente 40 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 500 nM, aproximadamente 1 aproximadamente 10 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 30 pM, aproximadamente 40 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 100 mM o más. En una realización preferida, la concentración de los sustratos (I) y (II) es de entre 0,1 y 1 mM.

Las concentraciones adecuadas de la tiolasa para llevar a cabo el primer procedimiento según la invención incluyen, sin limitación, aproximadamente 1 pg/ml, aproximadamente 2 pg /ml, aproximadamente 3 pg /ml, aproximadamente 5 pg /ml, aproximadamente 8 pg /ml, aproximadamente 10 pg /ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 30 pg /ml, aproximadamente 50 pg /ml, aproximadamente 75 pg /ml, aproximadamente 100 pg /ml, aproximadamente 200 pg /ml, aproximadamente 300 pg /ml, aproximadamente 500 pg /ml, aproximadamente 750 pg /ml, aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 3 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 7,5 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 30 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 75 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml. En una realización preferida, la concentración de la tiolasa es de entre 0,05 y 1 mg/ml.

En una realización particular y preferida de la invención, el primer procedimiento de la invención comprende además poner en contacto el compuesto de fórmula (I) con un polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa que puede catalizar la formación de un compuesto de fórmula (IV)

a partir del compuesto de fórmula (I) y en la que R¹y R²se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C¹-C⁶lineal o ramificado, alquenilo C²-C⁶lineal o ramificado, alquinilo C²-C⁶lineal o ramificado, arilo, aril alquilo y bencilo, y S-CoA es coenzima A y donde el polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 6.

El término “polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa”, tal como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que cataliza la conversión con NADP(H) de aldehídos o cetonas ramificados para dar sus respectivos alcoholes, en el que el término NAD(P)H se refiere o bien a NADH o bien a NADPH como cofactor. El polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa para su uso en la presente invención es un catalizador biológico; por tanto el polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa para su uso en la invención es una enzima.

La actividad beta-cetoacil-CoA reductasa puede determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica adecuado para la determinación de la actividad de aldehído reductasa dependiente de NAD(P)H tal como cromatografía de líquidos acoplada con espectrometría de masas o de manera espectrofotométrica monitorizando la oxidación de NAD(P)H a 240 nm.

El polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa para su uso en la presente invención incluye polipéptidos que tienen actividades específicas en el intervalo de al menos 0,001, al menos 0,01, al menos 0,1, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55, al menos 60, al menos 65, al menos 70, al menos 75, al menos 80, al menos 85, al menos 90, al menos 95 y/o al menos 100 mU/mg, al menos 200 mU/mg, al menos 400 mU/mg, al menos 800 mU/mg, al menos 1000 mU/mg o mas cuando se usa 3-ceto-2-etil-butiril-CoA como sustrato.

Según la presente divulgación, la secuencia de un polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa tiene una identidad de al menos el 45% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 6, en la que SEQ ID NO: 6 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la beta-cetoacil-CoA reductasa de Pseudomonas putida.

En una divulgación particular, la secuencia de un polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa tiene una identidad de al menos el 46%, al menos el 47%, al menos el 48%, al menos el 49%, al menos el 50%, al menos el 51%, al menos el 52%, al menos el 53%, al menos el 54%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 99% o más con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 6. En una realización preferida, el valor de identidad anterior se determina a lo largo de la longitud completa de los polipéptidos que están comparándose. El término “identidad” así como algoritmos adecuados para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias se detallaron anteriormente.

En particular, el polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa consiste en la secuencia de aminoácidos de la proteína beta-cetoacil-CoA reductasa de Pseudomonas putida que se muestra en SEQ ID NO: 6. Tal como entenderá el experto en la técnica, esta realización particular incluye condiciones adecuadas para llevar a cabo la reacción mediante la cual se obtiene el compuesto (IV) a partir del compuesto (I). Dichas condiciones incluyen una razón apropiada entre el polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa y el sustrato en cuanto a la concentración y condiciones apropiadas de sales, cofactores, pH y temperatura así como un tiempo de reacción apropiado.

Anteriormente se detallaron condiciones adecuadas de sales, pH, temperatura, concentración adecuada tanto de cofactor como de compuesto (I) y tiempo de reacción apropiado.

Las concentraciones adecuadas del polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa incluyen, sin limitación, aproximadamente 1 jig/ml, aproximadamente 2 |jg /ml, aproximadamente 3 |jg /ml, aproximadamente 5 |jg /ml, aproximadamente 8 jig/ml, aproximadamente 10 jig/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 30 jig/ml, aproximadamente 50 jig/ml, aproximadamente 75 jig/ml, aproximadamente 100 jig/ml, aproximadamente 200 jig/ml, aproximadamente 300 jig/ml, aproximadamente 500 jig/ml, aproximadamente 750 jig/ml, aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 3 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 7,5 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 30 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 75 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml. En una realización preferida, la concentración del polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa es de entre 0,05 y 1 mg/ml.

En una realización particular y preferida del primer procedimiento de la invención, R¹es un grupo etilo. En otra realización particular y preferida del primer procedimiento invención, R²es un grupo metilo.

PROCEDIMIENTO IN VITRO PARA LA PRODUCCIÓN DEL COMPUESTO DE FÓRMULA (IV)

En una divulgación, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de un compuesto de fórmula (IV), a continuación en el presente documento “el tercer procedimiento de la invención”, que comprende poner en contacto un compuesto de fórmula (I) con un polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa que puede catalizar la formación de un compuesto de fórmula (IV)

H

a partir del compuesto de fórmula (I), en la que R¹y R²se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C²-C⁶lineal o ramificado, alquenilo C²-C⁶lineal o ramificado, alquinilo C²-C⁶lineal o ramificado, arilo, arilalquilo y bencilo, y S-CoA es coenzima A.

Los términos “polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa”, “compuesto de fórmula I”, “compuesto de fórmula IV”, “alquilo C¹-C⁶”, “alquilo C²-C⁶”, “alquenilo C²-C⁶”, “alquinilo C²-C⁶”, “arilo”, “aril-alquilo”, “bencilo” así como los características particulares de los mismos se definieron anteriormente y se usan en el presente documento con el mismo significado.

La expresión “poner en contacto un compuesto de fórmula (I) con un polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la incubación de dicho polipéptido y dicho compuesto de fórmula (I) para la interacción entre dicho compuesto y dicho polipéptido; conduciendo así a la formación del compuesto de fórmula (IV).

Tal como entenderá el experto en la técnica, este procedimiento se lleva a cabo en condiciones adecuadas mediante lo cual se obtiene el compuesto (IV) a partir del compuesto (I). Dichas condiciones incluyen una razón apropiada entre el polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa y el sustrato (es decir el compuesto de fórmula I) en cuanto a la concentración y condiciones apropiadas de sales, cofactores, pH y temperatura así como un tiempo de reacción apropiado.

Las condiciones de sales adecuadas para llevar a cabo el tercer procedimiento según la divulgación incluyen, sin limitación, cualquier tampón comúnmente conocido tal como tampón fosfato, un tampón bicarbonato, un tampón carbonato, tampón Tris, un tampón borato, un tampón succinato, un tampón histidina, un tampón citrato o un tampón ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) a concentraciones de al menos 10 mM, al menos 20 mM, al menos 30 mM, al menos 40 mM, al menos 50 mM, al menos 60 mM, al menos 70 mM, al menos 80 mM, al menos 90 mM, al menos 100 mM, al menos 200 mM, al menos 300 mM o más. En una realización preferida, el tercer procedimiento según la presente invención se lleva a cabo en tampón MES 100 mM.

Los valores de pH adecuados para llevar a cabo el tercer procedimiento según la divulgación incluyen, sin limitación, valores de 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9 y 9,5. En una realización preferida, el procedimiento se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 6.

Las condiciones de temperatura adecuadas para llevar a cabo el tercer procedimiento según la divulgación incluyen, sin limitación, aproximadamente 20°C, aproximadamente 25°C, aproximadamente 30°C, aproximadamente 35°C, aproximadamente 37°C. En una realización preferida, el tercer procedimiento de la invención se lleva a cabo a 37°C. Los tiempos de reacción adecuados para llevar a cabo el tercer procedimiento según la divulgación incluyen, sin limitación, al menos 1 ms, al menos 1 s, al menos 15 s, al menos 30 s, al menos 1 min, al menos 2 min, al menos 3 min, al menos 4 min, al menos 5 min, al menos 6 min, al menos 7 min, al menos 8 min, al menos 9 min, al menos 10 min, al menos 15 min, al menos 20 min, al menos 25 min, al menos 30 min, al menos 35 min, al menos 40 min, al menos 45 min, al menos 50 min, al menos 55 min, al menos 1 h, al menos 2 h, al menos 3 h, al menos 4 h, al menos 5 h, al menos 6 h, al menos 7 h, al menos 8 h, al menos 9 h, al menos 10 h o más. En una realización preferida, el tiempo de reacción es de 1 hora.

La concentración adecuada del compuesto (I) para llevar a cabo el tercer procedimiento según la divulgación incluye, sin limitación, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 20 nM, aproximadamente 30 nM, aproximadamente 40 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 500 nM, aproximadamente 1 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 30 pM, aproximadamente 40 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 100 mM o más. En una realización preferida, la concentración del compuesto de fórmula (I) es de entre 0,1 y 0,5 mM.

Las concentraciones adecuadas del polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa incluyen, sin limitación, aproximadamente 1 |jg/ml, aproximadamente 2 |jg/ml, aproximadamente 3 |jg/ml, aproximadamente 5 |jg/ml, aproximadamente 8 jg/ml, aproximadamente 10 jg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 30 jg/ml, aproximadamente 50 jg/ml, aproximadamente 75 jg/ml, aproximadamente 100 jg/ml, aproximadamente 200 jg/ml, aproximadamente 300 jg/ml, aproximadamente 500 jg/ml, aproximadamente 750 jg/ml, aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 3 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 7,5 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 30 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 75 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml. En una realización preferida, la concentración del polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa es de entre 0,05 y 1 mg/ml.

El término “cofactor” tal como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto químico no proteico que se requiere para la actividad biológica de la proteína. En una realización, la molécula NADPH actúa como cofactor en el procedimiento para obtener un compuesto de fórmula (IV) definido anteriormente. En otra realización, la molécula NADH actúa como cofactor en el procedimiento para obtener un compuesto de fórmula (IV) definido anteriormente. NADH actúa como agente reductor que dona electrones que son necesarios para la formación del grupo hidroxilo (-OH) a partir del grupo carbonilo (=O). Por consiguiente, NADH se transforma en su forma oxidada, NAD+. Las concentraciones adecuadas del cofactor NADPH o NADH para llevar a cabo el primer procedimiento según la invención incluyen, sin limitación, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,5 mM, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 10 mM o más. En una realización preferida, la concentración de cofactor es de 1 mM.

En una divulgación particular y preferida del tercer procedimiento de la invención, R¹es un grupo etilo. En otra realización particular y preferida del tercer procedimiento de la invención, R²es un grupo metilo.

Se detallaron polipéptidos adecuados que tienen actividad beta-cetoacil-CoA reductasa para su uso según la presente invención en el contexto del primer procedimiento de la invención y pueden usarse igualmente en el contexto del tercer procedimiento de la invención. En una realización particular y preferida del tercer procedimiento de la invención, el polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa consiste en la secuencia de aminoácidos de la proteína beta-cetoacil-CoA reductasa de Pseudomonas putida y que se muestra en SEQ ID NO: 6.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Alineación de secuencias de tiolasa e identificación de residuos conservados.

Las tiolasas analizadas en el presente estudio se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Lista de tiolasas seleccionadas

Para indicar el grado de conservación de los residuos seleccionados, se realizó un alineamiento múltiple entre las secuencias de interés (SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4). La alineación se realizó utilizando el servidor web Clustal Omega del Instituto Europeo de Bioinformática (EBI) utilizando parámetros predeterminados. La alineación se muestra en la Figura 1.

Ejemplo 2. Clonación y purificación de tiolasas

Los plásmidos que codifican tiolasas naturales o mutantes se transformaron en E. coli BL21 (DE3) -T1R, se expresaron y purificaron como se describe a continuación. Las enzimas recombinantes purificadas se usaron luego como biocatalizador en la síntesis de 3-hidroxi-2-etil-butiril-CoA (3H2EB-CoA).

Se inoculó un cultivo durante la noche en medio LB a 37°C a una DO600 nm de 0,1 en 50 ml de medio LB de autoinducción NZY (NZYTech, Portugal). El medio NZY se complementó con 100 jg / mL de Kan o Amp (según el plásmido correspondiente - Tabla 1). Los cultivos se cultivaron a 37 ° C durante 7 h y a 25 ° C hasta 24 h en condiciones aeróbicas. A continuación, las células se recogieron mediante centrifugación a 4500 g durante 10 minutos y se mantuvieron a -20°C hasta su posterior purificación.

Se homogeneizaron gránulos (50 ml) con fosfato 50 mM pH 7,5 (10 ml) y se colocaron en un baño de hielo para sonicación. La sonicación se llevó a cabo durante 10 minutos usando el modo de pulso (5 segundos ON / OFF) y 20% de amplitud. Los lisados se centrifugaron a 4°C, 10.000 g durante 30 minutos. Los sobrenadantes que contenían la proteína de fusión se purificaron mediante cromatografía de afinidad por His usando columnas PD-10 vacías. Los sobrenadantes se incubaron con 1 ml de resina Talon® durante 30 minutos a 4°C. Las proteínas se eluyeron con 1 ml de tampón de elución (imidazol 300 mM, fosfato 50 mM pH 7,5), se cuantificaron y se usaron para la reacción enzimática.

Ejemplo 3. Expresión y purificación de tiolasas de alto rendimiento.

Los plásmidos que codifican tiolasas naturales o mutantes se transformaron en E. coli BL21 (DE3) -T1R, se expresaron y purificaron como se describe a continuación. Las enzimas recombinantes purificadas se utilizaron luego como biocatalizador en la síntesis de 3H2EB-CoA.

Se inoculó un cultivo durante la noche en medio LB a 37°C a una DO600 nm de 0,1 en 5 ml de medio NZY Auto-Induction LB (NZYTech, Portugal). El medio NZY se complementó con 100 |jg / mL de kanamicina o ampicilina (según el plásmido correspondiente - Tabla 1). Los cultivos se cultivaron aeróbicamente a 37 ° C durante 7 h y a 25 ° C hasta 24 h. A continuación, las células se dividieron en alícuotas en placas de 96 pocillos profundos y se centrifugaron a 4500 g durante 10 minutos. Los sedimentos se mantuvieron a -20°C hasta su posterior purificación. Los sedimentos en placas de 96 pocillos profundos se resuspendieron con 250 pl de tampón de lisis (tampón fosfato 50 mM pH 7,5, Bugbuster®, 10 pg/ml de DNasa I, MgSO4 20 mM) para la lisis celular. La lisis celular tuvo lugar durante 20 minutos. Los lisados se centrifugaron a temperatura ambiente, 10.000 g durante 30 minutos. Los sobrenadantes que contienen la proteína de fusión se purificaron con IMAC. Los sobrenadantes se incubaron con 100 pl de resina Talon® durante 15 minutos. Las proteínas se eluyeron con 50 pl de tampón de elución (imidazol 300 mM, tampón fosfato 50 mM pH 7,5), se cuantificaron y se usaron para la reacción enzimática.

Ejemplo 4.

Ensayo de condensación de acil-CoA por tiolasas.

a) Ensayo de condensación de acetil-CoA / butiril-CoA

La actividad de condensación de acetil-CoA / butiril-CoA de variantes de tiolasa se evaluó en la dirección sintética mediante un ensayo enzimático acoplado in vitro con perfil de producto por HPLC-MS. Dado que la reacción de condensación catalizada por tiolasas es endergónica, se acopló con 3-hidroxi-2-metilbutiril-CoA deshidrogenasa de Pseudomonas putida (SEQ ID NO: 6, PpFadB2) para impulsar la reacción en la dirección de avance (Thl / PpFadB2 ensayo acoplado). Fueron posibles tres productos de reacción: 3-hidroxibutiril-CoA (3HB-CoA) (producto de tipo salvaje de la condensación de 2 moléculas de acetil-CoA), 3-hidroxihexanoil-CoA (3HH-CoA) (acetil-CoA / butiril-CoA lineal producto de condensación) y 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA (3H2EB-CoA) (producto de condensación ramificado acetil-CoA / butiril-CoA). Los tres productos se analizaron mediante HPLC-MS (ver más abajo).

Las reacciones se llevaron a cabo en tampón de 2-(N-morfolino) etanosulfonato (MES) (pH 6,0), acetil-CoA 100 pM, butiril-CoA 100 pM, NADH 1 mM, 0,15 mg / ml de PpFadB2 (^sE^qID NO: 6) y 0,19 mg / ml de variante de tiolasa. Las mezclas de reacción se prepararon en microplacas de 96 pozos en un volumen de 200 jL, y se incubaron durante 1 ha 37°C con agitación (300 rpm en Thermomixer). Una vez completada, la enzima se eliminó mediante filtración a través de placas de filtración de corte de 10 kDa (Millipore). Las muestras se almacenaron a -20°C hasta su posterior análisis.

b) Ensayo de condensación de acetil-CoA / acetil-CoA

Las reacciones se llevaron a cabo en tampón de 2-(N-morfolino) etanosulfonato (MES) (pH 6) con acetil-CoA 200 pM, NADH 1 mM, 0,15 mg / ml de PpFadB2 y 0,19 mg / ml de variante de tiolasa. Las reacciones se procesaron como se describe en la sección anterior.

Ejemplo 5. Expresión y purificación de 3-hidroxi-2-metilbutiril-CoA-deshidrogenasa de Pseudomonas putida (SEQ ID NO: 6, PpFadB2)Se inoculó un cultivo durante la noche en medio LB a 37°C a una DO600 nm de 0,1 en 500 ml de medio LB de autoinducción NZY (NZYTech, Portugal). El medio NZY se complementó con 100 jg / ml de ampicilina. Los cultivos se cultivaron a 37 ° C durante 7 hy a 25 ° C hasta 24 h en condiciones aeróbicas. A continuación, las células se dividieron en alícuotas de 50 ml y se recogieron mediante centrifugación a 4500 g durante 10 minutos y se mantuvieron a -20°C hasta su posterior purificación.

Se homogeneizaron gránulos (50 ml) con fosfato 50 mM pH 7,5 (20 ml) y se colocaron en un baño de hielo para sonicación. La sonicación se llevó a cabo durante 10 minutos usando el modo de pulso (5 segundos ON / OFF) y 20% de amplitud. Los lisados se centrifugaron a 4°C, 10.000 g durante 30 minutos. Los sobrenadantes que contenían la proteína de fusión se purificaron mediante cromatografía de Afinidad His usando columnas PD-10 vacías. Los sobrenadantes se incubaron con 3 ml de resina Talon® durante 30 minutos a 4°C. Las proteínas se eluyeron con 3 ml de tampón de elución (imidazol 300 mM, fosfato 50 mM pH 7,5). La solución eluida se dializó y se concentró mediante una membrana de ultrafiltración de MWCO 10.000 (Amicon) hasta un volumen final de aprox.

0,5 ml. A continuación, la proteína purificada se cuantificó y se mantuvo a 4°C hasta su uso para la reacción enzimática.

Ejemplo 6. Caracterización de la actividad deshidrogenasa de la proteína PpFadB2 sobre 3-ceto-2-etilbutiril-CoA..

La proteína FadB2 de Pseudomonas putida (PpFadB2; Número de acceso: WP_064492895.1) exhibe una alta actividad sobre 3-ceto-2-etilbutiril-CoA. Para confirmar aún más el potencial biocatalítico de la enzima, se llevaron a cabo ensayos de transformación in vitro utilizando NADH 1 mM y 3-ceto-2-etilbutiril-CoA 100 pM. Se añadió PpFadB2 purificado a los ensayos hasta una concentración final de 0,0001-1 mg / ml. En todas las concentraciones de proteína, el consumo de 3-ceto-2-etilbutiril-CoA fue total, y los rendimientos del producto estuvieron en el rango de 76-95% según lo evaluado por HPLC (Fig. 2).

La reducción del grupo ceto en 3-ceto-2-etilbutiril-CoA genera un nuevo carbono quiral en la molécula. Las deshidrogenasas son altamente estereoselectivas y se espera una síntesis preferencial de un isómero.

LC-MS, LC-MS / MS y análisis de RMN de 3-hidroxi-2-etil-butiril-CoA y 3-hidroxihexanoil-CoA

Se adquirieron 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA y 3-hidroxihexanoil-CoA de Sigma-Aldrich y se analizaron por LC-MS. La 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA sintetizada químicamente se eluyó como dos picos con una relación m / z de 882,2. La 3-hidroxihexanoil-CoA sintetizada químicamente eluyó como un solo pico con una relación m / z de 882,2. Los tres picos se resolvieron bien cromatográficamente.

Los espectros MS / MS de los dos picos de 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA eran indistinguibles y diferían significativamente del espectro MS / MS del pico único de 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA (Tabla 2).

Tabla 2. Espectros de MS / MS de 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA (eluyendo como pico 1 y pico 2) y 3-hidroxihexanoil-CoA (eluyendo como un pico único). Los espectros MS / MS se registraron en modo negativo.

1Abund: valor absoluto de la integración del área de pico. 2Norm: valor relativo de integración del área de pico, normalizado por la suma de todas las áreas de integración de picos en el espectro MS/MS.

La 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA sintetizada químicamente se analizó adicionalmente mediante 1H-NMR, lo que confirmó además la presencia de dos isómeros (Fig. 3). Tanto la LC-MS como la 1H-NMR confirmaron que los isómeros del pico 1 y del pico 2 estaban presentes en una proporción de 7: 3 en la 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA sintetizada químicamente.

Por tanto, se concluyó que la 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA sintetizada químicamente consistía en una mezcla de dos diasteroisómeros en una proporción de 7:3.

Evaluación experimental de la estereoselectividad de PpFadB2.

En los ensayos in vitro, la estereoselectividad de la enzima se vio muy afectada por su concentración. A 1 mg / ml de PpFadB2, la reducción de 3-ceto-2-etil-butiril-CoA a 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA produce una mezcla de dos diasteroisómeros que se resuelven por HPLC. A concentraciones de enzima más bajas, la proporción de isómeros cambió, con un rendimiento creciente en el isómero del pico 2 (Figura 2).

Ejemplo 7. Actividad de condensación de acetil-CoA / butiril-CoA de variantes de tiolasa

Se construyó, expresó y purificó la variante BktB_L89I_M290A_M379L (Var10) para su uso como biocatalizador en la síntesis de 3H2EB-CoA.

Esta variante proteica fue capaz de catalizar la síntesis del compuesto deseado (ver cromatograma en la Figura 4).

Una vez que Var10 se identificó como un biocatalizador capaz de realizar la síntesis de 3H2EB-CoA, decidimos investigar el efecto de esas mutaciones en las otras tiolasas estudiadas (Tabla 3). Las tiolasas seleccionadas muestran identidades de secuencia inferiores al 50% (Tabla 3).

Tabla 3. Lista de variantes de tiolasa homólogas al mutante BktB Var10.

Las cuatro tiolasas modificadas se construyeron, purificaron y usaron como biocatalizadores para la condensación in vitro de acetil-CoA / butiril-CoA. La Figura 5 muestra el rendimiento de los productos A) 3H2EB-CoA, B) 3HHB-CoA, C) 3HB-CoA y D) selectividad del producto para tiolasas de tipo salvaje y sus mutantes triples.

Con respecto a la actividad de condensación de acetil-CoA, BktB_Var10, AtoB_Var10 y Erg10_Var10 mostraron una actividad peor que sus enzimas de tipo salvaje para la síntesis de 3HB-CoA (Fig. 5).

Sorprendentemente, AtoB_Var10 y Erg10_Var10 mejoraron los rendimientos del producto de condensación ramificada acetil-CoA / butiril-CoA, exhibiendo una actividad comparable (rendimiento de producto de aproximadamente 0,6%), 4 veces mayor que la de BtkB_Var10. Además, Erg10_Var10 mostró una notable selectividad hacia la síntesis del compuesto ramificado (3HB-CoA / 3H2EB-CoA 60:40).

En el caso de la síntesis de 3HH-CoA, BktB y su Var10 fueron los de mejor desempeño, teniendo una actividad sintética comparable. También AtoB_Var10 fue capaz de catalizar esa reacción, aunque dio lugar a rendimientos más bajos. Las mutaciones en TtThl mataron la actividad de condensación lineal. Curiosamente, Erg10_Var10 produjo trazas del producto lineal que estaban cerca de los límites de detección (actividad no observada en la enzima de tipo salvaje). Comparando, Erg10_Var10 y AtoB_Var10 mostraron rendimientos 43 y 3 veces más altos para el compuesto ramificado que para el lineal, respectivamente.

Por lo tanto, Erg10_Var10 fue la mejor variante, ya que acepta sustratos distintos de acetil-CoA en el segundo paso de la reacción de condensación de Claisen, mientras que es selectivo hacia la síntesis de compuestos ramificados.

Ejemplo 8. Análisis de mutantes simples y dobles de tiolasa Erg10.

Generamos todas las combinaciones posibles de las variaciones en estas tres posiciones. Las tres variantes simples (Erg10_V90I, Erg10_F293A y Erg10_I383V) y las tres variantes dobles (Erg10_V90I_F293A, Erg10_V90I_I383V y Erg10_F293A_I383V) se evaluaron para la síntesis de 3H2EB-CoA.

Las variantes dobles que tenían la mutación F293A en sus secuencias fueron capaces de catalizar la condensación de acetil-CoA y butiril-CoA, dando lugar a 3H2EB-CoA (Fig. 6). De los que tienen actividad, F293A_I383V mostró un rendimiento más alto que V90I_F293A. Con respecto a los mutantes individuales, solo F293A fue capaz de llevar a cabo la reacción deseada, mostrando un aumento de actividad de 3 veces en comparación con Erg10_Var10. En el caso de I383V de variante única, el compuesto ramificado sintetizado estaba cerca de los límites de detección. No se encontraron productos de condensación de acetil-CoA / butiril-CoA para la variante V90I (Fig. 6).

Ejemplo 9. Análisis de mutantes de tiolasa Erg10 en Phe293.

El papel del residuo Phe293 para la actividad tiolasa de Erg10 se exploró mediante mutagénesis por saturación (cambiándolo por los 19 aminoácidos naturales restantes). Sorprendentemente, el mutante F293D superó a Erg10_Var1017 veces y 120 veces la actividad inicial observada en BktB. (Figura 7).

Al observar la selectividad del producto (inserto de la Fig. 7A), F293D surgió como la variante más activa y selectiva para la producción de 3H2EB-CoA. Sorprendentemente, este mutante produjo 1,5 y 35 veces más 3H2EB-CoA que 3HB-CoA (Fig. 7B) y 3HH-CoA. (Fig. 7C), respectivamente.

Ejemplo 10. Análisis cinético de variantes de tiolasa.

Para el análisis cinético de la actividad de condensación de acetil-CoA / butiril-CoA de las mejores variantes de tiolasa, se ajustó la concentración de enzima en el ensayo para asegurar la captura de la fase lineal del perfil de síntesis del producto. Se ensayaron dos concentraciones de enzima diferentes para cada proteína (0,04 y 0,02 mg / ml para Erg10_F293D; 0,19 y 0,09 mg / ml para Erg10_F293A). Las reacciones se siguieron durante 24 h. Se calculó la actividad específica para los primeros 20 minutos de reacción.

Los ensayos se realizaron por triplicado y al menos a dos concentraciones de proteína con el fin de asegurar la fiabilidad de la actividad determinada.

Las reacciones se detuvieron por separación rápida de la enzima mediante filtración a través de placas de filtración de corte de 10 kDa. Las muestras se almacenaron a -20°C antes hasta su posterior análisis.

Se midió la actividad específica para Erg10_F293D y se comparó con la de Erg10_F293A. Los resultados mostraron que Erg_F293D era 12 veces más activo para la síntesis de 3H2EB-CoA que Erg_F293A, mostrando una actividad específica de 700 ± 140 mU / g de proteína y 54 ± 10 mU / g de proteína, respectivamente.

Realizamos un curso temporal de formación de 3H2EB-CoA. Ambas enzimas mostraron una curva de saturación típica (Figura 8). Después de 24 h, observamos rendimientos máximos de producción para Erg10_F293D y Erg10_F293A ca. 3000 nM y 1800 nM, respectivamente (Fig. 8).

Ejemplo 11. Caracterización de la flexibilidad del sustrato de variantes de tiolasa Erg10.

Hemos analizado la capacidad de las variantes de Erg10 para catalizar varias reacciones de condensación in vitro. Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo como se describe para la reacción de condensación de acetil-CoA / butiril-CoA pero con sustratos alternativos.

Realizamos reacciones de condensación Cross-Claisen usando acetil-CoA / propionil-CoA y acetil-CoA / hexanoil-CoA como pares de sustratos. Las reacciones se analizaron mediante LC-MS controlando los cromatogramas de compuestos con m / z de 868,1 o 910,2, respectivamente.

Condensación de acetil-CoA / propionil-CoA Cross Claisen.

Los cromatogramas se controlaron para los compuestos con m / z de 868,1. Se detectaron varios picos en las muestras, dos de ellos (picos 2 y 3) fueron significativamente más intensos (13 y 1,5 veces más altos en las muestras de reacción con Erg10_F293A en comparación con los controles sin enzimas; 122 y 5 veces más altos en las muestras de reacción con Erg10_F293D en comparación con los controles sin enzimas) (Fig. 9). Por tanto, estos dos picos corresponden a productos generados por la acción de variantes de Erg10 sobre sustratos.

Como en el caso de la condensación acetil-CoA / butiril-CoA, son posibles productos de condensación lineal (3-hidroxipentanoil-CoA) y ramificada (3-hidroxi-2-metilbutiril-CoA). El tiempo de retención del pico 2 difiere del del estándar comercial 3-hidroxipentanoil-CoA (Sigma), lo que sugiere que el producto principal generado en la reacción probablemente corresponda al producto de condensación ramificado (3-hidroxi-2-metilbutiril- CoA, pico 2), aunque también se forma el producto de condensación lineal (3-hidroxipentanoil-CoA, pico 3) (Fig. 9).

Condensación de acetil-CoA/hexanoil-CoA Cross Claisen.

Los cromatogramas se controlaron para los compuestos con m / z de 910,2. Se detectaron varios picos en las muestras, uno de ellos (tiempo de retención 12,5 min) fue significativamente más intenso en las muestras de reacción en comparación con los controles sin enzimas (22 veces más alto en las muestras de reacción con Erg10_F293D en comparación con los controles sin enzimas). Por tanto, este pico corresponde a un producto generado por la acción de la variante Erg10 sobre los sustratos (Fig. 10).

Los productos de condensación lineal (3-hidroxioctanoil-CoA) y ramificada (3-hidroxi-2-butilbutiril-CoA) son posibles pero su identidad no pudo ser confirmada debido a la falta de un estándar comercial.

Por lo tanto, los resultados de las reacciones de condensación de acetil-CoA / propionil-CoA y acetil-CoA / hexanoil-CoA Cross-Claisen sugieren que:

• La variante Erg10_F293D puede aceptar una amplia gama de acil-CoAs como sustrato en el segundo paso de la condensación de Claisen.

• La variante Erg10_F293D es altamente específica hacia acetil-CoA como sustrato en el primer paso de la condensación de Claisen.

• En conjunto, estas dos observaciones respaldan aún más la mayor selectividad de las variantes de Erg10_F293 hacia la síntesis de compuestos de condensación ramificados.

Ejemplo 12. Actividad de condensación de acetil-CoA/acetil-CoA de variantes de tiolasa Erg10.

También se llevó a cabo una reacción de tipo salvaje con estas enzimas. Erg10_F293D y Erg10_F293A retuvieron 60% y 30%, respectivamente, de la actividad de condensación de acetil-CoA / acetil-CoA de la enzima de tipo salvaje (Fig. 11).

Ejemplo 13: Efecto de la relación acetil-CoA / butiril-CoA sobre el perfil de formación de producto en ensayos de condensación acetil-CoA / butiril-CoA.

Se ensayaron diferentes proporciones de acetil-CoA: butiril-CoA. Evaluamos las relaciones acetil-CoA: butiril-CoA de 1:1 a 1:10. Se observó un aumento de la formación del producto 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA al aumentar la concentración de butiril-CoA. Por el contrario, la producción de 3HB-CoA se redujo significativamente en las mismas condiciones de reacción (Figura 12). Con respecto a la 3HH-CoA, no se observó una clara tendencia debido a la baja concentración cercana a los límites de detección en todos los casos.

Ejemplo 14: Análisis de mutantes simples y dobles de tiolasa de BktB (SEQ. ID NO. 2)

Ralstonia eutropha tiolasa (BktB, SEQ. ID. NO: 2) es capaz de condensar dos moléculas de acetil-CoA (produciendo acetoacetil-CoA) o una molécula de acetil-CoA y una de butiril-CoA (produciendo 3-cetohexanoil-CoA). Se produce una pequeña cantidad de 3-ceto-2-etilbutiril-CoA. En presencia de PpFadB2, estos compuestos se transforman en 3-hidroxibutiril-CoA, 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA y 3-hidroxihexanoil-CoA, respectivamente.

Se construyeron mutantes simples, dobles y triples en Leu89, Met290 y Met379. Se construyeron siete variantes de proteínas: BktB Leu89Ile, BktB Met290Ala, BktB Met290Asp, BktB Met379Val, BktB Leu89Ile Met290Ala, BktB Leu89Ile Met379Val, BktB Met290Ala Met379Val o BktB Leula89Ile Met290Ala. La capacidad para llevar a cabo una actividad de condensación de Claisen en una mezcla de acetil-CoA y butiril-CoA de las variantes de proteína resultantes se evaluó como se explicó anteriormente.

Los productos de reacción identificados fueron: 3-hidroxibutiril-CoA, 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA y 3-hidroxihexanoil-CoA. Se detectaron dos isómeros diferentes de 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA, que eluyeron en diferentes tiempos de retención (Fig 13).

Ejemplo 15: Análisis de mutantes simples y triples de tiolasa AtoB (SEQ. ID NO.3)

La tiolasa de Escherichia coli (AtoB, SEQ. ID. NO: 3) es capaz de condensar dos moléculas de acetil-CoA (produciendo acetoacetil-CoA) o una acetil-CoA y una de butiril-CoA (produciendo 3-cetohexanoil-CoA). En presencia de PpFadB2, estos compuestos se transforman en 3-hidroxibutiril-CoA y 3-hidroxihexanoil-CoA, respectivamente.

Se construyeron mutantes simples y triples en Val87, Met289 y Leu378. Se construyeron tres variantes de proteínas: AtoB Met289Ala, AtoB Met289Asp y AtoB Val87Ile Met289Ala Leu378Val (Var10). La capacidad para llevar a cabo una actividad de condensación de Claisen en una mezcla de acetil-CoA y butiril-CoA de las variantes proteicas resultantes se evaluó como se explicó anteriormente.

Los productos de reacción identificados fueron: 3-hidroxibutiril-CoA, 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA y 3-hidroxihexanoil-CoA. Se detectaron dos isómeros diferentes de 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA, que eluyeron en diferentes tiempos de retención (Tabla 4).

Tabla 4. Concentraciones de los productos de la reacción de condensación acetil-CoA / butiril-CoA (3-hidroxibutiril-CoA, 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA y 3-hidroxi-hexanoil-CoA) catalizada por la tiolasa AtoB y sus mutantes. Las reacciones se llevaron a cabo con una relación de acetil-CoA: butiril-CoA 1: 1.

Ejemplo 16. Análisis UPLC-MS de tioésteres de coenzima A.

Se prepararon soluciones madre estándar en dH2O. Luego, se obtuvieron muestras de la curva de calibración que contenían diferentes cantidades de cada analito después de la dilución con tampón de formiato de amonio 100 mM. Las concentraciones finales fueron 40, 30, 20, 10, 4, 1, 0,1 mM para acetil-CoA, butiril-CoA y 3-hidroxibutiril-CoA y 200, 150, 100, 50, 20, 5, 2, 0,5 |^jM para 3-hidroxihexanoil-CoA y 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA. También se incluyeron muestras en blanco antes y después de las muestras de la curva de calibración para controlar la ausencia de efecto de arrastre.

La cromatografía se realizó en un sistema Acquity UPLC usando una columna Acquity BEH C18 (100 x 2,1 mm, 1,7 |jm) de Waters (Milford, MA, EE.UU.) y equipada con un detector de matriz de fotodiodos (PDA). Los tampones de elución en gradiente fueron A (agua y formiato de amonio 100 mM) y B (acetonitrilo). El método de gradiente fue el siguiente: 0-1 min al 95% A, 1-14 min al 80% A, 14-15 min al 10% A 15-17 min al 10% A, 17-17,5 min al 95% A , 17,5-20 min a 95% A. La longitud de onda del detector de UV se fijó en 254 nm y el volumen de inyección fue de 10 jl. El tiempo total de ejecución fue de 20 min y el caudal se estableció en 300 jLmin-1.

La detección por espectrometría de masas se realizó mediante un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (ESI-TOF) LCT Premier XE de Waters (Milford, MA, EE.UU.) con una fuente de ionización por electropulverización, trabajando en modo positivo / V. El rango de MS adquirido estuvo entre m / z 100-1000. Los voltajes capilar y cónico se fijaron en 3000 y 100 V, respectivamente. Para otros parámetros, la temperatura del gas de desolvatación fue de 220 ° C y la temperatura de la fuente fue de 120 ° C. El flujo de gas de desolvatación se estableció en 600 L ■ h-1 y el flujo de gas de cono se estableció en 50 L h-1.

Se utilizó el software Masslynx v4.1 para analizar cromatogramas y espectros (Waters, Milford, MA, EE. UU.). Todos los analitos se identificaron mediante espectrometría de masas (Tabla 5). La cuantificación de 3-hidroxihexanoil-CoA y 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA se realizó mediante ESI-TOF MS. Por otro lado, para evitar la saturación de la señal, la cuantificación de acetil-CoA, butiril-CoA y 3-hidroxibutiril-CoA se realizó mediante absorbancia UV a 254 nm.

Tabla 5. Analitos tiem o de retención aducto e ión detectado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una tiolasa mutante que puede catalizar la formación de un compuesto de fórmula (I)

mediante la condensación de un compuesto de fórmula (II)

en donde R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C6 lineal o ramificado, alquenilo C2-C6 lineal o ramificado, alquinilo C2-C6 lineal o ramificado, arilo, aril-alquilo y bencilo, y S-CoA es coenzima A,

teniendo dicha tiolasa mutante al menos una sustitución de un amino ácido en una posición correspondiente a la posición 293 en el polipéptido de SEQ ID NO: 1 en donde la tiolasa muestra al menos un 75% de identidad de secuencia con una tiolasa seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2 o 3, con la condición de que dicha tiolasa no sea una tiolasa que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. y donde dicha tiolasa mutante muestra una actividad tiolasa específica de al menos 0,05 mU/mg para la catálisis de un producto ramificado de fórmula (I) cuando el compuesto de fórmula (II) es butiril-CoA y el compuesto de fórmula (III) es acetil-CoA.

2. La tiolasa según la reivindicación 1, en la que la secuencia en dicha tiolasa correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00098 en la base de datos Prosite tiene una identidad de al menos el 35% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma en el polipéptido de SEQ ID NO: 1, en la que la secuencia en dicha tiolasa correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00737 en la base de datos Prosite tiene una identidad de al menos el 50% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma en el polipéptido de SEQ ID NO: 1 y/o en la que la secuencia en dicha tiolasa correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00099 en la base de datos Prosite tiene una identidad de al menos el 25% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma en el polipéptido de SEQ ID NO: 1.

3. La tiolasa según la reivindicación 2, en la que la tiolasa mutante se selecciona del grupo que consiste en:

(i) El polipéptido de SEQ ID NO: 1, en donde la al menos una mutación está localizada en la posición Phe293;

(ii) El polipéptido de SEQ ID NO: 2, en donde la al menos una mutación está localizada en la posición Met290;

(iii) El polipéptido de SEQ ID NO: 3, en donde la al menos una mutación está localizada en la posición Met289.

4. La tiolasa según la reivindicación 3, en la que la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1 en donde la al menos una mutación localizada en la posición Phe293 se selecciona del grupo que consiste en Phe293Asp, Phe293Ala, Phe293Ser, Phe293Gly y Phe293Glu.

5. La tiolasa según la reivindicación 3, en la que la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 2 en donde la al menos una mutación localizada en la posición Met290 se selecciona del grupo que consiste en Met290Asp, Met290Ala, Met290Ser, Met290Gly y Met290Glu.

6. La tiolasa según la reivindicación 3, en la que la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 3 en donde la al menos una mutación localizada en la posición Met289 se selecciona del grupo que consiste en Met289Asp, Met289Ala, Met289Ser, Met289Gly y Met289Glu.

7. La tiolasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende además al menos una mutación adicional en una posición seleccionada del grupo que consiste en los residuos correspondientes a las posiciones 90 y 383 en el polipéptido de SEQ ID N^o: 1.

8. La tiolasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde R¹es un grupo etilo y/o R²es un grupo metilo.

9. Un ácido nucleico que codifica una tiolasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el vector que comprende el ácido nucleico que codifica una tiolasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una célula huésped que comprende el ácido nucleico que codifica una tiolasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la célula huésped que comprende el vector que comprende el ácido nucleico que codifica una tioloasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Un proceso para la producción de un compuesto de fórmula (I) que comprende poner en contacto un compuesto de fórmula (II) y un compuesto de fórmula (III) en presencia de una tiolasa mutante capaz de catalizar la formación de un compuesto de fórmula (I)

mediante la condensación de un compuesto de fórmula (II)

en donde R¹y R²se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C¹-C⁶lineal o ramificado, alquenilo C²-C⁶lineal o ramificado, alquinilo C²-C⁶lineal o ramificado, arilo, aril-alquilo y bencilo, y S-CoA es coenzima A,

teniendo dicha tiolasa mutante al menos una sustitución de un amino ácido con respecto a la tiolasa natural, en donde dicha sustitución de amino ácido está localizada en una posición correspondiente a la posición 293 en el polipéptido de SEQ ID NO: 1, donde dicha tiolasa tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con una tiolasa seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 1,2 o 3 y muestra una actividad tiolasa específica de al menos 0,05 mU/mg para la catálisis de un producto ramificado de fórmula (I) cuando el compuesto de fórmula (II) es butiril-CoA y el compuesto de fórmula (III) es acetil-CoA; y en donde dicho poner en contacto se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la condensación de compuestos de fórmula (II) y (III) en un compuesto de fórmula (I).

11. El proceso según la reivindicación 10 en donde la tiolasa no es una tiolasa que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

12. El proceso según la reivindicación 10, en donde:

la secuencia en dicha tiolasa correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00098 en la base de datos Prosite tiene una identidad de al menos el 35% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma en la tiolasa de SEQ ID NO: 1, en el que la secuencia en dicha tiolasa correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00737 en la base de datos Prosite tiene una identidad de al menos el 50% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma en la tiolasa de SEQ ID NO: 1 y/o en el que la secuencia en dicha tiolasa correspondiente a la firma de tiolasa que tiene el número de registro PS00099 en la base de datos Prosite tiene una identidad de al menos el 25% con respecto a la secuencia correspondiente a dicha firma en la tiolasa de SEQ ID NO: 1.

13. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en donde la tiolasa mutante se selecciona del grupo que consiste en:

14. El proceso según la reivindicación 13, en donde la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 1 en donde la al menos una mutación localizada en la posición Phe293 se selecciona del grupo que consiste en Phe293Asp, Phe293Ala, Phe293Ser, Phe293Gly y Phe293Glu.

15. El proceso según la reivindicación 13, en donde la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 2 en donde la al menos una mutación localizada en la posición Met290 se selecciona del grupo que consiste en Met290Asp, Met290Ala, Met290Ser, Met290Gly y Met290Glu.

16. El proceso según la reivindicación 13, en el que la tiolasa mutante es el polipéptido de SEQ ID NO: 3, en el que al menos una mutación localizada en la posición Met289 se selecciona del grupo que consiste en Met289Asp, Met289Ala, Met289Ser, Met289Gly y Met289Glu.

17. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16 en donde la tiolasa comprende además al menos una mutación adicional en una posición seleccionada del grupo que consiste en los residuos correspondientes a las posiciones 90 y 383 en el polipéptido de SEQ ID NO: 1.

18. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17 en donde R¹es un grupo etilo y/o R2 es un grupo metilo.

19. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17 que comprende además poner en contacto el compuesto de fórmula (I) con un polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa capaz de catalizar la formación de un compuesto de fórmula (IV)

H

a partir del compuesto de fórmula (I), en donde R¹, R²y S-CoA son tal como se han definido en la reivindicación 1.y donde el polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-CoA reductasa consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 6.