ES2834470T3 - Compuesto para el marcaje de proteínas - Google Patents

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Clemens Waltherus Gerardus Löwik
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Abstract

Un complejo, para su uso en un método in vivo de marcaje de células para discriminar, en una población de células, entre células vivas y células cuya membrana plasmática ha perdido la integridad, como es el caso de las células muertas; de un primer compuesto y una primera proteína de la célula cuya membrana plasmática ha perdido la integridad, en la que el primer compuesto se aplica extracelularmente sin activarse y es sustancialmente incapaz de atravesar una membrana celular sana; en el que este primer compuesto se selecciona de uno o más de un compuesto fluorescente, siendo una cianina, y un conjugado de la misma de los cuales, preferentemente un compuesto no activado o desactivado, como un carboxilato del mismo; donde la primera proteína se selecciona del grupo formado por : proteínas fibrosas, proteínas estructurales fibrosas, metaloenzimas, Hsp90p co-acompañante (CDC37), isómeros de las mismas, complejos de los mismas, y sus productos de descomposición, en donde el primer compuesto y la primera proteína interactúan química/físicamente/biológicamente, en donde la discriminación se realiza marcando a las células cuya membrana plasmática ha perdido su integridad y la realización de una medición para cuantificar la interacción entre el primer compuesto y la célula cuya membrana plasmática ha perdido integridad, y mediante (e) la realización de una o más mediciones adicionales en la muestra con una primera técnica adecuada para detectar el primer compuesto para obtener un valor o valores del primer compuesto, (f) adicionalmente la determinación de una cantidad de interacción analizando el valor o valores para determinar uno o más valores de uno o más parámetros de la muestra biológica, de aquellas células cuya membrana plasmática ha perdido la integridad, donde un valor o valores por encima de un valor umbral indican la unión del compuesto a la primera proteína celular.

Description

DESCRIPCIÓN
Compuesto para el mareaje de proteínas
El presente invento pertenece al campo del mareaje y/o identifieaeión de las células euya membrana plasmática ha perdido su integridad, tales como las células muertas.
La muerte celular masiva, en exceso, es característica de los trastornos vasculares, las enfermedades neurodegenerativas, los síndromes mielodisplásieos, las lesiones por isquemia/reperfusión y el rechazo de trasplantes de órganos, entre otros. La muerte celular también desempeña un papel en el tratamiento de enfermedades. En el cáncer, por ejemplo, la mayoría de los fármacos quimioterapéuticos, tratamientos de radiación y los fármacos de aeeión antihormonal actúan induciendo la muerte de las células cancerosas.
La muerte celular juega un papel importante en el desarrollo y en la renovación de tejidos o células normales eomo, por ejemplo, la piel, el intestino, el cabello y en el sistema reproductivo e inmunológieo. En condiciones fisiológicas normales, la muerte celular está estrictamente regulada y el desequilibrio suele estar asociado a enfermedades, eomo, por ejemplo, la lesión por isquemia-reperfusión, que suele ocurrir tras un ACV (accidente eerebrovaseular) o un infarto de miocardio, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades mielodisplásieas, rechazo después de un trasplante de órganos o células, enfermedades vasculares y psoriasis. La muerte celular, predominantemente, la necrosis, también puede ocurrir después de un traumatismo o una falta de oxígeno (hipoxia) localizada. La muerte celular también desempeña un papel en el tratamiento de las enfermedades. En el eáneer, por ejemplo, la mayoría de los tratamientos con quimioterapia, los tratamientos de radiación y los tratamientos con fármacos antihormonales actúan induciendo la muerte de las células cancerígenas.
Dado que la muerte celular desempeña un papel tan importante en muchas enfermedades, la obtención de imágenes no invasivas y la selección de células muertas en una muestra biológica que contenga una población de células es muy deseable y necesaria, por ejemplo, como herramienta de diagnóstico para la detección precoz y progresión de las enfermedades; y para el seguimiento de los efectos terapéuticos de las terapias instauradas. Esto permitirá, no sólo determinar el grado de daño tisular, p.ej. tras un infarto de miocardio, tras un ACV y la identifieaeión de placas vulnerables en la ateroselerosis; sino también, por ejemplo, monitorizar la respuesta al tratamiento en el eáneer.
Un documento útil sobre la clasificación de la muerte celular ha sido publicado por Kroemer y otros (Cell Death Differ, 2009, 16(1), 3-11). A los efectos del presente documento, una célula muerta es definida, de acuerdo con una recomendación del citado documento, como una célula cuya membrana plasmática ha perdido su integridad, tal y eomo se determina tras la aplicación de colorantes vitales, por ejemplo, el yoduro de propidio (PI).
Los métodos para teñir las células muertas son conocidos en el estado de la técnica.
Esos métodos se relacionan habitualmente con el uso de compuestos fluorescentes incapaces de penetrar en las células, y que son capaces de teñir los ácidos nucleicos. En las células sanas, la tinción y el ADN celular se mantienen separados por la membrana celular, la membrana nuclear y las membranas mitocondriales; sólo al morir la célula, estas membranas se vuelven permeables de tal manera que el ADN y la tinción pueden entrar en contacto. La intensidad de la fluorescencia es proporcional al número de células muertas en la muestra. Las desventajas de atacar el ADN son típicamente mutagénieas, y por lo tanto tóxicas.
Un método alternativo ha sido demostrado por el grupo de M. Roederer en el que se utilizan tinciones aminareactivas para discriminar entre las células vivas y las muertas. Las tinciones fluorescentes amina-reactivas, se unirán de forma no específica a las proteínas de membrana de las células vivas. Sin embargo, en las células muertas o moribundas, donde la membrana celular está alterada, los colorantes fluorescentes amina-reactivos, se unen específicamente a las abundantes proteínas intracelulares, dando lugar a un aumento de la señal fluorescente mostrada por la eitometría de flujo. (Perfetto SP et al., J. Immunol. Method. 2006, 313(1-2),199-208)
Las desventajas del uso de colorantes amina-reactivos para discriminar entre células vivas y muertas es que los colorantes también reaccionarán con cualquier otra amina presente en el medio que engloba la célula, tales eomo, los componentes séricos y las proteínas extracelulares. Además, tales compuestos son típicamente inestables y se degradan con el tiempo.
Uno de los objetos de este invento, es solventar uno o varios problemas de los métodos de la anterior técnica y proporcionar una alternativa a la misma.
Resumen de la invención
Se define un método para etiquetar o marear las células euya membrana plasmática ha perdido su integridad, tanto para las células muertas, eomo para discriminar entre las células vivas y las células euya membrana plasmática ha perdido su integridad; se plasma el método utilizado para determinar uno o más valores de uno o más parámetros de las células de una muestra biológica; se describe el uso del método en un ensayo para la detección de fármacos terapéuticos tales como los de terapia contra el cáncer; el uso del método para monitorizar y/o determinar la efectividad de una terapia; se define, así mismo, un kit de ensayo; un compuesto; se describe el compuesto para su uso como medicamento; la utilidad del compuesto en sí mismo y el uso del compuesto para el marcaje de células para discriminar en una población de células, entre las células vivas y las células cuya membrana plasmática ha perdido su integridad.
El método puede realizarse in vivo, in vitro, en un organismo muerto, o de cualquier otra manera.
Descripción detallada de la invención
Se describe un método para etiquetar o marcar las células cuya membrana plasmática ha perdido su integridad, como es el caso de las células muertas, así como para discriminar entre las células vivas y las células cuya membrana plasmática ha perdido la integridad, la descripción del método incluye: (a) La provisión una población de células compuesta por células cuya membrana plasmática ha perdido integridad, y una primera proteína intracelular; (b)El suministro de un primer compuesto no activado aplicado extracelularmente, en el que dicho primer compuesto es significativamente incapaz de atravesar una membrana celular sana; (c) la interacción química/física/biológicamente del primer compuesto y la primera proteína en una célula cuya membrana plasmática ha perdido integridad, como es el caso de una célula muerta, y (d) realizando una medición para determinar la cantidad de interacción entre el primer compuesto y la célula cuya membrana plasmática ha perdido integridad.
Los términos de etiquetado y marcado se utilizan comúnmente en el campo de esta invención y se les confiere su significado habitual, tal y como lo entendería una persona con experiencia en la materia.
Un compuesto que es básicamente incapaz de traspasar una membrana celular sana es un compuesto que si se aplica a una muestra de células (por ejemplo, en un cultivo celular, por ejemplo, una muestra de células de un tejido), no sería considerada por un experto en la materia como permeable a las células, por ejemplo, si no puede atravesar una membrana plasmática intacta. Si el compuesto es fluorescente, puede demostrarse, por ejemplo, mediante el uso de microscopio; para los compuestos no fluorescentes, las posibilidades incluyen el etiquetado del compuesto.
Los términos intracelular y extracelular se refieren a las partes que están dentro y fuera de la membrana plasmática de una célula respectivamente. La proteína intracelular no hace referencia preferentemente a una membrana proteica. La proteína intracelular está presente dentro de las células de la presente población de células.
El término "no activado" se utiliza comúnmente en el campo de la bioconjugación; el término se utiliza en la presente aplicación de la misma manera. Los compuestos activados son compuestos que han sido modificados químicamente para aumentar o introducir la reactividad química hacia ciertos grupos funcionales, en particular, los alcoholes, aminas y tioles, o compuestos que son inherentemente reactivos a ellos debido a los grupos funcionales propios, inicialmente presentes en el compuesto. Lo más común es que los ácidos carboxílicos, se activen para aumentar su reactividad con las aminas. En resumen, un compuesto no activado, es un compuesto que, una persona experta en la materia, lo consideraría como sustancialmente no reactivo respecto a los grupos funcionales que incluyen los ácidos carboxílicos, los alcoholes, las aminas y los tioles, bajo las condiciones que se utilizan habitualmente para el etiquetado de biomoléculas. Este llamado, primer compuesto no comprende grupos funcionales tales como las maleimidas, N-hidroxisuccinimida, N-hidroxisulfosuccinimida, 4-Sulfo-2,3,5,6-tetrafluorofenol (STP), tiocianatos, isotiocianatos, hidrazinas, aldehídos, alquil-halogenuros,ésteres activos, etc. El primer compuesto no contiene grupos funcionales que, p. ej, en una muestra biológica, p.e. en un medio acuoso, que p. e. contenga proteínas, reaccionaría significativamente de forma covalente con ello, es decir, que, por ejemplo, el compuesto es capaz de difundirse a través de la muestra biológica sin sufrir una interacción covalente. Como ejemplo, de dicho primer compuesto, podría ser un compuesto de tinción que sólo tiene un grupo funcional de ácido carboxílico, y como tal es un compuesto no activado, dado que no puede utilizarse para etiquetar las biomoléculas. Esto contrasta con la maleimida y/o la N-hidroxisuccinimida y sus correspondientes derivados.
El término "interacción química/física/biológica" se utiliza para definir en general, que el primer compuesto y la primera proteína interactúan de alguna manera, p. ej., a través de una interacción química, física, y/o biológica, como por ejemplo, a través de un enlace químico (covalente) (no es el preferido), en una reacción iónica, una reacción de van der Waals, una reacción de apilamiento de n-n, intercalación específica o no específica de enlace a enlace a partes o subpartes de proteínas de unión, etc. Lo importante es que la proteína y el compuesto interactúen de tal manera que se pueda detectar el complejo de la proteína y el compuesto, es decir, que la interacción no sea transitoria. El término complejo se utiliza para referirse a una proteína que tiene al menos el compuesto unido a ella.
En una muestra simple, la detección de una cantidad de interacción (por ejemplo, realizar una medición para determinar la cantidad de interacción), se relaciona con la confirmación de que el primer compuesto está dentro de una célula. Si el compuesto es fluorescente, esto puede lograr mediante la obtención de imágenes, como la fluorescencia y/o el microscopio confocal.
En una posterior muestra simple, será suficiente con detectar la señal del primer compuesto o una etiqueta del primer compuesto. En muchas técnicas la señal sólo es detectable, o sólo supera un valor de referencia particular, si una cantidad suficiente de compuesto ha sido localizado en un lugar determinado de una muestra.
La primera proteína se considera parte de la célula cuya membrana plasmática ha perdido su integridad.
La primera proteína se selecciona de un grupo que contiene proteínas fibrosas, tales como, las proteínas 40 kDa, las proteínas 100 kDa; las tubulinas, tales como la a-tubulina, la p-tubulina, la V-tubulina, la ó-tubulinay la e-tubulina; actinas, como la G-actina, y la F-actina; proteínas fibrosas estructurales, como la queratina, tales como queratina neutra, básica o ácida, caso de la queratina 1 - queratina 20; metaloenzimas, como la enolasa y la liasa; CDC37; preferiblemente son seleccionados los isómeros de tubulina o actina, así como sus compuestos y sus productos de descomposición.
Las proteínas identificadas anteriormente son predominantes en las células y sólo se hacen accesibles al primer compuesto al perderse la integridad de la membrana celular. Como tales, son objetivos particularmente adecuados. La tubulina y la actina están entre las proteínas más predominantes en las células.
El primer compuesto se selecciona de uno o más de los siguientes: un compuesto fluorescente, siendo la cianina, y un conjugado del mismo (por ejemplo, una cianina acoplada a otro compuesto), preferiblemente no activado o desactivado, como un carboxilato del mismo. Además también puede tratarse de un compuesto activo; a saber, un compuesto terapéutico, como es el caso de un medicamento; o bien un compuesto marcador, como es el caso de un trazador, como un trazador radioactivo, un producto de quimioterapia, un agente de contraste de IMR (imagen de resonancia magnética),una microburbuja para ultrasonidos o, técnicas de imagen con resolución óptico-acústica, una nanopartícula como es el caso un punto cuántico, un compuesto biológico activo y una molécula adecuada para la diagnóstico por imagen; y/o un vehículo para el transporte del compuesto activo. El primer compuesto, es un compuesto que si se conjuga con la primera proteína es capaz de interactuar con ella, es decir, se une de alguna manera a ella de tal manera que se puede determinar una interacción entre el par unido (complejo).
Un compuesto marcador puede ser un compuesto susceptible de ser detectado por una o más técnicas seleccionadas de un grupo que consisten en: espectroscopias ópticas, microscopia óptica, imágenes acústicas, espectroscopias acústicas, IMR, PET, SPECT, CT y combinaciones de las mismas.
Los ejemplos de lo anteriormente citado se relacionan con, por ejemplo, un primer compuesto que produce una 111 3+ fracción quelada (por ejemplo, fracciones similares a la DOTA) que puede ligar un isótopo o similar, como In ,
18
haciendo que el método sea adecuado para SPECT. Asimismo, un isótopo, como el F, puede ser utilizado,
19 haciendo que el método sea adecuado para PET. De la misma manera, puede utilizarse un isótopo como el F, lo que hace que el método sea adecuado para la resonancia magnética.
En un ejemplo, el primer compuesto es una cianina no activada, preferiblemente una cianina según la figura 1 I, II y III,
donde es un número entero, como n £ [2,10], preferentemente n £ [4,8], la cadena L tiene hasta n-1 dobles enlaces, preferiblemente n/2 dobles enlaces; en las que las subfamilias II y III pueden comprender respectivamente uno y dos sistemas de anillos aromáticos (A, B), que se representan por el sistema curvo línea(les) C,
donde A, B son preferentemente seleccionados cada uno individualmente a partir del benceno y naftalina, en el que pueden estar presentes otros grupos R5 , R6, R7 y R8 , R5 , R6 , R7 y R8 se seleccionan preferentemente cada uno individualmente del H, y el alquilo, como el metilo, el etilo y el propilo; preferentemente, el metilo, en el que los sistemas de anillos aromáticos pueden comprender otros grupos funcionales R1, R2y/o sustitutos. R1, R2 , se seleccionan preferentemente cada uno individualmente a partir del H, el sulfonato y la sulfonamida, en los que la cadena L de enlaces simples y dobles alternos puede ser interrumpida por una o más estructuras de anillos parcial y totalmente saturadas, como el ciclopenteno y el ciclohexeno, y combinaciones de la misma, tales como uno o más anillos de ciclohexeno, donde la estructura de los anillos saturados puede contener además los grupos funcionales R9 ; siendo R9 ,seleccionado de H, AA y BB, donde R10 es seleccionado de, H, SO3H, Cl,-N-C=0-(CH2)q-Y3 (q=1-6),-(CH2)r-Y4 (r=1 -6), Y3 y Y4 son cada uno de ellos independientemente de H, COOH, SO3H,CN;
donde los átomos de nitrógeno (N) pueden contener más grupos funcionales R3,R4 en la posición N; donde R3 ,R4son preferentemente seleccionados cada uno individualmente de -(CH2)m Y, donde Y es seleccionado individualmente de un ácido carboxílico que tiene de 1-4 átomos de carbono, un grupo sulfonato, CN, CeC, y C=C, y sus correspondientes sales;
donde dichos grupos en la aposición del enlace-N contienen m átomos de carbono, como el m£[1,10], (por orden de preferencia de menor a mayor): siendo el menos preferente m £[2,8], más preferente m£ [3,7], la más preferente m= 4, 5, y 6,
e incluso más preferentemente al menos uno de m = 4, 5 y 6, preferentemente = 6, y el otro m preferiblemente es 4, 5 o 6; donde dichos grupos del enlace- N comprenden uno o más grupos funcionales en un extremo opuesto al N, como un ácido carboxílico que tiene 1-4 átomos de carbono, un grupo sulfónico, y sales del mismo, tales como sales de sodio y potasio, más preferentemente el grupo funcional del final contiene uno o más enlaces de doble C-C, tal como es el caso de Hq4, HQ5, HQ6, HQ7, ICG, OW 800, L7, L11, y sus derivados conjugables, preferiblemente un carboxilato de la misma, prefiriéndose HQ4 o HQ5.
Las estructuras de estos compuestos se muestran en los Dibujos.
HQ4, HQ5, HQ6, HQ7, ICG, OW 800, L7 y L11, son ejemplos de compuestos fluorescentes que no pueden traspasar la membrana plasmática de las células sanas, pero si las de las células cuya membrana plasmática ha perdido integridad, como las células muertas, interactuando con proteínas como actinas y tubulinas. Además, estos compuestos tienen propiedades fotofísicas adecuadas desde el punto de vista de su uso como etiquetas, por ejemplo, fluorescencia cuántica de alto rendimiento, baja susceptibilidad al atenuado, etc.
Se relata una ejecución del método, en la que el método además contiene: (e) La realización de una o más mediciones en la muestra, con una primera técnica adecuada para detectar el primer compuesto a fin de obtener un valor o valores del primer compuesto; (f) análisis del valor o valores para determinar uno o más valores de uno o más parámetros de la muestra biológica en la que, las células, han perdido la integridad membrana plasmática y; (g) opcionalmente, repitiendo los apartados (d) y/o, (e) y (f) para una muestra determinada en múltiples espacios temporales para determinar un cambio en el valor de un parámetro, o la cantidad de interacción, como una función de tiempo.
Ventajosamente, además de determinar una cantidad de interacción, se pueden determinar otros valores de los parámetros. Mediante los pasos opcionales (g), que en una realización preferida no son facultativos, puede ser determinado el cambio de un parámetro en función del tiempo. Esto puede usarse, por ejemplo, para monitorizar un tratamiento in vivo o para medir la efectividad de un determinado compuesto in vitro.
En un ejemplo del método para determinar uno o más valores de uno o más parámetros de las células de una muestra biológica, un valor o valores por encima de un valor umbral indican la unión del compuesto a la primera proteína de la célula.
En un ejemplo del método para determinar uno o más valores de uno o más parámetros de las células de una muestra biológica; uno o más parámetros miden la presencia y/o concentración y/o ubicación de las células cuya membrana plasmática ha perdido integridad en la población de células.
Se describe el uso del método en un ensayo para la detección de drogas para uso terapéutico como la terapia del cáncer.
Se describe el uso del método en un método de diagnóstico, o para monitorizar y/o determinar la eficacia de una terapia.
Se describe un kit de ensayo que contiene un fluido, como, un fluido fisiológico; un primer compuesto no activado que si se une a la primera proteína intracelular, es capaz de interactuar química/física/biológicamente con ella, donde el primer compuesto es uno o más compuesto activos, como, es el caso de un compuesto terapéutico, esto es un medicamento; o bien, un compuesto marcador, como es el caso de un trazador radioactivo; un agente de quimioterapia, un agente de contraste para resonancia magnética, una microburbuja para ultrasonido o técnicas de imagen con resolución óptico-acústica; una nanopartícula, como es el caso de un punto cuántico; un compuesto biológico activo y una molécula adecuada para técnicas de imagen; y un vehículo para el transporte del compuesto activo; un medio para almacenaje, un medio para transferir, y cualquier otro producto adecuado.
La invención relaciona un complejo, para la discriminación entre las células vivas y las células cuya membrana plasmática haya perdido la integridad, con el primer compuesto y la primera proteína obtenida usando por el método de la invención.
En un ejemplo, el complejo se caracteriza por la relación de una ratio de la cantidad del primer compuesto que está ligada a una cantidad dada de células cuya membrana plasmática ha perdido su integridad dividida por una cantidad del primer compuesto que está ligada a la misma cantidad de células vivas([n° de células muertas]/[n° células vivas]), donde el ratio es mayor que 10, mejor si es mayor que 102; es preferible que sea mayor a 105incluso mucho mejor que supere 107,como es el caso de 109.
Se describe el compuesto para detectar la radiación.
Se describe el uso del compuesto como medicamento.
Se describe el compuesto para el uso en el tratamiento de cánceres y/o placa(s) y/o regeneración y/o como apoyo del sistema inmunológico.
Se describen células muertas que contienen el primer compuesto y la primera proteína obtenida por el método de la invención.
La invención se vislumbrará más adelante con la referencia de los dibujos de las figuras 1 a 17 y el ejemplo al que se refieren las figuras 6 a 17. El ejemplo y los Dibujos se proporcionan con fines ilustrativos y no se debe considerar que limiten la invención.
Descripción de los dibujos
La figura 1 muestra las estructuras genéricas de tres subfamilias principales de la actual cianina. La cianina es un nombre no sistemático de una familia de colorantes sintéticos que pertenecen al grupo de los polimetinos. En referencia a la cadena central de carbono de la figura 1; n es un número entero, como n £ [2,10], preferiblemente n£ [4,8]. La cadena L tiene hasta n-1 dobles enlaces, preferiblemente n/2 dobles enlaces, donde las subfamilias II y III pueden contener respectivamente uno y dos sistemas de anillos aromáticos (A,B) representados por la(s)línea(s) curva(s) C, donde es preferible que A,B sean seleccionados cada uno de ellos individualmente de benceno y naftaleno. En los grupos más alejados pueden estar presentes R5, R6, R7 y R8. R5, R6, R7 y R8se seleccionan preferentemente cada uno, individualmente de H, y alquilo, como metilo, etilo, y propilo, prefiriéndose metilo, donde los sistemas de anillo aromáticos pueden contener grupos funcionales más lejanos de los grupos de R1, R2, y/o grupos sustituyentes de los mismos. R1, R2, son preferentemente seleccionado cada uno individualmente de H, sulfonato y sulfonamida, donde la cadena de enlaces simples y dobles alternados L puede ser interrumpida por una o más estructuras de anillos parcial y totalmente saturados, como el ciclopenteno y el ciclohexeno, y combinaciones de la misma, como uno o más anillos de ciclohexeno, donde la estructura de los anillos saturados puede comprender además los grupos funcionales R9 - siendo R9 seleccionado de H, AA y BB, donde R10es seleccionado de, H, SO3H, Cl, -N-C=0-(CH2)q-Y3 (q=1 -6), -(CH2)r-Y 4 (r=1-6); Y3 y Y4 son cada uno independientes de uno de H, COOH, SO3H,CN,
donde los átomos de nitrógeno (N) pueden contener más grupos funcionales del lado N en los grupos R3, R4, en donde R3, R4 son preferentemente seleccionados cada uno individualmente de -(CH2)mY, donde Y es seleccionado cada uno individualmente de un ácido carboxílico que tiene 1-4 átomos de carbono, un grupo sulfonato, CN, C=C, y C=C, y sus sales correspondientes;
en los que en dichos grupos en su lado N contienen m átomos de carbono ,tales como el m £ [1,10], preferentemente M £ [2,8], mejor M £ [3,7], siendo el más adecuado m= 4,5, y 6,incluso más preferible si al menos uno de m = 4, 5 y 6, prefiriéndose m = 6, y el que el otro m preferiblemente sea 4, 5 o 6,donde los citados grupos del lado N contienen uno o más grupos funcionales en el extremo opuesto a la posición N, como un ácido carboxílico que tiene 1-4 átomos de carbono, un grupo sulfónico, y sales del mismo, como sales de sodio y sales de potasio; y es más preferible que el grupo funcional del extremo contenga uno o más dobles enlaces C-C.
El término cianina se refiere a cualquier compuesto cuya estructura central es la de la subfamilia I, II o III. El número entero en los nombres de las cianinas como Cy 3, Cy 5, Cy 7, etc. se refiere al número de átomos de carbono en la cadena L. En un ejemplo de representación, la cianina pertenece a una de estas familias.
En la figura 2, se muestra una estructura genérica de una Rodamina; las sustancias R1 a R12 pueden ser hidrógeno o un grupo funcional; entre los ejemplos de grupos funcionales adecuados se encuentran los grupos de ácido sulfónico, grupos de ácido carboxílico, sulfonamidas, alcoholes, aminas, ésteres, éteres, tioles, tío-ésteres y combinaciones de ellos. El término Rodamina se refiere a cualquier compuesto cuya estructura central sea la que se muestra en la figura 2.
En la figura 3 (a)-(j) se muestran las estructuras de los compuestos a los que se hace referencia en toda la solicitud.
Las figuras 4 y 5 muestran más ejemplos de "primeros compuestos"... adecuados para el método de la invención. Las estructuras (a)-(j)de la figura 3 son los ejemplos preferidos, HQ4 y HQ5 son particularmente adecuadas para el método de la invención. Específicamente: La Fig. 4 muestra las estructuras de Cy3, Cy5, Cy7, Cy3.5, Cy5.5 y Cy3b (R = SO3-, H o alquilo; * = OH); la Fig. 5 muestra una serie de tinciones Dy.
Ejemplo
Unión selectiva de tintes de cianina a células muertas in vitro e in vivo
Introducción
Se ha observado que los colorantes de cianina de la invención, compuestos que se utilizan como control de los colorantes acoplados a las (bio) moléculas parentales para determinar los efectos potenciales o la retención del propio colorante, mostraron una alta y selectiva afinidad por las células muertas. Estas formas de carboxilato de los colorantes de cianina, en contraste con sus homólogos de maleimida y NHS éster NO contienen grupos reactivos y no pueden ser utilizados para etiquetar (bio) moléculas.
Es importante mencionar que los colorantes amina reactivos no pueden utilizarse in vivo porque se unirían inmediatamente de forma no selectiva a los enlaces covalentes de todas las proteínas séricas y otras proteínas del cuerpo que contienen un grupo libre de NH2(amina).
Usando el carboxilato HQ5 como compuesto principal, se ha determinado mediante citometría de flujo, FACS,("Fluorescence-Activated Cell Sorter"), la especificidad de unión a las células muertas in vitro en nuestro recientemente desarrollado “hielo seco”,. Es más, usando la microscopia confocal y marcadores específicos de los primeros y últimos estadios de la muerte celular, se ha establecido que, en dichas fases, dichos carboxilatos de cianina se unen a las células muertas o moribundas. Además, se ha identificado, las proteínas diana intracelulares y el mecanismo por el cual, estos carboxilatos de cianina se unen en las células muertas.
En pruebas in vivo, usando ratones con una crio-lesión y Matrigel, que contiene células muertas, se ha demostrado que el HQ5 se extravasó a través de vasos intactos y no sólo actúa como un agente en el torrente sanguíneo. En relación con esto, es importante mencionar el trabajo del grupo de C. Keller donde describen el colorante de cianina IR-820 para visualizar los tejidos dañados. Sin embargo, muestran que el IR-820 es un agente que, en el torrente sanguíneo simplemente se filtra por los vasos sanguíneos tras la ruptura de los mismos. (Near-infrared imaging de tejido dañado en organismos vivos usando IR-820. Imagen Mol 2009 Jan-Feb;8(1):45-54.)
Finalmente, usando ratones trasplantados con el tumor de mama de ratones, de rápido crecimiento 4T1-luc2, demostramos que el HQ5 marcó específicamente las áreas necróticas de los tumores. Estas áreas necróticas surgen espontáneamente durante el desarrollo del tumor debido a la insuficiencia de suministro de sangre como resultado de la rápida tasa de crecimiento.
Método
Ensayo en hielo seco
Las células 4T1-Luc fueron sembradas en pozos individuales, desde una placa de cultivo celular de 12 celdas y se les permitió crecer hasta su entrelazamiento en medios de RPMI complementados con un 10% de suero bovino fetal. Se utilizaron células de cáncer de mama de ratón 4T1-luc2, ya que la adherencia de estas células al fondo del pocillo de cultivo se mantiene fuerte después del tratamiento con hielo seco. Para iniciar la muerte celular crioinducida, los medios fueron removidos y se aplicó hielo seco en el centro inferior de cada pozo individual durante 15 segundos. Posteriormente, se añadió medio fresco con diferentes concentraciones del primer compuesto de la invención y las células se incubaron a 37 °C durante 15 min. Después de la incubación, el medio fue desechado y las células fueron lavadas dos veces con medio libre de suero y se añadió 0.5 ml de RPMI fresco a cada pozo. Las células fueron entonces visualizadas usando un equipo “LI-COR Odyssey” equipado con un láser de diodo de 700 y 800 nm. También se añadió luciferina (1,25 mg/kg) a cada pozo y se obtuvieron imágenes de fluorescencia y bioluminiscencia utilizando un espectro IVIS (fluorescencia: filtro de excitación: 710 nm, filtro de emisión: 820 nm, tiempo de exposición:90”, bin:8, f/stop: 2, campo de visión: 12,9 cm (bioluminiscencia: filtro abierto, tiempo de exposición: 30”, bin: 8, f/stop: 1, campo de visión: 12,9 cm). Algunos pozos de cultivo también fueron teñidos durante 15 min con Azul Trypan (0,2% en el medio de cultivo) para confirmar la muerte celular.
Resultados
En referencia a las figuras 6 a 17.
La figura 6 muestra las estructuras químicas de los colorantes de cianina HQ5 y CW800 que se utilizaron en los experimentos del ejemplo.
La figura 7 muestra la unión de los colorantes de cianina HQ5 y CW800 con las células muertas o la absorción por células vivas usando el ensayo de hielo seco.
Los colorantes de cianina carboxilada HQ5 y CW800 se unen específicamente y de forma dosis dependiente a las células muertas en el centro de los pozos.
La figura 8 muestra el análisis FACS de las células Jurkat vivas y muertas etiquetadas con HQ5. El análisis FACS de las células Jurkat vivas y tratadas con Estaurosporina, incubadas con HQQ muestran que e1HQ5 etiqueta específicamente a las células muertas y no a las vivas.
La figura 9 es una representación de gráfico de barras de los datos del análisis FACS de la Fig. 8. La absorción del HQ5 por las células muertas es dosis y tiempo dependiente.
La figura 10 muestra imágenes microscópicas confocales de células 4T1 tratadas con ácido Gambógico y teñidas con HQ5 o AnnexinV. El ácido Gambógico mata a las células, debido a la ruptura de la membrana que provoca. Se ha demostrado que el HQ5 tiñe el citoplasma de las células y no los núcleos celulares de las células 4T1 apoptóticas o necróticas tardías. El Annexin V-FITC se une específicamente a la serina de fosfatidilo (PS) expresada en el medio exterior de la membrana celular de las células apoptóticas y necróticas.
La figura 11 muestra imágenes microscópicas confocales de células 4T1 tratadas con ácido gambógico y teñidas con HQ5, Annexin V y EtD. Tanto el HQ5 como el EtD no pueden traspasar las membranas de las células vivas. Sin embargo,cuando la membrana celular está interrumpida, como, por ejemplo, es el caso del último estadío de las células apoptóticas o necróticas, el HQ5 tiñe el citoplasma y la EtD se une al ADN en el núcleo de la célula. Demostramos que la tinción de HQ5 y EtD se co-localiza, indicando células apoptóticas o necróticas tardías. El Annexin V, sin embargo, puede además de teñir las células apoptóticas y necróticas tardías, y también teñir las células en una etapa temprana de apoptosis. Con este Annexin V se tiñe un mayor número de células que con el uso del HQ5 y el EtD.
La figura 12 se refiere a la identificación de las proteínas intracelulares que se unen a la HQ5. Para tratar de identificar la proteína a la que los colorantes HQ se unen, el lisado se incuba (después del pretratamiento) con HQ5 y CW800. El protocolo exacto y la técnica no están especificados. HQ5y CW800 comparten la tinción de algunas proteínas, pero también tienen se unen con diferentes proteínas. Una proteína específica de unión con HQ5 tiene un peso molecular de aproximadamente 40 kD.
La figura 13 muestra los homogeneizados de las células vivas y muertas tratadas con HQ5 (1 y 5pM) y la realización posterior de técnica de electroforesis SDS PAGE (abreviatura de gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico).Se demuestra que el HQ5 se une específicamente a ciertas proteínas intracelulares de las células muertas mientras que no se une a las células vivas. Una de las bandas prominentes que están teñidas tanto por e1HQ5 como por el CW800 es una de 40 kD. Esta banda fue separada del gel y analizada por espectrometría de masas. Esta técnica reveló que dicha banda de proteína 40K contiene proteínas, que son las más abundantes en las células incluyendo actina y tubulina.
La figura 14 muestra los recorridos de la electroforesis en SDS-PAGE de diferentes proteínas intracelulares ~ 40 y BSA (Bovine Serum Albumine) teñidas con HQ5.
La Figura 15 muestra las curvas de saturación de HQ5 en las células 4T1 muertas, las células han muerto por la aplicación del N2 líquido. Se ha demostrado que hasta una concentración de HQ5 de 200 pM, no se alcanza la saturación.
La figura 16 demuestra que el HQ5 no indica la muerte tisular al actuar como un agente de reserva de sangre. Específicamente, la Fig. 16 es una imagen de un ratón inyectado con HQ5 que contiene una crio-lesión cerebral y matrigel inyectado por vía subcutánea; el matrigel contienen células muertas 4T1. En el lugar de la crio-lesión cerebral los vasos sanguíneos se destruyen masivamente, mientras que en los lugares de inyección de matrigel los vasos sanguíneos están completamente intactos. El hecho de que las células muertas en la matrigel se tiñan con HQ5 sugiere que este tinte puede extravasarse a través de los vasos intactos y no actúa simplemente como un agente de reserva de sangre.
La figura 17 muestra la nanopartícula CW800-PLGA dirigida a los tumores después de una terapia fotodinámica. Un ratón desnudo con dos tumores de cáncer de mama 4T1, uno de los cuales (el superior) fue tratado con terapia fotodinámica. Al ratón se le inyectaron nanopartículas y se le tomaron imágenes a las 3, 6 y 24 horas después de la inyección a través de la sonda.
La figura 18 es un examen histológico del desarrollo denecrosis espontánea en los tumores 4T1 a lo largo del tiempo. En (a) se muestra el tumor 4T1 después de una semana teñido con HQ5 y TUNEL (acrónimo en inglés de Terminaldeoxinucleotidiltransferasa). La tinción de TUNEL es específica para las células muertas. No hay necrosis. En (b) se muestra el tumor 4T1 después de 2 semanas de tinción con HQ5 y TÚNEL. Se ven algunos signos del comienzo de la Necrosis. En (c) se muestra un tumor 4T1 en un momento posterior, por ejemplo, a las 24 h, de haber sido teñido con HQ5 y TUNEL. SE observa una clara necrosis en el centro del tumor como se indica tanto con la tinción HQ5 como con la tinción TUNEL. Los tumores 4T1 desarrollan espontáneamente núcleos necróticos en el centro del tumor debido a un crecimiento rápido e incontrolado. La necrosis puede ser identificada por e1HQ5, que se localiza muy bien con la tinción de TUNEL.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un complejo, para su uso en un método in vivo de mareaje de células para discriminar, en una población de células, entre células vivas y células cuya membrana plasmática ha perdido la integridad, como es el caso de las células muertas; de un primer compuesto y una primera proteína de la célula cuya membrana plasmática ha perdido la integridad, en la que el primer compuesto se aplica extracelularmente sin activarse y es sustancialmente incapaz de atravesar una membrana celular sana;
en el que este primer compuesto se selecciona de uno o más de un compuesto fluorescente, siendo una cianina, y un conjugado de la misma de los cuales, preferentemente un compuesto no activado o desactivado, como un carboxilato del mismo;
donde la primera proteína se selecciona del grupo formado por : proteínas fibrosas, proteínas estructurales fibrosas, metaloenzimas, Hsp90p co-acompañante (CDC37), isómeros de las mismas, complejos de los mismas, y sus productos de descomposición,
en donde el primer compuesto y la primera proteína interactúan química/físicamente/biológicamente,
en donde la discriminación se realiza marcando a las células cuya membrana plasmática ha perdido su integridad y la realización de una medición para cuantificar la interacción entre el primer compuesto y la célula cuya membrana plasmática ha perdido integridad, y mediante (e) la realización de una o más mediciones adicionales en la muestra con una primera técnica adecuada para detectar el primer compuesto para obtener un valor o valores del primer compuesto, (f) adicionalmente la determinación de una cantidad de interacción analizando el valor o valores para determinar uno o más valores de uno o más parámetros de la muestra biológica, de aquellas células cuya membrana plasmática ha perdido la integridad, donde un valor o valores por encima de un valor umbral indican la unión del compuesto a la primera proteína celular.
2. Un complejo para su uso según la reivindicación 1, caracterizado porque la primera proteína se selecciona de un grupo que engloba proteínas fibrosas 40 kDa, proteínas fibrosas 100 kDa , como son la tubulina, como la a-tubulina, la (3-tubulina, la Y-tubulina, la ó-tubulina y la £-tubulina,las actinas,talescomo la G-actina, y la F-actina, queratina, como queratina neutra, básica o ácida, como queratina 1 - queratina 20, enolasa y liasa, preferentemente tubulina o actina, sus isómeros, sus complejos y sus productos de descomposición.
3. Un complejo para un uso de acuerdo con una o más de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el primer compuesto es una cianina y se selecciona posteriormente de una o más de un compuesto activo, como: puede ser 1) Un compuesto terapéutico, esto es, un medicamento, 2) un compuesto marcador como un trazador, es decir un trazador radioactivo, un agente de quimioterapia, un agente de contraste de resonancia magnética, una micro burbuja para ultrasonido u obtención de imagen por técnicas optoacústicas, una nanopartícula como es un punto cuántico, un compuesto biológico activo y una molécula adecuada para obtención de imagen; y un vehículo para el transporte del compuesto activo.
4. Un complejo para un uso de acuerdo con una o más de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la cianina es una cianina no activada, preferentemente una cianina según la figura 1 I, II o III,
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
en el que es un número entero, como n £ [2,10], preferentemente n e[4,8],la cadena L tiene hasta n-1 dobles enlaces, preferiblemente n/2 dobles enlaces,
en los que las subfamilias II y III pueden contener respectivamente uno y dos sistemas de anillos aromáticos (A,B) representados por la(s) línea(s) curva(s) C,
donde A,B son preferentemente seleccionados cada uno individualmente de benceno y naftalina,
en el que pueden estar presentes otros grupos R5, R6,R7y R8 ; R5, R6 ,R7 y R8, se seleccionan preferentemente cada uno individualmente del H, y el alquilo, como es el caso de metilo, el etilo y el propilo, preferentemente el metilo, en el que los sistemas de anillos aromáticos pueden contener más grupos funcionales R1, R2, y/o sustitutos, R1, R2, se seleccionan preferentemente cada uno individualmente de H, sulfonato y sulfonamida,
donde la cadena de enlaces alternados simples y dobles L puede ser interrumpida por uno o más anillos parcial y totalmente saturados estructuras, como el ciclopenteno y el ciclohexeno, y combinaciones de ellas, como uno o más anillos de ciclohexeno, en las que la estructura de anillos saturados puede comprender además los grupos funcionales R9- entre los que se selecciona el R9 deH, AA y BB, donde R es seleccionado de, H, SO3H, Cl, -N-C=0-(CH2) q-Y3 (q=1-6), -(CH2) r-Y4(r=1-6), Y3y Y4son cada uno de ellos independientemente uno de H, COOH, SO3H, CN,
Figure imgf000010_0002
donde los átomos de nitrógeno (N) pueden comprender otras funciones en los grupos del lado N R3, R4,donde R3, R4 son preferentemente seleccionados cada uno individualmente de -(CH2)mY, donde Y es seleccionado cada uno individualmente de un ácido carboxílico que tiene de 1-4 átomos de carbono, un grupo sulfonato, CN, C=C, y C=C, y sus correspondientes sales,
donde dichos grupos del lado N comprenden m átomos de carbono, como el m £[1,10], preferentemente m £ [2,8], más preferentemente m £ [3,7], más preferentemente m= 4,5, y 6,e incluso más preferentemente al menos uno de m = 4, 5 y 6, preferiblemente uno m = 6, y el otro m preferiblemente es 4, 5 o 6, en el que dichos grupos del lado N comprenden uno o más grupos funcionales en la posición final que se opone al N, como un ácido carboxílico que tiene 1-4 átomos de carbono, un grupo sulfónico, y sales del mismo, como sales de sodio y potasio, más preferentemente el grupo funcional en el final comprende uno o más dobles enlaces C-C,
tales como uno de HQ4, HQ5, HQ6, HQ7, ICG, CW 800, L7 y L11, y sus derivados conjugables, preferiblemente un carboxilato, preferiblemente HQ4 o HQ5
Figure imgf000011_0001
5 5. Un complejo para un uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado por una ratio entre una cantidad del primer compuesto que está ligado a una cantidad dada de células cuya membrana plasmática ha perdido su integridad, dividida por una cantidad de primer compuesto ligado a una misma cantidad dada de células vivas ([cantidad de células muertas]/[cantidad de células vivas]); donde dicho ratio es mayor que 10, preferiblemente 2 5 7
más grande que 10 , más preferiblemente más grande que 10 ,incluso, preferiblemente más grande que 10 , incluso 9
U tan grande como 10.
6. Utilización de un complejo en un método in vitro de selección de células para discriminar, en una población de células, entre células vivas y células cuya membrana plasmática ha perdido su integridad, tales como
como las células muertas, de un primer compuesto y una primera proteína de la célula cuya membrana plasmática ha perdido su integridad, en la que el primer compuesto no se activa cuando es aplicado extracelularmente y es sustancialmente incapaz de cruzar una membrana celular sana,
caracterizado porque el primer compuesto se selecciona de uno o más de un compuesto fluorescente, siendo una cianina, y un conjugado de la misma, preferentemente un compuesto no activado o desactivado, como un carboxilato de la misma; donde la primera proteína se selecciona del grupo de proteínas fibrosas, proteínas estructurales fibrosas, metaloenzimas, Hsp90p co-caperona (CDC37), sus isómeros, sus complejos y sus productos de descomposición,
donde el primer compuesto y la primera proteína interactúan química, física y biológicamente,
donde la discriminación se realiza marcando a las células cuya membrana plasmática ha perdido su integridad y realizando una medición para determinar la cantidad de interacción entre el primer compuesto y la célula cuya membrana plasmática ha perdido su integridad, y (e) realizando una o más mediciones adicionales en la muestra con una primera técnica adecuada para detectar el primer compuesto con el fin de proporcionar un valor o valores del primer compuesto, (f) además de determinar la cantidad de interacción analizando el valor o valores para determinar uno o más valores de uno o más parámetros de las células cuya membrana plasmática ha perdido la integridad de la muestra biológica, en los que un valor o valores por encima de un valor umbral indican la unión del compuesto a la proteína de la primera célula.
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