ES2833280T3

ES2833280T3 - Células progenitoras pulmonares humanas aisladas y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2833280T3
Application number: ES13735786T
Authority: ES
Inventors: Jayaraj Rajagopal; Hongmei Mou
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 2012-01-13
Filing date: 2013-01-11
Publication date: 2021-06-14
Anticipated expiration: 2033-01-11
Also published as: EP2802647A4; US20190276800A1; US11214769B2; JP2018198614A; JP6388831B2; JP2015504676A; EP3822340A1; US9828583B2; CA2861068A1; EP2802647A1; US20170369839A1; CA3210893A1; EP2802647B1; US20220221779A1; WO2013106677A1; US11987807B2; CA2861068C; JP6931635B2; US10273450B2; US20140329318A1

Abstract

Una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2, humana aislada, en la que la célula es proliferativa y se diferencia en una célula madre basal de las vías respiratorias, una célula ciliada, una célula de Clara, una célula neuroendocrina o una célula epitelial escamosa en condiciones de diferenciación elegidas.

Description

DESCRIPCIÓN

Células progenitoras pulmonares humanas aisladas y usos de las mismas

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad del artículo 35 U.S.C. 119(e) de la solicitud de patente provisional estadounidense con n.° de serie 61/586.551 presentada el 13 de enero de 2012 y la solicitud de patente provisional estadounidense con n.° de serie 61/619.568 presentada el 3 de abril de 2012.

Campo de la invención

El campo de la invención se refiere a células progenitoras pulmonares humanas aisladas, a métodos para elaborar tales células progenitoras pulmonares humanas aisladas y a usos de las mismas.

Antecedentes

Las enfermedades pulmonares, incluyendo las enfermedades respiratorias, son una causa principal de mortalidad y morbilidad a nivel mundial. Los tratamientos actuales están dirigidos a reducir los síntomas de la enfermedad pulmonar y ofrecen pocas o ninguna posibilidad de curación o reversión completa de la enfermedad.

El trasplante de células progenitoras pulmonares derivadas de células madre es un enfoque que puede usarse para regenerar células pulmonares endógenas destruidas por lesiones y enfermedades. Se ha desarrollado un interés considerable en el potencial uso de células madre para reparar el epitelio pulmonar destruido por lesiones y enfermedades.

Las células madre representan poblaciones de células únicas que tienen la capacidad de experimentar tanto autorrenovación como diferenciación. Es beneficioso poder aislar y purificar células precursoras a partir de un sujeto que pueden manipularse antes de reintroducirse en el sujeto con fines de tratamiento. El uso de las propias células de un sujeto evitaría la necesidad de emplear terapia inmunosupresora complementaria, manteniendo así la competencia del sistema inmunitario del sujeto. Por ejemplo, la diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas generadas a partir de la muestra de células somáticas de un sujeto proporciona ventajas al proporcionar poblaciones de células para terapia celular regenerativa autóloga.

Sumario

La diferenciación celular es un proceso complejo que se produce normalmente a través de muchas divisiones celulares. Una célula parcial o totalmente diferenciada puede derivarse de una célula multipotente que a su vez se deriva de una célula multipotente, etc. Si bien cada una de estas células multipotentes pueden considerarse células madre, la variedad de tipos de células que pueden dar lugar cada una puede variar considerablemente. Algunas células diferenciadas también tienen la capacidad de dar lugar a células de mayor potencial de desarrollo (por ejemplo, reprogramación). Tal capacidad puede ser natural o puede inducirse artificialmente tras el tratamiento con diversos factores. En muchos casos biológicos, las células madre también son “multipotentes” porque pueden producir progenie de más de un tipo de célula distinta, pero esto no es necesario para la “troncalidad”.

Además de la capacidad de diferenciarse en un fenotipo de desarrollo más específico, la autorrenovación es otra parte clásica de la definición de célula madre. En teoría, la autorrenovación puede producirse mediante cualquiera de dos mecanismos principales. Las células madre pueden dividirse asimétricamente, conservando una hija el estado madre y expresando la otra hija alguna otra función y fenotipo específicos distintos. Alternativamente, algunas de las células madre en una población pueden dividirse simétricamente en dos tallos, manteniéndose así algunas células madre en la población como un conjunto, mientras que otras células en la población dan lugar a progenie diferenciada solamente. Formalmente, es posible que las células que comienzan como células madre puedan avanzar hacia un fenotipo diferenciado, pero luego “revertir” y volver a expresar el fenotipo de células madre, un término que a menudo se denomina “desdiferenciación” o “reprogramación” o “retrodiferenciación” por expertos habituales en la técnica. La reversión del fenotipo de diferenciación de esta manera generalmente requiere la manipulación artificial de la célula, por ejemplo, expresando proteínas o ARNm específicos de células madre (por ejemplo, c-Myc, Klf4, Oct4, Sox2, entre otros) o poniendo en contacto una célula con un medio de desdiferenciación. Las composiciones y los métodos proporcionados en el presente documento se refieren, en parte, a la generación de células progenitoras humanas comprometidas con el linaje pulmonar y a los usos de tales células para el tratamiento de trastornos/enfermedades pulmonares o lesiones pulmonares. Ya sea una célula madre adulta que puede aislarse a partir del pulmón de un adulto humano, sigue siendo controvertido en la técnica y, en la actualidad, los métodos para aislar y usar células madre pulmonares adultas de humanos carecen de reproducibilidad. Por tanto, las composiciones y los métodos descritos en el presente documento son ventajosos con respecto al estado actual de conocimiento en la técnica y permiten la generación de células progenitoras pulmonares humanas para tratamiento, ingeniería de tejidos y ensayos de selección.

Un aspecto dado a conocer en el presente documento se refiere a una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2, humana aislada, en la que la célula es proliferativa y se diferencia en una célula madre basal de las vías respiratorias, una célula ciliada, una célula de Clara, una célula neuroendocrina o una célula epitelial escamosa en condiciones de diferenciación elegidas.

En una realización de este aspecto, la célula es negativa para Tuj1 y negativa para Pax8.

En otra realización de este aspecto, la célula es una célula específica de enfermedad.

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a una composición que comprende una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2, humana aislada y un armazón, en la que la célula es proliferativa y se diferencia en una célula madre basal de las vías respiratorias, una célula ciliada, una célula de Clara, una célula neuroendocrina o una célula epitelial escamosa en condiciones de diferenciación elegidas.

En otra realización de este aspecto, el armazón puede implantarse en un sujeto.

En otra realización de este aspecto, la célula es autóloga del sujeto en el que se implanta la composición.

En otra realización de este aspecto, el armazón es biodegradable.

En otra realización de este aspecto, el armazón comprende una fibra natural, una fibra sintética, tejido pulmonar descelularizado o una combinación de los mismos.

En otra realización de este aspecto, la fibra natural se selecciona del grupo que consiste en colágeno, fibrina, seda, trombina, quitosano, quitina, ácido algínico, ácido hialurónico y gelatina.

En otra realización de este aspecto, la fibra sintética se selecciona del grupo que consiste en: poliésteres alifáticos biodegradables representativos tales como poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), poli(D,L-lactida-coglicolida) (PLGA), policaprolactona, poliéster alifático de diol/diácido, poliéster-amida/poliéster-uretano, polivalerolactona, polihidroxibutirato, poli(tereftalato de butileno) (PBT), polihidroxihexanoato (PHH), poli(succinato de butileno) (PBS) y polihidroxivalerato.

En otra realización de este aspecto, la célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales es negativa para Tuj1 y/o negativa para Pax8.

También se proporcionan en el presente documento, en otro aspecto, métodos de generación de una célula progenitora pulmonar humana o una población de células progenitoras pulmonares humanas que es una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2 que es proliferativa y se diferencia en una célula madre basal de las vías respiratorias, una célula ciliada, una célula de Clara, una célula neuroendocrina o una célula epitelial escamosa en condiciones de diferenciación elegidas, comprendiendo el método poner en contacto una célula de endodermo del intestino proximal humana con FGF2, WNT y BMP4, cada uno durante un tiempo y a una concentración suficiente para permitir la diferenciación de dicha célula de endodermo del intestino proximal humana en una célula progenitora pulmonar positiva para Nkx2.1, negativa para Tuj1, negativa para Pax8, y comprendiendo además poner en contacto la célula progenitora pulmonar positiva para Nkx2.1, negativa para Tuj1, negativa para Pax8 con BMP7, FGF7, un antagonista de WNT y un antagonista de MAPKK/ERK, cada uno durante un tiempo y a una concentración suficiente para permitir la diferenciación de la célula progenitora pulmonar positiva para Nkx2.1, negativa para Tuj1, negativa para Pax8 en una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2. En una realización de este aspecto, la etapa de poner en contacto con FGF2, WNT y BMP4 se realiza durante al menos 2 días.

En otra realización de este aspecto, el antagonista de Wnt comprende IWR-1.

En otra realización de este aspecto, el antagonista de MAPKK/ERK comprende PD98059.

En otra realización de este aspecto, la etapa de poner en contacto con BMP7, FGF7, un antagonista de WNT y un antagonista de MAPKK/ERK se realiza durante al menos 4 días.

En otra realización de este aspecto, el cultivo de células de endodermo del intestino proximal se derivan de células madre embrionarias (ES) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC).

También se proporciona en el presente documento, en otro aspecto, una composición que comprende una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2, humana aislada y un portador farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de un trastorno o una enfermedad pulmonar, o una lesión pulmonar, en un sujeto, en la que la célula es proliferativa y se diferencia en una célula madre basal de las vías respiratorias, una célula ciliada, una célula de Clara, una célula neuroendocrina o una célula epitelial escamosa en condiciones de diferenciación elegidas.

En otra realización de este aspecto, la composición se administra al pulmón.

En otra realización de este aspecto, la célula progenitora pulmonar humana aislada es autóloga del sujeto al que se le administra la composición.

En otra realización de este aspecto, la composición comprende además un armazón.

En otra realización de este aspecto, el armazón es biodegradable.

En otra realización de este aspecto, el armazón comprende un agente que fomenta la diferenciación de la célula progenitora pulmonar humana aislada.

En otra realización de este aspecto, la composición se formula para administración en aerosol.

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a métodos de selección de un agente para tratar un trastorno o una enfermedad pulmonar, comprendiendo el método: (a) cultivar una población de células de las vías respiratorias específicas de enfermedad humanas producidas mediante diferenciación in vitro de una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2 en presencia y ausencia de un agente candidato para tratar un trastorno o una enfermedad pulmonar, en el que la célula es proliferativa y se diferencia en una célula madre basal de las vías respiratorias, una célula ciliada, una célula de Clara, una célula neuroendocrina o una célula epitelial escamosa en las condiciones de diferenciación elegidas, (b) comparar la expresión o actividad de al menos un marcador que se regula por incremento en la enfermedad o comparar la expresión o actividad de al menos un marcador que se regula por disminución en la enfermedad en presencia y ausencia del agente candidato, en el que una disminución en la expresión o actividad de al menos un marcador de enfermedad regulado por incremento o un aumento en la expresión o actividad de al menos un marcador de enfermedad regulado por disminución identifica al agente candidato como candidato para el tratamiento del trastorno o la enfermedad pulmonar en un sujeto.

En una realización de este aspecto, el método comprende además etapas antes de la etapa (a) de diferenciar una población de células progenitoras pulmonares específicas de enfermedad humanas aisladas en un cultivo de células de las vías respiratorias específicas de enfermedad humanas.

En otra realización de este aspecto, el método comprende además etapas antes de la etapa (a) de diferenciar una población de células madre pluripotentes inducidas derivadas de un sujeto que tiene un trastorno o una enfermedad pulmonar en una población de células progenitoras pulmonares específicas de enfermedad humanas aisladas. En otra realización de este aspecto, el agente candidato comprende una molécula pequeña, una proteína, un polipéptido, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un ácido nucleico.

En otra realización de este aspecto, la célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2, humana se elabora mediante un método que comprende poner en contacto una célula progenitora pulmonar positiva para Nkx2.1, negativa para Tuj1, negativa para Pax8 con BMP7, FGF7, un antagonista de WNT y un antagonista de MAPKK/ERK, cada uno durante un tiempo y a una concentración suficiente para permitir que la célula progenitora pulmonar positiva Nkx2.1, negativa para Tuj1, negativa para Pax8 se diferencie en una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox9.

En otra realización de este aspecto, la etapa de puesta en contacto se realiza durante al menos 4 días.

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a métodos de selección de un agente para inducir la diferenciación de una célula progenitora pulmonar humana que es una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2, humana, que es proliferativa y se diferencia en una célula madre basal de las vías respiratorias, una célula ciliada, una célula de Clara, una célula neuroendocrina o una célula epitelial escamosa en condiciones de diferenciación elegidas, comprendiendo el método: (a) cultivar una célula progenitora pulmonar humana positiva para Nkx2.1, negativa para Tuj1, negativa para Pax8 en presencia y ausencia de un agente de diferenciación candidato, (b) comparar la expresión o actividad de al menos un marcador que se regula por incremento durante la diferenciación de la célula progenitora pulmonar con un estado más diferenciado o comparar la expresión o actividad de al menos un marcador que se regula por disminución durante la diferenciación de la célula progenitora pulmonar con un estado más diferenciado en presencia y ausencia del agente candidato, en los que una disminución en la expresión o actividad de al menos un marcador de diferenciación regulado por incremento o un aumento en la expresión o actividad de al menos un marcador de diferenciación regulado por disminución es indicativo de que el agente candidato puede usarse para inducir la diferenciación de una célula progenitora pulmonar humana aislada en un sujeto.

En una realización de este aspecto, el método comprende además etapas antes de la etapa (a) de diferenciar una célula madre embrionaria o una célula madre pluripotente inducida en una célula progenitora pulmonar humana.

En otra realización de este aspecto, el agente candidato comprende una molécula pequeña, una proteína, un polipéptido, un anticuerpo o un ácido nucleico.

En otra realización de este aspecto, la célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2, humana se elabora mediante un método que comprende poner en contacto una célula progenitora pulmonar humana positiva para Nkx2.1, negativa para Tuj1, negativa para Pax8 con BMP7, FGF7, un antagonista de WNT y un antagonista de MAPKK/ERK, cada uno durante un tiempo y a una concentración suficiente para permitir que la célula progenitora pulmonar positiva para Nkx2.1, negativa para Tuj1, negativa para Pax8 se diferencie en una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox9.

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a kits para tratar un trastorno o una enfermedad pulmonar, comprendiendo el kit: una célula según la reivindicación 1, un portador farmacéuticamente aceptable e instrucciones para tratar un trastorno o una enfermedad pulmonar.

En una realización de este aspecto, el kit comprende además un armazón.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un esquema que representa una estrategia global para la diferenciación por etapas de progenitores de las vías respiratorias a partir de las ESC de ratón. El esquema muestra el enfoque para desarrollar un protocolo eficiente y reproducible para producir progenitores epiteliales embrionarios de las vías respiratorias a partir de ESC de ratón. La red de señalización fomenta la diferenciación de las ESC en el endodermo definitivo, la anteriorización del endodermo en el endodermo del intestino proximal, la inducción del endodermo pulmonar más temprano a partir del endodermo del intestino proximal y la generación de células progenitoras embrionarias de las vías respiratorias. Las figuras 2A-2B muestran datos que indican que la anteriorización del endodermo en el endodermo del intestino proximal fomenta la diferenciación de células Nkx2.1+. La figura 2A muestra que la administración de BMP4 20 ng/ml, FGF2 20 ng/ml y GSK3iXV 5 nM al endodermo definitivo dio como resultado una diferenciación del intestino distal con expresión de CDX2 y una inducción mínima de NKX2.1. Barra de escala, 50 |im. La figura 2B muestra el tratamiento del endodermo definitivo con diferentes combinaciones de agonistas y antagonistas de BMP4/TGFP tal como se enumeran en la tabla durante 2 días. Las células Foxa2+/Sox2+ se cuantificaron como porcentaje de células positivas con respecto al número total de células Foxa2+. Las células se trataron adicionalmente con B^mP4 20 ng/ml, FG^f2 20 ng/ml y GSK3iXV 5 nM para inducir la expresión de NKX2.1. El porcentaje de células Nkx2.1+ se cuantificó como porcentaje del total de células presentes. Todos los datos se promediaron a partir de 3 experimentos independientes.

Las figuras 3A-3C muestran que las señalizaciones de BMP4, FGF2 y WNT son necesarias para la especificación pulmonar a partir de células de endodermo del intestino proximal. La figura 3A es un esquema que representa la estrategia y el marco de tiempo para generar células Nkx2.1+ a partir de células de endodermo del intestino proximal. La figura 3B es una lista de diversas combinaciones de BMP4, FGF2, WNT y sus antagonistas para la inducción de Nkx2.1+. La figura 3C muestra el porcentaje de NKX2.1 tal como se puntúa mediante el número de células Nkx2.1+ con respecto al número total de células en un promedio de 3 experimentos independientes.

La figura 4 muestra que se requiere la señalización de BMP dependiente de Smad para la diferenciación pulmonar. La expresión de NKX2.1 se indujo con FGF2 20 ng/ml y g Sk 3ÍXV 5 nM sólo (control) o con BMP4 adicional (20 ng/ml), BMP2 (20 ng/ml), BMP7 (20 ng/ml), BMP4 (20 ng/ml) dorsomorfina 10 |iM o BMP4 (20 ng/ml) PD980591 |iM (datos no mostrados). La figura 4 muestra que se requiere la señalización de BMP a través de rutas dependientes de SMAD para la diferenciación de Nkx2.1+ pulmonares. Por el contrario, no se requiere la señalización a través de la ruta de MAP cinasas para la expresión de Nkx2.1. La dorsomorfina inhibe la señalización de BMP a través de la ruta de SMAD, mientras que PD98059 inhibe la señalización de MAPK.

Las figuras 5A-5B muestran la generación de progenitores embrionarios de las vías respiratorias a partir de células de endodermo pulmonar multipotentes. La figura 5A es un esquema que representa una estrategia y una línea de tiempo para generar progenitores embrionarios de las vías respiratorias a partir de células de endodermo pulmonar multipotentes. La figura 5B es un resumen de los interruptores de señalización que son distintos en las vías respiratorias proximales y la punta del brote pulmonar distal durante la etapa pseudoglandular del desarrollo pulmonar. La tinción por inmunofluorescencia de NKX2.1 y SOX2 se realizó después del tratamiento de las células de endodermo pulmonar Nkx2.1+ en D9 con medio que contenía B27 complementado con RA, BMP7 20 ng/ml, FGF7 20 ng/ml, IWR-1 (antagonista de WNT) 100 nM y Noggin 100 ng/ml durante 2 días (datos no mostrados). Además, la tinción por inmunofluorescencia de NKX2.1 y SOX2 se realizó después del tratamiento de las células de endodermo pulmonar Nkx2.1+ en D9 con medio que contenía B27 complementado con RA, BMP720 ng/ml, FGF7 20 ng/ml, IWR-1 (antagonista de WNT) 100 nM y PD980591 |iM durante 2 días. Barra de escala, 50 |im (datos no mostrados). Los datos a partir de la tinción por inmunofluorescencia indicaron la presencia de una subpoblación de células Nkx2.1+ positivas para P63 (datos no mostrados).

La figura 6 es un esquema que representa una estrategia y una línea de tiempo a modo de ejemplo para generar progenitores multipotentes pulmonares Nkx2.1+ a partir de iPSC humanas. Los datos del experimento indican una diferenciación por etapas de progenitores pulmonares Nkx2.1+ a partir de iPSC humanas. Se obtuvo un alto rendimiento de endodermo definitivo a partir de células CF1 RiPS después del tratamiento durante 4 días en medios RPMI-1640 en presencia de suplemento de B27 al 2 %, activina A (100 ng/ml) e inhibidor de PI3 cinasa LY294002 5 |iM, coexpresando más del 90 % de células los factores de transcripción SOX17 y FOXA2 (datos no mostrados). La anteriorización del endodermo en células de endodermo del intestino proximal se observó detectando la expresión de SOX2 en células Foxa2+ derivadas de células CF1 RiPS después de 4 días de tratamiento con A-83-01 500 nM (antagonista de TGFp) y Noggin 100 ng/ml (antagonista de BMP4) (datos no mostrados). La tinción de NKX2.1 se realizó después de la anteriorización en las células del intestino proximal en D8 con medio sin suero que contenía BMP4 20 ng/ml, FGF2 20 ng/ml y GSK3iXV 5 nM durante 4 días (datos no mostrados). La inmunofluorescencia mostró la tinción conjunta de células positivas para Nkx2.1 con SOX2, SOX9, TUJ1 y PAX8, demostrando así una falta de diferenciación tiroidea y neuronal y la presencia de progenitores multipotentes de la punta distal y progenitores de las vías respiratorias Nkx2.1+/Sox2+ (datos no mostrados). Además, las imágenes confocales tras la tinción por inmunofluorescencia indican que alguna esfera de Nkx2.1+ contiene células basales positivas para p63 (datos no mostrados).

La figura 7 es un esquema que representa una estrategia de tratamiento y un marco de tiempo para generar endodermo definitivo. La inmunofluorescencia de FOXA2 y SOX17 se realizó el día 5 e indica que >90 % de las células eran endodermo definitivo generado a partir de mESC de p2A y a partir de mESC de V6.5 (datos no mostrados).

La figura 8 es una tabla y un esquema que resumen los datos de inmunofluorescencia para combinaciones específicas de marcadores que segregan primordio de órgano cerebral, tiroideo y pulmonar Nkx2.1+ en embriones de ratón. Se realizó obtención de imágenes de inmunofluorescencia de Nkx2.1 y SOX2 en el prosencéfalo ventral, la tiroides y el pulmón en E8.75-E9 (datos no mostrados). También se realizó obtención de imágenes de inmunofluorescencia para Nkx2.1, Tuj1 y Sox9 en el prosencéfalo ventral, así como para Nkx2.1, Pax8 y Sox9 en tiroides en E8.75-E9.

Las figuras 9A-9B son gráficos que representan un análisis de expresión génica de destinos del endodermo anterior derivados de ESC. Expresión cuantitativa de ARNm de Nkx2.1, Sox2, FoxNI, Pax9, Tbx1, Pax8, Sox9 y FoxP2 en ESC de ratón o iPSC humanas, correspondiente a endodermo definitivo (ED) y endodermo anterior (EA) y EA después del tratamiento con cóctel de factor de crecimiento inductivo de Nkx2.1. n = 3 réplicas biológicas por triplicado, el nivel de expresión se normaliza con respecto al nivel de ESC o iPSC.

La figura 10 es una micrografía que representa la presencia de cilios funcionales en la superficie de una célula de las vías respiratorias diferenciada a partir de un progenitor pulmonar humano tal como se describe en el presente documento. Se observó que los cilios vibraban en ondas coordinadas, lo que indica que la célula de las vías respiratorias es funcional.

La figura 11 es un esquema que representa las posibilidades de diferenciación para las células Nkx2.1+, Tuj1-, Pax8-. Sin desear limitarse a la teoría, la figura 11 muestra dos posibles mecanismos mediante los cuales los progenitores pulmonares humanos posteriores pueden diferenciarse a partir de células Nkx2.1+, Tuj1-, Pax8-.

La figura 12 es un diagrama esquemático que representa un protocolo de diferenciación por etapas de progenitores de las vías respiratorias a modo de ejemplo a partir de iPSC en progenitores de las vías respiratorias.

La figura 13 es un diagrama esquemático que representa una variación del protocolo para producir endodermo definitivo a partir de iPSC y ESC humanas; el protocolo permite la producción de endodermo definitivo con alta eficacia y uniformidad.

Las figuras 14A-14B muestran una selección química imparcial para potenciar la diferenciación pulmonar del endodermo anterior. La figura 14A muestra un diagrama esquemático que representa la plataforma de selección química. La figura 14B es una tabla que muestra los principales compuestos que facilitaron la producción de células progenitoras pulmonares Nkx2.1+.

Descripción detallada

Las composiciones y los métodos descritos en el presente documento se refieren, en parte, al descubrimiento de un método para elaborar células progenitoras pulmonares humanas aisladas a partir de células madre embrionarias (ES) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC). La presencia y el aislamiento de células progenitoras adultas del tejido pulmonar es controvertido y sólo ha logrado un éxito limitado, por tanto, las composiciones y los métodos descritos en el presente documento tienen la ventaja de que las células progenitoras pulmonares humanas aisladas pueden producirse en cantidades útiles para ensayos de selección o el tratamiento de trastornos/enfermedades pulmonares, o lesión pulmonar. Además, las composiciones celulares proporcionadas en el presente documento no se han aislado y/o cultivado previamente a partir de tejido pulmonar humano.

Definiciones

Tal como se usa en el presente documento, el término “célula madre humana” se refiere a una célula humana que puede autorrenovarse y diferenciarse en al menos un tipo de célula. El término “célula madre humana” abarca líneas de células madre humanas, células iPS derivadas de seres humanos, células madre embrionarias humanas, células pluripotentes humanas, células madre multipotentes humanas o células madre adultas humanas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “multipotente” se refiere a la capacidad de una célula para diferenciarse en una pluralidad de fenotipos diferentes. Las células multipotentes generalmente sólo pueden diferenciarse en células de un único linaje de la capa germinal. Esto contrasta con las células pluripotentes que pueden, por definición, diferenciarse en células de las tres capas germinales. Las células pluripotentes se caracterizan principalmente por su capacidad para diferenciarse en las tres capas germinales, usando, por ejemplo, un ensayo de formación de teratoma de ratón desnudo. La pluripotencia también se evidencia por la expresión de marcadores de células madre embrionarias (ES), aunque la prueba preferida para determinar la pluripotencia es la demostración de la capacidad para diferenciarse en células de cada una de las tres capas germinales. Una célula pluripotente tiene normalmente el potencial de dividirse in vitro durante un largo periodo de tiempo, por ejemplo, más de un año o más de 30 pases.

Tal como se usa en el presente documento, el término “célula progenitora pulmonar humana” es un término general que se refiere a cualquier célula progenitora que está comprometida con el linaje pulmonar y que también conserva la capacidad de autorrenovarse. Una de las primeras etapas en el compromiso con el linaje pulmonar es la aparición del marcador de células madre Nkx2.1, sin embargo, el marcador Nkx2.1 también puede detectarse en células del linaje tiroideo y cerebral. Por tanto, para los fines de esta descripción, las primeras células progenitoras comprometidas con el linaje pulmonar y abarcadas por el término “célula progenitora pulmonar humana” son aquellas células que expresan Nkx2.1, pero carecen de los marcadores de superficie celular Tuj1 y Pax8. Cualquier célula progenitora que pueda diferenciarse a partir de la célula positiva para Nkx2.1, negativa para Tuj1, negativa para Pax8 y que conserve la capacidad de autorrenovación también está incluida en el término “célula progenitora pulmonar humana”. Otros ejemplos de células progenitoras pulmonares humanas descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, células progenitoras multipotentes de las vías respiratorias proximales positivas para Nkx2.1, positivas para Sox2; células progenitoras pulmonares distales multipotentes positivas para Nkx2.1, positivas para Sox9; y células madre de las vías respiratorias basales positivas para Nkx2.1, positivas para p63. En algunas realizaciones, las células progenitoras pulmonares humanas se diferencian en una célula madre basal de las vías respiratorias, una célula ciliada, una célula de Clara, una célula caliciforme secretora de mucina, un neumocito de tipo I, un neumocito de tipo II o una célula neuroendocrina cuando se colocan en condiciones de diferenciación seleccionadas. Una célula progenitora pulmonar humana no es una célula tumoral ni una célula cancerosa. En un aspecto, una célula progenitora pulmonar humana no se deriva de un embrión o de una célula madre embrionaria u otra célula derivada en cultivo de un embrión. En algunas realizaciones, las células progenitoras pulmonares humanas se diferencian a partir de una célula autóloga o a partir de una célula no autóloga. En una realización, la célula progenitora pulmonar humana no se modifica genéticamente ni se deriva de una célula modificada genéticamente.

Tal como se usa en el presente documento, el término “célula progenitora pulmonar multipotente distal” se refiere a una célula positiva para Nkx2.1, positiva para Sox9 que puede diferenciarse en todos los tipos de células epiteliales del pulmón incluyendo, pero sin limitarse a, una célula madre basal de las vías respiratorias, una célula ciliada, una célula de Clara, una célula neuroendocrina, una célula epitelial escamosa, un neumocito de tipo I, un neumocito de tipo II, una célula madre bronquioalveolar (BASC), progenitores pulmonares ubicados en la unión del conducto bronquioalveolar (BADJ) dentro de los bronquiolos terminales, células progenitoras para neumocitos de tipo I y tipo II y/o una célula CK14+ migratoria para células alveolares y células epiteliales de las vías respiratorias que responden a la lesión pulmonar (por ejemplo, infección por gripe).

Tal como se usa en el presente documento, el término “progenitor multipotente de las vías respiratorias proximales” se refiere a una célula positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2 que puede diferenciarse en una célula madre basal de las vías respiratorias, una célula ciliada, una célula de Clara, una célula neuroendocrina, una célula epitelial escamosa o una célula CK14+ migratoria que se traslada a una ubicación bronquioalveolar para la diferenciación de células alveolares después de una lesión pulmonar.

Mediante el término “célula diferenciada” quiere decirse cualquier célula primaria que no es, en su forma nativa, pluripotente tal como se define en el presente documento. Los expertos habituales en la técnica reconocen que existe un espectro de diferenciación desde células totipotentes o pluripotentes en un extremo hasta células completamente diferenciadas que no tienen la capacidad normal de diferenciarse naturalmente en cualquier otro fenotipo. Por tanto, una célula pluripotente se diferencia en relación con una célula totipotente y una célula multipotente se diferencia en relación con una célula pluripotente. En algunas realizaciones, el término “célula diferenciada” también se refiere a una célula de un tipo de célula más especializada derivada de una célula de un tipo de célula menos especializada (por ejemplo, de una célula indiferenciada o una célula reprogramada), en la que la célula ha sufrido un proceso de diferenciación celular.

Tal como se usa en el presente documento, el término “positiva para”, cuando se refiere a una célula positiva para un marcador (por ejemplo, positiva para Nkx2.1), significa que un marcador de superficie celular es detectable por encima de los niveles de fondo en la célula usando los métodos de microscopía de inmunofluorescencia o citometría de flujo, tales como clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Alternativamente, los términos “positiva para” o “expresa un marcador” significa que la expresión de ARNm que codifica para un marcador de superficie celular o intracelular es detectable por encima de los niveles de fondo usando RT-PCR. El nivel de expresión de un marcador de superficie celular o marcador intracelular puede compararse con el nivel de expresión obtenido a partir de un control negativo (es decir, células que se sabe que carecen del marcador) o mediante controles de isotipo (es decir, un anticuerpo de control que no tiene una especificidad relevante y sólo se une de manera inespecífica a proteínas, lípidos o hidratos de carbono celulares). Por tanto, una célula que “expresa” un marcador (o es “positiva para un marcador”) tiene un nivel de expresión detectable por encima del nivel de expresión determinado para el control negativo para ese marcador.

Tal como se usa en el presente documento, el término “negativa para”, cuando se refiere a una célula negativa para un marcador (o el término “no expresa”), significa que un marcador de superficie celular no puede detectarse por encima de los niveles de fondo en la célula usando los métodos de microscopía de inmunofluorescencia o citometría de flujo, tales como clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Alternativamente, los términos “negativa” o “no expresa” significa que la expresión del ARNm para un marcador intracelular o marcador de superficie celular no puede detectarse por encima de los niveles de fondo usando RT-PCR. El nivel de expresión de un marcador de superficie celular o marcador intracelular puede compararse con el nivel de expresión obtenido a partir de un control negativo (es decir, células que se sabe que carecen del marcador) o mediante controles de isotipo (es decir, un anticuerpo de control que no tiene una especificidad relevante y sólo se une de manera inespecífica a proteínas, lípidos o hidratos de carbono celulares). Por tanto, una célula que “no expresa” un marcador parece similar al control negativo para ese marcador.

Tal como se usa en el presente documento, la frase “la célula es proliferativa” se refiere a la capacidad de una célula madre para autorrenovarse. La autorrenovación puede producirse mediante cualquiera de dos mecanismos principales. Las células madre pueden dividirse asimétricamente, conservando una hija el estado madre y expresando la otra hija alguna otra función y fenotipo específicos distintos. Alternativamente, algunas de las células madre en una población pueden dividirse simétricamente en dos tallos, manteniéndose así algunas células madre en la población como un conjunto, mientras que otras células en la población dan lugar a progenie diferenciada solamente.

Tal como se usa en el presente documento, el término “capacidad para diferenciarse” se refiere a la capacidad de una célula madre, célula progenitora, célula pluripotente o célula multipotente para diferenciarse en un subconjunto de células más diferenciadas. El término “capacidad para diferenciarse” no comprende retroceder a lo largo del espectro de diferenciación de modo que se produzca una célula que comprenda una mayor capacidad de diferenciación que la célula original. Es decir, el término “capacidad para diferenciarse” no abarca los métodos de reprogramación para cambiar las células a un estado menos diferenciado.

En el contexto de la ontogenia celular, el término “diferenciar” o “que se diferencia” es un término relativo que indica que una “célula diferenciada” es una célula que ha progresado más en la ruta de desarrollo que su célula precursora. Por tanto, en algunas realizaciones, una célula reprogramada, tal como se define este término en el presente documento, puede diferenciarse en células precursoras de linaje restringido (tales como una célula progenitora pulmonar humana), que a su vez pueden diferenciarse en otros tipos de células precursoras más adelante en la ruta (tales como como un precursor específico de tejido, por ejemplo, una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales), y luego en una célula diferenciada en etapa terminal, que desempeña un papel característico en un determinado tipo de tejido, y puede o no conservar la capacidad de proliferar adicionalmente. Tal como se usa en el presente documento, los términos “desdiferenciación” o “reprogramación” o “retrodiferenciación” se refieren al proceso que genera una célula que reexpresa un fenotipo más de células madre o un fenotipo menos diferenciado que la célula de la que se deriva. Por ejemplo, una célula multipotente puede desdiferenciarse en una célula pluripotente. Es decir, la desdiferenciación desplaza una célula hacia atrás a lo largo del espectro de diferenciación de las células totipotentes hasta células completamente diferenciadas. Normalmente, la reversión del fenotipo de diferenciación de una célula requiere la manipulación artificial de la célula, por ejemplo, mediante la expresión de proteínas y/o ARNm específicos de células madre. La reprogramación no suele observarse en condiciones nativas in vivo o in vitro.

Tal como se usa en el presente documento, el término “célula somática” se refiere a cualquier célula distinta de una célula germinal, una célula presente en u obtenida a partir de un embrión preimplantado o una célula resultante de la proliferación de una célula de este tipo in vitro. Dicho de otro modo, una célula somática se refiere a cualquier célula que forma el cuerpo de un organismo, a diferencia de las células de la línea germinal. Cada tipo de célula en el cuerpo de los mamíferos, aparte de los espermatozoides y los óvulos, las células de las que están constituidos (gametocitos) y las células madre indiferenciadas, es una célula somática: los órganos internos, la piel, los huesos, la sangre y el tejido conjuntivo están todos sustancialmente constituidos por células somáticas. En algunas realizaciones, la célula somática es una “célula somática no embrionaria”, mediante lo cual quiere decirse que una célula somática no está presente en ni se obtiene a partir de un embrión y no es el resultado de la proliferación de tal célula in vitro. En algunas realizaciones, la célula somática es una “célula somática adulta”, mediante lo cual quiere decirse que una célula está presente en o se obtiene a partir de un organismo que no es un embrión ni un feto o es el resultado de la proliferación de tal célula in vitro. A menos que se indique lo contrario, los métodos para reprogramar una célula diferenciada (por ejemplo, para generar una iPSC) pueden realizarse tanto in vivo como in vitro (en los que in vivo se emplea cuando una célula diferenciada está presente dentro de un sujeto y en los que in vitro se emplea usando una célula diferenciada aislada mantenida en cultivo).

Tal como se usa en el presente documento, el término “célula adulta” se refiere a una célula que se encuentra en todo el cuerpo después del desarrollo embrionario.

El término “célula aislada”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una célula que se ha retirado de un organismo en el que se encontraba originalmente o a un descendiente de tal célula. Opcionalmente, la célula se ha cultivado in vitro, por ejemplo, en presencia de otras células. Opcionalmente, la célula se introduce posteriormente en un segundo organismo o se reintroduce en el organismo del que se aisló (o la célula de la que desciende).

El término “población aislada”, con respecto a una población aislada de células, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una población de células que se ha retirado y separado de una población mixta o heterogénea de células. En algunas realizaciones, una población aislada es una población sustancialmente pura de células en comparación con la población heterogénea de la que se aislaron o enriquecieron las células. En algunas realizaciones, la población aislada es una población aislada de células progenitoras pulmonares humanas, por ejemplo, una población sustancialmente pura de células progenitoras pulmonares humanas en comparación con una población heterogénea de células que comprende células progenitoras pulmonares humanas y células de las que se derivaron las células progenitoras pulmonares humanas.

El término “sustancialmente pura”, con respecto a una población celular particular, se refiere a una población de células que es al menos aproximadamente el 75 %, preferiblemente al menos aproximadamente el 85 %, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90 % y lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 95 % pura, con respecto a las células que constituyen una población celular total. Es decir, los términos “sustancialmente pura” o “esencialmente purificada”, con respecto a una población de células progenitoras pulmonares, se refieren a una población de células que contiene menos de aproximadamente el 20 %, más preferiblemente menos de aproximadamente el 15 %, el 10 %, el 8 %, el 7 %, lo más preferiblemente menos de aproximadamente el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 %, el 1 % o menos del 1 %, de células que no son células progenitoras pulmonares, tal como se definen en los términos en el presente documento.

Los términos “que enriquece” o “enriquecido” se usan de manera intercambiable en el presente documento y significan que el rendimiento (fracción) de células de un tipo, tales como composiciones de células progenitoras pulmonares humanas y células para su uso en los métodos descritos en el presente documento, aumenta en al menos el 10 %, en al menos el 15 %, en al menos el 20 %, en al menos el 25 %, en al menos el 30 %, en al menos el 35 %, en al menos el 40 %, en al menos el 45 %, en al menos el 50 %, en al menos el 55 %, en al menos el 60 %, en al menos el 65 %, en al menos el 70 % o en al menos el 75 % con respecto a la fracción de células de ese tipo en la preparación, el cultivo o la muestra biológica de partida.

Tal como se usa en el presente documento, “que prolifera” y “proliferación” se refieren a un aumento en el número de células en una población (crecimiento) por medio de división celular. Se entiende generalmente que la proliferación celular es el resultado de la activación coordinada de múltiples rutas de transducción de señales en respuesta al entorno, incluyendo factores de crecimiento y otros mitógenos. La proliferación celular también puede fomentarse mediante la liberación de las acciones de señales y mecanismos intracelulares o extracelulares que bloquean o afectan negativamente a la proliferación celular.

Los términos “renovación” o “autorrenovación” o “proliferación” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a un proceso en el que una célula hace más copias de sí misma (por ejemplo, duplicación) de la célula. En algunas realizaciones, las células progenitoras pulmonares son capaces de renovarse por sí mismas dividiéndose en las mismas células indiferenciadas (por ejemplo, tal como se determina midiendo la presencia de ausencia de uno o más marcadores de superficie celular) durante largos periodos y/o de muchos meses a años. En algunos casos, la proliferación se refiere a la expansión de las células progenitoras pulmonares mediante la división repetida de células individuales en dos células hijas idénticas.

El término “separación” o “selección”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a aislar diferentes tipos de células en una o más poblaciones y recoger la población aislada como población de células diana que está enriquecida en una población de células madre diana específica. La selección puede realizarse usando selección positiva, mediante la cual se conserva una población de células diana enriquecida, o selección negativa, mediante la cual se descartan los tipos de células no diana (enriqueciendo así los tipos de células diana deseados en la población celular restante).

El término “selección positiva”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la selección de un tipo de célula deseado conservando las células de interés. En algunas realizaciones, la selección positiva implica el uso de un agente para ayudar a conservar las células de interés, por ejemplo, el uso de un agente de selección positiva tal como un anticuerpo que tiene afinidad de unión específica por un antígeno de superficie en la célula deseada o diana. En algunas realizaciones, la selección positiva puede producirse en ausencia de un agente de selección positiva, por ejemplo, en un sistema cerrado o “sin contacto”, por ejemplo, en el que la selección positiva de un tipo de célula diana se basa en cualquiera del tamaño, la densidad y/o la morfología celular del tipo de célula diana.

El término “selección negativa”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la selección de células madre no deseadas o no diana para el agotamiento o descarte, conservando (y, por tanto, enriqueciendo) el tipo de célula diana deseada. En algunas realizaciones, la selección negativa implica el uso de un agente para ayudar a seleccionar células no deseables para su descarte, por ejemplo, el uso de un agente de selección negativa tal como un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de unión específica por un antígeno de superficie en células no deseadas o no diana. En algunas realizaciones, la selección negativa no implica un agente de selección negativa. En algunas realizaciones, la selección negativa puede producirse en ausencia de un agente de selección negativa, por ejemplo, en un sistema cerrado o “sin contacto”, por ejemplo, en el que la selección negativa de un tipo de célula no deseada (no diana) que va a descartarse se basa en cualquiera del tamaño, la densidad y/o la morfología celular del tipo de célula no deseada (no diana).

El término “marcador”, tal como se usa en el presente documento, se usa para describir las características y/o el fenotipo de una célula. Los marcadores pueden usarse para la selección de células que comprenden características de interés y pueden variar con células específicas. Los marcadores son características, ya sean características morfológicas, funcionales o bioquímicas (enzimáticas) de la célula de un tipo de célula en particular, o moléculas expresadas por el tipo de célula. En un aspecto, tales marcadores son proteínas. Tales proteínas pueden poseer un epítopo para anticuerpos u otras moléculas de unión disponibles en la técnica. Sin embargo, un marcador puede consistir en cualquier molécula que se encuentre en una célula, incluyendo, pero sin limitarse a, proteínas (péptidos y polipéptidos), lípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos y esteroides. Los ejemplos de características o rasgos morfológicos incluyen, pero no se limitan a, forma, tamaño y razón de núcleo con respecto a citoplasma. Los ejemplos de características o rasgos funcionales incluyen, pero no se limitan a, la capacidad de adherirse a sustratos particulares, la capacidad de incorporar o excluir colorantes particulares, la capacidad de migrar en condiciones particulares y la capacidad de diferenciarse a lo largo de linajes particulares. Los marcadores pueden detectarse mediante cualquier método disponible para un experto en la técnica. Los marcadores también pueden estar ausentes de una característica morfológica o ausentes de proteínas, lípidos, etc. Los marcadores pueden ser una combinación de un panel de características únicas de la presencia y/o ausencia de polipéptidos y otras características morfológicas. En una realización, el marcador es un marcador de superficie celular. Los marcadores de superficie celular a modo de ejemplo expresados en células progenitoras pulmonares incluyen, pero no se limitan a, Sox2, Sox9, p63, FoxP2, ETV4/5, FoxA2, Nkx2.1, Gata6, ID2, CK5, NGFR, FoxJ1, CCSP, Scgb3a2, Muc5ac, T1a, Spc y Scgn. En algunas realizaciones, la ausencia de un marcador de superficie celular puede usarse para distinguir una célula progenitora pulmonar de una célula de otro linaje (por ejemplo, un linaje tiroideo o cerebral). Los marcadores de superficie celular a modo de ejemplo que están ausentes en las células progenitoras pulmonares o en las células pulmonares diferenciadas incluyen, pero no se limitan a, Tuj1 y Pax8. Un experto en la técnica reconocerá que un marcador de superficie celular puede estar presente en un punto particular del desarrollo o en un tipo particular de células progenitoras pulmonares. Por ejemplo, Sox2 se expresa en células progenitoras del endodermo anterior, no se expresa en progenitores pulmonares más diferenciados, tales como progenitores pulmonares distales multipotentes, y luego se reactiva en células tales como progenitores de las vías respiratorias a medida que avanza la diferenciación de los progenitores. Por tanto, puede usarse un marcador de superficie celular en combinación con una estrategia de selección positiva para determinados progenitores pulmonares y también puede usarse en combinación con una estrategia de selección negativa para otros progenitores pulmonares, dependiendo de la etapa de diferenciación particular del progenitor pulmonar deseado que va a seleccionarse.

Tal como se usa en el presente documento, el término “armazón” se refiere a una estructura, que comprende un material biocompatible, que proporciona una superficie adecuada para la adherencia y proliferación de células. Un armazón puede proporcionar además estabilidad mecánica y soporte. Un armazón puede tener una conformación o forma particular para influir en o delimitar una forma tridimensional o la forma asumida por una población de células en proliferación. Tales conformaciones o formas incluyen, pero no se limitan a, películas (por ejemplo, una forma con dos dimensiones sustancialmente mayores que la tercera dimensión), cintas, cordones, láminas, discos planos, cilindros, esferas, conformaciones amorfas tridimensionales, etc.

Tal como se usa en el presente documento, el término “implantable en un sujeto” se refiere a cualquier estructura implantable no viva (por ejemplo, acelular) que tras la implantación no genera una respuesta inmunitaria apreciable en el organismo huésped. Por tanto, una estructura implantable no debe, por ejemplo, ser o contener un irritante, o contener LPS, etc.

Tal como se usa en el presente documento, el término “biodegradable” se refiere a la capacidad de un armazón para degradarse en condiciones fisiológicas, por ejemplo, en condiciones que no afecten negativamente a la viabilidad celular de las células administradas o células in vivo. Tales armazones biodegradables preferiblemente no serán ni contendrán un irritante o un alérgeno que pueda provocar una reacción sistémica en el sujeto al que se le ha implantado la composición. En algunas realizaciones, biodegradable significa que el armazón puede metabolizarse y los metabolitos se aclaran del sujeto mediante mecanismos de excreción fisiológica (por ejemplo, orina, heces, desintoxicación del hígado, etc.).

Tal como se usa en el presente documento, el término “que trata” incluye reducir o aliviar al menos un síntoma o efecto adverso de un estado, una enfermedad o un trastorno. Por ejemplo, el término “que trata” y “tratamiento” se refiere a administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición, por ejemplo, una cantidad eficaz de una composición que comprende una población de células progenitoras pulmonares de modo que el sujeto tenga una reducción en al menos un síntoma de la enfermedad o una mejora en la enfermedad, por ejemplo, resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de esta divulgación, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, el alivio de uno o más síntomas, la disminución de la extensión de la enfermedad, la estabilización de la enfermedad (por ejemplo, sin empeoramiento), retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado patológico y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. En algunas realizaciones, tratar puede referirse a prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Por tanto, un experto en la técnica se da cuenta de que un tratamiento puede mejorar el estado patológico, pero puede que no sea una cura completa para la enfermedad. En algunas realizaciones, el tratamiento puede incluir profilaxis. Sin embargo, en realizaciones alternativas, el tratamiento no incluye profilaxis.

“Tratamiento” de un trastorno pulmonar, una enfermedad pulmonar o una lesión pulmonar (por ejemplo, lesión pulmonar aguda), tal como se hace referencia en el presente documento, se refiere a una intervención terapéutica que estabiliza o mejora la función del pulmón o las vías respiratorias. Es decir, el “tratamiento” está orientado a la función del aparato respiratorio. Un enfoque terapéutico que estabiliza o mejora la función del pulmón o las vías respiratorias en al menos el 10 %, y preferiblemente en al menos el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 75 %, el 90 %, el 100 % o más, por ejemplo, 2 veces, 5 veces, 10 veces o más, hasta e incluyendo la función completa, en relación con tal función antes de tal terapia se considera un tratamiento eficaz. El tratamiento eficaz no necesita curar o afectar directamente a la causa subyacente del trastorno o la enfermedad pulmonar para que se considere un tratamiento eficaz.

La frase “farmacéuticamente aceptable” se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “farmacéuticamente aceptable”, “fisiológicamente tolerable” y variaciones gramaticales de los mismos, cuando se refieren a composiciones, portadores, diluyentes y reactivos, se usan de manera intercambiable y representan que los materiales pueden administrarse a o sobre un mamífero sin la producción de efectos fisiológicos no deseables tales como náuseas, mareos, malestar gástrico y similares. Un portador farmacéuticamente aceptable no fomentará la aparición de una respuesta inmunitaria a un agente con el que se mezcla, a menos que se desee. La preparación de una composición farmacológica que contiene principios activos disueltos o dispersos en la misma se conoce bien en la técnica y no necesita limitarse basándose en la formulación. Normalmente, tales composiciones se preparan o bien como suspensiones o bien como disoluciones líquidas inyectables, sin embargo, también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para disolución, o suspensiones, en líquido antes de su uso. La preparación también puede emulsionarse o presentarse como una composición de liposomas. El principio activo puede mezclarse con excipientes que sean farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo y en cantidades adecuadas para su uso en los métodos terapéuticos descritos en el presente documento. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores del pH y similares que mejoran la eficacia del principio activo. La composición terapéutica de la presente invención puede incluir sales farmacéuticamente aceptables de los componentes en la misma. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del polipéptido) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, los hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y similares. Los portadores fisiológicamente tolerables se conocen bien en la técnica. Los portadores líquidos a modo de ejemplo son disoluciones acuosas estériles que no contienen materiales además de los principios activos y agua, o contienen un tampón tal como fosfato de sodio a un valor de pH fisiológico, solución salina fisiológica o ambos, tal como solución salina tamponada con fosfato. Además, los portadores acuosos pueden contener más de una sal de tampón, así como sales tales como los cloruros de sodio y potasio, dextrosa, polietilenglicol y otros solutos. Las composiciones líquidas también pueden contener fases líquidas además de y excluyendo agua. Los ejemplos de tales fases líquidas adicionales son glicerina, aceites vegetales, tales como aceite de semilla de algodón, y emulsiones de aceite en agua. La cantidad de un agente activo usado con los métodos descritos en el presente documento que será eficaz en el tratamiento de un trastorno o estado particular dependerá de la naturaleza del trastorno o estado, y puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales. Tal como se usa en el presente documento, “prevención” o “que previene”, cuando se usa en referencia a una enfermedad, un trastorno o síntomas de los mismos, se refiere a una reducción en la probabilidad de que un individuo desarrolle una enfermedad o un trastorno, por ejemplo, un trastorno pulmonar. La probabilidad de desarrollar una enfermedad o un trastorno se reduce, por ejemplo, cuando una persona que tiene uno o más factores de riesgo de padecer una enfermedad o un trastorno no logra desarrollar el trastorno o desarrolla tal enfermedad o trastorno en un momento posterior o con menos gravedad, estadísticamente hablando, en relación con una población que tiene los mismos factores de riesgo y que no recibe el tratamiento tal como se describe en el presente documento. La imposibilidad de desarrollar síntomas de una enfermedad o el desarrollo de síntomas reducidos (por ejemplo, en al menos el 10 % en una escala clínicamente aceptada para esa enfermedad o ese trastorno) o retrasados (por ejemplo, en días, semanas, meses o años) se considera una prevención eficaz.

Tal como se usa en el presente documento, el término “inducido a diferenciarse” se refiere a un tratamiento químico/biológico, un entorno físico o una modificación genética que conduce a la formación de células más diferenciadas (por ejemplo, células progenitoras pulmonares humanas o células que tienen un fenotipo de las vías respiratorias) a partir de células madre pluripotentes o multipotentes (por ejemplo, células de endodermo del intestino proximal anterior). La diferenciación puede evaluarse mediante la aparición de marcadores específicos de un tipo de célula distinta o mediante la pérdida de marcadores específicos de células madre, o ambos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “que comprende” o “comprende” se usa en referencia a composiciones, métodos y componente(s) respectivo(s) de los mismos, que son esenciales para la invención, pero abiertos a la inclusión de elementos no especificados, ya sean esenciales o no.

Tal como se usa en el presente documento, el término “que consiste esencialmente en” se refiere a aquellos elementos requeridos para una realización dada. El término permite la presencia de elementos adicionales que no afectan materialmente a la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s) o funcional(es) de esa realización de la invención.

El término “que consiste en” se refiere a composiciones, métodos y componentes respectivos de los mismos tal como se describe en el presente documento, que son exclusivos de cualquier elemento no mencionado en esa descripción de la realización.

Tal como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “una” y “el/la” incluyen las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, las referencias al “método” incluyen uno o más métodos y/o etapas del tipo descrito en el presente documento y/o que resultarán evidentes para los expertos en la técnica al leer esta divulgación, etc.

Células madre embrionarias

Las células madre son células que conservan la capacidad de autorrenovarse a través de la división de células mitóticas y pueden diferenciarse en una amplia variedad de tipos de células especializadas. Tres amplios tipos de células madre de mamífero incluyen: células madre embrionarias (ES), que se encuentran en blastocistos, células madre pluripotentes inducidas (iPSC), que se reprograman a partir de células somáticas, y células madre adultas, que se encuentran en tejidos adultos. En un embrión en desarrollo, las células madre pueden diferenciarse en todos los tejidos embrionarios especializados. En los organismos adultos, las células madre y las células progenitoras actúan como un sistema de reparación para el cuerpo, reponiendo células especializadas, pero también mantienen la renovación normal de los órganos regenerativos, tales como la sangre, la piel o los tejidos intestinales. Las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células derivadas de cualquiera de las tres capas germinales.

Las células madre se clasifican por su potencial de desarrollo en: (1) totipotente, que puede dar lugar a todos los tipos de células embrionarias y extraembrionarias; (2) pluripotente, que puede dar lugar a todos los tipos de células embrionarias, es decir, endodermo, mesodermo y ectodermo; (3) multipotente, que puede dar lugar a un subconjunto de linajes celulares, pero todos dentro de un tejido, órgano o sistema fisiológico particular (por ejemplo, las células progenitoras pulmonares distales multipotentes pueden producir progenie que incluye células progenitoras pulmonares distales multipotentes (autorrenovación) y los tipos y elementos celulares (por ejemplo, células basales, células ciliadas, células de Clara y células caliciformes) que son componentes normales de las vías respiratorias); (4) oligopotente, que puede dar lugar a un subconjunto más restringido de linajes celulares que las células madre multipotentes; y (5) unipotente, que puede dar lugar a un solo linaje celular (por ejemplo, células madre espermatogénicas).

En el presente documento se proporcionan métodos para generar células progenitoras pulmonares humanas a partir de células madre embrionarias y células madre pluripotentes inducidas. En una realización, los métodos proporcionados en el presente documento se refieren a la generación de células progenitoras pulmonares humanas a partir de células madre embrionarias. Alternativamente, en algunas realizaciones, los métodos proporcionados en el presente documento no abarcan la generación de células progenitoras pulmonares humanas a partir de células madre embrionarias o cualquier otra célula de origen embrionario humano.

Las características distintivas de una célula madre embrionaria definen un fenotipo de célula madre embrionaria. Por consiguiente, una célula tiene el fenotipo de una célula madre embrionaria si posee una o más de las características únicas de una célula madre embrionaria de modo que esa célula pueda distinguirse de otras células. Las características distintivas de células madre embrionarias a modo de ejemplo incluyen, sin limitación, el perfil de expresión génica, la capacidad proliferativa, la capacidad de diferenciación, el cariotipo, la capacidad de respuesta a condiciones de cultivo particulares y similares.

Las células derivadas de fuentes embrionarias pueden incluir células madre embrionarias o líneas de células madre obtenidas a partir de un banco de células madre u otra institución depositaria reconocida. Otros medios para producir líneas de células madre incluyen métodos que comprenden el uso de una célula blastomérica de un embrión en etapa temprana antes de la formación del blastocisto (alrededor de la etapa de 8 células). Tales técnicas corresponden a la técnica de diagnóstico genético preimplantacional que se emplea habitualmente en las clínicas de reproducción asistida. La célula de blastómero individual se cocultiva con líneas de células ES establecidas y luego se separa de ellas para formar líneas de células ES completamente competentes.

Las células madre embrionarias se consideran indiferenciadas cuando no se han comprometido con un linaje de diferenciación específico. Tales células presentan características morfológicas que las distinguen de las células diferenciadas de origen embrionario o adulto. Las células madre embrionarias (ES) indiferenciadas son fácilmente reconocidas por los expertos en la técnica, y normalmente aparecen en las dos dimensiones de una vista microscópica en colonias de células con altas razones de núcleo/citoplasma y nucléolos prominentes. En algunas realizaciones, las células progenitoras pulmonares humanas descritas en el presente documento no se derivan de células madre embrionarias ni de ninguna otra célula de origen embrionario.

También se conocen en la técnica células madre adultas que son células madre que se derivan de tejidos de un organismo posnatal o posneonatal o de un organismo adulto. Una célula madre adulta es estructuralmente distinta de una célula madre embrionaria, no sólo en los marcadores que expresa o no en relación con una célula madre embrionaria, sino también por la presencia de diferencias epigenéticas, por ejemplo, diferencias en los patrones de metilación del ADN.

Células madre pluripotentes inducidas (iPSC)

En algunas realizaciones, las células progenitoras pulmonares humanas descritas en el presente documento se derivan de células madre pluripotentes aisladas. Una ventaja de usar iPSC es que las células pueden derivarse del mismo sujeto al que se le van a administrar las células progenitoras pulmonares humanas. Es decir, puede obtenerse una célula somática a partir de un sujeto, reprogramarla a una célula madre pluripotente inducida y luego volver a diferenciarla en una célula progenitora pulmonar humana para administrarla al sujeto (por ejemplo, células autólogas). Dado que los progenitores pulmonares se derivan esencialmente de una fuente autóloga, se reduce el riesgo de rechazo del injerto o respuestas alérgicas en comparación con el uso de células de otro sujeto o grupo de sujetos. En algunas realizaciones, los progenitores pulmonares se derivan de fuentes no autólogas. Además, el uso de iPSC niega la necesidad de células obtenidas a partir de una fuente embrionaria. Por tanto, en una realización, las células madre usadas en los métodos dados a conocer no son células madre embrionarias.

Aunque la diferenciación es generalmente irreversible en contextos fisiológicos, se han desarrollado recientemente varios métodos para reprogramar células somáticas en células madre pluripotentes inducidas. Los expertos en la técnica conocen métodos a modo de ejemplo, y se describen brevemente a continuación en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, el término “reprogramación” se refiere a un proceso que altera o revierte el estado de diferenciación de una célula diferenciada (por ejemplo, una célula somática). Dicho de otro modo, la reprogramación se refiere a un proceso de conducir la diferenciación de una célula hacia atrás a un tipo de célula más indiferenciada o más primitiva. Cabe destacar que la colocación de muchas células primarias en cultivo puede conducir a cierta pérdida de características completamente diferenciadas. Por tanto, el simple cultivo de tales células incluidas en el término células diferenciadas no convierte a estas células en células no diferenciadas (por ejemplo, células indiferenciadas) o células pluripotentes. La transición de una célula diferenciada a la pluripotencia requiere un estímulo de reprogramación más allá de los estímulos que conducen a la pérdida parcial del carácter diferenciado en cultivo. Las células reprogramadas también tienen la característica de la capacidad de realizar pases prolongados sin pérdida de potencial de crecimiento, en relación con los orígenes de las células primarias, que generalmente tienen capacidad sólo para un número limitado de divisiones en cultivo.

La célula que va a reprogramarse puede diferenciarse o bien parcialmente o bien terminalmente antes de la reprogramación. En algunas realizaciones, la reprogramación abarca la reversión completa del estado de diferenciación de una célula diferenciada (por ejemplo, una célula somática) a un estado pluripotente o un estado multipotente. En algunas realizaciones, la reprogramación abarca la reversión total o parcial del estado de diferenciación de una célula diferenciada (por ejemplo, una célula somática) a una célula indiferenciada (por ejemplo, una célula de tipo embrionaria). La reprogramación puede dar como resultado la expresión de genes particulares por parte de las células, cuya expresión contribuye aún más a la reprogramación. En determinadas realizaciones descritas en el presente documento, la reprogramación de una célula diferenciada (por ejemplo, una célula somática) hace que la célula diferenciada asuma un estado indiferenciado (por ejemplo, es una célula indiferenciada). Las células resultantes se denominan “células reprogramadas” o “células madre pluripotentes inducidas (células iPSC o iPS)”.

La reprogramación puede implicar la alteración, por ejemplo, la reversión, de al menos algunos de los patrones hereditarios de modificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, metilación), condensación de cromatina, cambios epigenéticos, impronta genética, etc., que se producen durante la diferenciación celular. La reprogramación es distinta de simplemente mantener el estado indiferenciado existente de una célula que ya es pluripotente o mantener el estado menos que completamente diferenciado existente de una célula que ya es una célula multipotente (por ejemplo, una célula madre hematopoyética). La reprogramación también es distinta de fomentar la autorrenovación o la proliferación de células que ya son pluripotentes o multipotentes, aunque las composiciones y los métodos descritos en el presente documento también pueden ser útiles para tales fines, en algunas realizaciones.

El enfoque o método específico usado para generar células madre pluripotentes a partir de células somáticas (en líneas generales denominado “reprogramación”) no es crítico para la invención reivindicada. Por tanto, cualquier método que reprograme una célula somática al fenotipo pluripotente sería apropiado para su uso en los métodos descritos en el presente documento.

Se han descrito metodologías de reprogramación para generar células pluripotentes usando combinaciones definidas de factores de transcripción de células madre pluripotentes inducidas. Yamanaka y Takahashi convirtieron células somáticas de ratón en células similares a células ES con potencial de desarrollo ampliado mediante la transducción directa de Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc (Takahashi y Yamanaka, 2006). Las iPSC se asemejan a las células madre embrionarias, ya que restauran la circuitería transcripcional asociada a la pluripotencia y gran parte del panorama epigenético. Además, las iPSC de ratón satisfacen todos los ensayos convencionales para determinar la pluripotencia: específicamente, diferenciación in vitro en tipos de células de las tres capas germinales, formación de teratomas, contribución a las quimeras, transmisión de la línea germinal (Maherali y Hochedlinger, 2008) y complementación tetraploide (Woltjen et al., 2009).

Estudios posteriores han demostrado que las células iPS humanas pueden obtenerse usando métodos de transducción similares (Lowry et al., 2008; Park et al., 2008; Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007b), y el trío de factores de transcripción, OCT4, SOX2 y NANOG, se ha establecido como el conjunto central de factores de transcripción que rigen la pluripotencia (Jaenisch y Young, 2008). La producción de células iPS puede lograrse mediante la introducción de secuencias de ácido nucleico que codifican para genes asociados a células madre en una célula somática adulta, históricamente usando vectores virales.

Las células iPS pueden generarse o derivarse de células somáticas terminalmente diferenciadas, así como de células madre adultas o células madre somáticas. Es decir, una célula progenitora no pluripotente puede volverse pluripotente o multipotente mediante reprogramación. En tales casos, puede que no sea necesario incluir tantos factores de reprogramación como se requieren para reprogramar una célula terminalmente diferenciada. Además, la reprogramación puede inducirse mediante la introducción no viral de factores de reprogramación, por ejemplo, mediante la introducción de las propias proteínas, o mediante la introducción de ácidos nucleicos que codifican para los factores de reprogramación, o mediante la introducción de ARN mensajeros que, tras la traducción, producen los factores de reprogramación (véase, por ejemplo, Warren et al., Cell Stem Cell, 5 de noviembre de 2010; 7(5):618-30). La reprogramación puede lograrse mediante la introducción de una combinación de ácidos nucleicos que codifican para genes asociados a células madre, incluyendo, por ejemplo, Oct-4 (también conocido como Oct-3/4 o Pouf51), Sox1, Sox2, Sox3, Sox 15, Sox 18, NANOG, Klf1, Klf2, Klf4, Klf5, NR5A2, c-Myc, l-Myc, n-Myc, Rem2, Tert y LIN28. En una realización, la reprogramación que usa las composiciones y los métodos descritos en el presente documento puede comprender además la introducción de uno o más de Oct-3/4, un miembro de la familia de Sox, un miembro de la familia de Klf y un miembro de la familia de Myc a una célula somática. En una realización, las composiciones y los métodos descritos en el presente documento comprenden además la introducción de uno o más de cada uno de Oct 4, Sox2, Nanog, c-MYC y Klf4 para la reprogramación. Tal como se indicó anteriormente, el método exacto usado para la reprogramación no es necesariamente crítico para las composiciones y los métodos descritos en el presente documento. Sin embargo, cuando van a usarse células diferenciadas a partir de las células reprogramadas, por ejemplo, terapia en seres humanos, en una realización, la reprogramación no se efectúa mediante un método que altere el genoma. Por tanto, en tales realizaciones, se logra la reprogramación, por ejemplo, sin el uso de vectores plasmídicos o virales.

La eficacia de la reprogramación (es decir, el número de células reprogramadas) derivada de una población de células de partida puede potenciarse mediante la adición de diversas moléculas pequeñas tal como se muestra en Shi, Y., et al (2008) Cell-Stem Cell 2:525-528, Huangfu, D., et al (2008) Nature Biotechnology 26(7): 795-797 y Marson, A., et al (2008) Cell-Stem Cell 3:132-135. Por tanto, puede usarse un agente o una combinación de agentes que potencian la eficacia o la tasa de producción de células madre pluripotentes inducidas en la producción de iPSC específicas del paciente o específicas de la enfermedad. Algunos ejemplos no limitativos de agentes que potencian la eficacia de la reprogramación incluyen Wnt soluble, medios acondicionados con Wnt, BIX-01294 (una histona metiltransferasa G9a), PD0325901 (un inhibidor de MEK), inhibidores de ADN metiltransferasa, inhibidores de histona desacetilasa (HDAC), ácido valproico, 5'-azacitidina, dexametasona, suberoilanilida, ácido hidroxámico (SAHA), vitamina C y tricostatina (TSA), entre otros.

Otros ejemplos no limitativos de agentes potenciadores de la reprogramación incluyen: ácido hidroxámico de suberoilanilida (SAHA (por ejemplo, MK0683, vorinostat) y otros ácidos hidroxámicos), BML-210, depudecina (por ejemplo, (-)-depudecina), toxina HC, Nullscript (4-(1,3-dioxo-1H,3H-benzo[de]isoquinolin-2-il)-N-hidroxibutanamida), fenilbutirato (por ejemplo, fenilbutirato de sodio) y ácido valproico ((VPA) y otros ácidos grasos de cadena corta), Scriptaid, suramina de sodio, tricostatina A (TSA), compuesto 8 de APHA, apicidina, butirato de sodio, butirato de pivaloiloximetilo (Pivanex, AN-9), trapoxina B, clamidocina, depsipéptido (también conocido como FR901228 o FK228), benzamidas (por ejemplo, CI-994 (por ejemplo, N-acetildinalina) y MS-27-275), MGCD0103, NVP-LAQ-824, CBHA (ácido bishidroxámico de ácido m-carboxicinamínico), JNJ16241199, tubacina, A-161906, proxamida, oxamflatina, 3-Cl-UCHA (por ejemplo, ácido 6-(3-clorofenilureido)caproico-hidroxámico), AOE (ácido 2-amino-8-oxo-9,10-epoxidecanoico), CHAP31 y CHAP 50. Otros agentes potenciadores de la reprogramación incluyen, por ejemplo, formas negativas dominantes de las HDAC (por ejemplo, formas catalíticamente inactivas), inhibidores de ARNip de las HDAC y anticuerpos que se unen específicamente a las HDAC. Tales inhibidores están disponibles, por ejemplo, de BIOMOL International, Fukasawa, Merck Biosciences, Novartis, Gloucester Pharmaceuticals, Aton Pharma, Titan Pharmaceuticals, Schering AG, Pharmion, MethylGene y Sigma Aldrich.

Para confirmar la inducción de células madre pluripotentes para su uso con los métodos descritos en el presente documento, pueden someterse a prueba clones aislados para determinar la expresión de un marcador de células madre. Tal expresión en una célula derivada de una célula somática identifica las células como células madre pluripotentes inducidas. Los marcadores de células madre pueden seleccionarse del grupo no limitativo que incluye SSEA3, SSEA4, CD9, Nanog, Fbx15, Ecat1, Esg1, Eras, Gdf3, Fgf4, Cripto, Dax1, Zpf296, Slc2a3, Rex1, Utf1 y Nat1. En una realización, una célula que expresa Oct4 o Nanog se identifica como pluripotente. Los métodos para detectar la expresión de tales marcadores pueden incluir, por ejemplo, RT-PCR y métodos inmunológicos que detectan la presencia de los polipéptidos codificados, tales como inmunotransferencias de tipo Western o análisis de citometría de flujo. En algunas realizaciones, la detección no sólo implica RT-PCR, sino que también incluye la detección de marcadores de proteínas. Los marcadores intracelulares pueden identificarse mejor mediante RT-PCR, mientras que los marcadores de superficie celular se identifican fácilmente, por ejemplo, mediante inmunocitoquímica.

El carácter de células madre pluripotentes de las células aisladas puede confirmarse mediante pruebas que evalúan la capacidad de las iPSC para diferenciarse en células de cada una de las tres capas germinales. Como ejemplo, la formación de teratoma en ratones desnudos puede usarse para evaluar el carácter pluripotente de los clones aislados. Las células se introducen en ratones desnudos y se realiza histología y/o inmunohistoquímica en un tumor que surge de las células. El crecimiento de un tumor que comprende células de las tres capas germinales, por ejemplo, indica además que las células son células madre pluripotentes.

Células somáticas para reprogramación: las células somáticas, tal como se usa ese término en el presente documento, se refieren a cualquier célula que forma el cuerpo de un organismo, excluyendo las células de la línea germinal. Cada tipo de célula del cuerpo de los mamíferos, aparte de los espermatozoides y los óvulos, las células de las que están constituidos (gametocitos) y las células madre indiferenciadas, es una célula somática diferenciada. Por ejemplo, los órganos internos, la piel, los huesos, la sangre y el tejido conjuntivo están constituidos por células somáticas diferenciadas.

Los tipos de células somáticas adicionales para su uso con las composiciones y los métodos descritos en el presente documento incluyen: un fibroblasto (por ejemplo, un fibroblasto primario), una célula muscular (por ejemplo, un miocito), una célula del cúmulo, una célula neural, una célula mamaria, un hepatocito y una célula de islote pancreático. En algunas realizaciones, la célula somática es una línea celular primaria o es la progenie de una línea celular primaria o secundaria. En algunas realizaciones, la célula somática se obtiene a partir de una muestra humana, por ejemplo, un folículo piloso, una muestra de sangre, una biopsia (por ejemplo, una biopsia de piel o una biopsia de tejido adiposo), una muestra de hisopo (por ejemplo, una muestra de hisopo oral) y, por tanto, es una célula somática humana.

Algunos ejemplos no limitativos de células somáticas diferenciadas incluyen, pero no se limitan a, epiteliales, endoteliales, neuronales, adiposas, cardíacas, de músculo esquelético, células inmunitarias, hepáticas, esplénicas, pulmonares, células sanguíneas circulantes, gastrointestinales, renales, de médula ósea y células pancreáticas. En algunas realizaciones, una célula somática puede ser una célula primaria aislada de cualquier tejido somático incluyendo, pero sin limitarse a, cerebro, hígado, pulmón, tubo digestivo, estómago, intestino, grasa, músculo, útero, piel, bazo, órgano endocrino, hueso, etc. Además, la célula somática puede ser de cualquier especie de mamífero, incluyendo los ejemplos no limitativos una célula murina, bovina, simia, porcina, equina, ovina o humana. En algunas realizaciones, la célula somática es una célula somática humana.

Cuando se usan células reprogramadas para la generación de células progenitoras pulmonares humanas para su uso en el tratamiento terapéutico de una enfermedad, es deseable, pero no se requiere, usar células somáticas aisladas del paciente que está tratándose. Por ejemplo, pueden usarse células somáticas implicadas en enfermedades y células somáticas que participan en el tratamiento terapéutico de enfermedades, y similares. En algunas realizaciones, puede realizarse un método para seleccionar las células reprogramadas a partir de una población heterogénea que comprende células reprogramadas y células somáticas de las que se derivaron o generaron mediante cualquier medio conocido. Por ejemplo, puede usarse un gen farmacorresistente o similar, tal como un gen marcador seleccionable, para aislar las células reprogramadas usando el marcador seleccionable como índice.

Las células somáticas reprogramadas, tal como se da a conocer en el presente documento, pueden expresar cualquier número de marcadores de células pluripotentes, incluyendo: fosfatasa alcalina (AP); ABCG2; antígeno-1 embrionario específico de etapa (SSEA-1); SSEA-3; SSEA-4; TRA-1-60; TRA-1-81; Tra-2-49/6E; ERas/ECAT5, E-cadherina; p-MI-tubulina; a-actina de músculo liso (a-SMA); factor de crecimiento de fibroblastos 4 (Fgf4), Cripto, Dax1; proteína de dedos de zinc 296 (Zfp296); N-acetiltransferasa 1 (Nat1); (transcripto 1 asociado a células ES (ECAT1); ESG1/DPPA5/ECAT2; ECAT3; ECAT6; ECAT7; ECAT8; ECAT9; ECAT10; ECAT15-1; ECAT15-2; Fthl17; Sal14; factor de transcripción de células embrionarias indiferenciadas (Utf1); Rex1; p53; G3PDH; telomerasa, incluyendo TERT; genes del cromosoma X silenciado; Dnmt3a; Dnmt3b; TRIM28; F-box que contiene proteína 15 (Fbx15); Nanog/ECAT4; Oct3/4; Sox2; Klf4; c-Myc; Esrrb; TDGF1; GABRB3; Zfp42, FoxD3; GDF3; CYP25A1; asociado al desarrollo pluripotencial 2 (DPPA2); punto de corte 1 del linfoma de células T (Tcl 1); DPPA3/Stella; DPPA4; otros marcadores generales de pluripotencia, etc. Otros marcadores pueden incluir Dnmt3L; Sox15; Stat3; Grb2; p-catenina y Bmi1. Tales células también pueden caracterizarse mediante la regulación por disminución de marcadores característicos de la célula somática de la que se deriva la célula madre pluripotente inducida.

Generación de endodermo definitivo y endodermo del intestino anterior

Los métodos para generar células progenitoras pulmonares humanas, tal como se describe en el presente documento, comienzan generando en primer lugar un endodermo definitivo a partir de células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas. “Endodermo definitivo” comprende una célula multipotente comprometida con el linaje del endodermo y que puede dar lugar a células del tubo digestivo u órganos derivados del tubo digestivo. El endodermo definitivo es la capa germinal que da lugar a los órganos gastrointestinales (por ejemplo, esófago, estómago, hígado, vesícula biliar, intestino delgado, páncreas, colon, etc.), los órganos respiratorios (por ejemplo, alvéolos, tráquea, bronquios), las glándulas y los órganos endocrinos (por ejemplo, glándula paratiroidea, glándula tiroidea, timo), el sistema auditivo (por ejemplo, trompa auditiva y cavidad timpánica) y el aparato urinario (por ejemplo, vejiga urinaria y partes de la uretra). Véase, por ejemplo, Grapin-Botton y Melton, 2000; Kimelman y Griffin, 2000; Tremblay et al., 2000; Wells y Melton, 1999; Wells y Melton, 2000. El término “endodermo definitivo” no abarca el linaje separado de células denominado endodermo primitivo, que es responsable de la formación de tejidos extraembrionarios.

La formación de endodermo definitivo y de células de endodermo derivadas del mismo es una etapa importante para la derivación de células que constituyen tejidos y/u órganos terminalmente diferenciados derivados del linaje del endodermo definitivo, tales como células progenitoras pulmonares humanas tal como se describe en el presente documento.

Los métodos para derivar endodermo definitivo a partir de células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas se conocen en la técnica (por ejemplo, la patentes estadounidenses n.os 7.993.916; 7.695.963; 7.541.185; US2009/0298178; US2010/0272695; Sherwood et al., Mechanisms of Development (2011) 128:387-400; D'Amour K. et al., Nature Biotechnology (2005) 23:1534-1541; Turovets, N. et al., Differentiation (2011) 81(5):292-298; Kim, PT. et al., PLoS One (2010) 5(11):e14146). En una realización, el endodermo definitivo se produce poniendo en contacto una IPSC o ESC con un medio de endodermo definitivo que incluye por ejemplo, B27, activina A y ZSTK474. En una realización, el medio de endodermo definitivo comprende B27 al 1-5 % (por ejemplo, el 2 %), activina A 10-40 ng/ml (por ejemplo, 20 ng/ml) y ZSTK4740,2-0,5 |iM, y es útil para generar endodermo definitivo en líneas celulares que se han sometido a prueba para tener una baja eficacia de generación de endodermo definitivo o se sospecha que tienen una baja eficacia de generación de endodermo definitivo.

La diferenciación de células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas en el endodermo definitivo puede monitorizarse determinando la expresión de marcadores de superficie celular característicos del endodermo definitivo. En algunas realizaciones, la expresión de marcadores de endodermo definitivo se determina detectando la presencia o ausencia del marcador. Alternativamente, la expresión de determinados marcadores puede determinarse midiendo el nivel al que el marcador está presente en las células del cultivo celular o la población celular. Tales mediciones de expresión de marcadores pueden ser o bien cualitativas o bien cuantitativas.

En una realización, se usa PCR cuantitativa (Q-PCR) para cuantificar la expresión de marcadores en el endodermo definitivo. Los métodos para realizar Q-PCR se conocen bien en la técnica. En realizaciones alternativas, la expresión de un producto de gen marcador se detecta usando anticuerpos específicos para el marcador celular. En determinadas realizaciones, se determina la expresión de genes marcadores característica del endodermo definitivo, así como la falta de expresión significativa de genes marcadores característica de las células de las que se derivan (por ejemplo, células ES o iPSC) y otros tipos de células.

En una realización, un marcador de endodermo definitivo es el gen SOX17. Otros marcadores de endodermo definitivo incluyen, pero no se limitan a, MIXL1, GATA4, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 y CRIP1. En algunas realizaciones, se monitoriza la expresión tanto de SOX17 como de SOX7. En otras realizaciones, se monitoriza la expresión del gen marcador SOX17 y el gen marcador OCT4, que es característico de las células ES. Además, debido a que las células de endodermo definitivo expresan el gen marcador SOX17 a un nivel más alto que el de los genes marcadores AFP, SPARC o trombomodulina, también puede monitorizarse la expresión de estos genes. Otro marcador de endodermo definitivo es el gen CXCR4, que codifica para un receptor de quimiocinas de la superficie celular cuyo ligando es el quimioatrayente SDF-1. En una realización, la eficacia de la producción de endodermo definitivo puede determinarse mediante la tinción conjunta de FOXA2/SOX17 o mediante análisis de FACS con la combinación cKit/CXCR4 o cKit/EpCAM.

Una vez que se ha logrado la generación del endodermo definitivo, la siguiente etapa es diferenciar las células de endodermo definitivo en células de endodermo del intestino proximal anterior, que es la región que comprende las células destinadas a convertirse en células de pulmón y de tiroides. Este proceso también se denomina en el presente documento “anteriorización” del endodermo definitivo. Tal como se usa en el presente documento, “endodermo del intestino proximal” se refiere a células de la porción anterior del tubo intestinal y abarca células de la unión de intestino proximal/intestino medio. Un experto en la técnica reconocerá que las ESC o iPSC también pueden diferenciarse directamente en células de endodermo del intestino proximal anterior sin requerir una etapa intermedia de generación del endodermo definitivo. Los métodos de diferenciación descritos en el presente documento para generar células progenitoras pulmonares comienzan a partir de células de endodermo del intestino proximal anterior y, por tanto, el método para elaborar dichas células de endodermo del intestino proximal no es crítico y no se limita a los métodos para generar el endodermo del intestino proximal anterior que se describen en el presente documento; puede usarse cualquier método que proporcione endodermo del intestino proximal anterior para proporcionar el material de partida para la preparación de células progenitoras pulmonares, tal como se da a conocer en el presente documento.

Los métodos para generar endodermo del intestino proximal anterior a partir de endodermo definitivo se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, los documentos WO2010/136583, WO2011/139628; Green, MD et al., Nature Biotechnology (2011) 29:267-27; Morrison et al, (2008), Cell Stem Cell, 3:355-356; Goss AM et al., Developmental Cell (2009) 17(2):290-298; Livigni A et al., Current Protocols in Stem Cell Biology (2009) 10:1G.3.1-1G.3.10).

En una realización, la producción de endodermo del intestino proximal anterior se confirma mediante la activación de un marcador específico de endodermo del intestino proximal anterior, tal como el marcador Hex. Hex es un represor transcripcional que contiene homeosecuencia, que es uno de los primeros marcadores de endodermo del intestino proximal anterior y que se ha demostrado que suprime las características posteriores (véase, por ejemplo, Brickman JM et al., Development (2000) 127:2303-2315; Thomas PQ et al., Development (1998) 125:85-94; Zamparini AL et al., Development (2006) 133:3709-3722). La detección de Hex puede usarse en combinación con otros marcadores de endodermo del intestino proximal anterior, tales como Cxcr4 (Morrison, GM et al., Cell Stem Cell (2008) 3:402-412). Otros marcadores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, FoxA2 y Sox2, entre otros. En una realización, el endodermo definitivo se somete a una etapa de anteriorización que comprende el tratamiento con un agonista de TGFp (por ejemplo, activina).

Rutas de señalización para la diferenciación

Modulación de la ruta de señalización de TGF-p. en algunas realizaciones, se usan uno o más agonistas de TGF-p para fomentar una etapa de diferenciación particular de una célula pluripotente (por ejemplo, durante la generación de endodermo del intestino proximal anterior). En tales realizaciones, un agente activador específico para la señalización de TGF-p puede ser un polipéptido de TGF-p o un fragmento activo del mismo, una proteína de fusión que comprende un polipéptido de TGF-p o un fragmento activo del mismo, un anticuerpo agonista de un receptor de TGF-p o un agonista de molécula pequeña de un receptor de TGF-p.

En otras realizaciones, pueden usarse uno o más antagonistas de TGF-p para permitir la diferenciación de una célula pluripotente (por ejemplo, para inducir la expresión de Nkx2.1, la primera etapa hacia el compromiso con el linaje pulmonar). En tales realizaciones, un antagonista de la señalización de TGF-p puede ser un inhibidor polipeptídico o un fragmento del mismo, una proteína de fusión negativa dominante, un anticuerpo antagonista de un receptor de TGF-p o un antagonista de molécula pequeña de un receptor de TGF-p.

La ruta de señalización del factor de crecimiento transformante beta (TGF-p) está implicada en muchos procesos celulares tanto en el organismo adulto como en el embrión en desarrollo, incluyendo el crecimiento celular, la diferenciación celular, la apoptosis, la homeostasis celular y otras funciones celulares. Los ligandos de la superfamilia de TGF-p se unen a un receptor de tipo II, que recluta y fosforila un receptor de tipo I. A continuación, el receptor de tipo I fosforila los SMAD regulados por receptor (R-SMAD) que luego se unen a SMAD4 de coSMAD. Los complejos de R-SMAD/coSMAD se acumulan en el núcleo donde actúan como factores de transcripción y participan en la regulación de la expresión del gen diana.

El TGF-p1 es un miembro prototípico de una familia de citocinas que incluye los TGF-p, activinas, inhibinas, proteínas morfogenéticas óseas y sustancia inhibidora de Muller. Las proteínas Smad son factores de transducción de señales aguas abajo a modo de ejemplo en la ruta de TGF-beta y, por tanto, en algunas realizaciones, pueden activarse directamente para efectuar la diferenciación en un fenotipo de progenitor de células pulmonares humanas (por ejemplo, tratando una célula con un activador de una proteína Smad). Los activadores de Smad a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, proteínas Simad o péptidos funcionales o fragmentos de los mismos (por ejemplo, Smad1, Smad5, Smad8), BMP2, BMP4 y sustancia inhibidora de Muller (MIS). Los ligandos de activina transducen señales de manera similar a los ligandos de TGF-p. Las activinas se unen a y activan los receptores de ALK, que a su vez fosforilan proteínas Simad, tales como Smad2 y Smad3. La consiguiente formación de un complejo hetero-Smad con Smad4 da como resultado la regulación inducida por activina de la transcripción génica.

Algunos ejemplos no limitativos de inhibidores de molécula pequeña de los receptores de TGF-p incluyen 2-(3-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-4-il)-1,5-naftiridina, [3-(piridin-2-il)-4-(4-quinoil)]-1H-pirazol y 3-(6-metilpiridin-2-il)-4-(4-quinolil)-1-feniltiocarbamoil-1H-pirazol, que pueden adquirirse de Calbiochem (San Diego, CA). Otros inhibidores de molécula pequeña incluyen, pero no se limitan a, SB-431542 (véase, por ejemplo, Halder et al., 2005; Neoplasia 7(5):509-521), SM16 (véase, por ejemplo, Fu, K et al., 2008; Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 28(4):665) y SB-505124 (véase, por ejemplo, Dacosta Byfield, S. et al., 2004; Molecular Pharmacology 65:744-52), entre otros. En la técnica se conocen antagonistas del receptor de TGF-p adicionales.

Modulación de la ruta de señalización del receptor de BMP

BMP2 y BMP4 envían señales a través del receptor de tipo I (ALK3), mientras que BMP7 se une a un receptor de tipo I independiente (ALK2). Véase, por ejemplo, von Bubnoff A et al., Developmental Biology (2001) 239:1-14; Chen D. et al., Growth Factors (2004) 22(4):233-241; Sieber C. et al., Cytokine and Growth Factor Rev. (2009) 20:343-355; y Miyazono K et al., Journal of Biochemistry (2010) 147(1):35-51.

Normalmente, BMP2 y BMP4 se unen a un complejo de receptor I/II de BMP, lo que conduce a la fosforilación de Smad1/5/8, seguido de la formación de complejos heterotriméricos con Smad4. Estos complejos se trasladan al núcleo y activan la expresión de genes diana (von Bubnoff A et al., Developmental Biology (2001) 239:1-14; Chen D. et al., Growth Factors (2004) 22(4):233-241; Sieber C. et al., Cytokine and Growth Factor Rev. (2009) 20:343-355; y Miyazono K et al., Journal of Biochemistry (2010) 147(1):35-51). Además de la transcripción mediada por Smad1/5/8, los complejos de receptores inducidos por BMP pueden activar la ruta de la proteína cinasa activada por mitógenos (MAPK) a través de ERK, JNK o p38 (Kozawa O et al., Journal of Cellular Biochemistry 84:583-589).

Activación de la ruta del receptor de BMP: en algunas realizaciones, se usa un agonista de BMP con los métodos descritos en el presente documento para la diferenciación de una célula progenitora pulmonar humana. En una realización, el receptor de BMP es un receptor que envía señales a través de la ruta de SMAD (por ejemplo, ALK3). En otras realizaciones, las BMP usadas con los métodos descritos en el presente documento son BMP2 y/o BMP4.

En una realización, se usan uno o más agonistas de BMP para fomentar una etapa de diferenciación particular de una célula pluripotente. En tales realizaciones, un agente activador específico para la señalización de BMP puede ser un polipéptido de BMP o un fragmento activo del mismo, una proteína de fusión que comprende un polipéptido de BMP o un fragmento activo del mismo, un anticuerpo agonista de un receptor de ^bM^po un agonista de molécula pequeña de un receptor de BMP.

En algunas realizaciones, el intervalo de dosificación útil para BMP4 está entre 1 y 500 nM, por ejemplo, entre 1 y 400 nM, entre 1 y 300 nM, entre 1 y 200 nM, entre 1 y 100 nM, entre 1 y 50 nM, entre 1 y 25 nM, entre 1 y 10 nM, entre 1 y 5 nM, entre 1 y 2 nM, entre 10 y 300 nM, entre 15 y 250 nM, entre 20 y 250 nM, entre 20 y 200 nM, entre 30 y 200 nM, entre 40 y 200 nM, entre 50 y 200 nM, entre 60 y 200 nM, entre 70 y 200 nM, entre 80 y 200 nM, entre 90 y 200 nM, entre 100 y 200 nM, entre 150 y 200 nM, entre 150 nM y 300 nM, entre 175 y 300 nM, entre 200 nM y 300 nM, entre 200 nM y 400 nM, entre 200 nM y 500 nm.

En algunas realizaciones, la dosis de BMP4 es, por ejemplo, de al menos 1 nM, al menos 2 nM, al menos 5 nM, al menos 10 nM, al menos 20 nM, al menos 30 nM, al menos 40 nM, al menos 50 nM, al menos 60 nM, al menos 70 nM, al menos 80 nM, al menos 90 nM, al menos 100 nM, al menos 110 nM, al menos 120 nM, al menos 130 nM, al menos 140 nM, al menos 150 nM, al menos 160 nM, al menos 170 nM, al menos 180 nM, al menos 190 nM, al menos 200 nM, al menos 225 nM, al menos 250 nM, al menos 275 nM, al menos 300 nM, al menos 400 nM, al menos 500 nM o más.

En algunas realizaciones, el intervalo de dosificación útil para BMP7 está entre 1 y 200 ng/ml, por ejemplo, entre 1 y 100 ng/ml, entre 1 y 50 ng/ml, entre 1 y 25 ng/ml, entre 1 y 10 ng/ml, entre 1 y 5 ng/ml, entre 1 y 2 ng/ml, entre 10 y 200 ng/ml, entre 15 y 200 ng/ml, entre 20 y 200 ng/ml, entre 30 y 200 ng/ml, entre 40 y 200 ng/ml, entre 50 y 200 ng/ml, entre 60 y 200 ng/ml, entre 70 y 200 ng/ml, entre 80 y 200 ng/ml, entre 90 y 200 ng/ml, entre 100 y 200 ng/ml o entre 150 y 200 ng/ml.

En algunas realizaciones, la dosis de BMP7 es, por ejemplo, de al menos 1 ng/ml, al menos 2 ng/ml, al menos 5 ng/ml, al menos 10 ng/ml, al menos 20 ng/ml, al menos 30 ng/ml, al menos 40 ng/ml, al menos 50 ng/ml, al menos 60 ng/ml, al menos 70 ng/ml, al menos 80 ng/ml, al menos 90 ng/ml, al menos 100 ng/ml, al menos 110 ng/ml, al menos 120 ng/ml, al menos 130 ng/ml, al menos 140 ng/ml, al menos 150 ng/ml, al menos 160 ng/ml, al menos 170 ng/ml, al menos 180 ng/ml, al menos 190 ng/ml, al menos 200 ng/ml o más.

Inhibición de la ruta del receptor de BMP: en algunas realizaciones, se usa un antagonista de BMP con los métodos descritos en el presente documento para la diferenciación de una célula de endodermo del intestino proximal humana en una célula progenitora pulmonar. En una realización, el antagonista de BMP es dorsomorfina.

En una realización, se usan uno o más antagonistas de la ruta del receptor de BMP para fomentar una etapa de diferenciación particular de una célula pluripotente. En tales realizaciones, un inhibidor específico para la señalización de BMP puede ser un polipéptido o un fragmento del mismo, un ARNhc o ARNip dirigido contra un receptor de BMP, un anticuerpo antagonista de un receptor de BMP o un antagonista de molécula pequeña de un receptor de BMP.

En algunas realizaciones, el intervalo de dosificación útil para un inhibidor de la ruta de BMP está entre 1 y 500 nM, por ejemplo, entre 1 y 400 nM, entre 1 y 300 nM, entre 1 y 200 nM, entre 1 y 100 nM, entre 1 y 50 nM, entre 1 y 25 nM, entre 1 y 10 nM, entre 1 y 5 nM, entre 1 y 2 nM, entre 10 y 300 nM, entre 15 y 250 nM, entre 20 y 250 nM, entre 20 y 200 nM, entre 30 y 200 nM, entre 40 y 200 nM, entre 50 y 200 nM, entre 60 y 200 nM, entre 70 y 200 nM, entre 80 y 200 nM, entre 90 y 200 nM, entre 100 y 200 nM, entre 150 y 200 nM, entre 150 nM y 300 nM, entre 175 y 300 nM, entre 200 nM y 300 nM, entre 200 nM y 400 nM, entre 200 nM y 500 nM.

En algunas realizaciones, la dosis del antagonista de la ruta de BMP es, por ejemplo, de al menos 1 nM, al menos 2 nM, al menos 5 nM, al menos 10 nM, al menos 20 nM, al menos 30 nM, al menos 40 nM, al menos 50 nM, al menos 60 nM, al menos 70 nM, al menos 80 nM, al menos 90 nM, al menos 100 nM, al menos 110 nM, al menos 120 nM, al menos 130 nM, al menos 140 nM, al menos 150 nM, al menos 160 nM, al menos 170 nM, al menos 180 nM, al menos 190 nM, al menos 200 nM, al menos 225 nM, al menos 250 nM, al menos 275 nM, al menos 300 nM, al menos 400 nM, al menos 500 nM o más.

Inhibidores de MAPKK/ERK: en el presente documento se proporcionan métodos para diferenciar una célula progenitora pulmonar humana en una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales Nkx2.1+, Sox2+ o en una célula progenitora multipotente distal Nkx2.1+, Sox9, en los que los métodos comprenden el tratamiento con un inhibidor de MAPKK/ERK.

Las rutas de señalización de proteína cinasa activada por mitógenos (MAPK) están implicadas en acontecimientos celulares, tales como el crecimiento, la diferenciación y las respuestas al estrés (J. Biol. Chem. (1993) 268, 14553 14556). Hasta la fecha, se han identificado cuatro rutas de MAPK paralelas: ERK1/ERK2, JNK, p38 y ERK5. Estas rutas son cascadas de cinasas lineales en las que MAPKKK fosforila y activa MAPKK, y MAPKK fosforila y activa MAPK. Hasta la fecha, se han identificado siete homólogos de MAPKK (MEK1, MEK2, MKK3, MKK4/SEK, MEK5, MKK6 y MKK7) y cuatro familias de MAPK (ERK1/2, JNK, p38 y ER^k5). La activación de estas rutas regula la actividad de varios sustratos a través de la fosforilación. Estos sustratos incluyen: factores de transcripción, tales como TCF, c-myc, ATF2 y los componentes AP-1, fos y Jun; componentes EGF-R de la superficie celular; componentes citosólicos, incluyendo PHAS-T, p90rsk, cPLA²y c-Raf-1; y componentes del citoesqueleto, tales como tau y MAP2. Las cascadas de señalización de MAPK están implicadas en el control de procesos celulares, incluyendo la proliferación, la diferenciación, la apoptosis y las respuestas al estrés.

MEK ocupa una posición estratégica aguas abajo en la ruta de Mek/Erk catalizando la fosforilación de sus sustratos de MAPK, ERK1 y ERK2. Anderson et al. Nature 1990, vol. 343, págs. 651-653. En la ruta de ERK, MAPKK se corresponde con MEK (MAP cinasa ERK cinasa) y MAPK se corresponde con ERK (cinasa regulada extracelular). Algunos ejemplos no limitativos de inhibidores de la ruta de MAPK y/o ERK incluyen SL327, U0126, SP600125, PD98059, SB203580 y CAY10561. Los expertos en la técnica conocen inhibidores de la ruta de MAPK y/o ERK adicionales que pueden usarse con los métodos descritos en el presente documento.

Activación de FGF: los factores de crecimiento de fibroblastos, o FGF, son una familia de factores de crecimiento que desempeñan un papel en la angiogénesis, la cicatrización de heridas y el desarrollo embrionario. Los FGF y los fragmentos funcionales o análogos de los mismos son útiles para diferenciar las células progenitoras pulmonares humanas en, por ejemplo, células progenitoras multipotentes de las vías respiratorias proximales, células progenitoras pulmonares distales multipotentes y células madre basales multipotentes de las vías respiratorias, tal como se describe en el presente documento.

Los FGF son proteínas de unión a heparina que interactúan con proteoglicanos de sulfato de heparano asociados a la superficie celular para efectuar la señalización de FGF. Se han identificado al menos 22 miembros diferentes de la familia de FGF. FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9 y FGF10 se unen y efectúan la señalización a través de receptores de crecimiento de fibroblastos (FGFR).

Los FGF inducen la mitosis en una variedad de tipos de células y también tienen efectos reguladores, morfológicos y endocrinos. Los FGF funcionan durante todo el desarrollo embrionario y ayudan en la inducción del mesodermo, la polarización anteroposterior, el desarrollo de las extremidades, la inducción neural y el desarrollo neural. En una realización, un FGF preferido para su uso con los métodos descritos en el presente documento es FGF7, que también se conoce en la técnica como factor de crecimiento de queratinocitos (KGF).

En algunas realizaciones, el intervalo de dosificación útil para FGF7 o FGF2 está entre 10 y 200 ng/ml, por ejemplo, entre 10 y 100 ng/ml, entre 10 y 50 ng/ml, entre 15 y 200 ng/ml, entre 20 y 200 ng/ml, entre 30 y 200 ng/ml, entre 40 y 200 ng/ml, entre 50 y 200 ng/ml, entre 60 y 200 ng/ml, entre 70 y 200 ng/ml, entre 80 y 200 ng/ml, entre 90 y 200 ng/ml, entre 100 y 200 ng/ml o entre 150 y 200 ng/ml.

En algunas realizaciones, la dosis de FGF7 o FGF2 es, por ejemplo, de al menos 10 ng/ml, al menos 20 ng/ml, al menos 30 ng/ml, al menos 40 ng/ml, al menos 50 ng/ml, al menos 60 ng/ml, al menos 70 ng/ml, al menos 80 ng/ml, al menos 90 ng/ml, al menos 100 ng/ml, al menos 110 ng/ml, al menos 120 ng/ml, al menos 130 ng/ml, al menos 140 ng/ml, al menos 150 ng/ml, al menos 160 ng/ml, al menos 170 ng/ml, al menos 180 ng/ml, al menos 190 ng/ml, al menos 200 ng/ml, al menos 225 ng/ml, al menos 250 ng/ml o más.

Modulación de la ruta de Wnt: sin desear limitarse a la teoría, las proteínas Wnt y sus receptores relacionados emiten señales a través de al menos dos rutas intracelulares distintas. La ruta de señalización de Wnt “canónica” (denominada en el presente documento ruta de Wnt/p-catenina) implica la señalización de Wnt a través de pcatenina para activar la transcripción a través de proteínas relacionadas con TCF (van de Wetering et al. (2002) Cell 109 Supl:S13-9; Moon et al. (2002) Science 296(5573):1644-6). Existe una ruta alternativa no canónica, en la que Wnt activa la proteína cinasa C (PKC), la cinasa II dependiente de calcio/calmodulina (CaMKII), JNK y Rho-GTPasas (Veeman et al. (2003) Dev Cell 5(3):367-77), y a menudo está implicada en el control de la polaridad celular.

Antagonistas de Wnt: en el presente documento se proporcionan métodos para diferenciar las células progenitoras pulmonares humanas en un fenotipo de células madre más diferenciadas, por ejemplo, en una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales Nkx2.1+, Sox2+, o en una célula progenitora pulmonar distal multipotente Nkx2.1+, Sox9 , o en una célula madre basal multipotente de las vías respiratorias Nkx2.1+, p63+ al poner en contacto una célula con un antagonista de Wnt.

Tal como se usa en el presente documento, el término “antagonista de Wnt” o “inhibidor de Wnt” se refiere a cualquier agente que inhibe la ruta de Wnt/p-catenina, o mejora la actividad y/o expresión de inhibidores de la señalización de Wnt/p-catenina, por ejemplo, activadores o potenciadores de la actividad de GSK-3p. Un agente inhibidor de Wnt, tal como se usa en el presente documento, puede suprimir la ruta de Wnt/p-catenina en cualquier punto a lo largo de la ruta, por ejemplo, pero sin limitarse a, disminuyendo la expresión y/o actividad de Wnt, o proteínas y/o genes dependientes de p-catenina o de Wnt, y aumentando la expresión y/o actividad de inhibidores endógenos de Wnt y/o p-catenina o aumentando la expresión y/o actividad de inhibidores endógenos de componentes de la ruta de Wnt/p-catenina, por ejemplo, aumentando la expresión de GSK-3p.

Algunos ejemplos no limitativos de antagonistas de Wnt incluyen el inhibidor V de la ruta de Wnt (también conocido como (E)-4-(2,6-difluoroestiril)-N,N-dimetilanilina), IWR-1 endo, IWP-2, CCT036477 y un péptido que comprende la secuencia t-Boc-NH-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-CO2H (SEQ ID NO: 1).

En algunas realizaciones, el intervalo de dosificación útil para un antagonista de Wnt (por ejemplo, IWR-1) está entre 20 y 200 ng/ml, entre 30 y 200 ng/ml, entre 40 y 200 ng/ml, entre 50 y 200 ng/ml, entre 60 y 200 ng/ml, entre 70 y 200 ng/ml, entre 80 y 200 ng/ml, entre 90 y 200 ng/ml, entre 100 y 200 ng/ml o entre 150 y 200 ng/ml.

En algunas realizaciones, la dosis de un antagonista de Wnt es, por ejemplo, de al menos 20 ng/ml, al menos 30 ng/ml, al menos 40 ng/ml, al menos 50 ng/ml, al menos 60 ng/ml, al menos 70 ng/ml, al menos 80 ng/ml, al menos 90 ng/ml, al menos 100 ng/ml, al menos 110 ng/ml, al menos 120 ng/ml, al menos 130 ng/ml, al menos 140 ng/ml, al menos 150 ng/ml, al menos 160 ng/ml, al menos 170 ng/ml, al menos 180 ng/ml, al menos 190 ng/ml, al menos 200 ng/ml o más.

Agonistas de Wnt: en el presente documento se proporcionan métodos para diferenciar una célula de endodermo del intestino proximal humana en un tipo de célula más diferenciada, por ejemplo, en una célula progenitora pulmonar Nkx2.1+, negativa para Tuj, negativa para Pax8 al poner en contacto una célula con un agonista de Wnt.

Tal como se usa en el presente documento, el término “agonista de Wnt” se refiere a cualquier agente que activa la ruta de Wnt/p-catenina, o inhibe la actividad y/o expresión de inhibidores de la señalización de Wnt/p-catenina, por ejemplo, antagonistas o inhibidores de la actividad de GSK-3p. Un agente activador de Wnt, tal como se usa en el presente documento, puede potenciar la señalización a través de la ruta de Wnt/p-catenina en cualquier punto a lo largo de la ruta, por ejemplo, pero sin limitarse a, aumentando la expresión y/o actividad de Wnt, o proteínas y/o genes dependientes de p-catenina o de Wnt, y disminuyendo la expresión y/o actividad de inhibidores endógenos de Wnt y/o p-catenina o disminuyendo la expresión y/o actividad de inhibidores endógenos de componentes de la ruta de Wnt/p-catenina, por ejemplo, disminuyendo la expresión de GSK-3p.

Algunos ejemplos no limitativos de agonistas de la ruta de Wnt incluyen CHIR9902, 2-amino-4-[3,4-(metilendioxi)bencil-amino]-6-(3-metoxifenil)pirimidina, BIO, (2'Z,3'E)-6-

En algunas realizaciones, el intervalo de dosificación útil para un agonista de Wnt (por ejemplo, CHIR9902) está entre 20 y 200 ng/ml, entre 30 y 200 ng/ml, entre 40 y 200 ng/ml, entre 50 y 200 ng/ml, entre 60 y 200 ng/ml, entre 70 y 200 ng/ml, entre 80 y 200 ng/ml, entre 90 y 200 ng/ml, entre 100 y 200 ng/ml o entre 150 y 200 ng/ml.

En algunas realizaciones, la dosis de un agonista de Wnt es, por ejemplo, de al menos 20 ng/ml, al menos 30 ng/ml, al menos 40 ng/ml, al menos 50 ng/ml, al menos 60 ng/ml, al menos 70 ng/ml, al menos 80 ng/ml, al menos 90 ng/ml, al menos 100 ng/ml, al menos 110 ng/ml, al menos 120 ng/ml, al menos 130 ng/ml, al menos 140 ng/ml, al menos 150 ng/ml, al menos 160 ng/ml, al menos 170 ng/ml, al menos 180 ng/ml, al menos 190 ng/ml, al menos 200 ng/ml o más.

Inhibidores de PI3 cinasa: las fosfoinositida 3-cinasas (PI3K) son lípido cinasas que fosforilan los lípidos en el residuo 3-hidroxilo de un anillo de inositol (Whitman et al (1988) Nature, 332:664). Los fosfolípidos 3-fosforilados (PIP3) generados por PI3-cinasas actúan como segundos mensajeros que reclutan cinasas con dominios de unión a lípidos (incluyendo regiones de homología de plekstrina (PH)), tales como Akt y cinasa 1 dependiente de fosfoinositida (PDK1). La unión de Akt a PIP3 en la membrana provoca la translocación de Akt a la membrana plasmática, poniendo Akt en contacto con PDK1, que es responsable de activar Akt. La fosfatasa supresora de tumores, PTEN, desfosforila PIP3 y, por tanto, actúa como un regulador negativo de la activación de Akt. Las PI3-cinasas Akt y PDK1 son importantes en la regulación de muchos procesos celulares, incluyendo la regulación del ciclo celular, la proliferación, la supervivencia, la apoptosis y la motilidad, y son componentes significativos de los mecanismos moleculares de enfermedades tales como el cáncer, la diabetes y la inflamación inmunitaria (Vivanco et al (2002) Nature Rev. Cancer 2:489; Phillips et al (1998) Cancer 83:41).

Tal como se usa en el presente documento, el término “inhibidor de PI3 cinasa” o “antagonista de PI3 cinasa” se refiere a cualquier agente que inhibe la actividad de PI3 cinasa. Algunos ejemplos no limitativos de un inhibidor de PI3 cinasa útil con los métodos descritos en el presente documento incluyen LY294002, wortmanina, PIK-75, ZSTK474 y Pp242.

Monitorización de la diferenciación de progenitores pulmonares humanos

En el presente documento se proporcionan métodos para diferenciar o rediferenciar una célula madre pluripotente (por ejemplo, una célula de endodermo del intestino proximal anterior, una célula de endodermo definitivo, una célula Es o una iPSC) en una célula progenitora pulmonar humana y, opcionalmente, diferenciar adicionalmente tales células progenitoras pulmonares humanas en células de las vías respiratorias del pulmón, tales como células basales, células de Clara, células ciliadas y/o células caliciformes. Estos aspectos se basan en el novedoso descubrimiento de un método para la diferenciación de células madre pluripotentes en una célula madre o célula progenitora comprometida con el linaje pulmonar y/o de las vías respiratorias. Tales métodos se ejemplifican en la sección de ejemplos en el presente documento. También se proporcionan en el presente documento composiciones de células progenitoras pulmonares humanas que tienen características particulares, tales como la presencia de uno o más marcadores de superficie celular u otros marcadores que son específicos de células pulmonares. Alternativamente, o además, las composiciones de células progenitoras pulmonares humanas descritas en el presente documento carecen de marcadores de células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas. En una realización de los métodos descritos en el presente documento, se usan uno o más marcadores de superficie celular para determinar el grado de diferenciación a lo largo del espectro de células madre embrionarias o iPSC en células pulmonares completamente diferenciadas.

Los marcadores de superficie celular, particularmente los marcadores de superficie de células madre, son útiles con las composiciones y los métodos descritos en el presente documento para identificar el estado de diferenciación o desdiferenciación de una célula. Por ejemplo, durante la reprogramación de una célula somática a una célula madre pluripotente inducida, puede usarse la activación de marcadores de células madre para confirmar que la célula somática se ha desdiferenciado (parcial o completamente). Alternativamente, durante la diferenciación de una célula ES o una iPSC en una célula progenitora pulmonar humana, puede usarse la activación de marcadores específicos de pulmón para confirmar el grado de diferenciación que ha experimentado la célula madre. Además, puede usarse la activación o desactivación de marcadores específicos de pulmón particulares para determinar el grado de multipotencia de una célula progenitora pulmonar humana. Esto puede lograrse comparando los marcadores específicos de pulmón presentes en o expresados por la célula con el perfil de marcador de las células pulmonares durante el desarrollo e infiriendo el grado de multipotencia de la célula diferenciada basándose en el grado conocido de multipotencia de la célula pulmonar correspondiente durante el desarrollo embrionario.

Pueden usarse agentes específicos de marcadores para reconocer marcadores de células madre, por ejemplo, anticuerpos marcados que reconocen y se unen a marcadores de superficie celular o antígenos en células madre deseadas. Pueden usarse anticuerpos o agentes similares específicos para un marcador dado, o un conjunto de marcadores, para separar y aislar las células madre deseadas usando clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), métodos de cribado, selección de partículas magnéticas, selección de clasificador de partículas y otros métodos conocidos por personas expertas en la técnica, incluyendo separación por densidad (Xu et al. (2002) Circ. Res. 91:501; documento U.S.S.N. 20030022367) y separación basada en otras propiedades físicas (Doevendans et al. (2000) J. Mol. Cell. Cardiol. 32:839-851).

Alternativamente, pueden usarse métodos de selección genética, en los que una célula madre o progenitora puede modificarse genéticamente para expresar una proteína indicadora unida operativamente a un promotor específico de tejido y/o un promotor génico específico; por tanto, puede usarse la expresión del indicador para métodos de selección positiva para aislar y enriquecer la célula madre deseada. Por ejemplo, una proteína indicadora fluorescente puede expresarse en la célula madre deseada mediante métodos de ingeniería genética para unir operativamente la proteína marcadora a un promotor activo en una célula madre deseada (Klug et al. (1996) J. Clin. Invest. 98:216-224; patente estadounidense n.° 6.737.054). En algunas realizaciones, las células de las que se derivan las células progenitoras pulmonares humanas no se modifican usando medios genéticos. Otros enfoques para la selección positiva incluyen la selección de fármacos, por ejemplo, tal como describen Klug et al., anteriormente, que implica el enriquecimiento de las células deseadas mediante centrifugación en gradiente de densidad. Puede realizarse una selección negativa, seleccionando y retirando células con características o marcadores no deseados, por ejemplo marcadores de fibroblastos, marcadores de células epiteliales, etc.

Las células ES indiferenciadas expresan genes que pueden usarse como marcadores para detectar la presencia de células indiferenciadas. Los productos polipeptídicos de tales genes pueden usarse como marcadores para la selección negativa. Por ejemplo, véase el documento U.S.S.N. 2003/0224411 A1; Bhattacharya (2004) Blood 103(8):2956-64; y Thomson (1998), anteriormente, cada uno incorporado en el presente documento como referencia. Las líneas de células ES humanas expresan marcadores de superficie celular que caracterizan a las células EC humanas y ES de primates no humanos indiferenciadas, que incluyen, pero sin limitarse a, antígeno embrionario específico de etapa (SSEA)-3, SSEA-4, TRA-I-60, TRA-1-81 y fosfatasa alcalina. El glicolípido GL7 de la serie globo, que porta el epítopo de SSEA-4, se forma mediante la adición de ácido siálico al glicolípido Gb5 de la serie globo, que porta el epítopo de SSEA-3. Por tanto, GL7 reacciona con anticuerpos tanto para SSEA-3 como para SSEA-4. Las líneas de células ES humanas indiferenciadas no se tiñen para SSEA-1, pero las células diferenciadas se tiñen fuertemente para SSEA-1. Los métodos para la proliferación de células hES en forma indiferenciada se describen en los documentos WO 99/20741, WO 01/51616 y WO 03/020920, cuyo contenido se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad.

Los marcadores de superficie celular a modo de ejemplo expresados en células progenitoras pulmonares incluyen, pero no se limitan a, Sox2, Sox9, p63, FoxP2, ETV4/5, FoxA2, Nkx2.1, Gata6, ID2, CK5, NGFR, FoxJ1, CCSP, Scgb3a2, Muc5ac, T1a, Spc y Scgn. Las composiciones celulares particulares con combinaciones de tales marcadores de superficie celular se ejemplifican en el presente documento en la sección de ejemplos.

En algunas realizaciones, las células progenitoras pulmonares humanas son una población enriquecida de células; es decir, el porcentaje de células progenitoras pulmonares humanas (por ejemplo, porcentaje de células) en una población de células es de al menos el 10 % del número total de células de la población. Por ejemplo, una población enriquecida comprende al menos el 15 % de células progenitoras pulmonares humanas, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o incluso el 100 % de la población comprende células progenitoras pulmonares humanas. En algunas realizaciones, una población de células comprende al menos 100 células, al menos 500 células, al menos 1000 células, al menos 1 x 104 células, al menos 1 x 105 células, al menos 1 x 106 células, al menos 1 x 107 células, al menos 1 x 108 células, al menos 1 x 109 células, al menos 1 x 1010 células, al menos 1 x 1011 células, al menos 1 x 1012 células, al menos 1 x 1013 células, al menos 1 x 1014 células, al menos 1 x 1015 células o más.

En una realización, las células progenitoras pulmonares humanas descritas en el presente documento no son células tumorales ni células cancerosas. En tales realizaciones, la célula progenitora pulmonar humana puede distinguirse de una célula tumoral o una célula cancerosa usando, por ejemplo, un perfil de marcador celular.

Composiciones de armazones

Pueden usarse polímeros biocompatibles sintéticos, naturales, así como semisintéticos, para sintetizar partículas poliméricas que pueden usarse como material de armazón. En general, para la práctica de los métodos descritos en el presente documento, es preferible que un armazón se biodegrade, de modo que las células progenitoras pulmonares puedan aislarse del polímero antes de la implantación o de modo que el armazón se degrade con el tiempo en un sujeto y no requiera su extracción. Por tanto, en una realización, el armazón proporciona una estructura temporal para el crecimiento y/o el suministro de células progenitoras pulmonares humanas a un sujeto que lo necesita. En algunas realizaciones, el armazón permite que los progenitores de células humanas crezcan de forma adecuada para el trasplante o la administración a un sujeto que lo necesita, permitiendo de ese modo la extracción del armazón antes de la implantación y la reducción el riesgo de rechazo o respuesta alérgica iniciada por el propio armazón.

Los ejemplos de polímeros que pueden usarse incluyen polímeros naturales y sintéticos, aunque se prefieren los polímeros sintéticos por su reproducibilidad y cinética de liberación controlada. Los polímeros sintéticos que pueden usarse incluyen polímeros biodegradables, tales como polilactida (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), poli(lactida-coglicolida) (Plg A) y otros polihidroxiácidos, policaprolactona, policarbonatos, poliamidas, polianhídridos, polifosfaceno, poliaminoácidos, poliortoésteres, poliacetales, policianoacrilatos y poliuretanos biodegradables; polímeros no biodegradables, tales como poliacrilatos, polímeros de etileno-acetato de vinilo y otros acetatos de celulosa sustituidos con acilo y derivados de los mismos; poliuretanos, poliestirenos, poli(cloruro de vinilo), poli(fluoruro de vinilo), poli(vinil imidazol), poliolefinas clorosulfonadas y poli(óxido de etileno). Los ejemplos de polímeros naturales biodegradables incluyen proteínas, tales como albúmina, colágeno, fibrina, seda, poliaminoácidos sintéticos y prolaminas; polisacáridos, tales como alginato, heparina; y otros polímeros biodegradables naturales de unidades de azúcares. Alternativamente, pueden usarse combinaciones de los polímeros mencionados anteriormente.

El PLA, el PGA y los copolímeros de PLA/PGA son particularmente útiles para formar armazones biodegradables. Los polímeros de PLA se preparan normalmente a partir de ésteres cíclicos de ácidos lácticos. Pueden usarse tanto las formas L(+) como D(-) del ácido láctico para preparar los polímeros de PLA, así como la mezcla de ácido DL-láctico ópticamente inactiva de ácidos lácticos D(-) y L(+). Los métodos de preparación de polilactidas están bien documentados en la bibliografía de patentes. Las siguientes patentes estadounidenses, cuyas enseñanzas se incorporan en el presente documento como referencia, describen con detalle polilactidas adecuadas, sus propiedades y su preparación: patente estadounidense n.° 1.995.970 de Dorough; patente estadounidense n.° 2.703.316 de Schneider; patente estadounidense n.° 2.758.987 de Salzberg; patente estadounidense n.° 2.951.828 de Zeile; patente estadounidense n.° 2.676.945 de Higgins; y patentes estadounidenses n.os 2.683.136; 3.531.561 de Trehu.

El PGA es un homopolímero de ácido glicólico (ácido hidroxiacético). En la conversión de ácido glicólico para dar poli(ácido glicólico), el ácido glicólico reacciona inicialmente consigo mismo para formar la glicolida de éster cíclico, que en presencia de calor y un catalizador se convierte en un polímero de cadena lineal de alto peso molecular. Los polímeros de PGA y sus propiedades se describen con más detalle en Cyanamid Research Develops World's First Synthetic Absorbable Suture”, Chemistry and Industry, 905 (1970).

Las fibras pueden formarse mediante hilatura en estado fundido, extrusión, colada u otras técnicas bien conocidas en el área de procesamiento de polímeros. Los disolventes preferidos, si se usan para retirar un armazón antes de la implantación, son aquellos que se eliminan completamente mediante el procesamiento o que son biocompatibles en las cantidades que quedan después del procesamiento.

Los polímeros para su uso en la matriz deben cumplir los parámetros mecánicos y bioquímicos necesarios para proporcionar un soporte adecuado para las células con el crecimiento y la proliferación posteriores. Los polímeros pueden caracterizarse con respecto a las propiedades mecánicas, tales como la resistencia a la tracción usando un aparato de ensayo Instron, para determinar el peso molecular del polímero mediante cromatografía de permeación en gel (GPC), la temperatura de transición vítrea mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) y la estructura de enlace mediante espectroscopía de infrarrojos (IR).

Los armazones pueden tener cualquier forma deseada y pueden comprender una amplia variedad de geometrías que son útiles para los métodos descritos en el presente documento. Una lista no limitativa de formas incluye, por ejemplo, partículas huecas, tubos, láminas, cilindros, esferas y fibras, entre otros. La forma o el tamaño del armazón no debería impedir sustancialmente el crecimiento celular, la diferenciación celular, la proliferación celular o cualquier otro proceso celular, ni el armazón debería inducir la muerte celular mediante, por ejemplo, apoptosis o necrosis. Además, debe tenerse cuidado para garantizar que la forma del armazón permita un área de superficie apropiada para el suministro de nutrientes desde el medio circundante a las células en la población, de modo que la viabilidad celular no se vea afectada. La porosidad del armazón también puede variarse según lo desee un experto en la técnica.

En algunas realizaciones, la unión de las células a un polímero se potencia recubriendo los polímeros con compuestos tales como componentes de la membrana basal, agar, agarosa, gelatina, goma arábiga, colágenos de los tipos I, II, III, IV y V, fibronectina, laminina, glicosaminoglicanos, poli(alcohol vinílico), mezclas de los mismos y otros materiales hidrófilos y de unión a péptidos conocidos por los expertos en la técnica de cultivo celular o ingeniería de tejidos. Los ejemplos de un material para recubrir un armazón polimérico incluyen poli(alcohol vinílico) y colágeno.

En algunas realizaciones, el armazón puede incluir tejido pulmonar descelularizado. Los métodos para producir tejido pulmonar descelularizado se conocen en la técnica, véase, por ejemplo, el documento WO2011/005306. En resumen, el proceso de descelularización implica separar químicamente el tejido pulmonar de sus células y retirar los restos celulares que deja atrás la estructura de la matriz extracelular. A continuación, la matriz extracelular puede repoblarse con células progenitoras pulmonares humanas tal como se describe en el presente documento, y opcionalmente con otros agentes bioactivos. Tales armazones descelularizados pueden prepararse a partir de una parte del propio pulmón del sujeto y, por tanto, puede minimizarse el riesgo de rechazo o la reacción alérgica en respuesta al armazón repoblado y administrado.

En algunas realizaciones, puede ser deseable añadir moléculas bioactivas al armazón. Puede suministrarse una variedad de moléculas bioactivas usando las matrices descritas en el presente documento. En el presente documento se denominan genéricamente “factores” o “factores bioactivos”.

En una realización, los factores bioactivos incluyen factores de crecimiento. Los ejemplos de factores de crecimiento incluyen factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante alfa o beta (TGFp), proteína morfogénica ósea 4 (BMP4), factor de crecimiento de fibroblastos 7 (FGF7), factor de crecimiento de fibroblastos 10 (FGF10), factor de crecimiento epidérmico (EGF/TGFa), factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), algunos de los cuales también son factores angiogénicos.

Estos factores los conocen los expertos en la técnica y están disponibles comercialmente o se describen en la bibliografía. Las moléculas bioactivas pueden incorporarse en la matriz y liberarse con el tiempo mediante difusión y/o degradación de la matriz, o pueden suspenderse con la suspensión celular.

Tratamiento de trastornos/enfermedades pulmonares y lesión pulmonar

Las composiciones y los métodos proporcionados en el presente documento se refieren a la generación y al uso de células progenitoras pulmonares humanas. Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan métodos para el tratamiento y la prevención de una lesión pulmonar o un trastorno o una enfermedad pulmonar en un sujeto que lo necesita. Los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para tratar, mejorar, prevenir o ralentizar la progresión de varias enfermedades pulmonares o sus síntomas, tales como los que dan como resultado daño patológico a la arquitectura pulmonar o de las vías respiratorias y/o daño alveolar. Los términos “trastorno respiratorio”, “enfermedad respiratoria”, “enfermedad del pulmón”, “trastorno del pulmón”, “enfermedad pulmonar” y “trastorno pulmonar” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a cualquier estado y/o trastorno relacionado con la respiración y/o el aparato respiratorio, incluyendo los pulmones, la cavidad pleural, los bronquios, la tráquea, las vías respiratorias altas, las vías respiratorias u otros componentes o estructuras del sistema de las vías respiratorias.

Tales enfermedades pulmonares incluyen, pero no se limitan a, displasia broncopulmonar (DBP), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis quística, bronquiectasia, cardiopatía pulmonar, neumonía, absceso pulmonar, bronquitis aguda, bronquitis crónica, enfisema, neumonitis (por ejemplo, neumonitis por hipersensibilidad o neumonitis asociada con la exposición a la radiación), enfermedades pulmonares alveolares y enfermedades pulmonares intersticiales, enfermedad pulmonar ambiental (por ejemplo, asociada con asbestos, humos o exposición a gases), neumonía por aspiración, síndromes por hemorragia pulmonar, amiloidosis, enfermedades del tejido conjuntivo, esclerosis sistémica, espondilitis anquilosante, actinomicosis pulmonar, proteinosis alveolar pulmonar, carbunco pulmonar, edema pulmonar, embolia pulmonar, inflamación pulmonar, histiocitosis pulmonar X, hipertensión pulmonar, deficiencias de tensioactivos, hipoplasia pulmonar, neoplasia pulmonar, nocardiosis pulmonar, tuberculosis pulmonar, enfermedad venooclusiva pulmonar, enfermedad pulmonar reumatoide, sarcoidosis, posneumonectomía, granulomatosis de Wegener, granulomatosis alérgica, vasculitis granulomatosa, eosinofilia, asma e hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR) (por ejemplo, asma leve intermitente, asma leve persistente, asma moderada persistente, asma grave persistente, asma aguda, asma crónica, asma atópica, asma alérgica o asma idiosincrásica), aspergilosis broncopulmonar alérgica, sinusitis crónica, insuficiencia pancreática, inflamación pulmonar o vascular, infección bacteriana o viral, por ejemplo, Haemophilus influenzae, S. aureus, Pseudomonas aeruginosa o infección por virus sincitial respiratorio (VSR) o un síndrome de dificultad respiratoria (SDR) aguda o crónica, en adultos o en niños, tal como SDR de grado I, II, III o IV o un SDR asociado con, por ejemplo, septicemia, neumonía, reperfusión, atelectasia o traumatismo torácico.

Las enfermedades pulmonares obstructivas crónicas (EPOC) incluyen aquellos estados en los que la obstrucción del flujo de aire se localiza en las vías respiratorias altas, las vías respiratorias de tamaño intermedio, los bronquiolos o el parénquima, que pueden manifestarse como o asociarse con estenosis traqueal, hipertrofia traqueal del ventrículo derecho, hipertensión pulmonar, policondritis, bronquiectasia, bronquiolitis, por ejemplo, bronquiolitis idiopática, discinesia ciliar, asma, enfisema, enfermedad del tejido conjuntivo, bronquiolitis de bronquitis crónica o trasplante de pulmón.

Los métodos descritos en el presente documento también pueden usarse para tratar o mejorar trastornos/enfermedades pulmonares agudos o crónicos o sus síntomas o complicaciones, incluyendo lesión del epitelio de las vías respiratorias, espasmo del músculo liso de las vías respiratorias o hiperreactividad de las vías respiratorias, edema de la mucosa de las vías respiratorias, aumento de la secreción de moco, activación excesiva de células T o descamación, atelectasia, cardiopatía pulmonar, neumotórax, enfisema subcutáneo, disnea, tos, sibilancias, dificultad para respirar, taquipnea, fatiga, disminución del volumen espiratorio forzado en el 1er segundo (VEF1), hipoxemia arterial, acidosis respiratoria, inflamación que incluye niveles elevados no deseados de mediadores tales como IL-4, IL-5, IgE, histamina, sustancia P, neuroquinina A, péptido relacionado con el gen de la calcitonina o metabolitos del ácido araquidónico tales como tromboxano o leucotrienos (LTD⁴o LTC⁴) e infiltración celular de la pared de las vías respiratorias, por ejemplo, por eosinófilos, linfocitos, macrófagos o granulocitos.

Cualquiera de estos y otros estados o síntomas respiratorios o pulmonares se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, The Merck Manual, 17a edición, editores: M.H. Beers and R. Berkow, 1999, Merck Research Laboratories, Whitehouse Station, N.J., ISBN 0911910-10-7, o en otras referencias citadas en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “administrar”, “introducir” y “trasplantar” se usan de manera intercambiable en el contexto de la colocación de células, por ejemplo, células progenitoras pulmonares, tal como se describe en el presente documento, en un sujeto, mediante un método o una vía que da como resultado la localización al menos parcial de las células introducidas en un sitio deseado, tal como un sitio de lesión o reparación, de modo que se produce(n) un(os) efecto(s) deseado(s). Las células, por ejemplo, células progenitoras pulmonares, o su progenie diferenciada (por ejemplo, células progenitoras de las vías respiratorias, células basales, células de Clara, células ciliadas o células caliciformes) pueden implantarse directamente en las vías respiratorias o, alternativamente, administrarse por cualquier vía apropiada que dé como resultado el suministro a una ubicación deseada en el sujeto en la que al menos una porción de las células implantadas o los componentes de las células siguen siendo viables. El periodo de viabilidad de las células después de la administración a un sujeto puede ser tan breve como de unas pocas horas, por ejemplo, veinticuatro horas, hasta unos pocos días, hasta varios años, es decir, injerto a largo plazo. Por ejemplo, en algunas realizaciones de los aspectos descritos en el presente documento, una cantidad eficaz de células progenitoras pulmonares se administra directamente a los pulmones de un niño que padece displasia broncopulmonar mediante administración intratraqueal. En otras realizaciones, las células progenitoras pulmonares pueden administrarse mediante una vía de administración sistémica indirecta, tal como una vía intraperitoneal o intravenosa.

Cuando se proporcionan de forma profiláctica, las células progenitoras pulmonares descritas en el presente documento pueden administrarse a un sujeto antes de cualquier síntoma de un trastorno pulmonar, por ejemplo, un ataque de asma, o a un bebé prematuro. Por consiguiente, la administración profiláctica de una población de células progenitoras pulmonares sirve para prevenir un trastorno pulmonar, tal como se describe en el presente documento. Cuando se proporcionan terapéuticamente, las células progenitoras pulmonares se proporcionan en (o después) de la aparición de un síntoma o una indicación de un trastorno pulmonar, por ejemplo, al inicio de la EPOC.

En algunas realizaciones de los aspectos descritos en el presente documento, la población de células progenitoras pulmonares que se administra según los métodos descritos en el presente documento comprende células progenitoras pulmonares alogénicas obtenidas a partir de uno o más donantes. Tal como se usa en el presente documento, “alogénica” se refiere a una célula progenitora pulmonar o a muestras biológicas que comprenden células progenitoras pulmonares obtenidas a partir de uno o más donantes diferentes de la misma especie, en los que los genes en uno o más loci no son idénticos. Por ejemplo, una población de células progenitoras pulmonares que se administra a un sujeto puede derivarse de sangre de cordón umbilical obtenida a partir de uno más sujetos donantes no emparentados o a partir de uno o más hermanos no idénticos. En algunas realizaciones, pueden usarse poblaciones de células progenitoras pulmonares singénicas, tales como las obtenidas a partir de animales genéticamente idénticos o a partir de gemelos idénticos. En otras realizaciones de este aspecto, las células progenitoras pulmonares son células autólogas; es decir, las células progenitoras pulmonares se aíslan o se obtienen a partir de un sujeto y se administran al mismo sujeto, es decir, el donante y el receptor son el mismo. Dependiendo de la enfermedad/trastorno o lesión que va a tratarse, así como de la ubicación de la lesión pulmonar, puede administrarse al sujeto una célula progenitora pulmonar humana indiferenciada o una célula diferenciada de la misma.

Portadores farmacéuticamente aceptables

Los métodos de administración de progenitores pulmonares humanos a un sujeto, tal como se describe en el presente documento, implican el uso de composiciones terapéuticas que comprenden células progenitoras pulmonares. Las composiciones terapéuticas contienen un portador fisiológicamente tolerable junto con la composición celular y opcionalmente al menos un agente bioactivo adicional, tal como se describe en el presente documento, disuelto o disperso en la misma como principio activo. En una realización preferida, la composición terapéutica no es sustancialmente inmunogénica cuando se administra a un mamífero o paciente humano con fines terapéuticos, a menos que se desee. Tal como se usa en el presente documento, los términos “farmacéuticamente aceptable”, “fisiológicamente tolerable” y variaciones gramaticales de los mismos, cuando se refieren a composiciones, portadores, diluyentes y reactivos, se usan de manera intercambiable y representan que los materiales pueden administrarse a o sobre un mamífero sin la producción de efectos fisiológicos no deseables, tales como náuseas, mareos, malestar gástrico, rechazo del trasplante, reacción alérgica y similares. Un portador farmacéuticamente aceptable no fomentará la aparición de una respuesta inmunitaria a un agente con el que se mezcla, a menos que se desee. La preparación de una composición que contiene principios activos disueltos o dispersos en la misma se conoce bien en la técnica y no necesita limitarse a la formulación. Normalmente, tales composiciones se preparan o bien como suspensiones o bien como disoluciones líquidas inyectables, sin embargo, también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para disolución, o suspensiones, en líquido antes de su uso. En general, las células progenitoras pulmonares humanas descritas en el presente documento se administran como una suspensión con un portador farmacéuticamente aceptable. Un experto en la técnica reconocerá que un portador farmacéuticamente aceptable que va a usarse en una composición celular no incluirá tampones, compuestos, agentes de crioconservación, conservantes u otros agentes en cantidades que interfieran sustancialmente con la viabilidad de las células que van a administrarse al sujeto. Una formulación que comprende células puede incluir, por ejemplo, tampones osmóticos que permiten mantener la integridad de la membrana celular y, opcionalmente, nutrientes para mantener la viabilidad celular o potenciar el injerto tras la administración. Tales formulaciones y suspensiones son conocidas por los expertos en la técnica y/o pueden adaptarse para su uso con las células progenitoras pulmonares humanas, tal como se describe en el presente documento, usando experimentación de rutina.

Una composición celular también puede emulsionarse o presentarse como una composición de liposomas, siempre que el procedimiento de emulsificación no afecte negativamente a la viabilidad celular. Las células y cualquier otro principio activo pueden mezclarse con excipientes que sean farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo y en cantidades adecuadas para su uso en los métodos terapéuticos descritos en el presente documento.

Los agentes adicionales incluidos en una composición celular, tal como se describe en el presente documento, pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables de los componentes de la misma. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del polipéptido) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, los hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y similares. Los portadores fisiológicamente tolerables se conocen bien en la técnica. Los portadores líquidos a modo de ejemplo son disoluciones acuosas estériles que no contienen materiales además de los principios activos y agua, o contienen un tampón tal como fosfato de sodio a un valor de pH fisiológico, solución salina fisiológica o ambos, tal como solución salina tamponada con fosfato. Además, los portadores acuosos pueden contener más de una sal de tampón, así como sales tales como los cloruros de sodio y potasio, dextrosa, polietilenglicol y otros solutos. Las composiciones líquidas también pueden contener fases líquidas además de y excluyendo agua. Los ejemplos de tales fases líquidas adicionales son glicerina, aceites vegetales, tales como aceite de semilla de algodón, y emulsiones de aceite en agua. La cantidad de un compuesto activo usado en las composiciones celulares, tal como se describe en el presente documento, que es eficaz en el tratamiento de un trastorno o estado particular dependerá de la naturaleza del trastorno o estado y puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales.

Administración y eficacia

En el presente documento se proporcionan métodos para tratar una enfermedad pulmonar, un trastorno pulmonar o una lesión pulmonar que comprenden la administración de células progenitoras pulmonares humanas o progenie diferenciada de las mismas a un sujeto que lo necesita.

Los parámetros medidos o medibles incluyen marcadores de enfermedad clínicamente detectables, por ejemplo, niveles elevados o disminuidos de un marcador clínico o biológico, así como parámetros relacionados con una escala clínicamente aceptada de síntomas o marcadores de una enfermedad o un trastorno. Sin embargo, se entenderá que el médico responsable decidirá el uso diario total de las composiciones y formulaciones dadas a conocer en el presente documento dentro del alcance del buen juicio médico. La cantidad exacta requerida variará dependiendo de factores tales como el tipo de enfermedad que está tratándose.

El término “cantidad eficaz”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de una población de células progenitoras pulmonares humanas o su progenie necesaria para aliviar al menos uno o más síntomas de la lesión pulmonar o el trastorno o la enfermedad pulmonar, y se refiere a una cantidad suficiente de una composición para proporcionar el efecto deseado, por ejemplo, tratar un sujeto que tiene una lesión inducida por fumar o fibrosis quística. Por tanto, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de células progenitoras pulmonares humanas o a una composición que comprende células progenitoras pulmonares humanas que es suficiente para fomentar un efecto particular cuando se administra a un sujeto típico, tal como uno que tiene o está en riesgo de padecer un trastorno o una enfermedad pulmonar. Una cantidad eficaz, tal como se usa en el presente documento, también incluiría una cantidad suficiente para prevenir o retrasar el desarrollo de un síntoma de la enfermedad, alterar el curso de una enfermedad con síntomas (por ejemplo, pero sin limitarse a, retardar la progresión de un síntoma de la enfermedad) o revertir un síntoma de la enfermedad. Se entiende que para cualquier caso dado, una “cantidad eficaz” apropiada puede determinarla un experto en la técnica usando experimentación de rutina.

En algunas realizaciones, se diagnostica en primer lugar al sujeto como que tiene un trastorno o una enfermedad que afecta al tejido pulmonar antes de administrar las células según los métodos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, se diagnostica en primer lugar al sujeto como que tiene riesgo de desarrollar un trastorno o una enfermedad pulmonar antes de administrar las células. Por ejemplo, un bebé prematuro puede tener un riesgo significativo de desarrollar un trastorno o una enfermedad pulmonar.

Para su uso en los diversos aspectos descritos en el presente documento, una cantidad eficaz de células progenitoras pulmonares humanas comprende al menos 102 células progenitoras pulmonares, al menos 5x 102 células progenitoras pulmonares, al menos 103 células progenitoras pulmonares, al menos 5 x 103 células progenitoras pulmonares, al menos 104 células progenitoras pulmonares, al menos 5 x 104 células progenitoras pulmonares, al menos 105 células progenitoras pulmonares, al menos 2 x 105 células progenitoras pulmonares, al menos 3 x 105 células progenitoras pulmonares, al menos 4 x 105 células progenitoras pulmonares, al menos 5 x 105 células progenitoras pulmonares, al menos 6 x 105 células progenitoras pulmonares, al menos 7 x 105 células progenitoras pulmonares, al menos 8 x 105 células progenitoras pulmonares, al menos 9 x 105 células progenitoras pulmonares, al menos 1 x 106 células progenitoras pulmonares, al menos 2 x 106 células progenitoras pulmonares, al menos 3 x 106 células progenitoras pulmonares, al menos 4 x 106 células progenitoras pulmonares, al menos 5 x 106 células progenitoras pulmonares, al menos 6 x 106 células progenitoras pulmonares, al menos 7 x 106 células progenitoras pulmonares, al menos 8 x 106 células progenitoras pulmonares, al menos 9 x 106 células progenitoras pulmonares o múltiplos de las mismas. Las células progenitoras pulmonares pueden derivarse de uno o más donantes o pueden obtenerse a partir de una fuente autóloga. En algunas realizaciones de los aspectos descritos en el presente documento, las células progenitoras pulmonares se expanden en cultivo antes de la administración a un sujeto que lo necesita.

Los modos de administración a modo de ejemplo para su uso en los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, inyección, infusión intrapulmonar (incluyendo intranasal e intratraqueal), inhalación como aerosol (incluyendo intranasal) e implantación (con o sin un material de armazón). “Inyección” incluye, sin limitación, inyección intravenosa, intramuscular, intraarterial, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal y subcutánea. Las frases “administración parenteral” y “administrada por vía parenteral”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a modos de administración distintos a la administración enteral y tópica, generalmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intradérmica, transtraqueal y subcutánea.

En algunas realizaciones, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de células progenitoras pulmonares usando administración intrapulmonar, tal como una vía intranasal o intratraqueal. En algunos aspectos de estos métodos, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de células progenitoras pulmonares usando una vía sistémica, tal como intraperitoneal o intravenosa. En otros aspectos de estos métodos, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de células progenitoras pulmonares usando administración tanto intrapulmonar como intraperitoneal. Estos métodos están particularmente dirigidos a tratamientos terapéuticos y profilácticos de sujetos humanos que tienen, o están en riesgo de tener, un trastorno o una enfermedad pulmonar. Las células progenitoras pulmonares humanas descritas en el presente documento pueden administrarse a un sujeto que tenga cualquier trastorno o enfermedad pulmonar mediante cualquier vía apropiada que dé como resultado un tratamiento eficaz en el sujeto. En algunas realizaciones de los aspectos descritos en el presente documento, se selecciona en primer lugar un sujeto que tiene un trastorno pulmonar antes de la administración de las células.

En algunas realizaciones, se administra una cantidad eficaz de células progenitoras pulmonares a un sujeto mediante administración o suministro intrapulmonar. Tal como se define en el presente documento, administración o suministro “intrapulmonar” se refiere a todas las vías de administración mediante las cuales se administra una población de células progenitoras pulmonares, tales como células progenitoras pulmonares Nkx2.1+, Sox2+, de modo que da como resultado el contacto directo de estas células con las vías respiratorias de un sujeto, incluyendo, pero sin limitarse a, administración transtraqueal, intratraqueal e intranasal. En algunas de tales realizaciones, las células se inyectan en los conductos nasales o la tráquea. En algunas realizaciones, las células son inhaladas directamente por un sujeto. En algunas realizaciones, el suministro intrapulmonar de células incluye métodos de administración mediante los cuales se administran las células, por ejemplo, como una suspensión celular, a un sujeto intubado mediante un tubo colocado en la tráquea o “intubación traqueal”.

Tal como se usa en el presente documento, “intubación traqueal” se refiere a la colocación de un tubo flexible, tal como un tubo de plástico, en la tráquea. La intubación traqueal más común, denominada en el presente documento “intubación orotraqueal”, es cuando, con la ayuda de un laringoscopio, se pasa un tubo endotraqueal a través de la boca, la laringe y las cuerdas vocales hasta la tráquea. Luego, se infla una perilla cerca de la punta distal del tubo para ayudar a asegurarlo en su lugar y proteger las vías respiratorias de la sangre, el vómito y las secreciones. En algunas realizaciones, las células se administran a un sujeto que tiene “intubación nasotraqueal”, que se define como una intubación traqueal en la que se pasa un tubo a través de la nariz, la laringe, las cuerdas vocales y la tráquea.

En algunas realizaciones, se administra una cantidad eficaz de células progenitoras pulmonares a un sujeto mediante administración sistémica, tal como administración intravenosa.

Las frases “administración sistémica”, “administrada por vía sistémica”, “administración periférica” y “administrada periféricamente”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a la administración de una población de células progenitoras pulmonares distinta de directamente en un sitio, tejido u órgano diana, tal como el pulmón, de modo que ingresa, en cambio, al aparato circulatorio del sujeto y, por tanto, está sujeto al metabolismo y otros procesos similares.

En algunas realizaciones de los aspectos descritos en el presente documento, se usan una o más vías de administración en un sujeto para lograr efectos distintos. Por ejemplo, las células progenitoras pulmonares pueden administrarse a un sujeto por las vías de administración tanto intratraqueal como intraperitoneal para tratar o reparar el epitelio pulmonar y para la reparación y regeneración vascular pulmonar, respectivamente. En tales realizaciones, pueden usarse diferentes cantidades eficaces de las células progenitoras pulmonares aisladas o enriquecidas para cada vía de administración.

Cuando va a usarse administración en aerosol, los dispositivos nebulizadores requieren formulaciones adecuadas para dispensar la composición particular. La elección de la formulación dependerá de la composición específica usada y del número de progenitores pulmonares que van a administrarse; un médico experto puede ajustar tales formulaciones. Sin embargo, como ejemplo, cuando la composición son células progenitoras pulmonares en un portador farmacéuticamente aceptable, la composición puede ser una suspensión de las células en un tampón apropiado (por ejemplo, tampón de solución salina) a una concentración eficaz de células por ml de disolución. La formulación también puede incluir nutrientes celulares, un azúcar simple (por ejemplo, para la regulación de la presión osmótica) u otros componentes para mantener la viabilidad de las células.

Normalmente, cada formulación para la administración en aerosol a través de un nebulizador es específica del tipo de dispositivo empleado y puede implicar el uso de un material propelente apropiado, además de los diluyentes, adyuvantes y/o portadores habituales útiles en terapia.

En algunas realizaciones, pueden administrarse agentes adicionales para ayudar en el tratamiento del sujeto antes o después del tratamiento con las células progenitoras pulmonares descritas en el presente documento. Tales agentes adicionales pueden usarse para preparar el tejido pulmonar para la administración de las células progenitoras. Alternativamente, los agentes adicionales pueden administrarse después de las células progenitoras pulmonares para apoyar el injerto y el crecimiento de la célula administrada en el pulmón dañado. Tales agentes adicionales pueden formularse para su uso con un inhalador dosificador, que generalmente comprende un polvo finamente dividido que contiene una proteína o molécula pequeña suspendida en un propelente con la ayuda de un tensioactivo. El propelente puede ser cualquier material convencional empleado para este fin, tal como un clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono o un hidrocarburo, incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano, o combinaciones de los mismos. Los tensioactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitano y lecitina de soja. El ácido oleico también puede ser útil como tensioactivo.

Las formulaciones para dispensación desde un inhalador de polvo pueden comprender un polvo seco finamente dividido que contiene proteínas o moléculas pequeñas y también pueden incluir un agente de carga, tal como lactosa, sorbitol, sacarosa o manitol en cantidades que faciliten la dispersión del polvo desde el dispositivo, por ejemplo, del 50 al 90 % en peso de la formulación. Los agentes proteicos deberían prepararse más ventajosamente en forma de partículas con un tamaño de partícula promedio de menos de 10 |im (o micrómetros), lo más preferiblemente de 0,5 a 5 |im, para una administración más eficaz al pulmón distal.

También se contempla la administración nasal de proteínas u otros agentes además de las células progenitoras pulmonares o progenie de las mismas. La administración nasal permite el paso de la proteína u otro agente al torrente sanguíneo directamente después de administrar el producto terapéutico en la nariz, sin necesidad de depositar el producto en el pulmón. Las formulaciones para administración nasal incluyen aquellas con dextrano o ciclodextrano.

La eficacia del tratamiento la puede determinar un médico experto. Sin embargo, un tratamiento se considera “tratamiento eficaz”, tal como se usa el término en el presente documento, si se reducen uno o todos los síntomas u otros síntomas o marcadores clínicamente aceptados de enfermedad pulmonar, lesión pulmonar y/o trastorno pulmonar, por ejemplo, en al menos el 10 % después del tratamiento con una composición que comprende células progenitoras pulmonares humanas tal como se describe en el presente documento. Los expertos en la técnica conocen métodos para medir estos indicadores y/o se describen en el presente documento.

Los indicadores de enfermedad pulmonar o trastorno pulmonar, o lesión pulmonar, incluyen indicadores funcionales, por ejemplo, medición de la capacidad y función pulmonar y saturación de oxígeno (por ejemplo, saturación tisular de oxígeno o saturación arterial sistémica de oxígeno), así como indicadores bioquímicos.

Para la fibrosis pulmonar idiopática, por ejemplo, los síntomas mejorados incluyen un aumento de al menos el 10 % de la capacidad vital forzada (CVF) prevista en relación con los valores antes del tratamiento. La CVF es el volumen total de aire espirado después de una inspiración completa. Los pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva suelen tener una capacidad vital normal o sólo ligeramente disminuida. Los pacientes con enfermedad pulmonar restrictiva tienen una capacidad vital disminuida.

Otra medida es el VEF1 (volumen espiratorio forzado en 1 segundo). Este es el volumen de aire espirado en el primer segundo durante el esfuerzo espiratorio máximo. El VEF1 se reduce tanto en la enfermedad pulmonar obstructiva como en la restrictiva. El VEF1 se reduce en la enfermedad pulmonar obstructiva debido al aumento de la resistencia de las vías respiratorias. Se reduce en la enfermedad pulmonar restrictiva debido a la baja capacidad vital.

Una medida relacionada es el VEF1/CVF. Este es el porcentaje de la capacidad vital que se espira en el primer segundo de espiración máxima. En pacientes sanos, el VEF1/CVF es normalmente de alrededor del 70 %. En pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva, el VEF1/CVF disminuye y puede ser tan bajo como el 20-30 % en la enfermedad obstructiva grave de las vías respiratorias. Los trastornos restrictivos tienen un VEF1/CVF casi normal.

Cuando sea necesario o deseado, pueden usarse modelos animales de lesión pulmonar o enfermedad pulmonar para medir la eficacia de una composición particular tal como se describe en el presente documento. Como ejemplo, puede usarse el modelo de lesión pulmonar inducida por bleomicina de lesión pulmonar aguda (LPA). Los modelos animales de la función pulmonar son útiles para monitorizar la broncoconstricción, la respuesta alérgica, la hiperreactividad tardía de las vías respiratorias en respuesta a los alérgenos inhalados, entre otros criterios de valoración, y pueden incluir, por ejemplo, modelos de pletismografía de cabeza fuera o pletismografía corporal (véase, ejemplo, Hoymann, HG et al., J Pharmacol Toxicol Methods (2007) 55(1):16-26). Se conocen en la técnica modelos animales a modo de ejemplo para el asma, incluyendo modelos de asma alérgica (por ejemplo, asma alérgica aguda y crónica). Véase, por ejemplo, Nials y Uddin. (2008) Dis Model Mech 1:213-220; Zosky y Sly (2007) Clin Exp Allergy 37(7):973-88; y Kumar y Foster. (2002) Am J Respir Cell Mol Biol 27(3):267-72. Mizgerd y Skerrett (2008) Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 294:L387-L398 revisan modelos animales de neumonía. Además, la obtención de imágenes de animales pequeños puede aplicarse a la patofisiología pulmonar (Brown RH, et al., Proc Am Thorac Soc (2008) 5:591-600).

Ensayos de selección

Las composiciones descritas en el presente documento son útiles para seleccionar agentes para inducir la diferenciación de células progenitoras pulmonares humanas o para el tratamiento de un trastorno o una enfermedad pulmonar.

En algunas realizaciones, las células progenitoras pulmonares humanas aisladas o las células pulmonares específicas de enfermedad humanas aisladas derivadas de tales células progenitoras pulmonares humanas pueden usarse en métodos, ensayos, sistemas y kits para desarrollar ensayos in vitro específicos. Tales ensayos para la selección de fármacos y estudios de toxicología tienen una ventaja sobre los ensayos existentes porque son de origen humano y no requieren la inmortalización de líneas celulares, ni requieren tejido de cadáveres, que reflejan escasamente la fisiología de las células humanas normales. Por ejemplo, los métodos, ensayos, sistemas y kits descritos en el presente documento pueden usarse para identificar y/o someter a prueba agentes que pueden fomentar la diferenciación a lo largo del linaje pulmonar. Además, o alternativamente, los métodos, ensayos, sistemas y kits pueden usarse para identificar y/o someter a prueba agentes útiles en el tratamiento de un trastorno o una enfermedad pulmonar, o para prevenir/tratar una lesión pulmonar.

Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan métodos para seleccionar un compuesto de prueba para determinar la actividad biológica, comprendiendo el método (a) poner en contacto una célula progenitora pulmonar humana aislada, tal como se describe en el presente documento, o su progenie, con un compuesto de prueba y (b) determinar cualquier efecto del compuesto en la célula. En una realización, el método de selección comprende además generar una célula progenitora pulmonar humana o una célula específica de enfermedad pulmonar humana tal como se describe en el presente documento. En una realización, la célula progenitora pulmonar se diferencia en primer lugar en un fenotipo de célula pulmonar deseado. El efecto sobre la célula puede ser uno que puede observarse directa o indirectamente mediante el uso de moléculas indicadoras.

Tal como se usa en el presente documento, el término “actividad biológica” o “bioactividad” se refiere a la capacidad de un compuesto de prueba para afectar a una muestra biológica. La actividad biológica puede incluir, sin limitación, la provocación de una respuesta estimulante, inhibidora, reguladora, tóxica o letal en un ensayo biológico. Por ejemplo, una actividad biológica puede referirse a la capacidad de un compuesto para modular el efecto de una enzima, bloquear un receptor, estimular un receptor, modular el nivel de expresión de uno o más genes, modular la proliferación celular, modular la división celular, modular el metabolismo celular, modular la diferenciación, modular la morfología celular o una combinación de los mismos. En algunos casos, una actividad biológica puede referirse a la capacidad de un compuesto de prueba para producir un efecto tóxico en una muestra biológica.

Tal como se comentó anteriormente, el linaje específico puede ser un linaje fenotípico y/o genotípico de una enfermedad (por ejemplo, una enfermedad pulmonar). Alternativamente, el linaje específico puede ser un linaje fenotípico y/o genotípico de un órgano y/o tejido o una parte del mismo (por ejemplo, pulmón).

Tal como se usa en el presente documento, el término “compuesto de prueba” o “agente candidato” se refiere a un agente o una colección de agentes (por ejemplo, compuestos) que van a seleccionarse para determinar su capacidad de tener un efecto sobre la célula. Los compuestos de prueba pueden incluir una amplia variedad de compuestos diferentes, incluyendo compuestos químicos, mezclas de compuestos químicos, por ejemplo, polisacáridos, pequeñas moléculas orgánicas o inorgánicas (por ejemplo, moléculas que tienen un peso molecular de menos de 2000 Dalton, menos de 1000 Dalton, menos de 1500 Dalton, menos de 1000 Dalton o menos de 500 Dalton), macromoléculas biológicas, por ejemplo, péptidos, proteínas, análogos de péptidos y análogos y derivados de los mismos, peptidomiméticos, ácidos nucleicos, análogos y derivados de ácidos nucleicos, un extracto elaborado a partir de materiales biológicos tales como bacterias, plantas, hongos o células o tejidos animales, composiciones que se producen de manera natural o sintéticas.

Dependiendo de la realización particular que se practique, los compuestos de prueba pueden proporcionarse libres en disolución o pueden unirse a un portador o un soporte sólido, por ejemplo, perlas. Pueden emplearse varios soportes sólidos adecuados para la inmovilización de los compuestos de prueba. Los ejemplos de soportes sólidos adecuados incluyen agarosa, celulosa, dextrano (disponible comercialmente como, es decir, Sephadex, Sepharose) carboximetilcelulosa, poliestireno, polietilenglicol (PEG), papel de filtro, nitrocelulosa, resinas de intercambio iónico, películas plásticas, copolímero de poliaminametil vinil éter-ácido maleico, perlas de vidrio, copolímero de aminoácidos, copolímero de etileno-ácido maleico, nailon, seda, etc. Además, para los métodos descritos en el presente documento, los compuestos de prueba pueden seleccionarse individualmente o en grupos. La selección en grupos es particularmente útil cuando se espera que las tasas de aciertos de los compuestos de prueba eficaces sean bajas, de modo que no se esperaría más de un resultado positivo para un grupo dado.

Se conocen en la técnica varias bibliotecas de moléculas pequeñas y están disponibles comercialmente. Estas bibliotecas de moléculas pequeñas pueden seleccionarse usando los métodos de selección descritos en el presente documento. Una biblioteca química o biblioteca de compuestos es una colección de productos químicos almacenados que pueden usarse junto con los métodos descritos en el presente documento para seleccionar agentes candidatos para un efecto particular. Una biblioteca química comprende información sobre la estructura química, la pureza, la cantidad y las características fisicoquímicas de cada compuesto. Las bibliotecas de compuestos pueden obtenerse comercialmente, por ejemplo, de Enzo Life Sciences™, Aurora Fine Chemicals™, Exclusive Chemistry Ltd.™, ChemDiv, ChemBridge™, TimTec Inc.™, AsisChem™ y Princeton Biomolecular Research™, entre otros.

Sin limitación, los compuestos pueden someterse a prueba a cualquier concentración que pueda ejercer un efecto sobre las células en relación con un control durante un periodo de tiempo apropiado. En algunas realizaciones, los compuestos se someten a prueba a concentraciones en el intervalo de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 500 |iM, de aproximadamente 0,1 |iM a aproximadamente 20 |iM, de aproximadamente 0,1 |iM a aproximadamente 10 |iM o de aproximadamente 0,1 |iM a aproximadamente 5 |iM.

El ensayo de selección de compuestos puede usarse en una selección de alto rendimiento. La selección de alto rendimiento es un proceso en el que se analizan bibliotecas de compuestos para una actividad dada. La selección de alto rendimiento busca seleccionar grandes cantidades de compuestos de forma rápida y en paralelo. Por ejemplo, usando placas de microtitulación y equipos de ensayo automatizados, un laboratorio puede realizar hasta 100.000 ensayos al día en paralelo.

Los ensayos de selección de compuestos descritos en el presente documento pueden implicar más de una medición de la función celular o indicadora (por ejemplo, medición de más de un parámetro y/o medición de uno o más parámetros en múltiples puntos durante el transcurso del ensayo). Múltiples mediciones pueden permitir el seguimiento de la actividad biológica durante el tiempo de incubación con el compuesto de prueba. En una realización, la función indicadora se mide en una pluralidad de veces para permitir la monitorización de los efectos del compuesto de prueba en diferentes tiempos de incubación.

El ensayo de selección puede ir seguido de un ensayo posterior para identificar adicionalmente si el compuesto de prueba identificado tiene propiedades deseables para el uso previsto. Por ejemplo, el ensayo de selección puede ir seguido de un segundo ensayo seleccionado del grupo que consiste en la medición de cualquiera de: biodisponibilidad, toxicidad o farmacocinética, pero no se limita a estos métodos.

Kits

Otro aspecto de la tecnología descrita en el presente documento se refiere a kits para tratar un trastorno o una enfermedad pulmonar, a kits para seleccionar un agente candidato y/o a kits para diferenciar una célula madre humana en una célula progenitora pulmonar humana o para diferenciar una célula progenitora pulmonar humana en un tipo o tipos específicos de célula(s) pulmonar(es) humana(s). En el presente documento se describen componentes del kit que pueden incluirse en uno o más de los kits descritos en el presente documento.

En una realización, los kits descritos en el presente documento pueden incluir una célula progenitora pulmonar humana, tal como se usa ese término en el presente documento. En una realización, se incluyen en el kit uno o más agonistas o antagonistas de la ruta de señalización que fomentan la diferenciación de una célula madre. En otra realización, un componente descrito en el presente documento, tal como uno o más inhibidores del receptor de TGF-P, uno o más agonistas de BMP, uno o más agonistas de FGF e instrucciones para convertir una célula madre (por ejemplo, célula madre embrionaria, célula madre pluripotente aislada, célula de endodermo del intestino proximal anterior o célula de endodermo definitivo) en una célula progenitora pulmonar humana, por ejemplo, usando un método descrito en el presente documento.

Otro aspecto de la tecnología dada a conocer en el presente documento se refiere a kits para producir células progenitoras pulmonares humanas según los métodos dados a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, los componentes descritos en el presente documento pueden proporcionarse individualmente o en cualquier combinación como un kit. El kit incluye los componentes descritos en el presente documento, por ejemplo, una(s) composición/composiciones que incluye(n) un(os) compuesto(s) descrito(s) en el presente documento, por ejemplo, un compuesto o cóctel de compuestos o reactivos para diferenciar una célula madre humana en una célula progenitora pulmonar. Tales kits pueden incluir opcionalmente uno o más agentes que permitan la detección de un marcador de células progenitoras pulmonares o un marcador de células pulmonares o un conjunto de los mismos. Además, el kit incluye opcionalmente material informativo.

En algunas realizaciones, el compuesto del kit puede proporcionarse en un recipiente estanco al agua o al gas que en algunas realizaciones está sustancialmente libre de otros componentes del kit. Por ejemplo, puede proporcionarse un compuesto modulador de la ruta de señalización o ruta de diferenciación en más de un recipiente, por ejemplo, puede proporcionarse en un recipiente que tiene suficiente reactivo para un número predeterminado de reacciones de diferenciación, por ejemplo, 1, 2, 3 o mayor. Pueden proporcionarse uno o más compuestos, tal como se describe en el presente documento, en cualquier forma, por ejemplo, forma líquida, secada o liofilizada. Se prefiere que el/los compuesto(s) descrito(s) en el presente documento sea(n) sustancialmente puro(s) y/o estéril(es). Cuando el uno o más compuestos moduladores de la ruta de señalización descritos en el presente documento se proporcionan en una disolución líquida, la disolución líquida es preferiblemente una disolución acuosa, prefiriéndose una disolución acuosa estéril. Cuando un compuesto descrito en el presente documento se proporciona como una forma secada, la reconstitución generalmente se realiza mediante la adición de un disolvente adecuado. El disolvente, por ejemplo, agua estéril o tampón, puede proporcionarse opcionalmente en el kit.

El material informativo puede ser descriptivo, instructivo, de publicitario u otro material que esté relacionado con los métodos descritos en el presente documento y/o el uso de uno(s) compuesto(s) descrito(s) en el presente documento para los métodos descritos en el presente documento. El material informativo de los kits no está limitado en su forma. En una realización, el material informativo puede incluir información sobre la producción del compuesto, el peso molecular del compuesto, la concentración, la fecha de caducidad, la información del lote o del lugar de producción, etc. En una realización, el material informativo se refiere a métodos para usar o administrar el compuesto.

En una realización, el material informativo puede incluir instrucciones para administrar una célula progenitora pulmonar humana, tal como se describe en el presente documento, de una manera adecuada para efectuar el tratamiento de una lesión pulmonar o un trastorno o una enfermedad pulmonar, por ejemplo, en una dosis, una forma de dosificación o un modo de administración adecuados (por ejemplo, una dosis, una forma de dosificación o un modo de administración descrito en el presente documento). En otra realización, el material informativo puede incluir instrucciones para diferenciar una célula madre humana en una célula progenitora pulmonar humana. Alternativamente, el material informativo puede incluir instrucciones para seleccionar un agente candidato para tratar un trastorno o una enfermedad pulmonar.

Además de un(os) compuesto(s) descrito(s) en el presente documento, la composición del kit puede incluir otros componentes, tales como un disolvente o tampón, un estabilizador, un conservante y/o un agente adicional, por ejemplo, para diferenciar las células madre (por ejemplo, in vitro) o para tratar un estado o trastorno descrito en el presente documento. Alternativamente, los otros componentes pueden incluirse en el kit, pero en composiciones o recipientes diferentes a los de una célula o un compuesto modulador de la ruta de señalización o ruta de diferenciación descrito en el presente documento. En tales realizaciones, el kit puede incluir instrucciones para mezclar un(os) compuesto(s) descrito(s) en el presente documento y los otros componentes, o para usar un(os) compuesto(s) descrito(s) en el presente documento junto con los otros componentes, por ejemplo, instrucciones sobre la combinación de los dos agentes antes de su uso o administración.

El kit puede incluir un componente para la detección de un marcador para células progenitoras pulmonares humanas, células ES, células iPS, células de linaje tiroideo, células de linaje neuronal, etc. Además, el kit puede incluir uno o más anticuerpos que se unen a un marcador celular, o cebadores para una reacción de RT-PCR o PCR, por ejemplo, una reacción de RT-PCR o PCR semicuantitativa o cuantitativa. Tales componentes pueden usarse para evaluar la activación de marcadores específicos de células pulmonares o la pérdida de marcadores de células ES, iPSC, de linaje tiroideo o de linaje neuronal. Si el reactivo de detección es un anticuerpo, puede proporcionarse en una preparación seca, por ejemplo, liofilizado, o en disolución. El anticuerpo u otro reactivo de detección puede unirse a un marcador, por ejemplo, un marcador radiográfico, fluorescente (por ejemplo, GFP) o colorimétrico para su uso en detección. Si el reactivo de detección es un cebador, puede proporcionarse en una preparación seca, por ejemplo, liofilizado, o en disolución.

El kit también puede incluir uno o más reactivos para potenciar la eficacia de la producción de células madre pluripotentes inducidas, tal como un inhibidor de HDAC (por ejemplo, ácido valproico) o un inhibidor de la ADN metiltransferasa (por ejemplo, 5azaC).

En una realización, el kit comprende un medio celular o tisular para la generación de endodermo definitivo. En una realización, el medio comprende B27, activina A y ZSTK474. Un medio de generación de endodermo definitivo a modo de ejemplo comprende B27 al 2 %, activina A 20 ng/ml y ZSTK4740,2-0,5 |iM.

Normalmente, el kit se proporcionará con sus diversos elementos incluidos en un envase, por ejemplo, a base de fibra, por ejemplo, un cartón, o polimérico, por ejemplo, una caja de poliestireno. El receptáculo puede configurarse para mantener un diferencial de temperatura entre el interior y el exterior, por ejemplo, puede proporcionar propiedades aislantes para mantener los reactivos a una temperatura preseleccionada durante un tiempo preseleccionado.

EJEMPLOS

El descubrimiento de células madre embrionarias (células ES) y células madre pluripotentes inducidas (iPSC) ha dado como resultado una oportunidad sin precedentes para producir tipos de células específicas de tejido que pueden usarse en el modelado de enfermedades humanas, la selección de fármacos y las terapias específicas para pacientes. Aunque actualmente se están produciendo muchas iPSC de pacientes con enfermedades pulmonares, el principal obstáculo que impide el desarrollo real de modelos de enfermedades pulmonares humanas que usan estas células es la incapacidad de convertirlas en progenitores pulmonares y, posteriormente, en tipos de células epiteliales pulmonares diferenciadas para tratamiento terapéutico o para estudiar sus características en el laboratorio. Se han realizado varios intentos para producir células epiteliales pulmonares a partir de células ES de ratón y humanas. En muchos casos, los investigadores se han centrado en la generación de neumocitos de tipo II (Van Vranken et al., 2005; Samadikuchaksaraei et al., 2006; Wang et al., 2007). Menos estudios se han centrado en la diferenciación de las células epiteliales de las vías respiratorias a partir de células madre pluripotentes a pesar de que las enfermedades de las vías respiratorias tales como el asma, la fibrosis quística, la bronquitis y el carcinoma broncogénico son, en conjunto, más prevalentes que las enfermedades de los alvéolos tales como el enfisema. Además, cuando se forma el primordio pulmonar, los dos primeros progenitores reconocibles son los progenitores pulmonares embrionarios multipotentes y los progenitores de las vías respiratorias. Se espera, por tanto, que la producción de estos dos progenitores permita la diferenciación de cada tipo de célula epitelial pulmonar.

El epitelio de las vías respiratorias grandes del ratón y la mayor parte del epitelio de las vías respiratorias humanas está comprendido por cuatro tipos de células principales: células madre basales contiguas a la membrana basal, células de Clara detoxificantes secretoras con maquinaria P450 principalmente en el ratón, células ciliadas que impulsan el moco fuera del árbol respiratorio y las células caliciformes que responden a una lesión o inflamación y secretan el moco. Los intentos anteriores (Coraux et al., 2005; Van Haute et al., 2009) para generar epitelio pulmonar funcional a partir de células ES se caracterizaron por la producción estocástica de un número limitado de células y la generación de poblaciones de células mixtas que contienen células madre pluripotentes indiferenciadas que tienen un riesgo significativo de formación de teratomas después del trasplante. Otros han utilizado medios definidos de forma incompleta para inducir la diferenciación de las células de las vías respiratorias (tal como la exposición de células ES humanas al extracto de células tumorales; Roszell et al., 2009) o han usado células madre pluripotentes modificadas genéticamente que se seleccionaron en función de la presencia de un gen de resistencia a fármacos (Wang et al., 2007). Desafortunadamente, la modulación genética plantea la posibilidad de la introducción de mutaciones genéticas perjudiciales en las células resultantes.

Dada la dificultad de obtener células madre de las vías respiratorias humanas adultas con las que modelar la enfermedad pulmonar humana, los estudios descritos en este documento buscan generar células epiteliales pulmonares normales y específicas de la enfermedad a partir de iPSC humanas normales y específicas de la enfermedad pulmonar. Esto es particularmente importante porque los modelos murinos de enfermedad pulmonar a menudo no realizan fenocopia de la enfermedad pulmonar humana. Un buen ejemplo es el ratón con el gen Cftr inactivado que no muestra la patología pulmonar asociada a la enfermedad de fibrosis quística observada en pacientes humanos (Snouwaert et al., 1992; Clarke et al., 1992; Guilbault et al., 2006). Además, las células epiteliales derivadas de iPSC reflejarán el estado prepatológico de las células pulmonares en las que múltiples cambios secundarios, tales como los asociados con inflamación o infección, no oscurecen los efectos de la anomalía genética inicial en la patogénesis de la enfermedad.

La estrategia global descrita en este documento emplea un enfoque de diferenciación por etapas. Los mecanismos que regulan la regionalización del endodermo embrionario de ratón, la especificación pulmonar y la posterior polarización (patterning) y crecimiento de progenitores se ha estudiado bien (revisado en Morrisey y Hogan, 2010). El inicio de la especificación pulmonar dentro del endodermo va acompañado de expresión de Nkx2.1 y la regulación por disminución de Sox2 a lo largo del eje dorsal-ventral del tubo intestinal (Lazzaro et al., 1991; Minoo et al., 1999; Que et al., 2009). Nkx2.1 es el marcador más temprano del endodermo pulmonar que lo distingue del resto del endodermo del intestino proximal. Luego, la expresión de Sox2 aumenta nuevamente en el área de la futura tráquea, bronquios y bronquiolos mientras que Sox9, FoxP2 e ID2 permanecen en la punta del brote pulmonar distal y son marcadores de una población de progenitores pulmonares embrionarios multipotentes (Perl et al., 2005; Shu et al., 2007; Rawlins et al., 2009). Luego, las células progenitoras de las vías respiratorias Nkx2.1+Sox2+ ubicadas en la tráquea embrionaria se diferencian en células madre basales de las vías respiratorias p63+ (Que et al., 2009). El epitelio de las vías respiratorias grandes del ratón recuerda mucho a la mayor parte del epitelio de las vías respiratorias humanas (Rock et al., 2010; Rock et al., 2009; Evans et al., 2001) y, por tanto, pueden usarse como modelo para estudiar enfermedad de las vías respiratorias humanas.

Los inventores se centraron en producir endodermo pulmonar Nkx2.1+ que carece de endodermo tiroideo Nkx2.1+ y progenitores neurales. Un informe reciente que usó células ES humanas demostró que una estrategia de diferenciación basada en la imitación de la organogénesis del intestino del ratón condujo a la producción de células del intestino proximal anterior y células Nkx2.1+ con eficiencias de hasta el 30 % (Green et al., 2011). Sin embargo, no se demostró que estas células Nkx2.1+ se compusieran exclusivamente de progenitores pulmonares. La expresión de TUJ1 (un marcador de tejido neuronal) y PAX8 (un marcador de tejido de tiroides) no se evaluó a nivel de una sola célula mediante tinción conjunta con un anticuerpo Nkx2.1. Por tanto, se necesita el desarrollo de una estrategia novedosa para producir progenitores Nkx2.1+ que reflejen sólo la diferenciación pulmonar y no tiroidea o cerebral, y la técnica debe ser aplicable a las iPSC específicas de enfermedades humanas para que la técnica sea ampliamente relevante para el estudio de la enfermedad pulmonar humana.

En el presente documento se describe un método de diferenciación por etapas eficiente y constante para generar endodermo definitivo (ED), endodermo del intestino proximal, endodermo pulmonar temprano, células progenitoras pulmonares embrionarias multipotentes Nkx2.1+ y células progenitoras de las vías respiratorias, comenzando con células ES de ratón (figura 1) y posteriormente con iPSC humanas normales y específicas de enfermedad pulmonar. Los inventores muestran que una dosis alta de activina, activación transitoria de WNT e inhibición de BMP4 por etapas convierte las células ES en endodermo definitivo con altas eficiencias. La inhibición adicional de TGFp solo es suficiente para anteriorizar el endodermo en el endodermo del intestino proximal Sox2+. Estos estudios indican que la anteriorización del endodermo en el endodermo del intestino proximal potencia la diferenciación final de las células Nkx2.1+ en las etapas posteriores de la estrategia. BMP4, FGF2 y ^wN^tson, cada uno, necesarios para la inducción de los progenitores pulmonares inmaduros Nkx2.1+. Estos progenitores tempranos pueden madurar para dar células progenitoras Nkx2.1+Sox2+ y células madre basales de las vías respiratorias Nkx2.1+p63+ in vitro, y pueden diferenciarse para dar epitelio maduro de las vías respiratorias.

EJEMPLO 1A: Un protocolo altamente eficiente y de aplicación universal para mejorar la eficiencia de la producción de endodermo definitivo

El endodermo es una de las tres capas primarias de células germinales del embrión. Forma el intestino embrionario que a su vez da lugar a los epitelios de los pulmones y los órganos digestivos. Por tanto, la primera etapa esencial para dirigir iPSC humana hacia un linaje pulmonar es generar células de endodermo, preferiblemente con alta eficiencia. Por una variedad de motivos, algunas líneas celulares no generan endodermo definitivo con alta eficiencia. Por ejemplo, el protocolo publicado actualmente (Mou et al., 2012; RPMI B27 al 2 % activina A de agonista de TGF-beta 100 ng/ml inhibidor de PI3K LY-294002 5 uM) es eficaz en varias líneas de iPSC y ESC humanas con eficiencia de endodermo definitivo superior al 90 %. En algunas líneas celulares “difíciles” o “resistentes”, este mismo protocolo genera endodermo definitivo que varía entre eficiencia baja (<30 %) y eficiencia media (40-70 %). Los inventores seleccionaron múltiples inhibidores de PI3K, incluyendo LY-294002, ZSTK474 (Zenyaku Kogyo Co.™), Wortmannin, PI828 (PIramed Ltd.™, Roche™), NVP-BKM120 (Novartis™) y PIK-75 (Drug Discovery Research, Astellas Pharma Inc.™), y determinaron que ZSTK474 es el más potente para la generación del endodermo definitivo. Además, el uso de ZSTK474 permite que se reduzca considerablemente la dosis del factor de crecimiento activina A (por ejemplo, desde 100 ng/ml hasta 20 ng/ml y en algunas líneas celulares hasta 10 ng/ml de activina A). Por tanto, este protocolo es mucho más rentable que los protocolos anteriores. Los inhibidores de la PI3 cinasa indicados anteriormente también pueden obtenerse de fuentes comerciales que incluyen, pero no se limitan a, Promega™, Invivogen™, Sigma-Aldrich™, Cayman Chemicals™, Tocris™ y Cell Signaling Technologies™.

Este protocolo permite que se convierta un notable 90 % o más, incluyendo el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 % e incluso tan alto como el 98 % o más, de células iPSC/ESC humanas en célula de endodermo definitivo tal como se determina mediante tinción nuclear para los factores de transcripción Foxa2 y Sox17. Es importante destacar que este protocolo es muy uniforme de un experimento a otro (es decir, reproducible). Además, este protocolo puede aplicarse universalmente a múltiples líneas celulares, incluyendo varias líneas celulares “difíciles” que se determinó que tienen una baja eficiencia de generación del endodermo definitivo.

Resumen del protocolo: las ESC e iPSC humanas se hacen crecer con medio mTeSR1 completo en placas recubiertas con Geltrex™ (extracto de membrana basal (BME) de factor de crecimiento reducido (RGf ) purificado de tumor de Engelbreth-Holm-Swarm murino). Las células se alimentan todos los días y la diferenciación se realiza al 65-80 % de confluencia. Para la diferenciación del endodermo definitivo, se aspiró mTeSR1 y se aclararon las células con RPMI-1640 templado dos veces para retirar los factores de crecimiento residuales en mTeSR1. Se reemplazó el medio con medio de diferenciación de endodermo definitivo (RPMI B27 al 2 % activina A 20 ng/ml ZSTK474 0,2-0,5 uM). Se cambió el medio diariamente durante un tiempo de diferenciación total de 4 días. Se examinó la eficiencia de endodermo definitivo mediante tinción conjunta con FOXA2/SOX17 o mediante análisis FACS con una combinación de cKit/CXCR4 y cKit/EpCAM.

Un esquema que representa el protocolo para la generación de endodermo definitivo de alta eficiencia se muestra en el presente documento en la figura 13.

EJEMPLO 1B: La inhibición de TGFp específica de la etapa regionaliza el endodermo indiferenciado al endodermo del intestino proximal anterior y facilita la diferenciación de las células Nkx2.1

Un informe reciente describió una estrategia basada en monocapa que usa la activación sinérgica de la señalización nodal y Wnt-p-catenina, así como la inhibición de BMP4 por etapas para dirigir las células ES de ratón hacia un destino de endodermo con alta eficiencia (Sherwood et al., 2011). Esta tecnología se adaptó en el presente documento para generar endodermo definitivo (ED) a partir de células ES de ratón. La figura 7 muestra una estrategia esquemática y un marco de tiempo para generar endodermo definitivo. Este protocolo dio como resultado que se convirtiera un notable 80 %-90 % de células en ED basándose en la expresión dual de los factores de transcripción del endodermo FoxA2 y Sox17 (datos no mostrados). A continuación, se preguntó si las células de ED recién generadas tienen la competencia para generar células Nkx2.1+. Después de exponerlas durante 2 días a un medio sin suero que contenía BMP4, FGF2 y GSK3iXV (agonista de WNT) (figura 2A), se observó que menos del 1 % de las células eran Nkx2.1+ (datos no mostrados). Sin embargo, más del 60 % de las células eran Cdx2+, lo que indica que la mayoría de las células se especificaron para un destino del intestino distal (datos no mostrados). Dado que las células de endodermo en esta etapa no se diferenciaron eficientemente en células Nkx2.1+, se sometió a prueba si una etapa de “anteriorización” facilitaría la especificación del destino pulmonar. Snoeck y colaboradores informaron que Noggin (un inhibidor de BMP) se sinergizó con SB431542 (un inhibidor de TGFp) para suprimir un destino del endodermo posterior (Cdx2+) a favor de un destino del endodermo anterior (Sox2+) (Green et al., 2011). Dado que los inventores ya habían incorporado la inhibición de BMP durante la generación de ED (figura 7), se exploró la cuestión de si la inhibición continua de BMP es necesaria para la anteriorización o si la inhibición de TGFp sola era suficiente para la polarización anterior. Se trató el endodermo con combinaciones de activina (un agonista de TGFp), A-83-01 (un antagonista de TGFp), BMP4 y dorsomorfina (un antagonista de BMP4) durante 2 días (figura 2B). El número de células de endodermo anterior FoxA2+Sox2+ se comparó con el número total de células de endodermo FoxA2+ (figura 2B). Se expusieron adicionalmente las células tratadas al cóctel de agonista de BMP4/FGF2/WNT durante otros 2 días para examinar su competencia para generar células Nkx2.1+ (figura 2B). Los resultados indican que la inhibición de TGFp en sí misma fue suficiente para aumentar el endodermo anterior FoxA2+Sox2+ (el 40 %-55 %, en comparación con <0.1 % en medio solo, figura 2B) y mejorar la competencia de las células de endodermo para formar células Nkx2.1+ (~ 7 %-13 % en comparación con <1 % sin regionalización, figura 2B). Se observó que el tratamiento continuo con activina dio como resultado células FoxA2+Sox2+ pocas comunes y pocas células Nkx2.1+ (figura 2B), lo que indica que la duración óptima de la exposición a activina desempeña un papel en la eficiencia de la regionalización. También se encontró que no se requería inhibición adicional de BMP4 para la generación de células FoxA2+Sox2+ y, en última instancia, puede dar como resultado porcentajes ligeramente más bajos de células Nkx2.1+ (figura 2B). También se observó que estaba presente menos marcador neuroectodérmico Tuj1 si BMP4 estuvo presente entre los días 5-7 (datos no mostrados) conforme al hallazgo de que BMP4 suprime el compromiso neuronal y promueve la diferenciación de linaje no neuronal de las ESC (Zhang et al., 2010). Se ha demostrado que la señalización de FGF y WNT mantiene la identidad del intestino distal y reprime activamente la diferenciación del endodermo del intestino proximal (Wells y Melton, 2000; Ameri et al., 2010). Se sometió a prueba si su inhibición potenciaría la anteriorización junto con un inhibidor de TGFp. Los experimentos posteriores revelaron la muerte celular inducida por un antagonista de FGF (PD173074), mientras que un antagonista de WNT (IWR-1) no aumentó la población de FoxA2+Sox2+ (datos no mostrados).

EJEMPLO 2: Las células Nkx2.1+ derivadas de ESC de ratón están desprovistas de marcadores neuronales y tiroideos, son proliferativas y contienen progenitores pulmonares multipotentes distales y progenitores de las vías respiratorias proximales

Nkx2.1 no es un marcador específico del pulmón, y su expresión también se encuentra en el prosencéfalo ventral y la tiroides. Por tanto, era importante determinar la identidad de las células Nkx2.1+ generadas en el sistema de cultivo usado en el presente documento. Desafortunadamente, no existen marcadores fiables del linaje pulmonar en la etapa embrionaria E9 que no se expresen en el cerebro o la tiroides. La Sp-C (proteína tensioactiva C), que es el marcador más específico para los progenitores epiteliales pulmonares, no se detecta hasta E10-E11 (Wert et al., 1993). SOX9 y FOXP2, de hecho, se coexpresan con NKX2.1 en células progenitoras epiteliales multipotentes pulmonares distales (datos no mostrados) y no se encuentran en el cerebro o en la tiroides recién especificada (datos no mostrados), pero su expresión no es evidente hasta después de E11-E12. SOX2, por otro lado, se expresa en el endodermo pulmonar E9 (datos no mostrados) y después en progenitores epiteliales de las vías respiratorias (datos no mostrados), pero SOX2 también puede encontrarse en células que expresan NKX2.1 en el prosencéfalo ventral (figura 8 y datos no mostrados). Por tanto, en la etapa más temprana de la especificación del endodermo pulmonar (E8.75-E9), ninguno de estos marcadores (SPC, SOX2, SOX9 y FOXP2) puede usarse para identificar de manera fiable y única las células pulmonares. En cambio, la expresión de TUJ1 en células Nkx2.1+ en el prosencéfalo ventral comienza en E8.0 y continúa estando presente después de eso en el prosencéfalo ventral y no en la tiroides o pulmón (figura 8 y datos no mostrados), lo que hace la expresión de Tuj1 un indicador específico de la identidad celular neuronal dentro del dominio NKX2.1. La expresión de PAX8 se detecta en la tiroides primordial en E8.75 en el momento de la especificación de la tiroides (datos no mostrados) pero no en el pulmón o el cerebro. Por tanto, PAX8 puede usarse como un indicador específico de la identidad de las células tiroideas en el dominio NKX2.1 (figura 8 y datos no mostrados). En resumen, los inventores concluyen que en la etapa de especificación temprana, puede considerarse que las células Nkx2.1+/Tuj1-/Pax8- tienen un linaje de células pulmonares. Por consiguiente, las células Nkx2.1+ derivadas de ESC se interrogaron para determinar la expresión de TUJ1 y PAX8 para excluir la identidad neuronal y tiroidea (datos no mostrados). Tal como se esperaba para cualquier célula Nkx2.1+ en el embrión (tiroides, pulmón y prosencéfalo ventral), todas las células Nkx2.1+ diferenciadas ex vivo se tiñeron conjuntamente con Foxa2 (datos no mostrados). Se detectó un pequeño subconjunto de células Tuj1+ en los cultivos, pero estas células neuronales no se superpusieron con las células Nkx2.1+ (datos no mostrados). Los inventores no detectaron ninguna célula Pax8+ en su cultivo (datos no mostrados). Por tanto, estos datos indican que las células Nkx2.1+ que se diferencian in vitro representan las células de endodermo pulmonar. Estas células Nkx2.1+ son proliferativas, y más de la mitad expresan Ki67 (datos no mostrados).

Los datos de los experimentos de inmunofluorescencia indican que las células Nkx2.1+ derivadas de ESC están desprovistas de marcadores neuronales y tiroideos, son proliferativas y poseen marcadores de endodermo pulmonar proximal y distal. Se realizó una tinción por inmunofluorescencia para FOXA2, TUJ1 y PAX8 que muestra que las células Nkx2.1+ son positivas para el marcador endodérmico FOXA2, negativas para el marcador neuroectodérmico TUJ1 y negativas para el marcador tiroideo PAX8 (datos no mostrados). Las células Nkx2.1+ eran proliferativas tal como se demostró mediante la tinción conjunta de Nkx2.1 con KI67 (datos no mostrados). La tinción por inmunofluorescencia también indicó la presencia de subpoblaciones de células Nkx2.1+ que son positivas para SOX2 (un marcador de progenitores de las vías respiratorias) y FOXP2/SOX9 (marcador de progenitores pulmonares multipotentes) (datos no mostrados).

En el ratón, Sox2 se regula rápidamente por disminución en el endodermo prepulmonar del intestino proximal justo cuando la expresión de Nkx2.1 se inicia en este mismo endodermo prepulmonar durante el proceso de especificación pulmonar en E9 (datos no mostrados). Por tanto, las células de endodermo pulmonar más tempranas son las células Nkx2.1+ y Sox2-low. Poco después de eso, se detecta una expresión sostenida de SOX2 de alto nivel en los progenitores epiteliales de las vías respiratorias proximales de la futura tráquea, bronquios y bronquiolos durante el proceso de morfogénesis ramificada (datos no mostrados). Los progenitores de las vías respiratorias son, por tanto, Nkx2.1+Sox2+.

Por el contrario, SOX9 y FOXP2 se expresan exclusivamente en las células progenitoras pulmonares multipotentes de la punta distal (datos no mostrados), lo que genera marcadores SOX9 y FOXP2 que identifican de manera única una población distinta de células progenitoras pulmonares embrionarias multipotentes dentro del dominio NKX2.1, ya que no están presentes en los progenitores de las vías respiratorias proximales o en la tiroides o el cerebro como antes. Por tanto, los inventores comprobaron si sus células Nkx2.1+ derivadas de células ES en el día 9 contenían células progenitoras tanto de las vías respiratorias proximales (Nkx2.1+Sox2+) como multipotentes distales (Nkx2.1+Sox9+; o Nkx2.1+FoxP2+). Se contaron las células Nkx2.1+ generadas a partir de 10 experimentos independientes. La proporción promedio de células progenitoras de las vías respiratorias (Nkx2.1+ Sox2+) fue del 1,8 % /- 0,8 % del total de células Nkx2.1+, mientras que las proporciones de células progenitoras multipotentes distales, Nkx2.1+Sox9+ o Nkx2.1+FoxP2+, fueron del 4,8 %+ /- 2,5 % y 6,6 /- 3,1 % del total de células Nkx2.1+, respectivamente. Las células Nkx2.1+ restantes (no tiroideas ni neurales) son células con expresión mínima de SOX2 y pueden reflejar endodermo prepulmonar temprano. Por tanto, la mayoría de las células Nkx2.1+ en el día 9 probablemente representan un endodermo pulmonar temprano que no se ha especificado para dar un progenitor de las vías respiratorias o una población de progenitores pulmonares multipotentes de punta distal. La inmunofluorescencia indica que las células están enriquecidas en células Nkx2.1+Sox2+, Nkx2.1+Sox9+ y Nkx2.1+FoxP2+ (datos no mostrados). En conjunto, estos resultados implican que las células Nkx2.1+ derivadas de ESC en el día 9 eran inmaduras, y la mayoría carecía de marcadores de células progenitoras proximales y distales, que representan células de endodermo pulmonar tempranas. Aunque es poco común, la existencia de células Nkx2.1+Sox2+, Nkx2.1+Sox9+ y Nkx2.1+FoxP2+ indicó que las células de endodermo pulmonar Nkx2.1+ derivadas de células ES se estaban diferenciando en células progenitoras de las vías respiratorias y células progenitoras pulmonares multipotentes que luego podrían diferenciarse en células epiteliales maduras.

Se analizó la expresión de los genes del linaje de destino de las células pulmonares y otras anteriores, incluyendo FoxNI (timo), Pax8 (tiroides), y Pax9 y Tbx1 (endodermo de la bolsa faríngea) mediante qPCR en tiempo real (figura S4A). Tal como se esperaba, los resultados mostraron que Sox2 se reguló por disminución a medida que las células pluripotentes se diferenciaron en endodermo definitivo (ED). Posteriormente, los niveles de Sox2 aumentaron de acuerdo con la expectativa de que el endodermo anterior expresa Sox2. La expresión de Nkx2.1, Sox9 y FoxP2 fue mínima en ESC, endodermo definitivo y endodermo anteriorizado, pero aumentó considerablemente (10-20 veces) después de la estimulación con el cóctel de inducción de FGF2/WNT/BMP4, en consonancia con los resultados anteriores que demostraron estas combinaciones de marcadores específicos de pulmón mediante tinción de anticuerpos (datos no mostrados). De manera similar, la expresión de FoxNI, Tbx1, Pax8 y Pax9 fue baja en ESC, endodermo definitivo y endodermo anteriorizado. Sin embargo, en las células del intestino proximal anterior inducidas por el factor de crecimiento, se observó un modesto aumento en la expresión de Pax9 y Tbx1, mientras que la expresión de FoxNI y Pax8 aún era mínima. A pesar del aumento en la expresión de los genes Pax9 y Tbx1 , los inventores no detectaron ninguna tinción reproducible para estas proteínas mediante inmunofluorescencia (datos no mostrados). Todos estos resultados son coherentes con el hallazgo de que una combinación de señalización de FGF, BMP4 y WNT impulsa predominantemente la diferenciación de las células progenitoras Nkx2.1+ específicas de pulmón a partir del endodermo anterior.

EJEMPLO 3A: Las señalizaciones de BMP4, FGF y WNT son, cada una, necesarias para la inducción de NKX2.1 in vitro, recapitulando el desarrollo pulmonar murino

Se sometió a prueba si se requiere cada una de las señalizaciones de BMP4, FGF2 y WNT para especificar el endodermo pulmonar a partir del intestino proximal anterior en un sistema de diferenciación de ESC de ratón in vitro. Para hacer esto, se expusieron las células de endodermo anteriorizadas a combinaciones de agonistas y antagonistas de BMP4, FGF2 y WNT (figuras 3A y B). Se encontró que BMP4 solo podía inducir la expresión de NKX2.1. En cambio, FGF2 o/y GSK3i sin BMP4 no fue suficiente para la inducción de NKX2.1, lo que indica que la señalización de BMP4 es necesaria para la especificación pulmonar (figuras 3B y C). De manera interesante, en presencia de antagonistas de FGF y WNT, BMP4 ya no podía inducir células Nkx2.1+. Este resultado implica una secreción endógena de ligandos de FGF y WNT. También sugiere que las activaciones de FGF y WNT son necesarias para la especificación de Nkx2.1 dependiente de BMP4 (figuras 3B y C). A pesar de la presunta señalización de FGF endógeno, una dosis añadida de concentración de FGF2 regulaba por incremento las células Nkx2.1+ (figuras 3B y C). En comparación con la señalización de FGF2, la activación de WNT exagerada fue perjudicial, con una disminución en las células Nkx2.1+ (figuras 4B y C) y un aumento en las células Cdx2+ del intestino distal (datos no mostrados).

BMP2, 4 y 7 son, con mucho, los miembros más estudiados de la familia BMP. Tanto BMP2 como BMP4 señalizan a través del receptor de tipo I (ALK3), mientras que BMP7 se une a un receptor de tipo I separado (ALK2) (revisado por von Bubnoff y Cho, 2001; Chen et al., 2004; Sieber et al., 2009; Miyazono et al., 2010). Los efectos de BMP2 y BMP7 se compararon con BMP4 sobre la inducción de células Nkx2.1+ a partir del endodermo anterior. Los resultados mostraron que BMP2 fue menos eficiente que BMP4 en la inducción de células Nkx2.1+, mientras que BMP7 (10 ng/ml) no tuvo ningún efecto (datos no mostrados). Incluso con una concentración aumentada (> 100 ng/ml), BMP7 aún no pudo generar células Nkx2.1+ (datos no mostrados). Esto indica que la señalización de BMP7 a través del receptor ALK2 no es necesaria para la inducción de NKX2.1. En la señalización canónica de BMP2/4, BMP2/4 se une al complejo del receptor de BMP I/II, lo que conduce a la fosforilación de Smad1/5/8, seguida de la formación de complejos heteroméricos con Smad4. Estos complejos se trasladan al núcleo y activan la expresión de genes diana (von Bubnoff y Cho, 2001; Chen et al., 2004; Sieber et al., 2009; Miyazono et al., 2010). Además de la transcripción mediada por Smad1/5/8, los complejos de receptores inducidos por BMP pueden activar la ruta de la proteína cinasa activada por mitógenos (MAPK) a través de ERK, JNK o p38 (Kozawa et al., 2002). Usando dorsomorfina (un inhibidor de pSmad1/5/8) y PD98059 (un inhibidor de MAPKK/ERK), se observó que la dorsomorfina anuló completamente la generación de células Nkx2.1+, mientras que PD98059 sólo disminuyó parcialmente la proporción de células Nkx2.1+ (datos no mostrados). Se observó una muerte celular significativa en presencia de PD98059, por lo que no pudo excluirse la posibilidad de que la disminución de las células Nkx2.1+ se debiera a la apoptosis. Además, las rutas mediadas por Smad y MAPK pueden integrarse (Aubin et al., 2004), y la disminución de las células Nkx2.1+ en presencia de PD98059 también podría deberse a una regulación por disminución de la señalización dependiente de Smad. En general, se concluyó que la cascada de señalización de BMP2/4 dependiente de Smad es necesaria para la especificación de NKX2.1 a partir de las células del intestino proximal (figura 4).

EJEMPLO 3B: Diferenciación de Nkx2.1+ para generar progenitores pulmonares

Se usó una selección química de alto rendimiento para identificar compuestos que pueden facilitar los progenitores pulmonares Nkx2.1+ y también identifica rutas de señalización novedosas que controlan la especificación del pulmón humano.

Para aumentar la eficiencia de la producción de progenitores pulmonares Nkx2.1+, los inventores realizaron una selección química de alto rendimiento imparcial en una biblioteca de inhibidores de la ruta de la cinasa y una biblioteca de fármacos clínicos de los NIH para identificar compuestos de moléculas pequeñas y fármacos clínicos aprobados por la FDA que pueden facilitar la diferenciación de progenitores pulmonares positivos para NKX2.1. La plataforma para la selección química se ilustra en la figura 14A. La selección se realizó en la etapa de conversión del endodermo anterior FoxA2+Sox2+ en endodermo pulmonar Nkx2.1+.

Se identificaron al menos cinco moléculas del conjunto de compuestos de cinasa (240 compuestos) y se identificaron al menos 6 fármacos de la colección clínica de los NIH (400 compuestos) que produjeron aumentos estadísticamente significativos (más de 3 veces) en el porcentaje de células Nkx2.1+ (figura 14B). Estas células Nkx2.1+ se han teñido adicionalmente en experimentos separados para excluir la expresión del marcador de linaje neuronal Tuj1 y el marcador de linaje tiroideo Pax8. Además, se ha evaluado la duración del fármaco y los efectos de la dosis de todos los candidatos positivos identificados en la selección primaria para aumentar la formación de progenitores pulmonares, y se han evaluado otros efectos, incluyendo la inducción de citotoxicidad y la proliferación celular mediante tinción con Ki67. Ya que estos compuestos están anotados, los inventores encontraron que hay múltiples aciertos positivos que seleccionan como diana la misma ruta, tal como las rutas de señalización relacionadas con PI3K y PKC. Sin desear limitarse a la teoría, estos datos indican que estas rutas biológicas están implicadas activamente en la organogénesis del pulmón humano. También se determinó que la BMP4 es prescindible para la diferenciación de progenitores pulmonares humanos a partir de las iPSC, lo que indica una diferencia de especie en el desarrollo pulmonar en seres humanos y ratones. Se determinó que la inhibición de BMP4 genera progenitores pulmonares con un alto nivel de expresión de NKX2.1, mientras que la adición de BMP4 disminuye la expresión de NKX2.1 sin afectar al número total de células progenitoras pulmonares NKX2.1+.

Además de los aciertos positivos, se encontró que algunos compuestos disminuyen o incluso bloquean la producción de células NKX2.1+. Varios de estos compuestos negativos son antagonistas de MEK1/2. Sin desear limitarse a la teoría, estos datos indican que las rutas de señalización relacionadas con MEK1/2 desempeñan papeles importantes en la organogénesis del pulmón humano y la diferenciación de progenitores pulmonares a partir de las iPSC. Por ejemplo, la deleción específica del endodermo de MEK1/2 da como resultado agenesia pulmonar en ratones (datos no publicados). En los sistemas de diferenciación in vitro, los inventores encontraron que la activación de MEK1/2 (tal como por 12-miristato 13-acetato de forbol o PMA, y otros agonistas de MEK1/2) estimula la producción de células NKX2.1+.

Después de estudiar los efectos aditivos y sinérgicos de los aciertos positivos, se diseñó un nuevo protocolo robusto y económicamente eficiente para la generación de una población altamente enriquecida de progenitores pulmonares Nkx2.1+ (hasta el 85 % -90 %) a partir de múltiples líneas celulares iPS en condiciones libres de xenógenos para mantener las células adecuadas para futuras aplicaciones clínicas. Este medio de diferenciación a modo de ejemplo contiene un agonista de Wnt (por ejemplo, CHIR9902 0,5 uM), un inhibidor de la PI3 cinasa (por ejemplo, PIK-75 0,02-0,05 uM), un fármaco de uso clínico (por ejemplo, metotrexato 0.02-0,05 uM), un antagonista de BMP (por ejemplo, dorsomorfina 2-4 uM) y un solo factor de crecimiento (por ejemplo, FGF2 10-50 ng/ml). La figura 12 es el resumen del protocolo de diferenciación por etapas de progenitores de las vías respiratorias recientemente desarrollado para la diferenciación de progenitores de las vías respiratorias a partir de iPSC. Un experto en la técnica puede generar muchos otros protocolos a partir de este protocolo básico (RPMI B27 al 2 % FGF210-50 ng/ml CHIR99020,5 uM dorsomorfina 2-4 uM) junto con los compuestos enumerados en la figura 14.

Basándose en el coste actual de los medios, etc., los inventores calculan que el coste del medio para la diferenciación de progenitores pulmonares a partir de iPSC (etapa I a etapa III) es sólo el 10 % del original informado en Mou et al., 2012, pero el protocolo ha potenciado la eficiencia de la producción de células NKX2.1+.

Además, los inventores han demostrado que este enfoque es eficaz en múltiples células iPS humanas y células ESC. La etapa IV permite la maduración de los progenitores pulmonares inmaduros para dar las células madre de las vías respiratorias NKX2.1+SOX2+p63+CK5+ y también puede usarse para expandir tales poblaciones a pases aumentados y/o para aumentar la cantidad de células para, por ejemplo, ensayos funcionales, modelado de enfermedades y selección de fármacos.

EJEMPLO 4: La combinación de la señalización de BMP7 y FGF7, así como la inhibición de WNT y MAPKK/ERK, genera progenitores de las vías respiratorias proximales

Tal como se demostró en el presente documento anteriormente, la mayoría de las células Nkx2.1+ derivadas de ESC en el día 9 eran células de endodermo pulmonar inmaduras. Por tanto, se diferenciaron estas células con el fin de producir progenitores embrionarios de las vías respiratorias Nkx2.1+Sox2+ más maduros. Los inventores aplicaron selectivamente factores de señalización para generar progenitores del tallo de las vías respiratorias a partir de células pulmonares inmaduras Nkx2.1+ (figuras 5A y B). Se cambiaron las células el día 9 a un medio de “inducción proximal” preparado con B27, BMP7, FGF7, IWR-1 (antagonista de WNT) y Noggin complementados con RA (datos no mostrados). Después de 2-3 días, se observó un aumento en las células progenitoras de las vías respiratorias Nkx2.1+Sox2+. La proporción fue -10 % del número total de células Nkx2.1+, en comparación con 1 % -2 % antes del tratamiento. En experimentos separados en los que se eliminaron factores de crecimiento individuales, se encontró que el antagonismo de WNT tenía el efecto más pronunciado sobre la producción de células Nkx2.1+Sox2+. La adición de dorsomorfina (antagonista de BMP) para reemplazar Noggin en esta etapa tuvo poco efecto sobre el número de células Nkx2.1+Sox2+. De manera interesante, la molécula pequeña PD98059 (un inhibidor de MAPKK/ERK) potenció la generación de células progenitoras de las vías respiratorias Nkx2.1+Sox2+ hasta un 18 % del número total de células Nkx2.1+ (datos no mostrados). Estos datos indican que los progenitores de las vías respiratorias se forman después de la inhibición de una ruta relacionada con MAPKK/ERK. Más notablemente, los inventores comenzaron a detectar una pequeña fracción de células Nkx2.1+p63+ (aproximadamente 1 %-4 % del número total de células Nkx2.1+) el día 11-12 (figura 6D). Un aumento en la duración del cultivo en el medio de “inducción proximal” de 2 a 5 o más días dio como resultado proporciones más altas de células Nkx2.1+Sox2+ y Nkx2.1+p63+ (datos no mostrados). Aunque la producción de células Nkx2.1+Sox2+ y Nkx2.1+p63+ aún necesita optimizarse, estos resultados demuestran que las células Nkx2.1 derivadas de ESC pueden diferenciarse en progenitores de las vías respiratorias proximales y células basales conductoras de las vías respiratorias. Un enfoque para aislar subpoblaciones específicas de estas células, por ejemplo, células Nkx2.1+, Sox2+ o células Nkx2.1 , Sox9+ o células Nkx2.1+, p63+ es transfectar las células con un constructo de gen indicador, por ejemplo, un constructo de indicador GFP impulsado por el promotor Sox2, Sox9 o p63. La expresión de GFP en estas circunstancias identificará a la célula como permisiva para la expresión del factor objeto. Se contempla que estos estudios puedan realizarse en células a dilución limitativa. Por ejemplo, puede inducirse una población de células de endodermo del intestino proximal anterior para que se diferencien en progenitores pulmonares multipotentes Nkx2.1+, Tuj1-, Pax8- tal como se describe en el presente documento, seguido de tratamiento para diferenciarse en progenitores de las vías respiratorias tal como también se describe. Después de un tiempo apropiado en condiciones de inducción, la población puede someterse a una dilución limitativa y sembrarse en una placa de microtitulación con una célula por pocillo. Puede permitirse que las células aisladas se expandan clonalmente en cultivo, y puede someterse a prueba una porción de células expandidas, por ejemplo, mediante inmunofluorescencia, para determinar la expresión o coexpresión de los marcadores de progenitores de las vías respiratorias derivados, por ejemplo, Nkx2.1, Sox2, Sox9, p63 o incluso más marcadores de diferenciación distal, por ejemplo, CCSP, FoxJ1, etc. De esta manera, pueden prepararse poblaciones aisladas de los diversos progenitores.

Un experto en la técnica reconocerá que también pueden emplearse métodos alternativos para producir una población aislada de células con los métodos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, puede usarse una sustancia química o una combinación de sustancias químicas para potenciar la eficiencia de la diferenciación celular en cultivo para aumentar el número de un tipo celular deseado. Tal eficiencia potenciada de diferenciación celular permite la producción de una población aislada del tipo de células progenitoras pulmonares humanas deseado mediante, por ejemplo, selección positiva para un fenotipo celular deseado o destrucción selectiva de un fenotipo celular no deseado. Alternativamente, las células pueden modificarse genéticamente de modo que expresen GFP tras la diferenciación a un fenotipo progenitor de células de pulmón humano deseado, lo que permite el uso de por ejemplo, clasificación FACS para aislar células de un fenotipo definido. Además, un experto en la técnica puede generar anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) contra un marcador de superficie celular o una combinación de marcadores particular. Tal anticuerpo o combinación de anticuerpos puede usarse para purificar un tipo de célula deseado de una población de células.

EJEMPLO 5: Las poblaciones de células Nkx2.1+ derivadas de ESC pueden diferenciarse en epitelio maduro de las vías respiratorias cuando se trasplantan in vivo

Las células progenitoras pulmonares Nkx2.1+ derivadas de células madre pluripotentes deben poseer la capacidad de generar epitelio respiratorio funcional para ser útiles. Por tanto, se sometieron a prueba los progenitores Nkx2.1 derivados de ESC de ratón para determinar su capacidad para formar epitelio respiratorio maduro mediante injerto subcutáneo (datos no mostrados). El ensayo evaluó la capacidad de las células Nkx2.1+ para diferenciarse dentro de una población de células mixtas. Se suspendieron 20.000-50.000 células en Matrigel al 50 % y se inyectaron bajo la piel de ratones inmunodeficientes. 20-30 días después de la inyección, se extirparon los tejidos injertados para su examen. Se observó la diferenciación del epitelio de las vías respiratorias del endodermo pulmonar derivado de ESC de ratón tras el injerto subcutáneo. La tinción por inmunofluorescencia indica que algunas células Nkx2.1+ son positivas para SOX2 (datos no mostrados). La tinción por inmunofluorescencia indicó además la diferenciación de células Nkx2.1+ derivadas de ESC en células madre basales de las vías respiratorias p63+, células de Clara CC10+, células ciliadas FoxJ1+ y células caliciformes Muc5ac+ (datos no mostrados).

Se observó que muchas esferas epiteliales se formaron dentro de los injertos y que algunas de estas esferas contenían células que expresaban Nkx2.1. En algunas esferas Nkx2.1+, se detectaron marcadores de células epiteliales maduras de las vías respiratorias (datos no mostrados), incluyendo células epiteliales de las vías respiratorias proximales Sox2+ (datos no mostrados), células madre basales p63+, células de Clara CC10+, células ciliadas FoxJ1+ y células secretoras de mucina Muc5ac+ (datos no mostrados).

La tinción por inmunofluorescencia triple con obtención de imágenes confocales demostró esferas que contienen más de un marcador de epitelio maduro de las vías respiratorias. Tales marcadores de epitelio maduro de las vías respiratorias nunca se han detectado en teratomas derivados de ESC. La diferenciación de células madre basales previamente publicada usando un ensayo de formación de esferas tridimensionales produjo células ciliadas y basales, pero no células de Clara (Rock et al., 2009). Los inventores no detectaron ningún marcador de neumocitos de tipo I y tipo II tal como PRO-SPC, PRP-SPA y AQUAPORIN5 a pesar de tener células multipotentes pulmonares distales (Nkx2.1+Sox9+ y Nkx2.1 FoxP2+) en la mezcla celular inicial. En general, se concluyó que las poblaciones que contienen células Nkx2.1+ derivadas de ESC son capaces de diferenciación de células epiteliales de las vías respiratorias.

EJEMPLO 6: Un enfoque por etapas eficiente y reproducible para generar células pulmonares NKX2.1+ a partir de células iPS de fibrosis quística humana. Ejemplo de referencia.

A continuación, se examinó si pudiera usarse un enfoque de diferenciación por etapas similar para generar progenitores pulmonares de las vías respiratorias a partir de iPSC humanas específicas de la enfermedad de fibrosis quística (FQ) (figura 6). Todas las etapas de diferenciación se realizaron en condiciones libres de xenógenos. Además, dos de las líneas de iPSC de CF se generaron usando ARN modificados (RiPS) en lugar de factores de reprogramación codificados por virus (Warren et al., 2010) y, por tanto, no se modificaron genéticamente, otra ventaja para un posible uso clínico futuro. Las iPSC de CF se mantuvieron en placas recubiertas con Geltrex en medio mTeSR1 completo. Se obtuvieron altos rendimientos de endodermo definitivo (ED) después del tratamiento durante 3-4 días en medio RPMI-1640 en presencia de activina (100 ng/ml) e inhibidor de PI3 cinasa LY294002 (5 |iM). Más del 85 %-90 % de las células coexpresaron los factores de transcripción SOX17 y FOXA2 en el día 4, lo que demuestra una producción muy eficiente de ED a partir de una línea celular RiPS que es un compuesto heterocigótico para los alelemos mutantes de CFTR A508 y G551D (datos no mostrados). Este protocolo también se aplicó con éxito a otras células pluripotentes humanas, incluyendo tres líneas de iPSC de fibrosis quística homocigóticas para el alelo A508, una línea celular BJ RiPS humana de tipo silvestre (Warren et al., 2010), y las líneas de ESC humanas HUES-3 y HUES-9 (datos no mostrados).

Mediante el uso de condiciones de anteriorización similares a las de Green et al., se obtuvo la inducción de la expresión de SOX2 en células de ED con eficiencias de hasta el 50 %-60 % después de 4 días de tratamiento con A-83-01 (un antagonista de TGFP; datos no mostrados). Se encontró que Noggin (un antagonista de BMP4) en realidad no era necesario para esta anteriorización. Pueden usarse combinaciones similares de factores de crecimiento y agonistas (BMP4, FGF2 y GSK3iXV) identificadas en los estudios en células ES de ratón para generar células NKX2.1+ con eficiencias del 10 %-30 % (datos no mostrados). Estas células NKX2.1+ fueron negativas para TUJ1 y PAX8 (datos no mostrados), lo que demuestra que no tenían identidad neural o tiroidea. Además, las subpoblaciones de estas células NKX2.1+ también fueron positivas para SOX2 y SOX9 (datos no mostrados). Estos marcadores sugieren la presencia de progenitores de las vías respiratorias comprometidos (células NKX2.1+SOX2+) y progenitores pulmonares embrionarios multipotentes (células NKX2.1+SOX9+).

La expresión de diversos genes de destino de células anteriores se cuantificó mediante qPCR (figura 9) y se observaron patrones de expresión génica similares en comparación con los patrones de expresión observados durante la diferenciación de células ES de ratón. SOX2 se reguló por disminución después de la diferenciación en endodermo definitivo y luego aumentó tal como se esperaba después de la anteriorización. Se observó una drástica regulación por incremento de NKX2.1, SOX9 y FOXP2 (20-30 veces) en células de endodermo anteriorizadas después de la inducción con FGF2/BMP4/WNT. La expresión de otros genes del destino de las células anteriores, incluyendo PAX8 (endodermo tiroideo), PAX9 (endodermo faríngeo) y TBX1 (endodermo faríngeo anterior al pulmón/esófago) sólo se reguló por incremento moderadamente sin ninguna expresión de FOXN1 (endodermo del timo). En conjunto, el espectro de diferenciación del endodermo fue notablemente similar en las plataformas humanas y de ratón.

Finalmente, se injertaron por vía subcutánea poblaciones de células mixtas NKX2.1+ derivadas de células RiPS humanas (datos no mostrados). Muchas esferas se formaron en tejidos injertados después de 30 días bajo la piel de ratones receptores inmunodeficientes. En las esferas de NKX2.1 , algunas de las células NKX2.1+ coexpresaron p63, lo que indica que estas células NKX2.1+ habían madurado para dar células madre basales de las vías respiratorias (datos no mostrados).

EJEMPLO 7: Resumen

En el presente documento se informa de una estrategia por etapas para diferenciar las células madre pluripotentes en progenitores multipotentes pulmonares (Nkx2.1+Sox9+ y Nkx2.1+FoxP2+) y progenitores de las vías respiratorias (Nkx2.1+ Sox2+). Los inventores muestran que la imitación de la regionalización del intestino proximal embrionario potenció la diferenciación posterior de las células pulmonares Nkx2.1+. Esto da crédito a la noción de que la optimización de cada etapa diferenciada durante la embriogénesis dará como resultado una mejora en la eficiencia de la diferenciación en cada etapa posterior. Algunas de estas células de endodermo pulmonar Nkx2.1+ finalmente se diferenciaron en células progenitoras pulmonares embrionarias multipotentes y células progenitoras de las vías respiratorias, un hallazgo que no se había informado previamente. Además, las células progenitoras pulmonares Nkx2.1+ comprometidas produjeron marcadores de células maduras específicas del epitelio de las vías respiratorias cuando se injertaron. A continuación, los inventores adaptaron su estrategia para producir células progenitoras pulmonares específicas de la enfermedad a partir de células iPS de fibrosis quística humana y otras líneas de células madre pluripotentes humanas, creando así una nueva plataforma para diseccionar la enfermedad pulmonar humana.

Además, los sistemas de ESC pueden usarse como una herramienta de descubrimiento para investigar las etapas en el desarrollo pulmonar. También se demostró que la señalización de FGF además de la señalización de BMP y WNT se requiere en el sistema de cultivo actual para la inducción de NKX2.1, una observación que ha resultado difícil de definir en sistemas genéticos murinos debido a la presencia de múltiples FGF en las proximidades del primordio pulmonar del intestino proximal. La disección mecánica del efecto de señalización de BMP4 también reveló una nueva observación de que la señalización de BMP4 se produce a través de una ruta dependiente de Smad y que la modulación farmacológica de Smad mejora la diferenciación de las células pulmonares Nkx2.1+. Los inventores también han demostrado que el antagonismo o agonismo por etapas cuidadosamente cronometrado de la misma ruta es esencial para impulsar la diferenciación óptima. La adición temprana de señales de WNT que luego son necesarias para la inducción de células pulmonares Nkx2.1+ en la etapa del endodermo, por ejemplo, regionaliza el endodermo en un epitelio del intestino distal que es resistente a la formación de células Nkx2.1 (Spence et al., 2011; Cao et al., 2011; Sherwood et al., 2011). Por tanto, no sólo las combinaciones de cascadas de señalización, sino también su sincronización precisa es esencial para recapitular la diferenciación in vivo. Por consiguiente, el sistema descrito en el presente documento es una plataforma complementaria útil para definir los mecanismos de diferenciación de las células pulmonares que no se describieron previamente usando la genética del desarrollo del ratón.

Este trabajo fue el primero en demostrar los progenitores de las vías respiratorias proximales Nkx2.1+Sox2+, así como las células madre Nkx2.1+p63+ doble positivas de las vías respiratorias que se derivan tanto de células madre pluripotentes humanas como de ratón. Zaret y colaboradores han sugerido que el intestino proximal contiene un patrón epigenético que regula la capacidad del endodermo intestinal para diferenciarse en un tejido particular a pesar de la presencia de los factores de crecimiento correctos (Zaret et al., 2008). Será de interés investigar si un patrón previo endodérmico basado en factores epigenéticos podría modularse para potenciar la especificación de las células progenitoras pulmonares.

Los inventores han diferenciado con éxito las poblaciones de células mixtas en el epitelio de las vías respiratorias injertándolas en un ratón inmunodeficiente por vía subcutánea. De hecho, es posible que otras células dentro de esta población mixta sean necesarias para inducir a los progenitores de las vías respiratorias a formar las esferas respiratorias.

En resumen, se proporciona en el presente documento un protocolo robusto y generalmente aplicable para la generación del e D, anteriorización del endodermo al intestino proximal y derivación del endodermo pulmonar más temprano Nkx2.1+, así como progenitores pulmonares multipotentes Nkx2.1+Sox9+, progenitores de las vías respiratorias embrionarios Nkx2.1+ Sox2+ y células madre de las vías respiratorias Nkx2.1+p63+ a partir de las ESC de ratón. La estrategia se adaptó para generar células progenitoras pulmonares específicas de la enfermedad a partir de iPSC de fibrosis quística humana, estableciendo así una nueva plataforma para la disección de la enfermedad pulmonar humana. Esto permite el modelado de enfermedades, la selección de fármacos, el rescate genético del gen CFTR mutante (usando recombinación homóloga, nucleasas de dedos de zinc o nucleasas efectoras TAL) y trasplante autólogo. Además, esta estrategia puede aplicarse en principio a cualquier trastorno pulmonar de influencia genética humana. Dada la gran cantidad de datos emergentes en la genética de enfermedades pulmonares humanas comunes, esta plataforma también servirá como trampolín para someter a prueba la importancia biológica de genes candidatos en el epitelio de las vías respiratorias. Finalmente, la capacidad de generar un gran número de células epiteliales pulmonares puede permitir experimentos bioquímicos y proteómicos que antes no eran posibles debido al suministro limitado de células epiteliales pulmonares humanas. EJEMPLO 8: PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Ejemplo de referencia

Líneas celulares humanas y de ratones: se adquirieron ratones inmunodeficientes nulos NOD-SCID IL2Rgamma (NOD/SCIDIl2rg-/-) de Jackson Laboratory. Los procedimientos con animales se realizaron según e1Hospital General de Massachusetts (MGH) y las pautas y regulaciones nacionales y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) para MGH. El uso de líneas celulares pluripotentes inducidas por fibrosis quística humana y líneas celulares embrionarias (Hues-3 y Hues-9) fueron revisadas y aprobadas por el Comité de Supervisión de la Investigación de Células Madre Embrionarias (ESCRO) y el IRB del MGH.

Anteriorización del endodermo de ratón y diferenciación de células Nkx2.1: se generó endodermo definitivo de ratón tal como se describe en el presente documento. Para anteriorizar el endodermo, en y después del día 5, las células se dividieron y se volvieron a sembrar en las placas recubiertas previamente con medio acondicionado con 804G y se alimentaron con medio D0 A8301 0,5-1 |iM (CalBiochem, 616454) durante 2 días. Luego, se aclaró el medio con medio D0 2 veces y se cambió a medio D0 suplementado con BMP4 50 ng/ml, FGF2 100 ng/ml (GIBCO, PHG0026) y GSK3iXV 5-10 nM durante otros 2-3 días. Para generar células progenitoras proximales Nkx2.1+Sox2+, las células se aclararon con medio D02 veces y se cambiaron a medio D0 que contenía B27 complementado con RA, BMP750 ng/ml, FGF750 ng/ml, IWR-1 100 nM y PD980591-2 |iM durante 2 días o más.

Cultivo y diferenciación de iPSC humanas: se mantuvieron iPSC humanas en placas recubiertas con Geltrex en medio completo mTeSRI (Stemcell). Se obtuvieron altos rendimientos de progenitores de endodermo definitivo después del tratamiento durante 3-4 días en medio RPMI-1640 en presencia de suplemento B27 al 2 % menos vitamina A (GIBCO, 12587-010), activina A (Peprotech, 100 ng/ml) e inhibidor de PI3 cinasa LY294002 (5 pM). Para generar células de endodermo del intestino proximal, se trató el endodermo definitivo durante 4 días con medio RPMI-1640 que contenía B27 al 2 %, A-83-01 500 nM (antagonista de TGFp) con o sin Noggin (antagonista de BMP4, 100 ng/ml) o dorsomorfina (2-5 pM). Después de eso, las células se expusieron durante 4 días o más al medio RPMI-1640 que contenía B27 al 2 %, BM^p450 ng/ml, FGF2100 ng/ml y GSK3iXV 5 nM para la inducción de Nkx2.1 a partir de células de endodermo.

Inmunofluorescencia: en cada etapa de diferenciación, las células se fijaron con paraformaldehído recién preparado (4 %) durante 15 min a temperatura ambiente, se aclararon en PBS, se lavaron con PBS Triton X-100 al 0,2 % y se incubaron con los anticuerpos primarios a 4°C durante la noche (> 16 h) diluidos en PBS BSA al 1 %. Tras la incubación, las células se aclararon 4 veces con PBS Triton X-100 al 0,2 % y se incubaron con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 2 horas. Las imágenes se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia invertido Olympus IX71 o un microscopio láser confocal Nikon A1. Los anticuerpos primarios usados se resumen en la siguiente tabla:

Tabla 1: lista de anticuerpos primarios

Los anticuerpos secundarios se adquirieron de Invitrogen (AlexaFluor-549 y AlexaFluor-488). La cuantificación se realizó contando al menos 5 campos aleatorios con un aumento de 20x y calculando el promedio y la desviación estándar.

Recogida de embriones, corte de secciones y tinción: los embriones o pulmones en las etapas embrionarias deseadas se disecaron y se fijaron a 4°C durante 6 horas o durante la noche con PFA al 4 % recién preparado. Luego, los tejidos se aclararon con PBS durante 3 min (5 min por vez) y se incubaron en sacarosa al 30 % en PBS a 4°C durante la noche. Los tejidos se remojaron en OCT durante 1 hora y luego se congelaron en OCT para criosección a 7 |im de grosor. Los portaobjetos se tiñeron con los anticuerpos primarios y secundarios tal como se describió anteriormente.

Diferenciación de los progenitores pulmonares Nkx2.1+ derivados de iPS humano y ESC de ratón después del injerto subcutáneo: se suspendieron 2-5x105 células en 200 pl de mezcla 1:1 de Matrigel de factor de crecimiento reducido (BD Biosciences, 354230) Advanced DMEM y se inyectaron por vía subcutánea en ratones nulos NOD-SCID IL2Rgamma. Los tejidos se recogieron y examinaron después de 20-30 días, se fijaron durante la noche en paraformaldehído frío al 4 %, se aclararon 2 veces con PBS, se remojaron en sacarosa al 30 % durante 2-3 horas y luego se incrustaron en OCT y se seccionaron a 7 |im. Los portaobjetos se examinaron en busca de células epiteliales de las vías respiratorias basándose en la expresión de NKX2.1. La diferenciación de células Nkx2.1 derivadas de ESC en células madre basales se basó en la expresión de P63 y CK5, células caliciformes basadas en la expresión de MUC5AC, células de Clara basadas en la expresión de CCSP y células ciliadas basadas en la expresión de FOXJ1.

Medios a modo de ejemplo para la diferenciación

Etapa I: de células ES y células iPS humanas a endodermo definitivo

Un medio de diferenciación a modo de ejemplo basado en RPMI-1640 puede contener B-27 al 2 % (libre de ácido retinoico), Albumax II al 0,1 %, 1x Glutamax, 1x aminoácidos no esenciales (NEAA), LY294002 5 uM (inhibidor de PI3K) y activina A 100 ng/ml. En algunas realizaciones, se usan LY294002 5 |iM y/o activina A 100 ng/ml. Sin embargo, LY294002 puede usarse dentro de un intervalo de, por ejemplo, 2-10 uM, y activina A puede usarse dentro de un intervalo de, por ejemplo, 75-150 ng/ml. En algunas realizaciones, la duración del tratamiento para la etapa I es de 4-5 días.

Etapa II: de endodermo definitivo a endodermo del intestino proximal anterior

Un medio de diferenciación basado en RPMI-1640 para la etapa II puede contener B-27 al 2 % (libre de ácido retinoico), Albumax II al 0,1 %, 1x Glutamax, 1x aminoácidos no esenciales (NEAA), antagonista de TGFb A8301 0.5-2 uM, antagonista IWR-1 de WNT 100-500 nM. En algunas realizaciones, la duración del tratamiento es de 2 a 4 días.

Etapa III: de células del intestino proximal anterior a células Nkx2.1

Un medio de diferenciación a modo de ejemplo basado en RPMI-1640 para la etapa III puede contener B-27 al 2 % (suplemento con RA), Albumax II al 0,1 %, 1x Glutamax, 1x aminoácidos no esenciales (NEAA), BMP420-200 nM, FGF2 20-200 ng/ml, GSK3iXV 5-50 nM (o CHIR-99021 100-1000 nM para reemplazar GSK3iXV). En algunas realizaciones, la duración del tratamiento es de aproximadamente 4-6 días.

Etapa IV: de células de endodermo pulmonar temprano Nkx2.1 a células proximales de las vías respiratorias Nkx2.1+Sox2+ y células madre basales de las vías respiratorias Nkx2.1+p63+

Un medio a modo de ejemplo basado en RPMI-1640 puede contener B-27 al 2 % (suplemento con AR), Albumax II al 0,1 %, 1x Glutamax, 1x aminoácidos no esenciales (NEAA), BMP720-100 ng/ml, FGF720-100 ng/ml, IWR-1 50 100 ng/ml (antagonista de WNT) y PD98059 1-2 uM (antagonista de MAPKK/ERK). En algunas realizaciones, la duración del tratamiento es de aproximadamente 4-6 días.

Un segundo medio a modo de ejemplo para la diferenciación se representa en el presente documento en la figura 12.

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Claims

REIVINDICACIONES

i . Una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2, humana aislada, en la que la célula es proliferativa y se diferencia en una célula madre basal de las vías respiratorias, una célula ciliada, una célula de Clara, una célula neuroendocrina o una célula epitelial escamosa en condiciones de diferenciación elegidas.
2. La célula aislada según la reivindicación 1, en la que la célula es negativa para Tuj1 y negativa para Pax8.
3. La célula aislada según la reivindicación 1, en la que la célula es una célula específica de enfermedad.
4. Una composición que comprende una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2, humana aislada, y un armazón, en la que la célula es proliferativa y se diferencia en una célula madre basal de las vías respiratorias, una célula ciliada, una célula de Clara, una célula neuroendocrina o una célula epitelial escamosa en condiciones de diferenciación elegidas.
5. Una composición según la reivindicación 4, en la que la célula es una célula específica de enfermedad.
6. Una composición que comprende una célula progenitora pulmonar multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2, humana aislada, y un portador farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de un trastorno o una enfermedad pulmonar, o una lesión pulmonar, en la que la célula es proliferativa y se diferencia en una célula madre basal de las vías respiratorias, una célula ciliada, una célula de Clara, una célula neuroendocrina o una célula epitelial escamosa en condiciones de diferenciación elegidas.
7. La composición para su uso según la reivindicación 6, en la que la composición comprende además un armazón.
8. La composición según la reivindicación 4, o composición para su uso según la reivindicación 7, en la que el armazón puede implantarse en un sujeto; y/o

en la que la célula es autóloga del sujeto en el que se implanta la composición; y/o

en la que el armazón es biodegradable; y/o

en la que el armazón comprende una fibra natural, una fibra sintética, tejido pulmonar descelularizado o una combinación de los mismos, y opcionalmente en la que la fibra natural se selecciona del grupo que consiste en colágeno, fibrina, seda, trombina, quitosano, quitina, ácido algínico, ácido hialurónico y gelatina, y opcionalmente en la que la fibra sintética se selecciona del grupo que consiste en: poliésteres alifáticos biodegradables representativos tales como poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), poli(D,L-lactida-co-glicolida) (PLGA), policaprolactona, poliéster alifático de diol/diácido, poliéster-amida/poliésteruretano, polivalerolactona, polihidroxibutirato, poli(tereftalato de butileno) (PBT), polihidroxihexanoato (PHH), poli(succinato de butileno) (PBS) y polihidroxivalerato; y/o

en la que la célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales es negativa para Tuj1 y/o negativa para Pax8.
9. La composición para su uso según la reivindicación 6,

en la que la célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales es negativa para Tuj1 y/o negativa para Pax8; y/o

en la que la composición se administra al pulmón; y/o

en la que la célula progenitora pulmonar humana aislada es autóloga del sujeto al que se le administra la composición.
10. La composición para su uso según la reivindicación 7, en la que el armazón comprende un agente que fomenta la diferenciación de la célula progenitora pulmonar humana aislada; y/o

en la que la composición se formula para administración en aerosol.
11. Un método de generación de una célula progenitora pulmonar humana o una población de células progenitoras pulmonares humanas que es una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2 que es proliferativa y se diferencia en una célula madre basal de las vías respiratorias, una célula ciliada, una célula de Clara, una célula neuroendocrina o una célula epitelial escamosa en condiciones de diferenciación elegidas, comprendiendo el método poner en contacto una célula de endodermo del intestino proximal humana con FGF2, WNT y BMP4, cada uno durante un tiempo y a una concentración suficiente para permitir la diferenciación de dicha célula de endodermo del intestino proximal humana en una célula progenitora pulmonar positiva para Nkx2.1, negativa para Tuj1, negativa para Pax8, y que comprende además poner en contacto la célula progenitora pulmonar positiva para Nkx2.1, negativa para Tuj1, negativa para Pax8 con BMP7, FGF7, un antagonista de WNT y un antagonista de MAPKK/ERK, cada uno durante un tiempo y a una concentración suficiente para permitir la diferenciación de la célula progenitora pulmonar positiva para Nkx2.1, negativa para Tuj1, negativa para Pax8 en una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2, y opcionalmente

en la que el antagonista de Wnt comprende IWR-1, o

en la que el antagonista de MAPKK/ERK comprende PD98059, o

en la que la etapa de poner en contacto con BMP7, FGF7, un antagonista de WNT y un antagonista de MAPKK/ERK se realiza durante al menos 4 días.
12. El método según la reivindicación 11, en el que la etapa de poner en contacto con FGF2, WNT y BMP4 se realiza durante al menos 2 días.
13. El método según la reivindicación 11, en el que el cultivo de células de endodermo del intestino proximal se derivan de células madre embrionarias (ES) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC).
14. Un método de selección de un agente para tratar un trastorno o una enfermedad pulmonar, comprendiendo el método:

(a) cultivar una población de células de las vías respiratorias específicas de enfermedad humanas producida mediante diferenciación in vitro de una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2 específica de enfermedad humana en presencia y ausencia de un agente candidato para tratar un trastorno o una enfermedad pulmonar, en el que la célula es proliferativa y se diferencia en una célula madre basal de las vías respiratorias, una célula ciliada, una célula de Clara, una célula neuroendocrina, o una célula epitelial escamosa en condiciones de diferenciación elegidas,

(b) comparar la expresión o actividad de al menos un marcador que se regula por incremento en la enfermedad o comparar la expresión o actividad de al menos un marcador que se regula por disminución en la enfermedad en presencia y ausencia del agente candidato,

en el que una disminución en la expresión o actividad de al menos un marcador de enfermedad regulado por incremento o un aumento en la expresión o actividad de al menos un marcador de enfermedad regulado por disminución identifica al agente candidato como un candidato para el tratamiento del trastorno o la enfermedad pulmonar en un sujeto.
15. El método según la reivindicación 14, en el que el método comprende además etapas antes de la etapa (a) de diferenciar una población de células progenitoras pulmonares específicas de enfermedad humanas aisladas en un cultivo de células de las vías respiratorias específicas de enfermedad humanas; y/o en el que el método comprende además etapas antes de la etapa (a) de diferenciar una población de células madre pluripotentes inducidas derivadas de un sujeto que tiene un trastorno o una enfermedad pulmonar en una población de células progenitoras pulmonares específicas de enfermedad humanas aisladas; y/o

en el que el agente candidato comprende una molécula pequeña, una proteína, un polipéptido, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un ácido nucleico;

y opcionalmente

en el que la célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2, humana se elaboran mediante un método que comprende poner en contacto una célula progenitora pulmonar positiva para Nkx2.1, negativa para Tuj1, negativa para Pax8 con BMP7, FGF7, un antagonista de WNT y un antagonista de MAPKK/ERK, cada uno durante un tiempo y a una concentración suficiente para permitir que la célula progenitora pulmonar positiva para Nkx2.1, negativa para Tuj1, negativa para Pax8 se diferencie en una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox9, opcionalmente además en el que la etapa de puesta en contacto se realiza durante al menos 4 días.
16. Un método de selección de un agente para inducir la diferenciación de una célula progenitora pulmonar humana que es una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2, humana que es proliferativa y se diferencia en una célula madre basal de las vías respiratorias, una célula ciliada, una célula de Clara, una célula neuroendocrina o una célula epitelial escamosa en condiciones de diferenciación elegidas, comprendiendo el método:

(a) cultivar una célula progenitora pulmonar humana positiva para Nkx2.1, negativa para Tuj1, negativa para Pax8 en presencia y ausencia de un agente de diferenciación candidato,

(b) comparar la expresión o actividad de al menos un marcador que se regula por incremento durante la diferenciación de la célula progenitora pulmonar con un estado más diferenciado o comparar la expresión o actividad de al menos un marcador que se regula por disminución durante la diferenciación de la célula progenitora pulmonar con un estado más diferenciado en presencia y ausencia del agente candidato, en el que una disminución en la expresión o actividad de al menos un marcador de diferenciación regulado por incremento o un aumento en la expresión o actividad de al menos un marcador de diferenciación regulado por disminución es indicativo de que el agente candidato puede usarse para inducir la diferenciación de una célula progenitora pulmonar humana aislada en un sujeto.

El método según la reivindicación 16, en el que el método comprende además etapas antes de la etapa (a) de diferenciar una célula madre embrionaria o célula madre pluripotente inducida en una célula progenitora pulmonar humana; o

en el que el agente candidato comprende una molécula pequeña, una proteína, un polipéptido, un anticuerpo o un ácido nucleico; o

en el que la célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox2, humana, se elaboran mediante un método que comprende poner en contacto una célula progenitora pulmonar humana positiva para Nkx2.1, negativa para Tuj1, negativa para Pax8 con BMP7, FGF7, un antagonista de WNT y un antagonista de MAPKK/ERK, cada uno durante un tiempo y a una concentración suficiente para permitir que la célula progenitora pulmonar positiva para Nkx2.1, negativa para Tuj1, negativa para Pax8 se diferencie en una célula progenitora multipotente de las vías respiratorias proximales positiva para Nkx2.1, positiva para Sox9, opcionalmente en el que la etapa de puesta en contacto se realiza durante al menos 4 días.

Un kit para tratar un trastorno o una enfermedad pulmonar, comprendiendo el kit: una célula según la reivindicación 1, un portador farmacéuticamente aceptable e instrucciones para tratar un trastorno o una enfermedad pulmonar, y opcionalmente comprendiendo además un armazón.