ES2838749T3 - Síntesis de oligosacáridos de la leche humana sialilados/fucosilados - Google Patents

Abstract

Un método para preparar un derivado de 3-O-galactosil-GlcNAc o -GalNAc de la fórmula 1 y sus sales. **(Ver fórmula)** en donde R es -OH, R1 es el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico, R2 se selecciona de H y del grupo L-fucopiranosilo, R3 se selecciona de H y del residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico, R4 se selecciona de H y del grupo L-fucopiranosilo, siempre y cuando al menos uno de R3 y R4 sea H, y A es un grupo lactosilo divalente que está unido al grupo R por su carbono anomérico C-1, y que está unido vía su grupo 3'-OH al núcleo 3-O-galactosil-GlcNAc o -GalNAc de la fórmula 1, y que puede ser opcionalmente sustituido por un grupo L-fucopiranosilo en su grupo 3-OH o por un grupo N-acetil-lactosaminilo en su 6'-OH, cuyo N-acetil-lactosaminilo puede ser opcionalmente sustituido adicionalmente por el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico en su 6-OH, o por el grupo L-fucopiranosilo en su 3-OH o 2'-OH, que comprende las etapas: a) sialilación de un compuesto de la fórmula 2 **(Ver fórmula)** en donde R' es -OR'6 y en donde R'6 es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis, R7 es independientemente acilo, Y se selecciona de -NHAc, haloalcanoilamido y -NAC2, y B es un grupo lactosilo divalente que está unido al grupo R' por su carbono anomérico C-1, y que está unido vía su grupo 3'-OH al núcleo 3-O-galactosil-GlcNAc o GalNAc de la fórmula 2, y que puede ser opcionalmente sustituido por un grupo L-fucopiranosilo en su grupo 3-OH o por un grupo N-acetil-lactosaminilo en su 6'-OH, cuyo N-acetil-lactosaminilo puede ser opcionalmente sustituido adicionalmente por el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico en su 6-OH, o por L-fucopiranosilo en su 3-OH o 2'-OH, en donde los grupos OH libres son acilados, el grupo OH axial de cualquier galactosa está opcionalmente protegido y el grupo carboxi del residuo glicosilo opcional del ácido N-acetil-neuramínico está bloqueado en forma de éster, b) fucosilación opcional del compuesto obtenido en la etapa a), c) des-O-acilación y/o hidrólisis básica, hidrólisis ácida suave opcional y transformación opcional de Y en - NHAc del compuesto obtenido en la etapa a) o la etapa b), d) sialilación o fucosilación opcional del compuesto obtenido en la etapa c), y e) hidrogenólisis catalítica del compuesto obtenido en la etapa d) en donde el grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis se selecciona del grupo que consiste en: grupos bencilo, difenilmetilo, 1-naftilmetilo, 2- naftilmetilo y trifenilmetilo, cada uno de los cuales puede ser opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes grupos: alquilo, alcoxi, fenilo, amino, acilamino, alquilamino, dialquilamino, nitro, carboxilo, alcoxicarbonilo, carbamoilo, N-alquilcarbamoilo, N,N-dialquilcarbamoilo, azido, halogenoalquilo o halógeno.

Description

DESCRIPCIÓN

Síntesis de oligosacáridos de la leche humana sialilados/fucosilados

Campo de la invención

La invención se refiere a una síntesis quimioenzimática de oligosacáridos de la leche humana (HMO) sialilados y opcionalmente fucosilados y sus análogos que tienen valor comercial para la industria farmacéutica y alimentaria. Antecedentes de la invención

En los últimos años, la fabricación y comercialización de carbohidratos complejos, particularmente oligosacáridos secretados, ha aumentado significativamente debido a su papel en numerosos procesos biológicos que ocurren en organismos vivos. Los oligosacáridos secretados tales como los oligosacáridos de la leche humana (HMO), los oligosacáridos de mucina y los oligosacáridos de tipo Lewis han ganado mucho interés y se han convertido en importantes dianas comerciales para aplicaciones nutricionales y terapéuticas. En particular, la síntesis de estos oligosacáridos ha aumentado significativamente debido a su papel en numerosos procesos biológicos que ocurren en humanos.

Muchos oligosacáridos de la leche humana contienen sialósidos, principalmente ácido N-acetil-neuramínico, que se encuentra con mayor frecuencia en el extremo terminal de los oligosacáridos. Los enlaces del ácido N-acetilneuramínico en el que se une a la galactosa y la N-acetil-glucosamina son enlaces a-2,3- y a-2,6-cetosídicos. Esta posición expuesta terminalmente permite que los sialoconjugados sean reconocidos por los receptores de células, virus y bacterias, por lo que se involucran en una amplia variedad de procesos biológicos.

El pentasacárido 6”'-O-sialil-LNT (LST b, Gall3(1-3)-[Neu5Aca(2-6)-]GlcNAcl3(1-3)-Gall3(1-4)-Glc) es un oligosacárido de la leche humana y representa un elemento estructural común en algunos otros oligosacáridos de la leche humana sialilados (Urashima y otros: Milk Oligosaccharides, Nova Medical Books, NY, 2011); estos se enumeran en la Tabla 1.

Tabla 1. HMO sialilados seleccionados

Un método de diversificación de oligosacáridos de la leche humana se describe en el documento WO 2012/156898. Se ha descubierto recientemente que DS-LNT es preventivo contra la enterocolitis necrotizante (NEC) en modelo de rata (Jantscher-Krenn y otros Gut 61, 1417 (2012), documento WO 2012/106665).

Estudios de investigación más exhaustivos de las interacciones célula-célula, el mecanismo de malignidad del cáncer y/o la determinación de la conformación bioactiva de compuestos que están involucrados en los procesos de reconocimiento de proteína-glucano han requerido mayores cantidades de tales oligosacáridos, pero los métodos enzimáticos y/o microbianos actuales han no ha sido capaces de proporcionarlos en cantidades y/o purezas suficientes. Los métodos químicos sintéticos, adaptados para proporcionarlos con suficiente pureza, han requerido muchas etapas de reacción costosas y el uso extensivo de secuencias de protección-desprotección durante la síntesis, y producen compuestos solo en cantidades de mg, como lo demuestra la síntesis de una a(2-3)/a(2-6)-disialil lactotetraosil ceramida y un gangliósido disialil Lewis A (Ando y otros J.

Carbohydr. Chem. 20, 425 (2001), Carbohydr. Res. 338, 503 (2003)).

Por tanto, ha existido la necesidad de un método eficiente para preparar un grupo diverso de derivados de LNT sialilados y/o fucosilados y sus análogos. Ha habido una necesidad particular de un método que pueda ampliarse fácilmente para un uso industrial potencial.

Resumen de la invención

La invención se refiere a un método para preparar un derivado de 3-O-galactosil-GlcNAc o -GalNAc de la fórmula 1 y sus sales.

en donde R es -OH,

R1 es el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico,

R2 se selecciona de H y del grupo L-fucopiranosilo,

R3 se selecciona de H y del residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico,

R4 se selecciona de H y del grupo L-fucopiranosilo, siempre y cuando al menos uno de R3 y R4 sea H, y

A es un grupo lactosilo divalente que está unido al grupo R por su carbono anomérico C-1, y que está unido vía su grupo 3'-OH al núcleo 3-O-galactosil-GlcNAc o -GalNAc de la fórmula 1, y que puede ser opcionalmente sustituido por un grupo L-fucopiranosilo en su grupo 3-OH o por un grupo N-acetil lactosaminilo en su 6'-OH, cuyo N-acetil lactosaminilo puede ser opcionalmente sustituido adicionalmente por el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico en su 6-OH, o por el grupo L-fucopiranosilo en su 3-OH o 2'-OH,

que comprende las etapas:

a) sialilación de un compuesto de la fórmula 2

en donde R' es -OR'6 en donde R'6 es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis,

R7 es independientemente acilo,

Y se selecciona de -NHAc, haloalcanoilamido y -NAC2, y

B es un grupo lactosilo divalente que está unido al grupo R' por su carbono anomérico C-1, y que está unido vía su grupo 3'-OH al núcleo 3-O-galactosil-GlcNAc o GalNAc de la fórmula 2, y que puede ser opcionalmente sustituido por un grupo L-fucopiranosilo en su grupo 3-OH o por un grupo N-acetil lactosaminilo en su 6'-OH, cuyo N-acetil lactosaminilo puede ser opcionalmente sustituido adicionalmente por el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico en su 6-OH, o por L-fucopiranosilo en su 3-OH o 2'-OH, en donde los grupos OH libres son acilados y el grupo carboxi del residuo glicosilo opcional del ácido N-acetil-neuramínico está bloqueado en forma de éster,

b) fucosilación opcional del compuesto obtenido en la etapa a),

c) des-O-acilación y/o hidrólisis básica, hidrólisis ácida suave opcional y transformación opcional de Y en -NHAc del compuesto obtenido en la etapa a) o la etapa b),

d) sialilación o fucosilación opcional del compuesto obtenido en la etapa c), y

e) hidrogenólisis catalítica del compuesto obtenido en la etapa d) en donde el grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis se selecciona del grupo que consiste en: grupos bencilo, difenilmetilo, 1-naftilmetilo, 2-naftilmetilo y trifenilmetilo, cada uno de los cuales puede ser opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes grupos: alquilo, alcoxi, fenilo, amino, acilamino, alquilamino, dialquilamino, nitro, carboxilo, alcoxicarbonilo, carbamoilo, N-alquilcarbamoilo, N,N-dialquilcarbamoilo, azido, halogenoalquilo o halógeno.

Además, la invención proporciona

compuestos de la fórmula 12

en donde R es -OR 6 en donde R 6 es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis como se definió anteriormente,

R7 es independientemente acilo,

Y se selecciona de -NHAc, haloalcanoilamido y -NAC2, y

B' es un grupo lactosilo divalente que está unido al grupo R' por su carbono anomérico C-1, y que está unido vía su grupo 3'-OH al núcleo 3-O-galactosil-GlcNAc o GalNAc de la fórmula 12, y que puede ser opcionalmente sustituido por un grupo L-fucopiranosilo en su grupo 3-OH o por un grupo N-acetil lactosaminilo en su 6'-OH, cuyo N-acetil lactosaminilo puede ser opcionalmente sustituido adicionalmente por el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico en su 6-OH, o por L-fucopiranosilo en su 3-OH o 2'-OH, en donde los grupos OH libres son acilados y el grupo carboxi del residuo glicosilo opcional del ácido N-acetil-neuramínico está bloqueado en forma de éster,

P es un residuo glicosilo protegido del ácido N-acetil-neuramínico, y

R25 se selecciona del resto I y H, preferentemente H,

en donde R22 y R23 se seleccionan, independientemente, de un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis como se definió anteriormente, y acilo.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con esta invención, el término "acilo" significa preferentemente un grupo R*-C(=0)-, en donde R* puede ser H, alquilo lineal o ramificado con 1-6 átomos de carbono o arilo que incluye fenilo y naftilo, preferentemente fenilo, como formilo, acetilo, propionilo, butirilo, pivaloilo, benzoilo, etc. Los residuos alquilo y arilo pueden estar sin sustituir o sustituidos una o varias veces, preferentemente 1-5 veces, con mayor preferencia 1-3 veces. Los sustituyentes pueden ser preferentemente alquilo (para acilo aromático), hidroxi, alcoxi, carboxi, oxo (para alquilo, que forma una función ceto o aldehído), alcoxicarbonilo, alquilcarbonilo, formilo, arilo, ariloxicarbonilo, ariloxi, arilamino, arilcarbonilo, amino, mono- y dialquilamino, carbamoílo, mono- y dialquil-aminocarbonilo, alquilcarbonilamino, ciano, alcanoiloxi, nitro, alquiltio y/o halógeno (F, Cl, Br, I). Los sustituyentes en los restos arilo y alquilo de los grupos acilo pueden modificar las características químicas generales del grupo acilo y, de esta manera, las características, tales como estabilidad, solubilidad y capacidad para formar cristales, de una molécula como un conjunto.

En la presente descripción, el término "grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis" significa un grupo protector cuyo enlace C-0 puede ser escindido por hidrógeno en presencia de una cantidad catalítica de paladio, níquel Raney o cualquier otro catalizador de hidrogenólisis convencional para regenerar el grupo -OH protegido. Dichos grupos protectores se describen en Wuts y Greene: Grupos protectores en síntesis orgánica, John Wiley & Sons, 2007, y son grupos bencilo, difenilmetilo (benzhidrilo), 1-naftilmetilo, 2-naftilmetilo y trifenilmetilo (tritilo), cada uno de los cuales puede ser opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes grupos: alquilo, alcoxi, fenilo, amino, acilamino, alquilamino, dialquilamino, nitro, carboxilo, alcoxicarbonilo, carbamoilo, N-alquilcarbamoilo, N, N-dialquilcarbamoilo, azido, halogenoalquilo o halógeno. Preferentemente, tal sustitución, si está presente, está en el anillo o anillos aromáticos. Un grupo protector preferido es bencilo opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes grupos: grupos fenilo, alquilo y halógeno, particularmente bencilo sin sustituir, 4-clorobencilo, 3-fenilbencilo y 4-metilbencilo. Estos grupos protectores preferidos y particularmente preferidos tienen la ventaja de que los subproductos de su hidrogenólisis son exclusivamente tolueno o tolueno sustituido. Dichos subproductos pueden eliminarse fácilmente, incluso en cantidades de varias toneladas, de los productos oligosacáridos solubles en agua mediante procesos de evaporación y/o extracción.

También en la presente descripción, el término "a-sialilo" o "sialilo" significa el residuo glicosilo de Neu5Ac (ácido N-acetil-neuramínico) (ver Esquema 1). Se debe señalar que el término "sialilo" en los nombres triviales generalmente aceptados de oligosacáridos de la leche humana y oligosacáridos de tipo Lewis siempre se refiere a Neu5Ac.

Además, en la presente descripción, el término "fucosilo" significa un grupo L-fucopiranosilo (véase el Esquema 2) unido a un oligosacárido núcleo con enlace a-interglucosídico.

Esquema 2

Aún más en la presente descripción, el término "sal" en relación con los compuestos sialilados, sulfatados y carboximetilados descritos en la solicitud significa preferentemente un par iónico asociado que consiste en el residuo ácido cargado negativamente y uno o más cationes en cualquier proporción estequiométrica. Los cationes, que son átomos o moléculas con carga positiva, pueden ser inorgánicos u orgánicos. Los cationes inorgánicos preferidos son iones de iones de amonio, metales alcalinos, metales alcalinotérreos y metales de transición, con mayor preferencia Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Ba2+, Fe2+, Zn2+, Mn2+ y Cu2+, con mayor preferencia K+, Ca2+, Mg2+, Ba2+, Fe2+ y Zn2+. Los compuestos orgánicos básicos preferidos en forma cargada positivamente son dietilamina, trietilamina, diisopropiletilamina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, imidazol, piperidina, piperazina, morfolina, bencilamina, etilendiamina, meglumina, pirrolidina, colina, tris-(hidroximetil)-metilamina, N-(2-hidroxietil)-pirrolidina, N-(2-hidroxietil)-piperidina, N-(2-hidroxietil)-piperazina, N-(2-hidroxietil)-morfolina, L-arginina, L-lisina, oligopéptidos que tienen unidad L-arginina o L-lisina u oligopéptidos que tienen un grupo amino libre en el N-terminal, etc., todos en forma protonada. Dichas sales pueden usarse de manera convencional para modificar las características de los compuestos de esta invención, tales como su estabilidad, compatibilidad con excipientes, solubilidad y capacidad para formar cristales.

Aún más en la presente descripción, el término "alquilo" significa preferentemente un grupo hidrocarbono lineal o ramificado con 1-6 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo, s-butilo, t-butilo, etc.; el término "haloalcanoilamido" significa preferentemente un C1-C6-alcanoilamido sustituido con halógeno tal como cloroacetamido, tricloroacetamido, trifluoroacetamido, etc.; el término “haloalcoxicarbonilammo” significa preferentemente un grupo C1-C6-alquiloxicarbonil-NH sustituido con uno o más átomos de halógeno tal como 2,2,2-tricloroetoxicarbonilamino, etc.; el término "fenilo opcionalmente sustituido" y "bencilo opcionalmente sustituido" significan preferentemente un grupo fenilo o bencilo, respectivamente, que está sin sustituir o sustituido con 1 a 5, preferentemente 1 a 3, con mayor preferencia 1 o 2 sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de alquilo, halógeno, alcoxi, fenilo, nitro, haloalquilo, haloalcoxi, amino, alquilamino, dialquilamino, acilamino, carbamoilo, N-alquilcarbamoilo y N,N-dialquilcarbamoilo; el término "cicloalquilideno" significa preferentemente un grupo C3-C8-cicloalquilideno opcionalmente sustituido con alquilo(s) en donde el grupo cicloalquilo con el(los) sustituyente(s) opcional(es) es de 3-8 átomos de carbono, tal como ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo o 4,4-dimetilciclohexilo.

La presente invención proporciona un enfoque eficiente para un grupo diverso de derivados de 3'-O-galactosil-6-O-sialil-GlcNAc o -GalNAc sialilados y opcionalmente fucosilados y análogos de los mismos en base a la combinación única de etapas de glucosilación química y enzimática. El método reivindicado es atractivo para desarrollos a gran escala y, por tanto, puede implicar un proceso industrial potencial.

El primer aspecto de la invención se refiere a un método para preparar un derivado de 3-O-galactosil-GlcNAc o -GalNAc de la fórmula 1 y sus sales.

en donde R es -OH,

R1 es el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico,

R2 se selecciona de H y del grupo L-fucopiranosilo,

R3 se selecciona de H y del residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico,

R4 se selecciona de H y del grupo L-fucopiranosilo, siempre y cuando al menos uno de R3 y R4 sea H, y

A es un grupo lactosilo divalente que está unido al grupo R por su carbono anomérico C-1, y que está unido vía su grupo 3'-OH al núcleo 3-O-galactosil-GlcNAc o -GalNAc de la fórmula 1, y que puede ser opcionalmente sustituido por un grupo L-fucopiranosilo en su grupo 3-OH o por un grupo N-acetil lactosaminilo en su 6'-OH, cuyo N-acetil lactosaminilo puede ser opcionalmente sustituido adicionalmente por el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico en su 6-OH, o por el grupo L-fucopiranosilo en su 3-OH o 2'-OH,

que comprende las etapas:

a) sialilación de un compuesto de la fórmula 2

en donde R es -OR6 en donde R6 es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis,

R7 es independientemente acilo,

Y se selecciona de -NHAc, haloalcanoilamido y -NAC2, y

B es un grupo lactosilo divalente que está unido al grupo R' por su carbono anomérico C-1, y que está unido vía su grupo 3'-OH al núcleo 3-O-galactosil-GlcNAc o GalNAc de la fórmula 2, y que puede ser opcionalmente sustituido por un grupo L-fucopiranosilo en su grupo 3-OH o por un grupo N-acetil lactosaminilo en su 6'-OH, cuyo N-acetil lactosaminilo puede ser opcionalmente sustituido adicionalmente por el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico en su 6-OH, o por L-fucopiranosilo en su 3-OH o 2'-OH, en donde los grupos OH libres son acilados y el grupo carboxi del residuo glicosilo opcional del ácido N-acetil-neuramínico está bloqueado en forma de éster,

b) fucosilación opcional del compuesto obtenido en la etapa a),

c) des-O-acilación y/o hidrólisis básica, hidrólisis ácida suave opcional y transformación opcional de Y en -NHAc del compuesto obtenido en la etapa a) o la etapa b),

d) sialilación o fucosilación opcional del compuesto obtenido en la etapa c), y

e) hidrogenólisis catalítica del compuesto obtenido en la etapa d).

En la etapa a), un compuesto de acuerdo con la fórmula 2 se emplea en una reacción de sialilación. En un compuesto de la fórmula 2 , B es un enlazador de carbohidratos divalentes en forma protegida.

En esta invención, el término "enlazador de carbohidrato en forma protegida" significa un resto lactosilo o un resto oligosacárido que consiste en un resto lactosilo y al menos una unidad de monosacárido seleccionada del grupo que consiste en galactosa, N-acetilglucosamina, fucosa y ácido N-acetil-neuramínico.

El resto lactosilo divalente está unido al grupo R' por su átomo de carbono anomérico C-1, y al mismo tiempo está unido también, mediante su grupo 3'-OH al residuo aminodesoxi-hexosa galactosilado del compuesto de la fórmula 2.

El resto lactosilo divalente definido anteriormente puede ser opcionalmente sustituido por otros restos glicosilo, preferentemente en su grupo 3-OH por un resto fucosilo, o en su grupo 6'-OH por un resto N-acetil-lactosaminilo, cuyo resto N-acetil-lactosaminilo puede ser opcionalmente sustituido adicionalmente por un resto N-acetil-neuraminilo en su 6-OH, o por un fucosilo en su 3-OH o 2'-OH.

Estas subestructuras de oligosacáridos pueden encontrarse en oligosacáridos de la leche humana. Los grupos funcionales del residuo glicosilo divalente B están protegidos; los grupos OH libres están acilados (por ejemplo, acetilados, benzoilados) y el grupo carboxi del resto opcional N-acetil-neuraminilo está bloqueado en forma de éster (por ejemplo, éster metílico, etílico o bencílico). El grupo OH axial de cualquier galactosa en el resto B está opcionalmente protegido.

En una modalidad preferida de los compuestos de la fórmula 2, el grupo R' tiene orientación P. También preferentemente, el resto B se une al esqueleto de carbohidrato parental mediante un enlace P. Compuestos de la fórmula 2 en donde B es un enlazador de carbohidrato divalente en forma protegida puede sintetizarse mediante el uso de procedimientos de glucosilación química de múltiples etapas como se describió en o por analogía con, por ejemplo, Xia y otros Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2941 (1999), Pozsgay y otros Tetrahedron 48, 10249 (1992), Aly y otros Carbohydr. Res. 316, 121 (1999) y el documento WO 2012/155916.

Al realizar la etapa a), el grupo OH libre primario de un compuesto de la fórmula 2 se sialila regioselectivamente sin afectar al grupo OH secundario vecino, para dar un compuesto de la fórmula 4

en donde R', R7, B y Y son como los definidos anteriormente, y

P es un residuo glicosilo protegido del ácido N-acetil-neuramínico.

Para la sialilación química, se usan donantes de sialilo protegido y activado adecuadamente. Para la protección del grupo funcional del donante de sialilo, la persona experta dispone de una serie de grupos protectores, principalmente ésteres, éteres y acetales. Entre las posibilidades de protección OH, los acilos opcionalmente sustituidos, tales como acetilo, benzoilo, cloroacetilo o clorobenzoilo, y los grupos de tipo éter tales como bencilo son de utilidad sintética; el grupo carboxilo puede estar protegido por un éster, típicamente por un éster metílico, etílico o bencílico; y el amino funcional puede estar enmascarado por grupos diacetilo, trifluoroacetilo, tricloroacetilo, Troc o Fmoc, o como un carbamato cíclico con el 4-OH adyacente. La activación del centro anomérico puede variar entre halo, alquil- o ariltio, dialquilo, dibencilo o diarilfosfito, o trihaloacetimidato, cada uno de los cuales es usado comúnmente en métodos de sialoglucosidación. La introducción del grupo protector y las activaciones del centro anomérico mencionadas anteriormente pueden llevarse a cabo mediante procesos conocidos (véase, por ejemplo, Ress y otros Curr. Org. Synth. 1, 31 (2004), Chen y otros ACS Chem. Biol. 5, 163 (2010) y referencias citadas en estos documentos). Los donantes de sialilos preferidos son los descritos en los documentos WO 2011/100979 y WO 2012/113404, entre los que se encuentran los donantes de fosfito de N-acetil-neuraminilo de la fórmula 3

en donde R8 es acilo, preferentemente acetilo,

Q se selecciona de alquilo y bencilo, preferentemente metilo, etilo y bencilo, y R9 es fenilo o bencilo opcionalmente sustituido,

son especialmente preferidos. La reacción de acoplamiento se desarrolla en un solvente aprótico, preferentemente en diclorometano, THF, metil-THF, tolueno, acetonitrilo o en mezclas de los mismos, a temperaturas entre -78 - 0 °C, en presencia de promotores como NBS, NIS, TMSOTf, TfOH, Tf²O, ZnCl2, BF³ OEt² , LiClO⁴ , DTBPI, Bu⁴NI, AgClO⁴, LiClO⁴ , Sn(OTf)² , yodo, montmorillonita, Tf²NH o mezclas de los mismos, preferentemente TMSOTf. El producto sialilado puede caracterizarse por la fórmula 4A siguiente

en donde R', R7, R8, B, Q y Y son como los definidos anteriormente.

En la etapa b), el compuesto sialilado obtenido en la etapa a) se fucosila opcionalmente con un donante de fucosilo activado y protegido adecuadamente. El resto fucosilo se introduce en el grupo OH (4-OH) secundario libre restante del compuesto de la fórmula 4. Por tanto, un donante de fucosilo de la fórmula 5

en donde X se selecciona de un halógeno, -OC(=NH)CCl3, -O-pentenilo, -OAc, -OBz y -SR13, en el que R13 es alquilo o fenilo opcionalmente sustituido,

R11 se selecciona de acilo y un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis, y

R12 se selecciona de un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis, acilo o dos grupos R12 juntos forman un resto

Y /

Rij C Ri

en donde R14 y R15 independientemente son alquilo o fenilo, o

en donde R14 y R15 junto con el átomo de carbono, al que están unidos, forman cicloalquilideno,

puede usarse en esta reacción para dar un compuesto de la fórmula 6

en donde R', R7, R11, R12, B, P y Y son como los definidos anteriormente.

La fucosilación puede llevarse a cabo de manera convencional en un solvente aprótico o en una mezcla de solventes apróticos en presencia de un activador, ver Demchenko (Ed.): Manual de glucosilación química Wiley (2008). La reacción de fucosilación es promovida generalmente por iones de metales pesados, principalmente mercurio o plata, y ácidos de Lewis como triflato de trimetilsililo o BF3-eterato.

Preferentemente, se usa un haluro de fucosilo (es decir, X es F, Cl, Br o I) debido a su fácil accesibilidad y reactividad satisfactoria. Típicamente, los haluros anoméricos siguen el orden de reactividad F<Cl<Br<I por desplazamiento nucleofílico. Los fluoruros de glicosilo pueden prepararse mediante el tratamiento de los precursores apropiados, tales como hemiacetales, haluros de glicosilo, ésteres de glicosilo y S-glucósidos con reactivos de fluoración tales como HF, AgF, AgBF4, fluoruro de tetrabutilamonio, trifluoruro de dietilaminosulfuro, tosilato de 2-fluoro-1-metilpiridinio, Selectfluor, Deoxo-Fluor o 4-metil(difluoroyodo)-benceno.

Puede prepararse un tricloroacetimidato de fucosilo (es decir, X es -OC(=NH)CCl3) al añadir un azúcar con un OH anomérico libre al tricloroacetonitrilo en catálisis de base inorgánica u orgánica. El donante de glicosilo resultante puede activarse mediante una cantidad catalítica de un ácido de Lewis, tal como triflato de trimetilsililo o BF3-eterato, para la reacción de glucosilación.

Los acetatos o benzoatos de fucosilo (es decir, X es -OAc o -OBz) se someten primero a activación electrófila preferentemente para proporcionar un reactivo intermedio y luego se tratan con un aceptor de OH nucleófilo. Los activadores típicos de elección son ácidos de Bronsted (por ejemplo, p-TsOH, HCIO4 o ácido sulfámico), ácidos de Lewis (por ejemplo, ZnCl2, SnCl4, sales de triflato, BF3-eterato, perclorato de tritilo, AlCl3 o anhídrido tríflico) o una mezcla de los mismos

Fucósidos de pentenilo (es decir, X es -0-(CH2)3-CH=CH2) puede transglucosilarse con el aceptor de glicosilo apropiado en presencia de un promotor tal como NBS y NIS. Los ácidos próticos o de Lewis (ácido tríflico, triflato de plata, etc.) pueden mejorar la reacción. Los pentenilglicósidos pueden prepararse con ayuda de n-pentenol por glucosilación estándar de Fischer de hemiacetales en condiciones ácidas, por acoplamiento de bromuros de glicosilo promovido por sal de plata (I) (método de Koenigs-Knorr), o por glucosilación de glicósidos de 1-acetilo en presencia de cloruro de estaño (IV).

Los tiofucósidos (es decir, X es alquiltio o un grupo feniltio opcionalmente sustituido) pueden activarse mediante promotores tiofílicos tales como las sales de mercurio (II), Br2,I2, NBS, NIS, ácido tríflico, sales de triflato, BF3-eterato, triflato de trimetilsililo, triflato de dimetilmetiltio sulfonio, triflato de fenilselenilo, perclorato de dicolidina de yodonio, yoduro de tetrabutilamonio o mezclas de los mismos, preferentemente por Br2, NBS, NIS o ácido tríflico.

Solventes apróticos tales como tolueno, THF, metil-THF, DCM, cloroformo, dioxano, acetonitrilo, clorobenceno, dicloruro de etileno, DMSO, DMF o N-metilpirrolidona o mezclas de los mismos, preferentemente DMF, tolueno, DCM o mezclas de los mismos, con mayor preferencia tolueno o la mezcla de DMF-DCM pueden usarse en esta reacción de glucosilación a una temperatura de -20 a 20 °C, preferentemente de -10 a 5 °C, con un tiempo de reacción de 5 minutos a 2 horas. Para la activación tiofílica, pueden usarse Br2, NBS o NIS, opcionalmente en presencia de ácido tríflico o un derivado de triflato. Normalmente se usa un ligero exceso de donante (equivalente a 1,1-1,2) en comparación con el aceptor. Para templar la reacción, se usa generalmente agua o un alcohol de C1-C6, preferentemente una solución acuosa o alcohólica de una base tal como carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, amoniaco o trietilamina, con mayor preferencia una solución acuosa de Na2S2O3/NaHCO3.

Con mayor preferencia, el donante de fucosilo es un compuesto de la fórmula 5 en la que R17 es como se definió anteriormente, R12 es acilo o un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis, y X es feniltio opcionalmente sustituido con uno o más alquilo. Con mayor preferencia R11 es bencilo, 4-metilbencilo, naftilmetilo, 4-fenilbencilo, 4-clorobencilo, 4-metoxibencilo, 3,4-dimetoxibencilo, 2,4,6-trimetilbencilo o 2,3,4,5,6-pentametilbencilo, R12 es bencilo, 4-metilbencilo, naftilmetilo, 4-fenilbencilo, 4-clorobencilo, 4-metoxibencilo, 3,4-dimetoxibencilo, 2,4,6-trimetilbencilo, 2,3,4,5,6-pentametilbencilo o benzoilo opcionalmente sustituido por uno o más halógenos y X es feniltio sin sustituir. Aún con mayor preferencia, R11 es bencilo o 4-metilbencilo y R12 es benzoilo o 4-clorobenzoilo.

De acuerdo con una modalidad preferida de la etapa b), un compuesto de la fórmula 4A definida anteriormente se hace reaccionar con un donante de fucosilo de la fórmula 5 lo que da como resultado un compuesto de la fórmula 6A y sus sales

en donde R', R5, R7, R8, R10, R11, R12, B, Q y Y son como los definidos anteriormente.

En la etapa c), los grupos protectores de un compuesto obtenido en la etapa a) o la etapa b) se eliminan excepto la protección anomérica R', y opcionalmente Y se convierte en un grupo -NHAc.

La mayoría de los grupos protectores son O-acilos (R7, R8, las protecciones OH en el resto B, y opcionalmente R11 y R12). Los grupos protectores de acilo pueden eliminarse mediante una reacción de desprotección de transesterificación catalizada por una base convencional en donde los grupos acilo se eliminan en un solvente alcohólico como metanol, etanol, propanol o t-butanol en presencia de un alcoholato tal como NaOMe, NaOEt o KOtBu a 20-100 °C. El solvente alcohólico y el alcoholato deben emparejarse. Un cosolvente tal como tolueno o xileno puede ser beneficioso para controlar el tamaño de partícula del producto y evitar la formación de gel. Preferentemente, se usa una cantidad catalítica de NaOMe en metanol (des-O-acilación de Zemplén). En esta condición, solo pueden desprotegerse los O-acilos. Si Y es -NAC2, uno de los grupos acetilo también puede eliminarse para formar el grupo Y -NHAc. Cuando Y es haloalcanoilamido, y los grupos éster (ver grupo -COOQ) permanecen intactos en estas condiciones.

Los grupos aciloxi a OH, ésteres a carboxilo (ver grupo -COOQ) y el siguiente grupo Y: haloalcanoilamido a -NH2 pueden desprotegerse por hidrólisis básica, que es una hidrólisis catalizada por una base en agua, alcohol o mezclas de agua-solvente orgánico, en condiciones de reacción homogéneas o heterogéneas a 0-100 °C. Preferentemente, se usa una base fuerte, como LiOH, NaOH, KOH, Ba(OH)2, K2CO3, una resina de intercambio iónico básica o hidróxidos de tetraalquilamonio, pero la base también puede estar en una solución acuosa. Si Y es -NAC2, uno de los grupos acetilo también puede eliminarse para formar el grupo Y -NHAc. Preferentemente, la base es NaOH y el solvente es metanol.

El grupo amino libre obtenido mediante uno de los métodos de desprotección puede entonces acetilarse sin acetilar los grupos OH libres. La N-acetilación selectiva en presencia de uno o más hidroxilos puede llevarse a cabo de manera convencional con un ligero exceso de anhídrido acético o cloruro de acetilo (equivalente a “1,5-3) a aproximadamente 0-35 °C con o sin base añadida. Cualquier subproducto(s) sobreacetilado(s) resultante(s) puede(n) transformarse fácilmente en los compuestos deseados con, por ejemplo, tratamiento con NaOH/MeOH o NaOMe/MeOH. Alternativamente, el compuesto desprotegido que tiene un grupo amino libre puede peracetilarse (es decir, el grupo amino y todos los grupos OH disponibles están acetilados) seguido de transesterificación catalizada por bases (ver anteriormente).

También en la etapa c), el grupo Y de la tricloroacetilamida puede transformarse en -NHAc con hidruro de tributilestaño en una etapa.

También en la etapa c), el grupo acetal/cetal opcionalmente presente en el compuesto de la fórmula 6A (es decir, cuando dos grupos R12 juntos forman un resto

puede desprotegerse selectivamente mediante hidrólisis suave catalizada por ácido, es decir, al hacer reaccionar los compuestos con agua o un alcohol en presencia de ácido a pH>1-2 para producir grupos OH en los compuestos. Los grupos protectores de acilo no se afectarán porque solo pueden desprotegerse por hidrólisis ácida extremadamente fuerte (pH<1). Aunque el enlace interglucosídico y los grupos protectores anoméricos del compuesto de la fórmula 6A también pueden ser sensibles a los ácidos, pueden dividirse en el compuesto de la fórmula 6A solo por hidrólisis ácida a pH<1-2. La persona experta en la materia es capaz de distinguir qué condición desprotectora afecta al grupo acetal mientras los grupos acilo y los enlaces interglucosídicos permanecen intactos. El agua, que es un reactivo, también puede servir como solvente o cosolvente. Disolventes orgánicos próticos o apróticos que son estables en condiciones ácidas y total o parcialmente miscibles con agua, como alcoholes de C1-C6, acetona, THF, dioxano, acetato de etilo o MeCN, también pueden utilizarse en mezcla con agua. El ácido usado es generalmente un ácido prótico, tal como ácido acético, ácido trifluoroacético, HCl, ácido fórmico, ácido sulfúrico, ácido perclórico, ácido oxálico, ácido p-toluensulfónico, ácido bencenosulfónico o una resina de intercambio catiónica, y puede estar presente desde una cantidad catalítica hasta un gran exceso. La hidrólisis puede llevarse a cabo entre 20 °C y reflujo hasta la terminación de la reacción, lo que puede llevar de aproximadamente 2 horas a 3 días en dependencia de la temperatura, la concentración y el pH. Preferentemente, se usa un ácido orgánico, tal como ácido acético, ácido fórmico, ácido cloroacético o ácido oxálico. Preferentemente, se usa una mezcla de un alcohol de C1-C6 y acetonitrilo o un alcohol de C1-C6 y agua en presencia de HCl o un ácido sulfónico tal como ácido p-toluenosulfónico o ácido canforsulfónico. Alternativamente, un alcohol anhidro de C1-C6, tal como metanol, etanol, propanol y butanol, puede usarse para la escisión de acetal mediante procesos de transacetalización/transcetalización catalizados por ácidos. Puede usarse una cantidad catalítica de cloruro de hidrógeno, ácido sulfúrico, ácido perclórico, ácido p-toluensulfónico, ácido acético, ácido oxálico, ácido canforsulfónico o una resina de intercambio iónico ácida fuerte a temperaturas de 20 °C a reflujo.

Las etapas de desprotección mencionadas anteriormente pueden llevarse a cabo en cualquier orden. Como resultado, puede obtenerse un compuesto de la fórmula 7 y sus sales

en donde R' es como se definió anteriormente,

A es un enlazador de carbohidratos divalentes,

R1 es el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico, y

R16 se selecciona de H y un resto de la fórmula C

en donde R17 y R18, independientemente, se seleccionan de H y un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis.

El término "enlazador de carbohidrato divalente" anterior significa un resto lactosilo o un resto oligosacárido que consiste en un resto lactosilo y al menos una unidad de monosacárido seleccionada del grupo que consiste en galactosa, N-acetilglucosamina, fucosa y ácido N-acetil-neuramínico como se definió anteriormente para el resto B, en forma desprotegida, lo que significa que los grupos protectores de OH y el grupo protector de éster del resto N-acetil neuraminilo (si está presente) en el enlazador de carbohidrato divalente del resto B se eliminan cuando se lleva a cabo la etapa c), lo que transforma así el resto B en el resto A. El resto lactosilo divalente está unido al grupo R' por su átomo de carbono anomérico C-1, y al mismo tiempo también está unido, mediante su grupo 3'-OH al residuo de aminodesoxi-hexosa galactosilado del compuesto de la fórmula 7. El resto lactosilo divalente definido anteriormente puede ser opcionalmente sustituido por otros restos glicosilo, preferentemente en su grupo 3-OH por un resto fucosilo, o en su grupo 6'-OH por un resto N-acetil-lactosaminilo, cuyo resto N-acetil-lactosaminilo puede ser opcionalmente sustituido adicionalmente por un resto N-acetil-neuraminilo en su 6-OH, o por un fucosilo en su 3-OH o 2'-OH.

En la etapa d) un compuesto obtenido en la etapa c), que es un compuesto de la fórmula 7 definido anteriormente, se lleva opcionalmente a una reacción de transialilación o transfucosilación mediada por glucosidasa y pueden obtenerse un compuesto de la fórmula 10 y sus sales

en donde R', R1, R16 y A son como los definidos anteriormente,

R3 se selecciona de H y del residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico, y

R4 se selecciona de H y del grupo L-fucopiranosilo, siempre y cuando uno pero solo uno de R3 y R4 es H.

Con respecto a la reacción de transialilación de la etapa d), se hace reaccionar un compuesto de la fórmula 7 con un donante de sialilo, preferentemente un donante de N-acetil-neuraminilo, en la catálisis de una enzima que tiene actividad a2-3-transialidasa. Los donantes de sialilo natural típico puede seleccionarse de, pero no se limitan a, 3'-O-sialil-lactosa, fetuina, gangliósidos, glicopéptidos unidos a O- o N-, todos los cuales contienen un ácido siálico a-2,3 unido a un residuo terminal de p-galactósido, o ácido polisiálico con un enlace a-2,8. Preferentemente también, el donante de sialilo usado en la etapa d) puede caracterizarse por la fórmula 8 y sus sales,

en donde Z se selecciona del grupo que consiste en azida, flúor, fenoxi opcionalmente sustituido, piridiniloxi opcionalmente sustituido, grupo D, grupo E, grupo F y grupo G

en donde Ra es independientemente H o alquilo, o dos grupos Ra vecinos representan un grupo =C(Rb)2, en donde Rb es independientemente H o alquilo, R^c se selecciona independientemente del grupo que consiste en alcoxi, amino, alquilamino y dialquilamino, Ra se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo y -C(=O)Re, en donde R^e es OH, alcoxi, amino, alquilamino, dialquilamino, hidrazino, alquilhidrazino, dialquilhidrazino o trialquilhidrazino. Entre los donantes de sialilo, 4-metilumbeliferilo y N-acetil-a-neuraminósidos de fenilo opcionalmente sustituidos y 3'-O-sialillactosa, más comúnmente N-acetil-a-neuraminósido de p-nitrofenilo y 3'-O-sialil-lactosa, son de gran preferencia.

Las enzimas que tienen actividad a2-3-transialidasa se seleccionan preferentemente de una sialidasa o transialidasa como se describió a continuación, por ejemplo, de sialidasas (EC 3.2.1.18) y transialidasas (EC 2.4.1.-) clasificadas de acuerdo con la familia GH33. Estas son las que retienen enzimas. Las sialidasas y transialidasas se distribuyen ampliamente en la naturaleza. Estas se encuentran particularmente en diversas familias de virus y bacterias, y también en protozoos, algunos invertebrados y mamíferos. Estas enzimas difieren en sus propiedades bioquímicas, por ejemplo, cinética, afinidad de unión o preferencia de sustrato. Estas, sin embargo, poseen dominios conservados y similitudes estructurales. Las transialidasas difieren de las sialidasas ya que pueden transferir ácidos siálicos, preferentemente ácidos siálicos con enlaces a-2,3, desde una molécula donante a un derivado aceptor, que es preferentemente un resto de galactosa terminal con un enlace p-interglucosídico. Como resultado de esta transferencia, se forma un enlace a-glucosídico entre el ácido siálico y el aceptor. Sin embargo, si no hay un aceptor adecuado, la transialidasa hidroliza el ácido siálico.

La primera enzima transialidasa descrita se encontró en Trypanosoma cruzi, un protozoo que causa la enfermedad de Chagas. Esta transialidasa (TcTS) ha sido ampliamente estudiada. Desde entonces, se han detectado transialidasas en varios otros tipos de tripanosomas, tales como Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma brucei rhodesiense, Trypanosoma brucei brucei y Trypanosoma congolense. Además, la existencia de transialidasas se ha demostrado en tipos de Endotrypanum, en Corynebacterium diphtheriae e incluso en el plasma humano.

Las sialidasas pueden clasificarse en dos subgrupos diferentes, endo y exosialidasas. Las endosialidasas hidrolizan desde los enlaces internos del ácido siálico a las macromoléculas, mientras que las exosialidasas atacan los enlaces terminales del ácido siálico, y desialilan glicoproteínas, glicopéptidos, gangliósidos, oligosacáridos y polysacáridos. Recientemente, las sialidasas de Bifidobacterium bijidum y Bifidobacterium longum subsp. infantis han sido identificados, clonados y caracterizados. Estas sialidasas pueden escindir y, por lo tanto, reconocer sialósidos con enlaces tanto a-2,3 como a-2,6. Las sialidasas de Bifidobacterium longum subsp. infantis tienen una preferencia consistente por el enlace a-2,6 mientras que las sialidasas de Bifidobacterium bifidum tienen una preferencia consistente por el enlace a-2,3. Estas enzimas también son capaces de actuar como catalizadores para reacciones de sialilación debido a su actividad transialidasa y, por tanto, pueden usarse en el contexto del método de la presente invención, preferentemente en condiciones controladas cinéticamente.

Las sialidasas, que pueden emplearse en el contexto de la presente invención, también pueden comprender sialidasas manipuladas por ingeniería genética. Basado en comparaciones de secuencia y estructura, la sialidasa de Trypanosoma rangeli puede mutarse en seis posiciones, en donde el mutante resultante es capaz de mostrar un nivel significativo de actividad transialidasa (ver Paris y otros J. Mol. Biol. 345, 923 (2005)).

Aún con mayor preferencia, la enzima que tiene una actividad sialidasa y/o transialidasa puede seleccionarse entre sialidasas o transialidasas derivadas de Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697, Bifidobacterium bifidum JCM1254, Bifidobacterium bifidum S17, Bifidobacterium bifidum PRL2010, Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171, Trypanosoma cruzi, etc.

Aún con mayor preferencia, la enzima que tiene una actividad de sialidasa y/o transialidasa puede seleccionarse de sialidasas o transialidasas como se definió de acuerdo con los siguientes números de depósito: gi|213524659 (Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697), gi|213523006 (Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697), siab2 (Bifidobacterium bifidum JCM1254), sialidasas o transialidasas adicionales de Bifidobacterium bifidum JCM1254, gi|309252191 {Bifidobacterium bifidum S17), gi|309252190

(Bifidobacterium bifidum S17), gi\310867437 (Bifidobacterium bifidum PRL2010), gi\310867438 {Bifidobacterium bifidum PRL2010), gi\224283484 {Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171), gi\313140638 {Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171), gi\47252690 {Trypanosoma cruzi), gi\432485 {Trypanosoma cruzi), gi\343957998 {Trypanosoma congolense), gi\343958004 {Trypanosoma congolense) etc., o una secuencia que exhibe una identidad de secuencia con la secuencia de una de las enzimas mencionadas anteriormente que tiene una actividad sialidasa y/o transialidasa de al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, igualmente con mayor preferencia al menos 85 %, aún con mayor preferencia al menos 90 % y con la máxima preferencia al menos 95 % o incluso 97 %, 98 % o 99 % en comparación con la secuencia de tipo salvaje completa a nivel de aminoácido.

Las sialidasas particularmente preferidas con actividad sialidasa/transialidasa se enumeran en la siguiente Tabla 2 :

Tabla 2: Sialidasas/transialidasas preferidas

En la reacción de transialilación de acuerdo con la etapa d) puede prepararse un compuesto de la fórmula 10A y sus sales.

en donde R', R1, R16 y A son como los definidos anteriormente, y R3 es el residuo glicosilo del ácido N-acetilneuramínico.

Con respecto a la reacción de transfucosilación de la etapa d), se hace reaccionar un compuesto de la fórmula 7 con un donante de fucosilo en la catálisis de una enzima que tiene actividad a1-2-transfucosidasa. Los donantes de fucosilo típicos pueden seleccionarse de, pero no se limitan a, 2'-O-fucosil-lactosa, difucosil-lactosa y donantes de fucosa de la fórmula 9

en donde Z se selecciona del grupo que consiste en azida, flúor, fenoxi opcionalmente sustituido, piridiniloxi opcionalmente sustituido, grupo D, grupo E, grupo F y grupo G

en donde Ra es independientemente H o alquilo, o dos grupos Ra vecinos representan un grupo =C(Rb)2, en donde Rb es independientemente H o alquilo, R^c se selecciona independientemente del grupo que consiste en alcoxi, amino, alquilamino y dialquilamino, Ra se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo y -C(=O)Re, donde Re es OH, alcoxi, amino, alquilamino, dialquilamino, hidrazino, alquilhidrazino, dialquilhidrazino o trialquilhidrazino.

La enzima que exhibe la actividad de a1-2-transfucosidasa se selecciona preferentemente de fucosidasas, transfucosidasas y fucosintasas clasificadas de acuerdo con EC 3.2.1.38 y 3.2.1.51. Las a-L-fucosidasas se encuentran ampliamente distribuidas en organismos vivos tales como mamíferos, plantas, hongos y bacterias. Estas enzimas pertenecen a las familias 29 y 95 de las glucósido hidrolasas (GH29 y GH95) definidas por la nomenclatura CAZY (http://www.cazy.org). Las fucosidasas de GH29 son enzimas de retención (estructura 3D: (p/a)8) mientras que las fucosidasas de GH95 son enzimas de inversión (estructura 3D: (a/a)6). La especificidad del sustrato de la familia GH29 es amplia, mientras que la de la familia GH95 es estricta para los residuos fucosilo con enlaces a1,2. Las a-L-fucosidasas generalmente hidrolizan el residuo fucosilo terminal de los glicanos. Estas enzimas también son capaces de actuar como catalizadores para reacciones de fucosilación debido a su actividad de transfucosilación y, por tanto, pueden usarse en el contexto del método de la presente invención, preferentemente en condiciones controladas cinéticamente.

Las fucosidasas, que pueden emplearse en el contexto de la presente invención, también pueden comprender fucosidasas manipuladas por ingeniería genética. Tales fucosidasas manipuladas por ingeniería genética comprenden preferentemente a-L-fucosidasas manipuladas por ingeniería genética, preferentemente fucosidasas manipuladas por ingeniería genética derivadas de fucosidasas como se describió anteriormente, por ejemplo, una a-1,2-L-fucosidasas manipuladas por ingeniería genética de Bifidobacterium bifidum, a-L-fucosintasas de Sulfolobus solfataricus y Thermotoga marítima, etc. Tales fucosidasas manipuladas por ingeniería genética muestran una regioselectividad dependiente del aceptor y están desprovistas de actividad de hidrólisis del producto. Además, las fucosidasas manipuladas por ingeniería genética comprenden preferentemente a-L-fucosidasa de Thermotoga maritima, que también se ha convertido recientemente en una a-L-transfucosidasa eficiente mediante evolución dirigida (ver Osanjo y otros Biochemistry 46, 1022 (2007)).

Aún con mayor preferencia, la enzima que tiene una actividad fucosidasa y/o transfucosidasa y/o fucosintasa puede seleccionarse de a-L-fucosidasas derivadas de Thermotoga maritima MSB8, Sulfolobus solfataricus P2, Bifidobacterium bifidum JCM 1254, Bifidobacterium bifidum JCM 1254, Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697, Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697, Bifidobacterium longum subsp. infantis JCM 1222, Bifidobacterium bifidum PRF2010, Bifidobacterium bifidum S17, Bifidobacterium longum subsp. longum JDM 301, Bifidobacterium dentium Bd1, o Lactobacillus casei BF23, etc.

Aún con mayor preferencia, la enzima que tiene una actividad fucosidasa y/o transfucosidasa y/o fucosintasa puede seleccionarse entre las siguientes a-L-fucosidasas como se define de acuerdo con los siguientes números de depósito gi|4980806 (Thermotoga maritima MSB8), gi| 13816464 {Sulfolobus solfataricus P2), gi|34451973 {Bifidobacterium bifidum JCM 1254), gi|242345155 {Bifidobacterium bifidum, JCM 1254), gi|213524647 {Bifidobacterium longum subsp.

infantis, ATCC 15697), gi|213522629 {Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697), gi|213522799 {Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697), gi|213524646 {Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697), gi|320457227 {Bifidobacterium longum subsp. infantis JCM 1222), gi|320457408 {Bifidobacterium longum subsp. infantis JCM 1222), gi|320459369 {Bifidobacterium longum subsp. infantis JcM 1222), gi|320459368 {Bifidobacterium longum subsp. infantis JCM 1222), gi|310867039 {Bifidobacterium bifidum PRF2010), gi|310865953 {Bifidobacterium bifidum PRF2010), gi|309250672 {Bifidobacterium bifidum S17), gi|309251774 {Bifidobacterium bifidum S17), gi|296182927 {Bifidobacterium longum subsp. longum JDM 301), gi|296182928 {Bifidobacterium longum subsp. longum JDM 301), gi|283103603 {Bifidobacterium dentium Bd1), gi| 190713109 {Lactobacillus casei BF23), gi| 190713871 {Lactobacillus casei BF23), gi| 190713978 {Lactobacillus casei BF23), etc., o una secuencia que exhibe una identidad de secuencia con las secuencias de una de las enzimas mencionadas anteriormente que tiene una actividad fucosidasa y/o transfucosidasa de al menos el 70 %, con mayor preferencia al menos el 80 %, igualmente con mayor preferencia al menos al menos el 85%, aún con mayor preferencia el 90 % y con la máxima preferencia al menos el 95 % o incluso el 97 %, el 98 % o el 99 % en comparación con la secuencia de tipo salvaje completa a nivel de aminoácido.

Las a-L-fucosidasas particularmente preferidas con actividad fucosidasa/transfucosidasa/fucosintasa se enumeran en la siguiente Tabla 3:

Tabla 3: a-L-fucosidasas preferidas

La reacción de fucosilación enzimática de acuerdo con la etapa d) proporciona un compuesto de la fórmula 10B y sus sales

en donde R', R1, R16 y A son como los definidos anteriormente.

En la etapa d), las enzimas que comprenden actividad transialidasa o transfucosidasa como se definió anteriormente también pueden comprender enzimas manipuladas por ingeniería genética que comprenden actividad transialidasa o transfucosidasa. Se prevé particularmente que las glucosidasas de tipo salvaje o mutadas que presentan actividad atransialidasa o a-transfucosidasa pueden usarse en la presente invención para producir los oligosacáridos diana. La preparación de tales enzimas se lleva a cabo preferentemente mediante enfoques de mutagénesis dirigida al sitio o de evolución dirigida.

En la ingeniería racional se crean nuevas enzimas alteradas (mutantes) mediante enfoques de mutagénesis dirigida al sitio, preferentemente mediante la introducción de mutaciones puntuales. Esta técnica generalmente requiere la dependencia de la estructura 3D de la proteína estática. Las mutaciones generalmente afectan el sitio activo de las enzimas de manera que pierden su capacidad para degradar sus productos de transglucosilación pero permanecen con la capacidad de síntesis. Una estrategia preferida consiste en la sustitución del nucleófilo catalítico por un residuo no nucleófilo. Esta modificación da como resultado la formación de un mutante inactivo o una enzima alterada con actividad de transglucosilación reducida debido a la falta de un entorno apropiado para la formación del complejo reactivo huésped-hospedero para la transglucosilación. Sin embargo, en presencia de un donante de glicosilo más activo (por ejemplo, fluoruro de fucosilo) que imita el intermedio enzimático de glicosilo, la enzima mutada es capaz de transferir eficientemente el resto glicosilo a un aceptor adecuado que genera un glucósido con estereoquímica anomérica invertida. Esta glucosidasa mutante se denomina glucosintasa (por ejemplo, fucosintasa) y su desarrollo representa uno de los principales avances en el uso de glucosidasas con fines sintéticos. En principio, el concepto de glucosintasa puede aplicarse a todas las especificidades de GH y ofrecer un gran panel de enzimas potencialmente capaces de sintetizar varios oligosacáridos con rendimientos muy altos, hasta el 95 %.

La segunda técnica preferida se llama evolución dirigida. Esta estrategia comprende mutagénesis aleatoria aplicada al gen de la glucosidasa seleccionada y genera así una biblioteca de genes genéticamente diversos que expresan glucosidasa. La generación de la diversidad de secuencias puede realizarse mediante el uso de metodologías bien conocidas, siendo la más preferible el método de la reacción en cadena de la polimerasa propensa a errores (epCR). Esta biblioteca de genes puede insertarse en microorganismos adecuados tales como E. coli o S. cerevisiae para producir variantes recombinantes con propiedades ligeramente alteradas. Los clones que expresan enzimas mejoradas se identifican entonces con un método de cribado rápido y confiable, se seleccionan y se llevan a una siguiente ronda de proceso de mutación. Los ciclos repetidos de mutación, recombinación y selección se continúan en la medida en que se desarrolle(n) el(los) mutante(s) con la actividad y/o especificidad deseadas. Hasta la fecha, se han desarrollado diferentes metodologías de cribado de alto rendimiento para las glucosidasas, que incluye las glucosintasas. Al aplicar estos enfoques, se pueden y se han creado y aislado transglucosidasas manipuladas por ingeniería genética efectivas, que incluyen glucosintasas nuevas y más eficientes. Una a-L-fucosidasa de Thermotoga maritima se ha convertido recientemente en una a-L-transfucosidasa eficiente mediante evolución dirigida. La relación transferasa/hidrólisis de la enzima desarrollada fue 30 veces mayor que la de la enzima nativa (ver Osanjo y otros Biochemistry 46, 1022 (2007)).

Las proteínas que comprenden una actividad transglucosidasa y/o glucosintasa como se definió anteriormente también pueden comprender fragmentos o variantes de esas secuencias de proteínas. Tales fragmentos o variantes pueden comprender típicamente una secuencia que tiene una identidad de secuencia con una de las secuencias de proteínas mencionadas anteriormente de al menos el 70 %, con mayor preferencia el 80 %, igualmente con mayor preferencia el 85 %, aún con mayor preferencia al menos el 90 % y con la máxima preferencia al menos el 95 % o incluso el 97 %, el 98 % o el 99 % en comparación con la secuencia de tipo salvaje completa a nivel de aminoácido.

Los "fragmentos" de proteínas o péptidos en el contexto de la presente invención también pueden comprender una secuencia de una proteína o péptido como se define en la presente descripción, que es, con respecto a su secuencia de aminoácidos N-terminal, C-terminal y/o intrasecuencialmente truncada en comparación con la secuencia de aminoácidos de la proteína original (nativa). Por tanto, tal truncamiento puede ocurrir a nivel de aminoácido o correspondientemente a nivel de ácido nucleico. Por lo tanto, una identidad de secuencia con respecto a tal fragmento como se define en la presente descripción puede referirse preferentemente a la proteína o péptido completo como se definió en la presente descripción o a la molécula de ácido nucleico (codificante) completa de dicha proteína o péptido. Igualmente, los "fragmentos" de ácidos nucleicos en el contexto de la presente invención pueden comprender una secuencia de un ácido nucleico como se define en la presente descripción, que es, con respecto a su molécula de ácido nucleico 5'-, 3'- y/o intrasecuencialmente truncada en comparación a la molécula de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico original (nativa). Por lo tanto, una identidad de secuencia con respecto a tal fragmento como se define en la presente descripción puede referirse preferentemente al ácido nucleico completo como se define en la presente descripción.

Las "variantes" de proteínas o péptidos como se definen en el contexto de la presente invención (por ejemplo, como codificadas por un ácido nucleico como se define en la presente descripción) pueden estar codificadas por la molécula de ácido nucleico de un complejo de carga portador polimérico. De esta manera, puede generarse una proteína o péptido, que tenga una secuencia de aminoácidos que difiera de la secuencia original en una o más mutaciones, tales como uno o más aminoácidos sustituidos, insertados y/o eliminados. Preferentemente, estos fragmentos y/o variantes tienen la misma función biológica o actividad específica en comparación con la proteína nativa de longitud completa, por ejemplo, su propiedad antigénica específica.

Las "variantes" de proteínas o péptidos como se definen en el contexto de la presente invención (por ejemplo, como codificadas por un ácido nucleico como se define en la presente descripción) también pueden comprender sustitución(es) de aminoácido(s) conservativa(s) en comparación con su secuencia fisiológica nativa, es decir, no mutada. Esas secuencias de aminoácidos así como también sus secuencias de nucleótidos codificantes en particular caen bajo el término variantes como se define en la presente descripción.Las sustituciones en las que los aminoácidos, que se originan en la misma clase, se intercambian entre sí se llaman sustituciones conservativas. En particular, estos son aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas, cadenas laterales cargadas positiva o negativamente, grupos aromáticos en las cadenas laterales o aminoácidos, cadenas laterales que pueden entrar en puentes de hidrógeno, por ejemplo, cadenas laterales que tienen una función hidroxilo. Esto significa que, por ejemplo, un aminoácido que tiene una cadena lateral polar se reemplaza por otro aminoácido que tiene una cadena lateral igualmente polar, o, por ejemplo, un aminoácido que se caracteriza por una cadena lateral hidrófoba se sustituye por otro aminoácido que tiene una cadena lateral igualmente hidrófoba (por ejemplo, serina (treonina) por treonina (serina) o leucina (isoleucina) por isoleucina (leucina)). Son posibles las inserciones y sustituciones, en particular, en aquellas posiciones de secuencia que no provocan ninguna modificación de la estructura tridimensional o que no afectan a la región de unión. Las modificaciones a una estructura tridimensional por inserción(es) o deleción(es) pueden determinarse fácilmente, por ejemplo, mediante el uso de espectros de CD (espectros de dicroísmo circular) (Urry, 1985, Absorción, Dicroísmo Circular y ORD de Polipéptidos, en: Modem Physical Methods in Biochemistry, Neuberger y otros (ed.), Elsevier, Amsterdam).

Además, las variantes de proteínas o péptidos como se definen en la presente descripción también pueden comprender esas secuencias, en donde los nucleótidos del ácido nucleico se intercambian de acuerdo con la degeneración del código genético, sin conducir a una alteración de la secuencia de aminoácidos respectiva de la proteína o el péptido, es decir, la secuencia de aminoácidos o al menos parte de la misma puede no diferir de la secuencia original en una o más mutaciones dentro del significado anterior.

Con el fin de determinar el porcentaje en el que dos secuencias son idénticas, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico o secuencias de aminoácidos como se definen en la presente descripción, preferentemente las secuencias de aminoácidos codificadas por una secuencia de ácidos nucleicos del portador polimérico como se define en la presente descripción o las propias secuencias de aminoácidos, las secuencias pueden alinearse con el fin de compararlas subsecuentemente entre sí. Por tanto, por ejemplo, una posición de una primera secuencia puede compararse con la posición correspondiente de la segunda secuencia. Si una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo componente que está en una posición en la segunda secuencia, las dos secuencias son idénticas en esta posición. Si este no es el caso, las secuencias difieren en esta posición. Si se producen inserciones en la segunda secuencia en comparación con la primera secuencia, pueden insertarse espacios en la primera secuencia para permitir una alineación adicional. Si se producen deleciones en la segunda secuencia en comparación con la primera secuencia, pueden insertarse espacios en la segunda secuencia para permitir una alineación adicional. El porcentaje en el que dos secuencias son idénticas es entonces una función del número de posiciones idénticas dividido por el número total de posiciones, que incluye aquellas posiciones que sólo están ocupadas en una secuencia. El porcentaje en el que dos secuencias son idénticas puede determinarse mediante el uso de un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido, pero que no limita, de un algoritmo matemático que puede usarse es el algoritmo de Karlin y otros Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873 (1993) o Altschul y otros Nucleic Acids Res. 25, 3389 (1997). Dicho algoritmo está integrado en el programa BLAST. Las secuencias que son idénticas a las secuencias de la presente invención hasta cierto punto pueden identificarse mediante este programa.

Las enzimas usadas en la etapa d) pueden proporcionarse en una forma libre o, alternativamente, pueden estar unidas o inmovilizadas sobre una superficie. La unión o inmovilización sobre una superficie puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante enlaces electrostáticos, enlaces de van der Waals, enlaces covalentes, etc. La unión o inmovilización sobre una superficie puede llevarse a cabo además, mediante el uso de un enlazador covalente o un reticulante, o una etiqueta, como es conocido por una persona experta para la purificación de proteínas. Dichas etiquetas comprenden, entre otras, por ejemplo, etiquetas de afinidad o etiquetas de cromatografía. Las etiquetas de afinidad pueden incluir, por ejemplo, proteína de unión a quitina (CBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST) o la etiqueta Strep. La etiqueta de poli(His) es una etiqueta de proteína ampliamente usada que se une a matrices metálicas. Las etiquetas de cromatografía se usan para alterar las propiedades cromatográficas de la proteína para proporcionar una resolución diferente a través de una técnica de separación particular, e incluyen, por ejemplo, etiquetas basadas en aminoácidos polianiónicos, como la etiqueta FLAG. La superficie puede ser la superficie de un biorreactor, o cualquier cámara de reacción adecuada.

La reacción enzimática puede llevarse a cabo como se describió en los documentos WO 2012/007588, WO 2012/127410 o WO 2012/156897, preferentemente se producen con una concentración de la enzima respectiva en una concentración de 1 mU/l a 1000 U/l, preferentemente 10 mU/l a 100 U/l, cuando la actividad capaz de formar 1 pmol de producto específico para una proteína definida a partir de un educto definido se define como 1 unidad (U), por ejemplo, para una glucotransferasa, la producción de un carbohidrato complejo que contiene glucosa a 37 °C en 1 minuto. La actividad de cada enzima como se define en la presente descripción puede evaluarse con respecto a su sustrato de origen natural o manipulado por ingeniería genética. La incubación puede llevarse a cabo en un medio de reacción, preferentemente un medio acuoso, que comprende el compuesto obtenido de acuerdo con la etapa c) y opcionalmente agua; un tampón tal como un tampón fosfato, un tampón carbonato, un tampón acetato, un tampón borato, un tampón citrato y un tampón tris, o sus combinaciones; alcohol, tal como metanol y etanol; éster tal como acetato de etilo; cetona tal como acetona; amida tal como acetamida; y similares. Además, la incubación puede llevarse a cabo en un medio de reacción como se definió anteriormente, en donde opcionalmente puede añadirse un surfactante o un solvente orgánico, si es necesario. Puede usarse como surfactante cualquier surfactante capaz de acelerar la formación de un carbohidrato complejo como se define de acuerdo con la presente invención como un posible producto de la invención. Los ejemplos incluyen surfactantes no iónicos tales como polioxietilen-octadecilamina (por ejemplo, Nymeen S-215, fabricado por Nippon Oil & Fats); surfactantes catiónicos, tales como bromuro de cetiltrimetilamonio y cloruro de alquildimetilbencilamonio (por ejemplo, Cation F2-40E, fabricado por Nippon Oil & Fats); surfactantes aniónicos tales como lauroil sarcosinato; aminas terciarias tales como alquildimetilamina (por ejemplo, Amina terciaria FB, fabricada por Nippon Oil & Fats); y similares, los que se usan solos o como una mezcla de dos o más. El surfactante puede usarse generalmente en una concentración de 0,1 a 50 g/l. El solvente orgánico puede incluir xileno, tolueno, alcohol de ácido graso, acetona, acetato de etilo y similares, que pueden usarse generalmente en una concentración de 0,1 a 50 ml/l.

Además, la incubación puede llevarse a cabo en un medio de reacción como se definió anteriormente, preferentemente que tenga un pH de 3 a 10, un pH de 5 a 10, preferentemente un pH de 6 a 8.

Además, la incubación puede llevarse a cabo a una temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 100 °C, preferentemente a una temperatura de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 °C, por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 50 °C. En el medio de reacción, pueden añadirse sales inorgánicas, tales como MnCl2 y MgCl2, si es necesario.

La incubación de acuerdo con la etapa d) del método de la presente invención puede llevarse a cabo en un biorreactor. El biorreactor es preferentemente adecuado tanto para un modo continuo o un modo discontinuo. Si se lleva a cabo en un modo continuo, el método preferentemente proporciona un flujo continuo de compuestos y/o enzimas según sea necesario, preferentemente que proporciona continuamente eductos de la reacción a la mezcla de reacción y que elimina continuamente los productos de la mezcla de reacción, mientras se mantiene la concentración de todos los componentes, que incluye las enzimas a un nivel predeterminado. Las enzimas usadas en un modo continuo pueden añadirse tanto en forma libre o unidas o inmovilizadas a una superficie.

En la etapa e) de la presente invención, un compuesto obtenido en la etapa c) o la etapa d) se somete a hidrogenólisis catalítica.

En consecuencia, la hidrogenólisis catalítica se realiza cuando, en un compuesto de la fórmula 7 obtenido en la etapa c) o en un compuesto de la fórmula 10 obtenido en la etapa d), R' es -OR'6 en donde R'6 es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis. Dicha hidrogenólisis catalítica tiene lugar típicamente en un solvente prótico o en una mezcla de solventes próticos. Puede seleccionarse un solvente prótico del grupo que consiste en agua, ácido acético o alcoholes de C1-C6. También puede usarse una mezcla de uno o más solventes próticos con uno o más solventes orgánicos apróticos adecuados parcial o totalmente miscibles con el(los) solvente(s) prótico(s) (como THF, dioxano, acetato de etilo o acetona). Preferentemente se usa agua, uno o más alcoholes de C1-C6 o una mezcla de agua y uno o más alcoholes de C1-C6 como el sistema solvente. También son aplicables las soluciones que contienen los derivados de carbohidratos en cualquier concentración o las suspensiones de los derivados de carbohidratos en el(los) solvente(s) usado(s). La mezcla de reacción se agita a una temperatura en el intervalo de 10-100 °C, preferentemente entre 20-50 °C, en una atmósfera de hidrógeno de 1-50 bar absolutos (100 a 5000 kPa) en presencia de un catalizador tal como paladio, níquel Raney o cualquier otro catalizador metálico apropiado, preferentemente paladio sobre carbón o negro de paladio, hasta la terminación de la reacción. La hidrogenólisis de transferencia también puede realizarse, cuando el hidrógeno se genera in situ a partir de ciclohexeno, ciclohexadieno, ácido fórmico o formiato de amonio. También puede usarse la adición de bases o ácidos orgánicos o inorgánicos y/o resinas de intercambio iónico básicas y/o ácidas para mejorar la cinética de la hidrogenólisis. Las condiciones propuestas anteriormente permiten la eliminación simple, conveniente y delicada de grupos protectores de tipo bencilo dando como resultado un grupo de compuesto de la fórmula 1 en donde R es OH (de compuestos de la fórmula 7 o 10 en donde R' es -OR'6 en donde R'6 es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis).

Por tanto, de acuerdo con la presente invención, los derivados del complejo de 3-O-galactosil-GlcNAc o -GalNAc de la fórmula 1 y sus sales

en donde R es -OH,

R1 es el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico,

R2 se selecciona de H y del grupo L-fucopiranosilo,

R3 se selecciona de H y del residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico,

R4 se selecciona de H y del grupo L-fucopiranosilo, siempre y cuando al menos uno de R3 y R4 sea H, y

A es un enlazador de carbohidratos divalentes como se definió anteriormente,

puede sintetizarse efectivamente.

El presente método proporciona fácilmente la síntesis de derivados complejos sialilados y/o fucosilados de 3-O-galactosil-6-O-sialil-GlcNAc o -GalNAc, mediante una combinación única de etapas de glucosilación química y enzimática en la secuencia de reacción. El proceso abre la posibilidad, mediante la permutación de las etapas de glucosilación obligatoria y opcional, para obtener un número de compuestos que están sustituidos por resto/restos sialilo y/o fucosilo en varias posiciones. Estos posibles patrones de sustitución se resumen en la Tabla 4 más abajo.

Además, el presente método es ventajoso porque estos diversos grupos de compuestos pueden estar disponibles de una manera más sencilla y/o en menos etapas. Ando y otros (Carbohydr. Res. 338, 503 (2003)) enseñaron que la 6-O-sialilación de los aceptores "voluminosos" donde el grupo OH que se va a sialilar pertenecía a un residuo interno de GlcNAc no era favorable porque solo pudo conseguirse rendimientos bajos. Por tanto, se propuso sialilar los aceptores que tiene un resto GlcNAc terminal. Sin embargo, los presentes inventores encontraron que los compuestos de la fórmula 2 que tiene una GlcNAc interna pueden sialilarse efectivamente. Además, Ando y otros J. Carbohydr. Chem.

20, 425 (2001) y Carbohydr. Res. 338, 503 (2003), informaron la introducción del resto 3'-O-sialilo de una manera indirecta, es decir, mediante la sialilación de un derivado monosacárido de galactosa para obtener primero un disacárido de sialilgalactosa que, después de transformarla en un donante de disacárido, fue usado para glucosilar el aceptor GlcNAc, a menudo con regioselectividad insatisfactoria. Sin embargo, el presente método evita la fabricación y el uso de este tipo de donante de disacárido difícil de obtener, y en su lugar introduce una sialilación enzimática directa de los intermedios de la fórmula 7 obtenidos en la etapa c) del presente método que tiene lugar con buena regio y estereoselectividad. Adicionalmente, el intermedio de la fórmula 7 también puede ser un sustrato para la fucosilación enzimática y, por tanto, el método proporciona un grupo diverso de derivados de 3'-O-galactosil-6-O-sialil-GlcNAc o -GalNAc sialilados y/o fucosilados de forma diversa y análogos de los mismos.

Dentro del primer aspecto de la invención, preferentemente, los compuestos de la fórmula 1 son oligosacáridos de la leche humana enumerados en la Tabla 1 anterior y derivados, aún con mayor preferencia LST b, F-LST b, DS-LNT o FDS-LNT I y derivados. En consecuencia, un compuesto de la fórmula 2A que entra en el alcance de los compuestos de la fórmula 2

en donde Y y R7 son como los definidos anteriormente,

R' es como el definido anteriormente y

B' es un resto lactosilo divalente que tiene el grupo R' en su átomo de carbono anomérico C-1 y está unido a través de su grupo 3'-OH al residuo lacto-N-biosa del compuesto de la fórmula 2A, opcionalmente sustituido por un resto fucosilo en su 3-OH o por un resto N-acetil-lactosaminilo en su 6'-OH, cuyo resto N-acetil-lactosaminilo puede estar opcionalmente sustituido adicionalmente por un resto N-acetil-neuraminilo en su 6-OH, o por un fucosilo en su 3-OH o 2'-OH, y los grupos funcionales del residuo lactosilo divalente B' están protegidos, es decir, los grupos OH libres están acilados (por ejemplo, acetilados, benzoilados) y el grupo carboxi del resto opcional N-acetil-neuraminilo está bloqueado en forma de éster (por ejemplo, éster metílico, etílico o bencílico), excepto por el grupo 4-OH axial de cualquier resto galactosilo del grupo B' que está opcionalmente protegido,

se sialila en la etapa a) que da un compuesto de la fórmula 4D

en donde R', B', Y y R7son como los definidos anteriormente y R19 es un resto H

en donde R5 y R8 son como los definidos anteriormente.

Preferentemente un compuesto de la fórmula 2A

en donde R'' es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis,

Y y R7 son como los definidos anteriormente,

R20 es independientemente acilo, y

R21 se selecciona de H y acilo,

con mayor preferencia un compuesto de la fórmula 2A, en donde Y se selecciona de -NHAc y tricloroacetamido, los grupos R7 son idénticos y se seleccionan de acetilo, benzoilo y 4-clorobenzoilo, los grupos R20 son idénticos y se seleccionan de acetilo, benzoilo y 4-clorobenzoilo, y R21 se selecciona de H, acetilo, benzoilo o 4-clorobenzoilo, se hace reaccionar con un donante de sialilo de la fórmula 3 definida anteriormente para dar un compuesto de la fórmula 4E

en donde R'' es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis,

Y se selecciona de -NHAc, haloalcanoilamido y -NAC2, preferentemente -NHAc y tricloroacetamido,

R7 es independientemente acilo, preferentemente los grupos R7 son idénticos y se seleccionan de acetilo, benzoilo y 4-clorobenzoilo,

R8 es independientemente acilo, preferentemente los grupos R8 son acetilo,

R20 es independientemente acilo, preferentemente los grupos R20 son idénticos y se seleccionan de acetilo, benzoilo y 4-clorobenzoilo,

R21 se selecciona de H y acilo, preferentemente R21 se selecciona de H, acetilo, benzoilo o 4-clorobenzoilo, y Q se selecciona de alquilo y bencilo, preferentemente metilo, etilo y bencilo.

En la subsecuente etapa b) un compuesto de la fórmula 4D, preferentemente de fórmula 4E, es opcionalmente fucosilado con un donante de fucosilo de la fórmula 5A

en donde Xa se selecciona de alquiltio y feniltio opcionalmente sustituido, preferentemente -SPh,

R22 y R23 se seleccionan, independientemente, de un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis y acilo (preferentemente acetilo, pivaloilo, benzoilo y 4-clorobenzoilo),

para dar como resultado un compuesto de la fórmula 6D

en donde R', B', Y, R7 y R19 son como los definidos anteriormente, y

R24 es un resto I

en donde R22 y R23 son como los definidos anteriormente,

Preferentemente, un compuesto de la fórmula 6D está representado por la fórmula 6E

en donde R'' es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis,

Y se selecciona de -NHAc, haloalcanoilamido y -NAc2, preferentemente -NHAc y tricloroacetamido,

R7 es independientemente acilo, preferentemente los grupos R7 son idénticos y se seleccionan de acetilo, benzoilo y 4-clorobenzoilo,

R8 es independientemente acilo, preferentemente los grupos R8 son acetilo,

R20 es independientemente acilo, preferentemente los grupos R20 son idénticos y se seleccionan de acetilo, benzoilo y 4-clorobenzoilo,

R21 se selecciona de H y acilo, preferentemente R21 se selecciona de H, acetilo, benzoilo o 4-clorobenzoilo, y Q se selecciona de alquilo y bencilo, preferentemente metilo, etilo y bencilo, y

R24 es el resto I como se definió anteriormente.

En la subsecuente etapa c) un compuesto de la fórmula 4D obtenido en la etapa a) o un compuesto de la fórmula 6D obtenido en la etapa b) se somete a tratamiento desprotector y transformación opcional de Y en -NHAc para dar como resultado la formación de un compuesto de la fórmula 7A

en donde R' es como se definió anteriormente,

el resto A' es un resto lactosilo divalente que tiene el grupo R' en su átomo de carbono anomérico C-1 y está unido a través de su grupo 3'-OH al residuo lacto-N-biosa del compuesto de la fórmula 7A, opcionalmente sustituido por un resto fucosilo en su 3-OH o por un resto N-acetil-lactosaminilo en su 6'-OH, cuyo resto N-acetil-lactosaminilo puede estar opcionalmente sustituido adicionalmente por un resto N-acetil-neuraminilo en su 6-OH, o por un fucosilo en su 3-OH o 2'-OH, por lo que el resto A' queda desprovisto de cualquier grupo protector de OH y el grupo protector de éster del resto N-acetil-neuraminilo (si está presente),

R1 es el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico, y

R16 se selecciona de H y un resto de la fórmula C

en donde R17 y R18, independientemente, se seleccionan de H y un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis, que comprende las etapas de

i) transesterificación catalizada por bases para eliminar grupos O-acilo,

ii) hidrólisis básica,

iii) y transformación opcional de Y en -NHAc.

Alternativamente, puede evitarse la desprotección por transesterificación catalizada por bases y los grupos O-acilo pueden eliminarse mediante hidrólisis básica.

Preferentemente, en esta etapa c) del método, un compuesto de la fórmula 4E o un compuesto de la fórmula 6E definido anteriormente se convierte en un compuesto de la fórmula 7B

en donde R'' es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis, y

R16 se selecciona de H y resto C definido anteriormente, preferentemente H que comprende:

i) desprotección por transesterificación catalizada por bases, preferentemente tratamiento con NaOMe/MeOH, ii) hidrólisis básica, preferentemente tratamiento con NaOH/MeOH, y

iii) donde el grupo Y en un compuesto de la fórmula 4E o 6E es haloalcanoilamido, preferentemente tricloroacetamido, y se desprotege a amino en las condiciones usadas en la etapa ii) seguido de N-acetilación selectiva o peracetilación/des-O-acetilación.

Aún dentro de la modalidad preferida del método, en la etapa d), un compuesto de la fórmula 7A es opcionalmente sialilado o fucosilado bajo la acción de una sialidasa o fucosidasa que tiene actividad transialidasa o transfucosidasa/fucosintasa, respectivamente, para dar un compuesto de la fórmula 10C

en donde R', A', R1 y R16 son como los definidos anteriormente,

R3 se selecciona de H y del residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico, y

R4 se selecciona de H y L-fucopiranosilo, siempre y cuando uno pero solo uno de R3 y R4 es H.

Particularmente, un compuesto de acuerdo con la fórmula 7B puede hacerse reaccionar con un donante de N-acetilneuraminilo seleccionado de 3'-O-sialil lactosa o N-acetil-a-neuraminósido de p-nitrofenil en presencia de transialidasa, preferentemente una transialidasa enumerada en la Tabla 2 anterior, para fabricar un compuesto de la fórmula 10D

en donde R'' y R16 son como se definieron anteriormente.

Con respecto a la fucosilación enzimática opcional en esta etapa d) del método reivindicado, un compuesto de la fórmula 7A, preferentemente de la fórmula 7B, puede someterse a fucosilación enzimática bajo la acción de una fucosidasa que tiene actividad transfucosidasa/fucosintasa, preferentemente las enumeradas en la Tabla 3, en presencia de un donante de fucosilo seleccionado entre 2'-O-fucosil lactosa o fluoruro de fucosilo para dar un compuesto de la fórmula 10E

en donde R'' y R16 son como se definieron anteriormente.

Finalmente en la etapa e), un compuesto de fórmula 7A o 10C se somete a hidrogenación catalítica para eliminar el(los) grupo(s) protector(es) de bencilo/bencilo sustituido para dar oligosacáridos complejos de la fórmula 1A y análogos de los mismos, preferentemente oligosacáridos de la leche humana enumerados en la Tabla 1 anterior o análogos

en donde A', R, R1, R2, R3 y R4 son como los definidos anteriormente, siempre y cuando al menos uno de R3 y R4 es H.

Preferentemente, la hidrogenólisis de un compuesto de la fórmula 10D proporciona un compuesto de la fórmula 1B

en donde R2 se selecciona de H y fucosilo,

eso es DS-LNT y FDS-LNT I, respectivamente. De manera similar, de un compuesto de la fórmula 10E definido anteriormente un compuesto de la fórmula 1C

en donde R2 es como se definió anteriormente,

es de fácil acceso. Preferentemente, R2 es H en un compuesto de la fórmula 1C que corresponde a F-LST b.

También preferentemente, la hidrogenólisis catalítica de un compuesto de la fórmula 7B proporciona fácilmente un compuesto de la fórmula 1D

en donde R16 es como se definió anteriormente, preferentemente H (correspondiente a LST b).

El método de acuerdo con el primer aspecto de la invención implica nuevos intermedios sintéticos útiles para la síntesis de oligosacáridos sialilados/fucosilados y sus análogos, tales como un compuesto de la fórmula 11 y sus sales

en donde R'' es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis,

A es un enlazador de carbohidratos divalentes como se definió anteriormente,

R1 es el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico,

R3 se selecciona de H y del residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico,

R4 se selecciona de H y L-fucopiranosilo, siempre y cuando al menos uno de R3 y R4 es H, y R16 se selecciona de H y el resto C, preferentemente H,

en donde R17 y R18, independientemente, se seleccionan de H y un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis.

Un compuesto de la fórmula 11 puede ser tanto un anómero a o p o una mezcla anomérica de anómeros a y p. Puede ser un sólido cristalino, aceite, jarabe, material amorfo precipitado o producto secado por pulverización. Si es cristalino, un compuesto de la fórmula 11 podría existir en forma cristalina anhidra o hidratada que incorpora una o varias moléculas de agua en su estructura cristalina. Igualmente, un compuesto de la fórmula 11 podría existir como una sustancia cristalina, que incorpora ligandos como iones y/o moléculas orgánicas en su estructura cristalina.

Un compuesto preferido de la fórmula 11 es un compuesto de la fórmula 11A siendo un precursor para DS-LNT, FDS-LNT I, F-LST b, LST b y análogos de los mismos

en donde R'', R1, R3, R4 y R16 son como se definieron anteriormente, siempre y cuando al menos uno de R3 y R4 es H, y

A' es un resto lactosilo divalente que tiene el grupo -OR'' en su átomo de carbono anomérico C-1 y está unido a través de su grupo 3'-OH al residuo lacto-N-biosa del compuesto de la fórmula 11A, opcionalmente sustituido por un resto fucosilo en su 3-OH o por un resto N-acetil-lactosaminilo en su 6'-OH, cuyo resto N-acetil-lactosaminilo puede estar opcionalmente sustituido adicionalmente por un resto N-acetil-neuraminilo en su 6-OH, o por un fucosilo en su 3-OH o 2'-OH, por lo que el resto A' queda desprovisto de cualquier grupo protector de OH y el grupo protector de éster del resto N-acetil-neuraminilo (si está presente),

particularmente un compuesto de la fórmula 10D

en donde R'' y R16 son como los definidos anteriormente,

también particularmente un compuesto de la fórmula 10E

en donde R'' y R16 son como se definieron anteriormente.

Otro compuesto preferido de la fórmula 11A se caracteriza por la fórmula 7C

en donde R'', A', R1 y R16 son como se definieron anteriormente.

Un compuesto preferido de la fórmula 7C es un compuesto de la fórmula 7B

en donde R'' es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis, y

R16 se selecciona de H y el resto C definido anteriormente, preferentemente H.

El segundo aspecto de la invención se refiere a los precursores de los compuestos de la fórmula 11 definidos anteriormente en el proceso sintético reivindicado, que se caracterizan por la fórmula 12

en donde R' es -OR'6 en donde R'6 es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis,

R7 es independientemente acilo,

Y se selecciona de -NHAc, haloalcanoilamido y -NAC2, y

B' es un enlazador de lactosilo divalente en forma protegida, esto significa que B' es un resto lactosilo divalente que tiene el grupo R' en su átomo de carbono anomérico C-1 y está unido a través de su grupo 3'-OH al residuo lacto-N-biosa del compuesto de la fórmula 12, opcionalmente sustituido por un grupo L-fucopiranosilo en su 3-OH o por un grupo N-acetil-lactosaminilo en su 6'-OH, cuyo resto N-acetil-lactosaminilo puede estar opcionalmente sustituido adicionalmente por un residuo de ácido N-acetil-neuramínico en su 6-OH, o por un L-fucopiranosilo en su 3-OH o 2'-OH, y los grupos Oh libres están acilados (por ejemplo, acetilados, benzoilados) y el grupo carboxi del residuo opcional del ácido N-acetil-neuramínico está bloqueado en forma de éster (por ejemplo, éster metílico, etílico o bencílico), excepto por el grupo 4-OH axial de cualquier resto galactosilo del grupo B' que está opcionalmente protegido, P se selecciona de un residuo glicosilo protegido del ácido N-acetil-neuramínico, y

R25 se selecciona del resto I y H, preferentemente H,

en donde R22 y R23 se seleccionan, independientemente, de un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis y acilo (preferentemente acetilo, pivaloilo, benzoilo o 4-clorobenzoilo).

Un compuesto de la fórmula 12 puede ser tanto un anómero a o p o una mezcla anomérica de anómeros a y p. Puede ser un sólido cristalino, aceite, jarabe, material amorfo precipitado o producto secado por pulverización. Si es cristalino, un compuesto de la fórmula 12 puede existir en forma cristalina anhidra o hidratada que incorpora una o varias moléculas de agua en su estructura cristalina. Igualmente, un compuesto de la fórmula 12 puede existir como una sustancia cristalina, que incorpora ligandos como iones y/o moléculas orgánicas en su estructura cristalina.

Los precursores preferidos de los compuestos de la fórmula 12 están definidos por la fórmula 12A

en donde R' y R25 son como los definidos anteriormente,

Y se selecciona de -NHAc, haloalcanoilamido y -NAC2, , preferentemente -NHAc y tricloroacetamido,

R7 es independientemente acilo, preferentemente los grupos R7 son idénticos y se seleccionan de acetilo, benzoilo y 4-clorobenzoilo,

R8 es independientemente acilo, preferentemente los grupos R8 son acetilo,

R20 es independientemente acilo, preferentemente los grupos R20 son idénticos y se seleccionan de acetilo, benzoilo y 4-clorobenzoilo,

R21 se selecciona de H y acilo, preferentemente R21 se selecciona de H, acetilo, benzoilo o 4-clorobenzoilo, y Q se selecciona de alquilo y bencilo, preferentemente metilo, etilo y bencilo, con mayor preferencia por la fórmula 4E

en donde R7, R8, R20, R21, Q y Y son como los definidos anteriormente, y

R'' es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis.

Otras características de la invención serán evidentes en el curso de las siguientes modalidades ilustrativas, que son ilustrativas pero no limitantes de la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

A una solución del aceptor de diol tetrasacárido (10,0 g, aproximadamente 93 % de pureza, preparado como se describió en el documento WO 2012/155916) y donante de fosfito de ácido siálico (4,45 g, preparado como se describió en el documento WO 2012/113404) en propionitrilo (30 ml) se añadió triflato de trimetilsililo (0,4 ml) gota a gota a -30 °C en presencia de cribas moleculares de 4Á y la mezcla de reacción se dejó calentar lentamente a -20 °C y se agitó a esta temperatura durante 60 minutos. Se añadieron periódicamente cantidades adicionales del donante (2,4 g 2,4 g 1,2 g) cada una seguida de la adición de TMSOTf (100 pl 100 pl 50 pl) cada 60 min a -30 °C seguido de agitación a -20 °C. Después de 7 horas, la mezcla se templó con EtOAc (50 ml) y una solución acuosa saturada de NaHCO3 (20 ml), se agitó durante 10 minutos a 0 °C y se particionó entre EtOAc (150 ml en total) y NaHCO3 (100 ml), se lavó con NaHC03 al 5 % y salmuera. La solución acuosa combinada se volvió a extraer con EtOAc (50 ml) y se lavó como anteriormente. La solución orgánica combinada se secó y se evaporó para dar una espuma blanca (20,4 g). El producto del título se aisló mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, lo que produjo 7,9 g del pentasacárido del título (62 %). LC-HRMS se calculó para [C103H102Cl8N2O43 H]⁺ 2340,3412, y se encontró m/z 2340,3371 ([M E1]⁺, intensidad de rel. 100 %).

1H NMR (CDCl3, 300 MHz, CHCl3 = 7,26) 5: 8,00-7,06 (m, 28H), 6,91-6,85 (m, 2H), 6,62 (d, 1H, J = 7,1 Hz, NH), 5,64 (d, 1H, J= 3,1 Hz), 5,56 (pt, 1H, J= 9,7 Hz, J= 9,1 Hz), 5,49-5,27 (m, 5H), 5,16 (bd, 1H, J= 9,5 Hz), 5,09 (dd, 1H, J= 8.0 Hz, J= 10,6 Hz), 4,99-4,89 (m, 2H), 4,81-4,74 (m, 2H), 4,64 (d, 2H, J= 8,0 Hz), 4,54 (d, 1H, 12,5 Hz), 4,40-4,33 (m, 3H), 4,31 (dd^po, 1H, J= 2,6 Hz, J= 12,6 Hz), 4,24 (dd, 1H, J= 3,4 Hz, J= 10,3 Hz), 4.16-3,94 (m, 8H), 3,88-3,79 (m, 3H), 3,76 (s0, 3H, C02Me), 3,77-3,71 (m0, 1H), 3,66 (pdt, 1H, J= 3,6 Hz, J= 10,6 Hz), 3,40-3,28 (m, 3H), 3,04 (pdt, 1H, J= 1.1 Hz, J= 9,8 Hz, H-2^glucN), 2,58 (dd, 1H, J=4,8 Hz, J= 13,2 Hz, H-3a^sial), 2,12 (s, 3H), 2,11 (s, 6H), 2,02 (so, 3H), 2,01 (s^o , 3H), 1,99 (pt^o , 1H, H-3b^sial) 1,98 (s0, 3H), 1,93 (s, 3H), 1,91 (s, 3H), 1,89 (s, 3H).

13C NMR (CDCl^a , 75 MHz) 5: 171,3, 171,1, 170,6, 170,5, 170,4 (3C), 170,3, 169,5, 168,5, 165,3, 165,2, 165,1, 164,8, 164,6, 164,0, 161,8, 140,5, 140,3 (2C), 140,2, 139,8, 138,2, 136,6, 133,8, 131,7- 127,6 (33C), 125,6, 101,2, 100,8, 99,2, 99,0, 98,2, 92,0, 81,2, 76,0, 75,1 (2C), 73,3 (2C), 72,6, 72,4, 72,0 (2C), 71,3, 71,0, 70,9, 70,4, 69,4, 69,2, 68,8, 68,7, 67,5, 67,0, 64,4, 63,2, 62,7, 62,5, 61,3, 58,9, 53,1, 48,8, 37,3, 23,6, 21,8, 21,5, 21,2-20,8 (6C).

Ejemplo 2

Una solución del producto obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1 (13,18 g) en MeOH seco (65 ml) se trató con MeONa metanólico al 25 % (p/p) (1,05 ml) a 65 °C. La mezcla se agitó a esta temperatura durante 3 h. La mezcla de reacción se neutralizó mediante la adición de AcOH y la solución obtenida se concentró a aproximadamente un volumen de 1/10. La solución resultante se recogió en agua y hexano. Se separaron las capas y la capa acuosa se lavó dos veces con hexano. La fase de agua-MeOH se concentró luego a aproximadamente 250 ml y se trató con una solución acuosa de NaOH al 50 % (2,6 ml) a 65 °C durante 1,5 horas. La mezcla de reacción se evaporó luego en vacío. El residuo se recogió en piridina seca (200 ml) y anhídrido acético (160 ml) y la mezcla se agitó durante 40 horas. Los volátiles se evaporaron y se co-evaporaron dos veces con tolueno. El residuo se recogió en CH2Cl2, se lavó con HCl acuoso al 5 %, y luego dos veces con salmuera. La fase orgánica se secó, se filtró y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida para dar el compuesto peracetilado (7,86 g, 81 %) como un sólido beige. LC-HRMS m/z 860,2636 [M 2H]²⁺ , 871,2552 [M H Na]²⁺ , 879,2423 [M H K]²⁺.

1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) 5: 7,66 (d, 1H, J= 11,6 Hz, NH), 7,58 (d, 1H, J= 8,9 Hz, NH), 7,39-7,21 (m, 5H), 5,31­ 5,01 (m, 5H), 4,91-4,47 (m, 9H), 4,41-3,27 (m, 23H), 2,52 (dd^o , 1H,J= 5,2 Hz, H- 3a^sial), 2,09 (s, 6H), 2,04 (s, 6H), 2,02 (s, 6H), 1,98 (s, 6H), 1,96 (s, 3H), 1,95 (s, 3H), 1,94 (s, 3H), 1,92 (s, 3H), 1,89 (s, 6H), 1,87 (s, 3H), 1,81 (s, 3H), 1,62 (s, 3H), 1,33 (pt, 1H, J= 11,8 Hz, J= 11,1 Hz, H-3b^sial).

Ejemplo 3

Etapa 1. Una solución del compuesto del ejemplo 1 (6,57 g) en MeOH seco (50 ml) se trató con MeONa metanólico al 25 % (p/p) (0,5 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 21 horas, se templó con AcOH y se evaporó al vacío. El residuo obtenido (6,14 g) se sonicó con Et2O y se filtró (5 x 40 ml). Alternativamente, los benzoatos de metilo pudieron extraerse al hacer particiones entre agua y un solvente orgánico como éter o hexano. El compuesto se secó en un horno al vacío para dar 3,90 g de un material crudo.

Etapa 2. El sólido obtenido en la etapa 1 se recogió en agua (30 ml) que contenía NaOH (0,514 g) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 días y luego a 60 °C durante 2 horas. La mezcla se neutralizó con AcOH y se extrajo con éter. La fase acuosa dio 5,52 g de sólido después de la evaporación. Se calculó LC-HRMS para [C42H66N2O28-H]- 1045,3729, y se encontró 1045,3732 ([M-H]-).

Etapa 3. El producto de la etapa 2 se recogió en una mezcla de piridina y AC2O (50 ml cada uno) y se agitó a 50 °C durante 30 minutos, luego a temperatura ambiente durante 18 horas. Se añadió una cantidad adicional de anhídrido acético (20 ml) y la mezcla se agitó a 40 °C durante 2 horas. Los volátiles se eliminaron al vacío y el residuo se co­ evaporó con tolueno y luego se particionó entre CH2Cl2 (200 ml) y HCl 0,5 M (50 ml). La fase acuosa se reextrajo con CH2Cl2 (3 x 20 ml). La solución orgánica combinada se secó y se evaporó para dar 5,0 g de producto crudo como sólido blanco. Se cromatografió sobre sílice para dar 3,89 g del compuesto del título (80,5 %).

Ejemplo 4

A una solución agitada del compuesto de acuerdo con los Ejemplos 2 o 3 (4,89 g) en MeOH seco (60 ml) se añadió MeONa metanólico al 25 % (p/p) (2,02 ml). Después de 16 horas, la mezcla de reacción se neutralizó cuidadosamente mediante la adición de resina Dowex 50W-X8 (en forma de H⁺), resina a pH = 3. La suspensión se filtró y los solventes se evaporaron para dar el compuesto del título (3,05 g, 98 %) como un sólido blanco. LC-HRMS calculada, para [C44H68N2O29-H]- 1087,3835, y encontrada 1087,3848 ([M-H]).

1H NMR (D²O, 300 MHz) 5: 7,46-7,35 (m, 5H), 4,89 (d, 1H, J = 11,6 Hz, H^Bn), 4,71 (d, 1H, J = 11,6 Hz, H^Bn), 4,65 (d, 1H, J = 8,40 Hz), 4,51 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 4,39 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 4,38 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 4,12 (d, 1H, J = 3,1 Hz), 3,99-3,44 (m, 29 H), 3,30 (pt, 1H, J = 8,5 Hz), 2,69 (dd, 1H, J = 4,6 Hz, J = 12,7 Hz, H-3a^sial), 1,99 (s, 3H), 1,98 (s, 3H), 1,68 (pt, 1H, J = 11,3 Hz, J = 12,3 Hz, H-3b^sial)

¹³C NMR (D²O, 75 MHz) 5: 175,6, 175,5, 173,5, 137,1, 129,4 (2C), 129,3 (2C), 129,1, 104,1, 103,6, 103,3, 101,6, 100.4, 82,9, 82,5, 79,0, 75,9, 75,6, 75,4, 75,1,74,3, 73,4, 73,3, 73,1,72,2 (2C), 71,3, 71,1,70,6, 69,2, 69,0, 68,9, 68,7, 63.4, 63,3, 61,7, 60,7, 55,4, 52,5, 49,5, 40,5, 22,9, 22,7.

Ejemplo 5

A una solución agitada del compuesto de acuerdo con los Ejemplos 2 o 3 (7,77 g) en MeOH seco (95 ml) se añadió MeONa metanólico al 25 % (p/p) (2,12 ml). Después de 16 horas, la mezcla de reacción se neutralizó cuidadosamente mediante la adición de resina Dowex 50W-X8 (en forma de H+) a pH=3. La suspensión se filtró y se añadió una solución acuosa de NH3 al 25 % (1,5 ml) al filtrado. A continuación, se evaporaron los volátiles para dar la sal de amonio (5,0 g, 100 %) como un sólido blanco.

Ejemplo 6

A una solución agitada del compuesto de acuerdo con los Ejemplos 2 o 3 (3,83 g) en MeOH seco (100 ml) se añadió MeONa metanólico al 25 % (p/p) (0,5 ml) para dar un pH neutro. Se añadió una cantidad adicional de MeONa (0,5 ml) para dar un pH fuertemente básico. Después de 13 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se neutralizó cuidadosamente mediante la adición de resina Dowex 50W-X8 (en forma de H+) a pH=3. La suspensión se filtró y se añadió una solución acuosa de NH3 al 25 % (1,0 ml) al filtrado. A continuación, se evaporaron los volátiles para dar la sal de amonio (2,50 g, 100 %).

Ejemplo 7

En experimentos paralelos, se incubó una solución de 3'-O-sialil lactosa (300 mM) o N-acetil-a-neuraminósido de pnitrofenilo (150 mM) como donantes y el compuesto de acuerdo con el Ejemplo 4 como aceptor (100 mM) en tampón de incubación tR18-HCl (100 mM) a pH 7,0 con la transialidasa recombinante de Trypanosoma cruzi (Agusti y otros Glycobiology 14, 659 (2004) y Neubacher y otros Org. Biomol. Chem. 3, 1551 (2005)). Las mezclas de reacción se agitaron a 20 °C durante 24 horas y la conversión del aceptor al producto deseado se determinó por HPLC. Se estimó que el rendimiento de conversión era de 70 a 80 % cuando se usaba 3'-O-sialil lactosa o de 40 a 50 % cuando se usaba N-acetil-a-neuraminósido de p-nitrofenilo.

Las mezclas de reacción se cargaron en una columna Dowex 1 (en forma de HCO3"). Después de lavar con agua destilada, los compuestos monoácidos (3'-O-sialil lactosa o ácido siálico y el aceptor restante) se eluyeron con una solución de NaHCO3 60 mM. A continuación, el producto se eluyó con una solución de NaHCO3 125 mM. Las fracciones eluidas que contenían oligosacáridos ácidos se analizaron mediante HPLC y se combinaron. El NaHCO3 se eliminó mediante un tratamiento con Amberlite IR120 (en forma de H⁺) hasta que se alcanzó un pH de 3,0. A continuación, se ajustó el pH a 6,0 con NaOH. Las fracciones monoácidas se liofilizaron y se reutilizaron con otra corrida enzimática. Las fracciones que contenían los productos se liofilizaron.

LC-HRMS: se calculó m/z para [C55H85N3O37 -H]- 1378,4789, y se encontró 1378,4807 ([M-H]-), se calculó para [M-2H]² 688,7358, y se encontró 688,7376 (pico principal).

1H NMR (300 MHz, 100 mg en 0,7 ml de D² O, DHO = 4,81 ppm) 5: 7,37-7,47 (m, 5H, Ph de Bn), 4,923 (d, J = 11,6 Hz, 1H, CH² de Bn), 4,739 (d, J = 11,5 Hz, 1H, CH² de Bn), 4,685 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,534 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,494 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,419 (d, J = 7,7 Hz, 1H ), 4,154 (d, J = 3,1 Hz, 1H, H-4'), 4,074 (dd, J = 3,1 Hz, J = 9,8 Hz, 1H, H-3'''), 3,48-4,02 (solapamiento m, 35 H), 3,921 (solapamiento d, J = 3,2 Hz, H-4'''), 3,335 (t, J = 8,35 Hz, 1H, H-2), 2,731 y 2,748 (dos solapamientos dd, J = 12,5 Hz, J = 4,9 Hz, 2H, dos H-3'''' ec. (² , 6) y (² , 3)), 2.01 (tres solapamientos s, 9H, 3 AcNH), 1.775 (t, J = 12.1 Hz, 1H, H- 3m'a^{x (2} , 3)) y 1,679 (t, J = 12,1 Hz, 1H, H-3'm^ax(2,6)).

¹³C NMR (75 Hz, NaOAc = 182,02 y 23,95 ppm) 5: 175,80, 175,73, 175,65 (3 Ac), 174,70 (C-l"u⁽²-³⁾), 174,23 (C-l"u⁽²-6)), 137,29 (C-1 de Ph), 129,58, 129,53 (C-2 y C-3 de Ph), 129,30 (C-4 de Ph), 104,19, 103,70, 103,37 (C-1"", C-1', C-1''), 101,77 (C-1), 100,96 (C-2m'(² ,⁶⁾), 100,41 (C-2'm(² ,³⁾), 83,07 (C-3''), 82,55 (C-3'), 79,17 (C-4), 76,37 (C-3'''), 75,87 (C-5'''), 75,75 (C-5'), 75,58 (C-5), 75,19 (C-3), 74,50 (C-5''), 73,57 (C-6''''(²-³⁾), 73,28 (C-6''''(²-⁶⁾), 72,62 (C-8''''(²-³⁾), 72,50 (C-8 ''''⁽²-^{6 )}), 72,30 (CH² de Bn), 70,74 (C-2'), 69,89 (C-2'''), 69,15, 69,14, 69,11,69,00, 68,80 (solapamiento C-4', C-4'', C-4''''⁽²-6)y⁽²-3), C-7''''⁽²-6)^y(2-3)), 68,07 (C-4'''), 63,60 (C-6''), 63,36 (C-9''''(² ,³⁾), 63,21 (C-9''''(² ,⁶⁾), 63,86 (solapamiento C-6', C-6'''), 60,83 (C-6), 53,39 (C-2''), 52,63 (C-5''''(² ,⁶⁾), 52,43 (C-5''''(² ,³⁾), 40,86 (C-3''''⁽²,6)), 40,53 (C-3''''(² ,³⁾), 23,12 (Ac de GlcNAc), 22,88 y 22,86 (2 solapamientos Ac de NeuAc(²-6)y(²-3)).

Ejemplo 8: Sal disódica DS-LNT

El compuesto obtenido de acuerdo con el Ejemplo 7 (4,43 g) y Pd al 10 % sobre carbono (0,4 g) se suspendieron en una mezcla de agua desionizada (15 ml) y metanol (15 ml) y se agitó en hidrógeno a 5 bares de presión. Después de 24 horas, se añadió una cantidad adicional de catalizador (100 mg) y la hidrogenólisis continuó a 5 bares durante 3 días. La mezcla de reacción se filtró mediante un tapón corto de Celite (5 g), que se lavó adicionalmente con metanol acuoso 1:1 y se concentró a presión reducida hasta un volumen pequeño. El residuo se trató con Amberlite IRC-86 (en forma de H⁺). La solución obtenida se pasó a través de la columna Amberlite IRC-86 (en forma de Na⁺). Después de que se eluyó todo el producto con agua, se liofilizó para dar la sal disódica del título como una espuma blanca (3,855 g, 93 %). LC-MS: Pureza UV 97,2 % (205 nm); el tiempo de retención y MS/MS fueron idénticos a los de una muestra de referencia comprada en Carbosynth. h Rm S, se calculó m/z para [C48H79N3O37 - 2H]² ' 643,7123, se encontró 643,7150 ([M-2H]²").¹H NMR (300 MHz, D2O) fue idéntico dentro de 0,01 ppm con lo reportado en la literatura para DS-LNT (Sabesan y otros J. Am. Chem. Soc. 108, 2068 (1986)).

Ejemplo 9: Sal de sodio LST b

El compuesto de acuerdo con el ejemplo 5 o 6 (200 mg) se hidrogenolizó a 5 bares en presencia de Pd al 10 % sobre carbón vegetal (40 mg) en una mezcla de metanol-agua 1:1 (20 ml) hasta su completa conversión monitoreada por TLC. La mezcla de reacción obtenida se filtró, se pasó a través de resina Dowex 50WX4 (en forma de Na+, 10 g), las fracciones que contenían el producto se concentraron y se liofilizaron para dar 178 mg de espuma blanca. HRMS: se calculó m/z para [C37H61N2O29-H]- 997,3360, y se encontró 997,3269 ([M-H]-). El espectro de 1H NMR fue idéntico al de la literatura para LST b (Sabesan y otros J. Am. Chem. Soc. 108, 2068 (1986)).

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   Un método para preparar un derivado de 3-O-galactosil-GlcNAc o -GalNAc de la fórmula 1 y sus sales.

   

   en donde R es -OH,

   R1 es el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico,

   R2 se selecciona de H y del grupo L-fucopiranosilo,

   R3 se selecciona de H y del residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico,

   R4 se selecciona de H y del grupo L-fucopiranosilo, siempre y cuando al menos uno de R3 y R4 sea H, y A es un grupo lactosilo divalente que está unido al grupo R por su carbono anomérico C-1, y que está unido vía su grupo 3'-OH al núcleo 3-O-galactosil-GlcNAc o -GalNAc de la fórmula 1, y que puede ser opcionalmente sustituido por un grupo L-fucopiranosilo en su grupo 3-OH o por un grupo N-acetil-lactosaminilo en su 6'-OH, cuyo N-acetil-lactosaminilo puede ser opcionalmente sustituido adicionalmente por el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico en su 6-OH, o por el grupo L-fucopiranosilo en su 3-OH o 2'-OH,

   que comprende las etapas:

   a) sialilación de un compuesto de la fórmula 2

   

   en donde R' es -OR'6 y en donde R'6 es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis,

   R7 es independientemente acilo,

   Y se selecciona de -NHAc, haloalcanoilamido y -NAC2, y

   B es un grupo lactosilo divalente que está unido al grupo R' por su carbono anomérico C-1, y que está unido vía su grupo 3'-OH al núcleo 3-O-galactosil-GlcNAc o GalNAc de la fórmula 2, y que puede ser opcionalmente sustituido por un grupo L-fucopiranosilo en su grupo 3-OH o por un grupo N-acetil-lactosaminilo en su 6'-OH, cuyo N-acetil-lactosaminilo puede ser opcionalmente sustituido adicionalmente por el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico en su 6-OH, o por L-fucopiranosilo en su 3-OH o 2'-OH, en donde los grupos OH libres son acilados, el grupo OH axial de cualquier galactosa está opcionalmente protegido y el grupo carboxi del residuo glicosilo opcional del ácido N-acetil-neuramínico está bloqueado en forma de éster,

   b) fucosilación opcional del compuesto obtenido en la etapa a),

   c) des-O-acilación y/o hidrólisis básica, hidrólisis ácida suave opcional y transformación opcional de Y en -NHAc del compuesto obtenido en la etapa a) o la etapa b),

   d) sialilación o fucosilación opcional del compuesto obtenido en la etapa c), y

   e) hidrogenólisis catalítica del compuesto obtenido en la etapa d) en donde el grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis se selecciona del grupo que consiste en: grupos bencilo, difenilmetilo, 1-naftilmetilo, 2-naftilmetilo y trifenilmetilo, cada uno de los cuales puede ser opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes grupos: alquilo, alcoxi, fenilo, amino, acilamino, alquilamino, dialquilamino, nitro, carboxilo, alcoxicarbonilo, carbamoilo, N-alquilcarbamoilo, N,N-dialquilcarbamoilo, azido, halogenoalquilo o halógeno.

   El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la sialilación de un compuesto de la fórmula 2 en la etapa a) da como resultado la formación de un compuesto de la fórmula 4

   

   en donde R', R7, B y Y son como se definen en la reivindicación 1, y

   P es un residuo glicosilo protegido del ácido N-acetil-neuramínico.

   El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la sialilación en la etapa a) se lleva a cabo mediante la reacción de un compuesto de la fórmula 2 con un compuesto de la fórmula 3

   

   en donde R8 es acilo, preferentemente acetilo,

   Q se selecciona de alquilo y bencilo, preferentemente metilo, etilo y bencilo, y

   R9 es fenilo o bencilo opcionalmente sustituido,

   para dar un compuesto de la fórmula 4A

   

   en donde R', R7 B y Y son como se definen en la reivindicación 1 y R8 y Q son como se definieron anteriormente.

   El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el compuesto de la fórmula 4A está representado por la fórmula 4E

   

   en donde R'' es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis como se define en la reivindicación 1, Y se selecciona de -NHAc, haloalcanoilamido y -NAc2, preferentemente -NHAc y tricloroacetamido,

   R7 es independientemente acilo, preferentemente los grupos R7 son idénticos y se seleccionan de acetilo, benzoilo y 4-clorobenzoilo,

   R8 es independientemente acilo, preferentemente los grupos R8 son acetilo,

   R20 es independientemente acilo, preferentemente los grupos R20 son idénticos y se seleccionan de acetilo, benzoilo y 4-clorobenzoilo,

   R21 se selecciona de H y acilo, preferentemente R21 se selecciona de H, acetilo, benzoilo o 4-clorobenzoilo, y Q se selecciona de alquilo y bencilo, preferentemente metilo, etilo y bencilo.

   El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la fucosilación opcional en la etapa b) comprende la reacción de un compuesto de la fórmula 4

   

   en donde R', R7, B y Y son como se definen en la reivindicación 1, y

   P es un residuo glicosilo protegido del ácido N-acetil-neuramínico,

   con un compuesto de la fórmula 5

   

   en donde X se selecciona de un halógeno, -OC(=NH)CCl3, -O-pentenilo, -OAc, -OBz y -SR13, en el que R13 es alquilo o fenilo opcionalmente sustituido,

   R11 se selecciona de acilo y un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis como se define en la reivindicación 1, y

   R12 se selecciona de un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis como se define en la reivindicación 1, acilo o

   ^{dos grupos R12 juntos forman un resto}

   

   Rtí

   en donde R14 y R15 son independientemente alquilo o fenilo, o en donde R14 y R15 junto con el átomo de carbono, al que están unidos, forman un cicloalquilideno,

   para dar un compuesto de la fórmula 6

   

   en donde R', R7, R11, R12, B, P y Y se definieron anteriormente.

   El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el compuesto de la fórmula 4 es un compuesto de la fórmula 4E definido en la reivindicación 4, el compuesto de la fórmula 5 es un compuesto de la fórmula 5A

   

   en donde Xa se selecciona de alquiltio y feniltio opcionalmente sustituido, preferentemente -SPh,

   R22 y R23 se seleccionan, independientemente, de un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis como se define en la reivindicación 1 y acilo, preferentemente acetilo, pivaloilo, benzoilo y 4-clorobenzoilo, y el compuesto de la fórmula 6 es un compuesto de la fórmula 6E

   

   en donde R'' es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis como se define en la reivindicación 1, Y se selecciona de -NHAc, haloalcanoilamido y -NAc2, preferentemente -NHAc y tricloroacetamido,

   R7 es independientemente acilo, preferentemente los grupos R7 son idénticos y se seleccionan de acetilo, benzoilo y 4-clorobenzoilo,

   R8 es independientemente acilo, preferentemente los grupos R8 son acetilo,

   R20 es independientemente acilo, preferentemente los grupos R20 son idénticos y se seleccionan de acetilo, benzoilo y 4-clorobenzoilo,

   R21 se selecciona de H y acilo, preferentemente R21 se selecciona de H, acetilo, benzoilo o 4-clorobenzoilo, y Q se selecciona de alquilo y bencilo, preferentemente metilo, etilo y bencilo, y R24 es el resto I

   

   en donde R22 y R23 son como se definieron anteriormente.

   El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde un compuesto obtenido en la etapa a) o la etapa b) se convierte en un compuesto de la fórmula 7

   

   en donde R' y R1 son como se definen en la reivindicación 1,

   A es un grupo lactosilo divalente que está unido al grupo R' por su carbono anomérico C-1, y que está unido mediante su grupo 3'-OH al núcleo 3-O-galactosil-GlcNAc o GalNAc de la fórmula 7, y que puede ser opcionalmente sustituido por un grupo L-fucopiranosilo en su grupo 3-OH o por un grupo W-acetil-lactosaminilo en su 6'-OH, cuyo N-acetil-lactosaminilo puede ser opcionalmente sustituido adicionalmente por el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico en su 6-OH, o por el grupo L-fucopiranosilo en su 3-OH o 2'-OH, y R16 se selecciona de H y un resto de la fórmula C

   

   en donde R17 y R18 se seleccionan, independientemente, de H y un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis como se define en la reivindicación 1,

   que comprende las etapas de:

   i) transesterificación catalizada por bases y/o

   ii) hidrólisis básica,

   iii) hidrólisis ácida suave opcional, y

   iv) conversión opcional de Y a -NHAc.

   8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde un compuesto de la fórmula 4E definido en la reivindicación 4 y obtenido en la etapa a) o un compuesto de la fórmula 6E definido en la reivindicación 6 y obtenido en la etapa b) se somete a desprotección y transformación opcional del grupo funcional que comprende:

   i) desprotección por transesterificación catalizada por bases, preferentemente tratamiento con NaOMe/MeOH,

   ii) hidrólisis básica, preferentemente tratamiento con NaOH/MeOH, y

   iii) donde el grupo Y en un compuesto de la fórmula 4E o 6E es haloalcanoilamido, preferentemente tricloroacetamido, y se desprotege a amino en las condiciones usadas en la etapa ii), N-acetilación selectiva o peracetilación seguida de des-O-acetilación, para producir un compuesto de la fórmula 7B

   

   en donde R'' es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis como se define en la reivindicación 1, y R16 se selecciona de H y el resto C definido en la reivindicación 7, preferentemente H.

   9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la etapa d) un compuesto de la fórmula 7 definido en la reivindicación 7 y obtenido en la etapa c) se hace reaccionar opcionalmente con un donante de N-acetilneuraminilo, en la catálisis de una enzima que tiene actividad a2-3-transialidasa o con un donante de L-fucosilo en la catálisis de una enzima que tiene actividad transfucosidasa/fucosintasa para dar un compuesto de la fórmula 10

   

   en donde R', R1 y R16 son como se definen en la reivindicación 7,

   R3 se selecciona de H y del residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico, y

   R4 se selecciona de H y del grupo L-fucopiranosilo, siempre y cuando al menos uno de R3 y R4 sea H.

   10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el compuesto de la fórmula 7 es un compuesto de la fórmula 7B definido en la reivindicación 8, el donante de N-acetil-neuraminilo se selecciona de 3'-O-sialil lactosa o N-acetil-a-neuraminósido de 2-O-(p-nitrofenilo), y el compuesto de la fórmula 10 es un compuesto de la fórmula 10D

   

   en donde R'' y R16 son como se definen en la reivindicación 8.

   11. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el compuesto de la fórmula 7 es un compuesto de la fórmula 7B definido en la reivindicación 8, el donante de fucosilo se selecciona de 2'-O-fucosil lactosa o fluoruro de fucosilo, y el compuesto de la fórmula 10 es un compuesto de la fórmula 10E

   

   en donde R'' y R16 son como se definen en la reivindicación 8.

   12. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde un compuesto de la fórmula 10 definido en la reivindicación 9 se somete a hidrogenólisis catalítica en la etapa e) para dar un compuesto de la fórmula 1 definido en la reivindicación 1.

   13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde un compuesto de la fórmula 10 es un compuesto de la fórmula 10D definido en la reivindicación 10 o 10E definido en la reivindicación 11, y la hidrogenólisis catalítica da DS-LNT, FDS-LNT o F-LST b;

   o en donde el compuesto de la fórmula 10 es un compuesto de la fórmula 7B

   

   en donde R'' y R16 son como se definen en la reivindicación 8,

   y la hidrogenólisis catalítica da un compuesto de la fórmula 1D

   

   en donde R16 es como se definió anteriormente, preferentemente H.

   14. Un compuesto de la fórmula 12

   

   en donde R es -OR6 en donde R6 es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis como se define en la reivindicación 1,

   R7 es independientemente acilo,

   Y se selecciona de -NHAc, haloalcanoilamido y -NAC2, y

   B' es un grupo lactosilo divalente que está unido al grupo R' por su carbono anomérico C-1, y que está unido vía su grupo 3'-OH al núcleo 3-O-galactosil-GlcNAc o GalNAc del compuesto de la fórmula 12, y que puede ser opcionalmente sustituido por un grupo L-fucopiranosilo en su grupo 3-OH o por un grupo N-acetil-lactosaminilo en su 6'-OH, cuyo N-acetil-lactosaminilo puede ser opcionalmente sustituido adicionalmente por el residuo glicosilo del ácido N-acetil-neuramínico en su 6-OH, o por L-fucopiranosilo en su 3-OH o 2'-OH, en donde los grupos OH libres son acilados y el grupo carboxi del residuo glicosilo opcional del ácido N-acetil-neuramínico está bloqueado en forma de éster,

   P es un residuo glicosilo protegido del ácido N-acetil-neuramínico, y

   R25 se selecciona del resto I y H, preferentemente H,

   

   R22 y R23 se seleccionan, independientemente, de un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis como se define en la reivindicación 1 y acilo, cuyo acilo es preferentemente acetilo, pivaloilo, benzoilo y 4-clorobenzoilo.

   15. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 14 caracterizado por la fórmula 4E

   

   en donde R'' es un grupo que puede eliminarse por hidrogenólisis como se define en la reivindicación 1, Y se selecciona de -NHAc, haloalcanoilamido y -NAc2, preferentemente -NHAc y tricloroacetamido, R7 es independientemente acilo, preferentemente los grupos R7 son idénticos y se seleccionan de acetilo, benzoilo y 4-clorobenzoilo,

   R8 es independientemente acilo, preferentemente los grupos R8 son acetilo,

   R20 es independientemente acilo, preferentemente los grupos R20 son idénticos y se seleccionan de acetilo, benzoilo y 4-clorobenzoilo,

   R21 se selecciona de H y acilo, preferentemente R21 se selecciona de H, acetilo, benzoilo o 4-clorobenzoilo, y Q se selecciona de alquilo y bencilo, preferentemente metilo, etilo y bencilo.