ES2834850T3

ES2834850T3 - Híbrido de subtipos de IFN alfa

Info

Publication number: ES2834850T3
Application number: ES15712186T
Authority: ES
Inventors: William Stimson
Original assignee: ILC Therapeutics Ltd
Current assignee: ILC Therapeutics Ltd
Priority date: 2014-03-12
Filing date: 2015-03-12
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2035-03-12
Also published as: WO2015136287A3; EP3116530B1; DK3116530T3; US10487127B2; US20170174735A1; EP3116530A2; GB201404403D0; WO2015136287A2; CA2937412A1

Abstract

Un híbrido de subtipos de interferón alfa que comprende los sitios primarios de unión del receptor de interferón de IFN-α10 e IFN-α14.

Description

DESCRIPCIÓN

Híbrido de subtipos de IFN-a

Campo de la invención

La presente invención versa sobre composiciones y métodos para promover la inducción de una respuesta inmunitaria mediada por células (como la mediada por células Th1) y la supresión de una respuesta inmunitaria humoral o alérgica (como la mediada por células Th2 y Th17). En particular, la invención se refiere a composiciones y métodos para prevenir o tratar alergias, tales como alergias alimentarias y enfermedades alérgicas asociadas, y afecciones en las que una respuesta Th17 exagerada desempeña un papel perjudicial. La invención se extiende además al uso de las composiciones de la invención en el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y enfermedades alérgicas asociadas y también del cáncer.

Antecedentes de la invención

Las citocinas son proteínas inmunomoduladoras que median la activación y las respuestas del sistema inmunológico, como la inmunidad mediada por células y las respuestas humorales de tipo alérgico. Los linfocitos T (células T), que son una fuente importante de citocinas, poseen receptores específicos de antígeno (el receptor de células T) en su superficie celular, lo que permite el reconocimiento de antígenos extraños. Hay dos subconjuntos principales de linfocitos T, que se distinguen por la presencia de marcadores de superficie celular conocidos como CD4 y CD8. Los linfocitos T que expresan CD4 también son denominados células T auxiliares, y se considera que son los productores más prolíficos de citocinas. Este subconjunto se puede subdividir en células Th1 y células Th2/T17, y las citocinas que producen se conocen como citocinas de tipo Th1 y citocinas de tipo Th2/Th17, respectivamente.

Las células Th1 se caracterizan por la producción de citocinas proinflamatorias como IFN-y , IL-2 y TNF-p. Las células Th1 están involucradas en la inmunidad mediada por células (CMI, por sus siglas en inglés), siendo esta la respuesta inmunitaria normalmente montada contra virus y patógenos intracelulares. La respuesta mediada por células también elimina las células cancerosas y estimula las reacciones cutáneas de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH, por sus siglas en inglés).

Las células Th2 se caracterizan por la producción de interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-9 (IL-9), interleucina-10 (IL-10) e interleucina-13 (IL-13). Se cree que las células Th2 desempeñan un papel en las respuestas alérgicas. Las citocinas como la IL-4 generalmente estimulan la producción de anticuerpos (la denominada “respuesta inmunitaria humoral”) dirigida hacia organismos extracelulares, como los parásitos. La IL-5 estimula las respuestas de los eosinófilos, que también forman parte de la respuesta inmunitaria hacia los grandes parásitos extracelulares.

Las células Th17 secretan IL-17 y participan en la regulación inmunitaria en el cáncer y las reacciones alérgicas. Funcionalmente, las células Th17 desempeñan un papel en la defensa del anfitrión contra patógenos extracelulares al mediar en el reclutamiento de neutrófilos y macrófagos para los tejidos infectados. Por lo tanto, son en gran medida parte de la respuesta humoral, junto con las células Th2. La identificación de la familia Th17 de células T efectoras representó un gran avance reciente. La familia de citocinas IL-17 es un grupo de citocinas que incluye IL-17A, B, C, D, IL-17E (IL-25) e IL-17F. Se reconoce cada vez más que, además de las células T, otras células como las células NK y los neutrófilos también podrían ser una fuente importante de IL-17. Además de IL-17A, la citocina principal producida por las células Th17, estas células también liberan IL-17F, IL-21 e IL-22.

Se plantea la hipótesis de que, en determinadas circunstancias, la respuesta Th1 o la respuesta Th2/Th17 puede causar enfermedad. Una respuesta Th1 sobrerreactiva puede generar enfermedades autoinmunitarias específicas de órganos, como artritis, esclerosis múltiple o diabetes tipo I, mientras que una respuesta Th2/Th17 sobrerreactiva puede ser la base de la alergia y la atrofia. Actualmente se cree que las células Th17 desempeñan un papel importante en la defensa del anfitrión contra patógenos y que una respuesta Th17 exagerada puede conducir a respuestas inflamatorias graves y enfermedades autoinmunitarias; las enfermedades inflamatorias del intestino (EII), concretamente la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC), son procesos inflamatorios crónicos del tracto gastrointestinal. En estas enfermedades desempeña un papel importante una respuesta inmunitaria alterada y exagerada, principalmente hacia la microflora endógena. La expresión de IL-17 aumenta tanto en la CU como en la EC. Los IFN de tipo I se han estudiado en ensayos clínicos en pacientes con CU y han demostrado su eficacia en estudios seleccionados. Como citocinas antivirales, ahora se sabe que los IFN de tipo I pueden regular el desarrollo de las células Th17.

Tanto una respuesta Th1 como una respuesta Th2/Th17 pueden regular la otra a la baja y esta es la base de la llamada hipótesis “Th1/Th2” por la que una respuesta inmunitaria puede estar sesgada hacia la ruta Th1 o Th2/Th17, siendo impulsado esto por el perfil de citocinas secretado por un grupo celular que puede promover la expansión de ese tipo de célula y restringir la expansión del tipo de célula opuesto.

Los interferones (IFN) son una familia de proteínas que son efectores pleiotrópicos del sistema inmunológico. Los interferones se pueden clasificar en tres tipos distintos: interferones de tipo I, interferones de tipo II e interferones de tipo III. Los IFN de tipo I representan una familia de citocinas altamente homólogas que se ha descubierto que activan diversas respuestas fisiológicas, incluidas actividades antivirales y antiproliferativas, además de desempeñar un papel importante como activador de la respuesta inmunitaria.

Los interferones de tipo I consisten en interferón alfa (IFN-a), interferón beta (IFN-p), interferón kappa (IFN-k), interferón tau (IFN-t), interferón nu (IFN-v) e interferón omega (IFN-w). El IFN-a está representado en el genoma por 13 genes (12 subtipos), algunos de los cuales tienen variantes alélicas y los diferentes productos génicos del IFN-a se denominan subtipos. Todos los subtipos de interferón constan de 166 aminoácidos estabilizados por dos enlaces disulfuro, excepto el IFN-a2 que tiene un aminoácido menos. La homología con el IFN-a de ratón es del 40%.

Hay 2 formas de IFN-a: (i) IFN-alfa recombinantes que se denominan IFN-a2a e IFN-a2b, con una sola diferencia de aminoácidos (el IFN-a2a se clonó a partir de una línea celular tumoral y se presenta como una variante polimórfica en poblaciones humanas); y (ii) un IFN-a de múltiples subtipos, a veces denominado IFN-alfa natural, que se expresa a partir de la fracción de leucocitos de sangre humana desafiados con el virus Sendai o producida por líneas celulares; por ejemplo, la linfoblastoide. Este producto está altamente purificado con una etapa final de inmunoafinidad y contiene seis subtipos principales; concretamente, IFN-a1, IFN-a2, IFN-a8, IFN-a10, IFN-a14 e IFN-a21, siendo los dos primeros los componentes principales.

Es sabido que diferentes patógenos inducen diferentes subtipos de IFN-a in vitro y que los subtipos de IFN-a tienen diferentes actividades antivirales. Se ha demostrado que la infección por diversas vías, incluida la oral, induce diferentes perfiles de subtipos. Los subtipos de IFN-a se unen al mismo receptor, activan sistemas de señalización comunes y cabe esperar que tengan las mismas funciones biológicas. De manera similar a muchas citocinas, dos de los subtipos de IFN-a naturales están glicosilados. El IFN-a14 tiene glicosilación ligada a N, mientras que el IFN-a2 tiene glicosilación ligada a O. La glicosilación influye en la estructura y la polarización de la molécula, pero no se han demostrado efectos sobre la unión del receptor o la función fisiológica directa. Sin embargo, la glicosilación podría modular el reconocimiento por parte del sistema inmunológico o aumentar la vida media en la circulación.

Por definición, todos los subtipos de IFN-a tienen actividades antivirales, aunque su eficacia absoluta en este contexto puede variar considerablemente. Además, se han descrito muchas otras propiedades biológicas, pero con potencias variables, que incluyen actividades inmunomoduladoras y antiproliferativas. Los efectos pleiotrópicos parecen deberse a la interacción diferencial con las cadenas de receptores y la señalización a través de diferentes sistemas intracelulares hacia una serie de moléculas efectoras.

En general, el IFN-a es parte de la inmunidad innata con fuertes vínculos con la inmunidad adaptativa. Tanto las células T como las B están activadas. El IFN-a promueve la inducción de una respuesta inmunitaria Th1, siendo un mecanismo posiblemente a través del aumento de la expresión de la proteína 10 inducible por IFN-a (IP-10) en las células dendríticas. Pocos estudios se ocupan del papel de los subtipos en la regulación de los T auxiliares mientras se mejora la actividad citolítica tanto de las células T como de las células NK.

El IFN-a puede tener un papel clave en la regulación de la respuesta Th1. Se ha demostrado que el tratamiento con IFN-a promueve la diferenciación de las células Th1 indirectamente (en gran parte a través de IFN-y), pero también parece suprimir el desarrollo de las células Th2 mediante la supresión de la expresión de los genes IL-4 e IL-13. Por lo tanto, el IFN-a puede restablecer un equilibrio de población Th1/Th2 en enfermedades e infecciones que promueven un desequilibrio de células Th2. En los últimos años, se hizo evidente que, además de sus efectos antivirales, el IFN-a ejerce varias funciones inmunomoduladoras. El IFN-a puede tener un impacto en la diferenciación de las células dendríticas y controla la expresión de diversas citocinas proinflamatorias, como IL-8 o IL-18, e induce varios mediadores antiinflamatorios, como el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1 Ra), el receptor soluble p55 del TNF y la proteína de unión de IL-10 e IL-18. Sin embargo, los mecanismos de acción del IFN-a todavía se comprenden solo en parte.

En pacientes con alergia o enfermedad alérgica, se genera una respuesta inmunitaria predominantemente Th2. Las células Th2 secretan IL-4 e IL-13, que impulsan a las células B a producir anticuerpos de inmunoglobulina E (IgE) específicos para un alérgeno. Un alérgeno es un antígeno capaz de estimular una reacción de hipersensibilidad de tipo I en individuos atópicos, principalmente a través de respuestas mediadas por inmunoglobulina E (IgE). Después de eso, la IgE se une a su receptor de alta afinidad en los mastocitos, las células de la piel y tejidos de las mucosas. Tras la exposición al alérgeno, los mastocitos liberan su contenido, que incluye histamina, leucotrienos y prostaglandinas. Esto causa síntomas alérgicos que incluyen, entre otros, enrojecimiento de los ojos, picazón, secreción nasal, eccema, urticaria, angioedema, dificultad respiratoria, sibilancias, tos, un ataque de asma, dolor abdominal, vómitos, diarrea o incluso anafilaxia.

Las enfermedades alérgicas se encuentran entre las formas más comunes de enfermedad crónica. La Organización Mundial de la Salud estima que más del 20 por ciento de la población mundial se ve afectada y solo Europa tiene más de 80 millones de pacientes (Red europea de alergia y asma globales, 2008). Una reacción alérgica suele ser causada por la hipersensibilidad del sistema inmunológico a un alérgeno, lo que provoca una respuesta inmunitaria mal dirigida. Las alergias leves, como la fiebre del heno, son muy comunes en la población humana. Las alergias graves pueden ser causadas por alérgenos dietéticos, como los alimentos, por alérgenos ambientales, como el veneno de las picaduras de insectos, por medicamentos, o pueden estar determinadas genéticamente.

La alergia alimentaria es un problema de salud importante, que se estima que afecta a alrededor del 6% de los niños pequeños y al 3-4% de los adultos en las sociedades occidentales. Se supone que la alergia a los alimentos es el resultado de una degradación de la tolerancia oral a los antígenos o alérgenos ingeridos. Las alergias a los alimentos y las enfermedades alérgicas asociadas incluyen, sin limitación, alergia a los lácteos (leche), incluido el síndrome de Heiner, alergia a los huevos, alergia a la soja, alergia al pescado (mariscos), alergia a los cacahuetes y los frutos secos, alergia al ajonjolí y otras semillas, alergia al gluten (trigo) y a los cereales, alergia a frutas y verduras, alergia a la cafeína, síndrome oral alérgico, alergia al alcohol, síndrome de alergia alimentaria al polen, gastroenteritis eosinofílica, alergia alimentaria gastrointestinal mediada por IgE y deficiencia de esterasa C1.

La atención y el tratamiento de las enfermedades alérgicas se realizan generalmente a través de tres planteamientos generales: (i) evitar el alérgeno; (ii) medicamentos que se dirigen a los síntomas de la enfermedad y (iii) inmunoterapia convencional, conocida como desensibilización, que tiene como objetivo mejorar la respuesta Th 1 en la enfermedad establecida. Sin embargo, estos planteamientos están lejos de ser ideales. No siempre es posible evitar los alérgenos; los medicamentos que se dirigen a los síntomas de la enfermedad, como los antihistamínicos, brindan solo un alivio a corto plazo; y la desensibilización implica el uso del alérgeno real, lo que puede provocar efectos secundarios dañinos potencialmente frecuentes. La posibilidad de anafilaxia nunca se elimina por completo en pacientes que padecen enfermedades alérgicas y esto causa mucho estrés al paciente y su familia.

El presente inventor sostiene que sería deseable desarrollar un planteamiento inmunoterapéutico que implique un uso más seguro de un alérgeno, ya que pueden emplearse dosis más bajas y que proporcione protección a más largo plazo contra la reacción alérgica. Dado que la alergia es el resultado de una sobrerreactividad de las células Th2/Th17 y la correspondiente falta de actividad de la respuesta Th1, un medicamento que sea capaz de modificar y equilibrar una respuesta Th2/Th17 mal dirigida sería beneficioso para prevenir la reacción alérgica. Tal medicamento sería además adecuado para tratar enfermedades y afecciones, como la EII, en las que una respuesta Th17 exagerada desempeña un papel. Además, el inventor considera que la capacidad de potenciar una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y suprimir una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17 sería útil en la provisión de composiciones que median la respuesta inmunitaria en sujetos con cáncer.

Compendio de la invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones.

Tras amplia experimentación, el presente inventor ha hecho el sorprendente descubrimiento de que la administración de un subtipo de interferón alfa (IFN-a) específico seleccionado entre IFN-a10, IFN-a14, un híbrido de los mismos, incluyendo preferiblemente el híbrido los sitios primarios de unión del receptor de interferón de IFN-a10 e IFN-a14 o mezclas de al menos dos de IFN-a10, IFN-a14, o un híbrido de los mismos como parte de una composición para modular el sistema inmunitario, tal como una vacuna, que comprende, por ejemplo, un alérgeno, puede dan como resultado una activación mejorada de la respuesta inmunitaria Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria Th2/Th17. Esto ha conducido a la identificación, por parte del inventor, de composiciones terapéuticas mejoradas que tienen utilidad en el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y enfermedades alérgicas y enfermedades y afecciones en las que desempeña un papel una respuesta Th17 exagerada y también para el cáncer. En particular, el inventor ha identificado que la administración de al menos un alérgeno alimentario que es capaz de mediar una respuesta inmunitaria Th2/Th17 con IFN-a10, IFN-a14 o un híbrido de los mismos, incluyendo preferiblemente el híbrido los sitios primarios de unión del receptor de interferón IFN-a10 e IFN-a14 se puede usar en el tratamiento de alergias alimentarias y enfermedades alérgicas asociadas.

Además, el inventor ha identificado que la administración de un antígeno tumoral, ya sea un antígeno asociado a un tumor o un antígeno específico del tumor, en combinación con un subtipo de interferón alfa específico (IFN-a) seleccionado entre IFN-a10, o IFN-a14, o un híbrido del mismo, preferiblemente en el que el híbrido incluye los sitios primarios de unión del receptor de interferón de IFN-a10 e IFN-a14 o mezclas de al menos dos de IFN-a10, IFN-a14, o un híbrido de los mismos como parte de una composición para modular el sistema inmunitario, como una vacuna, se puede utilizar en el tratamiento del cáncer. De manera adecuada, el cáncer puede ser cáncer de hígado, cáncer de pulmón, en particular cáncer pulmonar no microcítico, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de piel, melanoma o cáncer genitourinario. De forma adecuada, el antígeno asociado al tumor puede seleccionarse de un tumor de próstata, un tumor de células renales y un tumor de vejiga.

Por consiguiente, un primer aspecto de la presente divulgación proporciona un tratamiento y/o una profilaxis de una afección en la que se desean una mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th 1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17, comprendiendo dicho método la etapa de:

(i) administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un subtipo de interferón alfa seleccionado entre IFN-a10, IFN-a14 y un híbrido de los mismos, incluyendo el híbrido los sitios primarios de unión del receptor de interferón IFN-a10 e IFN-a14.

En algunas realizaciones, a un sujeto que lo necesite se le puede administrar una mezcla de al menos dos de IFN-a10, IFN-a14 o un híbrido de los mismos.

Sin desear entrar en consideraciones teóricas, el inventor cree que las proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de IFN-a10 tienen mayor afinidad por el receptor de interferón 2 y las proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de IFN-a14 tienen mayor afinidad por el receptor de interferón 1. Así, la sustitución de una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de IFN-a10 por aminoácidos de IFN-a14 que permiten la unión al receptor de interferón 1 o la sustitución de una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de IFN-a14 por aminoácidos de IFN-a10 que permiten la unión al receptor de interferón 2 se considera que proporciona una proteína híbrida IFN-a10 IFN-a14 que debería tener una afinidad de unión más fuerte a ambos receptores de interferón 1 y 2 que el IFN-a10 o el IFN-a14 por sí solos. La inclusión de los sitios primarios de unión del receptor de interferón de IFN-a10 e IFN-a14 significa que el híbrido comprende aminoácidos seleccionados de IFN-a10 y sustituidos en una secuencia de aminoácidos de IFN-a14 para mejorar la capacidad de un subtipo de IFN-a14 para unirse a un receptor de interferón 2 y/o que el híbrido comprende aminoácidos seleccionados de IFN-a14 y sustituidos en una secuencia de aminoácidos de IFN-a10 para mejorar la capacidad de un subtipo de IFN-a10 de unirse a un receptor de interferón 1.

De manera adecuada, varias sustituciones de aminoácidos de una proteína que comprenden una secuencia de aminoácidos de IFN-a10 con aminoácidos de IFN-a14 que se determina que están involucrados en la unión al receptor de interferón 1 pueden mejorar la unión de la proteína al receptor de interferón 1. De manera adecuada, la sustitución de aminoácidos de la proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de IFN-a14 por aminoácidos de IFN-a10 que se determina que están implicados en la unión al receptor de interferón 2 puede potenciar la unión de la proteína al receptor de interferón 2.

En algunas realizaciones, el híbrido de IFN-a10 IFN-a14 puede tener sustancialmente la secuencia de aminoácidos de IFN-a10, pero estar modificado en una región entre los residuos de aminoácidos 80 a 120, adecuadamente los residuos de aminoácidos 92 a 115 o adecuadamente entre los residuos de aminoácidos 90 a 110 o adecuadamente entre los residuos de aminoácidos 84 a 104 (utilizando la numeración de la secuencia de IFN-a10 proporcionada en la Figura 16) para proporcionar los aminoácidos proporcionados por la secuencia de IFN-a14. Se considera que los residuos de aminoácidos en estas regiones o partes de estas regiones proporcionan la unión de IFN-a14 al receptor de interferón 1. En particular, la secuencia híbrida puede incluir al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos 4, al menos 5 o 6 modificaciones de la secuencia de IFN-a10 para proporcionar los residuos correspondientes de la secuencia de IFN-a14 (los residuos adecuadamente sustituidos se indican en negrita en la Figura 9) o una mutación conservada de los mismos. En algunas realizaciones, se proporcionan seis modificaciones según lo indicado por los aminoácidos señalados en negrita en la Figura 9. En realizaciones alternativas, el IFN-a14 se puede utilizar como una estructura principal del híbrido y los residuos que difieren entre las secuencias de IFN-a10, IFN-a14 en las regiones terminales N y C de las secuencias se pueden proporcionar en la secuencia híbrida como las presentes en la secuencia de IFN-a10. De forma adecuada, se pueden realizar al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6 o 7 sustituciones de la secuencia N-terminal de IFN-a14 para proporcionar la secuencia híbrida para proporcionar residuos de IFN-a10 en las posiciones de aminoácidos en las que los aminoácidos no son compartidos/comunes entre IFN-a10 e IFN-a14. De manera adecuada, se proporcionan al menos 1, al menos 2 o 3 sustituciones en la secuencia terminal C de IFN-a14 para proporcionar residuos de IFN-a10 a la secuencia híbrida en las posiciones de aminoácidos que no son compartidas/comunes entre IFN-a10 y IFN-a14. En algunas realizaciones, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6 o 7 sustituciones de la secuencia N-terminal y al menos 1, al menos 2 o 3 sustituciones de la secuencia C-terminal del IFN-a14 se hacen para proporcionar residuos de IFN-a10 al híbrido en las posiciones de aminoácidos que tienen aminoácidos que no son compartidos/comunes entre IFN-a10 e IFN-a14.

En algunas realizaciones, el híbrido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o un fragmento funcionalmente activo o una variante de la misma.

En ciertas realizaciones, el método incluye una etapa de administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de vacuna para el tratamiento o la profilaxis de la afección en la que se desean la mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17. La composición de vacuna se puede administrar secuencialmente, por separado o simultáneamente con el al menos un subtipo de interferón alfa.

Por funcionalmente activo se entiende un péptido híbrido IL-a10 IL-a14 que comprende los sitios primarios de unión de interferón de IFN-a10 e IFN-a14 en el que la administración de péptido a un sujeto o la expresión de péptido en un sujeto promueve la mejora de una respuesta inmunitaria medicada con Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17. Además, la actividad funcional puede estar indicada por la capacidad de un péptido híbrido para potenciar una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y para suprimir una respuesta mediada por Th2/Th17.

Un fragmento puede comprender al menos 50, preferiblemente 100 y más preferiblemente 150 o más aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 y que es funcionalmente activa. De forma adecuada, se puede determinar un fragmento usando, por ejemplo, deleción C-terminal en serie de ADNc tal como la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3. Dichos constructos de deleción pueden luego clonarse en plásmidos adecuados. La actividad de estos mutantes por deleción se puede someter luego a ensayo para determinar la actividad biológica como se describe en la presente memoria.

Por variante se entiende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70% homóloga a la SEQ ID NO: 1, más preferiblemente al menos 80% homóloga a la SEQ ID NO: 1, más preferiblemente al menos 90% homóloga a la SEQ ID NO: 1, incluso más preferiblemente al menos 95% homólogo a la SEQ ID NO: 1, incluso más preferiblemente al menos 96% homóloga a la SEQ ID NO: 1, incluso más preferiblemente al menos 97% homóloga a la SEQ ID NO: 1 y más preferiblemente al menos 98% de homología con la SEQ ID NO: 1. Una variante engloba una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 1 que incluye la sustitución de aminoácidos, especialmente una sustitución o sustituciones que son conocidas por tener una alta probabilidad de no conducir a ninguna modificación significativa de la actividad biológica o la configuración, o el plegamiento, de la proteína. Estas sustituciones, normalmente denominadas sustituciones conservadas, son conocidas en la técnica. Por ejemplo, el grupo de arginina, lisina e histidina son aminoácidos básicos intercambiables conocidos. De forma adecuada, en algunas realizaciones, pueden sustituirse entre los aminoácidos de carga, tamaño o hidrofobicidad iguales sí. De forma adecuada, cualquier sustitución puede seleccionarse en función del análisis de alineaciones de secuencias de aminoácidos de subtipos de interferón alfa para proporcionar sustituciones de aminoácidos en aminoácidos que están presentes en otros subtipos alfa en posiciones similares o idénticas cuando las secuencias están alineadas. Pueden generarse híbridos y variantes y fragmentos de los mismos usando métodos de biología molecular adecuados conocidos en la técnica.

En ciertas realizaciones, la composición de vacuna comprende al menos un antígeno. En ciertas realizaciones, la composición de vacuna comprende al menos un alérgeno capaz de mediar una respuesta inmunitaria Th2/Th17; por ejemplo, un alérgeno alimentario.

En aspectos y realizaciones de la invención, el antígeno puede ser un antígeno tumoral; por ejemplo, un antígeno tumoral específico o un antígeno asociado a un tumor; en particular, un antígeno tumoral puede ser de un carcinoma hepático, cáncer de pulmón, en particular cáncer pulmonar no microcítico, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de piel, melanoma o de un cáncer genitourinario. En particular, un antígeno de un cáncer genitourinario puede incluir un antígeno de un cáncer de próstata, carcinoma de células renales o cáncer de vejiga. De forma adecuada, un antígeno puede ser un antígeno tumoral específico o un antígeno asociado a un tumor proporcionado en una vacuna contra el cáncer existente en uso o en desarrollo que se beneficiaría de un adyuvante que mejore la inmunidad de las células T, en particular que mejore una respuesta Th1 o proporcione una mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17. De forma adecuada, puede obtenerse un antígeno tumoral específico o asociado a un tumor a partir de un tumor de un sujeto que ha de ser tratado. En algunas realizaciones, solo se puede usar un antígeno asociado a un tumor.

En algunas realizaciones, un antígeno tumoral, en particular un antígeno asociado, puede ser un antígeno para un antígeno de cáncer de próstata, en particular un antígeno específico de próstata. De manera adecuada, puede usarse un método para proporcionar un antígeno específico de próstata o un antígeno de cáncer de próstata con los subtipos de interferón alfa de la invención para tratar el cáncer de próstata, específicamente el cáncer de próstata resistente a la castración.

Como apreciará un médico, los sujetos que se beneficiarán más de tales tratamientos pueden ser aquellos con enfermedad mínima, ya que puede haber menos posibilidades de aumentar la supresión tumoral del sistema inmunológico; adicional o alternativamente, dichos tratamientos pueden beneficiar a sujetos con enfermedad avanzada, que pueden tener una inmunosupresión tumoral significativa y pueden beneficiarse más del uso de vacunas en combinación con otras formas de tratamiento. De forma adecuada, el uso de vacunas que incluyen antígenos tumorales, en particular antígenos asociados a tumores, puede combinarse con otras formas de inmunoterapia; por ejemplo, Sunitinib (Sutent de Pfizer), un inhibidor de la tirosina quinasa.

En algunas realizaciones, pueden seleccionarse antígenos tumorales específicos, en particular antígenos asociados a tumores, de los antígenos utilizados en las vacunas T roVax y Prostvac contra el cáncer de próstata.

En algunas realizaciones, puede seleccionarse un antígeno tumoral, en particular un antígeno asociado a tumor, de carcinoma de células renales. De forma adecuada, se puede seleccionar un antígeno tumoral, por ejemplo, un antígeno asociado a tumor para carcinoma de células renales, de una proteína de choque térmico o de proteínas de lisados de células tumorales renales, en particular el antígeno usado en la posible vacuna MVA-5T4.

De forma adecuada, un antígeno tumoral puede ser MUC1 de melanoma.

En algunas realizaciones, puede seleccionarse un antígeno tumoral, por ejemplo, un antígeno asociado a un tumor, de cáncer de vejiga. De forma adecuada, se pueden seleccionar un antígeno asociado a tumores de la vacuna contra el bacilo de Calmette y Guérin (BCG), péptidos de epítopos restringidos del antígeno leucocitario humano A*2402, factor estimulante de colonias de gonadotropina coriónica humana del péptido de inmucina (una vacuna sintética 21 -mérica compuesta por el péptido señal completo de la proteína MUC1) o gonadotropina beta coriónica humana.

En ciertas realizaciones, el método incluye, por lo tanto, una etapa de administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un alérgeno capaz de mediar una respuesta inmunitaria Th2/Th17; por ejemplo, un alérgeno alimentario o un antígeno tumoral, por ejemplo un antígeno asociado a un tumor. El alérgeno puede administrarse secuencialmente, por separado o simultáneamente con el al menos un subtipo de interferón alfa.

Normalmente, el sujeto es un mamífero, en particular un ser humano. En ciertas realizaciones, el sujeto puede padecer una afección en la que se desean una mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17.

Según un segundo aspecto de la presente divulgación, se proporciona al menos un subtipo de interferón alfa seleccionado entre IFN-a10, IFN-a14 y un híbrido de los mismos, comprendiendo el híbrido los sitios primarios de unión de interferón de IFN-a10 e IFN-a14, en particular la SEQ ID NO: 1 o un fragmento o variante de la misma para su uso en el tratamiento y/o la profilaxis de una afección en la que se desean una mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17.

En algunas realizaciones se proporciona una mezcla de al menos dos de IFN-a10, IFN-a14 o un híbrido de los mismos.

En ciertas realizaciones, se proporciona el al menos un subtipo de interferón alfa, en particular un subtipo híbrido de IFN-a10 e IFN-a14, por ejemplo la SEQ ID NO: 1, como se describe en el presente documento, para la administración simultánea, separada o secuencial con una composición de vacuna para el tratamiento o la profilaxis de la afección en la que se desean una mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17. En ciertas realizaciones, el al menos un subtipo de interferón alfa se proporciona para la administración simultánea, separada o secuencial con al menos un alérgeno capaz de mediar una respuesta inmunitaria Th2/Th17 contra, por ejemplo, un alérgeno alimentario o un antígeno tumoral; en particular, un antígeno asociado a un tumor.

Según un tercer aspecto de la presente divulgación, se proporciona el uso de al menos un subtipo de interferón alfa seleccionado entre IFN-a10, IFN-a14 y un híbrido de los mismos, comprendiendo el híbrido los sitios primarios de unión de interferón de IFN-a10 e IFN-a14, pudiendo ser el híbrido, en particular, la SEQ ID NO: 1 o una variante o un fragmento de la misma, en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de una afección en la que se desean una mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una la respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17.

En ciertas realizaciones, se proporciona el al menos un subtipo de interferón alfa para la administración simultánea, separada o secuencial con una composición de vacuna para el tratamiento o la profilaxis de la afección en la que se desean una mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17. En ciertas realizaciones, se proporciona el al menos un subtipo de interferón alfa para la administración simultánea, separada o secuencial con al menos un alérgeno capaz de mediar la respuesta inmunitaria Th2/Th17 contra, por ejemplo, un alérgeno alimentario o un antígeno tumoral; en particular, un antígeno asociado a un tumor.

Según un aspecto adicional de la presente divulgación, se proporciona una composición que comprende:

(i) una vacuna para el tratamiento o la profilaxis de una afección en la que se desean una mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17; y

(ii) al menos un subtipo de interferón alfa seleccionado entre IFN-a10, IFN-a14 y un híbrido de los mismos, comprendiendo el híbrido, en particular, los sitios primarios de unión de interferón de IFN-a10 e IFN-a14, pudiendo el híbrido, en particular, ser la SEQ ID NO: 1 o una variante o fragmento, como se describe en la presente memoria.

En ciertas realizaciones, la vacuna comprende al menos un alérgeno capaz de mediar una respuesta inmunitaria Th2/Th17, por ejemplo, un alérgeno alimentario o un antígeno tumoral, en particular un antígeno asociado a un tumor.

Un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica para la mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17, comprendiendo la composición una vacuna para el tratamiento o la profilaxis de una afección en la que se desean una mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17 y al menos un subtipo de interferón alfa seleccionado entre IFN-a10, IFN-a14 y un híbrido de los mismos, comprendiendo el híbrido, en particular, los sitios primarios de unión de interferón de IFN-a10 e IFN-a14, pudiendo ser el híbrido, en particular, la SEQ ID NO: 1 o un fragmento o variante de la misma, junto con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

En ciertas realizaciones, la vacuna comprende al menos un alérgeno capaz de mediar una respuesta inmunitaria Th2/Th17; por ejemplo, un alérgeno alimentario o un antígeno tumoral, en particular un antígeno asociado a un tumor.

En un aspecto adicional, la presente divulgación se extiende a mejoras en la eficacia de las vacunas; por ejemplo, vacunas antialérgicas o para enfermedades alérgicas o vacunas contra tumores o cáncer, en particular vacunas contra el cáncer genitourinario; por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer renal y/o cáncer de vejiga. El inventor ha identificado con sorpresa que una composición que comprende una vacuna para el tratamiento o la profilaxis de una afección en la que se desean una mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17, tal como al menos un alérgeno capaz de mediar una respuesta inmunitaria de Th2/Th17, y al menos un subtipo de interferón alfa seleccionado entre IFN-a10, IFN-a14 y un híbrido de los mismos en particular, comprendiendo el híbrido los sitios primarios de unión de interferón de IFN-a10 e IFN-a14, en particular la SEQ ID NO: 1 o una variante o fragmento de la misma, constituye una composición inesperadamente eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades tales como alergia o enfermedades alérgicas asociadas.

Por consiguiente, un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona una composición de vacuna que comprende:

(ii) al menos un subtipo de interferón alfa seleccionado entre IFN-a10, IFN-a14 y un híbrido de los mismos, comprendiendo el híbrido, en particular, los sitios primarios de unión de interferón de IFN-a10 e IFN-a14, pudiendo ser, en particular, la SEQ ID NO: 1 o una variante o fragmento de la misma.

Un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona una composición de vacuna para su uso en el tratamiento y/o la profilaxis de alergia o cáncer, en particular cáncer genitourinario —por ejemplo cáncer de próstata, cáncer de riñón o cáncer de vejiga—, donde se desean la mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17, comprendiendo dicha composición de vacuna:

(i) al menos un alérgeno capaz de mediar una respuesta inmunitaria Th2/Th17; y

(ii) al menos un subtipo de interferón alfa seleccionado entre IFN-a10, IFN-a14 y un híbrido de los mismos, en particular un subtipo híbrido de IFN-a10 e IFN-a14; por ejemplo la SEQ ID NO: 1 o una variante o fragmento, según se describe en la presente memoria.

Un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona el uso de una composición de vacuna que comprende al menos un alérgeno capaz de mediar una respuesta inmunitaria Th2/Th17 y al menos un subtipo de interferón alfa seleccionado entre IFN-a10, IFN-a14 y un híbrido de los mismos, comprendiendo el híbrido, en particular, los sitios primarios de unión de interferón de IFN-a10 e IFN-a14, pudiendo ser el híbrido, en particular, la SEQ ID NO: 1 o una variante o fragmento de la misma, en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de alergias o enfermedades alérgicas asociadas, o cáncer, en particular cáncer genitourinario; por ejemplo cáncer de próstata, cáncer renal o cáncer de vejiga.

Un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona un tratamiento y/o una profilaxis de alergia o enfermedades alérgicas asociadas o de cáncer; en particular, cáncer genitourinario —por ejemplo cáncer de próstata, cáncer renal o cáncer de vejiga—, comprendiendo el método la etapa de:

administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de vacuna o una composición inmunogénica que comprende al menos un alérgeno capaz de mediar una respuesta inmunitaria Th2/Th17 y al menos un subtipo de interferón alfa seleccionado entre IFN-a10, IFN-a14 y un híbrido de los mismos, comprendiendo el híbrido, en particular, los sitios primarios de unión de interferón de IFN-a10 e IFN-a14, pudiendo ser el híbrido, en particular, la SEQ ID NO: 1 o un fragmento o variante de la misma para un sujeto que lo necesite.

Según un aspecto adicional de la presente divulgación, se proporciona un tratamiento y/o una profilaxis de una afección mediada por una expresión mejorada de IL-17, comprendiendo dicho método la etapa de:

administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un subtipo de interferón alfa seleccionado entre IFN-a10, IFN-a14 y un híbrido de los mismos, comprendiendo el híbrido, en particular, los sitios primarios de unión de interferón de IFN-a10 e IFN-a14; en particular la SEQ ID NO: 1 o un fragmento o variante de la misma.

Según un aspecto adicional de la presente divulgación, se proporciona al menos un subtipo de interferón alfa que comprende o consiste en un híbrido de IFN-a10 e IFN-a14, comprendiendo el híbrido, en particular, los sitios primarios de unión de interferón de IFN-a10 e IFN-a14, en particular la SEQ ID NO: 1 o una variante o fragmento de la misma para su uso en el tratamiento y/o la profilaxis de una afección mediada por la expresión potenciada de IL-17.

De manera adecuada, en aspectos y realizaciones de la invención, el híbrido puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

Según un aspecto adicional de la presente divulgación, se proporciona el uso de al menos un híbrido de subtipos de interferón alfa IFN-a10 e IFN-a14, comprendiendo el híbrido, en particular, los sitios primarios de unión del interferón de IFN-a10 e IFN-a14, en particular la SEQ ID NO: 1 o una variante o fragmento de la misma, en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de una afección mediada por la expresión potenciada de IL-17.

Según un aspecto adicional de la presente divulgación, se proporciona la modulación de una respuesta inmunitaria, comprendiendo dicho método la etapa de:

(i) administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un híbrido de subtipos de interferón alfa IFN-a10 e IFN-a14, comprendiendo el híbrido los sitios primarios de unión de interferón de IFN-a10 e IFN-a14, y pudiendo ser, en particular, la SEQ ID NO: 1 o una variante o fragmento de la misma.

Según un aspecto adicional de la presente divulgación, se proporciona al menos un híbrido de subtipos de interferón alfa IFN-a10 e IFN-a14, comprendiendo el híbrido los sitios primarios de unión del interferón de IFN-a10 e IFN-a14, y pudiendo ser, en particular, la SEQ ID NO: 1 o una variante o fragmento de la misma para su uso en la modulación de una respuesta inmunitaria.

Según un aspecto adicional de la presente divulgación, se proporciona el uso de al menos un híbrido de interferón alfa de subtipo IFN-a10 y de subtipo de IFN-a14, comprendiendo el híbrido los sitios primarios de unión de interferón de IFN-a10 e IFN-a14, y, en particular, la SEQ ID NO: 1 o una variante o fragmento de la misma en la preparación de un medicamento para modular una respuesta inmunitaria.

En ciertas realizaciones de los aspectos de la invención descritos anteriormente, se proporciona el al menos un subtipo de interferón alfa para la administración simultánea, separada o secuencial con una vacuna para el tratamiento o la profilaxis de la afección en la que se desean la mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17; por ejemplo, una vacuna para el tratamiento o la profilaxis de una afección mediada por la expresión mejorada de IL-17; por ejemplo, una enfermedad o afección inflamatoria o una enfermedad autoinmunitaria, como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), la colitis ulcerosa (CU) o la enfermedad de Crohn (EC), el cáncer, adecuadamente cáncer hepático, cáncer de pulmón, en particular el cáncer pulmonar no microcítico, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de piel, melanoma o cáncer genitourinario, en particular cáncer genitourinario, por ejemplo cáncer de próstata, cáncer renal o cáncer de vejiga. En ciertas realizaciones, la composición de vacuna comprende al menos un antígeno. En ciertas realizaciones, la vacuna comprende al menos un alérgeno capaz de mediar una respuesta inmunitaria Th2/Th17 ahí; por ejemplo, contra un alérgeno alimentario.

En ciertas realizaciones, el antígeno puede ser un antígeno tumoral, en particular un antígeno tumoral específico y/o asociado a un tumor.

En ciertas realizaciones de los aspectos de la divulgación, esbozados anteriormente, el al menos un subtipo de IFN-a comprende, consiste o es un híbrido de IFN-a10 IFN-a14 tal como una proteína de fusión, o una proteína recombinante o similar que incluye los sitios primarios de unión del receptor de interferón de IFN-a10 e IFN-a14 y, en particular, que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o una variante o fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el híbrido de IFN-a10 IFN-a14 puede glicosilarse. De forma adecuada, el híbrido de IFN-a10 IFN-a14 se puede glicosilar de manera similar al IFN-a14.

En ciertos aspectos de la invención esbozados anteriormente, el al menos un alérgeno es al menos un alérgeno alimentario o un alérgeno tumoral específico o asociado a un tumor; por ejemplo, un alérgeno de cáncer de próstata, un alérgeno de cáncer de riñón y/o un alérgeno de cáncer de vejiga. En ciertas realizaciones, el al menos un alérgeno es un alérgeno dietético, como los alimentos; un alérgeno medioambiental, como el veneno de las picaduras de insectos; o un medicamento.

En un aspecto adicional de la divulgación, se proporciona un polipéptido recombinante que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 1 o un fragmento o variante de la misma. Las secuencias de ácidos nucleicos derivadas de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 se proporcionan como SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente. Estas secuencias de ácidos nucleicos pueden formar aspectos adicionales de la invención.

En ciertos aspectos de la invención descritos anteriormente, el al menos un alérgeno alimentario se selecciona del grupo constituido, sin limitación, por maíz, ajo, avena, café, chocolate, encurtidos, trigo o gluten y sus productos o derivados, que incluyen trigo duro, espelta (triticum spelta), kamut (triticum polonicum), cuscús, salvado, salvado de trigo, germen de trigo, gluten de trigo, farina, biscote, sémola, sémola de trigo duro, harina, harina integral, harina de trigo, almidón de trigo, almidón, almidón modificado, almidón hidrolizado, almidón alimentario, almidón comestible, almidón vegetal, goma vegetal, proteína vegetal, carga de cereales, aglutinante de cereales, proteína de cereales; frutos secos (incluidos anacardos, almendras, macadamia, nueces y nueces de Brasil); semillas, incluidas semillas de ajonjolí, girasol y amapola; antígenos derivados de lácteos, tales como leche o derivados lácteos, incluidos queso y yogur; pescados o mariscos o sus derivados, incluidos los del filo Mollusca (clase de gasterópodos: caracoles y abulones; clase de bivalvos: almejas, mejillones y ostras; clase de cefalópodos: pulpos, calamares y vieiras), los del filo Arthropoda (familia de crustáceos: cangrejos, langostas, camarones, langostino y cangrejo de río) o los del filo Chordata (familia cartilaginosa: rayas y tiburones; peces óseos: bacalao, salmón y atún); huevos o derivados del huevo; glutamato monosódico (MSG, por sus siglas en inglés); sulfitos o dióxido de azufre; alergias a las leguminosas de la familia Leguminosae, que incluye cacahuete, soja (soja o derivados de la soja), semillas de judía, guisantes, judías verdes, lentejas, algarroba y regaliz; otras alergias a hortalizas como la patata; alergias a frutas de la familia de las rosáceas, que incluye manzana, pera, cereza, melocotón y ciruela; alergias a frutas de la familia de las cucurbitáceas, que incluye pepino, melón, sandía, calabacín y calabaza; y otras alergias a frutas como las desarrolladas contra kiwi, plátano, aguacate, tomates, fresas y frambuesas.

En ciertas realizaciones, la vacuna o la composición de la vacuna puede ser una composición de vacuna para el tratamiento o la profilaxis de una afección mediada por la expresión potenciada de IL-17; por ejemplo, una enfermedad o afección inflamatoria o una enfermedad autoinmunitaria, como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), la colitis ulcerosa (CU) o la enfermedad de Crohn (EC), o cáncer, adecuadamente cáncer hepático, cáncer de pulmón, cáncer pulmonar no microcítico, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de piel, melanoma o cáncer genitourinario, en particular cáncer genitourinario, por ejemplo cáncer de próstata, cáncer renal o cáncer de vejiga. En ciertas realizaciones, la vacuna o composición de vacuna puede ser una composición de vacuna para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad o afección inflamatoria o una enfermedad autoinmunitaria, como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), la colitis ulcerosa (CU) o la enfermedad de Crohn (EC).

En ciertas realizaciones de los aspectos de la invención descritos anteriormente, la afección en la que se desean una mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17 puede ser una afección mediada por una expresión mejorada de IL-17; por ejemplo, una enfermedad o afección inflamatoria o una enfermedad autoinmunitaria, como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), la colitis ulcerosa (CU) o la enfermedad de Crohn (EC).

En ciertas realizaciones de los aspectos de la invención descritos anteriormente, la afección en la que se desean una mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17 puede ser una enfermedad inflamatoria, en particular una enfermedad inflamatoria que está mediada por una respuesta inmunitaria Th17 exagerada o hiperactiva. En ciertas realizaciones de los aspectos de la invención descritos anteriormente, la afección en la que se desean una mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17 puede ser una enfermedad autoinmunitaria, en particular una enfermedad autoinmunitaria que está mediada por una respuesta inmunitaria Th17 exagerada o hiperactiva. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la afección puede ser una enfermedad inflamatoria intestinal (EII), como la colitis ulcerosa (CU) o la enfermedad de Crohn (EC). En ciertas realizaciones, la afección se puede seleccionar del grupo constituido por asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica y alergia alimentaria. En ciertas realizaciones, la afección es cáncer, en particular un cáncer genitourinario, en particular cáncer de próstata, cáncer de vejiga o cáncer renal.

En ciertas realizaciones de los aspectos de la invención descritos anteriormente, la afección en la que se desean una mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17 es una alergia o enfermedades alérgicas asociadas y afecciones causadas por la misma, o cáncer en el que se desea una respuesta inmunitaria contra un antígeno asociado a un tumor, en particular un antígeno asociado a un tumor de cáncer de próstata, cáncer de riñón o cáncer de vejiga. En particular, en ciertas realizaciones, la afección es una alergia alimentaria que incluye alergias asociadas a alimentos o derivadas de ellos, y enfermedades alérgicas asociadas y afecciones causadas por las mismas.

En ciertas realizaciones, las enfermedades o afecciones alérgicas asociadas a la alergia alimentaria incluyen, sin limitación, alergia a la leche/productos lácteos, incluido el síndrome de Heiner, alergia a los huevos, alergia a la soja, alergia al pescado (mariscos), alergia a los cacahuetes y los frutos secos, alergia al ajonjolí y a otras semillas, alergia al trigo y a los cereales, alergia a frutas y verduras, alergia a la cafeína, síndrome oral alérgico, alergia al alcohol, síndrome de alergia alimentaria al polen, gastroenteritis eosinofílica, alergia alimentaria gastrointestinal mediada por IgE y deficiencia de esterasa C1.

En ciertas realizaciones de la presente invención, el método de administración es la administración oral. En ciertas realizaciones, el método de administración es la administración sublingual o bucal. En ciertas realizaciones, el método de administración implica colocar una pastilla debajo de la lengua del paciente. En ciertas realizaciones, la vía de administración es ocular o mediante introducción en la cavidad nasal, mediante administración nasal. También se puede introducir mediante la administración oral (deglución) de una cápsula o dispositivo similar en el intestino delgado/duodeno de manera que la cápsula no se disuelva en el estómago, sino que lo desvíe y libere/libere el subtipo de interferón alfa solo en el intestino delgado/duodeno.

Descripción detallada de la invención

El inventor de la presente invención ha descubierto con sorpresa que la administración de un subtipo de IFN-a seleccionado entre IFN-a10, IFN-a14 y un híbrido de los mismos, en particular un subtipo híbrido de IFN-a10 e IFN-a14, por ejemplo la SEQ ID NO: 1, como se describe en la presente memoria, da como resultado la mejora de una respuesta inmunitaria mediada por células T Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por células T Th2/Th17 y, por lo tanto, puede dar un sesgo a la respuesta inmunitaria hacia una ruta mediada por células (Th1), mientras que simultáneamente suprime la respuesta alérgica (Th2/Th17). Sorprendentemente, este efecto aumenta cuando el subtipo de IFN-a se administra por vía oral. Este hallazgo se puede aplicar para proporcionar un método mejorado y una composición adyuvante mejorada para tratar y/o prevenir afecciones en las que se desean la potenciación de una respuesta inmunitaria mediada por células T Th 1 y/o la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por células T Th2/Th17; por ejemplo, afecciones inflamatorias, autoinmunitarias o alérgicas, o cáncer (incluidas afecciones malignas), en particular cánceres genitourinarios, en particular cáncer de próstata, cáncer renal o cáncer de vejiga. En particular, IFN-a10, IFN-a14 o un híbrido de los mismos, comprendiendo el híbrido, en particular, los sitios primarios de unión de interferón de IFN-a10 e IFN-a14, y en particular la SEQ ID NO: 1 o un fragmento o variante de la misma, puede ser utilizado como adyuvante en vacunas para estimular la respuesta inmunitaria a los antígenos y dirigir la respuesta inmunitaria hacia una respuesta inmunitaria Th1.

El inventor también ha descubierto que una combinación de una composición de vacuna o un alérgeno de antígeno asociado a un tumor o específico de un tumor o de un alimento que es capaz de mediar una respuesta inmunitaria Th2/Th17 y un subtipo de IFN-a seleccionado entre IFN-a10, IFN-a14 y un híbrido de los mismos, en particular un híbrido que comprende los sitios primarios de unión de interferón de IFN-a10 e IFN-a14, y en particular la SEQ ID NO: 1 o un fragmento o variante de la misma puede dar lugar a la activación de una respuesta inmunitaria mediada por células T Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por células T Th2/Th17.

La progresión del tumor en sujetos inmunocompetentes normales puede reflejar una falla del sistema inmunitario para reconocer los antígenos tumorales o una subversión de la respuesta inmunitaria antitumoral a través de la inducción y la activación de células T reguladoras. En sujetos con coriocarcinoma hepático (CCH), los estudios de las células con IL-17 a han sugerido un papel potencial prototumoral de la IL-17. El aumento de la densidad de células productoras de IL-17 dentro de los tumores de pacientes con CCH se correlaciona tanto con la densidad de microvasos como con un mal pronóstico. Además, en sujetos con cáncer de ovario y de pulmón no microcítico, los niveles más altos de IL-17 dentro del tumor se correlacionaron con una mayor densidad de vasos sanguíneos y una supervivencia más corta. Además, se ha sugerido que la IL-17 tiene funciones proangiogénicas y esto no se ha restringido a poblaciones de células particulares. Además, se ha demostrado que las células productoras de IL-17A o IL-17A están elevadas en el entorno de los tumores de mama y se correlacionan con un mal pronóstico.

El aislamiento de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL, por sus siglas en inglés) de biopsias de cáncer de mama reveló que estas células secretaban cantidades significativas de IL-17A y que la IL-17A recombinante recluta la vía MAPK regulando al alza las ERK 1/2 fosforiladas en líneas de cáncer de mama humano promoviendo así la proliferación y la resistencia frente a agentes quimioterapéuticos convencionales como Docetaxel. También se ha indicado que la IL-17A estimula la migración y la invasión de las células del cáncer de mama. Es importante destacar que los anticuerpos neutralizantes de IL-17A anularon estos efectos, lo que demuestra el papel fisiopatológico de la IL-17A como una posible diana terapéutica para el cáncer de mama. Por lo tanto, la determinación por parte del inventor de activar una respuesta inmunitaria mediada por células T Th1 y suprimir una respuesta inmunitaria mediada por células T Th2/Th17 es significativa y de utilidad en el cáncer. Así, la presente invención se puede utilizar para el tratamiento y la profilaxis de cualquier afección cancerosa o maligna conocida.

Además, el inventor ha descubierto con sorpresa que la administración oral del antígeno y el subtipo de IFN-a seleccionado entre IFN-a10, IFN-a14 y un híbrido de los mismos, en particular, un híbrido que comprende los sitios primarios de unión de interferón de IFN-a10 e IFN-a14, y en particular, la SEQ ID NO: 1 o un fragmento o variante de la misma en combinación como se describe en la presente memoria puede dar como resultado la activación de una respuesta inmunitaria mediada por células T Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por células T Th2/Th17. Se mezcló una vacuna estándar contra la gripe con una dosis baja de interferón alfa derivado de leucocitos (LDA1, por sus siglas en inglés) y se administró por vía oral a ratones. El inventor observó que, sin el interferón, se registró una pequeña respuesta de anticuerpos contra la gripe en ratones, que fue aproximadamente 50 veces menor que con una vacuna inyectada. Con interferón-alfa, la respuesta de la vacuna administrada por vía oral fue exactamente la misma que la de la vacuna inyectada. Una serie de inmunizaciones bucales usando un antígeno proteico estándar y dos interferones, LDA1 y un subtipo IFN-a14 aislado, dio como resultado, sorprendentemente, la inmunización oral de ratones a los que se administró la composición. Sin embargo, el inventor observó con sorpresa que mientras que el LDA1 dio una respuesta equilibrada, el IFN-a14 medió solo una respuesta humoral significativa. La producción de IgG1 es indicativa de una respuesta Th2 (inmunidad humoral) y la producción de IgG2a es indicativa de una respuesta Th1 (inmunidad mediada por células).

Aunque no desea ceñirse a ninguna teoría, el inventor ha identificado que la administración oral de un alérgeno alimentario capaz de mediar una respuesta inmunitaria Th2/Th17 y un subtipo de interferón alfa seleccionado entre IFN-a10 e IFN-a14 puede dar un sesgo a la respuesta inmunitaria hacia una ruta mediada por células (Th1), mientras que simultáneamente suprime la respuesta alérgica (Th2/Th17). En consecuencia, el inventor ha demostrado sorprendentemente por primera vez que la coadministración de un alérgeno, tal como un antígeno derivado de alimentos que es causante de alergia o enfermedades alérgicas asociadas en un sujeto con ciertos subtipos de interferón, modula la respuesta inmunitaria resultante y le da un sesgo apartándola de la respuesta Th2/Th17 que se hubiera esperado que se desarrollara contra el alérgeno o antígeno. Este sorprendente hallazgo proporciona un planteamiento inesperado para tratar o prevenir respuestas alérgicas o enfermedades que se producen en sujetos como resultado de alérgenos, tales como alérgenos derivados de alimentos.

Definiciones

Sujeto

Como se define en el presente documento, un “sujeto” incluye y abarca mamíferos tales como seres humanos, primates y animales de cría (por ejemplo, ovejas, cerdos, vacas, caballos, asnos); animales de prueba de laboratorio tales como ratones, conejos, ratas y cobayas; y animales de compañía como perros y gatos.

T ratamiento/T erapia

El término “tratamiento” se usa en la presente memoria para hacer referencia a cualquier régimen que pueda beneficiar a un animal humano o no humano. El tratamiento puede ser con respecto a cualquier afección existente inflamatoria, autoinmunitaria, alérgica o asociada con alergia y el tratamiento puede ser profiláctico (tratamiento preventivo). El tratamiento puede incluir efectos curativos o paliativos. La referencia en la presente memoria al tratamiento “terapéutico” y “profiláctico” debe considerarse en su contexto más amplio. El término “terapéutico” no implica necesariamente que un sujeto sea tratado hasta la recuperación total. De manera similar, “profiláctico” no significa necesariamente que el sujeto no contraiga finalmente una enfermedad. Por consiguiente, el tratamiento terapéutico y/o profiláctico incluye la mejora de los síntomas de una afección alérgica particular o la prevención o la reducción del riesgo de desarrollar una afección alérgica particular. Puede considerarse que el término “profiláctico” reduce la gravedad o la aparición de una afección particular. “Terapéutico” también puede reducir la gravedad de una afección existente.

Administración

Los ingredientes activos usados en la presente invención (por ejemplo, vacuna o alérgeno e IFN-a10, IFN-a14 o un híbrido de los mismos), en particular un híbrido de los subtipos IFN-a10 e IFN-a14, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 descrita en la presente memoria, pueden ser administrados por separado al mismo sujeto, opcionalmente secuencialmente, o se pueden coadministrar simultáneamente como una composición farmacéutica, inmunogénica o de vacuna. En ciertas realizaciones, la vacuna o alérgeno se coadministra con el subtipo de interferón alfa. La composición farmacéutica comprenderá generalmente un excipiente, diluyente o vehículo farmacéutico adecuado seleccionado dependiendo de la vía de administración deseada.

Los ingredientes activos se pueden administrar por cualquier vía adecuada a un paciente que necesite tratamiento. La dosis precisa dependerá de varios factores, como se explica a continuación con más detalle.

Una vía de administración adecuada es la parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, por medio de, por ejemplo, un parche de goteo). Otras vías de administración adecuadas incluyen (sin limitación) oral, ocular, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), perfusión, intradérmica o administración por inhalación oral o nasal, por medio de, por ejemplo, un nebulizador o inhalador o por un implante. Las vías de administración preferidas incluyen (sin limitación) oral, bucal y sublingual. Las composiciones de la invención también se pueden administrar de tal manera que se dirijan o se liberen en áreas específicas del tracto intestinal (tal como el intestino delgado/duodeno). Normalmente, dicha liberación se producirá después del paso a través del estómago, y esta liberación dirigida se puede lograr mediante el uso de revestimientos y similares.

Para la inyección intravenosa, el ingrediente activo estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que esté libre de pirógenos y tenga un pH, una isotonicidad y una estabilidad adecuados. Los expertos en la técnica son capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección láctica de Ringer. Pueden incluirse conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según se requiera.

Las composiciones de la presente invención para administración oral pueden estar en forma de comprimido, cápsula, pastilla, polvo o líquido. La administración oral puede implicar colocar una pastilla debajo de la lengua del paciente. Un comprimido puede comprender un vehículo sólido como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente comprenden un vehículo líquido tal como agua, parafina, aceites de origen animal o vegetal, aceite mineral o aceite sintético. Se pueden incluir solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

Las composiciones de la presente invención también pueden administrarse mediante microesferas, liposomas, otros sistemas de suministro de micropartículas o formulaciones de liberación sostenida colocadas en ciertos tejidos, incluida la sangre. Ejemplos adecuados de vehículos de liberación sostenida incluyen matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos compartidos; por ejemplo, supositorios o microcápsulas. Se pueden encontrar ejemplos de las técnicas y los protocolos mencionados anteriormente y otras técnicas y protocolos que se pueden usar según la invención en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Gennaro, A.R., Lippincott Williams & Wilkins; 20a edición (15 de diciembre de 2000) ISBN 0-912734-04-3 y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems; Ansel, H.C. et al. 7a edición Is Bn 0-683305-72-7.

Composiciones farmacéuticas

Como se describió anteriormente, la presente invención se extiende a una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias y alergias, tales como alergia a alimentos y enfermedades alérgicas asociadas y, en particular, para la inducción de una respuesta inmunitaria Th1 y la supresión o inhibición de una respuesta inmunitaria Th2/Th17.

Las composiciones farmacéuticas según la presente invención, y para su uso según la presente invención, pueden comprender, además de un ingrediente activo, un excipiente, vehículo, estabilizador de tampón u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichos materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir en la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser, por ejemplo, oral, intravenosa, intranasal o por inhalación oral o nasal. La formulación puede ser un líquido; por ejemplo, una solución salina fisiológica que contiene un tampón sin fosfato a pH 6,8-7,6, o un polvo liofilizado o secado por congelación.

Dosis

La composición se administra preferiblemente a un individuo en una “cantidad terapéuticamente eficaz” o una “cantidad deseada”, siendo esto suficiente para mostrar un beneficio para el individuo. Como se define en el presente documento, la expresión “cantidad eficaz” significa una cantidad necesaria para obtener al menos parcialmente la respuesta deseada, o para retrasar el inicio o inhibir la progresión o detener por completo la aparición o el avance de una afección particular que se está tratando. La cantidad varía dependiendo de la salud y el estado físico del sujeto que se está tratando, del grupo taxonómico del sujeto que se está tratando, del grado de protección deseado, de la formulación de la composición, de la evaluación de la situación médica y de otros factores relevantes. Se espera que la cantidad se encuentre en un intervalo relativamente amplio, que puede determinarse mediante ensayos rutinarios. La prescripción de tratamiento —por ejemplo, las decisiones sobre la dosificación, etc.— es en última instancia responsabilidad y está a discreción de los médicos de cabecera, de médicos especialistas u otros doctores, y generalmente tienen en cuenta el trastorno que se va a tratar, la afección del paciente individual, el lugar del parto, el método de administración y otros factores conocidos por los médicos. Los médicos pueden determinar la dosis óptima basándose en una serie de parámetros que incluyen, por ejemplo, la edad, el sexo, el peso, la gravedad de la afección que se está tratando, el ingrediente activo que se administra y la vía de administración. Puede aplicarse una amplia gama de dosis. Considerando la administración oral a un paciente humano, por ejemplo, se pueden administrar de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 1000 pg de agente por dosis humana, opcionalmente para 3 a 4 dosis. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima y reducir los efectos secundarios. Por ejemplo, pueden administrarse varias dosis divididas a diario, semanalmente, mensualmente u otros intervalos de tiempo adecuados, o la dosis puede reducirse proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el significado comúnmente entendido por una persona experta en la técnica en el campo de la presente invención.

Enfermedad autoinmunitaria

La expresión “enfermedad autoinmunitaria”, como se usa en la presente memoria, se entiende que significa cualquier enfermedad o afección causada por el ataque a los tejidos del cuerpo por su propio sistema inmunológico.

A lo largo de la memoria descriptiva, a no ser que el contexto exija algo distinto, se entenderá que los términos “comprender” o “incluir”, o variaciones como “comprende” o “comprendiendo”, “incluye” o “incluyendo”, implican la inclusión de un número entero indicado o de un grupo de números enteros, pero sin la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros.

La presente invención se ejemplificará ahora con referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitativos que se proporcionan con un fin ilustrativo y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Otras realizaciones de esta invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica a la vista de esta descripción.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un gráfico de la producción de subtipos de IgG (IgG1 e IgG2a) en ratones BALB-c inmunizados con ovoalbúmina y diferentes subtipos de IFN-a.

La Figura 2 muestra un gráfico del porcentaje de subtipos de IgG (IgG1 e IgG2a) producido en ratones BALB-c inmunizados con ovoalbúmina y diferentes subtipos de IFN-a.

La Figura 3 muestra un gráfico de la producción de IgG2a en ratones BALB-c inmunizados con ovoalbúmina y MULTIFERON™, IFN-a14 glicosilado e IFN-a14 no glicosilado administrados mediante inyección intraperitoneal.

La Figura 4 muestra un gráfico de la producción de IgG1 en ratones BALB-c inmunizados con ovoalbúmina y MULTIFERON™, IFN-a14 glicosilado e IFN-a14 no glicosilado administrados mediante inyección intraperitoneal.

La Figura 5 muestra un gráfico de la producción de IgG2a en ratones BALB-c inmunizados con ovoalbúmina y MULTIFERON™, IFN-a14 glicosilado e IFN-a14 no glicosilado administrados por vía oral.

La Figura 6 muestra un gráfico de la producción de IgG1 en ratones BALB-c inmunizados con ovoalbúmina y MULTIFERON™, IFN-a14 glicosilado e IFN-a14 no glicosilado administrados por vía oral.

La Figura 7 muestra la inhibición de la secreción de interleucina 17 (IL-17) de PBMC humanas con lipopolisacárido (LPS) solo y con LPS y concentraciones crecientes de IFN-a2a (negro), IFN-a10 (blanco) o IFN-14 (gris).

La Figura 8 muestra la inhibición del desarrollo de células Th2 CD4+ inducido por interleucina-4 (IL4) usando concentraciones crecientes de IFN-a2a (negro), IFN-a10 (blanco) o IFN-14 (gris).

La Figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos del híbrido de IFN-a10 e IFN-a14 que contiene los 2 sitios de unión del receptor de interferón (IFNaR1 e IFNaR2).

La Figura 10 muestra la traducción inversa para proporcionar la secuencia de ácido nucleico para la secuencia híbrida de IFN-a10/14 basada en los codones más probables.

La Figura 11 muestra la traducción inversa de la secuencia de aminoácidos para proporcionar la secuencia de ácido nucleico usando codones consenso.

La Figura 12 indica el efecto causado por rIFN-a14 en la producción de IL-17 en sangre humana completa incubada con un microgramo de lipopopolisacárido (LPS) de E. coli durante 48 horas. El a-14 dio una supresión significativa de la secreción de IL-17. La IL-a-2 y el a-10 no mostraron supresión significativa.

La Figura 13 muestra el efecto causado por rIFN-a14 en la producción de IL-17 a partir de células mononucleares de sangre periférica humana incubadas con 10 microgramos de lipopolisacárido (LPS) de E. coli durante 48 horas. El a-14 provocó una supresión significativa de la secreción de IL-17 con y sin activación de LPS. La IL-a-2 y el a-10 no mostraron cambios significativos en las concentraciones de IL-17 (resultados no mostrados).

La Figura 14 muestra el efecto causado por rIFN-a10, rIFN-a14 y rIFN-a2 en la producción de IL-17 por sangre humana completa incubada con PHA durante 5 días. El a-14 es un inhibidor sumamente potente (P <0,001 a 1000 UI/ml) de IL-17 en comparación con el a-2 comúnmente disponible; el a-10 es más de 20 veces menos activo en este contexto.

La Figura 15 muestra el efecto causado por rIFN-a10, rIFN-a14 y rIFN-a2 en la producción de IFN-gamma por sangre humana completa incubada con PHA durante 5 días. El a-10 es el interferón-alfa más potente en este contexto que causa una secreción mejorada de IFN-gamma y/o IFN gamma o interferón de tipo 2, fundamental para la inmunidad innata y adaptativa contra virus, infecciones bacterianas intracelulares y en el control o la eliminación de tumores.

La Figura 16 ilustra un alineamiento de secuencia de secuencias de aminoácidos de IFN-alfa10 (SEQ ID NO: 4) e IFN-alfa14 (SEQ ID NO: 5) y la secuencia híbrida SEQ ID NO: 1 presentada en la presente memoria.

Ejemplo 1: Identificación de subtipos de interferón-alfa que son adyuvantes inmunológicos

Se administraron mediante inyección intraperitoneal tres veces por semana a ratones hembra BALB-c, en grupos de 10, 50pg de ovoalbúmina y 105 Ui de los subtipos de interferón IFN-a14, IFN-a2, IFN-a21, IFN-a10, una “mezcla” de IFN (que incluye IFN-a1, IFN-a8, IFN-a21 y posiblemente IFN-a17), IFN-a8, Intrón A, MULTIFERON™ e IFN-a1 en 50 pl.

Las concentraciones séricas de mg/ml de IgG1 (respuesta Th2: inmunidad humoral al antígeno de ovoalbúmina) y IgG2a mg/ml de IgG2a (respuesta Th1: inmunidad mediada por células al antígeno de ovoalbúmina) se midieron mediante ELISA.

Las Figuras 1 y 2 muestran la producción del subtipo de IgG anti-ovoalbúmina en ratones BALB-c tratados con IFN-a14, IFN-a2, lFN-a21, IFN-a10, una “mezcla” de IFN-a1, IFN-a8, IFN-a21 y posiblemente IFN-a17), IFN-a8, Intrón A, MULTIFERON™, solo ovoalbúmina, ovoalbúmina más albúmina de suero humano (utilizado como vehículo en preparaciones de interferón) e IFN-a1.

El inventor demostró que el IFN-a10 y el IFN-a14 potenciaron significativamente la producción de anticuerpos IgG2a, lo que es indicativo de una respuesta inmunitaria Th1 potenciada. El inventor también demostró que el IFN-a10 en particular mostraba una baja producción de anticuerpo IgG1, lo que es indicativo de la supresión de una respuesta inmunitaria Th2/Th17.

Ejemplo 2: Identificación de la respuesta de anticuerpos en ratones BALB-c después de la administración de una composición que comprende una vacuna contra la gripe y una dosis baja de interferón alfa derivado de leucocitos (LDA1)

La vacuna estándar contra la gripe se mezcló con una dosis baja (105 UI) de interferón alfa derivado de leucocitos (LDA1). Sin el interferón, se registró una pequeña respuesta de anticuerpos contra la gripe en ratones, aproximadamente 50 veces menos que con una inyección. Con interferón-alfa, la respuesta de la vacuna administrada por vía oral fue exactamente la misma que la de la vacuna inyectada. Se llevaron a cabo una serie de inmunizaciones bucales utilizando un antígeno proteico estándar (ovoalbúmina). Se compararon dos interferones; concretamente, el LDA1 y un subtipo aislado, IFN-a14. Ambos produjeron una inmunización oral notable de los ratones, pero mientras que el LDA1 dio una respuesta equilibrada, el IFN-a14 sólo dio una respuesta humoral significativa. La producción de IgG 1 es indicativa de una respuesta Th2/Th17 (inmunidad humoral) y la producción de IgG2a es indicativa de una respuesta Th1 (inmunidad mediada por células).

Ejemplo 3: Identificación de IFN-alfa como adyuvante inmunológico oral

Se administraron 50pg de ovoalbúmina y 105 UI de subtipos de interferón, concretamente MULTIFERON™, IFN-a14 glicosilado e IFN-a14 no glicosilado, en dosis de 50 pl tres veces a la semana a ratones hembra BALB-c mediante inyección oral (bucal) e intraperitoneal.

Los controles utilizados fueron antígeno solo y Titermax —Titermax es una mezcla de compuestos utilizados en la generación de anticuerpos y la vacunación para estimular el sistema inmunológico para que reconozca un antígeno administrado junto con la mezcla— . Titermax es un adyuvante inmunológico desarrollado recientemente que se considera seguro en animales.

Las concentraciones séricas (mg/ml) de anticuerpos anti-ovoalbúmina IgG1 (indicativos de una respuesta Th2/Th17) e IgG2a (indicativos de una respuesta Th1) se cuantificaron mediante ELISA.

Se comparó la producción de anticuerpos IgG2a e IgG1 cuando se administraron MULTIFERON™, IFN-a14 glicosilado e IFN-a14 aglicosilado (derivado de células CHO) tanto por vía oral como por inyección (véanse las Figuras 3, 4, 5 y 6).

El inventor demostró que el IFN-a14 mostraba una actividad adyuvante inmunológica pronunciada tanto por vía oral como por inyección. No se observaron diferencias significativas entre las preparaciones glicosiladas y las no glicosiladas.

El inventor también demostró que el IFN-a14 solo potenciaba la producción de IgG2a asociada con las respuestas Th1 por la vía de administración oral. Por tanto, el IFN-a14 es un activador de la inmunidad mediada por células cuando se administra por vía oral.

El MULTIFERON™ mejoró las respuestas de IgG1 e IgG2a cuando se administró tanto por vía oral como por inyección; es decir, indujo respuestas tanto Th1 como Th2 de manera significativa.

Ejemplo 4: Determinación in vitro de la inhibición de la inmunidad humoral (Th2/Th17) por subtipos de interferón-alfa - Análisis de linfocitos Th17 e interleucina 17

Se estimularon un total de 2 x 106 PBMC humanas con lipopolisacárido (LPS) en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de IFN-alfa humano recombinante. Se recogieron los sobrenadantes después de 24 horas y se midieron las concentraciones de IL-17 mediante ELISA.

Cultivo de células humanas

Se recogió sangre periférica humana de voluntarios sanos y se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) mediante centrifugación en gradiente Lymphoprep (Pierce). Para experimentos PBMC, se sembraron 2x106 PBMC por ml en placas de 24 pocillos y se estimularon con lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli 055:B5 (Sigma) o se sembraron 2x106 PBMC por ml en placas de 24 pocillos y se estimularon con 5 mg/ml de anti-CD3 unido a placa (clon: UCHT1) y 2,5 mg/ml de anti-CD28 (clon: CD28.2). Se obtuvieron células T no modificadas (CD4+CD45RA) marcando magnéticamente y reduciendo las células T no colaboradoras y las células T de memoria según las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec). Se cebaron un total de 1x105 células T no modificadas en placas de fondo plano de 96 pocillos recubiertas con anticuerpos anti-CD3 (clon UCHT1,2,5 mg/ml) y con anticuerpos anti-CD28 (clon CD28.2, 2,5 mg/ml). Después de 48 h de cultivo, se añadieron al cultivo 20 UI/ml de IL-2 humana recombinante (Peprotech).

Para la diferenciación Th17 humana, las células se complementaron con anticuerpos neutralizantes anti-IL-4 y anti-IFNy (ambos de Peprotech) y con 10 ng/ml de IL-1 p recombinante y 50 ng/ml de IL-6 recombinante (ambos de Peprotech). Cuando fue necesario, se añadió al cultivo IFNa10/14 humano recombinante. Después de 5 días de cultivo, las células se lavaron, se transfirieron a nuevas placas y se expandieron hasta el día 12 en presencia de 20 UI/ml de IL-2 recombinante.

ELISA y tinción de citocinas intracelulares

La capacidad de producción de IL-17 de las células Th17 cebadas se evaluó mediante estimulación con 0,1 ng/ml de LPS o, alternativamente, se puede evaluar mediante la estimulación de células humanas con 1 mg/ml de anti-CD3 soluble (clon: OKT3) y forbol-12-13-dibutirato (PdBu). Las concentraciones de IL-17 humana en sobrenadantes de los cultivos celulares se determinaron usando pares de anticuerpos y estándares de proteínas disponibles comercialmente (R&D Systems). La absorción se determinó usando un lector ELISA a 450 nm. Para la tinción intracelular de IFNy e IL-17 de ratón, las células T se estimulan con PMA e ionomicina durante 5 horas. Se añade brefeldina A durante las últimas 3 h de cultivo. La tinción intracelular se puede realizar con un equipo BD Cytofix/Cytoperm según las instrucciones del fabricante. Las células se incuban con anti-IFNY marcado con isotiocianato de fluoresceína (clon: XMG1.2, BD Pharmingen) e IL-17A anti-ratón marcado con Alexa Fluor 647 (clon: eBio17B7, eBioscience). Después del lavado, las células se analizan inmediatamente usando clasificación de células activada por fluorescencia (FACS).

Resultados

Como se muestra en la Figura 7, se encontró que la inhibición de IL-17 ocurría en el orden IFNa10>IFNa14>IFNa2a. P <0,05 (Figura 7).

Ejemplo 5: Determinación in vitro de la inhibición de la inmunidad humoral (Th2/Th17) por subtipos de interferón-alfa - Análisis de células Th2 y citocinas asociadas

Antecedentes sobre CRTH2

El CRTH2 (molécula homologa de receptor quimioatrayente expresada en células Th2) es un receptor acoplado a la proteína G expresado por linfocitos Th2, eosinófilos y basófilos. El receptor media la activación y la quimiotaxis de estos tipos de células en respuesta a la prostaglandina D2 (PGD2), el prostanoide principal producido por los mastocitos. La PGD2 se libera a través de la desgranulación de los mastocitos en la fase inicial de las reacciones mediadas por la IgE. También se cree que este proceso ocurre en el sitio de la inflamación, como la mucosa nasal y bronquial. A través de la interacción con el CRTH2, se cree que la PGD2 media el reclutamiento y la activación de tipos de células portadoras de CRTH2 en el sitio de la reacción alérgica, amplificando y manteniendo en consecuencia la inflamación alérgica. En la mucosa nasal y bronquial, se cree que esta cascada proinflamatoria comienza durante la llamada respuesta alérgica tardía que ocurre de 3 a 9 horas después de la exposición al alérgeno. La interacción entre PGD2 y CRTH2 contribuiría, por tanto, a la denominada “polarización Th2”, con la consiguiente producción de citocinas Th2 y las características eosinofílicas y basofílicas típicas de la inflamación.

El IFNa inhibe el desarrollo de Th2 CD4+ humanos

Se activaron células CD4+/CD45RA+ humanas purificadas con anti-CD3/anti-CD28 unido a placa en condiciones de citocina definidas. La inducción de la expresión de CRTH2 se evaluó mediante citometría de flujo. Todos P <0,05, por encima de 100 UI de IFN en comparación con la IL-4 sola.

Sujetos humanos

Se tomaron muestras de sangre periférica de donantes adultos sanos y se purificaron las células como se indica a continuación.

Cultivos y análisis de células T

Se obtuvo sangre periférica de donantes varones adultos sanos y se purificaron células T CD4+/CD45RA+ no modificadas (>92%) de capas leucocíticas mediante separación de perlas magnéticas (BD Biosciences, EE. UU.). Las células CD4+ se activaron con anti-CD3/anti-CD28 e IL-2 (50 U/ml) unidos a placa en medio de Dulbecco modificado de Iscove completo que contenía FCS al 10%, en presencia de IL-4 humana recombinante (R&D Systems, EE. UU.), a una concentración de 20 ng/ml durante 7 días. El análisis de citometría de flujo se realizó con hCD294 (molécula homóloga de receptor quimioatrayente expresada en células Th2 [CRTH2]) - Alexa 647 (BD Biosciences).

Resultados

En los seres humanos, el receptor de PGD2, CRTH2, se expresa selectivamente en las células Th2 y es inducido por la IL-4 durante el desarrollo de los Th2. La IL-4 promovió el desarrollo de células que expresan CRTH2. Sin embargo, como se muestra en la Figura 8, todos los IFN-alfa bloquearon marcadamente la expresión de CRTH2 impulsada por IL-4, de una manera dependiente de la dosis en el orden IFNa10>IFNa14>IFNa2a, apoyando así el concepto de que estas citocinas suprimen la inmunidad Th2 (humoral), pero son reconocidos como potentes activadores de la inmunidad asociada a Th1.

Como se muestra en la Figura 12, se comprobó el efecto de rIFN-a14 sobre la producción de IL-17 en sangre humana incubada con LPS durante 48 h.

Se incubó sangre humana completa sin (columnas abiertas) o con 1 pg/ml de LPS (columnas sombreadas a rayas) en ausencia y presencia de un intervalo de concentraciones de rIFN-a14 (0 - 1.000 UI/ml) durante 48 h a 37°C, en una atmósfera de 5% de CO²en el aire, en una incubadora humidificada. El plasma se recogió por centrifugación y los niveles de IL-17 se determinaron mediante ELISA.

La Figura 12 indicó una respuesta a la dosis de IFN-a14 en la que 1 mg = 10-8 UI.

Como se muestra en la Figura 13, se comprobó el efecto de rIFN-a14 sobre la producción de IL-17 en PBMC humanas incubadas con LPS durante 48 h.

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) —un componente crítico del sistema inmunológico— a partir de sangre humana completa mediante centrifugación en gradiente de densidad. Se incubaron 2 x 106 PBMC sin (columnas abiertas) o con 10 pg/ml de LPS (columnas sombreadas a rayas) en ausencia y presencia de un intervalo de concentraciones de rIFN-a14 (0 - 1.000 UI/ml) durante 48 h a 37°C, en una atmósfera de 5% de CO²en el aire, en una incubadora humidificada. Los niveles de IL-17 en el sobrenadante se determinaron mediante ELISA.

Como se indica en la Figura 13, se encontró que las concentraciones crecientes de rIFN-a14 reducen la IL-17 tanto en células tratadas como no tratadas con LPS.

Como se muestra en la Figura 14, se comprobó el efecto de rIFNa10, rIFNa14 y rIFN2 sobre la producción de IL-17 mediante sangre completa incubada con fitohemaglutinina (PHA) durante 5 días.

Se diluyó sangre humana completa 1/10 con caldo de cultivo RPMI 1640 y se incubó sin o con 100 pg/ml de PHA en ausencia y presencia de un intervalo de concentraciones de rIFN-a14, rIFN-a10 y rIFN-a2 durante 5 días a 37°C, en una atmósfera de 5% de CO²en el aire, en una incubadora humidificada. Al final de este periodo, se aspiraron los sobrenadantes y se midieron los niveles de IL-17 en los sobrenadantes mediante ELISA. Los valores representan la media ± eem, para n = 3 incubaciones. El análisis estadístico y los valores de CI⁵⁰se determinaron usando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., California, EE. UU.).

Como se indica en la Figura 14, la provisión de rIFN-a14 a concentraciones más altas (100-1000 Ul/ml) provocó una mayor disminución en la IL-17 que la provisión de IFN-a12 o IFN-a10. Se considera que el rIFN-a14 es el interferón más potente probado para reducir los niveles de IL-17.

Como se muestra en la Figura 15, se comprobó el efecto de rIFNa10, rIFNa14 y rIFNa2 sobre la producción de IFN-gamma por sangre completa incubada con PHA durante 5 días.

Se diluyó sangre humana completa 1/10 con caldo de cultivo RPMI 1640 y se incubó sin o con 100 gg/ml de PHA en ausencia y presencia de un intervalo de concentraciones de rIFN-a10, rIFN-a14 y rIFN-a2 durante 5 días a 37°C, en una atmósfera de 5% de CO²en el aire, en una incubadora humidificada. Al final de este periodo, se aspiraron los sobrenadantes y se midieron los niveles de IFN-gamma en los sobrenadantes mediante ELISA. Los valores representan la media ± eem, para n = 3 incubaciones. El plasma se recogió por centrifugación y los niveles de IFN-gamma se determinaron mediante ELISA. Los valores representan la media ± eem, para n = 3 incubaciones.

Se determinó que el rIFN-a10 era el más eficaz de los interferones probados para promover niveles de IFN-gamma. Se ha sugerido previamente que el IFN-gamma es importante para proporcionar un efecto anticanceroso.

Ejemplo 6: Efectos del interferón alfa-14 y alfa-10 humano sobre leucocitos mononucleares humanos activados y no estimulados de sujetos normales

Tabla 1: Sinopsis de 400 estimaciones* de marcadores de interleucinas, quimiocinas y proteínas después del tratamiento de células mononucleares humanas con IFN-a10/14

0 = no se detectó analito

1 = analito presente pero sin efecto de alfa-10/14

x = no determinado

El efecto positivo de alfa-10/14 se denota por un

El efecto negativo del interferón alfa-10/14 se denota por un -

* El sistema de ensayo utilizado fue RayBio Quantibody Human Cytokine Array 9000 (QAH-CAA-9000 proporcionado por Insight Bio Ltd.). Se trata de un ELISA multiplexado, que mide las concentraciones de 400 proteínas en un único proceso de ensayo, incluidos marcadores pro y antiinflamatorios, interleucinas, marcadores de cáncer, quimiocinas, factores de crecimiento y moléculas relacionadas. Se trataron leucocitos mononucleares de sangre periférica humana (donantes de sangre normales) con 10 ng/ml de IFN-a14/10 durante 4 horas antes del ensayo. Las pruebas se realizaron en 2 grupos de células:

a) desactivadas y

b) activadas con PHA (fitohemaglutinina) para inducir un alto nivel de estimulación.

Efectos del alfa-14 sobre las células inmunitarias activadas

Se cuantificaron más de 30 interleucinas, pero solo 6 mostraron cambios significativos en las células activadas, lo que indica la naturaleza dirigida y muy específica de la interacción del alfa-14 con la respuesta inmunitaria humana.

La interleucina 2 aumentó 7 veces, la IL-12p70 más de 11 veces y el interferón-Y más de 600 veces, lo que indica una fuerte proliferación de la respuesta Th1 (mediada por células), mientras que un aumento de 6 veces en la IL-23 está en consonancia con su papel en la inmunidad mediada por células y su asociación con la IL-12.

Se observaron disminuciones muy grandes con IL-3 e IL-5 de 11 y 420 veces, respectivamente. Estas moléculas están asociadas con la producción de células mieloides y la producción de inmunoglobulinas (inmunidad humoral). La IL13 también se redujo 5 veces, lo que es importante, ya que esta interleucina está implicada en la secreción de IgE, el anticuerpo de la alergia. También fue crucial la disminución de 43 veces en la IL-17. Esta citocina reguladora aumenta en enfermedades autoinmunitarias, en la inmunidad humoral (mediada por anticuerpos) y en la estimulación de la inflamación a través de la atracción de neutrófilos.

El CD23 o FceRII es un receptor del anticuerpo de la alergia, IgE, y se muestra de forma generalizada en diferentes tipos de leucocitos. La activación del CD23 controla la producción de IgE y se observan aumentos significativos en pacientes con trastornos alérgicos. Este importante marcador se redujo 850 veces en las células activadas por alfa-14.

Efectos del alfa-14 en células inmunitarias no activadas

La IL-6 disminuyó 19 veces. Esta citocina estimula la síntesis de proteínas hepáticas en respuesta a traumatismos, provoca aumentos en la temperatura corporal y participa en la contracción muscular. Sin embargo, en la alergia lo importante es su papel esencial en la inmunidad mediada por anticuerpos.

El G-CSF también se redujo en más de 1000 veces. Esta molécula puede estimular la médula ósea para producir un mayor número de neutrófilos que podrían estar involucrados en la inflamación. Al mismo tiempo, la secreción de la quimiocina CXCL1 se suprimió 7.500 veces, lo que evita que atraiga neutrófilos al sitio de una respuesta y provoque inflamación. Además, la concentración de la quimiocina CXCL10 se incrementó 460 veces; su función es atraer a los linfocitos T a una respuesta inmunitaria en curso.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un híbrido de subtipos de interferón alfa que comprende los sitios primarios de unión del receptor de interferón de IFN-a10 e IFN-a14.

2. El híbrido de subtipos de interferón alfa según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento y/o la profilaxis de una afección en la que se desean una mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17, en la que la afección para la que se desean una mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17 se selecciona del grupo constituido por una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, alergia, en particular alergia alimentaria o una afección alérgica asociada seleccionada de ojos rojos, picazón, secreción nasal, eccema, urticaria, angioedema, dificultad respiratoria, sibilancias, tos, dolor abdominal, vómitos, diarrea, anafilaxia, asma, rinitis alérgica y dermatitis atópica, alergia a la leche/productos lácteos, incluido el síndrome de Heiner, alergia a los huevos, alergia a la soja, alergia al pescado o a los mariscos, alergia a los cacahuetes y los frutos secos, alergia al ajonjolí y otras semillas, alergia al trigo y a cereales, alergia a frutas y verduras, alergia a la cafeína, síndrome oral alérgico, alergia al alcohol, síndrome de alergia alimentaria al polen, gastroenteritis eosinofílica, alergia alimentaria gastrointestinal mediada por IgE y deficiencia de esterasa C1 y cáncer.

3. El híbrido de subtipos de interferón alfa para uso según la reivindicación 2 en el que la enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria intestinal.

4. El híbrido de subtipos de interferón alfa para uso según la reivindicación 3 en el que la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.

5. El híbrido de subtipos de interferón alfa para su uso según la reivindicación 2 en el que la afección en la que se desean una mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17 es alergia o una afección alérgica asociada, preferiblemente en la que la alergia es una alergia alimentaria o una afección alérgica asociada seleccionada entre ojos rojos, picazón, secreción nasal, eccema, urticaria, angioedema, dificultad respiratoria, sibilancias, tos, dolor abdominal, vómitos, diarrea, anafilaxia, asma, rinitis alérgica y dermatitis atópica, alergia a la leche/lácteos, incluyendo síndrome de Heiner, alergia a los huevos, alergia a la soja, alergia al pescado o a los mariscos, alergia a los cacahuetes y los frutos secos, alergia al ajonjolí y otras semillas, alergia al trigo y a cereales, alergia a frutas y verduras, alergia a la cafeína, síndrome oral alérgico, alergia al alcohol, síndrome de alergia alimentaria al polen, gastroenteritis eosinofílica, alergia alimentaria gastrointestinal mediada por IgE y deficiencia de esterasa C1.

6. El híbrido de subtipos de interferón alfa para su uso según la reivindicación 2 en el que el cáncer es cáncer de células hepáticas, cáncer de pulmón, cáncer pulmonar no microcítico, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de piel, melanoma, cáncer genitourinario, cáncer de próstata, cáncer de células renales o cáncer de vejiga.

7. El híbrido de subtipos de interferón alfa para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, proporcionándose el híbrido de subtipos de interferón alfa para su administración simultánea, separada o secuencial con una composición de vacuna para el tratamiento o la profilaxis de la afección en la que se desean una mejora de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y la supresión de una respuesta inmunitaria mediada por Th2/Th17.

8. El híbrido de subtipos de interferón alfa para su uso según la reivindicación 7 en el que la composición de vacuna comprende al menos un alérgeno capaz de mediar una respuesta inmunitaria Th2/Th17 contra el mismo.

9. El híbrido de subtipos de interferón alfa para uso según la reivindicación 8 en el que al menos un alérgeno es un alérgeno alimentario o un antígeno tumoral; por ejemplo, un antígeno específico a un tumor o un antígeno asociado a un tumor.

10. El híbrido de subtipos de interferón alfa para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, proporcionándose el híbrido de subtipos de interferón alfa para su administración por vía oral.

11. El híbrido de subtipos de interferón alfa para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, comprendiendo el híbrido la secuencia de aminoácidos establecida por la SEQ ID NO: 1 o un fragmento o variante funcionalmente activo de la misma, siendo la variante funcionalmente activa al menos un 95% homóloga a la SEQ ID NO: 1 y pudiendo potenciar una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y suprimir una respuesta mediada por Th2/Th17.

12. El híbrido de subtipos de interferón alfa para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, siendo el híbrido de subtipos de interferón alfa una proteína híbrida que comprende al menos parte de IFN-a10 e IFN-a14, incluyendo el híbrido al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6 de los aminoácidos correspondientes a los sitios primarios de unión del receptor de interferón de IFN-a10 e IFN-a14.

13. Una composición que comprende:

(i) una vacuna; y

(ii) un híbrido de subtipos de interferón alfa, incluyendo el híbrido los sitios primarios de unión del receptor de interferón de IFN-a10 e IFN-a14.

14. La composición según la reivindicación 13 en la que la vacuna comprende al menos un alérgeno capaz de mediar una respuesta inmunitaria Th2/Th17 contra el mismo y en la que el al menos un alérgeno es un alérgeno alimentario o un antígeno tumoral.

15. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14 en la que el híbrido comprende la secuencia de aminoácidos establecida por la SEQ ID NO: 1 o un fragmento o una variante funcionalmente activo de la misma en la que la variante funcionalmente activa es al menos un 95% homóloga a la SEQ ID NO: 1 y puede potenciar una respuesta inmunitaria mediada por Th1 y suprimir una respuesta mediada por Th2/Th17.