ES2842216T3 - Procedimiento para obtener una proteína poliepitópica, así como un vector de ADN para realizar este procedimiento - Google Patents

Procedimiento para obtener una proteína poliepitópica, así como un vector de ADN para realizar este procedimiento Download PDF

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Abstract

Procedimiento para obtener una proteína poliepitópica, caracterizado por que: a) se clona una secuencia de ADN de extremos romos que codifica un epítopo en un sitio reconocido por Smal en un vector de ADN que contiene una secuencia, el módulo de amplificación, que comprende dos secuencias de ADN convergentes reconocidas por Sapl y una secuencia de ADN que se encuentra entre ellas, que contiene un sitio para la clonación en un inserto reconocido por Smal, en el que el módulo de amplificación contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, de manera preferente, el módulo de amplificación posee la secuencia: GCTCTTCACCCGGGCCCAGAAGAGC (SEQ ID NO: 11), b) se amplifica el vector resultante en un huésped bacteriano, se aísla y se digiere con Sapl y, a continuación, se aísla el fragmento que contiene la secuencia de ADN que codifica el epítopo, el cual se modifica de manera que se equipa con extremos cohesivos monocatenarios que facilitan la ligación direccional del inserto al concatémero, c) se autoliga el fragmento aislado, d) se clona el producto de autoligación en un sitio reconocido por Sapl en dicho vector de ADN, tal como se define en el punto a), e) se utiliza el vector resultante para transformar un huésped bacteriano y, a continuación, se expresa y se aísla la proteína poliepitópica, en el que a efectos de aumentar el tamaño de la proteína poliepitópica, las etapas b) a d) se repiten antes de realizar la etapa e), en el vector resultante están presentes secuencias de ADN concatenadas que codifican los epítopos.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para obtener una proteína poliepitópica, así como un vector de ADN para realizar este procedimiento
El objetivo de la presente invención es un procedimiento para obtener una proteína poliepitópica, así como un vector de ADN para realizar este procedimiento. Las proteínas obtenidas según la proteína de la presente invención pueden encontrar un conjunto de usos y, en particular, para la producción de vacunas mejoradas.
Shen, S-H P.N.A.Sci USA 81:4.627-4.631 (1984) da a conocer un procedimiento para obtener una proinsulina multimérica (hasta 7 copias). Los multímeros se obtuvieron utilizando la concatenación consecutiva de tramos de ADN utilizando fragmentos de ADN sintéticos cortados con la endonucleasa IIS, SfaNI, fosfatasa alcalina, polinucleótido cinasa y ADN ligasa. Sin embargo, este procedimiento no permitió producir una secuencia de ADN repetida de forma múltiple en una reacción, ya que cada vez sólo se podía añadir una única copia de monómero adicional.
Lennick et al. Gene 61:103-112 (1987) dan a conocer un gen multimérico que codifica 8 copias de una hormona peptídica - péptido natriurético auricular. El procedimiento descrito no utiliza un vector que permitiría generar múltiples copias de secuencias que codifican un péptido, y el gen multimérico resultante producido in vitro se clonó finalmente en un vector de expresión utilizado habitualmente. Este procedimiento tampoco ha posibilitado multiplicar fácilmente la secuencia de ADN en una sola reacción, ya que cada vez se podía añadir una única copia de monómero adicional.
Kim, S.C. y Szybalski, W., Gene 71:1-8 (1988) dan a conocer un procedimiento para amplificar de manera direccional un fragmento de ADN clonado utilizando una endonucleasa de restricción IIS, BspMI, el vector de ADN pSK3, así como la ADN ligasa. Se obtuvieron 30 copias de monómero en el concatémero. Sin embargo, la utilización de BspMI es dificultosa en la práctica, ya que no digiere completamente el ADN sustrato. En efecto, no es posible mantener la continuidad del ORF y la amplificación introduce secuencias de ADN adicionales en el concatémero amplificado. El procedimiento descrito no permite repetir el ciclo de amplificación, lo cual limita de manera significativa la posibilidad de obtener el número deseado de segmentos de ADN repetidos. El vector descrito no fue un vector de expresión.
Lee, J. H. et al., Genetic Analysis: Biomolecular Engineering 13:139-145 (1996) dan a conocer un procedimiento para amplificar de manera direccional un fragmento de ADN clonado utilizando las endonucleasas de restricción IIS BspMI y Bbsl, el vector de ADN pBBS1, así como la ADN ligasa. Este procedimiento, basado en la autoligación de los extremos de ADN cohesivos de 4 nucleótidos (nt), imposibilita el mantenimiento de la continuidad del ORF, ya que permitió repetir el ciclo de amplificación a efectos de conseguir el número deseado de copias del segmento de ADN amplificado. El vector utilizado no fue un vector de expresión. El procedimiento se utilizó para amplificar un gen de péptido antibacteriano corto, mogainina (108 copias).
Lee, J. H. et al., Protein Expression and purification 12:53-60 (1998) dan a conocer otra variante de un procedimiento basado en el vector descrito previamente, pBBS1. El vector utilizado no fue un vector de expresión. Los autores utilizaron la enzima Bbsl para generar extremos cohesivos de 4 nt, que impedían seriamente la continuidad del ORF. El documento describe la producción de no más de 6 copias del ADN monomérico de ADN en la secuencia amplificada. El procedimiento se utilizó para amplificar el gen del péptido antibacteriano mogainina, así como bufferin II. Wang, Y.-Q y Cai, J.Y. Appl Biochem Biotechnol. 141:203-13 (2007) dan a conocer otra variante de genes multimerizantes que codifican péptidos antibióticos utilizando la autoligación de fragmentos de ADN sintéticos, que contienen extremos cohesivos asimétricos en presencia de 2 adaptadores de ADN. Los adaptadores contenían secuencias reconocidas por las endonucleasas de restricción Sail y EcoRI. El procedimiento no utilizó ningún vector, la amplificación es difícil de controlar y requiere la adición de partes consecutivas del monómero de ADN sintético durante la reacción. El procedimiento dado a conocer de construcción de genes poliméricos, diseñado para la producción de péptidos antibacterianos, dio lugar a 8 copias de monómeros en una proteína polimérica.
Lee et al., Genetic Analysis: Biomolecular Engineering 13 (1996) 139-145, dan a conocer la amplificación secuencial de ADN clonado como multímeros en tándem utilizando enzimas de restricción de clase IIS (véase: título, resumen y figura 1). Sin embargo, los multímeros de ADN obtenidos no codifican multímeros poliantigénicos en forma de un único ORF, que se expresaría como un único polipéptido.
Greetsma y Dutzler, Biochemistry 2011, 3.272-3.278, dan a conocer un vector de clonación en el que se introduce un inserto de ADN que codifica un polipéptido. La introducción del inserto implica digerir el ADN con Sapl como un cortador poco común (resumen, página 3274, columna 2, tercer párrafo cuando se cuenta desde la parte inferior y la figura 1). El documento citado también da a conocer que Sapl genera pequeñas protuberancias (“overhangs”) de tres pares de bases que conectan el ORF diana con elementos de expresión del vector, lo que permite generar fusiones en ambos extremos de la proteína traducida. Sin embargo, no menciona nada sobre cualquier concatenación de múltiples fragmentos de ADN en el vector.
El documento titulado Archive Cloning publicado en 2014 en www.genome.wisc.edu da a conocer la generación de vectores de expresión que comprenden ORF mediante la utilización de la endonucleasa de restricción Sapl para escindir el ORF del plásmido de archivo y su transferencia a un vector de expresión sin una etiqueta para la expresión de proteínas nativas de longitud completa y con una etiqueta de 6xHIS en el extremo amino para la expresión del polipéptido de fusión a partir de los mismos. No obstante, tampoco menciona nada sobre la generación de Or F concatenados en un único ORF para la expresión de una proteína poliepitópica.
El objetivo de la presente invención es dar a conocer un procedimiento para obtener fácilmente una proteína poliepitópica de longitud arbitraria, un vector útil en la realización del procedimiento, así como la obtención de estructuras de poliepítopos de orden superior. Las proteínas poliepitópicas resultantes, así como las estructuras poliepitópicas de orden superior, son útiles en una amplia selección de utilizaciones y, en particular, pueden utilizarse para producir vacunas mejoradas de mayor eficacia.
El objetivo de la presente invención es un procedimiento para obtener una proteína poliepitópica, caracterizado por que:
a) se clona una secuencia de ADN de extremos romos que codifica un epítopo en un sitio reconocido por Smal en un vector de ADN que contiene una secuencia, el módulo de amplificación, que comprende dos secuencias de ADN convergentes reconocidas por Sapl y una secuencia de ADN que se encuentra entre ellas, que contiene un sitio para la clonación en un inserto reconocido por Smal, en el que el módulo de amplificación contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: SEQ ID NO: 1, SEQ iD NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, de manera preferente, el módulo de amplificación posee la secuencia:
GCTCTTCACCCGGGCCCAGAAGAGC (SEQ ID NO: 11),
b) se amplifica el vector resultante en un huésped bacteriano, se aísla y se digiere con Sapl y, a continuación, se aísla el fragmento que contiene la secuencia de ADN que codifica el epítopo, el cual se modifica de manera que se equipa con extremos cohesivos monocatenarios que facilitan la ligación direccional del inserto al concatémero,
c) se autoliga el fragmento aislado,
d) se clona el producto de autoligación en un sitio reconocido por Sapl en dicho vector de ADN, tal como se define en el punto a),
e) se utiliza el vector resultante para transformar un huésped bacteriano y, a continuación, se expresa y se aísla la proteína poliepitópica,
en el que a efectos de aumentar el tamaño de la proteína poliepitópica, las etapas b) a d) se repiten antes de realizar la etapa e), en el vector resultante están presentes secuencias de ADN concatenadas que codifican los epítopos.
De manera preferente, el epítopo es el epítopo del VHB codificado, de manera preferente, por la SEQ ID NO: 9 sintética. De manera preferente, el fragmento de monómero amplificado contiene varios epítopos, provenientes de diferentes proteínas o diferentes regiones de la misma proteína, de manera preferente, codificados por una secuencia sintética. De manera preferente, la proteína poliepitópica contiene, adicionalmente, una secuencia que facilita su purificación, en particular, una etiqueta de fusión que contiene una secuencia de 6 residuos de histidina y el aislamiento realizado en la etapa e) comprende la utilización de cromatografía por metaloafinidad, de manera preferente, sobre residuos de níquel inmovilizados, de manera preferente, una etapa de purificación adicional seleccionada de un grupo que comprende: calentamiento de la muestra de proteína, fraccionamiento utilizando polietilenimina, salificación (“salting out”) con sulfato de amonio y cromatografía en gel de tamizado molecular. De manera preferente, en la etapa e) se inmoviliza la proteína poliepitópica sobre un portador macromolecular, en particular, uno seleccionado entre: microorganismos, células, bacterias, bacteriófagos, virus, viriones defectuosos, proteínas autoagregantes o nanopartículas, de manera preferente, de un sistema de presentación sobre fagos en el bacteriófago T7.
El objetivo de la presente invención es también un vector de ADN para la utilización en el procedimiento, según la presente invención, que contiene la secuencia del módulo de amplificación que comprende dos secuencias de ADN convergentes reconocidas por la endonucleasa SapI y la secuencia de ADN intermedia que se encuentra entre ellas, que contiene un sitio para la clonación en un inserto reconocido por la endonucleasa Smal, en el que el módulo de amplificación contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5 o SEQ ID NO: 6, de manera preferente el módulo de amplificación posee la secuencia: GCTCTTCACCCGGGCCCAGAAGAGC (SEQ ID NO: 11).
De manera preferente, un vector de ADN, según la presente invención, es un vector de expresión de proteínas, que contiene, adicionalmente, un origen de replicación, de manera preferente, p15A, un gen de resistencia a antibióticos, de manera preferente, cloranfenicol, un promotor de la transcripción, de manera preferente, Pr del bacteriófago lambda, un gen represor, de manera preferente, cl857ts, una señal de inicio de la traducción y, posiblemente, una secuencia que codifica 6 residuos de histidina, así como una secuencia que codifica una señal de parada de la traducción. De manera preferente, tiene la SEQ ID NO: 7. Los siguientes ejemplos contienen una descripción detallada de una posible variante de realización del procedimiento, según la presente invención. Un procedimiento alternativo de clonación en el inserto es la utilización de un vector digerido con Sapl con extremos cohesivos rellenos utilizando ADN polimerasa en presencia de desoxirribonucleótidos trifosfato. Siguiendo la presente invención, un experto en la materia puede proponer variantes de realización posteriores. De manera preferente, el epítopo es un epítopo de VHB, en particular, el codificado por la secuencia sintética 9 (véase también la figura 3). De manera preferente, el segmento de monómero amplificado puede contener diferentes epítopos, de diferentes proteínas o diferentes regiones de la misma proteína, de manera preferente, codificados por una secuencia sintética (véase el esquema en la figura 1).
Los inventores de la presente invención también dan a conocer un procedimiento de construcción, así como la utilización de genes artificiales que no se encuentran en la naturaleza, utilizando procedimientos de ingeniería genética, así como síntesis química, que contiene múltiples copias de ADN que codifican segmentos repetidos, que contienen múltiples unidades monoméricas de uno o más péptidos. La amplificación de un gen que codifica un péptido (epítopo) con una función biológica o química particular conduce a la amplificación de la interacción deseable del (poli)péptido resultante con un ligando específico. En particular, dichas proteínas poliepitópicas son útiles como: (i) antígenos artificiales, una nueva generación de vacunas con una estimulación potencial magnificada del sistema inmunológico; (ii) poliproteínas que contienen módulos para la quelación de metales raros para su producción industrial o remediación ambiental; (iii) un módulo de unión para cofactores enzimáticos (tales como cationes, aniones, moléculas orgánicas), tales como proteasas que actúan dentro de una herida a efectos de detener actividades perjudiciales; (iv) proteínas multiepitópicas protectoras, módulos multiplex que contienen péptidos con activadores o inhibidores de funciones biológicas para el tratamiento de enfermedades moleculares, virales y bacterianas; (V) proteínas multiepitópicas que contienen multímeros de hormonas peptídicas o fragmentos biológicamente activos de proteínas de señalización y aquellas que estimulan la regeneración tisular. Dichas proteínas, situadas en una herida, liberarían gradualmente péptidos biológicamente activos bajo la influencia de proteinasas, estimulando la regeneración del tejido; (vi) la proteína poliepitópica se inmoviliza sobre portadores macromoleculares, tales como microorganismos, células, bacterias, bacteriófagos, virus, viriones defectuosos, proteínas autoagregantes o nanopartículas. La inmovilización se puede realizar utilizando medios genéticos o químicos. Las proteínas poliepitópicas inmovilizadas pueden magnificar el efecto de las utilizaciones previstas (i) -(vi). En particular, los inventores de la presente invención diseñaron un sistema vector-enzimático para la amplificación de un segmento de ADN. El segmento de ADN amplificado puede ser de origen natural o el resultado de una síntesis química.
Ejemplo 1. Esquema general de la realización del procedimiento según la presente invención.
La figura 1 ilustra un esquema general del procedimiento, según la presente invención, descrito utilizando el ejemplo de la amplificación del antígeno de superficie del VHB. Esta representa un esquema del vector de amplificación, así como la reacción de amplificación del epítopo (en la figura: epítopo sintético del VHB). El vector de amplificación contiene 2 secuencias de ADN convergentes reconocidas por la endonucleasa de restricción subtipo IIS, que reconoce, de manera preferente, una secuencia de ADN relativamente larga, que corta el ADN y genera extremos cohesivos de 3 nt (o múltiplos de 3 nt). Se utilizó la endonucleasa Sapl, cuya característica particular es que reconoce una secuencia relativamente larga de 7 pares de bases (única en el vector y el segmento de ADN amplificado) que corta el ADN a una distancia de 1 nt en la cadena superior y 4 nt en la cadena inferior, generando así extremos cohesivos de 3 nt, o el equivalente de un solo codón. Los sitios de Sapl son adyacentes en el vector a la secuencia de la endonucleasa clásica de Tipo II, que está diseñada para clonación en el ADN insertado. Se utilizó la endonucleasa Smal, que corta el ADN dentro de la secuencia de reconocimiento, generando los denominados extremos “romos”. Un vector cortado con Smal puede clonarse con cualquier segmento de ADN arbitrario, sintético o natural, que, a continuación, se amplifica. En una realización preferente, el segmento de ADN amplificado codifica un antígeno o una secuencia de aminoácidos que comprende varios antígenos idénticos o diferentes. El único límite es la longitud del fragmento amplificado, según lo dictado por la longitud del inserto de ADN aceptado por una clase determinada del vector de ADN. El módulo de amplificación se puede transferir a diferentes clases de vectores utilizando la clonación.
Ejemplo 2. Una serie de 6 vectores pAMP1 diseñados.
En la realización de ejemplo mostrada en la figura 2, se diseñó la primera serie de vectores pAMP, basados en el esqueleto del vector, que contenía un origen de replicación p15A. Entre los vectores diseñados, se construyó pAMP1-A (que no contenía la etiqueta de fusión de 6 residuos de histidina), así como pAMP1-HisA (que contenía la etiqueta de 6 residuos de histidina). Adicionalmente, se construyó la serie de vectores pAMP con la opción de la expresión elevada de proteínas bajo el control del fago lambda Pr, así como la opción de fusionar con la etiqueta de His6, lo que permite el aislamiento de la proteína poliepitópica utilizando un protocolo de cromatografía por metaloafinidad eficaz.
Los vectores contienen el origen de replicación, p15A, un gen de resistencia a antibióticos contra cloranfenicol, el promotor de la transcripción fuerte, Pr del bacteriófago lambda, un gen represor, cl857ts, señales de inicio de la traducción, una secuencia de 6 residuos de histidina con afinidad por los iones de níquel, un sistema de sitios de restricción para fusionarse al codón de inicio de la traducción ATG, así como un módulo para la amplificación direccional de un fragmento de ADN que mantiene el ORF, que contiene sitios de restricción convergentes para una endonucleasa de subtipo IIS, de manera preferente, Sapl, separados por un segmento de ADN corto, que puede contener sitios de restricción complementarios para la clonación en el ADN de inserción, de manera preferente, Smal. Las variantes difieren con respecto a la posibilidad de manipular tres marcos de lectura (que pueden ser significativos cuando se amplifican secuencias de ADN naturales, no sintéticas), así como la presencia o ausencia de una etiqueta de His6 (excelente para facilitar el posterior aislamiento de la proteína poliepitópica expresada, independientemente de su carga, solubilidad y otros parámetros bioquímicos). La variante 4 se utilizó para el siguiente ejemplo de amplificación del epítopo del antígeno de superficie del VHB. El módulo de amplificación puede introducirse mediante clonación en varias clases de vectores, que contienen, por ejemplo, orígenes alternativos de replicación, genes de resistencia a antibióticos, promotores de la transcripción y señales de traducción. Por ejemplo, se transfirió el módulo de amplificación al vector pBAD/Myc-HisA, así como pET21d21d(+), que poseía resistencia a ampicilina, un origen de replicación colE1, así como los promotores de transcripción araBAD o T7, respectivamente. Los módulos sintéticos con extremos cohesivos para las enzimas Ncol y Sacl, en versiones que contenían y no contenían la etiqueta de afinidad de 6 residuos de His, se clonaron en un vector cortado con estas enzimas, permitiendo así la expresión de las proteínas poliepitópicas utilizando los promotores araBAD o T7 (respectivamente). Se obtuvieron los vectores: pBADAMP1-A, pBADAMP1-HisA, pETAMP1-A, pETAMP1-HisA que poseían el módulo de amplificación insertado en el MCS (sitio de clonación múltiple) estándar. La secuencia completa del vector pAMP1-HisA utilizado en el ejemplo 3 se muestra como la secuencia 7. Además, en la figura 8 se muestra un mapa de restricción del vector pAMP1-HisA y en la figura 9 un mapa de restricción del vector pAMP1 -HisA con un péptido antigénico clonado de 13 unidades.
Las secuencias de los oligodesoxirribonucleótidos sintéticos, que codifican el módulo de amplificación transferido en los vectores pBAD y pET, utilizadas en el ejemplo 2 se muestran como las secuencias 12, 13, 14 y 15.
Ejemplo 3. Producción de una proteína poliepitópica que contiene un epítopo modelo de 7 aminoácidos del antígeno de superficie del VHB.
En la figura 3 se muestra un epítopo modelo de 7 aminoácidos del antígeno de superficie del VHB sometido a la reacción de amplificación.
El fragmento de ADN sintético que codifica el epítopo del antígeno de superficie del VHB se sometió a un experimento de amplificación piloto en el vector pAMP1-HisA. Se obtuvieron más de 60 copias del epítopo en el concatémero de ADN in vitro, así como 13 copias en la proteína poliepitópica híbrida clonada in vivo.
La figura 4 muestra los resultados de la reacción de amplificación in vitro de un epítopo de 7 aminoácidos de la proteína de superficie modelo del VHB utilizando el vector pAMP1-HisA, la endonucleasa Sapl, así como ADN ligasa.
Se analizó la reacción de amplificación utilizando PAGE. Se clonó un fragmento de ADN sintético de 21 pb en el vector de amplificación pAMP1-HisA, que codificaba el epítopo de 7 aminoácidos del VHB. Un plásmido que contenía el epítopo monómero del VHB se digirió con la endonucleasa Sapl, escindiendo el gen del epítopo modificado de la construcción del plásmido. La modificación consistió en añadirle extremos cohesivos en 5' monocatenarios de 3 nt. Aparte de la función de amplificación, en la proteína híbrida polimérica final, estos extremos son responsables de la adición de un residuo de prolina, el denominado “rompedor helicoidal’, que separa los monómeros del epítopo y facilita el plegamiento independiente del epítopo en estructuras terciarias, ayudando así a mantener su estructura espacial natural. El número de “rompedores helicoidales’’ añadidos se puede regular arbitrariamente mediante la incorporación de aminoácidos que los codifican en el extremo del epítopo sintético (al nivel de su ADN codificante). El ADN modificado escindido que codificaba el epítopo se sometió a autoligación in vitro. Los carriles de 5 a 160 minutos muestran la cinética de autoligación. Los productos de la reacción se analizaron electroforéticamente, obteniendo una serie de segmentos de ADN de longitud creciente, que son concatémeros (polímeros) direccionales del gen del epítopo en relación con la reacción de control sin la ADN ligasa (K). Los concatémeros in vitro resultantes se volvieron a clonar en pAMP1-HisA, donde podrían someterse a otro ciclo de amplificación o expresión de la proteína multimérica codificada.
La figura 5 muestra los resultados del análisis de clones híbridos de genes que codifican la proteína poliepitópica del VHB obtenidos durante la primera ronda de amplificación.
La mezcla de genes de epítopos del VHB sintéticos polimerizados in vitro (figura 4, carril: MEZCLA) utilizando el siguiente sistema: el vector de amplificación pAMP1-HisA/endonucleasa Sapl/ADN ligasa se volvió a clonar en el vector de amplificación pAMP1-HisA para fijar las variantes de genes de epítopos poli-VHB, expresar las proteínas poliepitópicas codificadas, así como para repetir el ciclo de amplificación. En la primera ronda de la reacción de amplificación, se obtuvo una serie de clones que contenían de 2 a 13 copias del epítopo (carriles 1-13, análisis de PCR, los fragmentos de ADN migran cada vez más lentamente debido a su longitud creciente, un signo directo del número de copias de epítopos unidos). Un análisis de la secuencia de ADN mostró la continuidad del ORF en las construcciones resultantes, por lo tanto, cada uno de dichos poligenes sintéticos codifica una proteína poliepitópica del VHB diferente, lo cual es significativo con respecto a la función diana de estas proteínas sintéticas. Esto se debe al hecho de que sus diferentes variantes inducirán diferentes intensidades de respuesta inmunitaria, así como también diferentes solubilidades. Después de volver a escindir con Sapl, cada una de las variantes del gen concatémero puede someterse completamente a otra reacción de amplificación, lo que conduce a posteriores poligenes compuestos por cientos de copias del gen del epítopo del VHB (separados por residuos de prolina), dentro de la construcción híbrida, manteniendo la continuidad del ORF en un sistema de hiperexpresión bacteriana de Escherichia coli. De este modo, cada ronda de amplificación consecutiva aumenta el número de copias de monómero en el concatémero a una velocidad geométrica, lo que lleva a obtener en poco tiempo el número planificado de copias en las variantes de la construcción del plásmido diana.
La figura 6 muestra los resultados de la segunda ronda de amplificación de un concatémero pentámero del epítopo del VHB.
El fragmento de ADN se cortó utilizando la endonucleasa Sapl de una construcción pAMP1-HisA que contenía un concatémero de 5 copias de epítopo, obtenido durante la primera ronda de amplificación, y se sometió a amplificación de nuevo. El concatémero más grande, visible en el borde de la resolución del gel de agarosa, contiene 12 copias del pentámero, que constituye un epítopo del VHB polimerizado de manera direccional 60 veces. Los concatémeros más grandes son visibles de manera evidente, aunque no están separados en bandas distintas. Los productos resultantes de la segunda ronda se volvieron a clonar en pAMP-HisA y se pueden someter a una tercera ronda de amplificación, lo que conduce a la producción de cientos o miles de copias del epítopo del VHB, establecidas en un único polipéptido (proteína) recombinante con un ORF. Estos clones también se sometieron a la expresión analítica a efectos de obtener variantes de la multiplicación de epítopos dentro de la proteína poliepitópica.
La figura 7 muestra un análisis de expresión de ejemplo del gen híbrido que codifica la proteína poliepitópica del VHB, obtenido durante la primera ronda modelo de amplificación (13 unidades) en el vector pAMP1-HisA (SEQ ID. No. 7, figura 8). Se realizó un análisis electroforético de las 13 unidades del epítopo poliVHB expresado en un gel de poliacrilamida en condiciones de desnaturalización y tinción con azul de Coomassie. Carril M, marcador de masa proteica (kit de calibración GE LMW); carriles K0-3: cultivo de Escherichia coli recombinante, que contenía una construcción de VHBV de 13 unidades antes de la inducción, y muestreado a las 0, 1, 2 y 3 horas. Carriles 1h-16h: cultivos de Escherichia coli recombinante, que contienen la construcción de VHB de 13 unidades después de la inducción térmica, muestreados a las 1, 2, 3, 4 y 16 horas. La flecha roja indica la banda de 13 unidades de VHB en crecimiento, teñida de rojo púrpura. La tinción rojo púrpura inusual de la banda de 13 unidades, cuya concentración aumenta durante la duración de la inducción de la expresión en bacterias (carriles consecutivos), deriva de la disposición ordenada de la tinción en segmentos de aminoácidos de secuencia repetida y, de este modo, puede servir como una prueba adicional para la presencia de proteínas poliepitópicas durante la detección y el aislamiento. Se utilizó un análisis de expresión (síntesis de proteínas in vivo) en un clon que contenía una variante del gen concatémero de 13 copias resultante de la amplificación de un epítopo de 7 aminoácidos del VHB, en el que cada epítopo está separado por un residuo de prolina (véase el plásmido de expresión: SEQ. ID. No. 8, figura 9). Esta tecnología mantiene la continuidad del ORF. La expresión se realizó en el sistema: Escherichia coli/promotor Pr del bacteriófago lambda, produciendo la sobreexpresión de la proteína poliepitópica del VHB artificial.
La figura 10 ABC representa el procedimiento de aislamiento de la expresión de la variante de ejemplo de la proteína poliepitópica: gen concatémero de 13 copias, así como detección por transferencia Western. A partir de un cultivo bacteriano recombinante preparativo (10 litros) (que contenía el vector de amplificación, que expresaba el epítopo del VHB de 13 unidades) y después de la inducción y expresión, se centrifugó la biomasa bacteriana y se sometió a los siguientes procedimientos: (i) disgregación ultrasónica y centrifugación de restos celulares; (ii) calentamiento del lisado a 65 °C para desnaturalizar las proteínas del huésped y centrifugación de las proteínas precipitadas; (iii) tratamiento del preparado con polietilenimina tamponada a efectos de eliminar los ácidos nucleicos, así como las proteínas ácidas del huésped y centrifugación del precipitado; (iv) fraccionamiento mediante salificación con sulfato de amonio, centrifugación del precipitado que contiene el epítopo del VHB de 13 unidades y su disolución en un tampón para la utilización en una etapa de aislamiento posterior; (v) cromatografía de afinidad de alto rendimiento AkTa en un gel para quelar iones de níquel, HiTrap ImAc HP, que une la etiqueta de 6 residuos de histidina en el extremo N de las 13 unidades; (vi) cromatografía de tamizado molecular de alto rendimiento AKTA en Superdex 200 pg. El preparado purificado de la proteína poliepitópica de 13 unidades electroforéticamente homogénea se sometió a transferencia Western utilizando anticuerpos monoclonales contra la etiqueta de 6 residuos de histidina, donde la reacción cromogénica se realizó utilizando HRP conjugada, así como tetrahidrocloruro de 3,3',4,4'-tetraaminobifenilo. La figura 10 muestra: paneles A-B: PAGE desnaturalizante de muestras de etapas consecutivas de aislamiento del epítopo del VHB de 13 unidades. Carril M: marcador de masa molecular (kit de calibración GE LMW); carril 1: células de bacterias recombinantes que expresan las 13 unidades; carril 2: extracto celular resultante de ultrasonidos; carril 3: precipitado de proteína desnaturalizada después de calentar; carril 4: sobrenadante que contiene las 13 unidades después del tratamiento con polietilenimina; carriles 5 y 6: sobrenadante que contiene las 13 unidades después del fraccionamiento con sulfato de amonio; carril 7: 13 unidades del VHB después de la purificación utilizando cromatografía por metaloafinidad; carril 8: 13 unidades homogéneas después de cromatografía de tamizado molecular; panel C: detección por transferencia Western. Carril 1: marcador de masa molecular (kit de calibración GE LMW); carril 2: preparado purificado de 13 unidades del VHB; carril 3: detección por transferencia Western con anticuerpos contra la etiqueta de 6 residuos de histidina (Merck).
Debido a que ninguna de las propias proteínas del huésped recombinante contiene la secuencia de 6 histidinas, la reacción positiva indiscutiblemente confirma que la proteína aislada es el poliepítopo de 13 unidades del VHB. Una confirmación adicional es el tamaño esperado de la proteína aislada en comparación con los marcadores de masa, así como la unión específica al gel HiTrap IMAC Hp . El procedimiento es universal, confirmado con éxito en el aislamiento de otras variantes de proteínas poliepitópicas, fusionadas con etiquetas de 6 residuos de histidina, y contiene cantidades variables del epítopo del VHB polimerizado.
Ejemplo 4. Producción de estructuras multiméricas de orden superior que contienen varios cientos de copias inmovilizadas de la proteína poliepitópica, que contienen el epítopo modelo de 7 aminoácidos del antígeno de superficie del VHB en la superficie de la cápside del bacteriófago T7.
La construcción de proteínas poliepitópicas facilita un aumento múltiple en la concentración del epítopo en una única molécula de proteína, y una etapa de amplificación posterior se basa en la combinación de muchas moléculas de proteína poliepitópicas en una estructura de orden superior. Esto se puede lograr: (i) de manera biológica, mediante la fusión del gen que codifica la proteína poliepitópica con el material genético de un portador estructural de orden superior, tal como un cromosoma, nucleoide, plásmido microorgamal, una bacteria, bacteriófago o virus o (ii) mediante medios químicos, a través de la utilización de factores que unen macromoléculas.
La figura 11 representa la secuencia de una proteína poliepitópica poligénica de un epítopo pentámero con los cebadores indicados que sirven para amplificar el poligén del epítopo del VHB e introducir los sitios de restricción para EcoRI y HindIII, que se utilizan para fusionarlo genéticamente con un vector bacteriófago. Esta secuencia se utilizó para diseñar un procedimiento de inmovilización biológica de ejemplo para la proteína poliepitópica del epítopo pentámero del VHB sobre la superficie de la cápside del bacteriófago T7 que infecta a Escherichia coli. Se utilizó el sistema de presentación sobre fagos comercial Novagen T7Select® en la versión que utiliza el vector de fagos T7Select415-1b. El sistema inmovilizó con precisión 415 copias del polipéptido con una longitud que no excedía aproximadamente 50 residuos de aminoácidos, por lo tanto, la estructura macromolecular completa, en la que, de manera preferente, se utilizó un epítopo pentámero del VHB, contiene 2.075 copias del epítopo del VHB. El procedimiento de inmovilización para la proteína poliepitópica sobre la superficie de la cápside del bacteriófago consiste en las siguientes etapas: (i) amplificación por PCR del fragmento que codifica el epítopo pentámero del VHB, introduciendo sitios de restricción para las endonucleasas HindII I y EcoRI, destinados al vector T7Select415-1b para clonar fragmentos de ADN, mientras se mantiene la continuidad del ORF para su traducción con una proteína que forma la cápside de T7; (ii) digestión del fragmento amplificado por PCR con las endonucleasas de restricción HindII I y EcoRI; (iii) ligación direccional del fragmento de PCR digerido con los brazos izquierdo y derecho de HindIII y EcoRI predigeridos del bacteriófago T7; (iv) empaquetamiento in vitro del bacteriófago T7 recombinante e infección del huésped Escherichia coli; (v) aislamiento de clones individuales del bacteriófago T7 recombinante, amplificación de los clones, así como validación de la secuencia de ADN producida con la secuencia diseñada.
La secuencia del producto de PCR, que es el sustrato para la producción del inserto para el sistema de presentación sobre fagos (que codifica una variante del epítopo del HbV pentámero) utilizado en el ejemplo 4, se muestra como la secuencia 16, y las secuencias de los cebadores de PCR utilizados para amplificar la variante de 5 epítopos del VHB se muestran como secuencias 17 y 18.
Ejemplo 5. Actividad inmunológica de la proteína poliepitópica del VHB.
La proteína poliepitópica del VHB de 25 unidades del ejemplo 2 se aisló a partir de bacterias recombinantes utilizando el procedimiento mostrado en el ejemplo 4. Se inocularon grupos representativos de ratones (6 individuos cada uno) con 20 ^g/ratón con una proteína de 25 unidades purificada en tampón PBS mezclada con adyuvante incompleto de Freund. En paralelo, se inoculó un grupo de control con PBS y adyuvante incompleto de Freund. El ciclo de vacunación incluyó 3 inyecciones a intervalos de 3 semanas.
La figura 12 muestra una transferencia Western de la proteína de 25 unidades purificada utilizada en el ejemplo 3, así como un bacteriófago T7 recombinante que presentaba varios cientos de copias del epítopo pentámero del VHB utilizado en el ejemplo 4. Las muestras, separadas utilizando PAGE desnaturalizante, se transfirieron mediante Western, utilizando sueros de ratones inoculados con la proteína poliepitópica del VHB de 25 unidades mezclada con adyuvante incompleto de Freund, así como los sueros de ratones de control inoculados con PBS y adyuvante incompleto de Freund. Carril M, marcador Page Ruler; carril 1, bacteriófago recombinante purificado que contiene el epítopo pentámero del VHB. La flecha de la izquierda del panel A indica la posición de la proteína de fusión de la cápside del bacteriófago T7 y el epítopo pentámero de VHB. Las flechas de la derecha en el panel A muestran formas multiméricas de la proteína de 25 unidades purificada; carril 2: proteína poliepitópica del VHB de 25 unidades, según la figura 10, purificada hasta homogeneidad. Los resultados muestran una respuesta inmune humoral específica después de 3 ciclos iniciales de inmunización, dirigida contra multímeros del epítopo del VHB de 7 aminoácidos, presentes tanto en la proteína poliepitópica como en las proteínas poliepitópicas presentadas sobre la cápside del bacteriófago T7 recombinante. Al mismo tiempo, un resultado de transferencia Western positivo, además de la secuencia de ADN del bacteriófago T7 recombinante, valida la corrección del procedimiento de clonación del ejemplo 4 y las variantes de bacteriófagos recombinantes que presentan el epítopo pentámero del VHB, además de indicar la posibilidad de utilizar la tecnología descrita en variantes de vacunas de nueva generación. Las proteínas poliepitópicas del VHB resultantes, así como el bacteriófago T7 recombinante, dispuesto con múltiples copias de la proteína poliepitópica del VHB, constituyen un prototipo de vacuna contra el VHB.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para obtener una proteína poliepitópica, caracterizado por que:
a) se clona una secuencia de ADN de extremos romos que codifica un epítopo en un sitio reconocido por Smal en un vector de ADN que contiene una secuencia, el módulo de amplificación, que comprende dos secuencias de ADN convergentes reconocidas por Sapl y una secuencia de ADN que se encuentra entre ellas, que contiene un sitio para la clonación en un inserto reconocido por Smal, en el que el módulo de amplificación contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: SEQ ID NO: 1, SEQ iD NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, de manera preferente, el módulo de amplificación posee la secuencia:
GCTCTTCACCCGGGCCCAGAAGAGC (SEQ ID NO: 11),
b) se amplifica el vector resultante en un huésped bacteriano, se aísla y se digiere con Sapl y, a continuación, se aísla el fragmento que contiene la secuencia de ADN que codifica el epítopo, el cual se modifica de manera que se equipa con extremos cohesivos monocatenarios que facilitan la ligación direccional del inserto al concatémero,
c) se autoliga el fragmento aislado,
d) se clona el producto de autoligación en un sitio reconocido por Sapl en dicho vector de ADN, tal como se define en el punto a),
e) se utiliza el vector resultante para transformar un huésped bacteriano y, a continuación, se expresa y se aísla la proteína poliepitópica,
en el que a efectos de aumentar el tamaño de la proteína poliepitópica, las etapas b) a d) se repiten antes de realizar la etapa e), en el vector resultante están presentes secuencias de ADN concatenadas que codifican los epítopos.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por que el epítopo es el epítopo del VHB, de manera preferente, codificado por la SEQ ID NO: 9 sintética.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por que el fragmento de monómero amplificado contiene varios epítopos, provenientes de diferentes proteínas o diferentes regiones de la misma proteína, de manera preferente, codificados por una secuencia sintética.
4. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por que la proteína poliepitópica contiene, adicionalmente, una secuencia que facilita su purificación, en particular, una etiqueta de fusión que contiene una secuencia de 6 residuos de histidina y el aislamiento realizado en la etapa e) comprende la utilización de cromatografía por metaloafinidad, de manera preferente, sobre residuos de níquel inmovilizados, de manera preferente, una etapa de purificación adicional seleccionada de un grupo que comprende: calentamiento de la muestra de proteína, fraccionamiento utilizando polietilenimina, salificación (“salting out”) con sulfato de amonio y cromatografía en gel de tamizado molecular.
5. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por que la proteína poliepitópica de la etapa e) se inmoviliza sobre un portador macromolecular, en particular, uno seleccionado entre: microorganismos, células, bacterias, bacteriófagos, virus, viriones defectuosos, proteínas autoagregantes o nanopartículas, de manera preferente, de un sistema de presentación sobre fagos en el bacteriófago T7.
6. Vector de ADN para la utilización en el procedimiento, según las reivindicaciones 1-4, que contiene una secuencia, el módulo de amplificación, que comprende dos secuencias de ADN convergentes reconocidas por SapI y una secuencia de ADN que se encuentra entre ellas, que contiene un sitio para la clonación en un inserto reconocido por Smal, en el que el módulo de amplificación contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5 o SEQ ID NO: 6, de manera preferente el módulo de amplificación posee la secuencia:
GCTCTTCACCCGGGCCCAGAAGAGC (SEQ ID NO: 11).
7. Vector de ADN, según la reivindicación 6, caracterizado por que es un vector de expresión de proteínas, y contiene, adicionalmente, un origen de replicación, de manera preferente, p15A, un gen de resistencia a antibióticos, de manera preferente, cloranfenicol, un promotor de la transcripción, de manera preferente, Pr del bacteriófago lambda, un gen represor, de manera preferente, cl857ts, una señal de inicio de la traducción y, posiblemente, una secuencia que codifica 6 residuos de histidina, así como una secuencia que codifica una señal de parada de la traducción.
8. Vector de ADN, según la reivindicación 6, caracterizado por que tiene la SEQ ID NO: 7.
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US20030074695A1 (en) * 1998-06-24 2003-04-17 Farese Robert V. Plant diacylglycerol O-acyltransferase and uses thereof
FR2950350B1 (fr) * 2009-09-24 2013-12-13 Centre Nat Rech Scient Nouveaux polynucleotides et polypeptides chimeriques permettant la secretion d'un polypeptide d'interet en association avec des exosomes et leurs utilisations
SG185440A1 (en) * 2010-05-21 2012-12-28 Xl Protein Gmbh Biosynthetic proline/alanine random coil polypeptides and their uses

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