ES2837058T3 - Agente anticanceroso que comprende HVJ-E y CXCL2 - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica para uso en la profilaxis o el tratamiento de un cáncer que comprende los (1) y (2) siguientes: (1) HVJ-E (envuelta del virus hemaglutinante de Japón), (2) CXCL2 o un ácido nucleico que comprende una secuencia de bases que codifica CXCL2.

Description

DESCRIPCIÓN

Agente anticanceroso que comprende HVJ-E y CXCL2

Campo técnico

La presente invención se refiere a un agente anticanceroso que contiene HVJ-E (envuelta del virus hemaglutinante de Japón) y CXCL2 (o un ácido nucleico que contiene una secuencia de bases que codifica CXCL2).

Técnica anterior

La inmunidad innata es un sistema de defensa esencial de los vertebrados contra una invasión de factores patógenos y, por ejemplo, los receptores de tipo Toll (TLRs), los receptores (RLRs) similares al gen I inducibles con ácido retinoico (RIG-I), los receptores de tipo Nod, los receptores de ADN citosólico, los receptores de lectina de tipo C de la superficie celular y similares, tienen un papel importante. Entre los receptores mencionados anteriormente, también se sabe que los TLRs tienen un papel responsable de la inmunidad antitumoral, y se están realizando análisis clínicos para tratar pacientes con cáncer utilizando BCG como agonista de TLR2/4, poli I:C como agonista de TLR3, monofosforil lípido A (MLA) como agonista de TLR4, Imiquimod (imidazoquinolina sintética) como agonista de TLR7, SD-101 (fosforotioato CpG ODN) como agonista de TLR9 y similares.

Por otro lado, la participación de los RLRs, entre los receptores mencionados anteriormente, en la inmunidad antitumoral apenas ha sido descrita; sin embargo, se ha notificado que un ADN sintético podría inducir una apoptosis independiente del interferón en el melanoma humano, a través de la activación de RIG-I y MDA5 (documento no de patente 1). Los inventores también han notificado que el HVJ completamente inactivado (virus hemaglutinante de Japón) tiene una pluralidad de actividades antitumorales que incluyen la inmunidad antitumoral y la inducción de la apoptosis específica de células cancerígenas (documento no de patente 2), han encontrado que fragmentos de ARN obtenidos a partir del virus en la HVJ-E se transducen a través de una fusión de membranas en el citoplasma y son reconocidos por RIG-I, y un complejo de ARN/RIG-I obtenido a partir del virus, activa factores de transcripción tales como NF-kB, IRF-3, iRF-7 a través de una proteína señalizadora antivírica de la mitocondria (MAVS), activa moléculas proapoptóticas tales como TRAIL y NOXA en células cancerígenas humanas, pero no activa las de células no cancerígenas (documentos no de patente 2, 3). Los inventores también han descubierto que HVJ-E aumenta de forma transitoria el calcio en el citoplasma mediante una fusión de membranas e induce una necroptosis de las células de neuroblastoma que carecen de caspasa8 (documento no de patente 4). Además, los inventores han notificado que la función de los linfocitos T reguladores se suprime independientemente de la fusión de membranas, estimulando la producción de IL-6 a partir de células dendríticas mediante una interacción de receptores de la superficie celular no identificados sobre las células dendríticas con la proteína F de HVJ-E, contribuyendo de este modo a la activación de la inmunidad antitumoral (documentos no de patente 5, 6).

Como se ha mencionado anteriormente, los presentes inventores han demostrado que HVJ-E puede suprimir la proliferación de células cancerígenas activando diversas transducciones de señales. Sin embargo, aún se desconoce cómo cambia el efecto supresor de la proliferación de HVJ-E sobre las células cancerígenas cuando se activa simultáneamente la transducción de señales a través de TLRs.

Lista de documentos

Documentos no de patente

Documento no de patente 1: Besch R, Poeck H, Hohenauer T, Senft D, Hacker G, Berking C, Hornung V, Endres S, Ruzicka T, Rothenfusser S, Hartmann G. 2009. Proapoptotic signaling induced by RIG-I and MDA-5 results in type I interferon-independent apoptosis in human melanoma cells. J. Clin. Invest. 119: 2399-2411.

Documento no de patente 2: Kawaguchi Y, Mitamoto Y, Inoue T, Kaneda Y. Efficient eradication of hormoneresistant human prostate cancers by inactivated Sendai virus particle. Int. J. Cancer 2009. 124: 2478-87.

Documento no de patente 3: Matsushima-Miyagi T., Hatano K., Nomura M., Li-Wen L., Nishikawa T., Saga K., Shimbo T, Kaneda Y. TRAIL and Noxa are selectively up-regulated in prostate cancer cells downstream of the RIG-I/MAVS signaling pathway by non-replicating Sendai virus particles. Clinical Cancer Research, 18, 6271-83, 2012.

Documento no de patente 4: Nomura M, Ueno A, Saga K, Fukuzawa M, Kaneda Y. Accumulation of cytosolic calcium induces necroptotic cell death in human neuroblastoma. Cancer Res. 74, 1056-1066, 2014.

Documento no de patente 5: Suzuki H, Kurooka M, Hiroaki Y, Fujiyoshi Y, Kaneda Y. Sendai virus F glycoprotein induces IL-6 production in dendritic cells in a fusion-independent manner. FEBS Letter, 2008. 582: 1325-29.

Documento no de patente 6: Kurooka M Kaneda Y. Inactivated Sendai virus particles eradicate tumors by inducing immune responses through blocking regulatory T cells. Cancer Research, 67, 227-236, 2007.

Compendio de la invención

Problemas que debe resolver la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo agente anticanceroso que tenga un elevado efecto supresor de la proliferación en las células cancerígenas, en donde el agente se obtiene al confirmar si un efecto antitumoral de HVJ-E actúa de manera cooperativa con la activación de la transducción de señales a través de TLRs y suprime más fuertemente la proliferación de células cancerígenas y, en base a esos resultados, combinar una molécula que actúa sinérgicamente con HVJ-E.

Medios para resolver los problemas

En un intento de resolver los problemas mencionados anteriormente, los presentes inventores administraron de forma combinada HVJ-E y un agonista de TLR3, poli I:C, a ratones portadores de tumores. Como resultado, se confirmó que HVJ-E actúa de forma cooperativa con la activación de la transducción de señales a través de los TLRs y suprime la proliferación de células cancerígenas. Además, se encontró que el efecto supresor de la proliferación del cáncer supera la predicción de los expertos en la técnica, en comparación con una administración individual de HVJ-E o una administración individual de poli I:C, respectivamente. Además, se encontró que poli I:C induce la expresión de CXCL2 en un tumor y la infiltración de neutrófilos en un tumor. Además, los neutrófilos se convertían en neutrófilos de tipo N1 a través de IFN-p cuya expresión es inducida en las células dendríticas y similares a través de HVJ-E, o los neutrófilos se convertían en neutrófilos de tipo N1 a través de la propia HVJ-E. Se sabe que los neutrófilos de tipo N1 están implicados en la supresión de la proliferación del cáncer. Además, se encontró que el efecto supresor de la proliferación del cáncer supera la predicción de los expertos en la técnica, cuando HVJ-E y la proteína CXCL2 o el vector de expresión CXCL2 se administran combinados a ratones portadores de tumores, en comparación con una administración individual de HVJ-E o una administración individual de CXCL2, respectivamente. La presente invención se ha completado basándose en los hallazgos anteriores. Es decir, la presente invención proporciona

[1] una composición farmacéutica para uso en la profilaxis o el tratamiento del cáncer que comprende los (1) y (2) siguientes:

(1) HVJ-E (envuelta del virus hemaglutinante de Japón),

(2) CXCL2 o un ácido nucleico que comprende una secuencia de bases que codifica CXCL2;

[2] la composición farmacéutica para uso de [1], en la que el ácido nucleico que comprende la secuencia de bases que codifica CXCL2 es un vector de expresión que comprende una secuencia de bases que codifica CXCL2;

[3] la composición farmacéutica para uso de [1] o [2], en la que el ácido nucleico que comprende una secuencia de bases que codifica CXCL2 está encapsulado en HVJ-E;

[4] la composición farmacéutica para uso de uno cualquiera de [1] a [3], en donde el cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste en melanoma, cáncer de pulmón, mesotelioma, cáncer de lengua, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de intestino grueso, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de útero, cáncer de ovario, tumor cerebral, cáncer de tiroides, angiosarcoma, osteosarcoma, condrosarcoma, rabdomiosarcoma y leiomiosarcoma.

Efecto de la invención

La presente invención proporciona un nuevo agente anticanceroso que contiene una combinación de HVJ-E y CXCL2 o un ácido nucleico que comprende una secuencia de bases que codifica CXCL2, como ingrediente activo.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra los resultados de un ensayo MTS cuando se usaba PBS, poli I:C, HVJ-E o HVJ-E poli I:C (H+P). La Fig. 2 muestra

volumen de un tumor cuando se administraba PBS, poli I:C, HVJ-E o HVJ-E poli I:C (H+P). La Fig. 3 muestra

volumen de un tumor cuando se administraba PBS, poli I:C, HVJ-E o HVJ-E poli I:C. La Fig.4, en el panel superior, muestra una comparación de los niveles proteicos de CXCL1 y CXCL2 en un tumor cuando se administraba PBS, poli I:C, HVJ-E o HVJ-E poli I:C (H+P). El panel inferior muestra una comparación de los niveles de ARNm de CXCL1 y CXCL2 en un tumor cuando se administraba PBS, poli I:C, HVJ-E o HVJ-E poli I:C (H+P).

La Fig. 5 muestra el volumen y el peso de un tumor cuando se administraba PBS o HVJ-E poli I:C (H+P) después de la administración de un anticuerpo neutralizante de CXCL1. ISO muestra un anticuerpo que no tiene especificidad hacia CXCL1 (control del isotipo).

La Fig. 6 muestra el volumen y el peso de un tumor cuando se administraba PBS o HVJ-E poli I:C (H+P) después de la administración de un anticuerpo neutralizante de CXCL2. ISO muestra un anticuerpo que no tiene especificidad hacia CXCL2 (control del isotipo).

La Fig. 7 muestra una comparación del nivel de ARNm del gen relacionado con neutrófilos en un tumor cuando se administraba PBS, poli I:C, HVJ-E o HVJ-E poli I:C (H+P).

La Fig. 8, arriba a la izquierda, muestra una comparación de la proporción de neutrófilos en una población de células CD45+ en un tumor cuando se administraba PBS, poli I:C, HVJ-E o HVJ-E poli I:C (H+P). La parte inferior izquierda muestra una comparación de la proporción de neutrófilos de tipo N1 entre todos los neutrófilos en un tumor, cuando se administraba PBS, poli I:C, HVJ-E o HVJ-E poli I:C (H+P). A la derecha se muestra una comparación del número de células secretoras de IFN-y en el bazo cuando se administraba PBS, poli I:C, HVJ-E o HVJ-E poli I:C (H+P).

La Fig. 9 muestra el volumen y el peso de un tumor cuando se administraba HVJ-E poli I:C (H+P) después de una administración intratumoral o intraperitoneal de un anticuerpo anti-neutrófilo (anticuerpo anti-Ly-6G o anti-neutrófilo). ISO muestra un anticuerpo que no tiene especificidad hacia los neutrófilos (control del isotipo).

La Fig. 10, panel superior, muestra los resultados de un ensayo MTS cuando se utilizaba CXCL2. El panel inferior muestra el volumen y el peso de un tumor cuando se administraba PBS, CXCL2, HVJ-E o HVJ-E CXCL2 (H+C)

La Fig. 11, izquierda, muestra una comparación del número de células secretoras de IFN-y en el bazo cuando se administraba PBS, CXCL2, HVJ-E o HVJ-E CXCL2 (H+C). A la derecha se muestra una comparación del número de células secretoras de IFN-y en el bazo cuando se administraba HVJ-E (arriba a la derecha) o HVJ-E CXCL2 (H+C) (abajo a la derecha), después de la administración de un anticuerpo anti-neutrófilo (agotamiento de los neutrófilos). ISO muestra un anticuerpo que no tiene especificidad hacia los neutrófilos (control del isotipo).

La Fig. 12 muestra el volumen y el peso del tumor cuando se administraba HVJ-E, HVJ-E pCY4B (vector H+) o HVJ-E pCY4B-CXCL2 (vector H+CXCL2).

La Fig. 13 muestra los resultados del análisis de los niveles de expresión de ICAM-1 y Fas mediante un método de citometría de flujo cuando se incubaban neutrófilos en el material sobrenadante de un cultivo de células dendríticas (DC) cultivadas con PBS o HVJ-E.

La Fig. 14 muestra los resultados de un análisis de los niveles de expresión de ICAM-1 y Fas mediante un método de citometría de flujo cuando los neutrófilos se cultivaban junto con PBS o HVJ-E.

Descripción de las realizaciones

La presente invención se explica en detalle a continuación.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica para uso en la profilaxis o el tratamiento del cáncer que comprende los (1) y (2) siguientes:

(1) HVJ-E (envuelta del virus hemaglutinante de Japón),

(2) CXCL2 o un ácido nucleico que comprende una secuencia de bases que codifica CXCL2.

En la presente invención, la envuelta del virus Sendai (envuelta del virus hemaglutinante de Japón, en lo sucesivo la HVJ-E de la presente invención) se refiere a una envuelta vírica obtenida a partir del virus Sendai (virus hemaglutinante de Japón, en lo sucesivo el HVJ). HVJ se refiere a un virus que pertenece a los Paramyxoviridae, género paramyxovirus y que tiene actividad de fusión celular. Las partículas de HVJ tienen, en su superficie, una envuelta que tiene hemaglutinina y neuraminidasa, y muestran polimorfismo en un diámetro de 150 - 300 nm. HVJ tiene como genoma ARN de cadena negativa de aproximadamente 15.500 bases de longitud, tiene ARN polimerasa, es inestable al calor, coagula casi todos los tipos de eritrocitos y muestra hemólisis. Los ejemplos de HVJ usados para la preparación de la HVJ-E de la presente invención, incluyen VR-105, VR-907 y similares, y se pueden adquirir en la “American Type Culture Collection” (ATCC). El HVJ puede ser un virus de tipo silvestre o un virus recombinante.

La HVJ-E de la presente invención se puede preparar inactivando el ARN de HVJ. Los ejemplos del método para inactivar el HVJ para la preparación de la HVJ-E de la presente invención incluyen un tratamiento con UV y un tratamiento de alquilación. Mediante el tratamiento de inactivación, el ARN genómico se modifica o se fragmenta dentro de la envuelta vírica y pierde su actividad, por lo que pierde su capacidad de replicación como virus. Un método para preparar la HVJ-E de la presente invención se describe específicamente en los documentos JP-A-2001-286282 (WO 01/57204), JP-A-2002-065278, WO 03/014338 y similares, y particularmente, la HVJ-E se puede preparar de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 8 y similares del documento JP-A-2001-286282. La HVJ-E de la presente invención obtenida de ese modo que no tiene capacidad de replicación, se puede utilizar como un vector de transferencia de genes, encapsulando genes, polinucleótidos, oligonucleótidos, plásmidos y similares. La HVJ-E de la presente invención también puede ser una partícula fusionada obtenida fusionando un liposoma que encapsula un gen y una proteína, y HVJ después de una inactivación previa del ARN mediante radiación UV (virus Sendai-liposoma).

En la presente invención, CXCL2 es una proteína que comprende la misma secuencia de aminoácidos o sustancialmente la misma que la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 2.

CXCL2 puede ser, por ejemplo, una proteína aislada y purificada a partir de una célula humana. También puede ser una proteína sintetizada químicamente o una proteína sintetizada bioquímicamente en un sistema de traducción exento de células. Alternativamente, la proteína puede ser una proteína recombinante producida a partir de un transformante que incorpora un ácido nucleico que comprende una secuencia de bases que codifica la secuencia de aminoácidos descrita anteriormente.

Básicamente, la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de aproximadamente un 60% o más, preferiblemente aproximadamente un 70% o más, más preferiblemente aproximadamente un 80% o más, de forma particularmente preferible aproximadamente un 90% o más, lo más preferiblemente aproximadamente un 95% o más, con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, y similares. En esta memoria, "una homología" significa una proporción (%) de residuos de aminoácidos idénticos y residuos de aminoácidos similares para todos los residuos de aminoácidos solapantes en la alineación óptima (preferiblemente, el algoritmo considera la introducción de huecos en uno o ambos lados de la secuencia para obtener la mejor alineación), en donde dos secuencias de aminoácidos se alinean utilizando un algoritmo matemático conocido en el campo técnico.

La homología de secuencia de aminoácidos en la presente descripción se puede calcular utilizando el algoritmo de cálculo de homología NCBI BLAST (por sus siglas en inglés, “National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool”) con las siguientes condiciones (expectativa = 10; huecos permitidos; matriz = BLOSUM62; filtrado = INACTIVADO). Como ejemplos de otros algoritmos para determinar la homología de secuencia de los aminoácidos, se puede mencionar el algoritmo descrito en Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993) [el algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997))], el algoritmo descrito en Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970) [el algoritmo está incorporado en el programa GAP en el paquete de programas informáticos GCG], el algoritmo descrito en Myers y Miller, CABIOS, 4:11-17 (1988) [el algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que forma parte del paquete de programas informáticos de alineación de secuencias CGC], el algoritmo descrito en Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448 (1988) [el algoritmo está incorporado en el programa FASTA en el paquete de programas informáticos GCG] y similares, que se pueden utilizar preferentemente de igual modo.

De forma más preferible, sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 2 es una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de aproximadamente un 60% o más, preferiblemente aproximadamente un 70% o más, más preferiblemente aproximadamente un 80% o más, de forma particularmente preferible aproximadamente un 90% o más, y lo más preferible aproximadamente un 95% o más, con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2.

Se prefiere una proteína que comprende sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, por ejemplo, una proteína que comprende sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente mostrada en SEQ ID NO: 2, y que tiene una actividad sustancialmente con la misma calidad que la de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 y similares. En esta memoria, la "actividad" se refiere, por ejemplo, a la actividad para atraer neutrófilos y similares. Tener "sustancialmente la misma calidad" significa que su actividad es cualitativamente (por ejemplo, fisiológica o farmacológicamente) la misma. Por lo tanto, es preferible que las actividades mencionadas anteriormente sean equivalentes entre sí, pero que los factores cuantitativos de esas actividades, tales como el grado de actividad (por ejemplo, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 veces, preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2 veces) y el peso de la proteína, puedan ser diferentes.

Las actividades mencionadas anteriormente se pueden medir mediante un método conocido de por sí, tal como FACS y similares.

CXCL2 de la presente invención es preferiblemente una proteína CXCL2 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 2.

En la presente memoria descriptiva, la proteína se describe de acuerdo con la práctica común para designar péptidos, en la que el extremo izquierdo indica el extremo N-terminal (amino terminal) y el extremo derecho indica el extremo C-terminal (carboxilo terminal). En CXCL2 de la presente invención que incluye una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, el extremo C-terminal puede ser cualquiera entre un grupo carboxilo (-COOH), carboxilato (-COO-), amida (-CONH²) y éster (-COOR).

En esta memoria, como R en el éster, se puede emplear un grupo alquilo C^1-6, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo y n-butilo, un grupo cicloalquilo C^3-8, por ejemplo, ciclopentilo y ciclohexilo, un grupo arilo C^6-12, por ejemplo, fenilo y a-naftilo, un grupo fenil-alquilo C^1-2, por ejemplo, bencilo y fenetilo, un grupo aralquilo C^7-14, por ejemplo, un grupo a-naftil-alquilo C^1-2, tal como a-naftilmetilo, un grupo pivaloiloximetilo; y similares.

Cuando la CXCL2 de la presente invención tiene un grupo carboxilo (o carboxilato) en una posición distinta al extremo C-terminal, una proteína en la que el grupo carboxilo está amidado o esterificado, también se incluye en la proteína de la presente invención. En este caso, como éster se utiliza, por ejemplo, el éster descrito anteriormente en el extremo C-terminal y similares.

Además, la CXCL2 de la presente invención también incluye una proteína en la que el grupo amino del residuo de aminoácidos del extremo N-terminal está protegido por un grupo protector (por ejemplo, grupos acilo C^1-6 tales como alcanoílos C¹-⁶, tales como un grupo formilo y un grupo acetilo, y similares); una proteína en la que el residuo de glutamina que se puede producir después de una escisión en el extremo N-terminal in vivo, se ha convertido en ácido piroglutámico, una proteína en la que un sustituyente (p. ej., -OH, -SH, un grupo amino, un grupo imidazol, un grupo indol, un grupo guanidino y similares) en una cadena lateral de un aminoácido en la molécula, está protegido por un grupo protector apropiado (por ejemplo, grupos acilo C^1-6 tales como grupos alcanoílo C¹-⁶, tales como un grupo formilo y un grupo acetilo y similares), un péptido conjugado tal como el que se denomina un glicopéptido que tiene una cadena de azúcar unida al mismo, y similares.

La CXCL2 que se va a emplear en la presente invención puede estar en forma de una sal. Por ejemplo, se usan sales de ácido fisiológicamente aceptables (por ejemplo, ácido inorgánico, ácido orgánico), de base (por ejemplo, sal de metal alcalino) y similares, y son preferibles las sales de adición de ácido fisiológicamente aceptables. Las sales útiles incluyen, por ejemplo, sales con ácidos inorgánicos (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico) o sales con ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido málico, ácido oxálico, ácido benzoico, ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico) y similares.

La CXCL2 se puede producir a partir de una célula de los mamíferos mencionados anteriormente, mediante un método de purificación de proteínas conocido de por sí. Para ser más específicos, CXCL2 o una sal de la misma se puede preparar homogeneizando células de mamífero, eliminando los restos celulares mediante centrifugación a baja velocidad, centrifugando el material sobrenadante a alta velocidad para precipitar una fracción que comprende la membrana celular y sometiendo el material sobrenadante a una cromatografía, tal como cromatografía de fase inversa, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por afinidad y similares.

La CXCL2 también se puede producir de acuerdo con un método de síntesis de péptidos conocido públicamente.

El método de síntesis de péptidos puede ser cualquiera entre, por ejemplo, un procedimiento de síntesis en fase sólida y un procedimiento de síntesis en fase líquida. Se puede producir una proteína deseada condensando un péptido parcial o un aminoácido capaz de constituir CXCL2, con la porción restante, y eliminando cualquier grupo protector que pueda tener el producto resultante.

En esta memoria, la condensación y la eliminación de un grupo protector se llevan a cabo de acuerdo con métodos conocidos de por sí, por ejemplo, los métodos indicados en (1) y (2) a continuación:

(1) M. Bodanszky y M.A. Ondetti: Peptide Synthesis, Interscience Publishers, Nueva York (1966)

(2) Schroeder y Luebke: The Peptide, Academic Press, Nueva York (1965).

La CXCL2 obtenida de ese modo se puede purificar o aislar mediante un método conocido de purificación. En esta memoria, a modo de ejemplos del método de purificación, se puede mencionar la extracción con disolvente, la destilación, la cromatografía en columna, la cromatografía líquida, la recristalización, combinaciones de los mismos y similares.

Cuando la CXCL2 obtenida de ese modo está en forma libre, la forma libre se puede convertir en una forma de sal adecuada mediante un método conocido o uno análogo, y por otro lado, cuando la CXCL2 se obtiene en forma de sal, se puede convertir en la forma libre o en la forma de una sal diferente mediante un método conocido o uno análogo.

Además, la CXCL2 también se puede producir cultivando un transformante que comprende un ácido nucleico que lo codifica, y separando y purificando la CXCL2 a partir del cultivo obtenido. El ácido nucleico que codifica CXCL2 puede ser ADN o ARN, o una quimera de ADN/ARN, preferiblemente ADN. Además, el ácido nucleico puede ser bicatenario o monocatenario. En el caso de un ácido nucleico bicatenario, puede ser un ADN bicatenario, un ARN bicatenario o un híbrido ADN:ARN. En el caso de una sola hebra, puede ser una hebra con sentido (es decir, una hebra codificante) o una hebra antisentido (es decir, una hebra no codificante).

Los ejemplos del ADN que codifica CXCL2 incluyen ADN genómico, ADNc obtenido a partir de células humanas, ADN sintético y similares. El ADN genómico que codifica CXCL2 se puede amplificar directamente mediante la reacción en cadena de la polimerasa (de aquí en adelante abreviada como "método de PCR") utilizando, como molde, una fracción de ADN genómico preparada a partir de cualquier célula de los animales mencionados anteriormente [por ejemplo, hepatocito, esplenocito, célula nerviosa, célula glial, célula p pancreática, mielocito, célula mesangial, célula de Langerhans, célula epidérmica, célula epitelial, célula caliciforme, célula endotelial, célula del músculo liso, fibroblasto, fibrocito, miocito, adipocito, inmunocito (p. ej., macrófago, linfocito T, linfocito B, linfocito citolítico natural, mastocito, neutrófilo, basófilo, eosinófilo, monocito), megacariocito, célula sinovial, condrocito, célula ósea, osteoblasto, osteoclasto, célula de la glándula mamaria, hepatocito o célula intersticial, o una célula progenitora correspondiente, célula madre o célula cancerosa de la misma, y similares] de dicho animal o cualquier tejido, en donde esas células estén presentes [por ejemplo, cerebro o cualquier parte del cerebro (por ejemplo, bulbo olfatorio, núcleo amigdaloide, ganglios basales, hipocampo, tálamo, hipotálamo, corteza cerebral, bulbo raquídeo, cerebelo), médula espinal, hipófisis, estómago, páncreas, riñón, hígado, gónada, tiroides, vesícula biliar, médula ósea, glándula suprarrenal, piel, pulmón, tracto gastrointestinal (p. ej., intestino grueso, intestino delgado), vaso sanguíneo, corazón, timo, bazo, glándula submandibular, sangre periférica, próstata, testículo, ovario, placenta, útero, hueso, articulación, tejido adiposo (p. ej., tejido adiposo marrón, tejido adiposo blanco), músculo esquelético y similares], y un ADNc que codifica CXCL2 también se puede amplificar directamente mediante el método de PCR y la PCR con transcriptasa inversa (de aquí en adelante abreviado como "método de RT-PCR") utilizando como molde un ARN total o una fracción de ARNm preparada a partir de las células. Alternativamente, el ADN genómico y el ADNc que codifica CXCL2 también se pueden clonar mediante el método de hibridación de colonias o placas o el método de PCR y similares, a partir de una genoteca de ADN genómico y una genoteca de ADNc preparada insertando el ADN genómico mencionado anteriormente y el ARN total o un fragmento de ARNm, en un vector adecuado. El vector usado para la genoteca puede ser cualquiera entre un bacteriófago, un plásmido, un cósmido, un fagémido y similares.

Los ejemplos del ADN que codifica CXCL2 incluyen un ADN que comprende la misma o sustancialmente la misma secuencia de bases que la secuencia de bases mostrada en s Eq ID NO: 1 y similares.

Como ADN que comprende la misma o sustancialmente la misma secuencia de bases que la secuencia de bases mostrada en SEQ ID NO: 1, se puede emplear un ADN que comprende una secuencia de bases que tiene una homología de no menos de aproximadamente un 60%, preferiblemente no menos de aproximadamente un 70%, más preferiblemente no menos de aproximadamente un 80%, de forma particularmente preferible no menos de aproximadamente un 90%, con la secuencia de bases mostrada en SEQ ID NO: 1, y que codifica una proteína que tiene una actividad sustancialmente con la misma calidad que la de CXCL2 mencionada anteriormente y similares.

La homología de una secuencia de bases en la presente descripción se puede calcular usando el algoritmo de cálculo de homología NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) con las siguientes condiciones (expectativa = 10; espacio permitido; filtrado = ACTIVADO; puntuación de un apareamiento = 1; puntuación de un apareamiento erróneo = -3). Como ejemplos preferibles de otros algoritmos para determinar la homología de una secuencia de bases, también se puede mencionar el algoritmo de cálculo de homología de una secuencia de aminoácidos descrito anteriormente.

El ADN que codifica CXCL2 es preferiblemente un ADN que comprende una secuencia de bases que codifica la proteína CXCL2 humana que se muestra con la secuencia de bases mostrada en SEQ ID NO: 1.

Un ADN que codifica CXCL2 se puede clonar amplificando un cebador de ADN sintetizado que tiene una parte de una secuencia de bases que codifica la CXCL2 mediante el método de PCR, o hibridando un ADN incorporado en un vector de expresión adecuado con un fragmento de ADN marcado o un ADN sintético que codifica una parte o toda la región de CXCL2. La hibridación se puede realizar de acuerdo con un método conocido de por sí o un método basado en el mismo, por ejemplo, un método descrito en Molecular Cloning, 2a edición (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) y similares. Cuando se usa una genoteca disponible comercialmente, la hibridación se puede realizar de acuerdo con el método descrito en el manual de instrucciones que se adjunta. La hibridación se puede realizar preferiblemente en condiciones muy estrictas.

A modo de ejemplo de las condiciones muy estrictas, se pueden mencionar unas condiciones de una reacción de hibridación en 6 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) a 45°C seguida de un lavado en 0,2 x SSC/SDS al 0,1% a 65°C una vez o varias, y similares. Los expertos en la técnica pueden obtener fácilmente el rigor deseado, cambiando la concentración salina de la solución de hibridación, la temperatura de reacción de la hibridación, la concentración de la sonda, la longitud de la sonda, el número de apareamientos erróneos, el tiempo de reacción de la hibridación, la concentración salina de la solución de lavado, la temperatura de lavado y similares, según sea apropiado. Cuando se usa una genoteca disponible comercialmente, la hibridación se puede realizar de acuerdo con el método descrito en el manual de instrucciones que se adjunta a la genoteca.

Un vector de expresión que comprende ADN que codifica CXCL2, se puede producir, por ejemplo, cortando un fragmento de ADN deseado a partir del ADN que codifica CXCL2 y uniendo el fragmento de ADN aguas abajo de un promotor en un vector de expresión apropiado.

Como vector de expresión, se emplea un plásmido obtenido a partir de Escherichia coli (por ejemplo, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13); un plásmido de expresión en célula animal (por ejemplo, pCY4B, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo); vectores de virus animales tales como retrovirus, virus vaccinia, adenovirus y similares, y similares.

El promotor puede ser cualquier promotor, siempre que sea apropiado para el hospedador utilizado para expresar el gen.

Por ejemplo, cuando el hospedador es una célula animal, se emplea el promotor de SRa, promotor de SV40, promotor de LTR, promotor de CMV (citomegalovirus), promotor de RSV (virus del sarcoma de Rous), LTR de MoMuLV (virus de la leucemia murina de Moloney), promotor de HSV-TK (timidina cinasa del virus del herpes simple) y similares. Entre estos, son preferibles el promotor de CMV, el promotor de SRa y similares.

Cuando el hospedador es una bacteria del género Escherichia, se prefiere el promotor trp, el promotor lac, el promotor recA, el promotor AP^l, el promotor lpp, el promotor T7 y similares.

Los vectores de expresión útiles incluyen, además de los anteriores, aquellos que albergan opcionalmente un potenciador, una señal de corte y empalme, una señal de adición de poliA, un marcador de selección, un origen de replicación de SV40 (de aquí en adelante también abreviado como SV40ori) y similares. Como ejemplos del marcador de selección, se puede mencionar el gen de la dihidrofolato reductasa (en lo sucesivo también abreviado como dhfr) resistencia a metotrexato (MTX), el gen de resistencia a la ampicilina (en lo sucesivo también abreviado como Ampr), el gen de resistencia a la neomicina (en adelante también abreviado como Neor, resistencia a G418) y similares. En particular, cuando se usa una célula de hámster chino que carece del gen dhfr en combinación con el gen dhfr como marcador de selección, también se puede seleccionar un gen diana usando un medio sin timidina.

Cuando sea necesario, se puede añadir una secuencia de bases que codifica una secuencia señal adecuada para un hospedador (codón señal) (o sustituirse con un codón señal natural) en el lado 5'-terminal de un ADN que codifica CXCL2 o un péptido parcial del mismo. Por ejemplo, cuando el hospedador es del género Escherichia, se utiliza la secuencia señal de PhoA, la secuencia señal de OmpA y similares; cuando el hospedador es una célula animal, se utiliza una secuencia señal de insulina, una secuencia señal del interferón a, una secuencia señal de una molécula de anticuerpo y similares.

CXCL2 se puede producir transformando un hospedador con un vector de expresión que comprende el ADN que codifica CXCL2 mencionado anteriormente y cultivando el transformante obtenido.

Como hospedador, por ejemplo, se utiliza el género Escherichia, células animales y similares.

Como género Escherichia se emplea, por ejemplo, Escherichia coli K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA), vol. 60, 160 (1968)], Escherichia coli JM103 [Nucleic Acids Research, vol. 9, 309 (1981)], Escherichia coli JA221 [Journal of Molecular Biology, vol. 120, 517(1978)], Escherichia coli HB101 [Journal of Molecular Biology, vol. 41, 459 (1969)], Escherichia coli C600 [Genetics, vol. 39, 440 (1954)] y similares.

Como célula animal se emplea, por ejemplo, una célula COS-7 de mono, una célula Vero de mono, una célula de ovario de hámster chino (en lo sucesivo abreviada como célula CHO), una célula CHO que carece del gen dhfr (en adelante abreviada como célula CHO (dhfr-), una célula L de ratón, una célula AtT-20 de ratón, una célula de mieloma de ratón, una célula GH3 de rata, una célula FL humana y similares.

La transformación se puede llevar a cabo según el tipo de hospedador de acuerdo con un método conocido públicamente.

El género Escherichia se puede transformar, por ejemplo, de acuerdo con los métodos descritos en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 69, 2110 (1972), Gene, vol. 17, 107 (1982) y similares.

Una célula animal se puede transformar, por ejemplo, de acuerdo con un método descrito en Saibo Kogaku (Cell Engineering), número extra 8, Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol (New Cell Engineering Experimental Protocol), 263-267 (1995), publicado por Shujunshao, o Virology, vol. 52, 456 (1973).

El cultivo de un transformante se puede llevar a cabo según el tipo de hospedador de acuerdo con un método conocido públicamente.

A modo de ejemplo del medio utilizado para el cultivo de un transformante cuyo hospedador es una bacteria del género Escherichia, se prefiere un medio M9 complementado con glucosa y un casaminoácido [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York 1972]. Según sea necesario, para aumentar la eficacia del promotor, se puede añadir al medio un agente químico tal como ácido 3pindolilacrílico.

El cultivo de un transformante cuyo hospedador es una bacteria del género Escherichia se lleva a cabo normalmente desde aproximadamente 15°C hasta aproximadamente 43°C durante aproximadamente 3 hasta aproximadamente 24 horas. Cuando sea necesario, el cultivo se puede airear o agitar.

Un medio útil para cultivar un transformante cuyo hospedador es una célula animal incluye, por ejemplo, medio esencial mínimo (MEM) que comprende desde aproximadamente 5 a aproximadamente 20% de suero bovino fetal [Science, vol. 122, 501 (1952)], medio de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) [Virology, volumen 8, 396 (1959)], medio RPMI1640 [The Journal of the American Medical Association, vol. 199, 519 (1967)], medio 199 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, vol. 73, 1 (1950)] y similares. El pH del medio es preferiblemente desde aproximadamente 6 a aproximadamente 8. El cultivo se lleva a cabo normalmente desde aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C, durante desde aproximadamente 15 a aproximadamente 60 horas. Según sea necesario, el cultivo puede airearse o agitarse.

Como se ha descrito anteriormente, CXCL2 se puede producir en una célula del transformante o fuera de la célula.

CXCL2 se puede separar y purificar desde el cultivo obtenido, cultivando el transformante mencionado anteriormente según un método conocido de por sí.

Por ejemplo, cuando CXCL2 se extrae a partir de una bacteria cultivada o un citoplasma celular, se usa un método según sea apropiado, en el que las bacterias o las células se recogen desde el cultivo por medios conocidos, se suspenden en una solución tampón apropiada y se rompen mediante ultrasonidos, lisozima y/o congelacióndescongelación y similares, después de lo cual se obtiene un extracto crudo de proteína soluble mediante centrifugación o filtración. La solución tampón puede comprender un agente desnaturalizante de proteínas tal como urea o clorhidrato de guanidina y un tensioactivo tal como Triton X-100™. Además, cuando CXCL2 se secreta fuera del hongo (célula), se usa un método para separar un material sobrenadante de un cultivo mediante centrifugación, filtración o uno similar, desde un cultivo, y similares.

El aislamiento y la purificación de CXCL2 contenida en la fracción soluble obtenida de ese modo y el material sobrenadante del cultivo, se pueden realizar de acuerdo con un método conocido de por sí. Los métodos útiles incluyen métodos basados en la solubilidad, tales como la precipitación con disolventes y la salificación; métodos basados principalmente en diferencias de peso molecular, tales como la diálisis, la ultrafiltración, la filtración en gel y la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida; métodos basados en diferencias de carga, como la cromatografía de intercambio iónico; métodos basados en la afinidad específica, tales como la cromatografía por afinidad; métodos basados en diferencias de hidrofobicidad, tales como la cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa; y métodos basados en diferencias del punto isoeléctrico, tales como el enfoque isoeléctrico. Esos métodos se pueden combinar según sea conveniente.

La presencia de la CXCL2 obtenida de ese modo se puede confirmar mediante un inmunoensayo enzimático, transferencia Western y similares, utilizando un anticuerpo contra CXCL2.

En la presente descripción, un agente inductor de la expresión de CXCL2 es un compuesto capaz de expresar CXCL2. Por ejemplo, se puede mencionar ARN bicatenario sintetizado (p. ej., ácido poliinosínico-policitidílico (Poli I:C)), lipopolisacárido, leucotrieno 4, factor activador de plaquetas (PAF), angiotensina II (Ang II), factor de necrosis tumoral a (TNF-a), interleucina-17 (IL-17) y similares.

En la presente descripción, el ARN bicatenario sintetizado no está particularmente limitado, siempre que sea un ARN sintético que forme una cadena doble mediante la unión de un hidrógeno entre los pares de bases y exprese CXCL2 transfiriendo la señal de TLR3. Por ejemplo, se puede mencionar Poli I:C formado por una hebra de ARN que consiste solo en inosina como base y una hebra de ARN que consiste solo en citidina como base. En la presente descripción, además, Poli I:C tiene preferiblemente un peso molecular desde aproximadamente 100 kDa a aproximadamente 110 kDa. En la presente descripción, además, Poli I:C tiene preferiblemente una longitud desde aproximadamente 140 pb a aproximadamente 180 pb.

Una composición farmacéutica que contiene HVJ-E y CXCL2 obtenida como se ha mencionado anteriormente (a menos que se indique particularmente, en las descripciones relacionadas con las composiciones farmacéuticas, CXCL2 incluye no solo la proteína CXCL2 sino también el ácido nucleico que comprende una secuencia de bases que codifica CXCL2) se puede proporcionar como un agente anticanceroso.

En los ejemplos mencionados a continuación en la presente memoria descriptiva, una composición farmacéutica que contiene HVJ-E y CXCL2 mostraba un efecto supresor de la proliferación tumoral en ratones portadores de tumores, que era superior a solo HVJ-E, solo CXCL2 o solo Poli I:C. A partir de lo anterior, se sugiere que una composición farmacéutica que contiene HVJ-E y CXCL2 puede tratar el desarrollo y la progresión de un cáncer. Por tanto, una composición farmacéutica que contiene HVJ-E y CXCL2 se puede utilizar como agente anticanceroso.

Ejemplos del sujeto al que se va a administrar la composición farmacéutica de la presente invención que contiene HVJ-E y CXCL2, incluyen seres humanos y otros animales de sangre caliente (por ejemplo, ratón, rata, conejo, oveja, cerdo, vaca, gato, perro, mono, ave y similares).

El cáncer como diana para una aplicación de la composición farmacéutica de la presente invención que contiene HVJ-E y CXCL2, no está particularmente limitado siempre que sea, por ejemplo, un cáncer sólido. Ejemplos del mismo incluyen, pero no se limitan a, melanoma, cáncer de pulmón, mesotelioma, cáncer de lengua, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de intestino grueso, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de útero, cáncer de ovario, tumor cerebral, cáncer de tiroides, angiosarcoma, osteosarcoma, condrosarcoma, rabdomiosarcoma, leiomiosarcoma y similares. Entre estos, se puede mencionar preferiblemente el melanoma.

La composición farmacéutica de la presente invención que comprende HVJ-E y CXCL2 tiene baja toxicidad y se puede administrar como un líquido tal cual, o como una forma de dosificación apropiada de una composición farmacéutica, a seres humanos u otros mamíferos de sangre caliente (p. ej., ratón, rata, conejo, oveja, cerdo, vaca, gato, perro, mono, ave y similares) por vía oral o parenteral (por ejemplo, administración intravascular, administración subcutánea y similares), se prefiere la administración parenteral.

A modo de ejemplos de la composición para una administración parenteral, se utilizan inyecciones, supositorios y similares; las inyecciones pueden incluir formas de dosificación tales como inyecciones intravenosas, inyecciones subcutáneas, inyecciones intracutáneas, inyecciones intramusculares e inyecciones de infusión por goteo. Una inyección de ese tipo se puede preparar de acuerdo con un método conocido públicamente. Una inyección se puede preparar, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando HVJ-E y CXCL2 mencionados anteriormente de la presente invención en una solución acuosa u oleosa estéril de uso común para inyecciones. Como ejemplos de soluciones acuosas para inyección, se puede usar una solución salina fisiológica, una solución isotónica que comprende glucosa u otro fármaco auxiliar, y similares, en combinación con un agente solubilizante apropiado, por ejemplo, alcohol (por ejemplo, etanol), polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (un aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)] y similares. Como ejemplos de soluciones oleosas, se puede usar aceite de sésamo, aceite de soja y similares, que se pueden emplear en combinación con benzoato de bencilo, alcohol bencílico y similares como agentes solubilizantes. La solución para una inyección preparada, se carga preferiblemente en una ampolla apropiada. Los supositorios usados para una administración rectal se pueden preparar mezclando HVJ-E y CXCL2 mencionados anteriormente con una base de supositorio ordinaria.

Como composición para una administración oral, se pueden mencionar las formas de dosificación sólidas o líquidas, específicamente comprimidos (incluyendo los comprimidos recubiertos de azúcar y los comprimidos recubiertos con película), píldoras, gránulos, polvos, cápsulas (incluyendo las cápsulas blandas), jarabes, emulsiones, suspensiones y similares. Una composición de ese tipo se produce mediante un método conocido públicamente y puede comprender un vehículo, un diluyente o un excipiente de uso común en el campo de la industria farmacéutica. Como ejemplos del vehículo o excipiente para comprimidos, se puede usar lactosa, almidón, sacarosa, estearato de magnesio y similares.

Para una administración a pacientes adultos con cáncer mediante inyección, por ejemplo, la composición farmacéutica mencionada anteriormente de la presente invención que contiene HVJ-E y CXCL2, se puede administrar mediante una inyección directa de HVJ-E y CXCL2 en un sitio de tumor o en su proximidad. La dosis de la misma puede ser determinada apropiadamente por un médico o profesional médico teniendo en cuenta el tamaño del tumor, la edad, el peso corporal y el estado de los pacientes y similares. Cuando el volumen del tumor no supera los 1.000 mm3 (por ejemplo, aproximadamente 200 mm3 y similares), la dosis de HVJ-E para cada administración en un sitio de tumor, se puede establecer en 3 HAU - 6.000.000 HAU, preferiblemente 30 HAU - 3.000.000 HAU, más preferiblemente 300 Ha U - 1.500.000 HAU, (por ejemplo, 8.000 HAU - 37.000 HAU). Preferiblemente, no es más de 100.000 HAU/kg de peso corporal. En cuanto a la dosis de CXCL2, cuando el volumen tumoral no supera los 1.000 mm3 (por ejemplo, aproximadamente 200 mm3 y similar), la dosis de CXCL2 para cada administración en un sitio de tumor se puede establecer en 0,001 ng - 1.000 pg, preferiblemente 0,01 ng - 500 pg, más preferiblemente 0,1 ng -250 pg (por ejemplo, 0,96 ng - 4,4 ng). La dosis de un ácido nucleico que contiene una secuencia de bases que codifica CXCL2 puede ser una cantidad de ácido nucleico correspondiente a la dosis de CXCL2 mencionada anteriormente. Cuando el volumen del tumor no supera los 1.000 mm3 (por ejemplo, aproximadamente 200 mm3 y similar), la dosis de un ácido nucleico que contiene una secuencia de bases que codifica CXCL2 para cada administración en un sitio de tumor, se puede establecer en 0,15 pg - 6 mg, preferiblemente 1,5 pg - 3 mg, más preferiblemente 15 pg - 1,500 pg (p. ej., 160 pg - 740 pg). En cuanto a la dosis de, por ejemplo, Poli I:C como agente inductor de la expresión de CXCL2, cuando el volumen del tumor no es superior a 1000 mm3 (por ejemplo, aproximadamente 200 mm3 y similar), la dosis de CXCL2 para cada administración en un sitio tumoral se puede establecer en 0,1 pg - 4 mg, preferiblemente 1 pg - 2 mg, más preferiblemente 10 pg - 1 mg (por ejemplo, 80 pg -741 pg). El efecto anticanceroso de la propia HVJ-E y el efecto anticanceroso de CXCL2 se pueden combinar para lograr una actividad anticancerígena que no se puede obtener mediante un uso por separado. Por tanto, las dosis de HVJ-E y CXCL2 se pueden reducir cada una en comparación con una administración individual de cada una de HVJ-E y CXCL2, lo que es ventajoso desde el punto de vista de la seguridad. Además, la frecuencia de la administración también puede ser determinada según sea apropiado por un médico o profesional médico, teniendo en cuenta el tamaño del tumor, la edad, el peso corporal y el estado del paciente, y similares.

Cada una de las composiciones mencionadas anteriormente puede comprender cualquier otro ingrediente activo que no produzca una interacción no deseada cuando se formula con HVJ-E y CXCL2 de la presente invención.

En los ejemplos de la presente invención que se mencionan a continuación, una composición farmacéutica que contiene HVJ-E y CXCL2 mostraba un efecto de convertir neutrófilos atraídos hacia un tumor de ratones portadores de tumores, mediante CXCL2, en neutrófilos de tipo N1 mediante citocinas producidas a partir de células dendríticas estimuladas con HVJ-E, o con la propia HVJ-E. Lo anterior sugiere que una composición farmacéutica que contiene HVJ-E y CXCL2 puede inducir neutrófilos de tipo N1 en el sujeto al que se administran y en el sitio de la administración. Por tanto, se puede utilizar una composición farmacéutica que contiene HVJ-E y CXCL2 como un agente inductor de neutrófilos de tipo N1. El sujeto al que se administra, la forma de dosificación, la dosis, la vía de administración y similares pueden ser similares a los del agente anticanceroso de la presente invención.

Ejemplos

Línea celular y ratones

La línea celular de melanoma de ratón B16-F10 se sometió a un cultivo de mantenimiento en un medio DMEM (Nacalai Tesque Inc.) que contenía FBS al 10% (BioWest, Nuaille, Francia) y 0,1 mg/ml de una solución mixta de penicilina-estreptomicina (Nacalai Tesque Inc.). Ratones doblemente inactivados Myd88-/- TRIF-/- obtenidos cruzando un ratón hembra C57BL/6N de 6 semanas y un ratón Myd88-/- comprado en Clea Japan con un ratón TRIF-/-, se mantuvieron en una cámara aséptica a temperatura ambiente controlada y se manipularon de acuerdo con el protocolo y las pautas aprobadas para las cláusulas de experimentos con animales de la Universidad de Osaka (Suita, Japón).

Virus

Se adquirió HVJ (cepa VR-105 parainfluenza Sendai/52 Z) a partir del ATCC (Manassas, VA) y se preparó de acuerdo con el método descrito en Cancer Res. 67, 227-236, 2007. Brevemente, se inyectó una solución de cepa madre de HVJ en huevos de gallina con embrión de 10 días y los huevos se cultivaron durante 3 días a 37°C en una incubadora. Después de 3 días, se recogió líquido alantoideo de los huevos de gallina inyectados con HVJ. El virus recuperado (HVJ vivo) se inactivó mediante irradiación UV (198 mJ/cm2) para preparar la HVJ-E.

Poli I:C y MLA

El monofosforil lípido A artificial (MLA) se adquirió en Invivogen (San Diego, EE.UU.). Poli I:C (de aproximadamente 100 kDa a 110 kDa; de aproximadamente 140 pb a aproximadamente 180 pb) se adquirió en Sigma-Aldrich Japón (Tokio, Japón).

Ensayo MTS

La supervivencia de las células se detectó usando el kit de ensayo de proliferación celular CellTiter 96 Aqueous One Solution (Promega). Las células se trataron con poli I:C, HVJ-E o CXCL2 de una manera dependiente de la dosis, y se añadieron 100 gl de la solución CellTiter 96 Aqueous One Solution al medio (1 ml). Utilizando un lector de microplacas multimodo Mithras LB 940 de 96 pocillos (Berthold Technologies GmbH & Co. KG, Bad Wildbad, Alemania), se midió la absorbancia a 490 nm.

Prueba de inoculación tumoral

Células de melanoma de ratón B16-F10 (106 células) suspendidas en 50 gl de PBS se inyectaron por vía intradérmica en la parte dorsal de ratones C57BL/6N. Después de 6 días, cuando el diámetro del tumor creció hasta 3-5 mm, HVJ-E (número de partículas 2,5x109 (2.500 HAU) o número de partículas 5,0x109 (5.000 HAU)), HVJ-E (número de partículas 2,5x109 (2.500 HAU)) combinada con poli I:C (25 gg o 50 gg), CXCL-2 recombinante (Biolegend) (0,3 ng), poli I:C (25 gg) o HVJ-E (número de partículas 2,5x109 (2.500 HAU)) combinada con CXCL2 (0,3 ng), cada una suspendida en una cantidad total de 50 gl de PBS, se inyectaron intratumoralmente a los ratones cada dos días, 3 veces en total. El volumen del tumor se midió usando un calibrador de Vernier en una prueba ciega y se calculó usando la siguiente fórmula:

volumen del tumor (mm3) = longitud x (ancho)2/2

Sistema de citocinas de tejido tumoral

Veinticuatro horas después de la inyección final de HVJ-E, poli I:C, CXCL2, HVJ-E poli I:C o HVJ-E CXCL2, se recogieron tejidos tumorales de los ratones portadores de tumores. Los tejidos recogidos se sumergieron en PBS y se homogeneizaron durante 20 segundos a 2.500 rpm, utilizando un aparato Multi-Beads Shocker (Yasui Kikai Co. Osaka, Japón). Después de homogeneizar, se añadió Triton X-100 hasta tener una concentración final de 0,1% junto con un inhibidor de proteasas. La muestra obtenida se congeló a -80°C y se descongeló, seguido por una centrifugación durante 5 min a 10.000 x g, y se retiraron los restos celulares para proporcionar un lisado de tejido tumoral. Se usó un lisado de tejido tumoral que contenía 400 gg de cantidad equivalente de proteína y el panel A de un sistema de citocinas (R&D Systems, Minneapolis, MN) para un sistema de citocinas, y el ensayo se realizó de acuerdo con el manual. Los resultados fueron analizados mediante ImageQuant TL (GE Healthcare).

Estructura artificial de plásmido y gen

El gen CXCL2 de ratón se adquirió en Sino Biological Inc. (North Wales, EE.UU.). Usando una ADN polimerasa iProof™ High-Fidelity (Bio-Rad) y los siguientes cebadores, se amplificó el gen CXCL2:

directo: 5'-AAGCTTGCCACCATGGCCCCTCCCACCT-3' (SEQ ID NO: 3)

inverso: 5'-CTCGAGTCAGTTAGCCTTGCCTTTG-3' (SEQ ID NO: 4)

Para el experimento de terapia génica, se clonó el gen CXCL2 en el vector pCY4B.

Terapia génica empleando el vector de expresión de CXCL2 compatible con HVJ-E

En un experimento de terapia génica, se usó HVJ-E para transducir el plásmido del vector de expresión de CXCL2 (pCY4B-CXCL2) en un tumor B16-F10 obtenido a partir de un ratón C57BL6/N. HVJ-E obtenida a partir de huevos de gallina, se trató con un tampón del kit de transfección GenomeONE (GenomeONE; Ishihara-Sangyo Kaisha Ltd., Osaka, Japón). Junto con pCY4B-CXCL2 (50 gg/50 gl por ratón), se inyectó intratumoralmente HVJ-E (2500 HAU) a un ratón portador de B16-F10 cada dos días, 3 veces en total. El tamaño del tumor se observó hasta el día 25. Preparación de células del bazo

Se extrajo el bazo de ratones C57BL/6N. Las células obtenidas a partir del bazo se hicieron pasar a través de una malla de 40 gm y se hemolizaron con un tampón de hemólisis (Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.). Se lavó con el medio la médula ósea procedente de la tibia y el fémur. Las células obtenidas a partir de la médula ósea se hicieron pasar a través de una malla de 40 gm para aislar las células dendríticas de ratón. Después del lavado, las células se cultivaron en un medio que contenía 10 ng/ml de GM-CSF de ratón recombinante. Después de 6 días, se evaluó la expresión de CD11c mediante citometría de flujo para identificar las células no adherentes o poco adheridas como células dendríticas.

Ensayo ELISpot

Se inyectó por vía intratumoral PBS, poli I :C, CXCL2, HVJ-E, HVJ-E poli I:C o HVJ-E CXCL2 a ratones C57BL6/N que eran portadores de B16-F10 cada 2 días, 3 veces en total. Diez días después de la inyección final, se extrajo el bazo de los ratones y se prepararon células de bazo procedentes del bazo como se ha descrito en el protocolo de preparación de células de bazo mencionado anteriormente. Las células de melanoma B16-F10 se trataron con mitomicina C (15 gg/ml) durante 45 min. Las células del bazo y las células de melanoma B16-F10 tratadas con mitomicina C, se mezclaron en una proporción de 10:1. Después de 48 h, se recogieron las células de bazo no adhesivas y se realizó un ensayo ELISpot utilizando el Módulo de desarrollo de IFN-^y de ratón (R&D Systems) y el Módulo de color azul de ELISpot (R&D Systems). Posteriormente, se contaron las células que secretaban de IFN-y.

Neutralización de CXCL2 e inhibición de neutrófilos

En un experimento de neutralización de CXCL1/CXCL2, se inyectó intraperitonealmente previamente un anticuerpo neutralizante de CXCL1 o CXCL2 (R&D Systems) a ratones C57BL6/N portadores de b 16-F10, 24 h antes de una inyección intratumoral de PBS, HVJ-E, poli I:C o HVJ -E poli I:C. Después de la inyección final de PBS, HVJ-E, poli I:C o HVJ-E poli I:C, se observó el tamaño del tumor cada 2-3 días. El tumor se extirpó al finalizar el experimento y se pesó.

Para agotar los neutrófilos, antes o entre las inyecciones intratumorales de PBS, poli I:C, CXCL2, HVJ-E, HVJ-E poli I:C o HVJ-E CXCL2, se inyectó un anticuerpo Ly-6G (1A8) por vía intratumoral (50 gg) o intraperitonealmente (100 gg). Después de la inyección final de PBS, poli I:C, Cx c L2, HVJ-E, HVJ-E poli I:C o HVJ-E CXCL2, se observó el tamaño del tumor cada 2-3 días. El tumor se extirpó al finalizar el experimento y se pesó.

RT-PCR cuantitativa en tiempo real

Usando Isogen (Wako, Osaka, Japón), se extrajo el ARN total del tumor extirpado y lavado con PBS. Se cuantificó el ARN y 2 gg del mismo se transcribieron de manera inversa en ADNc (Applied Biosystems). Usando SYBR qPCR Mix (Toyobo CO., LTD) junto con un conjunto de cebadores de ratón para Ly-6G, CXCL1, CXCL2 y p-actina (abajo), se realizó una PCR cuantitativa. Utilizando el sistema CFX384 en tiempo real (Bio-Rad, CA, EE.UU.), se midió el número de copias del gen diana. Todas las operaciones se realizaron de acuerdo con el manual.

Ly-6G

Directo: 5'-TGGACTCTCACAGAAGCAAAG-3' (SEQ ID NO: 5)

Inverso: 5'-GCAGAGGTCTTCCTTCCAACA-3' (SEQ ID NO: 6)

CXCL1

Directo: 5'-GACTCCAGCCACACTCCAAC-3' (SEQ ID NO: 7)

Inverso: 5'-TGACAGCGCAGCTCATTG-3' (SEQ ID NO: 8)

CXCL2

Directo: 5'-AAAATCATCCAAAAGATACTGAACAA-3' (SEQ ID NO: 9)

Inverso: 5'-CTTTGGTTCTTCCGTTGAGG-3' (SEQ ID NO: 10)

p-actina

Directo: 5'-GGAGGGGGTTGAGGTGTT-3' (SEQ ID NO: 11)

Inverso: 5'-GTGTGCACTTTTATTGGTCTCAAG-3' (SEQ ID NO: 12)

ICAM-1

Directo: 5'-GTGGCGGGAAAGTTCCTG-3' (SEQ ID NO: 13)

Inverso: 5'-CGTCTTGCAGGTCATCTTAGGAG-3' (SEQ ID NO: 14)

MMP8

Directo: 5'-AACGGGAAGACATACTTCTTCATAA-3' (SEQ ID NO: 15)

Inverso: 5'-GGGTCCATGGATCTTCTTTG-3' (SEQ ID NO: 16)

IFN-p

Directo: 5'-CACAGCCCTCTCCATCAACTA-3' (SEQ ID NO: 17)

Inverso: 5'-CATTTCCGAATGTTCGTCCT-3' (SEQ ID NO: 18)

TGF-p

Directo: 5'-TGGAGCAACATGTGGAACTC-3' (SEQ ID NO: 19)

Inverso: 5'-GTCAGCAGCCGGTTACCA-3' (SEQ ID NO: 20)

Análisis del tumor mediante citometría de flujo

El tumor se extirpó de un ratón y se hidrolizó en un tampón de digestión que contenía FBS al 2% y 2,5 mg/ml de colagenasa A (Roche, Indianápolis, IN). El material hidrolizado se incubó en un tampón de digestión a 37°C durante 1 hora con agitación, se filtró a través de un filtro de 70 Mm y se lavó dos veces con PBS. Las células recogidas se tiñeron con los siguientes anticuerpos marcados con fluorescencia: CD45 (30-F11), CD11b (M1/70), Ly-6G (1A8), ICAM-1 (YN1/1.74) (BioLegend Inc.) y Fas (eBioscience, San Diego, EE.UU.). Toda la citometría de flujo se realizó en un aparato CSCanto™ II (Becton, Dickinson and Company, EE.UU.) y se analizó utilizando el programa informático FlowJo (FLOWJO LLC, Oregón, EE.UU.).

Tratamiento de los neutrófilos con HVJ-E

Usando el kit de aislamiento de neutrófilos (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania), se aislaron neutrófilos a partir de la médula ósea de ratón mediante MACS con un anticuerpo anti-neutrófilos, de acuerdo con el manual. Se trataron 2x105 neutrófilos en una placa de 96 pocillos con 500 m.o.i. de HVJ-E durante 24 horas. A modo de un método diferente, se trataron células dendríticas de ratón (2x105) obtenidas a partir de la médula ósea, aisladas como se ha mencionado anteriormente, con 500 m.o.i. de HVJ-E durante 24 horas. La suspensión celular se centrifugó a 18.500 x g durante 5 min para preparar el medio condicionado exento de células dendríticas y HVJ-E. Los neutrófilos (2x105) se cultivaron durante 36 h en el medio condicionado. Los neutrófilos cocultivados con HVJ-E y los neutrófilos cultivados en el medio condicionado se sometieron a FACS y se analizó la expresión de Fas y de ICAM-1.

Análisis estadístico

Utilizando una prueba t de Student para datos no apareados mediante GraphPad, se realizó un análisis estadístico y se consideró que P <0,05 mostraba una diferencia estadísticamente significativa.

Ejemplo 1 Efecto antitumoral de un fármaco concomitante con HVJ-E y Poli I:C - 1

Se sembró la línea celular de melanoma de ratón B16-F10, se trató con PBS, poli I:C (0,1 Mg/ml, 0,25 Mg/ml o 1 Mg/ml (cultivo durante 24 horas) o 0,625 Mg/ml, 1,25 Mg/ml o 5 Mg/ml (cultivo durante 48 horas)), HVJ-E (1.000 moi, 2.500 moi o 10.000 moi) o HVJ-E poli I:C (H+P) (1.000 moi 0,625 Mg/ml, 2500 moi 1,25 Mg/ml o 10.000 moi 5 Mg/ml) y se cultivó durante 24 h o 48 h. Se añadió al medio la solución CellTiter 96 Aqueous One Solution (100 mI) y se midió la absorbancia a 490 nm. Los resultados se muestran en la Fig. 1. Ninguno entre poli I:C, HVJ-E o HVJ-E poli I:C (H+P) afectaba in vitro a la proliferación celular.

Además, a los ratones C57BL/6N que eran portadores de la línea celular B16-F10 de melanoma de ratón se inyectó intratumoralmente PBS, poli I:C (25 Mg), HVJ-E (2.500 HAU) o HVJ-E poli I:C (H+P) (2.500 HAU 25 Mg), cada dos días, 3 veces en total, y se midió el volumen del tumor a lo largo del tiempo. Los resultados se muestran en la Fig. 2. La eficacia de HVJ-E poli I:C (H+P) para suprimir la proliferación tumoral in vivo era mejor que la de poli I:C o HVJ-E. Ejemplo 2 Efecto antitumoral del fármaco concomitante con HVJ-E y Poli I:C - 2

En el Ejemplo 1, se había podido confirmar el mismo nivel de efecto supresor de la proliferación tumoral tanto en poli I:C (25 Mg) como en HVJ-E (2.500 HAU). De la misma manera que en el Ejemplo 1, PBS, 2 veces la cantidad de poli I:C en el Ejemplo 1 (50 Mg), 2 veces la cantidad de HVJ-E en el Ejemplo 1 (5.000 HAU) o HVJ-E poli I:C (H+P) (2.500 HAU 25 Mg), que es una combinación de poli I:C y HVJ-E en cantidades iguales a las del Ejemplo 1, se inyectaron intratumoralmente a ratones C57BL/6N que eran portadores de la línea celular B16-F10 de melanoma de ratón cada dos días, 3 veces en total, y se midió el volumen del tumor a lo largo del tiempo. Los resultados se muestran en la Fig. 3. La eficacia de HVJ-E poli I:C (H+P) (2.500 HAU 25 pg) para suprimir la proliferación tumoral in vivo era mejor que la de poli I:C (50 pg) o HVJ-E (5.000 HAU).

Ejemplo 3 Citocina inducida mediante Poli I:C

Se inyectó por vía intratumoral PBS, poli I:C, HVJ-E o HVJ-E poli I:C (H+P) a ratones C57BL/6N que eran portadores de B16-F10. Los tejidos tumorales recogidos después de 24 h, se homogeneizaron en PBS. Se añadió un inhibidor de proteasa y T riton X-100 y la mezcla se centrifugó para preparar un lisado de tejido tumoral. Utilizando el lisado de tejido tumoral, se elaboró un sistema de citocinas. Como resultado, cuando se administraba Poli I:C solo o en combinación con HVJ-E, los niveles de proteína de CXCL1 y CXCL2 en el tumor aumentaban en comparación con los del tumor de ratón sin la administración de Poli I:C (Fig. 4, panel superior).

Además, se inyectó intratumoralmente PBS, poli I:C, HVJ-E o HVJ-E poli I:C (H+P) a ratones C57BL/6N que eran portadores de B16-F10. El tumor se extirpó a las 24 h de la inyección y se extrajo el ARN total del tumor. El ADN complementario se obtuvo mediante transcripción inversa usando el ARN preparado, y se realizó una PCR cuantitativa usando un conjunto de cebadores de CXCL1, CXCL2 de ratón. Como resultado, cuando se administraba Poli I:C solo o en combinación con HVJ-E, los niveles de ARNm de CXCL1 y CXCL2 en el tumor aumentaban en comparación con los del tumor del ratón sin la administración de Poli I:C (Fig. 4, panel inferior).

Ejemplo 4 Influencia de la inhibición de CXCL1 sobre el efecto antitumoral del fármaco concomitante con HVJ-E y Poli I:C

Se inyectó por vía intraperitoneal un anticuerpo neutralizante de CXCL1 a ratones C57BL/6N que eran portadores de B16-F10, se inyectó intratumoralmente PBS o HVJ-E poli I:C (H+P) 24 horas después, y se observó el tamaño del tumor cada 2-3 días. Al finalizar el experimento, se extirpó el tumor y se pesó. Los resultados se muestran en la Fig. 5. El volumen del tumor y el peso del tumor no cambiaban con 3 condiciones; con administración de anticuerpo neutralizante de CXCL1 (H+P antiCXCL1), sin administración de anticuerpo neutralizante (H+P) y con administración de un anticuerpo sin especificidad hacia CXCL1 (control del isotipo (ISO)) (H+P ISO). El resultado sugiere que la acción supresora tumoral de HVJ-E poli I:C (H+P) es independiente de CXCL1.

Ejemplo 5 Influencia de la inhibición de CXCL2 sobre el efecto antitumoral del fármaco concomitante con HVJ-E y Poli I:C

Se realizó una operación similar a la del Ejemplo 4, excepto que se utilizó un anticuerpo neutralizante de CXCL2 en lugar de un anticuerpo neutralizante de CXCL1. Se midió el tamaño y se pesó el tumor. Los resultados se muestran en la Fig. 6. Cuando se administraba un anticuerpo neutralizante de CXCL2 (H+P antiCXCL2) y se administraba un anticuerpo que no tenía especificidad hacia CXCL2 (H+P ISO), el volumen del tumor cambiaba en comparación con la falta de administración de un anticuerpo neutralizante (H+P) (panel superior), y la comparación de la administración de un anticuerpo neutralizante de CXCL2 (H+P antiCXCL2) y la administración de un anticuerpo que no tenía especificidad hacia CXCL2 (H+P ISO), reveló también una diferencia significativa en el peso del tumor (panel inferior). Por lo tanto, se sugirió que la acción supresora tumoral de HVJ-E poli I:C (H+P) depende de CXCL2.

Ejemplo 6 Perfil de la expresión génica relacionada con neutrófilos en tejido tumoral

Se sabe que CXCL2 tiene una función quimioatrayente sobre los neutrófilos. Los neutrófilos infiltrados en un tumor se denominan neutrófilos asociados a tumores (TANs) y se clasifican como neutrófilos de tipo N1 que tienen una actividad supresora de la proliferación tumoral contra un tumor y como neutrófilos de tipo N2 que tienen una actividad promotora de la proliferación tumoral. Un poli I:C aumenta el nivel de CXCL2 en un tumor y una acción supresora tumoral de HVJ-E poli I:C (H+P) depende de CXCL2. Por tanto, se examinaron los neutrófilos en el tumor y su clasificación.

De la misma manera que en el Ejemplo 3, se inyectó intratumoralmente PBS, poli I:C, HVJ-E o HVJ-E poli I:C (H+P) a ratones C57BL/6N que eran portadores de B16-F10, el tumor fue extirpado 24 horas más tarde y se extrajo el ARN total del tumor. El ADN complementario se obtuvo mediante transcripción inversa del ARN, y se realizó una PCR cuantitativa utilizando un conjunto de cebadores de CXCL2 de ratón, ICAM-1 (marcador de neutrófilos de tipo N1), MMP8 (marcador de neutrófilos de tipo N1), IFN-p (que convierte los neutrófilos a neutrófilos de tipo N1) y TGF-p (que convierte los neutrófilos a neutrófilos de tipo N2). Los resultados se muestran en la Fig. 7. Cuando se administraba Poli I:C de forma aislada, el nivel de ARNm de CXCL2 en el tumor aumentaba significativamente, en comparación con el tumor del grupo al que se había administrado únicamente HVJ-E. Cuando se administraba HVJ-E poli I:C (H+P), el nivel de ARNm del marcador de neutrófilos de tipo N1, ICAM-1, aumentaba significativamente, en comparación con el grupo al que se había administrado únicamente Poli I:C o al que se había administrado únicamente HVJ-E, y el nivel del ARNm del marcador de neutrófilos de tipo N1, MMP8 también aumentaba. Cuando se administraba HVJ-E de forma individual o en combinación con Poli I:C, el nivel del ARNm de IFN-p que convierte los TANs en el tumor al tipo N1, aumentaba en comparación con el del tumor sin administración del grupo HVJ-E, mientras que el nivel de ARNm de TGF-p que convierte los TANs, en el tumor al tipo N2, no cambiaba entre los grupos.

Ejemplo 7 Proporciones de neutrófilos y de neutrófilos de tipo N1 en tejido tumoral y células secretoras de IFN-^y en el bazo

Se inyectó intratumoralmente PBS, poli I:C, HVJ-E o HVJ-E poli l:C (H+P) a ratones C57BL/6N que eran portadores de B16-F10, el tumor extirpado del ratón se trató con un tampón de digestión, y las células recogidas se tiñeron con los siguientes anticuerpos marcados con fluorescencia: CD45 (30-F11), CD11b (M1/70), Ly-6G (1A8), lCAM-1 (YN1/1.74) (BioLegend Inc.) y Fas (eBioscience, San Diego, EE.UU.). Las células teñidas se analizaron mediante citometría de flujo. Como resultado, cuando se administraba Poli l:C, la proporción de neutrófilos intratumorales aumentaba significativamente en comparación con la observada en el tumor sin la administración del grupo Poli l:C (Fig. 8, parte superior izquierda). Cuando se administraba HVJ-E poli l:C (H+P), la proporción de neutrófilos intratumorales de tipo N1 aumentaba en comparación con la observada en otros grupos (Fig. 8, parte inferior izquierda).

Además, se inyectó intratumoralmente PBS, poli l:C, HVJ-E o HVJ-E poli l:C (H+P) a ratones que eran portadores de B16-F10 y se extirpó el bazo del ratón 10 días después. Las células de bazo se prepararon a partir del bazo, se mezclaron con células de melanoma B16-F10 tratadas con mitomicina C, y se recogieron las células de bazo no adhesivas 48 horas después. Se realizó un ensayo ELISpot y se contaron las células secretoras de IFN-^y. Como resultado, el número de células secretoras de IFN-^y en el bazo del grupo HVJ-E poli l:C (H+P) aumentaba significativamente en comparación con el de los grupos a los que se había administrado vehículo (PBS) o HVJ-E (Fig. 8, derecha).

Ejemplo 8 Influencia de la inhibición de neutrófilos sobre el efecto antitumoral del fármaco concomitante con HVJ-E y Poli l:C

Se inyectó intratumoral o intraperitonealmente un anticuerpo anti-neutrófilo Ly-6G (1A8) a ratones C57BL/6N que eran portadores de B16-F10, se inyectó intratumoralmente HVJ-E poli l:C (H+P) 24 horas después, y el tamaño del tumor se observó cada 2-3 días. Al finalizar el experimento, se extirpó el tumor y se pesó. Los resultados se muestran en la Fig. 9. Cuando se administraba el anticuerpo anti-neutrófilo, el volumen del tumor aumentaba en comparación con el del ratón sin una administración del anticuerpo, y el peso del tumor también mostraba una diferencia significativa. Por lo tanto, se sugirió que la acción supresora tumoral de HVJ-E poli l:C (H+P) depende de los neutrófilos.

Ejemplo 9 Efecto antitumoral del fármaco concomitante con HVJ-E y CXCL2

Se sembró la línea celular de melanoma de ratón B16-F10, se trató con CXCL2 (0 ng/ml, 3 ng/ml, 30 ng/ml, 300 ng/ml o 600 ng/ml) y se cultivó durante 24 h o 48 h. Se añadió al medio una solución de CellTiter 96 Aqueous One Solution (100 pl) y se midió la absorbancia a 490 nm. Los resultados se muestran en la Fig. 10, panel superior. No se pudo confirmar in vitro una diferencia significativa en la proliferación celular, independientemente de la concentración de CXCL2.

Además, se inyectó intratumoralmente PBS, CXCL2 (0,3 ng), HVJ-E (2.500 HAU) o HVJ-E CXCL2 (H+C) (2.500 HAU 0,3 ng) a ratones C57BL/6N que eran portadores de la línea celular B16-F10 de melanoma de ratón, cada dos días, 3 veces en total, y se midió el volumen del tumor a lo largo del tiempo. Los resultados se muestran en la Fig. 10, panel inferior. Una administración individual de CXCL2 in vivo no mostraba un efecto supresor tumoral. En comparación con la administración individual de HVJ-E, la administración de HVJ-E CXCL2 (H+C) mostraba un efecto superior sobre la supresión de la proliferación tumoral.

Ejemplo 10 Célula secretora de IFN-^y en el bazo e influencia en la inhibición de neutrófilos

Se realizó una operación similar a la del Ejemplo 7, excepto que se utilizó CXCL2 en lugar de poli l:C, y se contaron las células secretoras de IFN-^y en el bazo. Como resultado, el número de células secretoras de IFN-^y aumentaba significativamente en el bazo de ratones a los que se había administrado HVJ-E CXCL2 (H+C), en comparación con el observado en el bazo de ratones a los que se había administrado únicamente HVJ-E (Fig. 11, izquierda).

Además, se inyectó intraperitonealmente el anticuerpo anti-neutrófilo Ly-6G (1A8) a ratones C57BL/6N que eran portadores de B16-F10. Se realizó una operación similar a la anterior. Se realizó un ensayo ELISpot y se contaron las células secretoras de IFN-y. Como resultado, el número de células secretoras de IFN-y no variaba por el agotamiento de los neutrófilos cuando se administraba únicamente HVJ-E (Fig. 11, parte superior derecha). Por otro lado, cuando se administraba HVJ-E CXCL2 (H+C), el número de células secretoras de IFN-^y disminuía significativamente por el agotamiento de los neutrófilos (Fig. 11, parte inferior derecha).

Ejemplo 11 Efecto antitumoral del fármaco concomitante con HVJ-E y vector de expresión del gen CXCL2

Se inyectó intratumoralmente HVJ-E, HVJ-E pCY4B o HVJ-E pCY4B-CXCL2 a ratones C57BL/6N que eran portadores de la línea celular B16-F10 de melanoma de ratón, cada dos días, 3 veces en total, y se observó el tamaño del tumor. Los resultados se muestran en la Fig. 12. La administración de HVJ-E pCY4B-CXCL2 mostraba un efecto superior sobre la supresión de la proliferación tumoral in vivo que en comparación con el de HVJ-E pCY4B.

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para uso en la profilaxis o el tratamiento de un cáncer que comprende los (1) y (2) siguientes:

(1) HVJ-E (envuelta del virus hemaglutinante de Japón),

(2) CXCL2 o un ácido nucleico que comprende una secuencia de bases que codifica CXCL2.

2. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 1, en la que el ácido nucleico que comprende la secuencia de bases que codifica CXCL2 es un vector de expresión que comprende una secuencia de bases que codifica CXCL2.

3. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 1 o 2, en la que el ácido nucleico que comprende una secuencia de bases que codifica CXCL2 está encapsulado en HVJ-E.

4. La composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste en melanoma, cáncer de pulmón, mesotelioma, cáncer de lengua, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de intestino grueso, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de útero, cáncer de ovario, tumor cerebral, cáncer de tiroides, angiosarcoma, osteosarcoma, condrosarcoma, rabdomiosarcoma y leiomiosarcoma.