ES2831453T3 - Derivados de bencilidenguanidina y uso terapéutico para el tratamiento de enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas - Google Patents

Derivados de bencilidenguanidina y uso terapéutico para el tratamiento de enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas Download PDF

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Abstract

Compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, **(Ver fórmula)** o un tautómero del mismo donde: R1 es alquilo, Cl, F o Br; R2 es H o F; R3 se selecciona de H y alquilo; R4 se selecciona de H y C(O)R6; R5 es H; o R4 y R5 están unidos para formar un grupo heterocíclico que está opcionalmente sustituido con uno o más grupos R10; R6 se selecciona de R7, OR7 y NR8R9; R7, R8 y R9 se seleccionan cada uno independientemente de alquilo, cicloalquilo, aralquilo, cicloalquenilo, heterociclilo y arilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos R10; cada R10 se selecciona independientemente de halógeno, OH, NO2, CN, COO-alquilo, aralquilo, SO2-alquilo, SO2- arilo, COOH, CO-alquilo, CO-arilo, NH2, NH-alquilo, N(alquilo)2, CF3, alquilo y alcoxi; X y Z son cada uno independientemente CR11, e Y se selecciona de CR11 y N; R11 es H o F; para su uso en la protección de las células del estrés de RE citotóxico y trastornos relacionados con la edad.

Description

DESCRIPCIÓN
Derivados de bencilidenguanidina y uso terapéutico para el tratamiento de enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas
[0001] La presente invención describe compuestos que tienen aplicaciones terapéuticas potenciales en el tratamiento de trastornos asociados con el estrés por plegamiento incorrecto de proteínas y, en particular, con una acumulación de proteínas mal plegadas. En particular, la invención describe compuestos que son capaces de mostrar un efecto protector contra el estrés del retículo endoplasmático (RE) citotóxico.
Antecedentes de la invención
[0002] El compuesto 2-(2,6-diclorobenciliden)hidrazinacarboximidamida, también denominado guanabenz, es un agonista alfa del tipo alfa-2 que se utiliza como fármaco antihipertensivo.
Figure imgf000002_0001
[0003] También se ha informado de diversos derivados de guanabenz. Por ejemplo, el documento US 3.982.020 (Sandoz, Inc.) describe bencilidenhidrazinas sustituidas y su uso como agentes hipoglucémicosantihiperglucémicos, agentes anti-obesidad y agentes antiinflamatorios. El documento US 2004/0068017 (Bausch y Lomb Inc.) describe bencilidenhidrazinas sustituidas que son capaces de aumentar la actividad de gelatinasa A en las células oculares. Las moléculas tienen aplicaciones en el tratamiento del glaucoma primario de ángulo abierto. El documento WO 2008/061647 (Acure Pharma AB) describe el uso de N-(2-cloro-3,4-dimetoxibenzilidenamino)guanidina como inhibidor de VEGFR y sus aplicaciones asociadas en el tratamiento o prevención de la formación de vasos sanguíneos no deseados durante el crecimiento de tumores y/o afecciones inflamatorias. El documento WO 2005/031000 (Acadia Pharmaceuticals, Inc.) describe bencilidenhidrazinas sustituidas y su uso en el tratamiento del dolor agudo y el dolor neuropático crónico. Por último, el documento EP 1908464 (CNRS) describe guanabenz y cloroguanabenz y su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas a la expansión de poliglutamina, incluida la enfermedad de Huntington.
[0004] Más recientemente se ha informado que guanabenz tiene potencial terapéutico en varias otras áreas. Recientemente se observó que guanabenz tiene actividad antiprión (D. Tribouillard-Tanvier y col., 2008 PLoS One 3, e1981). Se ha informado que su actividad para proteger contra el plegamiento incorrecto de proteínas es sorprendentemente mucho más amplia e incluye la atenuación de la acumulación de huntingtina mutante en ensayos basados en células (documento WO 2008/041133) y protección contra los efectos letales de la expresión del insulina Akita mutante propenso al plegamiento incorrecto en el retículo endoplasmático (RE) de las células beta pancreáticas Min6 e INS-1 (P. Tsaytler, H. P. I Harding, D. I Ron y A. Bertolotti, Science, 332, 1 de abril de 2011, 91-94).
[0005] También se ha demostrado que guanabenz promueve la supervivencia de las células HeLa expuestas de otra manera a estrés RE citotóxico inducido por el inhibidor de N-glicosilación tunicamicina, de una manera dependiente de la dosis (P. Tsaytler, H. P. Harding, D. Ron y A. Bertolotti, Science, 332, 1 de abril de 2011, 91-94). La evaluación cuantitativa de la viabilidad celular reveló que guanabenz duplicó el número de células que sobrevivieron al estrés del RE con una concentración efectiva media de ~0,4 pM. Ni el agonista del receptor a2-adrenérgico clonidina, ni el antagonista del receptor a2-adrenérgico efaroxan protegieron a las células del estrés citotóxico del RE y efaroxan no interfirió con el efecto protector de guanabenz (P. Tsaytler, H. P. Harding, D. Ron y A. Bertolotti, Science, 332, 1 de abril 2011, 91-94). Estas observaciones demuestran que guanabenz rescata a las células del estrés letal del RE mediante un mecanismo independiente del receptor adrenérgico a2. Guanabenz protege a las células de otra manera de la acumulación letal de proteínas mal plegadas al unirse a una subunidad reguladora de la proteína fosfatasa 1, PPP1 R15A (GADD34), interrumpiendo selectivamente la desfosforilación inducida por estrés de la subunidad a del factor de iniciación de la traducción 2 (elF2a). Guanabenz establece las tasas de traducción en células estresadas a un nivel manejable por las chaperonas disponibles, restaurando así la homeostasis de las proteínas. Se informó que Guanabenz no se une a la PPP1 R15B constitutiva (CReP) y, por lo tanto, no inhibe la traducción en células no estresadas (P. Tsaytler, H. P. Harding, D. Ron y A. Bertolotti, Science, 332, 1 de abril de 2011, 91-94).
El documento WO02/11715 describe el uso de compuestos para el tratamiento de enfermedades tales como la enfermedad de Alzheimer, la diabetes de tipo 2 o el melanoma y las metástasis.
El documento US3541218 se refiere al uso de o-fluorobencilaminoguanidina en el tratamiento de la diabetes.
El documento DE1802394 describe el uso de benciliden aminoguanidinas como agentes antiparkinsonianos.
T saytler y col., Science, 332, 6025, 2011, 91-94 describen el uso de compuestos contra el cáncer.
[0006] El hecho de no mantener la proteostasis en el RE mediante el montaje de una proteína desplegada adecuada (Unfolded Protein Response, UPR, por sus siglas en inglés) se reconoce como un factor que contribuye a muchas afecciones patológicas. Por lo tanto, las moléculas descritas en este caso, que inhiben elF2a fosfatasa para ajustar la síntesis de proteínas, pueden ser de beneficio terapéutico para un gran número de enfermedades causadas por estrés por plegamiento incorrecto de proteínas y, en particular, con una acumulación de poteínas mal plegadas.
[0007] La presente invención busca proporcionar compuestos alternativos basados en una estructura central de guanabenz que tienen aplicaciones terapéuticas potenciales en el tratamiento de trastornos asociados con el estrés por plegamiento incorrecto de proteínas y, en particular, con una acumulación de proteínas mal plegadas.
Declaración de invención
[0008] Un primer aspecto de la invención se refiere a un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
Figure imgf000003_0001
donde:
Ri es alquilo, Cl, F o Br;
R 2 es H o F;
R 3 se selecciona de H y alquilo;
R 4 se selecciona de H y C(O)R6;
R 5 es H;
o R 4 y R 5 están unidos para formar un grupo heterocíclico que está opcionalmente sustituido con uno o más grupos R 10 ; R6 se selecciona de R 7 , OR 7 y NR 8 R 9 ;
R 7 , R8 y R 9 se seleccionan cada uno independientemente de alquilo, cicloalquilo, aralquilo, cicloalquenilo, heterociclilo y arilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos R 10 ;
cada R 10 se selecciona independientemente de halógeno, OH, CN, COO-alquilo, aralquilo, SO 2 -alquilo, SO 2 -arilo, COOH, CO-alquilo, CO-arilo, NH 2 , NH-alquilo, N(alquilo) 2 , CF 3 , alquilo y alcoxi;
X y Z son cada uno independientemente CR 11 , e Y se selecciona de CR 11 y N;
R 11 es H o F;
para su uso en la protección de células del estrés citotóxico del RE y trastornos relacionados con la edad.
[0009] Los estudios previos han indicado que el grupo arilo debe estar al menos disustituido para que los compuestos muestren una actividad farmacológica útil (véase, por ejemplo, D. Tribouillard-Tanvier y col., PLoS One 3, el981 (2008) y el documento EP1908464A, CNRS). Sin embargo, contrariamente a los resultados de estudios previos, el presente solicitante ha descubierto sorprendentemente que los derivados de arilo monosustituidos también son activos.
[0010] Además, los compuestos de fórmula (I) como se ha definido anteriormente no muestran ventajosamente actividad hacia el receptor adrenérgico a2A en relación con los compuestos de la técnica anterior tales como Guanabenz (figura 4). Esta pérdida de la actividad adrenérgica alfa-2 hace que los compuestos sean terapéuticamente útiles en el tratamiento de los trastornos asociados con el estrés por plegamiento incorrecto de proteínas y, en particular, con una acumulación de proteínas mal plegadas, tales como Charcot Marie Tooth (CMT), enfermedades de la retina, preferentemente retinitis pigmentosa (RP), enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson (EP), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Huntington, tauopatías, enfermedades priónicas, diabetes, preferentemente diabetes de tipo 2 y cáncer. La ausencia de actividad adrenérgica alfa-2 significa que los compuestos de fórmula (I) pueden administrarse en una dosis adecuada para tratar las enfermedades mencionadas anteriormente, sin ningún efecto significativo sobre la presión arterial.
[0011] También se describe un compuesto de fórmula (II), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
Figure imgf000004_0001
donde:
Ri es alquilo, Cl, F o Br;
R 2 es H o F;
R 3 se selecciona de H y alquilo;
R 4 se selecciona de H y C(O)R6¿
R 5 es H;
o R 4 y R 5 están unidos para formar un grupo heterocíclico que está opcionalmente sustituido con uno o más grupos R 10 ; R6 se selecciona de R 7 , OR 7 y NR 8 R 9 ;
R 7 , R8 y R 9 se seleccionan cada uno independientemente de alquilo, cicloalquilo, aralquilo, cicloalquenilo, heterocíclico, arilo y heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos R 10 ; cada R 10 se selecciona independientemente de halógeno, OH, CN, COO-alquilo, aralquilo, SO 2 -alquilo, SO 2 -arilo, COOH, CO-alquilo, CO-arilo, NH 2 , NH-alquilo, N(alquilo) 2 , CF 3 , alquilo y alcoxi;
X y Z son cada uno independientemente CR 11 , e Y es N;
R 11 es H o F.
[0012] También se describe un compuesto de fórmula (III), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
Figure imgf000004_0002
donde:
R 1 es alquilo, Cl, F o Br;
R 2 es H o F;
R 3 se selecciona de H y alquilo;
R 4 es C(O)R6;
R 5 es H;
o R 4 y R 5 están unidos para formar un grupo heterocíclico que está opcionalmente sustituido con uno o más grupos R 10 ; R6 se selecciona de R 7 , OR 7 y NR 8 R 9 ;
R 7 , R8 y R 9 se seleccionan cada uno independientemente de alquilo, cicloalquilo, aralquilo, cicloalquenilo, heterocíclico, arilo y heteroarilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos R 10 ; cada R 10 se selecciona independientemente de halógeno, OH, CN, COO-alquilo, aralquilo, SO 2 -alquilo, SO 2 -arilo, COOH, CO-alquilo, CO-arilo, NH 2 , NH-alquilo, N(alquilo) 2 , CF 3 , alquilo y alcoxi;
X y Z son cada uno independientemente CR 11 , e Y se selecciona de CR 11 y N; y R 11 es H o F.
[0013] También se describe un compuesto de fórmula (IV), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
Figure imgf000004_0003
donde:
Ri es alquilo o Br;R 2 es H;
R 3 se selecciona de H y alquilo;
R 4 se selecciona de H y C(O)R 6 ;
R 5 es H;
o R 4 y R 5 están unidos para formar un grupo heterocíclico que está opcionalmente sustituido con uno o más grupos R 10 ; R6 se selecciona de R 7 , OR 7 y NR 8 R 9 ;
R 7 , R 8 y R 9 se seleccionan cada uno independientemente de alquilo, cicloalquilo, aralquilo, cicloalquenilo, heterociclilo y arilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos R 10 ;
cada R 10 se selecciona independientemente de halógeno, OH, CN, COO-alquilo, araquilo, SO 2 -alquilo, SO 2 -arilo, COOH, CO-alquilo, CO-arilo, NH 2 , NH-alquilo, N(alquilo) 2 , CF 3 , alquilo y alcoxi;
X y Z son cada uno CH e Y es CR 11 ;
R 11 es H o F.
[0014] También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (II), (III) o (IV) como se ha descrito anteriormente, mezclado con un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable adecuado.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0015] Como se usa en esta invención, el término "alquilo" incluye grupos alquilo saturados de cadena lineal y ramificada que pueden estar sustituidos (mono o polisustituidos) o no sustiuidos. Preferentemente, el grupo alquilo es un grupo C 1-20 alquilo más preferentemente un C 1 - 15 , más preferentemente todavía un grupo C 1-12 alquilo, más preferentemente todavía un grupo C 1-6 alquilo, más preferentemente un grupo C 1-3 alquilo. Los grupos alquilo particularmente preferidos incluyen, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo y hexilo. Los sustituyentes adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más grupos R 10 . Preferentemente, el grupo alquilo no está sustituido.
[0016] Como se usa en esta invención, el término "cicloalquilo" se refiere a un grupo alquilo cíclico que puede estar sustituido (mono o polisustituido) o no sustituido. Preferentemente, el grupo cicloalquilo es un grupo C 3-12 cicloalquilo. Los sustituyentes adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más grupos R 10 .
[0017] Como se usa en esta invención, el término "alquenilo" se refiere a un grupo que contiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono, que pueden ser ramificados o no ramificados, sustituidos (mono o polisustituidos) o no sustituidos. Preferentemente, el grupo alquenilo es un grupo C 2-20 alquenilo, más preferentemente un grupo C 2-15 alquenilo, más preferentemente todavía un grupo C 2-12 alquenilo, o preferentemente un grupo C 2-6 alquenilo, más preferentemente un grupo C 2-3 alquenilo. Los sustituyentes adecuados, incluyen, por ejemplo, uno o más grupos R 10 como se ha definido anteriormente. La expresión "alquenilo cíclico" debe interpretarse en consecuencia.
[0018] Como se usa en esta invención, el término "arilo" se refiere a un grupo aromático C 6-12 que puede estar sustituido (mono o polisustituido) o no sustituido. Los ejemplos típicos incluyen fenilo y naftilo, etc. Los sustituyentes adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más grupos R 10 .
[0019] Como se usa en esta invención, el término "heterociclo" (también denominado en esta invención "heterociclilo" y "heterocíclico" se refiere a un grupo cíclico saturado, insaturado o parcialmente insaturado sustituido (mono o polisustituido) o no sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y S, y que opcionalmente contiene además uno o más grupos CO. Los sustituyentes adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más grupos R 10 . El término "heterociclo" abarca tanto grupos heteroarilo como grupos heterocicloalquilo como se define a continuación.
[ 0 0 2 0 ] Como se usa en esta invención, el término "heteroarilo" se refiere a un grupo aromático C 2-12 sustituido (mono o polisustituido) o no sustituido, que comprende uno o más heteroátomos. Preferentemente, el grupo heteroarilo es un grupo aromático C 4-12 que comprende uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y S. Los grupos heteroarilo adecuados incluyen pirrol, pirazol, pirimidina, pirazina, piridina, quinolina, tiofeno, 1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, tiazol, oxazol, isotiazol, isooxazol, imidazol, furano y similares. De nuevo, los sustituyentes adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más grupos R 10 .
[0021] Como se usa en esta invención, el término "heterocicloalquilo" se refiere a un grupo alifático cíclico sustituido (mono o polisustituido) o no sustituido que contiene uno o más heteroátomos. Los grupos heterocicloalquilo preferidos incluyen piperidinilo, pirrolidinilo, piperazinilo, tiomorfolinilo y morfolinilo. Más preferentemente, el grupo heterocicloalquilo se selecciona de N-piperidinilo, N-pirrolidinilo, N-piperazinilo, N-tiomorfolinilo y N-morfolinilo. De nuevo, los sustituyentes adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más grupos R 10 .
[0022] Como se usa en esta invención, el término "aralquilo" incluye, pero no se limita a, un grupo que tiene funcionalidades tanto arilo como alquilo. A modo de ejemplo, el término incluye grupos en los que uno de los átomos de hidrógeno del grupo alquilo está reemplazado por un grupo arilo, por ejemplo, un grupo fenilo que tiene opcionalmente uno o más sustituyentes tales como halo, alquilo, alcoxi, hidroxi y similares.Los grupos aralquilo típicos incluyen bencilo, fenetilo y similares.
[0023] En una realización preferida de la invención, R 1 es Cl, Br, Me o F, más preferentemente, Cl.
[0024] En una realización preferida de la invención, R 2 es H.
[0025] En una realización preferida de la invención, Y es CR 11 .
[0026] En otra realización preferida de la invención, Y es N.
[0027] En una realización preferida de la invención, R 3 y R 4 son ambos H.
[0028] En una realización preferida de la invención, R 3 es H y R 4 es C(O)R 6 .
[0029] En una realización preferida de la invención, R6 es alquilo o alcoxi, más preferentemente, Me u OMe.
[0030] En una realización preferida de la invención, R 4 y R 5 están unidos para formar un grupo heterocíclico que está opcionalmente sustituido con uno o más grupos R 10 .
[0031] En una realización preferida de la invención, dicho compuesto es de fórmula (Ia), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
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donde R 1 , R 2 , R 3 y R 10 son como se ha definido anteriormente.
[0032] En una realización especialmente preferida de la invención, el compuesto de fórmula (I) se selecciona de los siguientes:
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(continuación)
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y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.
[0033] En una realización muy preferida de la invención, el compuesto de fórmula (I) se selecciona de los ejemplos 1, 3, 6 y 15 como se ha indicado anteriormente.
[0034] Aún más preferentemente, el compuesto de fórmula (I) se selecciona del ejemplo 1 y el ejemplo 15, más preferentemente del ejemplo 1, es decir, el compuesto 1-[(E)-[(2-clorofenil)metiliden]amino]-guanidina.
COMPUESTOS
[0035] Se describen compuestos de fórmulas (II), (III) o (IV), o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, como se ha definido anteriormente. Los aspectos preferidos de la invención se aplican mutatis mutandis. Los compuestos particularmente preferidos incluyen los ejemplos 7, 8 , 9, 13 y 16 como se describe en esta invención. APLICACIONES TERAPÉUTICAS
[0036] El solicicitante ha demostrado que los compuestos de fórmula (I) tienen aplicaciones terapéuticas potenciales en el tratamiento de trastornos asociados con la acumulación de proteínas mal plegadas. En particular, se ha demostrado que los compuestos de fórmula (I) tienen un efecto protector contra el estrés del retículo endoplasmático (RE) citotóxico y los trastornos relacionados con la edad.
[0037] También se describe en esta invención el uso de un compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente en la preparación de un medicamento para tratar un trastorno asociado con estrés por plegamiento incorrecto de proteínas y, en particular, con una acumulación de proteínas mal plegadas.
[0038] Como se usa en esta invención, la expresión "preparación de un medicamento" incluye el uso de uno o más de los compuestos descritos anteriormente directamente como medicamento además de su uso en un programa de seleccion de agentes activos adicionales o en cualquier etapa de la fabricación de dicho medicamento.
[0039] También se describe un procedimiento para tratar un trastorno asociado con el estrés por plegamiento incorrecto de proteínas y, en particular, con una acumulación de proteínas mal plegadas en un sujeto que lo necesita, comprendiendo dicho procedimiento administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente a dicho sujeto.
[0040] El término "procedimiento" se refiere a modos, medios, técnicas y procedimientos para realizar una tarea determinada, que incluyen, pero no limitados a, aquellos modos, medios, técnicas y procedimientos que se conocen o se desarrollan fácilmente a partir de modos, medios, técnicas y procedimientos conocidos por profesionales de las técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas y médicas.
[0041] En esta invención, el término "tratar" incluye abrogar, inhibir sustancialmente, ralentizar o revertir la progresión de una enfermedad o trastorno, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos de una enfermedad o trastorno o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos de una enfermedad o trastorno.
[0042] La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del compuesto que se administra que aliviará hasta cierto punto uno o más de los síntomas de la enfermedad o trastorno que se está tratando.
[0043] La respuesta de la proteína desplegada (UPR) es un componente del sistema de defensa celular contra las proteínas mal plegadas que adapta el plegamiento en el retículo endoplasmático (RE) a las condiciones cambiantes. La UPR se activa en respuesta a una acumulación de proteínas desplegadas o mal plegadas en el lumen del retículo endoplasmático. En este escenario, la UPR tiene dos objetivos principales: (i) restaurar la función normal de la célula deteniendo la traducción de proteínas, y (ii) activar las vías de señalización que conducen a una mayor producción de chaperonas moleculares involucradas en el plegamiento de proteínas. Si estos objetivos no se logran en un período de tiempo determinado, o la interrupción se prolonga, la UPR apunta hacia la apoptosis.
[0044] Los componentes aguas arriba de la UPR son las proteínas transmembrana residentes en ER IRE1, ATF 6 y PERK, que detectan defectos de plegamiento para reprogramar la transcripción y traducción de manera concertada y restaurar la proteostasis. IRE1 y ATF 6 activadas aumentan la transcripción de genes implicados en el plegamiento en RE, tales como los que codifican las chaperonas BiP y GRP94. La PERK activada atenúa la síntesis de proteínas global al fosforilar la subunidad del factor de iniciación de la traducción 2 (elF2a) en Ser51 mientras promueve la traducción del factor de transcripción ATF4. Este ultimo controla la expresión de CHOP, otro factor de transcripción, que a su vez promueve la expresión de PPP1 R15A/GADD34. PPP1 R15A, un efector de un bucle de retroalimentación negativo que termina la señalización UPR, recluta una subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1c) para desfosforilar elF2a, lo que permite que se reanude la síntesis de proteínas. La falla de la UPR contribuye a muchas condiciones patológicas que podrían corregirse con un estímulo adecuado de esta respuesta adaptativa. Los inhibidores selectivos de la elF2a fosfatasa PPP1R15A-PP1 inducida por estrés retardan la desfosforilación de elF2a y, en consecuencia, la síntesis de proteínas de forma selectiva en células estresadas, sin afectar la síntesis de proteínas en células no estresadas. Esto prolonga los efectos beneficiosos de la UPR. Una reducción transitoria de la síntesis de proteínas es beneficiosa para las células estresadas porque la disminución del flujo de proteínas sintetizadas aumenta la disponibilidad de chaperonas y, por lo tanto, protege del estrés por plegamiento incorrecto (P. Tsaytler, H. P. Harding, D. Ron y A. Bertolotti, Science, 332, 1 de abril de 2011, 91-94). Los inhibidores no selectivos de las 2 elF2a fosfatasas pueden tener efectos indeseables, ya que la inhibición persistente de la traducción es perjudicial. De hecho, la ablación genética de PPP1R15Ay PPP1 R15B da como resultado una letalidad embrionaria temprana en ratones, lo que indica que la inibición de las dos elF2a fosfatasas PPP1R15A-PP1 y PPP1 R15B-PP1 es perjudicial en un contexto de organismo. Por el contrario, la ablación genética de PPP1 R15A no tiene consecuencias perjudiciales en ratones (Harding y col., 2009, Proc Natl Acad Sci USA, 106, 1832-1837). Además, se prevé que los inhibidores específicos de PPP1 R15A sean inertes en células no estresadas, ya que la PPP1 R15A no se expresa en ausencia de estrés. Por lo tanto, se prevé que los inhibidores selectivos de PPP1 R15A sean seguros. Los inhibidores no selectivos de las dos elF2a fosfatasas también pueden ser útiles para tratar enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas, cuando se usan en dosis que dan como resultado sólo una inhibición parcial de las fosfatasas.
[0045] La citoprotección contra el estrés del RE se puede medir mediante un ensayo adecuado. Por ejemplo, la citoprotección se puede medir en células HeLa en las que el estrés del RE se provoca mediante la adición de medios que contienen tunicamicina, una mezcla de antibióticos nucleósidos homólogos que inhibe la familia de enzimas UDP-HexNAc: poliprenol-P HexNAc-1-P y es utilizado para inducir la respuesta de la proteína deplegada. La viabilidad celular se puede detectar en presencia y ausencia de compuestos inhibidores después de un período de tiempo esablecido, midiendo la reducción de WST - 8 en formazán usando un kit de viabilidad celular estándar (tal como el kit de recuento de viabilidad celular 8 de Dojindo), La citoprotección del estrés del RE se mide en términos del porcentaje de aumento de células viables (en relación con el control) después del estrés del RE. En la sección de "Ejemplos" adjunta se exponen más detalles de un ensayo adecuado.
[0046] En una realización preferida de la invención, el compuesto de fórmula (I) es capaz de prolongar el efecto protector de la UPR en relación con el control (es decir, en ausencia del compuesto inhibidor) en al menos un 20 %, más preferentemente, al menos un 30 %, aún más preferentemente, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, más preferentemente todavía, al menos un 90 %.
[0047] El solicitante ha demostrado que los compuestos de fórmula (I) son inhibidores de la interaccion PPP1 R15A-PP1 que inducen un efecto protector. Preferentemente, el compuesto muestra un efecto protector con CE 50 inferior a 5 j M, aún más preferentemente, inferior a aproximadamente 2 j M, más preferentemente todavía, inferior a aproximadamente 1 j M. Preferentemente, el compuesto debería carecer de actividad adrenérgica alfa2. Por lo tanto, en una realización preferida de la invención, el compuesto no muestra ninguna actividad en un ensayo funcional alfa- 2 -adrenérgico.
[0048] El solicitante ha demostrado además que determinados compuestos de fórmula (I) inhiben selectivamente PPP1R15A-PP1, y, por lo tanto, prolongan el efecto protector de la UPR, rescatando así a las células del estrés por plegamiento incorrecto de proteínas. Los inhibidores de PPP1R15A-PP1 descritos, por lo tanto, tienen aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de una diversidad de enfermedades asociadas con el estrés por plegamiento incorrecto de proteínas y, en particular, con una acumulación de proteínas mal plegadas.
[0049] En una realización, el compuesto de fórmula (I) es capaz de inhibir PPP1 R15A y PPP1R15B.
[0050] En una realización preferida de la invencion, el compuesto de fórmula (I) es capaz de inhibir selectivamente PPP1R15A sobre PPP1R15B.
[0051] En una realización preferida de la invención, el compuesto de fórmula (I) es para su uso en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, y más específicamente donde la acumulación de proteínas mal plegadas está involucrada en el modo de acción (Brown y col, 2012, Frontiers in Physiology, 3, artículo 263).
[0052] En una realización particularmente preferida de la invención, el compuesto de fórmula (I) es para su uso en el tratamiento de un trastorno seleccionado de Charcot Marie Tooth, síndrome de Dejerine-Sottas grave (Voermans y col., 2012, J Peripher New Syst, 17(2), 223-5), una enfermedad de la retina (tales como, pero no restringidas a, retinitis pigmentosa, ciliopatías retinianas, degeneración macular, retinopatía diabética), enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Huntington, tauopatías, enfermedades priónicas, diabetes de tipo 2 y/o diabetes de tipo 1 y cáncer, tal como, pero no restringido a, mieloma multiple.
[0053] También se describe un compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con la ruta de fosforilación de elF2a donde la acumulación de proteínas mal plegadas está involucrada en el modo de acción. Preferentemente, el trastorno es una enfermedad o trastorno relacionado con PPP1 R15A. Los ejemplos de dichos trastornos incluyen enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas, tales como, pero no limitadas a, Charcot Marie Tooth, síndrome de Dejerine-Sottas grave y retinitis pigmentosa.
[0054] También se describe un compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente para su uso en el tratamiento de un trastorno causado, asociado o acompañado de fosforilacion de elF2a y/o actividad de PPP1 R15A donde la acumulación de proteínas mal plegadas está involucrada en el modo de acción.
[0055] También se describe un compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente para su uso en el tratamiento del trastorno de la UPR tal como, pero no limitado a, el envejecimiento (Naidoo y col., 2008, J Neurosci, 28, 6539-48).
[0056] Como se usa en esta invención, "enfermedad o trastorno relacionado con PPP1 R15A" se refiere a una enfermedad o trastorno caracterizado por una actividad anormal de PPP1R15Aen la que la acumulación de proteínas mal plegadas está involucrada en el modo de acción. La actividad anormal se refiere a: (i) expresión de PPP1 R15A en células que normalmente no expresan PPP1R15A; (ii) aumento de la expresión de PPP1 R15A; o, (iii) aumento de la actividad de PPP1 R15A.
[0057] También se describe un procedimiento para tratar a un mamífero que tiene una patología aliviada por la inhibición de PPP1R15A, donde la acumulación de proteínas mal plegadas está involucrada en el modo de acción, donde el procedimiento comprende administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente.
[0058] También se describe un inhibidor de PPP1 R15A de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso en el tratamiento de trastornos asociados con el estrés por plegamiento incorrecto de proteínas y, en particular, con una acumulación de proteínas mal plegadas y/o trastornos de UPR, donde dicho compuesto no tiene actividad agonista adrenérgica alfa2 o está reducida en comparación con Guanabenz.
[0059] También se describe un inhibidor de PPP1 R15A de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso en el tratamiento de trastornos asociados con el estrés por plegamiento incorrecto de proteínas y, en particular, con una acumulación de proteínas mal plegadas y/o trastornos de UPR, donde dicho compuesto no inhibe la traducción de proteínas en células no estresadas que expresan PPP1R15B.
[0060] También se describe un procedimiento para tratar un trastorno caracterizado por la actividad de respuesta al estrés del RE con una acumulación de proteínas mal plegadas, comprendiendo el procedimiento administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un compuesto de fórmula (I) donde dicho compuesto modula la respuesta al estrés del RE.
[0061] También se describe un inhibidor de PPP1 R15A de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso en el tratamiento de trastornos asociados con el estrés por plegamiento incorrecto de proteínas y, en particular, con una acumulación de proteínas mal plegadas y/o trastornos de UPR, donde dicho compuesto tiene una selectividad hacia la PPP1R15A-PP1 holofosfatasa, pero sin ninguna o actividad reducida hacia la PPP1R15B-PP1 holofosfatasa, y donde la relación (actividad hacia PPP1 R15A-PP1 holofosfatasa/actividad hacia PPP1R15B-PP1 holofosfatasa) para dicho compuesto es al menos igual o superior a la relación (actividad hacia PPP1R15A-PP1 holofosfatasa/actividad hacia PPP1R15B-PP1) para Guanabenz.
[0062] También se describe un inhibidor de PPP1 R15A de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso en el tratamiento de trastornos asociados con el estrés por plegamiento incorrecto de proteínas y, en particular, con una acumulación de proteínas mal plegadas y/o trastornos de UPR, donde:
- dicho compuesto tiene una actividad hacia la PPP1R15A-PP1 holofosfatasa, pero ninguna o actividad reducida hacia la PPP1 R15B-PP1 holofosfatasa, y;
- donde la relación (actividad hacia PPP1R15A-PP1 holofosfatasa/actividad hacia PPP1R15B-PP1) para dicho compuesto es al menos igual o superior a la relación (actividad hacia PPP1R15A-PP1 holofosfatasa/actividad hacia PPP1R15B-PP1) para Guanabenz; y
- donde dicho compuesto no tiene actividad agonista alfa2 adrenérgica o está reducida en comparación con Guanabenz.
[0063] Como se usa en esta invención, la enfermedad o trastorno caracterizado por la actividad de respuesta al estrés del RE, y/o la enfermedad o trastorno asociado con el estrés por plegamiento incorrecto de proteínas y, en particular, con una acumulación de proteínas mal plegadas y/o trastornos de UPR, se selecciona de Charcot Marie Tooth, síndrome de Dejerine-Sottas grave (Voermans y col., 2012, J Peripher New Syst, 17(2), 223-5), una enfermedad de la retina (tal como, pero no restringida a, retinosis pigmentosa, ciliopatías retinianas, degeneración macular, retinopatía diabética), enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Huntington, diabetes, tal como, pero no restringida a, diabetes de tipo 2 y cáncer, tal como, pero no restringido a, mieloma múltiple.
Charcot Marie Tooth
[0064] También se describe el compuesto de fórmula (I) para su uso en el tratamiento de Charcot Marie Tooth.
[0065] Más de 100 mutaciones en el gen que codifica la proteína cero de mielina (P0), una proteína transmembrana de un solo paso, que es la principal proteína producida por las células de Schwann mielinizantes, causa la neuropatía de Charcot-Marie-Tooth (D'Antonio y col., 2009, J Neurosci Res, 87, 3241-9). Las mutaciones se heredan predominantemente y causan la enfermedad a través de una ganancia de función tóxica (D'Antonio y col., 2009, J Neurosci Res, 87, 3241-9). La deleción de la serina 63 de P0 (POS63del) causa neuropatía de Charcot-Marie-Tooth 1B en seres humanos y una neuropatía desmielinizante similar en ratones transgénicos. La proteína mutante se acumula en el RE e induce la UPR (D'Antonio y col., 2009, J Neurosci Res, 87, 3241-9). La ablación genética de CHOP, un gen proapoptótico en la UPR restaura la función motora en ratones Charcot-Marie-Tooth (Pennuto y col., 2008, Neuron, 57, 393-405). El hallazgo de que la inhibición de PPP1 R15A en células casi anula la expresión de CHOP en células estresadas del RE indica que la inhibición genética o farmacológica de PPP1 R15A debería reducir la disfunción motora en ratones Charcot-Marie-Tooth. Recientemente, D'Antonio y col. (2013 J.Exp. Med Vol. págs 1­ 18) demostraron que los ratones POS63del tratados con salubrinal, una molécula pequeña que aumenta la fosforilación de elF2alfa (Boyce y col. 2005 Science vol. 307 págs. 935-939) recuperó la capacidad motora casi normal en el análisis de varilla giratoria y se acompañó de un rescate de anomalías morfológicas y electrofisiológicas. La acumulación del mutante relacionado con CMT en las proteínas RE no es exclusiva de POS63del; se han identificado al menos otros cinco mutantes P0 que se retienen en el RE y provocan una UPR (Pennuto y col., 2008 Neuron vol. 57 págs. 393-405; Saporta y col., 2012 Brain vol.135 págs. 2032-2047). Además, el plegamiento incorrecto de proteínas y la acumulación de proteínas mal plegadas en el RE se ha relacionado con la patogénesis de otras neuropatías de CMT como resultado de mutaciones en PMP22 y Cx32 (Colby y col., 2000 Neurobiol.Disease vol. 7 págs. 561-573; Kleopa y col., 2002 J. Neurosci. Res. vol. 68 págs. 522-534; Yum y col., 2002 Neurobiol. Dis. vol. 11 págs. 43-52). Sin embargo, Salubrinal es tóxico y no se puede utilizar para tratar pacientes humanos D'Antonio y col. (2013 J. Exp. Med vol. págs. 1-18). Por el contrario, se prevé que los inhibidores de PPP1 R15A de fórmula (I) sean seguros y podrían ser útiles para el tratamiento de CMT-1A y 1B.
Enfermedades de la retina
[0066] La bibliografía publicada recientemente ha proporcionado evidencias de que la UPR está involucrada en el desarrollo de la degeneración de la retina: degeneración retiniana hereditaria, tales como, ciliopatías retinianas y retinitis pigmentosa, degeneración macular, retinopatía de premadurez, degeneración retiniana inducida por luz, desprendimiento de retina, retinopatía diabética y glaucoma (para una revisión Gorbatyuk et Gorbatyuk 2013 - Retinal degeneration: Focus on the unfolded protein response (Degeneración de la retina: enfoque en la respuesta de la proteína desplegada), Molecular Vision vol. 19 págs. 1985-1998).
[0067] También se describe el compuesto de fórmula (I) para su uso en el tratamiento de enfermedades retinianas, más preferentemente, degeneración retiniana hereditaria, tales como, ciliopatías retinianas y retinitis pigmentosa, degeneración macular, retinopatía de premadurez, degeneración retiniana inducida por luz, desprendimiento de retina, retinopatía diabética y glaucoma.
[0068] Las ciliopatías retinianas son un grupo de trastornos genéticos raros que se originan por un defecto en el cilio primario de los fotorreceptores que inducen retinitis pigmentosa. Se ha informado que este defecto induce un estrés en el RE debido a la acumulación de proteínas en el segmento interno del fotorreceptor, que a su vez induce la UPR (documento WO2013/124484). La degeneración de la retina es una característica muy común en las ciliopatías que se puede observer tanto en la retinitis pigmentosa aislada, tal como, la amaurosis congénita o la retinitis pigmentosa ligada al cromosoma X, o también en condiciones sindrómicas como el síndrome de Bardet-Biedl (SBB) o el síndrome de Alstrom (SALM). La ciliopatía retiniana se selecciona del grupo que consiste en síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Senior-Loken, síndrome de Joubert, síndrome de Salidono-Mainzer, síndrome de Sensenbrenner, síndrome de Jeune, síndrome de Meckel-Gruder, síndrome de Alstrom, síndrome de MORM, amaurosis congénita de Leber causada por mutación en un gen ciliar y retinitis pigmentosa ligada al cromosoma X causada por mutación en el gen RPGR.
[0069] La retinitis pigmentosa es una enfermedad ocular degenerativa hereditaria que causa una discapacidad visual grave y, a menudo, ceguera. Es la causa más común de ceguera determinada genéticamente. Las personas que la padecen experimentarán uno o más de los siguientes síntomas: ceguera nocturna; visión de túnel (sin visión periférica); visión periférica (sin visión central); visión de celosia; aversión al deslumbramiento; ajuste lento de ambientes oscuros a claros y viceversa; visión borrosa; mala separación de colores y cansancio extremo.
[0070] La evidencia emergente respalda el papel del estrés de RE en la apoptosis retiniana y la muerte celular (Jing y col., 2012, Exp Diabetes Res, 2012, 589589). La retinitis pigmentosa (RP) es la forma más común de degeneración retiniana hereditaria causada por más de 100 mutaciones en el gen de la rodopsina (Dryja y col., 1991, Proc Natl Acad Sci USA, 88, 9370-4). La rodopsina es un receptor acoplado a proteína G que transduce la luz en los fotorreceptores de los bastones y consiste en un complejo covalente entre la proteína transmembrana opsina de 348 aminoácidos, unida covalentemente al 11-c/s retinal (Palczewski, 2006, Annu Rev Biochem, 75, 743-67). Las mutaciones de rodopsina que causan RP son en su mayoría mutaciones sin sentido distribuidas por toda la proteína (Dryja y col., 1991, Proc Natl Acad Sci USA, 88, 9370-4), similar a las mutaciones de SOD1 que causan ELA(Valentine y col., 2005, Annu Rev Biochem, 74, 563-93). Los mutantes de rodopsina que causan RP se han estudiado en diversos sistemas y los resultados de la expresión heteróloga de las proteínas en células de mamíferos, en ratones transgénicos y drosophila son consistentes (Griciuc y col., 2011, Trends Mol Med, 17, 442-51). Las rodopsinas causantes de RP más prevalentes están mal plegadas, no se unen al 11-c/s-retinal, no acanzan la superficie celular pero se retienen en el r E (Griciuc y col., 2011, Trends Mol Med, 17, 442-51). El plegamiento incorrecto de los mutantes de rodopsina causa estrés en el RE y muerte de las células de los bastones (Griciuc y col., 2011, Trends Mol Med, 17, 442-51). Esto sugiere fuertemente que los inhibidores de PPP1 R15A descritos en esta invención serán útiles para tratar la RP.
[0071] Degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) es la principal causa de ceguera legal entre las personas mayores de 65 años en los Estados Unidos. Se informó que la DMAE representa el 54 % de todos los casos actuales de ceguera entre la población caucásica en los Estados Unidos. El estudio predijo que, como resultado de la creciente prevalencia de DMAe , el número de personas ciegas en los EE.UU. podría aumentar hasta un 70 % para 2020.
[0072] Shen y col. (2011 Effect of Guanabenz on Rat AMD Models and Rabbit Choroidal Blood (Efecto de Guanabenz en modelos DMAE de rata y sangre coroidea de conejo 2011- vol. 5 págs. 27-31) demostró que Guanabenz protegió significativamente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) de la degeneración inducida por NalO3, inhibió el desarrollo de neovascularización coroidea (NVC) en un modelo DMAE de rata inducido por láser y aumentó el flujo sanguíneo coroideo notablemente /n v/vo.
[0073] Sin embargo, Guanabenz es un receptor adrenérgico alfa2 y, debido a su actividad hipotensora, no puede usarse para tratar la degeneración macular o retiniana.
[0074] Los compuestos descritos en esta invención son inhibidores de PPP1R15A como Guanabenz, pero que ventajosamente no muestran actividad hacia el receptor adrenérgico alfa2A mejorarán la degeneración macular o retiniana.
Enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, ELA, enfermedad de Huntington, tauopatías y enfermedades priónicas
[0075] También se describe el compuesto de fórmula (I) para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, ELA, enfermedad de Huntington, tauopatías y enfermedades priónicas.
[0076] Debido a que la acumulación de proteínas mal plegadas es un sello distintivo de diversas enfermedades y una vez demostrado que el compuesto de fórmula (I) reduce la acumulación de 4 proteínas mal plegadas no relacionadas y que causan enfermedades (figura 4-6), el compuesto de fórmula (I) también sera útil para tratar otras enfermedades neurodegenerativas provocadas por la acumulación de proteínas mal plegadas.
[0077] Además, como la inducción de la UPR es un sello distintivo de estas enfermedades causadas por la acumulación de proteínas mal plegadas, el compuesto de fórmula (I) sera útil para tratar estas enfermedades. (Scheper y Hoozemans 2009; Kim y col. 2008).
[0078] Guanabenz reduce los síntomas de los ratones infectados con priones (D. Tribouillard-Tanvier y col., 2008 PLoS One 3, e1981). Sin embargo, Guanabenz no es útil para el tratamiento de enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas humanas debido a su actividad hipotensora. Por el contrario, los inhibidores de PPP1 R15A, que carecen de actividad adrenérgica alfa2, y descritos en esta invención, podrían ser útiles para tratar enfermedades priónicas.
Enfermedad de Parkinson (EP)
[0079] Salubrinal inhibe la desfosforilación de elF2a mediada por PPP1 R15A (Boyce y col. 2005 Science vol.
307 pág. 935-939). Recientemente, Colla y col. (J. of Neuroscience 20l2 vol. 32 n.° 10 págs. 3306-3320) demostraron que Salubrinal atenúa significativamente las manifestaciones de la enfermedad en dos modelos animales de alfasinucleinopatía.
[0080] Sin quedar ligado a teoría alguna, se anticipa que los compuestos descritos en esta invención que son inhibidores de PPp1R15A mejorarán las manifestaciones de la enfermedad de alfa-sincleinopatías tales como la enfermedad de Parkinson.
Esclerosis lateral amiotrófica (ELA)
[0081] Saxena y col. (Nature Neuroscience 2009 vol. 12 págs. 627-636) demostraron que Salubrinal extiende la vida útil de un modelo de ratón transgénico G93A-SOD1 de enfermedad de la neurona motora. Sin quedar ligado a teoría alguna, se anticipa que los compuestos descritos en esta invención que son inhibidores de PPP1 R15A mejorarán las manifestaciones de la enfermedad de ELA con la mutación G93A de SOD1. Más de 140 mutaciones, en su mayoría sin sentido, en el gen SOD1 provocan la agregación de la proteína afectada en formas familiares de esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Debido a que diversos mutantes de SOD1 comparten defectos comunes (Munch y col. 2010), se acepta que diversos mutantes de SOD1 causan ELA por un mecanismo común. Además, las manifestaciones clínicas se comparten entre las formas esporádicas y familiares de las enfermedades, y ahora se reconoce bien que el plegamiento incorrecto de las proteínas juega un papel central en la ELA tanto familiar como esporádica. Por lo tanto, los compuestos de fórmula (I) pueden usarse para tratar formas familiares y esporádicas de ELA.
[0082] El solicitante ha descubierto que la actividad citoprotectora de guanabenz sobre el estrés por plegamiento incorrecto de proteínas es sorprendentemente amplia ya que guanabenz también reduce la acumulación de huntingtina mutante en las células (documento WO 2008/041133). Este hallazgo es inesperado ya que la huntingtina mutante es citosólica o nuclear. Sin embargo, existe evidencia de que el metabolismo de la huntingtina mutante se ha relacionado previamente con la respuesta al estrés del RE (Nishitoh y col., 2002, Genes Dev, 16, 1345­ 55; Rousseau y col., 2004, Proc Natl Acad Sci Us a , 101, 9648-53; Duennwald y Lindquist, 2008, Genes Dev, 22, 3308-19). Los hallazgos del solicitante de que guanabenz protege a las células del estrés citotóxico del RE y reduce la acumulación de huntingtina mutante respalda aún más la idea de que puede haber aspectos de la respuesta al estrés del RE que repercutan en la acumulación de huntingtina mutante.
Además, la disfunción de la respuesta al estrés del RE ha estado involucrada en una diversidad de patologías, incluida la diabetes de tipo 2 y la neurodegeneración (Scheper y Hoozemans, 2009, Curr Med Chem, 16, 615-26). Por lo tanto, sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que guanabenz y compuestos relacionados tienen un efecto protector contra trastornos secundarios de la UPR, es decir, trastornos debidos a la acumulación de una proteína mal plegada no residente en RE, que induce la UPR.
Diabetes
[0083] También se describe el compuesto de fórmula (I) para su uso en el tratamiento de la diabetes, más preferentemente la diabetes de tipo 2.
[0084] Las células p secretoras de insulina en el páncreas tienen una carga biosintética pesada y estrictamente regulada que consiste en la secrección de insulina. Por lo tanto, estas células tienen una necesidad importante de mantener la homeostasis del RE (Back y Kaufman, 2012, Annu Rev Biochem, 81, 767-93). La diabetes de tipo 2 se manifiesta por un aumento de los niveles de glucosa en sangre debido a la resistencia a la insulina en el tejido adiposo, muscular y hepático y/o secrección alterada de insulina de las células p pancreáticas. Como respuesta, la masa de células p aumenta y se mejora su función. En última instancia, la carga sobre las células p es demasiado alta, lo que lleva a su progresiva disminución y muerte. Cada vez hay más pruebas que revelan que la muerte de las células p se debe al estrés del RE (Back y Kaufman, 2012, Annu Rev Biochem, 81,767-93). Es importante destacar que la deleción de Chop mejora la función de las 3 células en diversos modelos de diabetes (Song y col., 2008, J Clin Invest, 118, 3378-89). Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que los inhibidores de PPP1R15A-PP1 mejorarán la función de las células p en la diabetes de tipo 2, ya que la inhibición de PPP1R15A-PP1 reduce los niveles de la proteína proapoptótica CHOP durante el estrés del RE (Tsaytler y col., 2011, Science, 332, 91-4).
Cáncer
[0085] También se describe el compuesto de fórmula (I) para su uso en el tratamiento del cáncer.
[0086] Las células cancerosas tienen una alto requerimiento metabólico y su proliferación depende de una síntesis de proteínas eficiente. El inicio de la traducción juega un papel crucial en el control de la homeostasis, diferenciación, proliferación y transformación maligna de las proteínas. El aumento del inicio de la traducción contribuye al inicio del cáncer y, a la inversa, la disminución del inicio de la traducción podría reducir el crecimiento tumoral (Donze y col., 1995, EMb O J, 14, 3828-34; Pervin y col., 2008, Cancer Res, 68, 4862-74; Chen y col., 2011, Nat Chem Biol, 7, 610-6). Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que la inhibición de PPP1 R15A podría reducir selectivamente la traducción en células tumorales y así reducir el crecimiento tumoral.
Envejecimiento
[0087] Se sabe que el envejecimiento afecta las respuestas al estrés y, en particular, la UPR se ve afectada con la edad (Naidoo y col., 2008, J Neurosci, 28, 6539-48). Por lo tanto, prolongar el efecto beneficioso de la UPR mediante la inhibición de elF2a fosfatasa podría mejorar los trastornos relacionados con la edad.
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
[0088] Para su uso según la presente invención, los compuestos o sales fisiológicamente aceptables, ésteres u otros derivados fisiológicamente funcionales de los mismos, descritos en esta invención, pueden presentarse como una formulación farmacéutica, que comprende los compuestos o la sal fisiológicamente aceptable, éster u otro derivado fisiológicamente funcional de los mismos, junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, por lo tanto y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos y/o profilácticos. El portador o portadores deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor de los mismos. Las composiciones farmacéuticas pueden ser para uso humano o animal en medicina humana y veterinaria.
[0089] Se pueden encontrar ejemplos de dichos excipientes adecuados para las diversas formas diferentes de composiciones descritas en esta invención en "Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2a edición, (1994), editado por A Wade y PJ Weller.
[0090] Los portadores o diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (AR Gennaro edit. 1985).
[0091] Los ejemplos de portadores adecuados incluyen lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol, sorbitol y similares. Los ejemplos de diluyentes adecuados incluyen glicerol y agua.
[0092] La elección del portador, excipiente o diluyente farmacéutico puede seleccionarse con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como, o además de, el portador, excipiente o diluyente cualquier aglutinante o aglutinantes, agente o agentes de suspensión, agente o agentes de recubrimiento, agente o agentes solubilizantes, tampón o tampones, agente o agentes aromatizantes, agente o agentes tensioactivos, espesante o espesantes, conservante o conservantes (incluidos los antioxidantes) y similares, y sustancias incluidas con el fin de hacer que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto.
[0093] Los ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como arábiga, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol.
[0094] Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares.
[0095] En la composición farmacéutica se pueden proporcionar conservantes, estabilizadores, colorantes e incluso agentes aromatizantes. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. También se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión.
[0096] Las formulaciones farmacéuticas incluyen aquellas adecuadas para administración oral, tópica (incluyendo dérmica, bucal, ocular y sublingual), rectal o parenteral (incluyendo subcutánea, intradérmica, intramuscular e intravenosa), nasal, intraocular y pulmonar, por ejemplo, por inhalación. La formulación puede, cuando sea apropiado, presentarse convenientemente en unidades de dosificación discretas y puede prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Todos los procedimientos incluyen la etapa de asociar un compuesto activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos y a continuación, si es necesario, dar forma al producto en la formulación deseada.
[0097] Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral donde el portador es un sólido se presentan más preferentemente como formulaciones de dosis unitaria tales como bolos, cápsulas o comprimidos que contienen cada uno una cantidad predeterminada de compuesto activo. Un comprimido puede prepararse por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos comprimidos pueden prepararse comprimiendo en una máquina adecuada un compuesto activo en una forma fluida tal como un polvo o gránulos opcionalmente mezclados con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, agente lubricante, agente tensioactivo o agente dispersante. Los comprimidos moldeados se pueden preparar moldeando un compuesto activo con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden estar opcionalmente recubiertos y, si no están recubiertos, opcionalmente pueden marcarse. Las cápsulas se pueden preparar llenando un compuesto activo, ya sea solo o mezclado con uno o más ingredientes accesorios, en las cubiertas de las cápsulas y a continuación sellarlas de la manera habitual. Las obleas son análogas a las cápsulas donde un compuesto activo junto con cualquier ingrediente o ingredientes accesorios se sellan en un sobre de papel de arroz. También se puede formular un compuesto activo en forma de gránulos dispersables, que, por ejemplo, se pueden suspender en agua antes de la administración o se pueden rociar sobre los alimentos. Los gránulos pueden envasarse, por ejemplo, en una bolsita. Las formulaciones adecuadas para la administración oral donde el portador es un líquido pueden presentarse como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida de aceite en agua.
[0098] Las formulaciones para administración oral incluyen formas de dosificación de liberación controlada, por ejemplo, comprimidos donde un compuesto activo se formula en una matriz de control de liberación apropiada o se recubre con una película de control de liberación adecuada. Dichas formulaciones pueden ser particularmente convenientes para uso profiláctico.
[0099] Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración rectal donde el portador es un sólido se presentan más preferentemente como supositorios de dosis unitaria. Los portadores adecuados incluyen manteca de cacao y otros materiales comúnmente usados en la técnica. Los supositorios pueden formarse convenientemente mediante la mezcla de un compuesto activo con el portador o portadores ablandados o fundidos seguido de enfriamiento y conformación en moldes.
[0100] Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones o suspensions estériles de un compuesto activo en vehículos acuosos u oleaginosos.
[0101] Las formulaciones farmacéuticas son adecuadas para la administración oftálmica, en particular, para la administración intraocular, ocular tópica o periocular, más preferentemente para la administración tópica ocular o periocular.
[0102] Las preparaciones inyectables pueden adaptarse para inyección en bolo o infusión continua. Dichas preparaciones se presentan convenientemente en envases de dosis unitaria o dosis múltiples que se sellan después de la introducción de la formulación hasta que se requiera para su uso. De forma alternativa, un compuesto activo puede estar en forma de polvo que se constituye con un vehículo adecuado, tal como agua estéril libre de priógenos, antes de su uso.
[0103] También se puede formular un compuesto activo como preparaciones de depósito de acción prolongada, que se pueden administrar mediante inyección intramuscular o mediante implantación, por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular. Las preparaciones de depósito pueden incluir, por ejemplo, materiales poliméricos o hidrófobos adecuados o resinas de intercambio iónico. Dichas formulaciones de acción prolongada son particularmente convenientes para uso profiláctico.
Las formulaciones adecuadas para la administración pulmonar a través de la cavidad bucal se presentan de tal manera que las partículas que contienen un compuesto activo y que deseablemente tienen un diámetro en el intervalo de 0,5 a 7 micrómetros se suministran en el árbol bronquial del receptor. Como una posibilidad, dichas formulaciones están en forma de polvos finamente triturados que pueden presentarse convenientemente en una cápsula perforable, adecuadamente de, por ejemplo, gelatina, para su uso en un dispositivo de inhalación, o de forma alternativa como una formulación autopropulsada que comprende un compuesto activo, un propulsor líquido o gaseoso adecuado y, opcionalmente, otros ingredientes tales como un tensioactivo y/o diluyente sólido. Los propulsores líquidos adecuados incluyen propano y los clorofluorocarbonos, y los propulsores gaseosos adecuados incluyen dióxido de carbono. También se pueden emplear formulaciones autopropulsadas donde se dispensa un compuesto activo en forma de gotitas de solución o suspensión.
[0104] Dichas formulaciones autopropulsadas son análogas a las conocidas en la técnica y pueden prepararse mediante procedimientos establecidos. Adecuadamente, se presentan en un recipiente provisto de una válvula de funcionamiento manual o automático que tiene las características de pulverización deseadas; ventajosamente, la válvula es de tipo medido que suministra un volumen fijo, por ejemplo, de 25 a 100 microlitros, en cada operación de la misma.
[0105] Como posibilidad adicional, un compuesto activo puede estar en forma de solución o suspensión para su uso en un atomizador o nebulizador mediante el cual se emplea una corriente de aire acelerada o agitación ultrasónica para producer una fina bruma de gotitas para inhalación.
[0106] Las formulaciones adecuadas para administración nasal incluyen preparaciones generalmente similares a las descritas anteriormente para administración pulmonar. Cuando se dispensan, dichas formulaciones deben tener deseablemente un diámetro de partícula en el intervalo de 10 a 200 micrómetros para permitir la retención en la cavidad nasal; esto se puede lograr mediante, según sea apropiado, el uso de un polvo de un tamaño de partícula adecuado o la elección de una válvula apropiada. Otras formulaciones adecuadas incluyen polvos gruesos que tienen un diámetro de partícula en el intervalo de 20 a 500 micrómetros, para administración por inhalación rápida a través del pasaje nasal desde un recipiente cerca de la nariz, y comprendiendo las gotitas nasales del 0,2 al 5 % p/v de un compuesto activo en solución o suspension acuosa u oleosa.
[0107] Los portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, pero no se limitan a, tampón fosfato 0,1 M y preferentemente 0,05 M o solución salina al 0,8 %. Además, dichos portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tal como el aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tal como el oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo medios salinos y tamponados. Los vehículos parentales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactato o aceites fijos. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares.
[0108] Las formulaciones adecuadas para la formulación tópica se pueden proporcionar, por ejemplo, como geles, cremas o ungüentos. Dichas preparaciones se pueden aplicar, por ejemplo, a una herida o úlcera, ya sea directamente extendidas sobre la superficie de la herida o úlcera o llevadas sobre un soporte adecuado tal como un vendaje, gasa, malla o similar que se puede aplicar en o sobre el área a tratar.
[0109] También se pueden proporcionar formulaciones líquidas o en polvo que se pueden pulverizar o rociar directamente sobre el sitio a tratar, por ejemplo, una herida o úlcera. De forma alternativa, se puede pulverizar o rociar con la formulación un portador tal como un vendaje, gasa, malla o similar y a continuación aplicarlo en el sitio a tratar.
[0110] Se describe un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica o veterinaria como se ha descrito anteriormente, comprendiendo el procedimiento asociar el compuesto o compuestos activos con el portador, por ejemplo mediante mezcla.
[0111] En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el agente activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y a continuación, si es necesario, dar forma al producto. Se describen procedimientos para preparar una composición farmacéutica que comprende llevar un compuesto de fórmula general (I) junto o en asociación con un portador o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.
SALES/ÉSTERES
[0112] Los compuestos descritos en esta invención pueden estar presentes como sales o ésteres, en particular sales o ésteres farmacéutica y veterinariamente aceptables.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en esta invención incluyen sales de adición de ácido o de base adecuadas de los mismos. Se puede encontrar una revisión de las sales farmacéuticas adecuadas en Berge y col, J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977). Las sales se forman, por ejemplo, con ácidos inorgánicos fuertes tales como ácidos minerales, por ejemplo, ácidos halohídricos tales como clorhidrato, bromhidrato y yodhidrato, ácido sulfúrico, sulfato de ácido fosfórico, bisulfato, hemisulfato, tiocianato, persulfato y ácidos sulfónicos; con ácidos carboxílicos orgánicos fuertes, tales como ácidos alcanocarboxílicos de 1 a 4 átomos de carbono que están sin sustituir o sustituidos (por ejemplo, con halógeno), tales como ácido acético; con ácidos dicarboxílicos saturados o insaturados, por ejemplo, oxálico, malónico, succínico, maleico, fumárico, Itálico o tetraftálico; con ácidos hidroxicarboxílicos, por ejemplo ácido ascorbico, glicólico, láctico, málico, tartárico o cítrico; con aminoácidos, por ejemplo ácido aspártico o glutámico; con ácido benzoico; o con ácidos sulfónicos orgánicos, tales como ácidos (C-rC^-alquilsulfónicos o arilsulfónicos que están sin sustituir o sustituidos (por ejemplo, con un halógeno) tales como ácido metanosulfónico o p-toluenosulfónico. Las sales que no son farmacéuticamente o veterinariamente aceptables aún pueden ser valiosas como productos intermedios.
[0113] Las sales preferidas incluyen, por ejemplo, acetato, trifluoroacetato, lactato, gluconato, citrato, tartrato, maleato, malato, pantotenato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, butirato, diglocunato, ciclopentanato, glucoheptanato, glicerofosfato, oxalato, heptanoato, hexanoato, fumarato, nicotinato, palmoato, pectinato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, proprionato, tartrato, lactobionato, pivolato, camforato, undecanoato y succinato, ácidos sulfónicos orgánicos tales como metanosulfonato, etanosulfonato, 2-hidroxietanosulfonato, camforsulfonato, 2-naftalenosulfonato, bencenosulfonato, p-clorobenzenosulfonato y p-toluenosulfonato; y ácidos inorgánicos tales como clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, bisulfato, hemisulfato, tiocianato, persulfato, ácidos fosfórico y sulfónico.
[0114] Los ésteres se forman utilizando ácidos orgánicos o alcoholes/hidróxidos, dependiendo del grupo funcional que se esté esterificando. Los ácidos orgánicos incluyen ácidos carboxílicos, tales como ácidos alcanocarboxílicos de 1 a 12 átomos de carbono que están sin sustituir o sustituidos (por ejemplo, con halógeno), tales como ácido acético; con ácido dicarboxílico saturado o insaturado, por ejemplo oxálico, malónico, succínico, maleico, fumárico, ftálico o tetraftálico; con ácidos hidroxicarboxílicos, por ejemplo ácido ascórbico, glicólico, láctico, málico, tartárico o cítrico; con aminoácidos, por ejemplo ácido aspártico o glutámico; con ácido benzoico; o con ácidos sulfónicos orgánicos, tales como (C 1 -C 4 )-alquilsulfónicos o arilsulfónicos que están sin sustituir o sustituidos (por ejemplo, con un halógeno) tales como ácido metanosulfónico o p-toluenosulfónico. Los hidróxidos adecuados incluyen hidróxidos inorgánicos, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, hidróxido de aluminio. Los alcoholes incluyen alcanoalcoholes de 1 a 12 átomos de carbono que pueden estar sin sustituir o sustituidos (por ejemplo, con un halógeno).
ENANTIÓMEROS/TAUTÓMEROS
[0115] En todos los aspectos de la presente invención analizados anteriormente, la invención incluye, cuando sea apropiado, todos los enantiómeros, diastereoisómeros y tautómeros de los compuestos descritos en esta invención. El experto en la materia reconocerá compuestos que poseen propiedades ópticas (uno o más átomos de carbono quirales) o características tautoméricas. Los enantiómeros y/o tautómeros correspondientes pueden aislarse/prepararse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los enantiómeros se caracterizan por la configuración absoluta de sus centros quirales y se describen mediante las reglas de secuenciación de Cahn, Ingold y Prelog. Dichas convenciones son bien conocidas en la técnica (por ejemplo, véase 'Advanced Organic Chemistry', 3a edición, ed. March, J., John Wiley y Sons, Nueva York, 1985).
[0116] Por lo tanto, los compuestos de fórmula (I) también incluyen las formas de tautómero de fórmula:
Figure imgf000016_0001
[0117] Como ejemplo ilustrativo, una forma de tautómero del ejemplo 1 es:
Figure imgf000017_0001
[0118] Los compuestos descritos en esta invención que contienen un centro quiral pueden usarse como una mezcla racémica, una mezcla enriquecida enantioméricamente, o la mezcla racémica puede separarse usando técnicas bien conocidas y puede usarse un enantiómero individual solo.
ESTEREOISÓMEROS E ISÓMEROS GEOMÉTRICOS
[0119] Algunos de los compuestos descritos en esta invención pueden existir como estereoisómeros e/o isómeros geométricos, por ejemplo, pueden poseer uno o omás centros asimétricos y/o geométricos y, por lo tanto, pueden existir en dos o más formas estereoisoméricas y/o geométricas. La presente invención contempla el uso de todos los estereoisómeros e isómeros geométricos individuales de esos agentes inhibidores y mezclas de los mismos.
Los términos utilizados en las reivindicaciones abarcan estas formas, siempre que dichas formas conserven la actividad funcional apropiada (aunque no necesariamente en el mismo grado).
[0120] La presente invención también incluye todas las variaciones isotópicas adecuadas del agente o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Una variación isotópica de un agente de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se define como aquella en la que al menos un átomo se reemplaza por un átomo que tiene el mismo número atómico pero una masa atómica diferente de la masa atómica que normalmente se encuentra en la naturaleza. Los ejemplos de isótopos que pueden incorporarse al agente y sus sales farmacéuticamente aceptables incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, flúor y cloro tales como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S,18F y 36Cl, respectivamente. isotópicas del agente y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo, por ejemplo, aquellas en las que se incorpora un isótopo radiactivo tal como 3H o 14C, son útiles en estudios de distribución de fármacos y/o sustratos en
tejidos. Los isótopos tritiados, es decir, 3H, y carbono-14, es decir, 14C, son particularmente preferidos por su facilidad
de preparación y detectabilidad. Además, la sustitución con isótopos tales como el deuterio, es decir, 2H, puede proporcionar determinadas ventajas terapéuticas como resultado de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, semivida in vivo aumentada o requisitos de dosificación reducidos y, por lo tanto, puede ser preferible en algunas circunstancias. Por ejemplo, la invención incluye compuestos de fórmula general (I) donde cualquier átomo de hidrógeno ha sido reemplazado por un átomo de deuterio. Las variaciones isotópicas del agente de la presente invención y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo de la presente invención se pueden preparar generalmente mediante procedimientos convencionales usando variaciones isotópicas apropiadas de reactivos adecuados.
PROFÁRMACOS
[0121] La invención incluye además los compuestos descritos en esta invención en forma de profármaco, es decir, compuestos unidos covalentemente que liberan el fárma
Dichos profármacos son generalmente compuestos de la invención donde uno o más grupos apropiados se han modificado de manera que la modificación puede revertirse tras la administración a un sujeto humano o mamífero. La reversión se realiza habitualmente mediante una enzima presente de forma natural en dicho sujeto, aunque es posible administrar un segundo agente junto con dicho profármaco para realizar la reversión in vivo. Los ejemplos de dichas modificaciones incluyen éster (por ejemplo, cualquiera de los descritos anteriormente), donde la reversión puede
llevarse a cabo con una esterasa, etc. Otros de dichos sistemas serán bien conocidos por los expertos en la materia.
SOLVATOS
[0122] La presente invención también incluye formas solvatos de los compuestos descritos en esta invención.
Los términos utilizados en las reivindicaciones abarcan estas formas.
POLIMORFOS
[0123] La invención se refiere además a los compuestos descritos en esta invención en sus diversas formas cristalinas, formas polimórficas y formas (an)hidras. Está bien establecido dentro de la industria farmacéutica que los compuestos químicos pueden aislarse en cualquiera de dichas formas variando ligeramente el procedimiento de purificación y/o aislamiento 1 de los disolventes usados en la preparación sintética de dichos compuestos.
ADMINISTRACIÓN
[0124] Las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención pueden adaptarse para administración rectal, nasal, intrabronquial, tópica (que incluye administración bucal, sublingual y oftálmica, en particular para administración intraocular, ocular tópica o periocular), vaginal o parenteral (que incluye administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial e intradérmica), intraperitoneal o intratecal. Preferentemente, la formulación es una formulación administrada por vía oral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria, es decir, en forma de porciones discretas que contienen una dosis unitaria, o un múltiplo o subunidad de una dosis unitaria. A modo de ejemplo, las formulaciones pueden estar en forma de comprimidos y cápsulas de liberación sostenida, y pueden prepararse mediante cualquier procedimiento bien conocido en la técnica de la farmacia.
[0125] Las formulaciones para administración oral se pueden presentar como: unidades discretas tales como cápsulas, geles, gotas, obleas, píldoras o comprimidos que contienen cada uno una cantidad predeterminada del agente activo; como polvo o gránulos; como una solución, emulsión o una suspensión del agente activo en un líquido acuoso o un líquido no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite; o como un bolo, etc. Preferentemente, estas composiciones contienen de 1 a 250 mg y más preferentemente de 10-100 mg de ingrediente activo por dosis.
[0126] Para composiciones para administración oral (por ejemplo, comprimidos y cápsulas), la expresión "portador aceptable" incluye vehículos tales como excipientes comunes, por ejemplo, agentes aglutinantes, por ejemplo, jarabe, goma arábiga, gelatina, sorbitol, tragacanto, polivinilpirrolidona (povidona), metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropilmetilcelulosa, sacarosa y almidón; cargas y portadores, por ejemplo almidón de maíz, gelatina, lactosa, sacarosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, fosfato dicálcico, cloruro de sodio y ácido algínico; y lubricantes tales como estearato de magnesio, estearato de sodio y otros estearatos metálicos, estearato de glicerol, ácido esteárico, fluido de silicona, ceras de talco, aceites y sílice coloidal. También se pueden usar agentes aromatizantes tales como menta, aceite de gaulteria, aroma de cereza y similares. Puede ser deseable añadir un agente colorante para que la forma de dosificación sea fácilmente identificable. Los comprimidos también se pueden recubrir mediante procedimientos bien conocidos en la técnica.
[0127] Un comprimido puede prepararse por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos comprimidos se pueden preparar comprimiendo en una máquina adecuada el agente activo en una forma fluida tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, agente tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados se pueden preparar moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos se pueden recubrir o ranurar opcionalmente y se pueden formular para proporcionar una liberación lenta o controlada del agente activo.
[0128] Otras formulaciones adecuadas para la administración oral incluyen pastillas que comprenden el agente activo en una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto; pastillas que comprenden el agente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y arábiga; y enjuagues bucales que comprenden el agente activo en un portador líquido adecuado.
[0129] Otras formas de administración comprenden soluciones o emulsiones que pueden inyectarse por vía intravenosa, intraarterial, intratecal, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intraocular, tópica, periocular o intramuscular, y que se preparan a partir de soluciones estériles o esterilizables. Las formas inyectables contienen típicamente entre 10-1000 mg, preferentemente entre 10-250 mg de ingrediente activo por dosis.
[0130] Las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención también pueden estar en forma de supositorios, pesarios, suspensiones, emulsiones, lociones, ungüentos, cremas, geles, pulverizadores, soluciones o polvos para uso externo.
[0131] Un medio alternativo de administración transdérmica es mediante el uso de un parche cutáneo. Por ejemplo, el ingrediente activo se puede incorporar a una crema que consiste en una emulsión acuosa de polietilenglicoles o parafina líquida. El ingrediente activo también se puede incorporar, en una concentración de entre el 1 y el 10 % en peso, en un ungüento que consiste en una cera blanca o una base de parafina blanda blanca junto con los estabilizadores y conservantes que se requieran.
DOSIFICACIÓN
[0132] Un experto en la materia puede determinar fácilmente una dosis apropiada de una de las presentes composiciones para administrar a un sujeto sin una experimentación indebida. Típicamente, un médico determinará la dosificación real que será más adecuada para un paciente individual y dependerá de una diversidad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y la duración de la acción de ese compuesto, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, modo y momento de administración, tasa de excreción, combinación de fármacos, la gravedad de la afección particular y el individuo que se somete a la terapia. Las dosificaciones descritas en esta invención son ejemplares del caso medio. Por supuesto, puede haber casos individuales en los que se necesiten intervalos de dosificación más altos o más bajos.
[0133] Puede administrarse una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula general (I) para dirigirse a una afección o enfermedad particular. Por supuesto, esta cantidad de dosificación se modificará adicionalmente según el tipo de administración del compuesto. Por ejemplo, para lograr una "cantidad efectiva" para la terapia aguda, se prefiere la administración parenteral de un compuesto de fórmula general (1). Una infusion intravenosa del compuesto en dextrosa al 5 % en agua o solución salina normal, o una formulación similar con excipientes adecuados, es más eficaz, aunque también es útil una inyección en bolo intramuscular. Típicamente, la dosis parenteral será de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg/kg; preferentemente entre 0,1 y 20 mg/kg, de manera que se mantenga la concentración de fármaco en el plasma a una concentración efectiva.Los compuestos se pueden administrar de una a cuatro veces al día a un nivel para lograr una dosis diaria total de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 400 mg/kg/día. La cantidad precisa de un compuesto de la invención que es terapéuticamente eficaz, y la vía por la cual dicho compuesto se administra mejor, la determina fácilmente un experto en la materia comparando el nivel en sangre del agente con la concentración requerida para tener un efecto terapéutico.
[0134] Los compuestos descritos en esta invención también se pueden administrar por vía oral al paciente, de manera que la concentración de fármaco sea suficiente para lograr una o más de las indicaciones terapéuticas descritas en esta invención. Típicamente, una composición farmacéutica que contiene el compuesto se administra a una dosis oral de entre aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/kg de una manera compatible con la afección del paciente. Preferentemente, la dosis oral sería de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 mg/kg.
[0135] No se esperan efectos toxicológicos inaceptables cuando los compuestos descritos en esta invención se administran conforme a la presente descricpción. Los compuestos, que pueden tener una buena biodisponibilidad, se pueden probar en uno o varios ensayos biológicos para determinar la concentración de un compuesto que se require para tener un efecto farmacológico dado.
COMBINACIONES
[0136] En una realización particularmente preferida de la invención, los uno o más compuestos descritos en esta invención se administran en combinación con uno o más de otros agentes activos, por ejemplo, fármacos existentes disponibles en el mercado. En dichos casos, los compuestos descritos en esta invención se pueden administrar consecutiva, simultánea o secuencialmente con los uno o más de los otros agentes activos.
[0137] Los fármacos en general son más eficaces cuando se utilizan en combinación. En particular, la terapia de combinación es deseable para evitar una superposición de las principales toxicidades, mecanismo de acción y mecanismo o mecanismos de resistencia. Además, también es deseable administrar la mayoría de los fármacos en sus dosis máximas toleradas con intervalos de tiempo mínimos entre dichas dosis. Las principales ventajas de la combinación de fármacos son que puede promover efectos aditivos o posibles sinérgicos a través de interacciones bioquímicas y también puede disminuir la aparición de resistencias.
[0138] Pueden sugerirse combinaciones beneficiosas estudiando la actividad inhibidora de los compuestos de prueba con agentes que se sabe o se sospecha que son valiosos en el tratamiento de un trastorno particular. Este procedimiento también se puede utilizar para determinar el orden de administración de los agentes, es decir, antes, simultáneamente o después del suministro. Dicha programación puede ser una característica de todos los agentes activos identificados en esta invención.
ENSAYO
[0139] También se describe el uso de un compuesto como se ha descrito anteriormente en un ensayo para identificar otros compuestos candidatos capaces de inhibir PPP1 R15A-PP1.
[0140] Preferentemente, el ensayo es un ensayo de unión competitiva.
[0141] Más preferentemente, el ensayo de unión competitiva comprende poner en contacto un compuesto descrito en esta invención con PPP1R15A-PP1 y un compuesto candidato y detectar cualquier cambio en la interacción entre el compuesto descrito en esta invención y PPP1R15A-PP1.
[0142] Preferentemente, el compuesto candidato se genera mediante la modificación de SAR convencional de un compuesto descrito en esta invención.
[0143] Como se usa en esta invención, la expresión "modificación de SAR convencional" se refiere a procedimientos estándar conocidos en la técnica para variar un compuesto dado mediante derivatización química.
[0144] Por lo tanto, en un aspecto, el compuesto identificado puede actuar como modelo (por ejemplo, una plantilla) para el desarrollo de otros compuestos. Los compuestos empleados en dicha prueba pueden estar libres en solución, fijados a un soporte sólido, soportados sobre una superficie celular o localizados intracelularmente. Puede medirse la abolición de la actividad o la formación de complejos de unión entre el compuesto y el agente que se está probando.
[0145] El ensayo puede ser un tamizado mediante el cual se prueban varios agentes. En un aspecto, el procedimiento de ensayo es un tamizado de alto rendimiento.
[0146] También se describe el uso de ensayos de tamizado de fármacos competitivos en los que los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse a un compuesto compiten específicamente con un compuesto de prueba para unirse a un compuesto.
[0147] Otra técnica de tamizado proporciona un tamizado de alto rendimiento (High-Throughtput Screening, HTS, por sus siglas en inglés) de agentes que tienen una afinidad de unión adecuada por las sustancias y se basa en el procedimiento descrito en detalle en el documento WO 84/03564.
[0148] Se espera que los procedimientos de ensayo sean adecuados para el tamizado de compuestos de prueba tanto a pequeña como a gran escala, así como para ensayos cuantitativos.
[0149] Preferentemente, el ensayo de unión competitiva comprende poner en contacto un compuesto descrito en esta invención con PPP1 R15A-PP1 en presencia de un sustrato conocido de PPP1 R15A-PP1 y detectar cualquier cambio en la interacción entre dicha PPP1R15A-PP1 y dicho sustrato conocido.
[0150] También se describe un procedimiento para detectar la unión de un ligando a PPP1 R15A-PP1, compendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(i) poner en contacto un ligando con PPP1 R15A-PP1 en presencia de un sustrato conocido
(ii) detectar cualquier cambio en la interacción entre PPP1R15A-PP1 y dicho sustrato conocido;
y donde dicho ligando es un compuesto descrito en esta invención.
[0151] También se describe un procedimiento que comprende las etapas de:
(a) realizar un procedimiento de ensayo descrito anteriormente;
(b) identificar uno o más ligandos capaces de unirse a un dominio de union al ligando; y
(c) preparar una cantidad de dichos uno o más ligandos.
[0152] También se describe un procedimiento que comprende las etapas de:
(a) realizar un procedimiento de ensayo descrito anteriormente;
(b) identificar uno o más ligandos capaces de unirse a un dominio de union al ligando; y
(c) preparar una composición farmacéutica que comprende dichos uno o más ligandos.
[0153] También se describe un procedimiento que comprende las etapas de:
(a) realizar un procedimiento de ensayo descrito anteriormente;
(b) identificar uno o más ligandos capaces de unirse a un dominio de union al ligando;
(c) modificar dichos uno o más ligandos capaces de unirse a un dominio de union al ligando;
(d) realizar el procedimiento de ensayo descrito anteriormente;
(e) preparar opcionalmente una composición farmacéutica que comprende dichos uno o más ligandos.
[0154] También se describe un ligando identificado por el procedimiento descrito anteriormente. También se describe una composición farmacéutica que comprende un ligando identificado por el procedimiento descrito anteriormente.
[0155] También se describe el uso de un ligando identificado por el procedimiento descrito anteriormente en la preparación de una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con la acumulación de proteínas mal plegadas como se ha definido anteriormente.
[0156] Los procedimientos anteriores se pueden usar para seleccionar un ligando útil como inhibidor de PPP1 R15A-PP1.
[0157] Los compuestos de fórmula general (1) son útiles como herramientas de laboratorio y como agentes terapéuticos. En el laboratorio, determinados compuestos descritos en esta invención son útiles para establecer si una diana conocida o recién descubierta contribuye a una función bioquímica crítica o al menos significativa durante el establecimiento o progresión de una patología, un procedimiento comúnmente denominado 'validación de la diana'.
[0158] La presente invención se describe adicionalmente con referencia a las siguientes figuras, donde: La figura 1 muestra protección dependiente de la dosis de células HeLa por el compuesto de fórmula (I), ejemplo 1 de la invención, del estrés RE inducido por exposición de 6 horas a tunicamicina. Véase la prueba de descripción 1.
La figura 2 muestra que el compuesto de fórmula (I), ejemplo 1 de la invención, pospone la recuperación de la traducción en células estresadas. Más específicamente, la figura 2 muestra que la traducción se atenúa 2 h después de la adición de tunicamicina. La recuperación de la traducción es notable en las células tratadas solo con tunicamicina. El ejemplo 1 de la invención prolonga la atenuación de la traducción en células tratadas con tunicamicina. Véase la prueba de descripción 3.
La figura 3 muestra el compuesto de fórmula (I), ejemplo 1 de la invención, a diferencia de Guanabenz, no tiene actividad para el receptor adrenérgico a2A según se mide mediante un ensayo funcional para el receptor adrenérgico a2A. Véase la prueba de descripción 5.
La figura 4 muestra que un compuesto de fórmula (I), ejemplo 1 de la invención, evita la retención en RE de POS63del, la proteína mutante asociada con Charcot Marie Tooth 1B. Eje Y: número de células. UT: sin tratar. La figura 5 muestra que un compuesto de fórmula (I), ejemplo 1 de la invención, reduce la acumulación de dos proteínas mal plegadas que causan enfermedades no relacionadas: el fragmento amino-terminal de huntingtina mutante (Htt48Q) asociado con la enfermedad de Huntington y el mutante SOD1 (A4V), asociado con la esclerosis lateral amiotrófica. Eje Y: porcentaje de acumulación de proteína, en relación con las células no tratadas. UT: sin tratar.
La figura 6 muestra que un compuesto de fórmula (I), ejemplo 1 de la invención, reduce la acumulación de P23H mutante de rodopsina asociada con retinitis pigmentosa. Eje Y: número de células. UT: sin tratar.
[0159] La presente invención se describe adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. EJEMPLOS
Procedimientos y materiales
[0160]
El ejemplo 1 se adquirió en Chemdiv ref: 1683-6588
El ejemplo 2 se adquirió en Chembridge ref: 5173161
El ejemplo 4 se adquirió en Enamine ref: Z49562642
El ejemplo 6 se adquirió en Chemdiv ref: 1683-6502
Preparación de los compuestos: usados en la presente invención
[0161] Los reactivos y compuestos comerciales se adquirieron en Acros Organics, Sigma-Aldrich. Los compuestos descritos en la presente invención se pueden preparar según el siguiente procedimiento general:
Procedimiento general A:
[0162]
Figure imgf000021_0001
[0163] A una solución de benzaldehído (1 eq.) en etanol (300 ml) se le añadió secuencialmente clorhidrato de aminoguanidina (1 eq.) y acetato de sodio (1 eq.) a 25 °C. La mezcla de reacción resultante se calentó a 80 °C durante las siguientes ~6 horas. La finalización de la reacción se monitorizó por CCF (Thin Layer Chromatography, TLC, por sus siglas en inglés) usando diclorometano/metanol (8/2) como fase móvil. Tras completarse la reacción, la mezcla de reacción se dejó enfriar a 25 °C y se vertió en la solución saturada de NaHCO 3 (700 ml). El precipitado resultante se eliminó por filtración y se lavó con agua (100 ml). El material sólido resultante se trituró con dietiléter (2 x 25 ml) y se secó al vacío 1 para proporcionar el derivado de aminoguanidina sustituido deseado.
[0164] Los siguientes compuestos se prepararon según el procedimiento general A:
Ejemplo 1: 1-[(E)-[(2-clorofenil)metiliden]amino]-guanidina
Preparado siguiendo el procedimiento general A a partir de 2-clorobenzaldehído. RMN 1H (DMSO- de): 8 (ppm) 5,61 (s, 2H); 6,06 (s, 2H); 7,22-7,32 (m, 2H); 7,40 (dd, 1H); 8,15 (dd, 1H); 8,28 (s, 1H); EM (ESI+): m/z = 197,4 [M+H]+
Ejemplo 3: 1-[(E)-[(2-fluorofenil)metiliden]amino]-guanidina
Preparado siguiendo el procedimiento general A a partir de 2-fluorobenzaldehído.
Ejemplo 7: 1-[(E)-[(2-cloro-4-fluorofenil)metiliden]amino]guanidina
Preparado siguiendo el procedimiento general A a partir de 2-cloro-4-fluorobenzaldehído con un rendimiento del 67 %. RMN 1H (DMSO-de): 8(ppm) 5,80 (brs, 2H); 5,84 (brs, 2H); 7,19-7,34 (m, 4H); 8,16 (s, 1H); EM (ESI+): m/z = 215,1 [M+H]+
Ejemplo 13: 1-[(E)-[(3-cloropiridm-4-il)metMiden]ammo]guamdma
Preparado siguiendo el procedimiento general A a partir de 3-cloroisonicotinaldehído con un rendimiento del 50 %. RMN 1H (DMSO-de): 8 (ppm) 6,01 (brs, 2H); 6,33 (brs, 2H); 8,10 (d, 1H); 8,14 (s, 1H); 8,37 (dd, 1H); 8,52(s, 1 H); EM (ESI+): m/z = 198,4 [M+H]+
Ejemplo 15: 1-[(E)-[(2-cloro-6-fluorofenil)metiliden]amino]guanidina
Preparado siguiendo el procedimiento general A a partir de 2-cloronicotinaldehído con un rendimiento del 56 %. RMN 1H (DMSO-de): 8 (ppm) 5,84 (brs, 2H); 5,88 (brs, 2H); 7,18-7,35 (m, 3H); 8,16 (s, 1H); EM (ESI+): m/z = 215,4 [M+H]+.
Producto intermedio 1: 3-cloro-5-fluoroisonicotinaldehído
[0165] A una solución agitada de N,N-diisopropilamina (0,864 g, 0,006690 mol) en THF (6 ml) se le añadió nbuLi (1,6 M en hexano) (7,6 ml, 0,012164 mol) gota a gota durante un período de 15 minutos a -78 °C. La mezcla de reacción resultante se agitó a -78 °C durante 15 minutos y a continuación se dejó calentar a 0 °C con lo que se agitó adicionalmente durante 1 hora. La mezcla de reacción resultante se enfrió de nuevo a -78 °C y se le añadió gota a gota una solución de 3-cloro-5-fluoropiridina (0,8 g, 0,006082 mol) en THF (6 ml) durante un período de 10 minutos. La mezcla de reacción resultante se agitó a -78° C durante 1 hora, a continuación se añadió formiato de metilo (0,73 g, 0,012164 mol) got a gota a -78 °C. La mezcla de reacción resultante se agitó adicionalmente a -78 °C durante 1 hora más. La reacción se monitorizó por CCF usando hexano: acetato de etilo (5: 5) como fase móvil. Tras completarse la reacción, la mezcla de reacción se vertió en una solución saturada de NH 4 Cl (50 ml) y se extrajo con acetato de etilo (4 x 25 ml). El extracto orgánico combinado se lavó con agua desmineralizada (50 ml), salmuera (25 ml), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. La destilación de la capa orgánica proporcionó el aldehido deseado (0,6 g, rendimiento del 61,85 %) en forma bruta. Este compuesto bruto se utilizó directamente para la etapa siguiente sin ningún tratamiento adicional.
Ejemplo 16: 1-[(E)-[(3-cloro-5-fluoropiridin-4-il)metiliden]amino]guanidina
[0166] Preparado siguiendo el procedimiento general A a partir de 3-cloro-5-fluoroisonicotinaldehído con un rendimiento del 14 %. RMN 1H (DM-SO-de): 8 (ppm) 5,95-6,30 (m, 4H); 8,10 (s, 1H); 8,46-8,52 (m, 2H); EM (ESI+): m/z= 216,0 [M+H]+.
Ejemplo 8 : N-{N-[(E)-[(2-clorofenil)metiliden]amino]carbamimidoil}acetamida
Figure imgf000022_0001
A una solución de 1-[(E)-[(2-clorofenil)metiliden]amino]-guanidina (0,50 g, 0,002543 mol) en DMSO (10 ml) se le añadió anhídrido acético (0,26 g, 0,002543 mol) a 25 °C. La mezcla de reacción resultante se agitó a 25 °C durante las siguientes 15 horas. La finalización de la reacción se monitorizó por CCF usando diclorometano/metanol (9,5/0,5) como fase móvil. Tras completarse la reacción, la mezcla re reacción se vertió en el agua (100 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2 x 150 ml). El extracto orgánico combinado se lavó con salmuera (100 ml), se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró al vacío. El material bruto resultante se purificó adicionalmente mediante cromatografía ultrarrápida usando diclorometano: metanol como fase móvil, por lo que el producto deseado se eluyó a aproximadamente el 1,0 % de metanol en diclorometano. La destilación de las fracciones de producto puro proporcionó N-{N-[(E)-[(2-dorofenil)metiliden]amino]carbamimidoil}acetamida (0,080 g, rendimiento del 13 %). RMN 1H (DMSO-de): 8 (ppm) 2,97 (s, 3H); 7,25-7,41 (m, 3H); 7,42-7,53 (m, 1H); 7,79 (brs, 1H); 8,22-8,29 (m, 1H); 8,48 (s, 1H); 10,58 (brs, 1H); EM (ESI+): m/z = 239,2 [M+H]+.
Ejemplo 9: N-{N-[(E)-[(2-dorofenil)metiliden]amino]carbamimidoil}carbamato de metilo
[0168]
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A una suspensión de 1-[(E)-[(2-clorofenil)metiliden]amino]-guanidina (0,15 g, 0,000762 mol) en diclorometano (5 ml) se le añadió trietilamina (0,32 ml, 0,002288 mol) a 25 °C. La mezcla de reacción resultante se enfrió a 0 °C usando un baño de hielo/sal; a continuación, se añadió cloroformiato de metilo (0,09 ml, 0,001144 mol) a la mezcla de reacción a 0 °C. La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. La finalización de la reacción se monitorizó por CCF usando diclorometano/metanol (9/1) como fase móvil. Tras completarse la reacción, la mezcla de reacción se vertió en una solución saturada de NaHCO3(20 ml) y se extrajo con diclorometano (3 x 25 ml). El extracto orgánico combinado se lavó con agua DM (20 ml), salmuera (20 ml), se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró al vacío. El material bruto resultante se purificó adicionalmente mediante cromatografía en columna ultrarrápida usando diclorometano: metanol como fase móvil, por lo que el producto deseado se eluyó a a proximadamente 1,0 % de metanol en diclorometano. La destilación de las fracciones de producto puro proporcionó N-{N-[(E)-[(2-clorofenil)metiliden]amino]carbamimidoil}carbamato de metilo (0,065 g, rendimiento del 37 %). RMN 1H (DMSO-d6): 8 (ppm) 3,60 (s, 3H); 7,34-7,43 (m, 2H); 7,45-7,52 (m, 1H); 7,67 (brs, 1H); 7,92 (brs, 1H); 8,22-8,30 (m, 1H); 8,44 (s, 1H); 11,02 (brs, 1H); EM (ESI+): m/z = 255,4 [M+H]+
[0169] Compuestos seleccionados; los Z que se describen en esta invención se establecen en la tabla 1 a continuación:
Figure imgf000023_0002
continuación
Figure imgf000024_0001
[0170] En algunos de los experimentos siguientes, se puede usar la sal de estos compuestos; por ejemplo, se puede usar la sal acetato del ejemplo 1 formada con ácido acético.
Citoprotección del estrés RE (Prueba 1)
[0171] Se cultivaron células HeLa en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Dulbecco's Modified Eagle Médium, DMEM, por sus siglas en inglés) suplementado con penicilina, estreptomicina, que contenía suero fetal bovino (SFB) al 5 %, a 37 °C en una atmósfera de CO 2 al 5 %. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 15.000 células/ml 24 horas antes del tratamiento. El estrés del RE se provocó mediante la adición de medio fresco que contenía 2,5 jg/ml de tunicamicina (Sigma-Aldrich) junto con inhibidores de elF2a fosfatasas (0,2-5 |jM). Los medios se cambiaron 6 h más tarde con medios nuevos que contenían inhibidores de la fosfatasa (0,2-5 jM). Los inhibidores se disolvieron en DMSO (50 mM) y se utilizó DMSO como tratamiento simulado. La viabilidad celular se evaluó midiendo la reducción de WST-8 [2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio] en formazán usando el kit de recuento de viabilidad celular 8 (Dojindo) según las recomendaciones del proveedor, 48 h después del tratamiento con tunicamicina. La citoprotección del estrés RE se mide en términos del porcentaje de aumento de células viables (en relación con el control) después del estrés del RE. Los resultados para el ejemplo 1 se muestran en la figura 1.
Evaluación de tasas de traducción en células no estresadas (Prueba 2)
[0172] Se sembraron células HeLa (80.000 células/ml) en placas de 12 pocillos 24 h antes de cada experimento y se trataron o no con compuestos (50 jM ) durante 0,5, 1, 2,5, 5 y 7,5 h. Al final de cada punto de tiempo se añadió 30,6 jCi/ml de 35S-metionina (EasyTag, PerkinElmer) al medio de cultivo durante 10 min a 37 °C. Después del marcaje, las células se lavaron con PBS helado y se lisaron en 75 j l de tampón Laemmli. Los lisados se sometieron a ultrasonidos, se hirvieron a 95 °C durante 5 min y se resolvieron en geles de gradiente NuPAGE al 4-12 %. A continuación, los geles se tiñeron con Coomassie Brilliant Blue R-250 y se analizaron mediante imágenes de fósforo. Evaluación de tasas de traducción en células estresadas (Prueba 3)
[0173] Los tratamientos se realizaron como para medir la traducción en células no estresadas, excepto que se anadió tunicamicina (2,5 jg/ml) junto con los compuestos. El resultado del ejemplo 1 se muestra en la figura 3. Immunoprecipitaciones (Prueba 4)
[0174] Se sembraron células HeLa (80.000 células/ml) en placas el día antes de los tratamientos indicados, se transfectaron con plásmidos de expresión GFP-PPP1R15A o FLAG-PPP1R15B usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según el procedimiento del fabricante. Dos días después de la transfección, las células se trataron durante 6 h con compuestos (50 pm) y a continuación se lavaron en PBS y se lisaron en tampón IP (Tris 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 0,2 %, glicerol al 10 % y cóctel inhibidor de proteasa sin EDTA). Los lisados se clarificaron mediante centrifugación a 15.000 g durante 15 min a 4 °C y se aclararon previamente en perlas de proteína G durante 1 hora a 4 °C. Las proteínas se inmunoprecipitaron con 1,5 pl de anticuerpo GFP (JL-8, Clontech, 632380), unido a 20 pl de perlas de proteína G-sepharose (Ge Healthcare, 17-0618-01). A continuación, las perlas se lavaron 3 veces con tampón IP frío y se hirvieron en 50 pl de tampón Laemmli (Tris-HCl 25 mM pH 6,8, SdS al 1 %, DTT 25 mM, glicerol al 7,5 %, azul de bromofenol al 0,05 %). Los complejos proteicos inmunoprecipitados (17 pl) se separaron en geles de gradiente NuPAGE al 4-12 % (Invitrogen), se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa reforzada Optitran BA-S 83 y se revelaron con anticuerpos GFP y PP1 (sc-7482, Santa Cruz).
Ensayo funcional de aequorina para el receptor adrenérgico a2A (Prueba 5)
[0175] Las células CHO-K1 que expresan conjuntamente apoaequorina mitocondrial, Ga16 y receptor adrenérgico a2A humano recombinante cultivado hasta la fase logarítmica media en medio de cultivo sin antibióticos se separaron con PBS-EDTA, se centrifugaron y se resuspendieron en DMEM/F12 de HAM con HEPES, sin rojo fenol tampón ASB al 0,1 % libre de protesas a una concentración de 1 x 106 células/ml. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 4 h con coelenterazina h. Cada día de la prueba, se probó el agonista de referencia (UK14304) para evaluar el rendimiento del ensayo y determinar la CE 50 . A continuación, se mezclaron 50 pl de suspensión celular con 50 pl de agonista de prueba en una placa de 96 pocillos. La emisión resultante de luz se registró utilizando un luminómetro Hamamatsu Functional Drug Screening System 6000. Para estandarizar la emisión de luz registrada (determinación de la "señal del 100 %") a través de la placa y en diferentes experimentos, algunos de los pocillos contenían digitonina 100 pM o una concentración saturante de AT (20 pM). Los datos de dosis-respuesta de los compuestos de prueba se analizaron con el software XLfit (IDBS) usando regresión no lineal aplicada a un modelo de dosis-respuesta sigmoidea.
[0176] El resultado del ejemplo 1 se muestra en la figura 4. Ventajosamente, a diferencia de Guanabenz, el ejemplo 1 no se considera un agonista de alfa-2 potente. Esta pérdida de actividad alfa-2 adrenérgica hace que el compuesto sea terapéuticamente útil en el tratamiento de los trastornos reivindicados en esta invención. La ausencia de actividad alfa-2 adrenérgica significa que el compuesto puede administrarse en una dosis adecuada para tratar los trastornos reivindicados en esta invención, pero sin ningún efecto significativo sobre la presión arterial, evitando así la necesidad de administrarlo conjuntamente con un antagonista de alfa-2 adrenérgico conocido (un bloqueador alfa).
Evaluación de selectividad
[0177] La selectividad se infirió a partir de los resultados de las pruebas 1, 2, 3 y 5:
un inhibidor selectivo de PPP1 R15A debe proteger a las células del estrés RE (Prueba 1), no inhibe la traducción en células no estresadas (Prueba 2), prolonga la atenuación de la traducción después de Tunicamicina (Prueba 3) y disocia selectivamente la PPP1R15A-PP1 holofosfatasa pero no la PPP1R15B-PP1 holofosfatasa (Prueba 4). Resultados
[0178] Los resultados de las pruebas 1 a 4 para los compuestos seleccionados se muestran a continuación en la tabla 1.
Tabla 1:
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Ensayos basados en células:
Materiales y procedimientos
[0179] Cultivo celular y reactivos Se mantuvieron células 293T en medio de Eagle modificado de Dubecco suplementado con suero fetal bovino al 10 % y se transfectaron en placas de 6 a 12 pocilios utilizando el procedimiento del fosfato de calcio que conduce normalmente a una eficacia de transfección del 70 %. De manera habitual, se sembraron en placas 45.000 células/ml antes de la transfección como se describe en (Rousseau y col. 2009), el constructo de SOD1A4V se describe en (Munch y col. 2011) y el constructo de P23H se describe en (Mendes y Cheetham 2008).
Microscopio de fluorescencia
[0180] Las células transfectadas se fijaron con paraformaldehído al 4 % y se marcaron con los anticuerpos indicados. Se tomaron micrografías con un aumento de 100 X en un microscopio confocal LEICA TCS SP2AOBS o un microscopio de fluorescencia Leica DMRB.
Inmunotransferencia
[0181] De manera habitual, se lisaron células confluentes al 70 % de un pocillo de una placa de 12 pocillos en 140 |jl de tampón Laemmli hirviendo (Tris-HCl 25 mM, pH 6,8, SDS al 1 %, ditiotreitol 25 mM, glicerol al 7,5 %, azul de bromofenol al 0,05 %) para análisis de inmunotransferencia. Se cargaron 18 j l de extractos de proteínas en geles NuPAGE al 2-12 % y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa reforzada Optitran BA-S 83 (Whatman y Schleicher & Schuell). La carga igual de extractos de proteínas analizados por inmunotransferencia se controló mediante tinción con rojo Ponceau y vimentina (datos no mostrados). Las membranas; se saturaron en leche desnatada en polvo al 5 % en solución salina tamponada con fosfato y se sondearon con anticuerpo Htt 2b4 o anticuerpo HA para revelar SOD1 marcado con HA. El anticuerpo secundario apropiado acoplado a la peroxidasa se reveló usando el kit de quimioluminiscencia SuperSignal West Pico. Las imágenes quimioluminiscentes se adquirieron usando el Chemi-Smart 5000 (Vilber-Lourmat) que permite la detección cuantitativa de la quimioluminiscencia. Las señales de interés se cuantificaron utilizando imageJ.
Ensayo de Charcot Marie Tooth 1B (Prueba 6 )
[0182] La deleción de la serina 63 de P0 (P0S63del) causa neuropatía de Charcot-Marie-Tooth 1B en humanos y una neuropatía desmielinizante similar en ratones transgénicos. La proteína mutante se pliega incorrectamente y se acumula en el RE, induce la UPR y no se incorpora a la mielina (D'Antonio y col., 2009, J Neurosci Res, 87, 3241-9). Se transfectaron células 293T con P0S63del -P0S63del-DSred- marcado, y se analizaron mediante microscopía confocal, 48 h después de la transfección en presencia o ausencia del compuesto de fórmula (I). Conforme a la metodología descrita en (Pennuto y col. 2008), se puntuaron las células con P0S63del-DSred retenido en RE. La figura 4 muestra que en las células no tratadas, P0S63del se acumula en el RE pero el ejemplo 1 evita esta acumulación. Dado que la acumulación de P0 mal plegada causa CMT-1B y una vez demostrado que el ejemplo 1 reduce la acumulación de la proteína que causa la enfermedad, el compuesto de fórmula (1) debería ser útil para tratar CMT-1B así como otras formas de c Mt donde la proteína que causa la enfermedad está mal plegada y retenida en el RE. Ensayo de la enfermedad de Huntington y la esclerosis lateral amiotrófica (Prueba 7)
[0183] Los inventores probaron la acumulación del fragmento amino terminal de huntingtina mutante (Htt48Q) asociado con la enfermedad de Huntington y el mutante SOD1 (A4V), asociado con la esclerosos lateral amiotrófica.
[0184] Los inventores usaron un procedimiento anteriormente descrito en el documento WO/2008/041133. Se transfectaron células 293T con plásmidos que codifican Htt48 o SOD1a4v y se trataron con el ejemplo 1 en DMSO o DMSO solo 4 h después de la transfección. Los lisados de SDS recolectados 48 h después de la transfección se analizaron en un NuPAGE seguido de inmunotransferencia con anticuerpo de huntingtina (2B4) o HA (SOD1). La figura 5 muestra las cuantificaciones de la señal e inmunotransferencias, normalizadas a células no tratadas. El ejemplo 1 reduce la acumulación de ambas proteínas. Una vez demostrado que el ejemplo 1 reduce la acumulación de las proteínas que causan la enfermedad de Huntington y la esclerosis lateral amiotrófica, el compuesto de fórmula (1) debería ser útil para tratar dichas enfermedades así como otras enfermedades neurodegenerativas provocadas por la acumulación de proteínas mal plegadas.
Ensayo de agregación de rodopsina P23H (Prueba 8 )
[0185] Los inventores probaron la agregación de rodopsina asociada a la retinitis pigmentosa como se describe (Mendes y Cheetham 2008).Se transfectaron células 293T con plásmido que codifica el mutante P23H de rodopsina y se trataron con el ejemplo 1en DMSO o DMSO solo 4 h después de la transfección. Las células se analizaron mediante microscopía. La figura 6 muestra las células con o sin agregados. El ejemplo 1 reduce los agregados. Dado que la acumulación de rodopsina mal plegada causa RP y una vez demostrado que el ejemplo 1 reduce la acumulación de la proteína que causa la enfermedad, el compuesto de fórmula (1) debería ser útil para tratar la retinitis pigmentosa. Los ejemplos 1 y 6 se confirmaron inhibidores selectivos de PPP1R15A.
Los ejemplos 2, 4, 7, 8 inhiben PPP1 R15A y B.
Ċ

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    Figure imgf000029_0001
    o un tautómero del mismo
    donde:
    Ri es alquilo, Cl, F o Br;
    R 2 es H o F;
    R 3 se selecciona de H y alquilo;
    R 4 se selecciona de H y C(O)R 6 ;
    R 5 es H;
    o R 4 y R 5 están unidos para formar un grupo heterocíclico que está opcionalmente sustituido con uno o más grupos R 10 ;
    R 6 se selecciona de R 7 , OR 7 y NR 8 R 9 ;
    R 7 , R 8 y R 9 se seleccionan cada uno independientemente de alquilo, cicloalquilo, aralquilo, cicloalquenilo, heterociclilo y arilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos R 10 ;
    cada R 10 se selecciona independientemente de halógeno, OH, NO 2 , CN, COO-alquilo, aralquilo, SO 2 -alquilo, SO 2 -arilo, COOH, CO-alquilo, CO-arilo, NH 2 , NH-alquilo, N(alquilo) 2 , CF 3 , alquilo y alcoxi;
    X y Z son cada uno independientemente CR 11 , e Y se selecciona de CR 11 y N;
    R 11 es H o F;
    para su uso en la protección de las células del estrés de RE citotóxico y trastornos relacionados con la edad.
  2. 2. Compuesto para su uso según la reivindicación 1, donde R 1 es Cl, Br, Me o F, más preferentemente, Cl.
  3. 3. Compuesto para su uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde R 2 es H.
  4. 4. Compuesto para su uso según cualquier reivindicación anterior, donde Y es CR 11 .
  5. 5. Compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde Y es N.
  6. 6 . Compuesto para su uso según cualquier reivindicación anterior, donde R 3 y R 4 son ambos H.
  7. 7. Compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde R 3 es H y R 4 es C(O)R 6 .
  8. 8. Compuesto para su uso según la reivindicación 7, donde R6 es Me u OMe.
  9. 9. Compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde R 4 y R 5 están unidos para formar un grupo heterocíclico que está opcionalmente sustituido con uno o más grupos R 10 .
  10. 10. Compuesto para su uso según la reivindicación 9, donde dicho compuesto es de fórmula (1a), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
    Figure imgf000029_0002
    o un tautómero del mismo
    donde R 1 , R 2 , R 3 y R 10 son como se definen en la reivindicación 1.
  11. 11. Compuesto para su uso según cualquier reivindicación anterior que se selecciona de los siguientes:
    Figure imgf000030_0001
    Figure imgf000031_0001
    o un tautómero del mismo
    Figure imgf000031_0002
  12. 12. Compuesto para su uso según la reivindicación 11, que es el ejemplo 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  13. 13. Compuesto para su uso según la reivindicación 11, que es el ejemplo 15 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  14. 14. Compuesto para su uso según la reivindicación 11, que es el ejemplo 16 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  15. 15. Compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho compuesto carece de actividad adrenérgica alfa2.
  16. 16. Compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho compuesto prolonga el efecto protector de la UPR.
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