ES2836885T3 - Nuevos inhibidores de glutaminil ciclasas bacterianas para su uso en el tratamiento de periodontopatías y enfermedades relacionadas - Google Patents

Abstract

Compuesto según la siguiente fórmula I, **(Ver fórmula)** sus enantiómeros individuales, sus diaestereoisómeros individuales, sus hidratos, sus solvatos, sus formas cristalinas, sus tautómeros individuales o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que: A se selecciona del grupo que consiste en arilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido y alquenilo opcionalmente sustituido; R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H y alquilo opcionalmente sustituido; L es ; Ra y Rb son iguales o diferentes el uno del otro y se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, halo, alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroalquilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido, y en la que Ra y Rb pueden estar opcionalmente unidos entre sí para formar un anillo carbocíclico o heterocíclico; en la que "opcionalmente sustituido" se refiere a sustitución opcional con uno o varios grupos seleccionados independientemente de: grupo alquilo C1-6, heteroalquilo C1-6, carbociclilo C1-6, heterociclilo C1-5 y heteroarilo C1-5, cada uno de los cuales puede estar sustituido por uno o varios átomos de halógeno y/o grupos hidroxilo; un átomo de halógeno; un grupo ciano; un grupo amino primario, secundario o terciario; un grupo hidroxilo; y un grupo carboxilo.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevos inhibidores de glutaminil ciclasas bacterianas para su uso en el tratamiento de periodontopatías y enfermedades relacionadas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos compuestos que son particularmente útiles como inhibidores de glutaminil ciclasas bacterianas (bacQC); a composiciones farmacéuticas que comprenden tales compuestos; a compuestos y/o a composiciones farmacéuticas para su uso en métodos para el tratamiento, en particular, para su uso en el tratamiento de periodontitis y estados relacionados. La presente divulgación también se refiere a cristales que comprenden glutaminil ciclasas bacterianas y a métodos para la identificación de compuestos candidatos que pueden estar asociados con el bolsillo de unión de bacQC y/o que son inhibidores de bacQC.

Antecedentes de la técnica

Las periodontopatías son altamente prevalentes que afectan a aproximadamente el 30% de la población humana en todo el mundo, tienen un impacto considerable sobre los individuos y la sociedad y son costosas de tratar. El coste del cuidado dental es el cuarto más alto de todas las enfermedades y que consume entre el 5 y el 10% de todos los recursos de atención médica (Batchelor, P. British Dental Journal 2014, 217, 405-409). Estudios en poblaciones representativas muestran que las periodontopatías están ampliamente extendidas y su prevalencia ha aumentado desde 1997 (Micheelis, W. et al. Vierte Deutsche Mundgesundheitsstudie (DMS IV), Deutscher Árzte-Verlag, Colonia, 2006). Entre la población adulta en Alemania, se encontró que el 52,7% estaban afectados por formas de periodontitis moderadamente graves y el 20,5% por formas de periodontitis graves. El gasto de seguros médicos en Alemania para el tratamiento directo de periodontitis representa aproximadamente 1,100 millones de euros (Statistisches Bundesamt, 2008), sin incluir los costes incurridos por enfermedades secundarias.

La periodontitis es un término general que describe el estado de inflamación del aparato periodontal que está provocado por inducción multibacteriana y tiene fuertes relaciones con diversas enfermedades sistémicas, tales como enfermedades cardiovasculares, artritis reumatoide, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y enfermedad de Alzheimer.

La terapia actualmente establecida de periodontitis, según las recomendaciones de la Sociedad Alemana de Ciencias Dentales, Orales y Craneomandibulares, se realiza generalmente mediante desbridamiento supragingival y subgingival manual (retirada de las placas bacterianas) junto con la aplicación de sustancias antisépticas (desinfección diaria mediante lavados bucales), que disgrega toda la biopelícula oral y proporciona una oportunidad para la recolonización por potenciales patógenos. Además, la terapia con antibióticos de amplio espectro sistémica adyuvante se aplica en formas avanzadas de la enfermedad. Esto último también conduce a una destrucción no selectiva de la biopelícula y ha de administrarse en altas dosis y a lo largo de un periodo de tiempo prolongado con el fin de alcanzar niveles terapéuticos suficientes en el sitio de acción particular, es decir, el bolsillo gingival. La terapia adyuvante convencional de periodontitis implica, por ejemplo, la administración sistémica de doxiciclina (por vía oral) 1 x 200 mg/día durante 1 día y 2 x 100 mg/día durante 18 días adicionales (Wissenschaftliche Stellungnahme: Adjuvante Antibiotika in der Parodontitistherapie, Deutsche Gesellschaft für Zahn- Mund- und Kieferheilkunde, DZZ 2003). Como resultado, se observa el desarrollo de resistencia en patógenos orales. Además, se destruye el microbioma en el intestino del paciente, lo que conduce a una pérdida de soporte metabólico, modulación inmunitaria, y permite la recolonización por potenciales patógenos. Una terapia centrada y dirigida junto con la conservación de la biopelícula restante representaría una mejora significativa en el tratamiento de periodontitis y estados asociados con la misma.

La presencia de bacterias periodontopatógenas varía entre pacientes con periodontitis. No obstante, se ha encontrado que la aparición de determinadas especies bacterianas en las placas subgingivales está estrechamente asociada con la etiología de periodontopatías (Socransky et al., Journal of Clinical Periodontology, 1998, 25, 134-144).

El documento WO 02/068409 A1 describe compuestos eficaces como antagonistas de NR2B de NMDA útiles para el alivio del dolor, por ejemplo, un derivado de 1H-imidazo[4,5-b]piridin-5-ilo que tiene además un grupo SO2 entre un resto piperidin-1,4-diílo y un resto 2-feniletilo. El documento WO 2016/171755 A1 se refiere a inhibidores de proteínas isocitrato deshidrogenasas mutantes (mt-IDH) con actividad neomórfica útiles en el tratamiento de trastornos y cánceres de proliferación celular, por ejemplo, un derivado de 1H-imidazo[4,5-c]piridin-4-ilo. El documento WO 2008/028617 A1 describe compuestos adecuados para la inhibición de proteína cinasas para el control y/o la prevención de afecciones como el cáncer que tienen un grupo C(O) (es decir, un grupo de unión amida) que conecta un resto de 3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-ilo y un resto de fenilo sustituido. El documento US 4 977 144 A describe determinados derivados de imidazo[4,5-b]piridina como ligandos de receptores de adenosina para el tratamiento de estados en mamíferos que responden a la actividad agonista de adenosina-2, por ejemplo, estados cardiovasculares tales como hipertensión, trombosis y ateroesclerosis. Los derivados de 3H-imidazo[4,5-b]piridina descritos en ese documento están sustituidos en la posición 5 y, además, tienen un grupo amino en la posición 7.

Por tanto, existe una alta demanda para el desarrollo de nuevos tratamientos para la periodontitis y estados relacionados capaces de seleccionar como diana selectivamente patógenos que inducen una periodontopatía, a la vez que son esencialmente inactivos en proteínas diana humanas homólogas y, preferiblemente, conservan sustancialmente la parte restante de la biopelícula que se produce de manera natural. Tal tratamiento proporcionaría una mejora significativa a los pacientes y sistemas de atención médica.

Problemas que van a resolverse mediante la invención

En vista de lo anterior, la presente invención tiene como objetivo identificar y proporcionar compuestos y/o composiciones farmacéuticas útiles en el tratamiento de periodontopatías y enfermedades relacionadas. Preferiblemente, dichos compuestos y/o dichas composiciones farmacéuticas deben ser capaces de seleccionar como diana selectivamente patógenos que inducen una periodontopatía. Más preferiblemente, la parte restante de la biopelícula que se produce de manera natural debe conservarse sustancialmente; no deben inhibirse sustancialmente proteínas diana humanas homólogas. Incluso más preferiblemente, los compuestos y/o las composiciones farmacéuticas deben mostrar altas actividades in vivo contra los patógenos seleccionados como diana.

Un objeto adicional en la presente divulgación es la preparación de un cristal y/o cocristal de la(s) proteína(s) diana terapéutica(s), que puede usarse para la identificación de inhibidores capaces de seleccionar como diana patógenos que inducen una periodontopatía, por ejemplo, por medio de diseño de fármacos basado en la estructura.

Un objeto adicional en la presente divulgación es proporcionar un método para la identificación de un compuesto candidato que puede estar asociado con un bolsillo de unión de dicha(s) proteína(s) diana terapéutica(s), compuesto que es preferiblemente un inhibidor de dicha proteína diana terapéutica.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un inhibidor de dicha(s) proteína(s) diana terapéutica(s), y una composición farmacéutica que comprende tal inhibidor. Dicho inhibidor debe ser preferiblemente un inhibidor selectivo, es decir, que destruye selectivamente o inhibe selectivamente el crecimiento de un(os) patógeno(s) bacteriano(s) diana a la vez que es sustancialmente inactivo hacia otras dianas proteicas bacterianas y/o humanas.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal, y/o un compuesto o una composición farmacéutica para su uso en tal método.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método para la terapia o profilaxis de una infección bacteriana, y/o un compuesto o una composición farmacéutica para su uso en tal método, preferiblemente destruyendo selectivamente o inhibiendo selectivamente el crecimiento de las especies bacterianas patógenas.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método para la terapia o profilaxis de una periodontopatía aguda, crónica o recurrente, y/o un compuesto o una composición farmacéutica para su uso en tal método.

En los métodos para el tratamiento según los objetos anteriores, la vía de administración debe ser preferiblemente administración tópica o administración sistémica, y los métodos son preferiblemente métodos no quirúrgicos.

Sumario de la invención

Como solución a los problemas formulados anteriormente, la presente divulgación proporciona un compuesto según una de las siguientes fórmulas I ó II,

sus enantiómeros individuales, sus diaestereoisómeros individuales, sus hidratos, sus solvatos, sus formas cristalinas, sus tautómeros individuales o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en las que L, A y R1 se definen según las reivindicaciones adjuntas.

La presente divulgación proporciona además una composición farmacéutica que comprende el compuesto tal como se definió anteriormente y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La presente divulgación proporciona además un compuesto tal como se definió anteriormente y/o una composición farmacéutica tal como se definió anteriormente, para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal; para su uso en un método para la terapia y/o profilaxis de una infección bacteriana; y para su uso en un método para la terapia y/o profilaxis de una periodontopatía aguda, crónica o recurrente.

La presente divulgación proporciona además un cristal que comprende una glutaminil ciclasa bacteriana (bacQC) seleccionada de PgQC y TfQC, y un cocristal que comprende además un compuesto candidato, preferiblemente un inhibidor de bacQC; así como métodos para la preparación de dicho cristal y/o cocristal.

La presente divulgación proporciona además métodos para la identificación de un compuesto candidato que puede estar asociado con el bolsillo de unión de bacQC, preferiblemente un inhibidor de bacQC.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra una alineación de secuencia de aminoácidos de QC humana (hQC, SEQ ID NO: 4) y supuestas glutaminil ciclasas bacterianas (QC, es decir, glutamina ciclotransferasas) de Porphyromonas gingivalis (PgQC, SEQ ID NO: 1) (A); una alineación de secuencia de aminoácidos de supuestas QC adicionales de Prevotella intermedia (PiQC, SEQ ID NO: 3), P. gingivalis (PgQC, SEQ ID NO: 1) y Tannerella forsythia (TfQC, SEQ ID NO: 2)) (B); numeración de aminoácidos de la secuencia de longitud completa (SEQ ID NO: 1) de glutaminil ciclasa (es decir, glutamina ciclotransferasa) de P. gingivalis (PgQC), aminoácidos 1-333 (C); y numeración de aminoácidos de la secuencia de longitud completa (SEQ ID NO: 2) de glutaminil ciclasa (es decir, glutamina ciclotransferasa) de T. forsythia (TfQC), aminoácidos 1-333 (D).

La figura 2 muestra SDS-PAGE de supuestas QC bacterianas recombinantes purificadas expresadas en E. coli Rosetta(DE3)pLysS.

La figura 3 muestra representaciones gráficas de Lineweaver-Burk para la ciclización catalizada por PgQC (A), PiQC (B) y TfQC (C) de H-Gln-AMC.

La figura 4 muestra representaciones gráficas de características v/S, Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee para la ciclización catalizada por PgQC de H-Gln-AMC en presencia del compuesto de referencia MWT-S-00431.

La figura 5 muestra la actividad PhoA en células de E. coli CC118 pGP1-2 permeabilizadas que expresan proteínas de fusión seqPgQC-'PhoA.

La figura 6 muestra representaciones de cintas para tres glutaminil ciclasas: PgQC (A); TfQC (B); hQC (C); y la superposición (D).

La figura 7 muestra superficies moleculares para tres glutaminil ciclasas en el cristal: PgQC (A); TfQC (B); y hQC (código de PDB 3SI0) (C). La superficie está coloreada en función de la lipofilicidad (verde: más lipófilo, violeta: más hidrófilo); el orificio central muestra el sitio activo.

La figura 8 muestra superficies moleculares para PgQC (A); TfQC (B); y hQC (C) en el cristal, en las que las áreas hidrófilas están destacadas en gris más oscuro (figuras superiores).

La figura 9 muestra superficies moleculares para PgQC (A); TfQC (B); y hQC (C) en el cristal, en las que las áreas lipófilas están destacadas en gris más oscuro (figuras inferiores).

La figura 10 muestra una comparación de los sitios activos y las superficies moleculares de PgQC y hQC.

Descripción detallada de la invención

Proteínas diana terapéuticas (bacQC)

Socransky et al. (Journal of Clinical Periodontology, 1998, 25 134-144) describieron que la aparición en las placas subgingivales del denominado “complejo rojo”, que consiste en el grupo estrechamente relacionado Tannerella forsythia, Porphyromonas gingivalis y Treponema denticola, se relaciona fuertemente con mediciones clínicas de periodontopatía y, en particular, con la profundidad del bolsillo y la hemorragia al sondaje.

Un complejo relacionado adicional (el denominado “complejo naranja”) incluye miembros de Fusobacterium subespecie nucleatum/periodonticum, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens y Peptostreptococcus micros. Se encontró que la colonización de sitios periodontales sanos por miembros del “complejo naranja” se correlaciona con la aparición de gingivitis. Además, las bacterias del “complejo naranja” fomentan la colonización por bacterias del “complejo rojo”, que a su vez están asociadas con bolsillos profundos y periodontitis crónica.

Las bacterias del “complejo rojo” y del “complejo naranja” secretan una variedad de factores virulentos. Por ejemplo, se encontró que P. gingivalis secreta cisteína proteasas tales como gingipaína, P. intermedia secreta proteasas de IgA salival y T. forsythia secreta glicosidasas.

Los presentes inventores encontraron sorprendentemente que aproximadamente el 80% de las proteínas secretadas que portan un péptido señal en el secretoma de los patógenos orales P. gingivalis, T. forsythia y P. intermedia se escinden en un enlace peptídico Xaa-Gln mediante una peptidasa señal. Los extremos N-terminales de las proteínas liberadas contienen un residuo pGlu. Esto implica la existencia de glutaminil ciclasas que parecen ser esenciales para la translocación de proteínas de crecimiento a través de la membrana externa y el crecimiento de dichos patógenos periodontales.

Las glutaminil ciclasas (QC) (EC 2.3.2.5), también denominadas glutamina ciclotransferasas, son aciltransferasas que catalizan la ciclización de residuos glutaminilo N-terminales de proteínas para dar piroglutamato (pGlu) bajo la liberación de NH3, modificándose de ese modo el extremo N-terminal de los péptidos:

Hasta la fecha se han definido dos tipos de QC (tipo I y tipo II). Las QC de tipo I se encontraron en plantas y en varias bacterias patógenas y parásitos humanos (Huang et al., J. Mol. Biol. 2010, 401, 374-388). La QC de la papaya (pQC) es la QC de tipo I mejor conocida. Esta enzima se descubrió por primera vez en el látex de la planta tropical Carica papaya (Messer, M. Nature 1963, 197, 1299). La enzima muestra actividad catalítica a lo largo de un amplio intervalo de pH (pH 3,5-11). Los análisis cristalográficos de rayos X revelaron que la pQC es una molécula con forma de sombrerera, que consiste en una hélice p de cinco palas atravesada por un canal central (Wintjens, R., Belrhali, H., Clantin, B., Azarkan, M., Bompard, C., Baeyens-Volant, D., Looze, Y., y Villeret, V. J. Mol. Biol. 2006, 357, 457-470). La pQC contiene un ion de zinc, pero no se inhibe en absoluto por quelantes heterocíclicos (Zerhouni et al,. Biochim. Biophys. Acta 1998, 1387, 275-290) y, por tanto, se asume que el zinc solo tiene una función estructural y estabilizante. La pQC es altamente resistente a desnaturalizaciones proteolíticas, químicas y térmicas (Wintjens et al., Zerhouni et al.)

Las QC de tipo II se identificaron principalmente en los tejidos neuroendocrinos de mamíferos. Entre las QC de tipo II, la QC humana (hQC) es la más extensamente estudiada, que se sabe que es importante en la maduración de numerosos neuropéptidos y citocinas en sus rutas secretoras. A diferencia de las QC de tipo I, la hQC es bastante susceptible a la desnaturalización química y térmica. Schilling et al., 2003 (J. Biol. Chem. 2003, 278, 49773-49779) han mostrado que la hQC era significativamente inestable por encima de pH 8,5 y por debajo de pH 6,0. La hQC adopta una topología a/p (Huang et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2005, 102, 13117-13122) y se identificó como una metaloenzima, tal como se sugiere por la inhibición dependiente del tiempo por parte de los quelantes heterocíclicos. La enzima inactivada puede restaurarse por completo mediante la adición de Zn2+ en presencia de concentraciones equimolares de EDTA (Schilling et al., 2003). Por tanto, las QC de tipo II son transferasas dependientes de metal, lo que sugiere que el metal (Zn2+) unido al sitio activo es esencial para la actividad catalítica, a diferencia de las QC de tipo I, en las que el zinc sólo tiene una función estructural y estabilizante.

En resumen, las QC de tipo I se encuentran generalmente en plantas, varias bacterias y protozoos; muestra estructuras de hélice P; alta resistencia frente a la proteolisis, el calor y el ácido; la actividad catalítica óptima es a pH 3,5-11; y poseen un ion Ca2+ / Zn2+ estructural.

En cambio, las QC de tipo II se encuentran principalmente en vertebrados; muestran topologías a/p; baja resistencia frente a la proteolisis, el calor y el ácido; la actividad catalítica óptima es a pH 6,0-8,0; y existe un ion Zn2+ catalíticamente esencial. Por tanto, las glutaminil ciclasas de tipo II son aciltransferasas dependientes de zinc.

Los presentes inventores encontraron sorprendentemente que las QC de tipo II se expresan en los patógenos orales P. gingivalis, T. forsythia y P. intermedia.

La estructura primaria de la proteína QC de P. gingivalis (PgQC, SEQ ID NO: 1) tiene una identidad del 25% con respecto a la Qc humana (hQC, SEQ ID NO: 4). Además, se identificaron la QC de P. intermedia (PiQC, SEQ ID NO: 3) y de T. forsythia (TfQC, SEQ ID NO: 2), que comparten una identidad con respecto a PgQC del 42% y del 49%, respectivamente. De hecho, evidencias experimentales adicionales muestran que estas enzimas pertenecen a la familia de QC de tipo II, tal como se confirmó, entre otros, por la dependencia del pH y de la fuerza iónica de la actividad de bacQC, la inhibición de la actividad de QC por parte de quelantes de metales, los patrones de plegamiento de las tres proteínas sugieren una topología a/p, tal como indica el análisis espectroscópico mediante CD, y su estabilidad térmica.

Los presentes inventores encontraron que las QC de tipo II bacterianas se expresan en y son esenciales para el crecimiento de 2 de las 3 especies bacterianas que provocan periodontitis del “complejo rojo”, así como al menos una especie bacteriana del “complejo naranja” y, por tanto, son de crucial importancia como diana para el desarrollo de un inhibidor terapéutico con propiedades antibióticas para el tratamiento de enfermedades y estados de periodontitis.

Por tanto, en el contexto del presente documento, las proteínas diana terapéuticas son glutaminil ciclasas bacterianas (bacQC), en las que una bacQC se define como un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 (también denominada PgQC), SEQ ID NO: 2 (también denominada TfQC), SEQ ID NO: 3 (también denominada PiQC) y una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 90% o más con respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

Las bacQC pueden identificarse, aislarse y purificarse y usarse para identificar inhibidores capaces de seleccionar como diana selectivamente de patógenos que inducen periodontitis, tal como se describe adicionalmente en los ejemplos en el presente documento. Con fines de comparar dos o más secuencias de aminoácidos, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos (porcentaje de “ identidad de secuencia”) puede determinarse mediante métodos convencionales, por ejemplo, por medio de algoritmos de alineación de secuencias convencionales conocidos en el estado de la técnica, tales como, por ejemplo, BLAST (Altschul S.F. et al. J Mol Biol. 1990, 215(3), 403-10).

Compuestos

Usando los métodos para la identificación de compuestos candidatos y/o inhibidores divulgados en el presente documento, los presentes inventores han identificado ahora un nuevo grupo como motivo estructural principal para el diseño y la preparación de inhibidores potentes y terapéuticamente eficaces de glutaminil ciclasas bacterianas. Dicho motivo estructural es un grupo imidazo[4,5-b]piridina tal como se muestra a continuación (que incluye la numeración de los átomos de anillo):

Este motivo estructural representa un grupo de unión a metal adecuado capaz de unirse de manera reversible al ion Zn2+ ubicado en el bolsillo de unión de las bacQC. Preferiblemente, cuando el grupo imidazo[4,5-b]piridina está sustituido en la posición 6 del anillo de piridina, puede lograrse una selectividad y actividad inhibidora de bacQC particularmente altas.

Más preferiblemente, el grupo unido al grupo imidazo[4,5-b]piridina es o bien una bencilamina o bien una sulfonamida aromática, cada una unida mediante el átomo de N al anillo de piridina. En cambio, se encontró que el uso de amidas aromáticas en su lugar proporciona una actividad débil y, por tanto, se prefieren menos. Dicho de otro modo, preferiblemente, Ra y Rb no representan juntos =O.

En una realización preferida adicional, los compuestos comprenden un resto representado por la siguiente estructura E:

La presencia de este resto potencia la captación de los compuestos inhibidores según la presente invención en las células de bacterias que expresan glutaminil ciclasas de tipo II (tales como P. gingivalis, T. forsythia y P. intermedia), que reconocen, captan de manera activa y capturan el resto porfirina anterior por medio de un sistema independiente de metal (por ejemplo, el dominio HA2, que es un receptor tanto para hemo como para hemoglobina) y/o un sistema dependiente de metal (por ejemplo, HusA, que es una proteína de unión a porfirina de tipo hemófora capaz de reconocer el grupo anterior). Por tanto, la conjugación de un inhibidor de la fórmula general I ó II con un resto representado por la estructura E proporciona una administración dirigida y potenciada a las células patógenas, una selectividad mejorada para los patógenos orales diana y/o una actividad antibiótica in vivo mejorada frente a estos patógenos. Estos efectos son particularmente pronunciados cuando un resto representado por la estructura E está unido al grupo A del inhibidor mediante un grupo de unión representado por la estructura E, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Específicamente, la presente divulgación proporciona compuestos según uno cualquiera de los siguientes aspectos <1>-<19>.

<1> Un compuesto según una de las siguientes fórmulas I ó II,

sus enantiómeros individuales, sus diaestereoisómeros individuales, sus hidratos, sus solvatos, sus formas cristalinas, sus tautómeros individuales o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en las que:

A se selecciona del grupo que consiste en arilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido y alquenilo opcionalmente sustituido;

R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H y alquilo opcionalmente sustituido;

L se selecciona

Ra y Rb son iguales o diferentes el uno del otro y se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, halo, alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroalquilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido, y en las que Ra y Rb pueden estar opcionalmente unidos entre sí para formar un anillo carbocíclico o heterocíclico.

<2> El compuesto según el aspecto <1>, en el que:

dicho arilo es independientemente un grupo arilo C6-10, preferiblemente C6;

dicho heterociclilo es independientemente un grupo heterocíclico monocíclico o bicíclico C1-11, preferiblemente C2-8, más preferiblemente C4-5 que comprende de 1 a 4 heteroátomos de anillo seleccionados de N, S y O;

dicho alquilo es independientemente un grupo alquilo lineal o ramificado, de cadena abierta o cíclico C1-6, preferiblemente C1-4, más preferiblemente C1-3, incluso más preferiblemente C1-2;

dicho cicloalquilo es independientemente un grupo alquilo cíclico C3-6, preferiblemente C4-6, más preferiblemente C5-6; dicho alquenilo es independientemente un grupo lineal o ramificado, de cadena abierta o cíclico C2-6, preferiblemente C2-4, más preferiblemente C2 que comprende al menos un enlace C=C;

dicho heteroarilo es independientemente un grupo heterocíclico aromático, monocíclico o bicíclico C1-11, preferiblemente C2-8, más preferiblemente C4-5 que comprende de 1 a 4 heteroátomos de anillo seleccionados de N, S y O; y

dicho heteroalquilo es independientemente un grupo heteroalquilo lineal o ramificado, de cadena abierta o cíclico C1-5, preferiblemente C1-3, más preferiblemente C1-2 que comprende de 1 a 4 heteroátomos seleccionados de N, S y O. <3> El compuesto según uno cualquiera de los aspectos <1> a <2>, que está representado por una de las siguientes fórmulas la, IIa, Ib y IIb, preferiblemente la:

en las que A se selecciona de arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido; y

R1, Ra y Rb son H.

<4> El compuesto según uno cualquiera de los aspectos <1> a <3>, en el que Ra y Rb se seleccionan independientemente de 1H y D.

<5> El compuesto según uno cualquiera de los aspectos <1> a <4>, en el que o bien uno de Ra y Rb es 1H y el otro es D; o bien cada uno de ellos es 1H; o bien cada uno de ellos es D.

<6> El compuesto según uno cualquiera de los aspectos <1> a <5>, en el que:

A está representado por una de las siguientes estructuras A-1 a A-7;

en las que Y se selecciona de O y S; y

R2 a R6 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, fluoro, cloro, bromo, yodo, alquilo, arilo, heteroarilo, alcoxilo, ariloxilo, (aminoalquil)oxilo, (heteroaril)oxilo, amino, (dialquil)amino, (monoalquil)amino, (alquil)(heteroalquil)amino, (diheteroalquil)amino, [(alquil)oxi]carbonilo y haloalquilo, cada uno de los cuales puede estar además opcionalmente sustituido.

<7> El compuesto según el aspecto <6>, en el que o bien:

(a) R4, o bien

(b) R3, o bien

(c) R3 y R4

se selecciona(n) cada uno independientemente del grupo que consiste en fluoro, cloro, bromo, yodo, alquilo, arilo, heteroarilo, alcoxilo, ariloxilo, (aminoalquil)oxilo, (heteroaril)oxilo, amino, (dialquil)amino, (monoalquil)amino, (alquil)(heteroalquil)amino, (diheteroalquil)amino, [(alquil)oxi]carbonilo y haloalquilo, cada uno de los cuales puede estar además opcionalmente sustituido;

y los restantes de R2 a R6 son H.

<8> El compuesto según uno cualquiera de los aspectos <6> a <7>, en el que

al menos uno de R2, R3, R4, R5 y R6 está independientemente representado por la siguiente estructura B:

en la que n = 1, 2, 3, 4, 5 ó 6;

R7 y R8 se seleccionan independientemente de alquilo, arilo, heteroalquilo, heteroarilo, carbamimidoílo, formilo, alquiladlo y arilacilo, cada uno puede estar además opcionalmente sustituido, y en la que R7 y R8 pueden estar opcionalmente unidos entre sí para formar un anillo carbocíclico o heterocíclico.

<9> El compuesto según uno cualquiera de los aspectos <6> a <8>, en el que:

R1, Ra y Rb son H; y

A está representado por la estructura A-1.

<10> El compuesto según uno cualquiera de los aspectos <1> a <7>, en el que A está sustituido por al menos un sustituyente representado por la siguiente estructura B:

en la que n = 1, 2, 3, 4, 5 ó 6; y

R7 y R8 se seleccionan independientemente de alquilo, arilo, heteroalquilo, heteroarilo, carbamimidoílo, formilo, alquilacilo y arilacilo, cada uno de los cuales puede estar además opcionalmente sustituido, y en la que R7 y R8 pueden estar opcionalmente unidos entre sí para formar un anillo carbocíclico o heterocíclico.

<11> El compuesto según uno cualquiera de los aspectos <8> a <10>, en el que R7 está representado por la siguiente estructura E:

en la que M se selecciona de Fe2+ y Fe3+ o está ausente;

Rc y Rd se seleccionan independientemente de -H, -CH3, -CH=CH2, -SO3H y-CH(OH)CH2OH; y

X se selecciona de un enlace covalente, un grupo alquileno, aralquileno, heteroalquileno, carbocicleno, heterocicleno, heteroarileno, heteroaralquileno, aminoalquileno, alquilamino y carbonil-alquilamino; en la que cada uno de estos puede tener hasta 12 átomos de carbono y hasta 11 heteroátomos en la cadena principal, y puede estar sustituido por uno o más grupo(s) alquilo C1-6, grupo(s) heteroalquilo C1-6, grupo(s) carbociclilo C1-6, grupo(s) heterociclilo C1-5, grupo(s) heteroarilo C1-5, átomo(s) de halógeno, grupo(s) hidroxilo, grupo(s) ciano, grupo(s) amino primario, secundario y terciario, grupo(s) carboxilo y una(s) cadena(s) lateral(es) derivada(s) de aminoácido(s) proteinogénico(s) o no proteinogénico(s).

<12> El compuesto según el aspecto <11>, en el que X está representado por la siguiente estructura:

en la que m = 0, 1, 2 ó 3, y

Re es una cadena lateral derivada de un aminoácido proteinogénico.

<13> El compuesto según uno cualquiera de los aspectos <1> a <12>, en el que A está sustituido por un sustituyente representado por la siguiente estructura F:

en la que M se selecciona de Fe2+ y Fe3+ o está ausente; y

Rc y Rd se seleccionan independientemente de -H, -CH3, -CH=CH2, -SO3H y-CH(OH)CH2OH.

<14> El compuesto según el aspecto <13>, en el que A es tal como se define según el aspecto <6>, y en el que al menos uno de R2, R3, R4, R5 y R6 está representado por la estructura F.

<15> El compuesto según uno cualquiera de los aspectos <1> a <14>, en el que A está sustituido por al menos un sustituyente representado por la siguiente estructura E1:

en la que M se selecciona de Fe2+ y Fe3+ o está ausente;

Rc y Rd se seleccionan independientemente de -H, -CH3, -CH=CH2, -SO3H y-CH(OH)CH2OH; y

X se selecciona de un enlace covalente, O, NH, un grupo alquileno, aralquileno, heteroalquileno, carbocicleno, heterocicleno, heteroarileno, heteroaralquileno, aminoalquileno, alquilamino y carbonil-alquilamino; en la que cada uno de estos puede tener hasta 12 átomos de carbono y hasta 11 heteroátomos en la cadena principal, y puede estar sustituido por uno o más grupo(s) alquilo C1-6, grupo(s) heteroalquilo C1-6, grupo(s) carbociclilo C1-6, grupo(s) heterociclilo C1.5, grupo(s) heteroarilo C1.5, átomo(s) de halógeno, grupo(s) hidroxilo, grupo(s) ciano, grupo(s) amino primario, secundario y terciario, grupo(s) carboxilo y una(s) cadena(s) lateral(es) derivada(s) de aminoácido(s) proteinogénico(s) o no proteinogénico(s).

<16> El compuesto según uno cualquiera de los aspectos <1> a <15>, en el que

A se selecciona del grupo que consiste en alcoxiarilo, (alcoxi)(halo)arilo, (alcoxi)heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, aminoarilo, aminoheteroarilo, arilarilo, arilheteroarilo, (ariloxi)arilo, (ariloxi)heteroarilo, haloarilo, haloheteroarilo, (heteroalquil)arilo, (haloalquil)arilo, (heteroaril)arilo, [(heteroaril)oxi]arilo, [(aminoalquil)oxi]arilo, arilo, heteroarilo, cicloalquilo y heterocicloalquilo, cada uno de los cuales puede estar además opcionalmente sustituido.

<17> El compuesto según uno cualquiera de los aspectos <1> a <16>, en el que:

A se selecciona del grupo que consiste en 2-alcoxifenilo, 3-alcoxifenilo, 4-alcoxifenilo, 2,3-dialcoxifenilo, 2,4-dialcoxifenilo, 2,5-dialcoxifenilo, 2,6-dialcoxifenilo, 3,4-dialcoxifenilo, 3,5-dialcoxifenilo, 3,4,5-trialcoxifenilo, 2,6-dihalo-4-alcoxifenilo, 2-halo-4-alcoxifenilo, 3-halo-5-alcoxifenilo, 4-halo-3-alcoxifenilo, 2-alquilfenilo, 3-alquilfenilo, 4-alquilfenilo, 3-[(alquil)(heteroalquil)amino]fenilo, 3-[(dialquil)amino]fenilo, 3-[(diheteroalquil)amino]fenilo, 3-[(monoalquil)amino]fenilo, 4-[(alquil)(heteroalquil)amino]fenilo, 4-[(dialquil)amino]fenilo, 4-[(diheteroalquil)amino]fenilo, 4- [(heteroaril)oxi]fenilo, 4-[(monoalquil)amino]fenilo, arilfenilo, 2-(ariloxi)fenilo, 3-(ariloxi)fenilo, 4-(ariloxi)fenilo, 2-halofenilo, 3-halofenilo, 4-halofenilo, 2,3-dihalofenilo, 2,4-dihalofenilo, 2,5-dihalofenilo, 2,6-dihalofenilo, 3,4-dihalofenilo, 3,5-dihalofenilo, 2,3,4-trihalofenilo, 2,3,5-trihalofenilo, 3,4,5-trihalofenilo, 2,4,5-trihalofenilo, 2,4,6-trihalofenilo, 3-(haloalquil)fenilo, 4-(haloalquil)fenilo, 3-(monoheteroaril C5)fenilo, 4-(monoheteroaril C5)fenilo, 3-(monoheteroaril C4)fenilo, 4-(monoheteroaril C4)fenilo, 3-[(heteroaril)oxi]fenilo, 4-{[amino(alquil)]oxi}fenilo, 3-{[amino(alquil)]oxi}fenilo, naftilo, fenilo, monoheteroarilo C5, monoheteroarilo C4, morfolinilo y piperidinilo, cada uno de los cuales puede estar además opcionalmente sustituido.

<18> El compuesto según uno cualquiera de los aspectos <1> a <17>, en el que:

A se selecciona del grupo que consiste en 2-metoxifenilo, 3-metoxifenilo, 4-propoxifenilo, 4-metoxifenilo, 4-isopropoxifenilo, 4-benciloxifenilo, 3,4-dimetoxifenilo, 2,3-dihidro-1,4-benzodioxin-6-ilo, 2,2-difluoro-1,3- benzodioxol-5- ilo, 7-metoxi-1,3-benzodioxol-5-ilo, 2,6-difluoro-4-metoxi-fenilo, 3-(1-piperidil)fenilo, 4-morfolinofenilo, [1,1'-bifenil]-3-ilo, [1,1'-bifenil]-4-ilo, 3-fenoxifenilo, 4-fenoxifenilo, 2-clorofenilo, 3-clorofenilo, 4-clorofenilo, 3,4-diclorofenilo, 3,4,5-trifluorofenilo, 4-(2-piridil)fenilo, 4-(2-carbamimidamidoetiloxi)fenilo, 4-(2-aminoetoxi)fenilo, 4-(2-morfolinoetoxi)fenilo, fenilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-tienilo y 3-tienilo.

<19> Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

La expresión “alquilo”, tal como se usa en el presente documento, a menos que se limite específicamente, indica un grupo alquilo C1-12, de manera adecuada un grupo alquilo C1-8, por ejemplo, un grupo alquilo C1-6, por ejemplo, un grupo alquilo C1-4. Los grupos alquilo pueden ser de cadena lineal o ramificados. Los grupos alquilo adecuados incluyen, por ejemplo, metilo, etilo, propilo (por ejemplo, n-propilo e isopropilo), butilo (por ejemplo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo y terc-butilo), pentilo (por ejemplo, n-pentilo), hexilo (por ejemplo, n-hexilo), heptilo (por ejemplo, n-heptilo) y octilo (por ejemplo, n-octilo). El término “alquilo” también comprende grupos cicloalquilo. La expresión “cicloalquilo”, a menos que se limite específicamente, indica un grupo cicloalquilo C3-10 (es decir, de 3 a 10 átomos de carbono de anillo), de manera más adecuada un grupo cicloalquilo C3-8, por ejemplo, un grupo cicloalquilo C3-6. Los grupos cicloalquilo a modo de ejemplo incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo. Un número de átomos de carbono de anillo más adecuado es de tres a seis.

La expresión “heteroalquilo”, a menos que se limite específicamente, se refiere a un grupo alquilo en el que uno o más átomos de carbono, preferiblemente 1, 2 ó 3, se reemplazan por heteroátomos seleccionados de N, S y O.

Las expresiones “carbociclilo” y “carbocíclico”, a menos que se limite específicamente, indican cualquier sistema de anillo en el que todos los átomos de anillo son carbono y que contiene entre tres y doce átomos de carbono de anillo, de manera adecuada entre tres y diez átomos de carbono y de manera más adecuada entre tres y ocho átomos de carbono. Los grupos carbociclilo pueden estar saturados o parcialmente insaturados, pero no incluyen anillos aromáticos. Los ejemplos de grupos carbociclilo incluyen sistemas de anillo monocíclicos, bicíclicos y tricíclicos, en particular sistemas de anillo monocíclicos y bicíclicos. Otros grupos carbociclilo incluyen sistemas de anillo de puente (por ejemplo, biciclo[2.2.1]heptenilo). Un ejemplo específico de un grupo carbociclilo es un grupo cicloalquilo. Un ejemplo adicional de un grupo carbociclilo es un grupo cicloalquenilo.

La expresión “arilo”, a menos que se limite específicamente, indica un grupo arilo C6-12, de manera adecuada un grupo arilo C6-10, de manera más adecuada un grupo arilo C6-8. Los grupos arilo contendrán al menos un anillo aromático (por ejemplo, uno, dos o tres anillos). Un ejemplo de un grupo arilo típico con un anillo aromático es fenilo. Un ejemplo de un grupo arilo típico con dos anillos aromáticos es naftilo.

Las expresiones “heterociclilo” y “heterocíclico”, a menos que se limite específicamente, se refieren a un grupo carbociclilo en el que uno o más (por ejemplo, 1, 2 ó 3) átomos de anillo se reemplazan por heteroátomos seleccionados de N, S y O. Un ejemplo específico de un grupo heterociclilo es un grupo cicloalquilo (por ejemplo, ciclopentilo o más particularmente ciclohexilo) en el que uno o más (por ejemplo, 1, 2 ó 3, particularmente 1 ó 2, especialmente 1) átomos de anillo se reemplazan por heteroátomos seleccionados de N, S u O. Los grupos heterociclilo a modo de ejemplo que contienen un heteroátomo incluyen pirrolidina, tetrahidrofurano y piperidina, y los grupos heterociclilo a modo de ejemplo que contienen dos heteroátomos incluyen morfolina y piperazina. Un ejemplo específico adicional de un grupo heterociclilo es un grupo cicloalquenilo (por ejemplo, un grupo ciclohexenilo) en el que uno o más (por ejemplo, 1, 2 ó 3, particularmente 1 ó 2, especialmente 1) átomos de anillo se reemplazan por heteroátomos seleccionados de N, S y O. Un ejemplo de un grupo de este tipo es dihidropiranilo (por ejemplo, 3,4-dihidro-2H-piran-2-ilo).

La expresión “heteroarilo”, a menos que se limite específicamente, indica un residuo arilo en el que uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4, de manera adecuada 1, 2 ó 3) átomos de anillo se reemplazan por heteroátomos seleccionados de N, S y O, o de lo contrario un anillo aromático de 5 miembros que contiene uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4, de manera adecuada 1, 2 ó 3) átomos de anillo seleccionados de N, S y O. Los grupos heteroarilo representan un subtipo particular dentro de la clase general de grupos “heterociclilo” o “heterocíclicos”. Los grupos heteroarilo monocíclicos a modo de ejemplo que tienen un heteroátomo incluyen: anillos de cinco miembros (por ejemplo, pirrol, furano, tiofeno); y anillos de seis miembros (por ejemplo, piridina tal como piridin-2-ilo, piridin-3-ilo y piridin-4-ilo). Los grupos heteroarilo monocíclicos a modo de ejemplo que tienen dos heteroátomos incluyen: anillos de cinco miembros (por ejemplo, pirazol, oxazol, isoxazol, tiazol, isotiazol, imidazol tal como imidazol-1-ilo, imidazol-2-ilo, imidazol-4-ilo); anillos de seis miembros (por ejemplo, piridazina, pirimidina, pirazina). Los grupos heteroarilo monocíclicos a modo de ejemplo que tienen tres heteroátomos incluyen: 1,2,3-triazol y 1,2,4-triazol. Los grupos heteroarilo monocíclicos a modo de ejemplo que tienen cuatro heteroátomos incluyen tetrazol. Los grupos heteroarilo bicíclicos a modo de ejemplo incluyen: indol (por ejemplo, indol-6-ilo), benzofurano, benzotiofeno, quinolina, isoquinolina, indazol, bencimidazol, benzotiazol, quinazolina y purina.

Las expresiones “alcoxiarilo”, “carboxiarilo”, “cianoarilo”, “haloarilo”, “hidroxiarilo” y “heteroarilarilo”, a menos que se limite específicamente, indican un residuo arilo que está sustituido con al menos un grupo alcoxilo, carboxilo, ciano, halo, hidroxilo y heteroarilo, respectivamente.

Las expresiones “alcoxiheteroarilo”, “carboxiheteroarilo”, “cianoheteroarilo”, “haloheteroarilo” e “hidroxiheteroarilo”, a menos que se limite específicamente, indican un residuo heteroarilo que está sustituido con al menos un grupo alcoxilo, carboxilo, ciano, halo e hidroxilo, respectivamente.

La expresión “alc” o “alq”, por ejemplo, en las expresiones “alcoxilo”, “haloalquilo”, debe interpretarse según la definición de “alquilo”. Los grupos alcoxilo a modo de ejemplo incluyen metoxilo, etoxilo, propoxilo (por ejemplo, npropoxilo), butoxilo (por ejemplo, n-butoxilo), pentoxilo (por ejemplo, n-pentoxilo), hexoxilo (por ejemplo, n-hexoxilo), heptoxilo (por ejemplo, n-heptoxilo) y octoxilo (por ejemplo, n-octoxilo). Los grupos haloalquilo a modo de ejemplo incluyen fluoroalquilo, por ejemplo, CF3; los grupos haloalcoxilo a modo de ejemplo incluyen fluoroalquilo, por ejemplo, OCF3.

El término “halógeno” o “halo” comprende flúor (F), cloro (CI), bromo (Br) y yodo (I).

Los términos “hidrógeno” o “H”, tal como se usan en el presente documento, abarcan todos los isótopos de hidrógeno, en particular, protio (1H) y deuterio (2H, también indicado como D)

El término “opcionalmente sustituido” se refiere una sustitución opcional con uno o varios grupos seleccionados independientemente de: grupo alquilo C1-6, heteroalquilo C1-6, carbociclilo C1-6, heterociclilo C1-5 y heteroarilo C1-5, cada uno de los cuales puede estar sustituido con uno o varios átomos de halógeno y/o grupos hidroxilo; un átomo de halógeno; un grupo ciano; un grupo amino primario, secundario o terciario; un grupo hidroxilo; y un grupo carboxilo.

Estereoisómeros

En la presente invención se incluyen todos los posibles estereoisómeros de los compuestos reivindicados.

Cuando los compuestos según esta invención tienen al menos un centro quiral, pueden existir por consiguiente como enantiómeros. Cuando los compuestos poseen dos o más centros quirales, pueden existir adicionalmente como diastereómeros. Debe entenderse que todos de tales isómeros y mezclas de los mismos están abarcados dentro del alcance de la presente invención.

Cuando los procedimientos para la preparación de los compuestos según la invención dan lugar a una mezcla de estereoisómeros, estos isómeros pueden separarse mediante técnicas convencionales tales como cromatografía preparativa. Los compuestos pueden prepararse en forma racémica, o pueden prepararse enantiómeros individuales o bien mediante síntesis enantioespecífica o bien mediante resolución. Los compuestos pueden resolverse, por ejemplo, para dar sus enantiómeros componentes mediante técnicas convencionales, tales como la formación de pares diastereoméricos mediante formación de sales con un ácido ópticamente activo, tal como ácido (-)-di-p-toluoild-tartático y/o ácido (+)-di-p-toluoil-l-tartático, seguido por cristalización fraccionada y regeneración de la base libre, o mediante formación de sales con una base ópticamente activa, tal como quinina, quinidina, quinotoxina, cincotoxina, (S)-feniletilamina, (1R,2S)-efedrina, (R)-fenilglicinol, (S)-2-aminobutanol, seguido por cristalización fraccionada y regeneración del ácido libre. Los compuestos también pueden resolverse mediante la formación de ésteres o amidas diastereoméricos, seguido por separación cromatográfica y retirada del agente auxiliar quiral. Alternativamente, los compuestos pueden resolverse usando una columna de HPLC quiral.

Formas cristalinas polimorfas, solvatos, hidratos

Además, algunas de las formas cristalinas individuales de los compuestos pueden existir como polimorfos y, como tal, se pretende que estén incluidos en la presente invención. Además, algunos de los compuestos pueden formar solvatos con agua (es decir, hidratos) o disolventes orgánicos comunes, y también se pretende que tales solvatos estén abarcados dentro del alcance de esta invención. Los compuestos, incluyendo sus sales, también pueden obtenerse en forma de sus hidratos, o incluir otros disolventes usados para su cristalización. En vista de la íntima relación entre los compuestos libres y los compuestos en forma de sus sales, hidratos o solvatos, siempre que se haga referencia a un compuesto en este contexto, también se hace a una sal, un solvato o un polimorfo correspondiente, siempre que sea posible o apropiado dadas las circunstancias.

Tautómeros

Tal como se usa en el presente documento, el término “tautómero” se refiere a la migración de protones entre enlaces sencillos y dobles adyacentes. El procedimiento de tautomerización es reversible. Los compuestos descritos en el presente documento pueden experimentar cualquier posible tautomerización que se encuentre dentro de las características físicas del compuesto.

Sales farmacéuticamente aceptables

Tal como se usa en el presente documento, el término “farmacéuticamente aceptable” engloba tanto uso humano como veterinario. Por ejemplo, el término “farmacéuticamente aceptable” engloba un compuesto veterinariamente aceptable o un compuesto aceptable en atención médica y medicina humana.

Las sales, los hidratos y los solvatos de los compuestos de fórmula I y los derivados fisiológicamente funcionales de los mismos que son adecuados para su uso en medicina son aquellos en los que el contraión o disolvente asociado es farmacéuticamente aceptable. Sin embargo, las sales, los hidratos y los solvatos que tienen contraiones o disolventes asociados que no son farmacéuticamente aceptables se encuentran dentro del alcance de la presente invención, por ejemplo, para su uso como productos intermedios en la preparación de otros compuestos y sus sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptables.

Las sales adecuadas según la invención incluyen aquellas formadas con ácidos o bases o bien orgánicos o bien inorgánicos. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas a partir de ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, cítrico, tartático, fosfórico, láctico, pirúvico, acético, trifluoroacético, trifenilacético, sulfámico, sulfanílico, succínico, oxálico, fumárico, maleico, málico, mandélico, glutámico, aspártico, oxaloacético, metanosulfónico, etanosulfónico, arilsulfónico (por ejemplo, p-toluenosulfónico, bencenosulfónico, naftalenosulfónico o naftalenodisulfónico), salicílico, glutárico, glucónico, tricarbalílico, cinámico, cinámico sustituido (por ejemplo, cinámico sustituido con fenilo, metilo, metoxilo o halo, incluyendo ácido 4-metilcinámico y 4-metoxicinámico), ascórbico, oleico, naftoico, hidroxinaftoico (por ejemplo, 1- ó 3-hidroxi-2-naftoico), naftalenoacrílico (por ejemplo, naftalenos-acrílico), benzoico, 4-metoxibenzoico, 2- ó 4-hidroxibenzoico, 4-clorobenzoico, 4-fenilbenzoico, bencenoacrílico (por ejemplo, 1,4-bencenodiacrílico), ácidos isetiónicos, perclórico, propiónico, glicólico, hidroxietanosulfónico, pamoico, ciclohexanosulfámico, salicílico, sacarínico y trifluoroacético. Las sales de base farmacéuticamente aceptables incluyen sales de amonio, sales de metales alcalinos, tales como aquellas de sodio y potasio, sales de metales alcalinotérreos, tales como aquellas de calcio y magnesio, y sales con bases orgánicas, tales como diciclohexilamina y N-metil-D-glucamina.

Se pretende que todas las formas de sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la presente invención estén englobadas por el alcance de la presente invención.

Composiciones farmacéuticas

La composición farmacéutica según la presente invención comprende un compuesto tal como se describió anteriormente y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Tal como se usa en el presente documento, el término “composición farmacéutica” pretende abarcar un producto que comprende los compuestos reivindicados en cantidades terapéuticamente eficaces, así como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de las combinaciones de los compuestos reivindicados. Tal como se usa en el presente documento, el término “excipiente” se refiere a un portador, un aglutinante, un disgregante y/o un aditivo adecuado adicional para formulaciones galénicas, por ejemplo, para preparaciones orales líquidas, tales como suspensiones, elixires y disoluciones; y/o para preparaciones orales sólidas, tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas, cápsulas de gelatina y comprimidos. Los portadores, que pueden añadirse a la mezcla, incluyen excipientes farmacéuticos necesarios e inertes, incluyendo, pero sin limitarse a, agentes de suspensión, lubricantes, aromatizantes, edulcorantes, conservantes, recubrimientos, agentes de granulación, tintes y agentes colorantes adecuados.

Aplicaciones terapéuticas

La presente divulgación proporciona un compuesto, por ejemplo, un compuesto según uno cualquiera de los aspectos <1>-<19> anteriores, y/o una composición farmacéutica tal como se describió anteriormente para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal. La presente divulgación también proporciona un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal, en el que el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho compuesto o dicha composición a un sujeto que lo necesita.

La presente divulgación proporciona además un compuesto y/o una composición farmacéutica tal como se describió anteriormente para su uso en un método para la terapia o profilaxis de una infección bacteriana. La presente divulgación también proporciona un método para la terapia o profilaxis de una infección bacteriana, en el que el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho compuesto o dicha composición a un sujeto que lo necesita. La infección bacteriana está provocada preferiblemente por una bacteria que expresa una glutaminil ciclasa bacteriana de tipo II (bacQC). Más preferiblemente, la infección bacteriana está provocada por una bacteria seleccionada del grupo que consiste en los géneros Porphyromonas, Prevotella y Tannerella, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en las especies Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia y Tannerella forsythia.

Preferiblemente, el compuesto inhibidor de bacQC o la composición farmacéutica usada en los métodos según la presente divulgación destruye selectivamente o inhibe selectivamente el crecimiento de una bacteria seleccionada del grupo que consiste en los géneros Porphyromonas, Prevotella y Tannerella, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en las especies Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia y Tannerella forsythia, dentro de una biopelícula, mientras que, preferiblemente, las bacterias restantes dentro de la biopelícula permanecen esencialmente intactas (es decir, se destruyen o se inhibe su crecimiento hasta un grado significativamente menor). Dicha biopelícula es preferiblemente una biopelícula compleja, más preferiblemente una biopelícula que se produce de manera natural e incluso más preferiblemente una biopelícula oral que se produce de manera natural.

La presente divulgación proporciona además un compuesto inhibidor de bacQC o una composición farmacéutica para su uso en un método para la terapia o profilaxis de un estado periodontal o una periodontopatía aguda, crónica o recurrente. Las principales categorías de estados periodontales y periodontopatías se clasifican en los grupos de enfermedades gingivales inducidas por la placa dental, periodontitis crónica, periodontitis agresiva, periodontitis como manifestación de enfermedades sistémicas, periodontopatías necrosantes, abscesos del periodonto, periodontitis asociada con lesiones endodóncicas, mucositis periimplantaria, periimplantitis e infecciones endodóncicas. En la presente divulgación, la periodontopatía aguda, crónica o recurrente se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en enfermedades gingivales inducidas por la placa dental, periodontitis crónica, periodontitis agresiva, periodontitis como manifestación de enfermedades sistémicas, periodontopatías necrosantes, abscesos del periodonto, periodontitis asociada con lesiones endodóncicas, mucositis periimplantaria, periimplantitis e infecciones endodóncicas. La presente divulgación también proporciona un método para la terapia o profilaxis de una periodontopatía aguda, crónica o recurrente que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en enfermedades gingivales inducidas por la placa dental, periodontitis crónica, periodontitis agresiva, periodontitis como manifestación de enfermedades sistémicas, periodontopatías necrosantes, abscesos del periodonto, periodontitis asociada con lesiones endodóncicas, mucositis periimplantaria, periimplantitis e infecciones endodóncicas, en el que el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto inhibidor de bacQC o una composición farmacéutica según la presente divulgación a un sujeto que lo necesita. Por ejemplo, en Armitage, A. Ann Periodontol 1999, 4, 1-6 se describen periodontopatías agudas, crónicas o recurrentes adicionales.

En una realización de la presente divulgación, el compuesto o la composición farmacéutica según la presente divulgación se usa preferiblemente en cualquiera de los métodos descritos anteriormente, en los que la vía de administración es administración tópica y/o en los que el método es un método no quirúrgico. En otra realización, el compuesto inhibidor o la composición farmacéutica según la presente divulgación se usa preferiblemente en cualquiera de los métodos descritos anteriormente, en los que la vía de administración es administración sistémica y/o en los que el método es un método no quirúrgico.

El término “sujeto”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un animal, preferiblemente a un mamífero, lo más preferiblemente a un humano, que es o ha sido objeto de tratamiento, terapia, profilaxis, observación o experimentación.

El término “cantidad terapéuticamente eficaz”, tal como se usa en el presente documento, significa aquella cantidad de compuesto activo o agente farmacéutico que provoca la respuesta biológica o medicinal en un sistema tisular, de animal o de ser humano, buscada por un investigador, veterinario, médico u otro clínico, que incluye el alivio de los síntomas de la enfermedad o el trastorno que está tratándose.

Cristales proteicos

La presente divulgación proporciona cristales de glutaminil ciclasas bacterianas (bacQC).

Las coordenadas atómicas en la estructura cristalina de PgQC se muestran en la tabla 1 en las páginas 21-42 de la solicitud de patente europea EP18158343 presentada ante la Oficina Europea de Patentes el 23 de febrero de 2018, cuya prioridad se reivindica mediante la presente solicitud y a la que se hace referencia en el presente documento; o alternativamente, en la base de datos de proteínas RCSB (www.rcsb.org) con el código de identificación PDB 6QQL, depositado el 19 de febrero de 2019. En una realización, el cristal que comprende una glutaminil ciclasa bacteriana (bacQC) es un cristal que comprende una PgQC, siendo la PgQC un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 90% o más con respecto a SEQ ID NO: 1, y que tiene preferiblemente:

- las coordenadas atómicas según la tabla 1 del documento EP18158343 o el código 6QQL tal como se mencionó anteriormente, o en las que la desviación cuadrática media de los átomos de la estructura principal de la cadena de polipéptido según la tabla 1 del documento EP18158343 o el código 6QQL tal como se mencionó anteriormente es de 2 A o menos, y/o

- un bolsillo de unión definido por los residuos Gln133; Asp149; Glu182; Asp183; Tyr187; Gly188; Asp189; Asp190; Trp193; Cys194; Asp218; Met219; Phe232; Gly263; Ala264; Leu265; Thr266; Asp267; Val270; Ile284; Tyr286; Asn290; Glu291; His292; Gly293; Phe294; Trp298; His299 de SEQ ID NO: 1, y/o

- el grupo espacial P 312 1 y unas dimensiones de la celda unitaria de a = 89,9 A, b = 89,9 A, c = 164,7 A, a = 90°, P = 90° y y =120°.

Además, preferiblemente, el cristal de PgQC difracta rayos X para la determinación de las coordenadas atómicas del cristal a una resolución de entre 2,81 y 44,95 A.

Las coordenadas atómicas en la estructura cristalina de TfQC se muestran en la tabla 2 en las páginas 43-91 de la solicitud de patente europea EP18158343 presentada ante la Oficina Europea de Patentes el 23 de febrero de 2018, cuya prioridad se reivindica mediante la presente solicitud y a la que se hace referencia en el presente documento; o alternativamente, en la base de datos de proteínas RCSB (www.rcsb.org) con el código de identificación PDB 6QRO, depositado el 19 de febrero de 2019.

En otra realización, el cristal que comprende una glutaminil ciclasa bacteriana (bacQC) puede ser un cristal que comprende una TfQC, siendo la TfQC un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 0 una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 90% o más con respecto a SEQ ID NO: 2, y que tiene preferiblemente:

- las coordenadas atómicas según la tabla 2 del documento EP18158343 o el código 6QQL tal como se mencionó anteriormente, o en las que la desviación cuadrática media de los átomos de la estructura principal de la cadena de polipéptido según la tabla 2 del documento EP18158343 o el código 6QQL tal como se mencionó anteriormente es de 3 A o menos, y/o

- un bolsillo de unión definido por los residuos His126; Arg130; His135; Glu183; Asp184; Gly186; Thr187; Glu189; Lys195; Pro196; Asp197; Trp199; Asp224; Met225; Gly269; Ala270; Ile271; Val272; Gln276; Tyr277; Ile290; Tyr292; Gln297; Ser298; Gly299; Phe300; Trp304; His305 de SEQ ID NO: 2, y/o

- el grupo espacial P 1 y unas dimensiones de la celda unitaria de a = 56,1 A, b = 79,2 A, c = 83,1 A, a = 89,9°, P = 90,0° y y =71,9°.

Además, preferiblemente, el cristal de TfQC difracta rayos X para la determinación de las coordenadas atómicas del cristal a una resolución de entre 2,10 y 38,28 A.

La desviación cuadrática media de los átomos de la estructura principal de la cadena de polipéptido puede determinarse como una desviación cuadrática media posicional a partir de las coordenadas estructurales de los átomos de la estructura principal Ca equivalentes tras la alineación estructural de la estructura que va a compararse con la estructura de la proteína según la presente invención y usando el programa DALI (L. Holm y C. Sander, Science, 1996, vol. 273, 595-602).El término “bolsillo de unión”, tal como se usa en el presente documento, incluye referencias a una región específica (o un átomo) en una entidad molecular que es capaz de entrar en la interacción estabilizante con otra entidad molecular. En determinadas realizaciones, el término también se refiere a las partes reactivas de una macromolécula que participan directamente en su combinación específica con otra molécula. En una realización alternativa, un sitio de unión comprende o está definido por la disposición tridimensional de uno o más residuos de aminoácido dentro de un polipéptido plegado. Lo más preferiblemente, el bolsillo de unión de las bacQC descritas en el presente documento está definido, respectivamente, por los átomos de los residuos enumerados para cada una de las bacQC anteriores.

En una realización particular de la invención, el cristal que comprende una glutaminil ciclasa bacteriana (bacQC) es un cristal que comprende un fragmento de polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos truncada de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 90% o más con respecto a una secuencia de aminoácidos truncada de SEQ Id NO: 1. Dicha secuencia de aminoácidos truncada de SEQ ID NO: 1 se obtiene mediante deleción de 1 a 132, preferiblemente de 1 a 20, más preferiblemente de 2 a 10 aminoácidos consecutivos comenzando a partir del extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y/o mediante deleción de 1 a 34, preferiblemente de 1 a 10, más preferiblemente de 2 a 5 aminoácidos consecutivos comenzando a partir del extremo C-terminal de SEQ ID NO: 1.

En otra realización particular de la invención, el cristal que comprende una glutaminil ciclasa bacteriana (bacQC) es un cristal que comprende un fragmento de polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos truncada de SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 90% o más con respecto a una secuencia de aminoácidos truncada de SEQ Id NO: 2. Dicha secuencia de aminoácidos truncada de SEQ ID NO: 2 se obtiene mediante deleción de 1 a 125, preferiblemente de 1 a 21, más preferiblemente de 2 a 10 aminoácidos consecutivos comenzando a partir del extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y/o mediante deleción de 1 a 29, preferiblemente de 1 a 10, más preferiblemente de 2 a 5 aminoácidos consecutivos comenzando a partir del extremo C-terminal de SEQ ID NO: 2.

En aún otra realización, se proporciona un cocristal que comprende una bacQC tal como se describió anteriormente junto con un compuesto candidato. El compuesto candidato está preferiblemente unido a un bolsillo de unión de la bacQC. Además, el compuesto candidato es preferiblemente un inhibidor de bacQC. Lo más preferiblemente, el compuesto candidato es un compuesto según una de las fórmulas I ó II tal como se especifica en uno cualquiera de los aspectos <1> a <19>.

Los cristales y cocristales según la presente invención son preferiblemente de calidad y tamaño suficientes para permitir la determinación de la estructura tridimensional mediante difracción de rayos X de una glutaminil ciclasa bacteriana a una resolución de aproximadamente 1,9 A a aproximadamente 2,8 A.

Ambas estructuras cristalinas comparten un pliegue de a/p-hidrolasa, que está determinado por una lámina P de 8 hebras rodeada por 7 hélices a. En ambos casos, el ion de Zn se coordina de manera tetraédrica con 2 aspartatos y 1 histidina, respectivamente. El cuarto sitio de coordinación lo ocupa una molécula de agua, el sustrato o un grupo de unión de metales como parte subestructural de un inhibidor. Estas interacciones con metales de un pequeño grupo y el ion de Zn son esenciales para el diseño de un compuesto activo usado como agente antibacteriano frente a los patógenos mencionados en el presente documento. Además, los sitios de unión están formados por áreas hidrófobas e hidrófilas que son diferentes en comparación con la enzima humana y que son responsables de generar la selectividad para las enzimas bacterianas (véanse las figuras 7-10).

Los cristales y cocristales según la presente invención pueden prepararse mediante métodos discontinuos, de puente de líquido, de diálisis, de difusión de vapor, tales como difusión de vapor de gota colgante o asentada, tal como se describe adicionalmente a continuación.

Un método preferido para la preparación del cristal de bacQC tal como se definió anteriormente comprende las etapas de:

(a) proporcionar una disolución que comprende una bacQC tal como se definió anteriormente, preferiblemente en presencia de NaCl 150 mM, en un tampón adecuado tal como Tris-HCI 50 mM pH 8,0;

(b) mezclar dicha disolución con una misma cantidad de disolución de cristalización que comprende (i) HEPES 1 M pH 8,0, sulfato de amonio 2 M, PEG400 al 3% (v/v) en el caso de PgQC; o (ii) acetato de sodio 0,1 M pH 4,6, sulfato de amonio 2 M en el caso de TfQC; y

(c) incubar la mezcla obtenida en condiciones para fomentar la difusión de vapor de gota colgante o asentada durante un tiempo suficiente para obtener el cristal de la bacQC.

Un método para la preparación del cocristal de una bacQC junto con un compuesto candidato comprende las etapas:

(a) proporcionar una disolución que comprende una bacQC tal como se definió anteriormente, preferiblemente PgQC, y un compuesto candidato disueltos en HCl 100 mM, en una razón molar de bacQC:compuesto = 1:2,3;

(b) mezclar dicha disolución con una misma cantidad de disolución de cristalización que comprende HEPES 1 M pH 8,0, sulfato de amonio 2 M, PEG400 al 3% (v/v); y

(c) incubar la mezcla obtenida en condiciones para fomentar la difusión de vapor de gota colgante o asentada durante un tiempo suficiente para obtener el cocristal de la bacQC y el compuesto candidato.

Otro método para la preparación del cocristal de una bacQC junto con un compuesto candidato comprende las etapas:

(d) proporcionar una disolución como reserva de siembra de bacQC recogida y triturada, preferiblemente cristal de TfQC sin compuesto candidato producido tal como se definió anteriormente;

(e) proporcionar una disolución que comprende una bacQC tal como se definió anteriormente y un compuesto candidato disueltos en HCl 100 mM, en una razón molar de bacQC:compuesto = 1:1,2;

(f) mezclar dicha disolución con una misma cantidad de disolución de cristalización que comprende PIPES de potasio 1 M pH 6,6 o pH 6,8, PEG600 al 32,5% (v/v), NaCl 0,1 M y disolución de reserva de siembra al 15%;

(g) incubar la mezcla obtenida en condiciones para fomentar la difusión de vapor de gota colgante o asentada durante un tiempo suficiente para obtener el cocristal de la bacQC y el compuesto candidato.

Métodos para la identificación de inhibidores y/o compuestos candidatos

La presente invención proporciona un método para la identificación de un compuesto candidato que puede estar asociado con un bolsillo de unión de una bacQC, que comprende las siguientes etapas:

(a) generar un modelo tridimensional de la bacQC respectiva usando las coordenadas estructurales descritas en la tabla 1 del documento EP18158343 o el código 6QQL tal como se mencionó anteriormente o 2,

(b) analizar el bolsillo de unión proporcionado por los residuos Gln133; Asp149; Glu182; Asp183; Tyr187; Gly188; Asp189; Asp190; Trp193; Cys194; Asp218; Met219; Phe232; Gly263; Ala264; Leu265; Thr266; Asp267; Val270; Ile284; Tyr286; Asn290; Glu291; His292; Gly293; Phe294; Trp298; His299 de SEQ ID NO: 1 según las coordenadas de la tabla 1 del documento EP18158343 o el código 6QQL tal como se mencionó anteriormente, o analizar el bolsillo de unión proporcionado por los residuos His126; Arg130; His135; Glu183; Asp184; Gly186; Thr187; Glu189; Lys195; Pro196; Asp197; Trp199; Asp224; Met225; Gly269; Ala270; Ile271; Val272; Gln276; Tyr277; Ile290; Tyr292; Gln297; Ser298; Gly299; Phe300; Trp304; His305 de SEQ ID NO: 2 según las coordenadas de la tabla 2 del documento EP18158343 o el código 6QQ^l tal como se mencionó anteriormente;

(c) realizar un análisis de modelación por ordenador para identificar un compuesto candidato que puede estar asociado con un bolsillo de unión de la bacQC respectiva.

Preferiblemente, el método comprende además:

(d) verificar in vitro si el compuesto candidato reduce la actividad catalítica de la bacQC, clasificándose de ese modo un compuesto candidato que reduce la actividad catalítica de la bacQC como un inhibidor de bacQC.

La verificación de si un compuesto candidato reduce la actividad catalítica de la bacQC puede realizarse, por ejemplo, mediante un método para la identificación de un inhibidor de la bacQC que comprende las siguientes etapas (d1)-(d5): (d1) proporcionar una composición que comprende un sustrato de la bacQC y la bacQC;

(d2) proporcionar un compuesto candidato identificado en (c);

(d3) poner en contacto el compuesto candidato con la composición;

(d4) monitorizar la actividad catalítica de la bacQC;

(d5) clasificar el compuesto candidato como un inhibidor de la bacQC basándose en el efecto del compuesto candidato sobre la actividad catalítica de la bacQC, en el que un compuesto candidato que reduce la actividad catalítica de la bacQC se clasifica como un inhibidor de bacQC.

Dicha composición (en la etapa d1) puede ser una disolución acuosa, que comprende preferiblemente componentes de tampón y/o sal adecuados. Dicho sustrato es preferiblemente un péptido o derivado de péptido que comprende un residuo de glutamina en su extremo N-terminal. Dicho sustrato está preferiblemente marcado, más preferiblemente marcado isotópicamente, lo más preferiblemente un sustrato fluorógeno. El sustrato fluorógeno experimenta preferiblemente un cambio en la intensidad de fluorescencia después de convertirse en el transcurso de una reacción catalizada por una bacQC.

Un sustrato fluorógeno adecuado para monitorizar la actividad de bacQC es H-Gln-AMC, tal como se describe en Schilling, S., Hoffmann, T., Wermann, M., Heiser, U., Wasternack, C., y Demuth, H.-U. Anal. Biochem. 2002, 303, 49­ 56 (Schilling et al., 2002), tal como se muestra en el siguiente esquema:

bacQC pGAP

H-GIn-R -------------- ► pGlu-R NH3 ---------------► pGlu R í R = 7-amino-metilcumarina pGAP = piroglutamil aminopeptidasa El compuesto candidato puede ponerse en contacto antes de, simultáneamente con o después de la adición de los componentes restantes de la composición de la etapa (d1). El compuesto candidato se proporciona preferiblemente en disolución, más preferiblemente como una disolución en DMSO.

La conversión del sustrato se monitoriza a lo largo del tiempo, por ejemplo, monitorizando la emisión del fluoróforo generado mediante la escisión de un sustrato fluorógeno. La actividad de bacQC puede determinarse a partir de una curva patrón del AMC en las condiciones de ensayo.

La actividad catalítica de bacQC puede determinarse usando diferentes concentraciones de sustrato, bacQC y/o compuesto candidato. Las mediciones adecuadas de la actividad catalítica de bacQC son, por ejemplo, las constantes de inhibición (Ki), la actividad residual al 50% (AR) en presencia de una concentración dada de un compuesto candidato y/o los valores de CI50.

La presente invención proporciona además un método para la identificación de un compuesto candidato que se asocia con un bolsillo de unión de una bacQC, comprendiendo el método las siguientes etapas:

(a) generar un modelo tridimensional de un cocristal que comprende bacQC tal como se describió anteriormente junto con un compuesto candidato;

(b) analizar las distancias entre los átomos del compuesto candidato y los átomos del bolsillo de unión proporcionados por los residuos Gln133; Asp149; Glu182; Asp183; Tyr187; Gly188; Asp189; Asp190; Trp193; Cys194; Asp218; Met219; Phe232; Gly263; Ala264; Leu265; Thr266; Asp267; Val270; Ile284; Tyr286; Asn290; Glu291; His292; Gly293; Phe294; Trp298; His299 de SEQ ID NO: 1 o los átomos del bolsillo de unión proporcionados por los residuos XXXX His126; Arg130; His135; Glu183; Asp184; Gly186; Thr187; Glu189; Lys195; Pro196; Asp197; Trp199; Asp224; Met225; Gly269; Ala270; Ile271; Val272; Gln276; Tyr277; Ile290; Tyr292; Gln297; Ser 298; Gly299; Phe300; Trp304; His305 de SEQ ID NO: 2 para identificar un compuesto candidato que se asocia con el bolsillo de unión de la bacQC.

Preferiblemente, el método comprende además:

(c) verificar in vitro si el compuesto candidato reduce la actividad catalítica de la bacQC, clasificándose de ese modo un compuesto candidato que reduce la actividad catalítica de la bacQC como un inhibidor de bacQC.

La verificación de si un compuesto candidato reduce la actividad catalítica de la bacQC puede realizarse, por ejemplo, mediante un método para la identificación de un inhibidor de la bacQC que comprende las siguientes etapas (c1)-(c5):

(c1) proporcionar una composición que comprende un sustrato de la bacQC y la bacQC;

(c2 ) proporcionar un compuesto candidato identificado en (b);

(c3) poner en contacto el compuesto candidato con la composición;

(c4) monitorizar la actividad catalítica de la bacQC;

(c5) clasificar el compuesto candidato como un inhibidor de la bacQC basándose en el efecto del compuesto candidato sobre la actividad catalítica de bacQC, en el que un compuesto candidato que reduce la actividad catalítica de la bacQC se clasifica como un inhibidor de bacQC.

Ejemplos

I. Identificación y preparación de supuestas glutaminil ciclasas bacterianas (bacQC)

a) Identificación

El análisis bioinformático del secretoma de los patógenos orales P. gingivalis, T. forsythia y P. intermedia (http://www.oralgen.lanl.gov/) mostró que aproximadamente el 80% de las proteínas secretadas que portan un péptido señal se escinden en un enlace peptídico Xaa-Gln mediante la peptidasa señal. Los extremos N-terminales de las proteínas liberadas contienen un residuo pGlu. Esto implica la existencia de glutaminil ciclasas que parecen ser esenciales para la translocación de proteínas de crecimiento a través de la membrana externa y el crecimiento de patógenos periodontales.

La figura 1 muestra una alineación de secuencia de aminoácidos de QC humana (hQC, SEQ ID NO: 4) y una supuesta QC bacteriana de P. gingivalis (PgQC, SEQ ID NO: 1) (A), y una alineación de secuencia de aminoácidos de supuestas QC adicionales de P. intermedia (PiQC, SEQ ID n O: 3) y T. forsythia (TfQC, SEQ ID NO: 2) y P. gingivalis (PgQC, SEQ ID NO: 1) (B). La supuesta PgQC posee una identidad del 25% con respecto a la QC humana. Además, la supuesta TfQC muestra una identidad del 49% con respecto a PgQC y la QC de P. intermedia posee una identidad del 42% con respecto a PgQC. Los residuos de cisteína subrayados en gris reflejan puentes disulfuro en hQC, que no se encuentran en PgQC. Las secuencias en negrita en QC humana reflejan residuos altamente conservados de QC de tipo II. Las secuencias en gris describen supuestas secuencias señal de PgQC y hQC. Además, el típico motivo de unión de metal Asp-Glu-His se presenta en letras en negrita y subrayadas. También se identificó un supuesto motivo de unión de metal en TfQC y PiQC (B, letras en negrita). Se prepararon las alineaciones usando el programa Clustal Omega en EMBL-EBlnet; (*) indica las posiciones que tienen un único residuo completamente conservado, (:) indica la conservación entre grupos de propiedades fuertemente similares, (.) indica la conservación entre grupos de propiedades débilmente similares (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).

El análisis mediante BLAST reveló un marco de lectura abierto (ORF) que codifica para una supuesta proteína QC en P. gingivalis (WP_005874301). La estructura primaria de esta supuesta proteína Qc muestra una identidad del 25% con respecto a QC humana. Además, también se identificaron supuestas proteínas QC en el genoma de los patógenos orales P. intermedia (WP_014709208) y T. forsythia (WP_014225037), que comparten una identidad del 42% o del 49% con respecto a la supuesta QC de P. gingivalis (figura 1). Tal como se muestra mediante la alineación de aminoácidos, los residuos conservados de QC humana parecen ser diferentes en las QC bacterianas de aquellos residuos de cisteína conservados que forman enlaces disulfuro en QC de tipo II humanas y otras que supuestamente no están presentes en las tres supuestas QC bacterianas. Sin embargo, el motivo de unión de metal altamente conservado Asp144, Glu184 (Asp) e His322 de QC de tipo II (Wintjens et al., 2006) parece estar presente en supuestas QC bacterianas, lo que puede representar el centro catalítico. Las estructuras primarias de estas proteínas pueden proporcionar una indicación de que estas proteínas son QC reales.

b) Preparación

La figura 2 muestra SDS-PAGE de supuestas QC bacterianas recombinantes purificadas expresadas en E. coli Rosetta(DE3)pLysS y purificadas tal como se describe en detalle a continuación. Por tanto, se cargaron 30 |ig de proteína purificada a SDS-PAGE al 12% y se visualizó mediante tinción de Coomassie, carril 1, PageRuler Broad Range sin teñir (Thermofisher Scientific), carril 2, HisPgQC, carril 3, HisPiQC y carril 5, HisTfQC. Las tres supuestas QC bacterianas poseen una masa molecular teórica de “ 37 KDa.

aa) Cepas huésped y medios

Se usaron la cepa de E. coli DH5a o XL-1 blue (Stratagene) para los procedimientos de clonación. Se usó E. coli Rosetta(DE3)pLysS (Novagen) para la expresión de proteínas. Se realizó el ensayo de actividad fosfatasa alcalina en la cepa CC118 pGP1-2 (Tabor, S. y Richardson, C. C. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1985, 82, 1074-1078; Manoil, C., J. J. Mekalanos y Beckwith, J. J. Bacteriol. 1990, 172(2), 515-518). Se hicieron crecer todas las cepas de E. coli en medio Luria-Bertani tal como se indica a 20°C, 30°C o 37°C. Se añadieron antibióticos (ampicilina [de 50 a 125 mg/litro], cloramfenicol [de 15 a 30 mg/litro] y kanamicina [25 mg/litro]) cuando fue apropiado. Para la preparación de medios sólidos, se añadió agar al 1,5% (Roth) al caldo correspondiente.

bb) Clonación molecular de vectores plasmídicos que codifican para las QC bacterianas

Todos los procedimientos de clonación se realizaron aplicando técnicas de biología molecular convencionales. Para la expresión de proteínas, se amplificaron marcos de lectura abiertos (ORF) de PgQC (SEQ ID NO: 1, supuesta QC de P. gingivalis), PiQC (SEQ ID NO: 3, supuesta QC de P. intermedia) y TfQC (SEQ ID NO: 2, supuesta QC de T. forsythia) usando secuencias de ADN sintetizado adquiridas de Eurofins Genomics como moldes en una PCR para introducir un sitio de restricción Nhel/Ndel esencial para la clonación directa en el vector pET28a(+) (Novagen). Para la construcción de una proteína de fusión PgQC-'PhoA, se subclonó una supuesta pgQC con secuencia señal predicha en pET26b(+) mediante el sitio de restricción Nhel/Xhol usando el par de cebadores Ndel (directo) de seqpgQC y Xhol (inverso) de seqpgQC. Además, se amplificó pgQC con secuencia señal original que incluía un sitio de unión al ribosoma de un vector pET26b(+) usando el par de cebadores Notl (directo) de seqpgQC RBS y Xbal (inverso) de seqpgQC para clonar en el vector de expresión de phoA pECD637. Todos los cebadores para la clonación se adquirieron de Metabion y se describen en la tabla 1.

Tabla 1. Oligonucleótidos usados para la clonación de constructos de bacQC.

cc) Expresión de QC bacterianas como proteína de fusión con etiqueta His o como proteína de fusión 'PhoA Se transformó el vector de expresión pET28a(+)::pgQC en E. co liRosetta(DE3)pLysS. Se hicieron crecer bacterias en medio Luria-Bertani que contenía kanamicina (25 ig/m l) y cloramfenicol (15 ig/m l) a 37°C hasta que la densidad celular alcanzó una DO600 ~ 0,6. Se indujeron los cultivos con isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido 0,4 mM y se añadió el 2% (v/v) de volumen de etanol seguido por un tiempo de incubación durante 16 h a 20°C. Se recogieron los cultivos mediante centrifugación a 4°C y 3900 g durante 30 min y se almacenaron los sedimentos celulares a -20°.

Para la expresión de proteínas de fusión seqPgQC-'PhoA, se transformó el vector recombinante pECD637::seqpgQC en CC118 (que carece, por ejemplo, del gen phoA) junto con plásmido auxiliar pGP1-2. Se inocularon los cultivos a 30°C durante la noche. Además, durante la noche, se diluyeron los cultivos en medio Luria-Bertani recién preparado hasta una densidad óptica final (DO600) ~0,4 seguido por una incubación a 42°C durante 20 min para inducir la expresión de proteínas de fusión seqPgQC-'PhoA. Luego se inocularon los cultivos durante 2 h adicionales a 30°C. Finalmente, se determinó la densidad óptica DO600 usando un espectrofotómetro (BioRad) y se recogieron 200 | l de cultivos mediante centrifugación a 4°C y 16000 g durante 15 min para la determinación de la actividad PhoA.

dd) Purificación de QC bacterianas

Se suspendió el sedimento de un cultivo de 500 ml en 20 ml de tampón que consiste en Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM pH 8,0, DNasa 10 ig/m l y mezcla de cóctel de inhibidores de proteasas (minicomprimidos completos, sin EDTA, Roche). Se rompieron las células haciéndolas pasar a través de una prensa francesa (Thermo Scientific, Waltman, MA, EE.UU.) durante 3-4 veces. Se retiró el residuo celular mediante centrifugación a 4°C y 30000 g durante 30 min. Se diluyó 1:2 el sobrenadante con tampón de equilibrado y se cargó en una columna HisTrap de 5 ml (GE Healthcare). Se equilibró la columna con Tris-HCI 50 mM que contenía NaCl 150 mM pH 8,0. Después de lavar con varios volúmenes de columna de tampón de equilibrado y al menos con imidazol 20 mM, se eluyeron las proteínas usando gradientes de múltiples etapas, alcanzando una concentración final de imidazol 250 mM, mientras que la mayor parte de proteína pura ya se había eluido con imidazol aproximadamente 100 mM. Se agruparon todas las fracciones que contenían bacQC, se concentraron con Vivaspin 20 (Sartorius AG) y se aplicaron a una columna de desalación HiPrep 26/10 (GE, Healthcare), que se equilibró con Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM pH 8,0. Se analizó la purificación mediante SDS-PAGE y se determinó el contenido de proteínas mediante absorción a 280 nm usando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientifc) o según los métodos de Bradford o Gill y von Hippel (Bradford, M. M. 1976 Anal Biochem 72, 248-254; Gill, S.C. y von Hippel, P.H. 1989 Anal Biochem 182, 319-326). Finalmente, se congelaron por choque las proteínas de fusión de bacQC recombinantes purificadas en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C, o se añadió glicerol hasta una concentración final del 50% y almacenamiento a -20°C. Se retiraron las etiquetas His de las proteínas de fusión N-terminales usando 1 unidad de trombina por 1 mg de proteína de fusión (kit de captura de escisión de trombina, Novagen) en presencia de Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl22,5 mM a pH 8,0 seguido por una incubación durante 16 h a 4°C. Se retiró la trombina a través de la unión a estreptavidina-agarosa (kit de captura de escisión de trombina, Novagen) y se recuperaron las proteínas bacQC sin etiqueta His mediante filtración por centrifugación. Después de una etapa de desalación adicional usando HiPrep (26/10), se agruparon las fracciones de bacQC y se concentraron con Vivaspin 20 (Sartorius AG). Finalmente, se congelaron por choque las bacQC recombinantes en Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM pH 8,0 en nitrógeno líquido y almacenamiento a -80°C, o se añadió glicerol hasta una concentración final del 50% y almacenamiento a -20°C. Se expresó PiQC y se purificó del mismo modo que PgQC. Se expresó TfQC del mismo modo que PgQC y se purificó usando una columna HiTrap Talon (GE, Healthcare).

Conclusiones: todas las supuestas QC bacterianas se expresaron en E. coli Rosetta(DE3)pLysS sin secuencia señal como proteínas de fusión con etiqueta His N-terminal y se purificaron hasta homogeneidad mediante cromatografía de afinidad. Se aislaron 16-40 mg de proteínas de fusión con etiqueta His puras recombinantes a partir de aproximadamente 500 ml de cultivos de E. coli inducidos. Posteriormente, se escindió la etiqueta His de las proteínas de fusión mediante trombina seguido por la caracterización enzimática de estas supuestas Qc bacterianas.

II. Cristalización de proteínas

a) Cristalización de PgQC

Se obtuvieron cristales de calidad cristalográfica a partir de PgQC expresada y purificada tal como se describió anteriormente. Se cristalizó PgQC a una concentración de 90 |iM (2,3 mg/ml) en un plazo de 40 días a 15°C usando una técnica de difusión de vapor de gota colgante. En una gota, se mezcló 1 |il de disolución de proteína con un mismo volumen de tampón de cristalización que consistía en HEPES 0,1 M pH 8,0, PEG400 al 3% (v/v) y (NH4)2SO42 M. Para el procedimiento de cristalización, se colocó la gota que contenía la proteína en equilibrio de vapor con 500 |il de tampón de cristalización incluido en un depósito.

Antes de la medición mediante rayos X, se crioconservaron los cristales mediante inmersión rápida en tampón de cristalización que contenía glicerol al 18% (v/v) y, posteriormente, se ultracongelaron a -180°C. Se recogieron datos internamente a partir de un cristal de única difracción usando un detector CCD (SATURN 944+, Rigaku Europe) montado en una fuente de ánodo giratorio de cobre (RA Micro 007, Rigaku Europe). Después de eso, se procesaron, escalaron y combinaron los datos de difracción recogidos usando XDSGUI. Los cristales de PgQC medidos pertenecen grupo espacial trigonal P 31 2 1 con las constantes de celda a = 89,9 A, b = 89,9 A, c = 164,7 A y a = 90°, p = 90°, y = 120°. Contienen dos moléculas de PgQC en la unidad asimétrica y difractan a 2,8 A.

Se obtuvieron las fases iniciales para la estructura de PgQC mediante reemplazo molecular usando el programa PHASER MR a partir de la serie cristalográfica CCP4 y el modelo de búsqueda de PgQC con PQ 50, en el que se llevaron a cabo algunos ciclos de reconstrucción manual usando el programa COOT y refinado de probabilidad máxima usando REFMAC5. Se refine el modelo hasta un valor Rwork de 0,2428 y un valor Rfree de 0,30404. Para obtener un modelo de PgQC final, la repetición de ciclos de reconstrucción manual y refinado es suficiente.

b) Cristalización de TfQC

Se obtuvieron cristales de calidad cristalográfica a partir de TfQC expresada y purificada tal como se describió anteriormente. Pudo cristalizarse la proteína a una concentración de 9,91 mg/ml (279 |iM) en un plazo de 91 días a 15°C usando una técnica de difusión de vapor de gota asentada. Por tanto, se mezclaron 200 nl de proteína con un mismo volumen de tampón de cristalización que consistía en (NH4)2SO42 M y acetato de sodio 0,1 M pH 4,6, en una gota que permanecía en contacto mediante difusión de vapor con un depósito que contenía 55 |il de tampón de cristalización.

Antes de la medición mediante rayos X, se crioconservaron los cristales mediante inmersión rápida en tampón de cristalización que contenía etilenglicol al 25% (v/v) y, posteriormente, se ultracongelaron a -180°C. Se recogieron internamente los siguientes datos a partir de un cristal de única difracción usando un detector CCD (SATURN 944+, Rigaku Europe) montado en una fuente de ánodo giratorio de cobre (RA Micro 007, Rigaku Europe).

Se procesaron, escalaron y combinaron los datos de difracción obtenidos usando el programa XDSGUI. Los cristales de TfQC pertenecen al grupo espacial triclínico P1 con las constantes de celda a = 56,1 A, b = 79,2 A, c = 83,1 A y a = 89,9°, p = 90°, y = 71,9°. Contienen cuatro moléculas de TfQC en la unidad asimétrica y difractan a 2,1 A.

Se obtuvieron las fases iniciales de la estructura de TfQC estimada mediante reemplazo molecular usando PHASER MR a partir de la serie cristalográfica CCP4. Para esta estrategia de solución hubo que generar un modelo de búsqueda adecuado, ya que en ese momento no existía ningún modelo de TfQC. Se preparó este modelo a partir de uno inicial de PgQC con Pq 50 mediante recorte de cadenas laterales usando el programa SCULPTOR de la serie PHENIX. Se obtuvo el modelo de TfQC final después de repetir ciclos de reconstrucción manual usando el programa COOT y refinado de probabilidad máxima usando PHENIX.REFINE. Se refinó hasta un valor Rwork de 0,1938 y un valor Rfree de 0,2404.

III. Ensayo fluorométrico para determinar la actividad de glutaminil ciclasas

Se evaluó la actividad de QC usando H-Gln-AMC como sustrato (tal como se describió previamente en Schilling et al., 2002).

El ensayo consiste en una concentración variable del sustrato fluorógeno y 0,5 U de piroglutaminil aminopeptidasa en Tris-HCl 50 mM, NaCl 50 mM a pH 8,0. Después de un tiempo de incubación de 10 minutos a 30°C, se inició la reacción mediante la adición de bacQC hasta un volumen final de 125 |il de mezcla de reacción. La longitud de onda de excitación/emisión fue de 380/460 nm. Se determinó la actividad de bacQC a partir de una curva de calibración del AMC fluoróforo en las condiciones de ensayo. Todas las determinaciones se llevaron a cabo en placas de microtitulación de 96 pocillos (Fisher Scientific) a 30°C usando FluoStar Optima (BMG Labtech). Se evaluaron los datos cinéticos usando el software GraFit (versión 7, Erithacus software Ltd., Horley, RU).

La figura 3 muestra representaciones gráficas de Lineweaver-Burk para la ciclización catalizada por PgQC (A), PiQC (B) y TfQC (C) de H-Gln-AMC. El recuadro muestra una representación gráfica secundaria de las pendientes obtenidas de la evaluación de Lineweaver-Burk. Medición de la actividad de bacQC llevada a cabo en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y Tris-HCI 50 mM a 30°C. Se evaluaron los datos cinéticos usando el software GraFit (versión 7, Erithacus software Ltd., Horley, RU). Se determinaron los parámetros enzimáticos de las QC bacterianas (tabla 2), que difieren de aquellos de hQC (Schilling, S., Manhart, S., Hoffmann, T., Ludwig, H.-H., Wasternack, C., y Demuth, H.-U. Biol. Chem. 2003, 384, 1583-1592).

Tabla 2. Parámetros cinéticos para la conversión de H-Gln-AMC mediante QC bacterianas. La determinación de los parámetros cinéticos se llevó a cabo en Tris-HCI 50 mM pH 8 y NaCl 50 mM a 30°C.

Conclusiones: se sometieron a prueba proteínas recombinantes purificadas para determinar la actividad enzimática usando un ensayo fluorométrico con HGln-AMC como sustrato. Estas proteínas bacterianas renovaron H-Gln-AMC como sustrato, dando como resultado un aumento de URF y, por tanto, un aumento de la tasa de reacción (figura 3). La afinidad por H-Gln AMC como sustrato es, en el caso de PgQC y PiQC, aproximadamente diez veces inferior a la de hQC para este sustrato. El valor Km de TfQC es en realidad 20 veces superior al valor Km de hQC. Además, la eficiencia de las proteínas bacterianas parece ser similar a la de hQC, con lo cual PiQC posee un número de renovación dos veces superior en comparación con PgQC o TfQC.

IV. Ensayo de inhibición para determinar la actividad de glutaminil ciclasas bacterianas

Para las pruebas de inhibición, la composición de las muestras fue la misma que se describió anteriormente, excepto por la adición del supuesto compuesto inhibidor. Esto dio como resultado la presencia de DMSO al 1% o al 2% (v/v) en la mezcla de reacción. Se determinaron las constantes de inhibición usando diferentes concentraciones de H-Gln-AMC que oscilaban desde 1/4 Km-2 Km. La concentración final de la QC bacteriana estaba en el intervalo de entre 25 nM-50 nM. Se evaluó la constante de inhibición ajustando el conjunto de curvas de progreso a la ecuación general para la inhibición competitiva usando el software GraFit (versión 7, Erithacus software Ltd., Horley, RU).

La figura 4 muestra representaciones gráficas de características v/S, Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee a modo de ejemplo para la ciclización catalizada por PgQC de H-Gln-AMC (A) en presencia de (•) 1 |iM, (□) 0,5 |iM, (■) 0,25 |iM, (A) 0,125 |aM y (▲) 0,063 p,M de compuesto de referencia MWT-S-00431 ((3,5-diclorofenil-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona). (o) representa la reacción sin inhibidor. Se llevaron a cabo las determinaciones en Tris-Hcl 50 mM, NaCl 50 mM pH 8,0 y DMSO al 1% (v/v) a 30°C. Se obtuvieron los parámetros cinéticos mostrados en la tabla 3.

Tabla 3. Parámetros cinéticos para la inhibición de la conversión de H-Gln-AMC por PgQC en presencia de compuesto de referencia MWT-S-00431.

V. Inhibición de glutaminil ciclasas por los compuestos

Se sintetizaron los siguientes compuestos tal como se describe en la descripción de métodos de síntesis a continuación. Se midieron los valores K¡ promedio para la inhibición de PgQC (aislada y purificada, tal como se describió anteriormente), TfQC, PiQC y hQC usando el ensayo de inhibición anterior y se muestran en. Ki se refiere a los valores Ki promedio medidos tal como se describió anteriormente, y desv.est.(Ki) se refiere a la desviación estándar de Ki.

Tabla 4. Inhibición de PgQC, TfQC, PiQC y hQC por inhibidores de bacQC.

Conclusión: todos los compuestos según la presente invención muestran actividad inhibidora frente a glutaminil ciclasas bacterianas. Los resultados anteriores muestran que los compuestos y/o las composiciones farmacéuticas son útiles en el tratamiento de periodontopatías y enfermedades relacionadas. En particular, los compuestos y/o las composiciones farmacéuticas son capaces de seleccionar como diana selectivamente patógenos que inducen una periodontopatía (P. gingivalis, T. forsythia y P. intermedia) a la vez que son esencialmente inertes con respecto al homólogo de la enzima humana.

Además, se encontró que cuando la parte restante de la biopelícula que se produce de manera natural debería conservarse sustancialmente. Incluso más preferiblemente, los compuestos y/o las composiciones farmacéuticas deberían mostrar altas actividades in vivo frente a los patógenos seleccionados como diana.

Además, se encontró que cuando dichos patógenos se incrustan dentro de una biopelícula (por ejemplo, una biopelícula compleja, una biopelícula que se produce de manera natural o una biopelícula oral que se produce de manera natural), preferiblemente, las bacterias restantes dentro de la biopelícula permanecen esencialmente intactas a los compuestos según la presente invención (es decir, se destruyen o se inhibe su crecimiento hasta un grado significativamente menor).

Tal como puede observarse a partir de los datos experimentales anteriores, puede lograrse una actividad inhibidora particularmente alta cuando el núcleo de imidazo[4,5-b]piridina está sustituido en la posición 6 (es decir, según la fórmula I, como en el ejemplo 2), a diferencia de la sustitución en la posición 5 (es decir, según la fórmula II, como en el ejemplo 1). No obstante, en ambos casos se observa una actividad inhibidora de bacQC significativa y selectividad para PgQC con respecto a la enzima humana hQC (tabla 5).

Tabla 5. Comparación de los parámetros de inhibición de los compuestos de los ejemplos 1 y 2.

Finalmente, en vista del grado de homología relativamente alto entre PiQC y las otras dos bacQC (tal como se muestra en la figura 1), también puede esperarse que los compuestos identificados como inhibidores de PgQC y/o TfQC usando los métodos de la presente invención muestren una actividad frente a PiQC significativa (tal como se evidencia mediante los datos experimentales en la tabla 6 anterior).

VI. Determinación de la actividad de seqQC-'PhoA

La figura 5 muestra la actividad PhoA en células de E. coli CC118 pGP1-2 permeabilizadas que expresan proteínas de fusión seqPgQC-'PhoA. Se clonó una PgQC con supuesta secuencia señal original en pECD637 para crear una proteína de fusión seqPgQC-'PhoA. Se transformó el vector resultante en la cepa de E. coli CC118 pGP1-2. Se inició la expresión de la proteína de fusión mediante incubación del cultivo a 42°C durante 20 min. Se determinó la actividad PhoA del cultivo inducido tal como se describió previamente (Pribyl, T., Topologie des CzcCBA-Efflux-Komplexes aus Ralstonia metallidurans CH34. Dissertation, 2001, Martin-Luther-University Halle-Wittenberg). La barra en negro representa la actividad PhoA de células de E. coli que expresan seqPgQC-'PhoA, la barra con rayas muestra la actividad PhoA de células que expresan 'BlaM-'PhoA y que sirvieron como control positivo, y se usaron células expresadas en vector sin inserto como control negativo (barra en blanco).

Se determinó la actividad PhoA a partir de cultivos hechos crecer tal como se describió anteriormente usando fosfato de p-nitrofenilo (PNPP) como sustrato cromógeno (Pribyl, 2001). Por tanto, se recogieron 200 |il de suspensión celular con DO600 conocida a 13000 rpm a 4°C durante 10 min. Se lavó el sedimento celular en 0,5 ml de Tris-HCI 10 mM pH 8,0, MgSO410 mM y yodoacetamida 1 mM. Se resuspendió el sedimento celular resultante en 1 ml de Tris-HCI 1 M pH 8,0, ZnCl20,1 mM y yodoacetamida 1 mM. Luego se añadieron 50 |il de SDS al 0,1% (p/v) y 50 |il de cloroformo a la mezcla seguido por un tiempo de incubación durante 5 min a 37°C. Luego se inició la reacción mediante la adición de 100 |il de disolución de sustrato (Tris-HCI 1 M pH 8,0, PNPP al 0,4% (p/v)). Se incubó adicionalmente la mezcla de reacción a 37°C hasta que la disolución se volvió de color amarillo. Luego se detuvo la reacción mediante la adición de 120 |il de KH2PO41 M, EDTA 0,5 M pH 8,0. El tiempo necesario para desarrollar una coloración amarilla definió la actividad PhoA enzimática específica. Se retiró el residuo celular mediante centrifugación (13000 rpm, 20 min) y se determinó la densidad óptica a 420 nm del sobrenadante. Se determinó la actividad PhoA según la ley de Lambert-Beer. Los cultivos de E. coli CC118 pGP1-2 que portaban el vector vacío pECD637 sirvieron como control negativo, mientras que E. coli CC118 pGP1-2 con pECD619 (Pribyl, 2001) sirvieron como control positivo. Este plásmido codifica para una forma corta de la secuencia señal inclusiva de p-lactamasa ('blaM) en el sentido 3' del dominio 'phoA.

Conclusión: el análisis in silico del marco de lectura abierto de PgQC reveló una supuesta secuencia señal. Esto indica una ubicación de PgQC fuera del citoplasma en P. gingivalis. Se construyeron fusiones C-terminales de secuencias señal “originales” inclusivas de PgQC con fosfatasa alcalina (PhoA) para investigar la ubicación “original” de PgQC. Las fusiones con fosfatasas alcalinas son exclusivamente activas cuando se ubican en el periplasma. La expresión de seqPgQC-'PhoA dio como resultado una alta actividad fosfatasa de 638,5 U/I ± 50,9 (figura 5). Esto indica que PgQC se ubica en el periplasma.

VII. Descripción de métodos de síntesis

a) Síntesis de imidazo[4,5-b]piridin-aminas 5-sustituidas

Se prepararon imidazo[4,5-b]piridin-aminas 5-sustituidas mediante un método general que comprende: tratar 6-cloropiridin-2,3-diamina con ortoformiato de trietilo a temperatura elevada para obtener 5-cloroimidazo[4,5-b]piridina (etapa A1); seguido por una reacción de acoplamiento cruzado del producto de la etapa A1 con una amina respectiva en presencia de un catalizador de Pd adecuado y una base para obtener la imidazo[4,5-b]piridin-amina 5-sustituida correspondiente (etapa A2).

Se preparó el compuesto del ejemplo 1 mediante el método anterior, tal como se muestra en el siguiente esquema 1.

Ejemplo 1: N-bencilimidazo[4,5-b]piridin-5-amina

Etapa A1: 5-cloroimidazo[4,5-b]piridina

Se calentó una disolución de 6-cloropiridin-2,3-diamina (718 mg, 5 mmol) en metanol (10 ml) y ortoformiato de trietilo (10 ml) hasta reflujo durante 3 horas. Se evaporaron los componentes volátiles y se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida en sílice usando un gradiente de CHCl3-MeOH. Rendimiento: 540 mg (58%); ESI-EM m/z 151,1 [M+H]+.

Etapa A2: N-bencilimidazo[4,5-b]piridin-5-amina

Se disolvieron 5-cloro[4,5-b]piridina (207 mg, 1,1 mmol, 1 eq), DavePhos (10 mg, 0,0264 mmol, 0,25 eq) y Pd2(dba)3 (9 mg, 0,011 mmol, 0,1 eq) en THF seco (15 ml) bajo una atmósfera de argón. Se añadieron LiN(TMS)2 (1 M en THF, 2,4 ml, 2,4 mmol, 2,2 eq) y bencilamina (144 |il, 1,3 mmol, 1,2 eq) y se agitó la mezcla a 65°C durante 18 h. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, se acidificó la mezcla por medio de HCl acuoso (5 N) y se continuó la agitación durante 10 min adicionales. Se vertió la mezcla de reacción en NaHCO3 acuoso saturado y se extrajo con EtOAc (3x25 ml). Se secaron las fases orgánicas combinadas sobre MgCO3 y se evaporaron hasta sequedad. Se purificó el residuo mediante HPLC semipreparativa. Rendimiento: 90 mg (24%); EM m/z: 225,2 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r.

8,93 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-da) 8: 4,55 (s, 2H); 6,80 (d, 1H, 3J=8,8 Hz); 7,22-7,27 (m, 1H); 7,30-7,37 (m, 4H); 7,83-7,91 (m, 2H); 9,08 (s, 1H).

b) Síntesis de imidazo[4,5-b]piridin-aminas 6-sustituidas

Se prepararon imidazo[4,5-b]piridin-aminas 6-sustituidas mediante un método general que comprende las etapas: tratar 2-cloro-3,5-dinitropiridina con amoniaco en un disolvente adecuado o una mezcla de disolventes para obtener 3,5-dinitropiridin-2-amina (etapa B1); tratar el producto obtenido en la etapa B1 con (NH4)2S para obtener 5-nitropiridin-2,3-diamina (etapa B2); tratar el producto obtenido en la etapa B2 con ortoformiato de trietilo para obtener 6-nitroimidazo[4,5-b]piridina (etapa B3); tratar el producto obtenido en la etapa B3 con un agente reductor adecuado para obtener imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (etapa B4); seguido por tratar el producto obtenido en la etapa B4 con un aldehído respectivo en presencia de un agente reductor adecuado, tal como NaBH4, para obtener la N-alquilimidazo[4,5-b]piridin-6-amina correspondiente (etapa B5).

En el esquema 2 a continuación se ejemplifica una ruta de síntesis según el método general anterior.

Esquema 2: esquema de síntesis para la preparación de imidazo[4,5-b]piridin-aminas 6-sustituidas

aa) Síntesis de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Etapa B1: 3,5-dinitropiridin-2-amina

Se trató gota a gota una disolución de 2-cloro-3,5-dinitropiridina (5 g, 24,6 mmol, 1 eq) en etanol (150 ml) con NH3 acuoso (7 ml, 123 mmol, 5 eq) a 0°C. Tras completarse la adición, se agitó la mezcla a temperatura ambiental durante 1 hora. Se recogió el producto sólido mediante filtración y se secó. Se usó el compuesto sin purificación posterior. Rendimiento: 4,17 g (92%).

Etapa B2: 5-nitropiridin-2,3-diamina

Se trató una disolución de 3,5-dinitropiridin-2-amina (3,9 g, 21,2 mmol, 1 eq) en metanol (80 ml) con (N H ^S acuoso al 20% (36,1 ml, 106 mmol, 5 eq) y se calentó hasta reflujo durante 1 hora. Después de enfriar, se recogió el sólido mediante filtración y se secó. Se usó el producto sin purificación posterior. Rendimiento: 3,2 g (98%); ESI-EM m/z: 155,0 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 4,08 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-da) 8: 5,31 (s a, 2H), 6,98 (s a, 2H), 7,36 (d, 1H, 4J=2,2 Hz), 8,28 (d, 1H, 4J=2,6 Hz).

Etapa 3: 6-nitroimidazo[4,5-b]piridina

Se agitó una disolución de 5-nitropiridin-2,3-diamina (2,7 g, 17,5 mmol) en metanol (14 ml) y ortoformiato de trietilo (14 ml) a 150°C en un microondas durante 10 min. Se evaporaron los disolventes y se usó el residuo sin purificación posterior. Rendimiento: 2,64 g (92%); ESI-EM m/z: 165,1 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 6,21 min, 100%.

Etapa 4: imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se trató una disolución de 6-nitroimidazo[4,5-b]piridina (1240 mg, 7,5 mmol, 1 eq) en ácido clorhídrico acuoso (10%) con SnCl2 (5076 mg, 22,5 mmol, 3 eq) y se calentó en un microondas hasta 100°C durante 30 minutos. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, se basificó la mezcla por medio de NaOH acuoso (1 M) y se evaporó. Se suspendió el residuo en MeOH y se filtró. Se evaporó el filtrado y se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida (sílice, gradiente de CHCh/MeOH con el 0,5% de NH3). Rendimiento: 993 mg (98%); ESI-EM m/z: 135,2 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 1,47 min, 100%.

bb) Procedimiento general para la síntesis de N-alquilimidazo[4,5-b]piridin-6-aminas

Etapa 5: N-alquilimidazo[4,5-b]piridin-6-aminas

Se disolvieron imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (1 eq) y el aldehído respectivo (1 eq) en EtOH (5 ml) y se agitaron a temperatura ambiente durante 4 horas. Se añadió NaBH4 (1,5 eq) y se continuó la agitación durante la noche. Se extinguió la reacción por medio de agua y se extrajo con EtOAc (3x20 ml). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera, se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida (sílice, gradiente de CHCh/MeOH).

Se prepararon los siguientes ejemplos de imidazo[4,5-b]piridin-aminas 6-sustituida usando los métodos descritos anteriormente.

Ejemplo 2: N-bencilimidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (50 mg, 0,4 mmol) y benzaldehído (38 |il, 0,4 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 30 mg (36%); EM m/z: 225,2 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 8,45 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-da) 8: 4,33 (s, 2H); 6,35 (s a, 1H); 6,93 (s, 1H); 7,21-7,26 (m, 1H); 7,31-7,36 (m, 2H); 7,39-7,43 (m, 2H); 7,94 (d, 1H, 4J=2,6 Hz); 8,07 (s, 1H); 12,20 (s a, 1H).

Ejemplo 3: N-(3,4,5-trifluorobencil)imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (67 mg, 0,5 mmol) y 3,4,5-trifluorobenzaldehído (80 mg, 0,5 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 74 mg (53%); EM m/z: 279,1 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 10,13 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 4,34 (d, 2H, 3J=5,7 Hz); 6,44 (s a, 1H); 6,94 (s, 1H); 7,31­ 7,39 (m, 2H); 7,92 (d, 1H, 4J=2,6 Hz); 8,10 (s, 1H); 12,16 (s a, 1H).

Ejemplo 4: N-(4-clorobencil)imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (50 mg, 0,4 mmol) y 4-clorobenzaldehído (52 mg, 0,4 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 48 mg (50%); EM m/z: 259,1 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 9,97 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 4,33 (s, 2H); 6,39 (s a, 1H); 6,91 (s, 1H); 7,36-7,45 (m, 4H); 7,93 (d, 1H, 4J=2,5 Hz); 8,08 (s, 1H); 12,22 (s a, 1H).

Ejemplo 5: N-(3-clorobencil)imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (50 mg, 0,4 mmol) y 3-clorobenzaldehído (42 |il, 0,4 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 70 mg (73%); EM m/z: 259,1 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 9,84 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 4,36 (d, 2H, 3J=5,9 Hz); 6,42 (s, 1H); 6,93 (s, 1H); 7,27-7,31 (m, 1H); 7,35-7,39 (m, 2H); 7,45-7,47 (m, 1H); 7,93 (d, 1H, 4J=2,3 Hz); 8,08 (s, 1H); 12,09 (s a, 1H).

Ejemplo 6: N-(3-metoxibencil)imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (50 mg, 0,4 mmol) y 3-metoxibenzaldehído (46 |il, 0,4 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 40 mg (42%); EM m/z: 255,1 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 8,51 min, 97%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 3,73 (s, 3H); 4,28-4,32 (m, 2H); 6,34 (s a, 1H); 6,80 (dd, 1H, 3J=8,1 Hz, 4J=1,9 Hz); 6,92 (s, 1H); 6,96-7,00 (m, 2H); 7,22-7,27 (m, 1H); 7,93 (d, 1H, 4J=2,5 Hz); 8,07 (s, 1H); 12,18 (s a, 1H).

Ejemplo 7: N-(4-metoxibencil)imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (50 mg, 0,4 mmol) y 3-metoxibenzaldehído (46 |il, 0,4 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 25 mg (26%); EM m/z: 255,1 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 8,43 min, 97%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 3,72 (s, 3H); 4,24 (s, 2H); 6,25 (s a, 1H); 6,85-6,97 (m, 3H); 7,29-7,35 (m, 2H); 7,92 (d, 1H, 4J=2,4 Hz); 8,06 (s, 1H); 12,13 (s a, 1H).

Ejemplo 8: N-(3-tienilmetil)imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (50 mg, 0,4 mmol) y tiofen-3-carbaldehído (33 |il, 0,4 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 60 mg (70%); EM m/z: 231,2 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 7,63 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 4,31 (s, 2H); 7,03 (d, 1H, 4J=2,5 Hz); 7,13 (dd, 1H, 3J=4,9 Hz, 4J=1,1 Hz); 7,37-7,40 (m, 1H); 7,49 (dd, 1H, 3J=4,9 Hz, 4J=3,0 Hz); 7,96 (d, 1H, 4J=2,5 Hz).

Ejemplo 9: N-(3-(1-piperidil)bencil)imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (50 mg, 0,4 mmol) y 3-(1-piperidil)benzaldehído (71 mg, 0,4 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 56 mg (49%); EM m/z: 308,3 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. (doble pico) 5,17/5,49 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 1,48-1,63 (m, 6H); 3,07-3,14 (m, 4H); 4,25 (s, 2H); 6,76-6,81 (m, 2H); 6,95 (d, 4J=2,5 Hz); 6,99 (s, 1H); 7,14 (t, 1H, 3J=7,8 Hz); 7,96 (d, 1H, 4J=2,5 Hz); 8,15 (s, 1H).

Ejemplo 10: N-(2-piridilmetil)imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (50 mg, 0,4 mmol) y piridin-2-carbaldehído (35 |il, 0,4 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 6 mg (7%); EM m/z: 226,2 [m H]+; HPLC (gradiente B): t.r. 4,96 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 4,43 (s, 2H); 6,97 (d, 1H, 4J=2,5 Hz); 7,25-7,30 (m, 1H); 7,42 (d, 1H, 3J=7,8 Hz); 7,72-7,78 (m, 1H); 8,01 (d, 1H, 4J=2,5 Hz); 8,27 (s, 1H); 8,55 (d, 1H, 3J=4,5 Hz).

Ejemplo 11: N-(3-piridilmetil)imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (50 mg, 0,4 mmol) y piridin-3-carbaldehído (35 |il, 0,4 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 15 mg (18%); EM m/z: 226,2 [M+H]+; HPLC (gradiente B): t.r. 4,64 min, 94%; 1H-RMN (DMSO-da) 8: 4,38 (s, 2H); 7,01 (d, 1H, 4J=2,5 Hz); 7,34-7,39 (m, 1H); 7,78-7,83 (m, 1H); 7,97 (d, 1H, 4J=2,5 Hz); 8,21 (s, 1H); 8,46 (dd, 1H, 3J=4,7 Hz, 4J=1,4 Hz); 8,64 (d, 1H, 4J=1,6 Hz).

Ejemplo 12: N-(2,3-dihidro-1,4-benzodioxin-6-il-metil)imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (50 mg, 0,4 mmol) y 1,4-benzodioxan-6-carbaldehído (61 mg, 0,4 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 21 mg (20%); EM m/z: 283,2 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 8,59 min, 96%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 4,16-4,23 (m, 6H); 6,27 (s a, 1H); 6,77-6,94 (m, 4H); 7,91 (d, 1H, 4J=2,5 Hz); 8,08 (s, 1H); 12,25 (s a, 1H).

Ejemplo 13: N-(3,4-dimetoxibencil)imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (134 mg, 1 mmol) y 3,4-dimetoxibenzaldehído (166 mg, 1 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 90 mg (32%); EM m/z: 285,2 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 7,79 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 3,70-3,76 (m, 6H); 4,24 (s, 2H); 6,24 (s a, 1H); 6,87-6,97 (m, 3H); 7,01-7,04 (m, 1H); 7,93 (d, 1H, 4J=2,3 Hz); 8,07 (s, 1H); 12,16 (s a, 1H).

Ejemplo 14: N-(3,4-diclorobencil)imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (50 mg, 0,4 mmol) y 3,4-diclorobenzaldehído (65 mg, 0,4 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 75 mg (69%); EM m/z: 293,1 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 11,09 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 4,36 (s, 2H); 6,45 (s a, 1H); 6,94 (d, 1H, 4J=1,6 Hz); 7,39 (dd, 1H, 3J=8,3 Hz, 4J=1,7 Hz); 7,59 (d, 1H, 3J=8,3 Hz); 7,66 (d, 1H, 4J=1,6 Hz); 7,93 (d, 1H, 4J=2,5 Hz); 8,09 (s, 1H); 12,25 (s a, 1H).

Ejemplo 15: N-(4-propoxibencil)imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (134 mg, 1 mmol) y 4-propoxibenzaldehído (158 |il, 1 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 110 mg (39%); EM m/z: 283,3 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 11,07 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 0,96 (t, 3H, 3J=7,4 Hz); 1,70 (sext, 2H, 3J=7,0 Hz); 3,88 (t, 2H, 3J=6,5 Hz); 4,24 (s, 2H); 6,84-6,97 (m, 3H); 7,27-7,34 (m, 2H); 7,93 (d, 1H, 4J=1,4 Hz); 8,07 (s, 1H); 12,18 (s a, 1H).

Ejemplo 16: N-(4-(2-aminoetoxi)bencil)imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (268 mg, 2 mmol) y N-Boc-(4-(2-aminoetoxi)benzaldehído (531 mg, 2 mmol) tal como se describió anteriormente, seguido por desprotección de Boc usando TFA/DCM (1:1, 2 ml) y TIS (100 |il) y purificación mediante HPLC semipreparativa. Rendimiento: 53 mg (9%); EM m/z: 284,1 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 5,12 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 3,18-3,25 (m, 2H); 4,13 (t, 2H, 3J=5,0 Hz); 4,31 (s, 2H); 6,94-6,99 (m, 2H); 7,07 (d, 1H, 4J=2,4 Hz); 7,33-7,38 (m, 2H); 7,91-8,01 (m, 3H); 8,09 (d, 1H, 4J=2,4 Hz); 8,85 (s, 1H).

Ejemplo 17: 1-(2-(4-((imidazo[4,5-b]piridin-6-ilamino)metil)-fenoxi)etil)guanidina

Se trató una disolución de N-(4-(2-aminoetoxi)bencil)imidazo[4,5-b]piridin-6-amina*TFA (41 mg, 0,08 mmol, 1 eq) en DMF con N,N'-bis(terc-butoxicarbonil)-S-metilisotiourea (23 mg, 0,08 mmol, 1 eq), DMa P (1 mg, 0,008 mmol, 0,1 eq) y TEA (33 |il, 0,24 mmol, 3 eq). Se agitó la mezcla durante 16 horas a temperatura ambiente, se extinguió con agua y se extrajo con EtOAc (3x20 ml). Se secaron las fases orgánicas combinadas sobre MgCO3 y se evaporaron. Se llevó a cabo la desprotección de Boc con TFA/DCM (1:1,2 ml) y TIS (100 |il). Se evaporaron los componentes volátiles y se purificó el residuo mediante HPLC semipreparativa. Rendimiento: 18 mg (41%); EM m/z: 326,1 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 5,95 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 4,04 (t, 2H, 3J=5,3 Hz); 4,30 (s, 2H); 6,91-6,95 (m, 2H); 7,07 (d, 1H, 4J=2,5 Hz); 7,32-7,36 (m, 2H); 7,64 (t, 1H, 3J=5,8 Hz); 8,09 (d, 1H, 4J=2,4 Hz); 8,86 (s, 1H).

Ejemplo 18: N-[(4-isopropoxifenil)metil]-3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (67 mg, 0,5 mmol) y 4-isopropoxibenzaldehído (78 |il, 0,5 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 6 mg (4%); EM m/z: 283,2 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 10,69 min, 89,7%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 1,23 (d, 6H, 3J=5,9 Hz), 4,20-4,24 (m, 2H), 4,50-4,60 (m, 1H), 6,83-6,89 (m, 3H), 7,26-7,32 (m, 2H), 7,92 (s a, 1H), 8,05 (s a, 1H), 12,02 (s a, 1H).

Ejemplo 19: N-[(3-fenoxifenil)metil]-3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (50 mg, 0,4 mmol) y 3-fenoxibenzaldehído (64 |il, 0,4 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 19 mg (16%); EM m/z: 317,3 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 12,13 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-da) 8: 4,30-4,36 (m, 2H), 6,41 (s a, 1H), 6,80-6,97 (m, 4H), 7,02-7,20 (m, 3H), 7,28-7,36 (m, 3H), 7,82-8,16 (m, 2H), 12,03 (s a, 1H).

Ejemplo 20: N-[(4-benciloxifenil)metil]-3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (50 mg, 0,4 mmol) y 3-benciloxibenzaldehído (79 mg, 0,4 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 47 mg (38%); e M m/z: 331,2 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 12,59 min, 97,8%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 4,22-4,26 (m, 2H), 5,06 (s, 2H), 6,24 (s a, 1H), 6,86-7,00 (m, 3H), 7,28-7,45 (m, 7H), 7,90-7,93 (m, 1H), 8,05 (s, 1H), 12,05 (s a, 1H).

Ejemplo 21: N-[(4-bifenil)metil]-3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (50 mg, 0,4 mmol) y 4-bifenilcarboxaldehído (68 mg, 0,4 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 30 mg (27%); EM m/z: 301,2 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 12,37 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 4,37 (d, 2H, 3J=5,4 Hz), 6,40 (s a, 1H), 6,94 (s a, 1H), 7,31­ 7,37 (m, 1H), 7,41-7,51 (m, 4H), 7,60-7,67 (m, 4H), 7,95 (s, 1H), 8,06 (s, 1H), 12,04 (s a, 1H).

Ejemplo 22: N-[(2,6-difluoro-4-metoxi-fenil)metil]-3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (67 mg, 0,5 mmol) y 2,6-difluoro-4-metoxibenzaldehído (86 mg, 0,4 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 77 mg (53%); EM m/z: 291,2 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 9,60 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 3,76 (s, 3H), 4,22 (d, 2H, 3J=5,9 Hz), 5,97 (s a, 1H), 6,71-6,79 (m, 2H), 7,10 (s a, 1H), 7,92 (s, 1H), 8,09 (s, 1H), 12,16 (s a, 1H).

Ejemplo 23: N-[(7-metoxi-1,3-benzodioxol-5-il)metil]-3H-imidazo-[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (60 mg, 0,45 mmol) y 5-metoxipiperonal (81 mg, 0,45 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 44 mg (33%); EM m/z: 299,2 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 8,91 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 3,80 (s, 3H), 4,21 (s, 2H), 5,93 (s, 2H), 6,27 (s a, 1H), 6,63 (s, 1H), 6,72 (s, 1H), 6,94 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 8,07 (s, 1H), 12,23 (s a, 1H).

Ejemplo 24: N-[(2,2-difluoro-1,3-benzodioxol-5-il)metil]-3H-imidazo-[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (67 mg, 0,5 mmol) y 2,2-difluoro-1,3-benzodioxol-5-carboxaldehído (93 mg, 0,5 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 60 mg (40%); EM m/z: 305,3 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 11,07 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 4,34 (d, 2H, 3J=6,4 Hz), 6,45/6,26 (s a, 1H, rotámero), 6,85/7,08 (s a, 1H, rotámero), 7,22-7,31 (m, 1H), 7,33-7,38 (m, 1H), 7,43 (s, 1H), 7,85-8,15 (m, 2H), 12,02/12,59 (s a, 1H).

Ejemplo 25: N-[[4-(2-piridil)fenil]metil]-3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (67 mg, 0,5 mmol) y 4-(2-piridil)benzaldehído (92 mg, 0,5 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 25 mg (17%); e M m/z: 302,4 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 6,00 min, 100%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 4,39 (d, 2H, 3J=5,9 Hz), 6,45 (s a, 1H), 7,29-7,35 (m, 1H), 7,51 (d, 2H, 3J=8,3 Hz), 7,82-7,88 (m, 1H), 7,91-7,98 (m, 2H), 8,02-8,09 (m, 3H), 8,64 (d, 2H, 3J=4,9 Hz), 12,02 (s a, 1H).

Ejemplo 26: N-[[4-(2-morfolinoetoxi)fenil]metil]-3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (67 mg, 0,5 mmol) y 4-(2-morfolinoetoxi)benzaldehído (118 mg, 0,5 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 21 mg (12%); EM m/z: 177,6 [M+2H]2+, 354,4 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 5,76 min, 100%; 1H-RMN (MeOH-d4) 8: 2,55-2,61 (m, 4H), 2,78 (t, 2H, 3J=5,4 Hz), 3,67-3,72 (m, 4H), 4,11 (t, 2H, 3J=5,4 Hz), 4,30 (s, 2H), 6,87-6,93 (m, 2H), 7,02 (s a, 1H), 7,29­ 7,35 (m, 2H), 7,94 (s, 1H), 8,05 (s, 1H).

Ejemplo 27: N-[(4-morfolinofenil)metil]-3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-amina

Se sintetizó el compuesto partiendo de imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (67 mg, 0,5 mmol) y 4-(4-morfolinil)benzaldehído (96 mg, 0,5 mmol) tal como se describió anteriormente. Rendimiento: 42 mg (26%); Em m/z: 310,4 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 6,91 min, 93,9%; 1H-RMN (MeOH-d4) 8: 3,07-3,11 (m, 4H), 3,79-3,82 (m, 4H), 4,29 (s, 2H), 6,91-6,96 (m, 2H), 7,01 (s a, 1H), 7,27-7,32 (m, 2H), 7,95 (s a, 1H), 8,04 (s a, 1H).

cc) Procedimiento general para la síntesis de conjugados de N-bencilimidazo[4,5-b]piridin-6-amina-porfirina Etapa C1:

Se disolvió imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (1 eq) en MeOH o EtOH (c = 0,05-0,08 M). Se añadió el aldehído respectivo y se agitó la mezcla a temperatura ambiente hasta que la CCF indicó una conversión completa de los materiales de partida. Se añadió con cuidado NaBH4 (1,5 eq) (en el caso de Ra/b = 1H) o NaBD4 (1,7 eq) (en el caso de Ra/b = D), respectivamente, y se continuó la agitación durante la noche. Se evaporaron los componentes volátiles y se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida (A^O3, gradiente de CHCh/MeOH).

Se disolvió el producto purificado en MeOH (c = 0,06-0,12 M) y se trató con HCl 1 M recién preparado en MeOH (16 eq). Después de agitar a temperatura ambiente durante 3 h, se evaporaron los componentes volátiles y se usó el residuo sin purificación posterior.

Esquema 3: esquema de síntesis a modo de ejemplo para la síntesis de conjugados de N-bencilimidazo[4,5-b]piridin6-amina-porfirina

Etapa C2:

Se disolvió N-[[4-(2-aminoetoxi)fenil]-metil]-1H-imidazo[4,5-b]piridin-6-amina o N-[[4-(2-aminoetoxi)-fenil]dideuteriometil]-1H-imidazo[4,5-b]piridin-6-amina (1 eq) obtenida en la etapa C1 en dimetilformamida (c=0,1-0,13 M). Se añadieron Fmoc-Lys(Boc)-OH (1,2 eq), TBTU (1,2 eq) y DIPEA (4 eq) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 4-5 horas. Se añadió agua y se extrajo con EtOAc (3x100 ml). Se secaron las fases orgánicas combinadas sobre Na2SO4 y se evaporaron. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida (AhO3, gradiente de CHCla/MeOH).

Etapa C3:

Se disolvió el producto respectivo obtenido mediante la etapa C2 (1 eq) en dimetilformamida (c = 0,03 M), se trató con DBU (1 eq) y se agitó a temperatura ambiente durante 30-40 minutos. Se disolvieron una porfirina adecuada (1,2 eq), HOBt (1,2 eq), TBTU (1 eq) y DIPEA (4 eq) en dimetilformamida, se mezclaron previamente durante 50 minutos a temperatura ambiente y se añadieron a la disolución. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Se extinguió con cuidado la reacción mediante la adición de TFA/DCM (1:1 v/v, 10 ml) y se continuó la agitación durante 45 minutos. Se evaporaron los componentes volátiles y se sometió directamente la mezcla en bruto a HPLC semipreparativa.

Ejemplo 28: ácido 3-[(1Z,4Z,9Z,15Z)-18-[3-[[(1S)-5-amino-1-[2-[4-[(3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-ilamino)metil]fenoxi]-etilcarbamoil]pentil]amino]-3-oxo-propil]-3,8,13,17-tetrametil-21,23-dihidroporfirina-2-il]-propanoico

Rendimiento (última etapa): 15 mg (6%); EM m/z: 453,1 [M+2H]2+; 904,8 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 12,43 min, 94%; 1H-RMN (DMSO-da) 8: 0,96-1,53 (m, 8H), 2,40-2,48 (m, 3H), 3,02-3,26 (m, 5H), 3,59-3,80 (m, 12H), 4,20-4,26 (m, 2H), 4,26-4,33 (m, 2H), 4,33-4,45 (m, 2H), 6,70 (d, 2H, J = 8,7 Hz), 7,04-7,08 (m, 1H), 7,17-7,24 (m, 2H), 7,42-7,51 (m, 3H), 7,87 (t, 1H, 3J = 5,4Hz), 8,05-8,12 (m, 2H), 8,97 (s a, 1H), 9,34 (d, 1H, J = 24,0 Hz), 9,35 (s, 1H), 10,19 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 10,32 (s, 1H), 10,33 (d, 2H, J = 9,8 Hz) 12,34 (s a, 1H).

Ejemplo 29: ácido 3-[(4Z,10Z,15Z,19Z)-18-[3-[[(1S)-5-amino-1 -[2-[4-[dideuterio-(1H-imidazo[4,5-b]piridin-6-ilamino)-metil]fenoxi]etilcarbamoil]pentil]amino]-3-oxo-propil]-3,8,13,17-tetrametil-22,24-dihidro-porfirina-2-il]propanoico

Rendimiento (última etapa): 37 mg (26%); EM m/z: 453,9 [M+2H]2+; 906,4 [M+H]+; HPLC (gradiente A): t.r. 12,45 min, >99%; 1H-RMN (DMSO-d6) 8: 0,96-1,53 (m, 6H), 2,40-2,48 (m, 2H), 3,02-3,26 (m, 6H), 3,59-3,80 (m, 14H), 4,26-4,45 (m, 5H), 6,70 (d, 2H, J = 8,4Hz), 7,04-7,08 (m, 1H), 7,17-7,24 (m, 2H), 7,42-7,51 (m, 3H), 7,87 (m, 1H), 8,05-8,12 (m, 2H), 8,98 (s a, 1H), 9,34 (d, 1H, J = 23,7 Hz), 9,35 (s, 1H), 10,28 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 10,31 (s, 1H), 10,33 (d, 2H, J = 10,0 Hz).

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   Compuesto según la siguiente fórmula I,

   

   sus enantiómeros individuales, sus diaestereoisómeros individuales, sus hidratos, sus solvatos, sus formas cristalinas, sus tautómeros individuales o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que:

   A se selecciona del grupo que consiste en arilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido y alquenilo opcionalmente sustituido;

   R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H y alquilo opcionalmente sustituido;

   

   Ra y Rb son iguales o diferentes el uno del otro y se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, halo, alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroalquilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido, y en la que Ra y Rb pueden estar opcionalmente unidos entre sí para formar un anillo carbocíclico o heterocíclico;

   en la que “opcionalmente sustituido” se refiere a sustitución opcional con uno o varios grupos seleccionados independientemente de: grupo alquilo C1-6, heteroalquilo C1-6, carbociclilo C1-6, heterociclilo C1-5 y heteroarilo C1-5, cada uno de los cuales puede estar sustituido por uno o varios átomos de halógeno y/o grupos hidroxilo; un átomo de halógeno; un grupo ciano; un grupo amino primario, secundario o terciario; un grupo hidroxilo; y un grupo carboxilo.

   Compuesto según la reivindicación 1, en el que:

   dicho arilo es independientemente un grupo arilo C6-10, preferiblemente C6;

   dicho heterociclilo es independientemente un grupo heterocíclico monocíclico o bicíclico C1-11, preferiblemente C2-8, más preferiblemente C4-5 que comprende de 1 a 4 heteroátomos de anillo seleccionados deN, S y O;

   dicho alquilo es independientemente un grupo alquilo lineal o ramificado, de cadena abierta o cíclico C1-6, preferiblemente C1-4, más preferiblemente C1-3, incluso más preferiblemente C1-2;

   dicho cicloalquilo es independientemente un grupo alquilo cíclico C3-6, preferiblemente C4-6, más preferiblemente C5-6;

   dicho alquenilo es independientemente un grupo lineal o ramificado, de cadena abierta o cíclico C2-6, preferiblemente C2-4, más preferiblemente C2 que comprende al menos un enlace C=C;

   dicho heteroarilo es independientemente un grupo heterocíclico aromático monocíclico o bicíclico C1-11, preferiblemente C2-8, más preferiblemente C4-5 que comprende de 1 a 4 heteroátomos de anillo seleccionados de N, S y O; y

   dicho heteroalquilo es independientemente un grupo heteroalquilo lineal o ramificado, de cadena abierta o cíclico C1-5, preferiblemente C1-3, más preferiblemente C1-2 que comprende de 1 a 4 heteroátomos seleccionados de N, S y O.

   Compuesto según la reivindicación 1 a 2, que está representado por la siguiente fórmula la,

   

   en la que A se selecciona de arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido; y R1, Ra y Rb son H.

   4. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que Ra y Rb se seleccionan independientemente de 1H y D.

   5. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que A está sustituido por al menos un sustituyente representado por la siguiente estructura B:

   

   en la que n = 1, 2, 3, 4, 5 ó 6; y

   R7 y R8 se seleccionan independientemente de alquilo, arilo, heteroalquilo, heteroarilo, carbamimidoílo, formilo, alquilacilo y arilacilo, cada uno de los cuales puede estar además opcionalmente sustituido, y en la que R7 y R8 pueden estar opcionalmente unidos entre sí para formar un anillo carbocíclico o heterocíclico.

   6. Compuesto según la reivindicación 5, en el que R7 está representado por la siguiente estructura E:

   

   en la que M se selecciona de Fe2+ y Fe3+ o está ausente;

   Rc y Rd se seleccionan independientemente de -H, -CH3, -CH=CH2, -SO3H y -CH(OH)CH2OH; y

   X se selecciona de un enlace covalente, un grupo alquileno, aralquileno, heteroalquileno, carbocicleno, heterocicleno, heteroarileno, heteroaralquileno, aminoalquileno, alquilamino y carbonil-alquilamino; en la que cada uno de estos puede tener hasta 12 átomos de carbono y hasta 11 heteroátomos en la cadena principal, y puede estar sustituido por uno o más grupo(s) alquilo C1-6, grupo(s) heteroalquilo C1-6, grupo(s) carbociclilo C1-6, grupo(s) heterociclilo C1-5, grupo(s) heteroarilo C1-5, átomo(s) de halógeno, grupo(s) hidroxilo, grupo(s) ciano, grupo(s) amino primario, secundario y terciario, grupo(s) carboxilo y una(s) cadena(s) lateral(es) derivada(s) de aminoácido(s) proteinogénico(s) o no proteinogénico(s).

   7. Compuesto según la reivindicación 6, en el que X está representado por la siguiente estructura :

   

   en la que m = 0, 1, 2 ó 3, y

   Re es una cadena lateral derivada de un aminoácido proteinogénico.

   8. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que A está sustituido por un sustituyente representado por la siguiente estructura F:

   

   en la que M se selecciona de Fe2+ y Fe3+ o está ausente; y

   Rc y Rd se seleccionan independientemente de -H, -CH3, -CH=CH2, -SO3H y -CH(OH)CH2OH.

   9. Composición farmacéutica que comprende el compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

   10. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o composición farmacéutica según la reivindicación 9, para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal.

   11. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o composición farmacéutica según la reivindicación 9, para su uso en un método para la terapia y/o profilaxis de una infección bacteriana.

   12. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o composición farmacéutica según la reivindicación 9, para su uso en el método según la reivindicación 11, en el que:

   (i) la infección bacteriana está provocada por una bacteria que expresa una glutaminil ciclasa bacteriana (bacQC), siendo la bacQC un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, y una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 90% o más con respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3; y/o

   (ii) la infección bacteriana está provocada por una bacteria seleccionada del grupo que consiste en Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia y Tannerella forsythia; y/o

   (iii) el compuesto inhibe selectivamente el crecimiento de la bacteria dentro de una biopelícula.

   13. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o composición farmacéutica según la reivindicación 9, para su uso en un método para la terapia o profilaxis de una periodontopatía aguda, crónica o recurrente.

   14. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o composición farmacéutica según la reivindicación 9, para su uso en el método según la reivindicación 13, en el que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedades gingivales inducidas por la placa dental, periodontitis crónica, periodontitis agresiva, periodontitis como manifestación de enfermedades sistémicas, periodontopatías necrosantes, abscesos del periodonto, periodontitis asociada con lesiones endodóncicas, mucositis periimplantaria, periimplantitis e infecciones endodóncicas.

   15. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o composición farmacéutica según la reivindicación 9, para su uso en el método según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que la vía de administración es administración tópica y/o en el que el método es un método no quirúrgico.