ES2845928T3 - Dispositivo para la microscopia electrónica de barrido-transmisión (STEM) y la microscopia óptica correlativas - Google Patents

Abstract

Dispositivo para la microscopia electrónica de barrido-transmisión - STEM - y la microscopia óptica correlativas con miras al estudio de una muestra (1), que comprende un detector STEM, caracterizado por que el detector STEM (7) está integrado en una lente fotoóptica (8).

Description

DESCRIPCIÓN

Dispositivo para la microscopía electrónica de barrido-transmisión (STEM) y la microscopía óptica correlativas

La invención se refiere a un dispositivo para la microscopia electrónica de barrido-transmisión (STEM) y la microscopia óptica correlativas.

La observación de procesos, composiciones y estructuras de muestras biológicas que contienen una fase líquida es difícil de realizar en el dominio nanométrico. Tales muestras pueden ser, por ejemplo, complejos proteínicos en células eucariotas, vesículas lipídicas en solución o en células o estructuras de material celular. La microscopía óptica hace posible, en el dominio normal, resoluciones de aproximadamente 200 nm y de 20 a 30 nm por medio de técnicas especiales. La microscopia con rayos X es problemática debido a que las fuentes de rayos X adecuadas requieren una gran inversión en aparatos. Los procedimientos de sondas de barrido solamente son adecuados para estudios de la superficie. La microscopia electrónica se emplea tradicionalmente para estudios en el dominio nanométrico, pero requiere un vacío para la óptica electrónica, con lo se excluyen los estudios de muestras en líquidos. Por tanto, en los últimos años se han desarrollado técnicas para realizar microscopias electrónicas en líquidos. En general, el líquido está confinado en una cámara con una delgada ventana permeable a los electrones. Es de especial importancia el empleo de la microscopia electrónica de barrido-transmisión (STEM; scanning transmission electron microscopy) para resoluciones en el dominio nanométrico de nanopartículas de altos números atómicos, por ejemplo nanopartículas de oro, en capas gruesas de líquidos de bajos números atómicos, por ejemplo agua. Las nanopartículas se emplean a menudo como marcadores proteínicos específicos para estudiar procesos celulares.

Aunque en la mayoría de los casos se puede conseguir una alta resolución, el espacio para la muestra está limitado a algunos micrómetros cuando se desea una resolución de algunos nanómetros.

Otro enfoque es el empleo de microscopia electrónica de barrido atmosférica (ESEM; environmental scanning electron microscopy). Se enfrían las muestras en un líquido, por ejemplo agua, a algunos grados Celsius y luego se guardan en vapor de agua a baja presión. Se puede ajustar la presión de modo que se conserve un equilibrio entre el líquido y el vapor. Esto permite observar una muestra en una delgada capa de agua. La detección se efectúa típicamente por medio del detector de electrones secundario, pero este modo de actuación solo es posible para la superficie de la muestra. Con un detector de electrones retrodispersados es posible la observación de espesores de capa de hasta cien nanómetros dentro de la muestra. Sin embargo, este último procedimiento de detección es relativamente ineficiente y, debido a los daños de radiación, no se puede utilizar para el estudio de material celular nativo. Las células tienen que inmovilizarse y teñirse con metal para aguantar los daños de radiación que entonces se produzcan, y se genera así un contraste suficiente durante la formación de la imagen. En las extensas regiones celulares es posible con el detector STEM una detección mucho más eficiente de marcadores específicos que consisten en nanopartículas de altos números atómicos. Los marcadores de nanopartículas pueden detectarse eficientemente en células enteras por medio de STEM, siendo necesaria solamente una mínima preparación de la muestra.

Es de interés especial la combinación de microscopia óptica con microscopia electrónica, la llamada microscopia correlativa. En este caso, se observan con resolución limitada procesos celulares y estructuras celulares por medio de microscopia óptica, mientras que la microscopia electrónica de alta resolución se utiliza en determinados momentos concretos y en determinadas regiones. El haz de electrones daña en general el material biológico. Por tanto, la microscopia óptica puede emplearse para seleccionar las regiones y momentos concretos que son de especial interés, ya que así no se daña la muestra. Ésta aporta también importantes informaciones adicionales para la microscopia electrónica; por ejemplo, facilita imágenes panorámicas de las células, así como informaciones sobre la presencia de determinadas proteínas en determinadas regiones celulares, por ejemplo empleando marcadores fluorescentes específicos. Los marcadores pueden ser marcadores genéticamente producidos, como la proteína fluorescente verde, o marcadores que estén dopados con átomos fluorescentes de alto número atómico, por ejemplo los llamados “puntos cuánticos” (quantum spots). En principio, se toman imágenes de microscopia óptica con dispositivos distintos de los empleados para la microscopia electrónica, por lo que se pierde la correlación temporal y se tiene que localizar la respectiva zona presentada como imagen.

Sería extraordinariamente ventajoso que ambos procedimientos de microscopia pudieran realizarse en el mismo sistema de modo que se consiga simultáneamente por medio de ambos procedimientos una correlación temporal lo mayor posible de las observaciones de procesos e informaciones estructurales, evitándose errores relativos a la localización de zonas o la variación de estructuras a lo largo del tiempo.

Un enfoque para esto es, por un lado, un microscopio de fluorescencia combinado que está montado sobre una columna de microscopia electrónica de transmisión (TEM; transmission electron microscopy) o STEM de alto voltaje, con lo que se consigue una correlación temporal en el rango de aproximadamente 30 segundos, ya que la muestra gira entre el haz de electrones vertical y el haz de luz. Otro enfoque es la integración de una lente óptica en el microscopio ESEM y la detección de la retrodispersión de electrones, si bien ésta es relativamente ineficiente y, debido a los daños por radiación, no puede utilizarse bien para muestras biológicas sensibles.

El documento US 5,811,804 describe un dispositivo para la microscopia electrónica de exploración-transmisión (STEM) y la espectroscopia de Raman correlacionadas.

Los documentos WO 2010/120238A1 y US 4,990,776 describen un dispositivo para la microscopia electrónica con una vía de detección óptica adicional.

El documento US 2012/0120226A1 describe una cámara de microfluido para la microscopia electrónica de transmisión en células vivas. Las tomas fotográficas obtenidas se correlacionan con tomas fotográficas de microscopia óptica. Los documentos EP 2975631 A1 y EP 2924706 A1, que se consideran como estado de la técnica según el artículos 54(3) CPE, divulgan una dispositivo para la microscopia electrónica y la microscopia óptica correlacionadas con un detector STEM entre la muestra y la lente óptica.

El problema de la presente invención consiste en crear un dispositivo para el microscopiado correlativo según el preámbulo que haga posible una combinación mejorada del procedimiento de microscopia óptica y el procedimiento STEM.

Este problema se resuelve con el dispositivo según la invención debido a que está integrado un detector STEM en una lente fotoóptica.

El dispositivo de detección combina la eficiente detección, por medio de microscopia STEM, de materiales de alto número atómico, por ejemplo marcadores de nanopartículas específicos en una muestra dentro de un líquido, tal como una célula, con la microscopia óptica simultánea, por ejemplo por contraste de fluorescencia en marcadores proteínicos de células o por contraste de dispersión del material celular. La invención se aparta del estado de la técnica en cuanto a que ésta hace posibles una detección sumamente eficiente de materiales de alto número atómico contenidos en la muestra con la mayor resolución posible y una microscopia óptica completamente correlativa en el tiempo. Una muestra puede estar seca, incrustada en una delgada capa de líquido o incrustada en una capa de hielo. En este contexto, es ventajoso que el detector STEM esté dispuesto en una cavidad de la lente fotoóptica.

Según la invención, se ha previsto que la cavidad presente en el lado de la muestra una abertura de pequeño diámetro a la que se una un espacio cónico de deriva de electrones, en cuyo extremo inferior está dispuesto el detector STEM. El término inferior se refiere aquí a una dirección del haz de electrones de arriba abajo. Son posibles direcciones de haz de cualquier naturaleza, dependiendo de la disposición del dispositivo. Esto significa que en el lado de la lente vuelto hacia el portamuestras está dispuesta la abertura a la que se une el espacio de deriva de electrones que se ensancha hacia abajo y en cuyo extremo inferior está dispuesto el detector STEM.

Se ha previsto en el marco de la invención que la señal del detector STEM pueda conducirse hacia fuera en el lado de la lente.

Se ha previsto en el marco de la invención que en el lado de la lente fotoóptica vuelto hacia la muestra esté dispuesto un portamuestras.

En este contexto, se ha previsto que el portamuestras esté construido como una delgada membrana permeable a los electrones.

Dado que el haz de electrones atraviesa la muestra dispuesta sobre el portamuestras, este portamuestras tiene que estar construido como permeable a los electrones.

Asimismo, pertenece a la invención que el espacio alrededor del portamuestras y el espacio de deriva de electrones posean la propiedad de ajustar un vacío.

Tiene que existir la posibilidad de generar un vacío en la zona de la muestra y en el espacio de deriva de electrones. Asimismo, se ha previsto en el marco de la invención que una fuente de haces de electrones esté dispuesta en el lado del portamuestras opuesto al detector STEM.

Asimismo, es concordante con la invención que una fuente de luz y unos medios de detección fotoópticos estén unidos con la lente.

La lente con un detector STEM integrado puede incorporarse en diferentes microscopios electrónicos, por ejemplo un ESEM con una energía típica de los electrones de 30 keV o un STEM de alta resolución con una energía típica de los electrones de 200 keV.

Pertenece también a la invención que estén previstas una o más trayectorias de haz fotoópticas distintas para fines de detección o de iluminación.

Otra ejecución de la invención prevé que la fuente de luz esté dispuesta a un lado del detector STEM, el haz de luz se solape en el foco con el haz de electrones y una vía de detección fotoóptica se solape con el haz de iluminación.

Está dentro del marco de la invención que el detector STEM presente una o más de una superficie de detección, de las que al menos una captura los electrones dispersados.

Un posible campo de aplicación de la invención es el estudio de procesos celulares que se basan en la construcción y deconstrucción dinámicas de complejos proteínicos, empleándose una combinación de diferentes nanopartículas para detectar una multiplicidad de diferentes clases de proteínas que se combinan con marcadores específicos de proteínas que fluorescen de manera diferente. Un campo de investigación específico puede ser, por ejemplo, la investigación biomédica, especialmente la investigación del cáncer. Otros posibles campos de aplicación de la invención son el estudio de la interacción de nanomateriales con células, en el que pueden obtenerse imágenes panorámicas de células, así como el empleo de marcadores fluorescentes para mostrar zonas con ciertas proteínas, determinadas organelas, lípidos, DNS, etc. Otros campos de aplicación son la patología y la medicina judicial, el estudio de organismos marinos y la obtención de imágenes de bacterias y virus. Finalmente, entra también en consideración el diagnóstico de la presencia de proteínas específicas u otras macromoléculas y determinadas acumulaciones de proteínas y macromoléculas, por ejemplo para detectar cáncer en material celular.

Asimismo, la invención puede aplicarse también al estudio de muestras de otros sectores, por ejemplo las ciencias de los materiales, en los que se necesita una combinación de microscopia óptica y microscopia electrónica, por ejemplo en el campo del almacenamiento de energía empleando materiales de baterías eléctricas. Otros posibles campos de aplicación son el estudio de polímeros, la caracterización de nanopartículas, el ensayo de herramientas de mecánica de presión y la obtención de imágenes de diferentes materiales, por ejemplo fragmentos de tubos de acero corroídos. A continuación, se explicarán algunos ejemplos de realización de la invención ayudándose de dibujos.

Muestran:

La figura 1, una representación esquemática de un dispositivo de detección según la invención,

La figura 2, un detalle esquemático del dispositivo de detección para la microscopia electrónica de barrido-transmisión y la microscopia óptica correlativas,

La figura 3, una representación esquemática de un ejemplo, no perteneciente a la invención, de un dispositivo de detección, tampoco perteneciente a la invención, y

La figura 4, un detalle esquemático de un ejemplo, no perteneciente a la invención, de un dispositivo de detección para la microscopia electrónica de barrido-transmisión y la microscopia óptica correlativas.

La figura 1 muestra un dispositivo de detección para la microscopia electrónica de barrido-transmisión y la microscopia óptica correlativas. Una muestra 1, por ejemplo una célula eucariótica 1, está dispuesta sobre una delgada membrana 2 permeable a los electrones. La membrana 2 está unida con un portamuestras. Se forma una imagen de la muestra 1 con un haz de electrones 3, escaneándose típicamente la muestra 1 con un haz de electrones 3. Los electrones transmitidos se propagan a través de la membrana 2 y penetran por una rendija 4 en una cavidad dotada de una pequeña abertura 5 que da a un espacio 6 de deriva de electrones, llegando éstos al detector STEM 7. El espacio 6 de deriva de electrones y el detector STEM 7 están dispuestos en una cavidad de la lente fotoóptica 8. La lente 8 enfoca un ancho haz de luz 9 sobre la muestra 1 en un punto focal 10. La muestra 1 y el espacio 6 de deriva de electrones se encuentran dentro del vacío 11. Se conserva sobre la muestra 1 una delgada capa de líquido 12. El detector fotoóptico y la fuente de luz están dispuestos debajo de la lente 8 en la zona 13.

El modo de actuación según la invención es el siguiente.

Una muestra 1 en un líquido, por ejemplo una célula eucariótica, está dispuesta sobre una delgada membrana 2 en el microscopio electrónico. La membrana 2 consiste en materiales ligeros de pequeño número atómico, por ejemplo nitruro de carbono o nitruro de silicio, de modo que un haz de electrones 3 de suficiente energía, por ejemplo 30 keV o 200 keV, pueda atravesar la membrana 2.

La membrana 2 está sostenida por un soporte, por ejemplo un microchip de silicio o un material delgado. El soporte está dispuesto sobre un portamuestras con medios para moverse en las direcciones x, y y z. El haz de electrones 3 está configurado de modo que la dirección de radiación discurra del lado superior al lado inferior del microscopio y a través de la muestra 1. Por supuesto, el haz de electrones puede discurrir también en otras direcciones en vez de hacerlo de arriba abajo, por ejemplo discurriendo de abajo arriba o de izquierda a derecha.

Una lente óptica especial 8 está dispuesta debajo de la membrana 2. La trayectoria de haz está dispuesta de modo que la luz pase por la lente 8 y se enfoque sobre la muestra, mientras que la luz reflejada o fluorescente es concentrada con la misma lente 8 y conducida al detector, por ejemplo empleando un cubo de filtro óptico que conste de espejos bicolores. El haz de luz converge en dirección a la muestra 1 con un semiángulo de apertura de, por ejemplo, 0,75 rad que viene determinado por la apertura numérica de la lente 8. Una lente de aire o de vacío de alta resolución hace posible una amplificación de 100 aumentos con una apertura numérica de 1,0 y una distancia de trabajo de 0,15 mm. La lente 8 enfoca el haz de luz 9 sobre la muestra 1, presentándose un ancho haz de luz 9 con un diámetro de, por ejemplo, 9 mm en el otro extremo de la lente 8. La lente 8 presenta una depresión cónica que está dispuesta a lo largo del eje óptico de la lente 8 y sirve de espacio 6 de deriva de electrones. Las dimensiones de la depresión cónica casan bien con la trayectoria de haz que se emplea para la detección STEM con semiángulos de apertura de 0,050 a 0,20 rad. El diámetro de la depresión en el lado superior de la lente 8 directamente debajo de la muestra 1 es de, por ejemplo, 0,060 mm, mientras que, en torno a 0,20 rad y con una distancia de 0,15 mm, disminuye dicho diámetro. La depresión se extiende a través de la lente 8 con un ángulo de 0,2 rad. Por tanto, en una lente 8 de 10 mm de longitud la depresión en el lado inferior de la lente 8 es de 4,0 mm. El detector STEM 7 se dispone en el punto más lejano de la depresión.

Aunque la presencia de la depresión limita la trayectoria del haz a través de la lente 8, ello reduce únicamente la cantidad total de luz que pasa por la lente 8, teniendo todavía la lente 8 la facultad de enfocar el haz de luz sobre la muestra 1, concentrar luz procedente de la muestra y proyectar para la microscopia óptica una imagen ampliada de la zona iluminada sobre un detector de luz sensible a la posición. Como alternativa, puede emplearse un sistema óptico confocal. Alternativamente, pueden utilizarse también varias trayectorias de haz fotoópticas adicionales para fines de detección o iluminación.

El detector STEM consiste en un cilindro hecho de material escintilador con un diámetro de, por ejemplo, 4,0 mm para transformar electrones en impulsos luminosos. El escintilador está acoplado con un sensible detector de luz, por ejemplo un tubo fotomultiplicador. Este tubo está lateralmente conectado a la lente. A este fin, el escintilador tiene una superficie de conexión situada a un lado de la lente óptica. El lado exterior está provisto de un material reflectante y ligeramente escalonado de modo que la luz de la trayectoria de haz fotoóptica no se acople con el detector STEM 7. El detector STM 7 puede consistir también en un pequeño microchip con un detector de elementos acoplado por carga. El círculo medio del detector STEM 7 con un semiángulo correspondiente de 50 mrad está desacoplado de la detección, por ejemplo está bloqueado, o la señal de esta zona se emplea como señal de detección secundaria.

El detector STEM 7 registra así señales de electrones transmitidos con semiángulos de 50 mrad a 0,20 rad. La señal se denomina señal de campo oscuro.

La figura 2 muestra un detalle esquemático del dispositivo de detección para la microscopia electrónica de barridotransmisión y la microscopia óptica correlativas. Un haz de electrones 1b transmitido a través de una muestra (aquí no mostrada) llega un espacio 2b de deriva de electrones que está dispuesto en una cavidad de una lente fotoóptica 3b. El espacio de deriva de electrones es accesible a través de una pequeña abertura 4b. La lente 3b enfoca un ancho haz de luz 5b en un punto focal 6b. En el espacio 2b de deriva de electrones se encuentra un detector STEM 7b que se ha fabricado a base de una varilla de material escintilante para que se transformen electrones en impulsos luminosos. La varilla 7b tiene una abertura 8b para que pasen sin impedimento electrones del campo oscuro al detector y solamente se detecten electrones que están dispersados según un ángulo mínimo determinado. El detector STEM 7b de forma de varilla sale lateralmente de la lente 3b y está unido con un sensible detector de luz, así como con un fotomultiplicador o un fotodiodo 9b, para transformar la luz en una señal eléctrica. En lugar de una varilla de material escintilante y un detector de luz, se puede emplear también otro detector de electrones, como, por ejemplo, un detector de electrones de semiconductor, que sea de dimensiones comparables. Se capturan electrones del campo oscuro en una cámara independiente con un pequeño diafragma de apertura 10b para que tales electrones no perturben la señal STEM.

En otro ejemplo, no perteneciente a la invención, el detector STEM no se monta en la lente óptica, sino en las proximidades de la lente óptica. El detector STEM captura el haz de electrones. El haz fotoóptico es guiado de tal manera que éste se solape en el foco con el haz de electrones, pero, por lo demás, discurra a un lado del haz de electrones. El detector STEM puede estar dispuesto lateralmente en la lente fotóptica. El sistema fotoóptico puede consistir también en varias trayectorias de haz y varias lentes.

La figura 3 muestra otro ejemplo de realización, no perteneciente a la invención, de un dispositivo de detección para la microscopia electrónica de barrido-transmisión y la microscopia óptica correlativas. Una muestra 1c, por ejemplo una célula eucariótica 1c, está dispuesta sobre una delgada membrana 2c permeable a los electrones. La membrana 2c está unida con un portamuestras. Se forma una imagen de la muestra 1c con un haz de electrones 3c. Los electrones se propagan a través de la membrana 2c y discurren en el vacío 4c existente por debajo de la membrana. El haz de electrones transmitido 5c se propaga adicionalmente hasta el detector STEM 6c. Una lente fotoóptica 7c está dispuesta a un lado del haz de electrones 5c. La lente 7c enfoca un ancho haz de luz 8c sobre la muestra 1c en un punto focal 9c. La detección fotoóptica y la fuente de luz están dispuestas por debajo de la lente 7c.

En otro ejemplo, no perteneciente a la invención, se posiciona un delgado detector STEM entre la lente fotoóptica y la muestra. Dependiendo de la configuración del detector STEM, la señal luminosa y la señal STEM pueden detectarse en proximidad temporal. Tan pronto como el detector STEM se salga de la trayectoria del haz de luz, se puede efectuar la detección fotoóptica.

En otro ejemplo de realización el detector STEM no es de configuración simétrica, sino que tiene una o más de una superficie de detección, de las que al menos una captura los electrones dispersados. Las superficies de detección pueden ubicarse por dentro, por encima o a un lado de la lente fotoóptica. La señal luminosa y la señal STEM pueden detectarse al mismo tiempo.

La figura 4 muestra un detalle esquemático de un ejemplo, no perteneciente a la invención, de un dispositivo de detección para la microscopia electrónica de barrido-transmisión y la microscopia óptica correlativas. Un haz de electrones 1d que se transmite a través de una muestra (aquí no indicada) es capturado en una cavidad 2d de una lente fotoóptica 3d. La cavidad 2d es accesible a través de una pequeña abertura 4d. La lente 3d enfoca un ancho haz de luz 5d sobre la muestra en un punto focal 6d. Entre el punto focal 6d y el canto superior de la lente con una pequeña abertura 4d se encuentra una superficie de detección STEM 7d. La superficie de detección STEM 7d puede fabricarse a base de una varilla de material escintilante y ésta puede conectarse a un detector de luz 8d. Se puede utilizar también un detector de electrones de semiconductor.

En lo que sigue se describe un ejemplo de aplicación para un procedimiento según la invención. Como ejemplo se emplea una célula eucariótica, por ejemplo una célula de fibroblasto COS7. La célula contiene nanopartículas, por ejemplo nanopartículas de oro de 5 nm de diámetro. Las nanopartículas presentan un revestimiento para la fijación específica de la nanopartícula a una proteína, por ejemplo un revestimiento que contiene una molécula en factores de crecimiento epidérmicos. Esta molécula es un ligando para el receptor de factores de crecimiento epidérmicos. La detección de este receptor es importante para la investigación sobre determinadas clases de cáncer y su diagnóstico, por ejemplo en el cáncer de mama. La célula se inmoviliza en líquido sobre una membrana de apoyo y se la estudia por medio de microscopia óptica. Moviendo el portamuestras se pueden estudiar diferentes regiones de la célula. Se adapta el foco moviendo la célula en la dirección z. En un momento concreto determinado se aplican nanopartículas sobre la muestra, continuándose el estudio de la muestra por medio de microscopia óptica. Cuando se presenta una zona especialmente interesante, se aspira el de aire alrededor de la célula por medio de sustancialmente una bomba de vacío y se disminuye la temperatura de la muestra en unos cuantos grados Celsius. Se regula luego la presión de modo que se presente un equilibrio entre agua en forma de vapor y agua líquida. De esta manera, se consigue que se mantenga una delgada película de agua sobre la muestra, mientras que el interior de la célula contiene agua. En determinados casos, se puede inmovilizar el material celular, por ejemplo por medio de glutaraldehído, y se puede sustituir el líquido por agua pura. Se conecta entonces el haz de electrones y se escanea con éste la muestra. El haz de electrones es un delgado haz convergente con un semiángulo típico de 5 mrad y es dirigido hacia un punto especialmente interesante de la muestra. Se genera un contraste sobre el material celular dispersando el haz de electrones. Los electrones dispersados y dispuestos en un cono con un semiángulo de apertura de 0,20 mrad se recogen en el espacio de deriva y llegan al detector. Con el detector STEM se recogen las señales de al menos los electrones con semiángulos entre 50 mrad y 0,20 rad. Se escanea píxel a píxel la muestra con el haz de electrones y se almacena la señal STEM. Con STEM se consiguen una resolución en el dominio nanométrico, un alto contraste en marcadores de alto número atómico y una menor resolución en la zona del material celular. El haz fotoóptico se emplea al mismo tiempo para iluminar la muestra y concentrar la luz dispersada o fluorescente. Tras la detección STEM se puede emplear también la microscopia óptica para estudiar la célula después de haberla expuesto al haz de electrones y para estudiar diferentes regiones celulares.

Cae dentro del marco de la presente invención un procedimiento para estudiar una célula por medio de microscopia óptica y microscopia electrónica, en el que los haces de luz y de electrones están espacial y temporalmente unidos o correlacionados. A este fin, se monta primero la muestra sobre un delgado soporte y se desplaza éste en las direcciones x, y y z hasta la posición deseada con relación al haz de electrones. El posicionamiento espacial del haz de electrones, el haz de luz y la muestra es conocido con toda precisión y, por tanto, las imágenes están espacialmente correlacionadas de una manera correspondiente. El aparato está exactamente dimensionado con este fin. Además, se puede calibrar la relación espacial o la correlación de las trayectorias de los haces. Se emplean para ello tomas fotográficas de imágenes con objetos bien reconocibles. Se puede adquirir a partir de éstas la correlación de las trayectorias de los haces y, mediante almacenamiento, se hace posible el establecimiento de la relación espacial de las imágenes de muestras que se deben estudiar. Una vez que se han tomado las imágenes, se almacenan éstas, por ejemplo, en un fichero de datos, con lo que tales imágenes pueden acoplarse con los datos de correlación espaciales. Las imágenes de la microscopia óptica y la microscopia electrónica pueden representarse por separado o bien pueden representarse o superponerse en el mismo sistema de coordenadas para que se obtenga una imagen global dela muestra.

La invención comprende también un procedimiento para poder correlacionar temporalmente las imágenes de microscopia óptica y microscopia electrónica. A este fin, por ejemplo, se toman las imágenes de microscopia óptica y microscopia electrónica al mismo tiempo o casi al mismo tiempo y se miden o calculan el momento concreto y la duración de la toma fotográfica. Así, por ejemplo, se almacenan las dos imágenes de la microscopia óptica y la microscopia electrónica y, al mismo tiempo, los momentos concretos de las tomas fotográficas. La toma de las imágenes puede tener lugar también en un orden determinado, por ejemplo dos imágenes de microscopia óptica y una imagen STEM. La toma de las imágenes puede efectuarse también de un modo repetitivo. Por ejemplo, se pueden tomar 100 imágenes de microscopia óptica con breves pausas intercaladas, mientras que se toman en paralelo siete imágenes por medio del procedimiento STEM. En este procedimiento se almacenan las imágenes con inclusión del momento concreto y la duración de las tomas fotográficas, con lo que es posible una representación temporalmente correlacionada de las imágenes.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Dispositivo para la microscopía electrónica de barrido-transmisión - STEM - y la microscopía óptica correlativas con miras al estudio de una muestra (1), que comprende un detector STEM, caracterizado por que el detector STEM (7) está integrado en una lente fotoóptica (8).

2. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado por que el detector STEM está dispuesto en una cavidad (5) de la lente fotoóptica (8).

3. Dispositivo según la reivindicación 2, caracterizado por que la cavidad (5) presenta en el lado de la muestra una abertura de pequeño diámetro a la que se une un espacio cónico (6) de deriva de electrones, en cuyo extremo inferior está dispuesto el detector STEM (7).

4. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la señal del detector STEM (7) puede conducirse hacia fuera en el lado de la lente.

5. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que en el lado de la lente fotoóptica (8) vuelto hacia la muestra (1) está dispuesto un portamuestras (2).

6. Dispositivo según la reivindicación 5, caracterizado por que el portamuestras (2) esté construido como una delgada membrana (2) permeable a los electrones.

7. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, caracterizado por que una fuente de haces de electrones está dispuesta en el lado del portamuestras (2) opuesto al detector STEM (7).

8. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que una fuente de luz y unos medios de detección fotoópticos estén unidos con la lente (8).

9. Dispositivo según la reivindicación 8, caracterizado por que están previstas una o más trayectorias de haz fotoópticas distintas para fines de detección o de iluminación.

10. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, caracterizado por que la fuente de luz está dispuesta a un lado del detector STEM (7), el haz de luz se solapa en el foco con el haz de electrones (3) y una vía de detección fotoóptica se solapa con el haz de iluminación.