ES2843553B2 - Tirosinasa de champinon como inhibidor del virus de la hepatitis c - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

TIROSINASA DE CHAMPIÑON COMO INHIBIDOR DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C

La presente invención se refiere al uso de tirosinasas de champiñón blanco, o fragmentos activos de las mismas, como medicamento, preferiblemente en el tratamiento de la hepatitis C, así como a composiciones farmacéuticas que comprenden dichas tirosinasas para el tratamiento de la hepatitis C. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la medicina, más concretamente en el campo de los fármacos o composiciones con capacidad antiviral, preferiblemente contra el virus de la hepatitis C.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La infección por el virus de la hepatitis C (VHC) es uno de los principales problemas de salud en el mundo. El VHC es un virus de ARN pequeño, de una sola hebra y que está formado por varias proteínas implicadas en su ciclo de replicación, que se procesan en el retículo endoplásmico (ER). Dentro de todas estas, las proteínas no estructurales NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B presentan una gran importancia debido a que la mayoría de los fármacos actualmente comercializados con indicación terapéutica, así como los que se están desarrollando, se basan en mecanismos de inhibición de algún tipo de estas proteínas.

Entre ellas, NS2 es una proteína multifuncional esencial para el ensamblaje y la replicación debido a su función como una cisteína proteasa autocatalítica. El dominio N-terminal de NS3 es la segunda proteasa viral que procesa el polipéptido viral hacia el extremo C, mientras que el dominio C-terminal de NS3 tiene una función helicasa. NS4A es una pequeña proteína hidrofóbica que sirve como cofactor para la serina NS3 proteasa. NS4B y NS5A son proteínas involucradas en la replicación y el ensamblaje. NS5B es la ARN polimerasa dependiente de ARN viral que forma un complejo de replicaciónjunto con NS3, NS4A, NS4B y NS5A.

Actualmente, algunos de los sistemas más conocidos en la formulación de fármacos contra el virus de la hepatitis C consisten en una mezcla de varias moléculas. Por ejemplo, Harvoni®, ultimo fármaco registrado por Gilead (2014), es una combinación de los compuestos Sofosbuvir y Ledipasvir, compuestos inhibidores frente a las proteínas NS5B y NS5A respectivamente. Otros fármacos comerciales que consisten en una combinación de compuestos son Epclusa® (Gilead), Vosevi® (Gilead), Zepatier® (MSD) y Maviret® (Abbvie).

Existen compuestos químicos, naturales y sintéticos, con capacidad antiviral contra el VHC. Por ejemplo, en el documento CN109574828A se describe el uso de los sesquiterpenoides extraídos de la fermentación del hongo Trichoderma harzianum en la inhibición del VHC. También, en el documento CN109627272A se describe un análogo de nucleósido fosfato para su uso en el tratamiento de la hepatitis C. Asimismo, en el documento CN109503518A se describe una composición farmacéutica que comprende un compuesto de diarilamida con actividad anti-VHC. En el documento JP2018076368A se describe una combinación de compuestos capaces de inhibir la función de la proteína NS5A del VHC.

Sin embargo, los tratamientos actualmente disponibles contra el virus de la hepatitis C son demasiado caros y muchos pacientes, sobre todo de países menos desarrollados, no tienen acceso a ellos. Son tratamientos que cuestan alrededor de 60.000€, así, incluso en países desarrollados, los presupuestos destinados a la salud se ven sobrepasados, obligando a que los gobiernos establezcan criterios restrictivos para la prescripción de estos medicamentos.

Se estima que en el mundo hay alrededor de 150 millones de personas infectadas por el VHC. Se hace, por lo tanto, necesario desarrollar tratamientos efectivos contra el virus alternativos a los existentes que además sean de bajo coste.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han demostrado que tirosinasas presentes en el champiñón blanco (Agaricus bisporus), y fragmentos de las mismas, tienen actividad antiviral contra el virus de la hepatitis C (VHC) mediante un mecanismo de inhibición basado en la hidroxilación selectiva de una tirosina superficial a L-DOPA y posterior Dopacromo de las proteínas implicadas en la replicación del virus (NS3, NS4 o NS5). Estas tirosinasas son proteínas que se extraen fácilmente del champiñón o de extractos proteicos comerciales de champiñón y, por tanto, son proteínas que pueden obtenerse fácilmente y formar parte de composiciones farmacéuticas o terapéuticas para el tratamiento de la hepatitis C, obteniendo con ello medicamentos de menor coste para los pacientes diagnosticados con dicho virus.

Los inventores purificaron las tirosinasas tanto de un extracto proteico comercial de Agaricus bisporus semipurificado de Sigma® como directamente de champiñón blanco. Posteriormente, realizaron ensayos de actividad L-DOPA in vitro, para comprobar la actividad tirosinasa, y determinaron la toxicidad celular y la actividad antiviral de las mismas en cultivos de células tumorales hepáticas Huh 5-2 transfectadas con un plásmido que incluye todas las proteínas no estructurales presentes en el virus de la Hepatitis C. Mediante dichos ensayos, los inventores determinaron que tanto la tirosinasa nativa obtenida directamente del champiñón blanco (A. bisporus), la cual es un tetrámero que comprende dos subunidades H¹L¹H²L² , donde las subunidades H pesan 45kDa y las subunidades L pesan 12kDa, como las subunidades H de dicha tirosinasa (dímero Hⁱ H2), denominada en la presente invención “tirosinasa Tyr45 o TyrAB”, son capaces de inhibir la replicación del virus de la hepatitis C sin inducir toxicidad en las células hepáticas.

Además, los inventores han descubierto una isoforma postraduccional de la tirosinasa Tyr45, denominada “Tyr50” por su peso de 50kDa, la cual han demostrado que presenta una capacidad antiviral aún más elevada que las demás tirosinasas testadas (hasta 10 veces mayor que la inhibición observada por Tyr45), y que fármacos conocidos, particularmente que el fármaco comercial Ribavirina®.

Por tanto, un primer aspecto de la invención es una tirosinasa de Agaricus bisporus para su uso como medicamento, preferiblemente para el tratamiento de la hepatitis C en un sujeto, donde el sujeto preferiblemente es un mamífero, más preferiblemente un humano.

El término “tirosinasa de Agaricus bisporus” o “tirosinasa de A. bisporus” o “tirosinasa de champiñón” , utilizados indistintamente en la presente invención, se refiere a una metaloenzima que contiene cobre y que cataliza la oxidación de un fenol, como por ejemplo la tirosina, donde dicha enzima pertenece a la especie Agaricus bisporus, cuyo nombre común es el champiñón blanco. El número de clasificación enzimática (número EC) es EC 1.14.18.1.

La tirosinasa de A. bisporus comprende una estructura tetramérica con un peso molecular alrededor de 120KDa, formada por dos dímeros, donde cada dímero comprende una subunidad larga denominada “subunidad H” con un peso molecular alrededor de 45KDa y una subunidad pequeña denominada “subunidad L” con un peso molecularalrededorde 12KDa, obteniendo el homodímero H¹L¹H²L².

Los inventores han demostrado que la tirosinasa de A. bisporus, extraída directamente del champiñón, no presenta toxicidad en células hepáticas y tiene actividad antiviral contra el virus de la hepatitis C (VHC), por lo que dicha enzima puede usarse para el tratamiento de la infección provocada por dicho virus.

El término “tratamiento de la hepatitis C” o “tratamiento del virus de la hepatitis C” o “tratamiento contra el VHC” , utilizados indistintamente en la presente invención, se refiere a combatir, inhibir, detener, revertir, aliviar y/o estabilizar las consecuencias, condiciones patológicas, complicaciones, sintomatología y/o efectos causados por el virus de la hepatitis C en un sujeto, o a frenar el desarrollo de la enfermedad.

En el contexto de la presente invención se entiende por “sujeto” o “individuo” cualquier animal, de cualquier raza, sexo o edad. En una realización preferida, el sujeto es un mamífero y más preferiblemente un humano.

Los inventores han demostrado también que las subunidades H de la tirosinasa, que se presentan formando un dímero H¹H² , presentan también la actividad antiviral contra el VHC. Este dímero de las subunidades H se denomina en la presente invención Tyr45 o tirosinasa Tyr45 o TyrAB, términos utilizados indistintamente en la presente invención. Este dímero activo de tirosinasa comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1. La SEQ ID NO: 1 de la presente invención es, por tanto, la Tyr45 o TyrAB (H¹H²).

Por ello, otro aspecto de la invención se refiere a un polipéptido (“polipéptido de la invención”) que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 para su uso como medicamento. Preferiblemente, dicho polipéptido comprende la SEQ ID NO: 2. La SEQ ID NO: 2 de la presente invención es la secuencia completa de la tirosinasa de A. bisporus, es decir, el tetrámero formado por dos subunidades H¹L¹H²L².

En una realización más preferida, dicho polipéptido de la invención consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

Adicionalmente, los inventores han demostrado la existencia de una isoforma de la tirosinasa Tyr45 (de SEQ ID NO: 1), denominada Tyr50, cuya diferencia en peso (50 KDa en la Tyr50 frente a 45 KDa en la Tyr4b) se debe a cambios postraduccionales, principalmente glicosilación, la cual está presente tanto en el champiñón blanco como en extractos proteicos semipurificados comerciales de champiñón. Dicha isoforma es capaz también de inhibir la replicación del virus de la hepatitis C, proporcionando una capacidad antiviral incluso más elevada que las demás tirosinasas aquí ensayadas y que fármacos conocidos como la Ribavirina, y que es hasta 10 veces superior a la inhibición observada por Tyr45, con un EC50 de 0,0012-0,0025 frente a 0,006-0,012, respectivamente.

Así, en otra realización particular, el polipéptido de la invención consiste en una isoforma postraduccional, glicosilada, de la secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 1. A esta isoforma se le denomina en la presente invención “Tyr50”.

En la presente invención el término “isoforma postraduccional” o “isoenzima postraduccional” se refiere a una forma diferente o equivalente de la tirosinasa Tyr45 de SEQ ID NO: 1, generada a partir del mismo gen pero sometida a modificaciones postraduccionales o a maduración diferencial y/o a splicing alternativo. De esta manera, la tirosinasa Tyr45 y la isoforma Tyr50 poseen la misma secuencia aminoacídica (SEQ ID NO: 1) pero la segunda presenta modificaciones postraduccionales en relación a la primera.

En la presente invención el término “modificación postraduccional” se refiere a los cambios, modificaciones, alteraciones, variaciones o transformaciones que sufre la tirosinasa Tyr45 después de su síntesis en los ribosomas como uno de los pasos finales de su síntesis y de su expresión génica. Dichas modificaciones postraduccionales comprenden la adición o eliminación de un grupo funcional o químico o el acoplamiento de dos o más proteínas. El experto en la materia conoce los tipos de modificaciones postraduccionales que existen. Una modificación postraduccional se selecciona, por ejemplo, de la lista que, sin limitar, consiste en: acilación, fosforilación, metilación, hidroxilación, glicosilación, glicación, sulfonilación, prenilación, palmitoilación, nitrosilación, nitración, sumoilación y ubiquitinación.

En particular, la modificación postraduccional que presenta la isoforma Tyr50 es glicosilación.

Preferiblemente, la isoforma glicosilada de la secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 1 a la que se refiere la presente invención, es decir, la isoforma Tyr50, se obtiene mediante el procedimiento descrito en López-Tejedor D. y Palomo José M., 2018, Protein expression and purification, 145: 64-70. Brevemente, dicha isoforma se obtiene mediante un procedimiento que comprende los siguientes pasos: la tirosinasa de Agaricus bisporus liofilizada comercial de Sigma-Aldrich®, más preferiblemente 1 mg de dicha tirosinasa, se disuelve en agua destilada, preferiblemente en 4 mi de agua destilada. A continuación, a esta solución se le añade octadecyl-Sepabeads® (preferiblemente 0,5 g) y, después de incubar la mezcla durante preferiblemente dos horas, ésta se filtra a vacío, recuperando el sobrenadante al cual se añade tampón de fosfato de sodio, preferiblemente a pH 7, hasta una concentración final de preferiblemente 100 mM, y Tritón™ X-100 hasta una concentración final de preferiblemente 0,07% (p/v). Por último, se adiciona octadecyl-Sepabeads® (preferiblemente 0,5 g) a esta solución y, tras incubar durante preferiblemente 3 h, se recupera el sobrenadante el cual contiene únicamente la isoforma de la enzima pura.

En otra realización más particular el medicamento al que se refiere la presente invención es para su uso en el tratamiento de la hepatitis, Denge o Zika, preferiblemente hepatitis, más preferiblemente hepatitis C, en un sujeto, donde el sujeto es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano.

Otro aspecto de la presente invención, es una composición farmacéutica (“composición farmacéutica de la invención”) que comprende:

a. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:

1 o SEQ ID NO: 2, o

b. un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:

1 o SEQ ID NO: 2, o

c. un polipéptido que consiste en una isoforma postraduccional, glicosilada, de la secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 1, o d. cualquier combinación de (a) a (c),

y un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, para su uso como medicamento.

El término “composición farmacéutica” o “composición terapéutica” , utilizados indistintamente en la presente invención, se refiere a una mezcla, solución o disolución, natural o artificial, usada para la prevención, alivio, tratamiento o curación de enfermedades, preferiblemente de la hepatitis C, en un sujeto, preferiblemente en un mamífero, más preferiblemente en un humano. La administración de dicha composición debe ajustarse a una dosis deseable de la composición y varía dependiendo de la condición y del peso del sujeto, de la gravedad de la enfermedad, de la forma del fármaco, de la ruta y del periodo de administración, y puede ser elegida por el especialista en la técnica.

La composición farmacéutica debe comprender una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de la invención, donde el término “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a aquella cantidad del polipéptido suficiente para producir la prevención y/o el tratamiento de la enfermedad, preferiblemente hepatitis C, en el sujeto, preferiblemente mamífero y más preferiblemente humano. Es práctica de rutina para el experto en la materia calcular la cantidad terapéuticamente efectiva en base a factores tales como la estabilidad enzimática del polipéptido, la biodisponibilidad del mismo una vez administrado, la edad, el sexo y el peso del sujeto a tratar, el estado general de salud del sujeto a tratar, el modo y el tiempo de administración de la composición, etc.

La composición farmacéutica de la invención puede comprender cualquier combinación de los polipéptidos definidos en la presente invención.

Además, la composición farmacéutica de la invención comprende uno o varios excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

El término “excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de los elementos de la composición de la invención, estabiliza dichos elementos, activa o ayuda a la preparación de la composición en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que la hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo es el caso de almidones, azúcares o celulosas, la función de endulzar, la función de colorante, la función de protección de la composición, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o la humedad, la función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, como por ejemplo, es el caso del fosfato de calcio dibásico, la función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

El “vehículo” , al igual que el excipiente, es una sustancia que se emplea en la composición para diluir cualquiera de los componentes comprendidos en ella hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacológicamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los principios activos comprendidos en la composición. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacológicamente aceptable es el diluyente. El término "vehículo" se refiere por tanto a un diluyente, coadyuvante o portador con el que se debe administrar la composición de la invención; obviamente, dicho vehículo debe ser compatible con dicha composición. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos, tales como agua, disolventes, aceites o surfactantes, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como por ejemplo, y sin sentido limitativo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, aceites de ricino, polisorbatos, ésteres de sorbitano, éter sulfatos, sulfatos, betaínas, glucósidos, maltósidos, alcoholes grasos, nonoxinoles, poloxámeros, polioxietilenos, polietilenglicoles, digitonina y similares. Otros ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de la lista que, sin limitar, consiste en: agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol, lactosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, celulosa, metil celulosa, carboximetil celulosa sódica, hidroxipropilmetil celulosa, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, polivinilpirrolidona, polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico y alginato de sodio.

El excipiente o vehículo también incluyen cualquier sustancia que sirva para mejorar el suministro y la eficacia del principio activo dentro de la composición farmacéutica, además pueden comprender cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que mejoran la vida útil o la eficacia de la composición farmacéutica.

El mecanismo de inhibición viral sobre el VHC descrito aquí para el polipéptido de la invención es extrapolare a otros virus de la hepatitis, a Dengue o a Zika. Así, en otra realización particular, la composición farmacéutica a la que se refiere la presente invención es para su uso como medicamento en el tratamiento de la hepatitis, Dengue o Zika, preferiblemente hepatitis, más preferiblemente hepatitis C, en un sujeto, donde el sujeto es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano.

En otra realización preferida, la composición farmacéutica de la invención se administra sola o en combinación, secuencial o simultánea, con uno o varios fármacos o principios activos empleados para el tratamiento de la hepatitis C de entre los conocidos en la técnica. Ejemplos de dichos fármacos son, pero sin limitarnos, Harvoni®, Epclusa®, Vosevi®, Zepatier® o Maviret®, o los principios activos sofosbuvir, ledipasvir, velpatasvir, voxilaprevir, elbasvir, grazoprevir, glecaprevir, pibrentasvir o rivabirina.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIGURA 1. Muestra la inhibición del replicón del virus de Hepatitis C (VHC), evaluación de la potencia y citotoxicidad de la proteína en los ensayos celulares. La tasa de replicación del replicón VHC se muestra con barras negras y la supervivencia celular con cuadrados cerrados, ambas se midieron en cultivo de células aumentando la concentración de proteína para determinar el EC50. La proteína está en solución acuosa a pH 5.

FIGURA 2. Muestra el efecto de la presencia de Tritón X-100 en la inhibición del replicón del virus de Hepatitis C (VHC), evaluación de la potencia y citotoxicidad de la proteína en los ensayos celulares. La tasa de replicación del replicón VHC se muestra con barras negras y la supervivencia celular con cuadrados cerrados, ambas se midieron en cultivo de células aumentando la concentración de proteína para determinar el EC50.

FIGURA 3. Muestra la inhibición del replicón del virus de Hepatitis C (VHC), evaluación de la potencia y citotoxicidad de la proteína en los ensayos celulares. La tasa de replicación del replicón VHC se muestra con barras negras y la supervivencia celular con cuadrados cerrados, ambas se midieron en cultivo de células aumentando la concentración de proteína para determinar el EC50. La muestra de proteína purificada (0,25 mg/ml) contenía <0,05% deTriton X-100.

FIGURA 4. Muestra la inhibición del replicón del virus de Hepatitis C (VHC), evaluación de la potencia y citotoxicidad de la proteína en los ensayos celulares. La tasa de replicación del replicón VHC se muestra con barras negras y la supervivencia celular con cuadrados cerrados, ambas se midieron en cultivo de células aumentando la concentración de proteína para determinar el EC50. Muestra de TyrAB purificada (0,25 mg/ml) (A) y muestra de la isoforma Tyr50 (0,5 mg/ml) en 10 mM fosfato sódico pH 7 (B).

FIGURA 5. Muestra la inhibición del replicón del virus de Hepatitis C (VHC), evaluación de la potencia y citotoxicidad de la isoforma Tyr50 inactivada con temperatura en los ensayos celulares. A) Inactivada a 37°C (parcialmente activa). B) Inactivada a 80oC (inactiva). La tasa de replicación del replicón VHC se muestra con barras negras y la supervivencia celular con cuadrados cerrados, ambas se midieron en cultivo de células aumentando la concentración de proteína para determinar el EC50. Proteínas a 0,5 mg/ml en10 mM fosfato sódico pH 7.

EJEMPLOS

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que ponen de manifiesto la actividad antiviral de la tirosinasa de champiñón contra el virus de la hepatitis C.

MATERIALES Y MÉTODOS

Purificación de tiros inasas de un extracto com ercial sem ipurificado de Agaricus bisporus de Sigma®.

Mediante este protocolo se consiguió purificar dos isoformas diferentes de tirosinasa activas en forma dimérica (subunidades H) (Tyr45 y Tyr50) del polvo crudo comercial de Sigma-Aldrich®.

Se disolvió 1 mg de tirosinasa liofilizada comercial de Sigma-Aldrich® en 4 mi de agua destilada. Se añadieron 0,5 g de octadecyl-Sepabeads® (C18-1) a esta solución y la mezcla se incubó durante 2 h. Después, se filtró la mezcla en vacío, se recuperó el sobrenadante y se añadió tampón de fosfato de sodio a pH 7 hasta una concentración final de 100 mM. Posteriormente, se agregó Tritón™ X-100 hasta una concentración final de 0,07% (p/v). Se añadieron 0,5 g de octadecyl-Sepabeads® fresco (C18-2) a este sobrenadante y la mezcla se incubó durante 3 h.

Mediante SDS-PAGE, los inventores confirmaron que el sobrenadante solo contenía la isoforma Tyr50, mientras que el sólido contenía Tyr45 y una ligera cantidad de Tyr50. Se realizó una semipurificación previa mediante la desorción del derivado C18-2 utilizando diferentes concentraciones de Tritón X-100. Finalmente, se purificaron las muestras de proteínas solubles para reducir la cantidad de detergente en la muestra mediante ultrafiltración con Amicon Ultra 10kDa (<0,05%).

Procedim iento de extracción de tiros inasa directam ente del cham piñón.

Los inventores cortaron en trozos pequeños 25 g de champiñones blancos (A. bisporus) (procedencia supermercados Eroski) y se agregaron a 50 mi de acetona fría. Mantuvieron la mezcla en agitación de palas durante 30 minutos dentro de un baño de hielo y luego la centrifugaron a 7000 rpm durante 20 minutos y recuperaron el sedimento, descartando la solución. Suspendieron este sólido en 25 mi de agua destilada e incubaron la mezcla durante 1 hora, luego la centrifugaron a 8000 rpm durante 40 min. Después de la filtración, realizaron el proceso de precipitación salina agregando 60% (p/v) de sulfato de amonio, agregándolo poco a poco, seguido de 1 h de incubación. Después, centrifugaron la mezcla a 8000 rpm durante 40 minutos, recuperaron el sólido y lo almacenaron a -20oC.

Ensayo de activ idad L-Dopa in vitro.

Los inventores comprobaron la actividad tirosinasa en presencia de 2 mi de L-DOPA 1 mM en tampón fosfato 0,1 M a pH 7 y temperatura ambiente, usando un espectrofotómetro V-730 (Jasco), midiendo el aumento de la absorbancia de los aminocromos a 475 nm causado por 40 pl de solución enzimática y tomando la velocidad inicial entre 10 y 70 segundos de la reacción. Una unidad de actividad enzimática (U) se definió como la cantidad de enzima que causa un aumento de la absorbancia en 0,001 / min a 25°C.

Determ inación de la tox ic idad ce lu lar y la activ idad antiviral.

En estos ensayos, los inventores utilizaron un tipo celular Huh 5-2, células tumorales hepáticas (Lunet) que fueron transfectadas con un plásmido con un sistema replicón en el que se incluyen todas las proteínas no estructurales presentes en el virus de la Hepatitis C (NS2, NS3, NS4, NS5A y NS5B). Al no contener las proteínas estructurales no es infectivo, pero permite cuantificar mediante la introducción de una secuencia reportero (que codifica para la enzima luciferasa), la tasa de replicación del sistema dentro de las células. En caso de producirse inhibición de la replicación, ésta se manifestará en la reducción de la señal de luminiscencia que se obtiene.

Los inventores realizaron el cultivo celular de Huh 5-2 utilizando DMEM con Rojo Fenol (RF) como medio de cultivo, suplementado con Suero Fetal Bovino (SFB), Penicilina / Glutamina / Streptavidina, aminoácidos no esenciales (NEAA) y 500 pg/ml Geneticina (G418) de Invitrogen (selección de células con sistema replicón en su interior). Las condiciones de cultivo fueron: temperatura 37°C, 5% CO² , 95% de aire y 1 atm de presión.

Para determinar tanto la actividad antiviral de las tirosinasas como la toxicidad celular de las mismas, utilizaron placas de 96 pocilios sembradas con 7000 células por pocilio (utilizando DMEM sin RF) en las que testaron concentraciones seriadas crecientes de tirosinasas (de 0 a 0,2 mg/ml) por triplicado para cada una de las concentraciones (100 pl por pocilio). Incubaron las células durante 72 horas con las tirosinasas, transcurridas las cuales evaluaron tanto su citotoxicidad como su actividad antiviral (en placas duplicadas).

Para la citotoxicidad, en una de las placas determinaron el metabolismo celular de cada uno de los pocilios mediante el reactivo Cell Titer 96®AQueous de Promega. Eliminaron el sobrenadante de los pocilios y añadieron 20 pl de Cell Titer 96®AQueous diluido 1:4 en el mismo medio de cultivo DMEM pero sin RF, y lo incubaron durante 3h a 37°C, 5% CO² y 1 atm de presión. Transcurrido este tiempo, midieron la absorbancia a 490nm y 800nm. La diferencia de estos valores de absorbancia a estas longitudes de onda corresponde al sustrato que es metabolizado por las células viables en el cultivo. Determinaron cada concentración de tirosinasa por triplicado, y realizaron la media de los valores obtenidos. Representaron en una gráfica la relación entre la concentración de tirosinasa y el porcentaje de absorbancia (tomando como valor 100%, los valores en los pocilios blanco sin tratamiento con tirosinasa). Calcularon el LC50 como la concentración de tirosinasa a la que se reduce en un 50% la viabilidad celular (respecto a la obtenida en ausencia de tratamiento).

Para la actividad antiviral, en otra de las placas los inventores determinaron la luminiscencia de cada uno de los pocilios mediante el reactivo Bright-Glo™ Luciferase Assay System de Promega. Sin quitar el sobrenadante, añadieron 30 pl de reactivo por pocilio y determinaron la señal de luminiscencia en un Lector Multi-Modal de Microplacas Synergy HT de Biotek (software Gen5™ Data Analysis). La luminiscencia obtenida es proporcional a la cantidad de ARN expresado por el gen reportero. Determinaron la concentración de tirosinasa por triplicado, y realizaron la media de los valores obtenidos. Representaron en una gráfica la relación entre la concentración de tirosinasa y el porcentaje de luminiscencia (tomando como valor 100%, los valores en los pocilios blanco sin tratamiento con tirosinasa). Calcularon el EC50 como la concentración de tirosinasa a la que se reduce en un 50% la replicación viral (respecto a la obtenida en ausencia de tratamiento).

RESULTADOS

En primer lugar, se evaluaron tanto la toxicidad como la actividad antiviral frente a células tumorales hepáticas (Huh 5-2) del extracto comercial de Sigma de tirosinasa de Agaricus bisporus. La tirosinasa es un tetrámero (homodimero) formado por dos subunidades H¹L¹H²L² , donde las subunidades H pesan 45kDa y las subunidades L 12kDa. Este extracto es semipurificado y presenta únicamente las subunidades H (activas) de 45kDa (dimero H¹H²) (TyrAB). Además, este preparado semipurificado contiene, además de TyrAB, otra proteína con actividad tirosinasa de 50 kDa (Tyr50) (actividad tirosinasa determinada por ensayo de actividad en electroforesis nativa).

El extracto de Sigma semipurificado fue valorado a pH 5 y 7, obteniéndose en ambos casos resultados similares, el extracto no presento toxicidad hacia las células hepáticas dando un sorprendente valor de inhibición de la replicación del virus (EC50 aproximadamente 0,02 mg/ml) (Figura 1).

Una vez observado esto, se procedió a evaluar si dicho resultado correspondía a la tirosinasa, y para ello se procedió a la purificación de la misma. En primer lugar, procedieron a una semipurificación para separar las tirosinasas del resto de proteínas del extracto comercial y evaluar su actividad antiviral.

En este primer proceso preliminar, cuya purificación hizo necesario el uso de un detergente (Tritón X-100), se pudo observar que a concentraciones >0,25% (v/v) de Tritón X-100 en el medio este era tóxico para la célula (Figura 2). Las muestras purificadas que contenían <0,05% de detergente, donde únicamente están presentes las tirosinasas, dio lugar a un resultado aún mejor que el obtenido la primera vez, ninguna toxicidad celular y un EC de inhibición antiviral de 0,001 mg/ml (Figura 3). Esto demostró que las tirosinasas activas son las responsables de la actividad antiviral de la muestra proteica.

De esta forma, para estar completamente seguros de que los resultados se debían a las enzimas y averiguar cuál de ellas era la responsable de la actividad, ambas enzimas {Tyr45 y Tyr50) presentes en el extracto comercial se purificaron, obteniéndose por separado y evaluándose su capacidad antiviral. En ambos casos, los inventores no observaron toxicidad celular y vieron que ambas enzimas presentaron actividad antiviral, aunque la isoforma Tyr50 era la responsable de la mayoría de la actividad, con una capacidad de inhibición de hasta 10 veces superior respecto a la observada por Tyr45, obteniendo un EC50 0,0012-0,0025 frente a 0,006-0,012, respectivamente. (Figura 4, Tabla 1).

Con este resultado los inventores demuestran que no sólo el homodímero H¹H² (Tyr45) de la tirosinasa de champiñón es un excelente inhibidor del virus de la hepatitis C, sino que la isoforma Tyr50 es la responsable de la mayor parte de esa actividad antiviral. Mediante análisis y secuenciación de la banda de electroforesis correspondiente a la proteína pura Tyr50, los inventores demostraron que esta corresponde a una isoforma de la tirosinasa Tyr45 con algún cambio postraduccional, particularmente glicosilación, ya que su secuencia correspondía exactamente con la de la tirosinasa Tyr45 de A. bisporus (SEQ ID NO: 1).

De esta forma, estos resultados parecen demostrar un mecanismo de inhibición de la replicación del virus basado en una actividad enzimática, en este caso en la oxidación selectiva de tirosinas a L-DOPA y posteriormente dopacromo.

Para verificar este nuevo mecanismo de inhibición del virus de la hepatitis C, los inventores evaluaron el efecto inhibitorio de la tirosinasa parcial y totalmente inactivada. Para ello, la tirosinasa purificada Tyr50 fue incubada a 37°C durante 24 h, o a 80oC el mismo tiempo. La tirosinasa incubada a 37°C dio un valor de EC50 de 0,01 (diez veces más alto) mientras que la inactivada a 80oC no inhibió la replicación del virus en absoluto (Tabla 1, Figura 5). Este resultado demuestra que el mecanismo de acción de la tirosinasa pasa por su actividad enzimática.

Un importante resultado es que, en las mismas condiciones, la ribavirina (fármaco utilizado adicional a otros fármacos como Harvoni® en el tratamiento de pacientes con cirrosis) presentó un EC50 de 0,01 mg/ml. Esto significa que la Tyr50 presentó casi 10 veces más potencia que la ribavirina.

Tabla 1. EC50 y LC50 de las diferentes isoformas de tirosinasa purificadas del extracto de A. bisporus de Sigma-Aldrich®. ND: no determinada a las concentraciones testadas.

Considerando estos resultados, los inventores evaluaron la actividad antiviral de un extracto proteico directamente producido a partir del champiñón (A. bisporus). En este caso el método de extracción y semipurificación que los inventores utilizaron permitió obtener la tirosinasa en su forma tetramérica con todas sus subunidades, de este modo se podría valorar el posible efecto de la presencia o ausencia de las subunidades L del homodimero. Este extracto semipurificado no presentó toxicidad celular, dando un valor similar en inhibición de replicación del virus al obtenido anteriormente utilizando la enzima de Sigma, de nuevo corroborando la mayor capacidad inhibitoria del virus en comparación con ribavirina (Tabla 2).

Tabla 2. EC50 and LC50 del extracto purificado directamente de champiñones (Tyr extracto). ND: no determinada a las concentraciones testadas.

Los inventores han demostrado así, a la vista de todos estos resultados, que las tirosinasas presentes en champiñón (A. bisporus) muestran actividad antiviral contra el virus de la hepatitis C a través de un mecanismo catalítico de hidroxilación selectiva de tirosina, donde una de ellas, Tyr50, es 10veces más activa que el fármaco Rivabirina.

Además, han demostrado que la actividad antiviral de estas proteínas se encuentra de forma similar tanto en extractos purificados comerciales como en un extracto directamente obtenido de champiñón.

Además, este nuevo mecanismo de acción de inhibición viral descubierto mediante la tirosinasa podría también ser efectivo en otros virus de la hepatitis, Denge o Zika, siendo así un posible agente farmacológico de amplio espectro.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 para su uso como medicamento.

2. El polipéptido para su uso según la reivindicación 1, que comprende la SEQ ID NO: 2.

3. El polipéptido para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

4. El polipéptido para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, que consiste en una isoforma glicosilada de la secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 1.

5. El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en el tratamiento de la hepatitis C en un sujeto, donde el sujeto es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano.

6. Una composición farmacéutica que comprende:

a. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:

1 o SEQ ID NO: 2, o

b. un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:

1 o SEQ ID NO: 2, o

c. un polipéptido que consiste en una isoforma glicosilada de la secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 1, o

d. cualquier combinación de (a) a (c),

y un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, para su uso como medicamento.

7. La composición farmacéutica según la reivindicación 6, para su uso en el tratamiento de la hepatitis C en un sujeto, donde el sujeto es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano.