ES2828025T3 - Nanosistemas magnetopoliméricos multifuncionales para el rápido direccionamiento, el aislamiento, la detección y la obtención de imágenes simultánea de células tumorales circulantes - Google Patents
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Abstract
Un nanosistema multicomponente biofuncional que comprende: (i) un anticuerpo especifico o no especifico de CTC que se dirige a celulas cancerosas, preferentemente un anticuerpo anti-transferrina (Tf) o anti-EpCam, o una biomolecula que se dirige a celulas cancerosas; (ii) nanoparticulas de oxido de hierro (Fe3O4); (iii) sonda de infrarrojos cercano de NHS de cianina5 (Cy5); (v) alotropos de carbono para la interaccion con las celulas cancerosas; (vi) poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAM); (vii) dendrimeros o polimeros de cuarta generacion (G4) seleccionados del grupo que consiste en poligliceroles, poliaminas y polimeros hiperramificados; y (viii) glutation (GSH) para direccionamiento celular, aislamiento y obtencion de imagenes de celulas cancerosas circulantes.
Description
DESCRIPCIÓN
Nanosistemas magnetopoliméricos multifuncionales para el rápido direccionamiento, el aislamiento, la detección y la obtención de imágenes simultánea de células tumorales circulantes
Campo de la invención
La presente solicitud se refiere a un nanosistema multicomponente biofuncional para direccionamiento celular, aislamiento rápido y obtención de imágenes de alta resolución simultánea de células cancerosas.
Antecedentes
El recuento de células metastásicas es de importancia vital en la predicción del pronóstico de los pacientes, la monitorización y la evaluación de los resultados terapéuticos (Cristofanilli et al. N. Engl. J. Med. 2004, 351, 781).
Sin embargo, la presencia de células cancerosas metastásicas en la corriente sanguínea es extremadamente rara, que hace que su aislamiento y detección sean muy complejos. Se sabe que estas células metastásicas denominadas células tumorales circulantes (CTC) se asocian a supervivencia corta en células hematológicas y han sido objeto de investigación, especialmente para desarrollar diagnósticos rápidos y rentables en la biología del cáncer. El diagnóstico basado en CTC es muy valioso, ya que proporciona el entendimiento del tumor, fundamental para el diseño de la intervención terapéutica.
Los avances técnicos han permitido la detección de CTC hasta un cierto grado. Actualmente, la FDA ha autorizado la separación inmunomagnética de CTC (ensayo de CellSearch). Sin embargo, se exploran más técnicas de detección debido a la necesidad de detectar diferentes formas de células cancerosas, reducir el coste y aumentar la eficiencia. Estas incluyen citometría de flujo (Allan et al. Cytom Part A, 2005, 65:4), sistemas de filtración basados en el tamaño (Jacob et al, Biotechnology and Bioengineering, 2009, 102: 521) y dispositivos microfluídicos (J Chromatogr A, 2007, 1162: 154). Pero estas técnicas no son eficientes en el aislamiento rápido y la caracterización de CTC. Wang et al. han mostrado un ensayo de CTC capaz de numerar CTC en muestras de sangre completa de pacientes con cáncer de próstata en donde se han usado sustratos con afinidad por las células con sustratos de nanoalambre de silicio recubierto con agente de captura para inmovilizar las CTC (Adv Materials, 2011, 23: 4788 92). Además, también se describe un chip de nanovelcro que captura CTC de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) de la sangre y que recupera las CTC de CPCNP inmovilizadas en el nanosustrato tras el tratamiento de disolución de nucleasa (Shen et al., Advanced Materials, 2013, 25: 2368-73). La presente divulgación La proporciona un NanoSistema MagnetoPolimérico (NSMP) que consiste en alótropos de carbono que incluyen nanotubo de carbono y o grafeno que capturan de forma fiable células cancerosas mediadas por anticuerpo/s específico/s y componentes de direccionamiento específico de las muestras de sangre con mayores interacciones con las células cancerosas que hasta ahora no se conocían en ningún otro sistema de detección. Por ejemplo, Banerjee et al. proporcionan un nanosistema magnetodendrítico (NSMD) multicomponente para el rápido direccionamiento de células tumorales, aislamiento y obtención de imágenes de alta resolución (Advanced Healthcare materials, 2013, 2(6): 800). Pero este tipo de sistema carece de rasgos ideales, que incluyen nanotubo de carbono (CNT) como plataforma y un sistema de polímeros adicionales tal como poli(N-isopropilacrilamida (PNIPAM) y polímeros hiperramificados [(por ejemplo, dendrímeros y poligliceroles de poli(amidoamina (PAMAM)), poli(etilenglicoles)] que soportan la mayor dispersabilidad acuosa de los anticuerpos multicomponente y específicos (por ejemplo, anti-moléculas de adhesión a células del epitelio (EpCAM) que finalmente potencian las interacciones con el cáncer
El documento de patente WO 2008/073856 A2 desvela sistemas, métodos y composiciones para administración dirigida de nanopartículas y/o agentes a tejidos, células y/o sitios subcelulares.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. (A) Una imagen típica de TEM de nanopartículas de Fe3O4. (B) Se estimó la distribución del tamaño de nanopartículas de Fe3O4 a partir de imágenes de TEM.
Figura 2. Espectros de ATR-IR (a) Fe3O4, (b) AIR-001, (c) AIR-002, (d) CNT-COOH, (e) AIR-010, (f) AIR-011 y (g) AIR-012.
Figura 3. Dispersabilidad de AIR-072 en medios acuosos.
Figura 4. Espectros de fluorescencia normalizada (Aex = 600 nm) de Cy5 libre y AIR-007. La línea roja de puntos muestra los picos de fluorescencia para Cy5 libre.
Figura 5. (A-G) Imagen de la suspensión de células restante después de la captura magnética de las células HCT116. Las células HCT116 que se encontró que seguían en disolución se muestran por el círculo de puntos rojo. (H) Imagen de las células HCT116 magnéticamente aisladas de medios celulares después de 3 min de incubación.
Figura 6. Gráfico que muestra las células capturadas por NSMP en porcentaje.
Figura 7. (A-C) Imagen de la suspensión de células restante después de la captura magnética de las células
HCT116. Las células HCT116 que se encontró que seguían en disolución se muestran por el círculo de puntos rojo; (D,E) Imágenes de las células HCT116 magnéticamente aisladas usando NSMP con (E) y sin (D) anticuerpo contra EpCaM de medios celulares después de 3 min de incubación, (F) Control.
Figura 8. Gráfico que muestra células capturadas por NSMP con (AIR-060) y sin (AIR-011) anticuerpo contra EpCaM en porcentaje.
Figura 9. Gráfico que muestra células HCT116 capturadas de suspensión enriquecida de células por NSMP con (AIR-060) y sin (AIR-039) anticuerpo contra EpCam en porcentaje.
Figura 10. Imagen de las células HCT116 aisladas de los medios celulares por NSMP con EpCam después de 3 min de incubación.
Figura 11. Gráfico que muestra células HCT116 capturadas por NSMP con (AIR-072) y sin (AIR-071) anticuerpo contra EpCam en porcentaje de suspensiones de tipo CTC clínicamente relevantes preparadas en relaciones 1 x 105:1 (CMSPh:HCT116).
Figura 12. Inmunotinción de células de CTC capturadas de células de la sangre periférica de sujetos con cáncer de colon, rectal, de pulmón y de mama. Fijadas con paraformaldehído, DAPI (azul), CK18 FITC (verde) y DAPI+CK18 FITC positivas (combinación de verde y azul) de paciente usando los métodos de AIR basados en nanosistemas de CNT/grafeno.
Detalles de la invención
Como una parte del diseño, se han desarrollado tres nanosistemas biofuncionalizados para el direccionamiento celular, el aislamiento rápido y la obtención de imágenes de alta redisolución de células cancerosas. Los nanosistemas se diseñan usando 7 elementos funcionales como se proporciona a continuación:
(i) anticuerpo contra transferrina (Tf)/EpCAM o cualquier otro anticuerpo específico o no específico de CTC que se dirige a células cancerosas y otras biomoléculas que incluyen proteína, hidrato de carbono o moléculas pequeñas biológicamente relevantes,
(ii) nanopartículas de óxido de hierro (Fe3O4) para permitir el aislamiento magnético,
(iii) colorante de NHS de cianina5 (Cy5) para permitir la obtención de imágenes de alta resolución de CTC aisladas,
(iv) poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAM), un polímero termosensible (que presenta una menor temperatura de disolución crítica (LCST)) capaz de afectar los cambios estructurales conformacionales dando como resultado la ayuda en la captura de células cancerosas, para aumentar la dispersabilidad del nanosistema,
(v) alótropos de carbono, ejemplificados por nanotubos de una sola pared/de pared múltiple (CNT) o nanocuernos o grafeno, o cualquier otro alótropo de carbono para una mejor interacción con células cancerosas, (vi) polímeros hiperramificados de cuarta generación (G4) como dendrímeros (poli(aminoamidina) (PAMAM) con 64 sitios reactivos (generación ~ G4) y polímeros hiperramificados (por ejemplo, poligliceroles, poliiminas, etc.) para facilitar la conjugación simultánea de múltiples entidades funcionales, y
(viii) glutatión (GSH) como conector reactivo multifuncional. Los presentes inventores siguieron un proceso de múltiples etapas (Esquema 1, 2, 3 y 4) para sintetizar la plataforma de NanoSistemas MagnetoPoliméricos (NSMP). Por 'cualquier otro anticuerpo específico de CTC' se indica cualquier anticuerpo en la bibliografía publicada que se dirige a las células cancerosas o anticuerpo novedoso que podrá encontrar uso en el futuro. La presente invención proporciona un nanosistema multicomponente biofuncional, un proceso de síntesis del mismo, usos diagnósticos del nanosistema y un kit que comprende el nanosistema según las reivindicaciones adjuntas. Síntesis de Fe3O4
Se prepararon nanopartículas magnéticas (NPM) de Fe3O4 precipitando simultáneamente iones Fe2+ y Fe3+ por disolución de amoniaco y tratando en condiciones hidrotérmicas.
Anclaje de glutatión (GSH) con Fe3O4 (AIR-001)
Se mezcló Fe3O4 dispersado en agua ultrapura y metanol por sonicación con GSH disuelto en agua ultrapura. Entonces se volvió a sonicar la mezcla durante 2 h. Entonces se aisló Fe3O4-GSH por separación magnética, se lavó con ciclos repetidos de exceso de agua desionizada (D.I.) y se secó a vacío. El conjugado se indicará como AIR-001 en los siguientes estudios.
Síntesis del conjugado de Fe3O4-GSH-dentrímero PAMAM G4 (AIR-002)
Se conjugó AIR-001 con el dendrímero PAMAM G4 por el método de acoplamiento de ácido clorhídrico de (N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida) (EDCHCl). Se acoplan dendrímeros PAMAM (G4) con COOH, NH2, OH u otros grupos reactivos. Entonces se aisló el conjugado por separación magnética, se lavó con ciclos repetidos de agua D.I. y se secó a vacío. El conjugado se indica como AIR-002 en los siguientes estudios.
Síntesis de conjugado de Fe3O4-GSH-PAMAM G4-CNT/nanotubo de carbono de pared múltiple (CNT) o nanocuernos o grafeno o cualquier otro alótropo de carbono (AIR-010)
Se conjugó AIR-002 con CNT o grafeno o nanocuernos por el método de acoplamiento de EDC. Entonces se aisló el conjugado por separación magnética, se lavó con ciclos repetidos de agua D.I. y se secó a vacío. El conjugado se indica como AIR-010 en los siguientes estudios.
Síntesis de conjugado de Fe3O4-GSH-PAMAM G4-CNT-o nanocuernos o grafeno-PNIPAM (AIR-054) (Esquema 2 y 4)
Se conjugó AIR-010 con PNIPAM-COOH/NH2/SH por el método de acoplamiento de EDC. Entonces se aisló el conjugado por separación magnética, se lavó con ciclos repetidos de agua D.I. y se secó a vacío. El conjugado se indica como AIR-054 en los siguientes estudios.
Síntesis de conjugado Fe3O4-GSH-PAMAM G4-nanotubo de carbono de pared múltiple CNT (CNT) o nanocuernos o grafeno o cualquier otro alótropo de carbono-Cy5 (AIR-011)
Se conjugó NHS de Cy5 con AIR-010 en presencia de DIPEA a un pH de 7,8. Entonces se aisló el conjugado por separación magnética, se lavó con ciclos repetidos de agua D.I. y se secó a temperatura ambiente a vacío. El conjugado se indica como AIR-011 en los siguientes estudios.
Síntesis de conjugado de Fe3O4-GSH-PAMAM G4-nanotubo de carbono de pared múltiple CNT (CNT) o nanocuernos o grafeno o cualquier otro alótropo de carbono-PNIPAM-Cy5 (AIR-055)
Se conjugó AIR-054 con NHS de Cy5 en presencia de DIPEA a un pH de 7,8. Entonces se aisló el conjugado por separación magnética, se lavó con ciclos repetidos de agua D.I. y se secó a vacío. El conjugado se indica como AIR-055 en los siguientes estudios.
Síntesis de conjugado de Fe
3
O
4
-GSH-PAMAM
G4-CNT-nanotubo de carbono de pared múltiple (CNT) o nanocuernos o grafeno o cualquier otro alótropo de carbono Cy5-Tf (AIR-012)
Se conjugó AIR-011 con transferrina (Tf) usando el método de acoplamiento de EDC. Entonces se aisló el conjugado por separación magnética, se lavó con ciclos repetidos de agua D.I. y se secó a vacío. El conjugado final se indica como AIR-012 en los siguientes estudios.
Síntesis de conjugado de Fe
3
O
4
-GSH-PAMAM G4-CNT
-nanotubo de carbono de pared múltiple (CNT) o nanocuernos o grafeno o cualquier otro alótropo de carbono-Cy5-Tf (AIR-056)
Se conjugó AIR-055 con transferrina (Tf) usando el método de acoplamiento de EDC. Entonces se aisló el conjugado por separación magnética, se lavó con ciclos repetidos de agua D.I. y se secó a vacío. El conjugado final se indica como AIR-056 en los siguientes estudios.
Síntesis de conjugado de Fe3O4-GSH-PAMAM G4-CNT-nanotubo de carbono de pared múltiple (CNT) o nanocuernos o grafeno o cualquier otro alótropo de carbono Cy5-EpCam
Se conjugó AIR-011 con el anticuerpo contra EpCam usando el método de acoplamiento de EDC. Entonces se aisló el conjugado por separación magnética, se lavó con ciclos repetidos de agua D.I. y se secó a vacío. El conjugado final se indica como AIR-060 en los siguientes estudios.
Síntesis de conjugado de Fe3O4-GSH-PAMAM G4-CNT-nanotubo de carbono de pared múltiple (CNT) o nanocuernos o grafeno o cualquier otro alótropo de carbono-Cy5-EpCam
Se conjugó AIR-055 con el anticuerpo contra EpCam usando el método de acoplamiento de EDC. Entonces se aisló el conjugado por separación magnética, se lavó con ciclos repetidos de agua D.I. y se secó a vacío. El conjugado final se indica como AIR-066 en los siguientes estudios.
Interacción NSMP-célula y obtención de imágenes
Se sembraron células HCT116 a una densidad de 5x102 por 100 |jl en placa de 96 pocillos. Se trataron células HCT116 con 500 jg de NSMP suficientemente diluido con tampones adecuados y se incubaron en un agitador durante 3 minutos. Se aplicó un campo magnético fuerte para separar los NSMP y se transfirió el medio celular del sobrenadante a otro pocillo para contar las células cancerosas no capturadas. Se contaron las células capturadas y no capturadas con NSMP de las imágenes de células capturadas y no capturadas con NSMP usando un microscopio de fluorescencia Leica para estimar la eficiencia de captura de células cancerosas de nanosistemas NSMP.
Estimación de la eficiencia de captura de la suspensión artificial de CTC
Se prepararon muestras de CTC enriqueciendo células HCT116 con células mononucleares de sangre periférica humana (CMSPh) en la relación 1:1000 en placa de 96 pocillos. Se trató la suspensión artificial de CTC con 500 |jg de conjugado de NSMP (con y sin EpCam) suficientemente diluido con tampones adecuados y se incubó en un agitador durante 3 minutos. Se aplicó un campo magnético fuerte para separar NSMP y se transfirió el medio celular del sobrenadante a otro pocillo para contar las células cancerosas no capturadas. Se contaron las células capturadas y no capturadas por NSMP a partir de las imágenes de células capturadas y no capturadas por NSMP usando un microscopio de fluorescencia para estimar la eficiencia de captura de células cancerosas de los sistemas NSMP.
Esquema 2. Esquema de síntesis para AIR-056 que muestra las etapas del proceso
de conjugación de nanotubos de carbono de pared múltiple
Esquema 3. Esquema de síntesis para AIR-060 que muestra las etapas del proceso
de conjugación de CNT y anti-EpCam.
Esquema 4. Esquema de síntesis para AIR-066 que muestra las etapas del proceso
de conjugación de CNT y anti-EpCam.
Ventajas de NSMP
Los NSMP de la presente invención demuestran mayor dispersabilidad en fluidos biológicamente relevantes y captura de forma fiable de células cancerosas de la suspensión de CTC de concentración clínicamente relevante con aproximadamente 95 % de exactitud.
El NSMP proporciona una alternativa conveniente, rentable y de captura rápida de CTC para muestras clínicas. La viabilidad celular con la plataforma NSMP es de hasta el 90 %, que es propicia para liberar posteriormente las células, cultivarlas y realizar el diagnóstico molecular y clínico.
El uso de PNIPAM, un polímero inteligente termosensible, y el dendrímero PAMAM G4 potencia significativamente la dispersabilidad del sistema multicomponente magnético de la presente invención. El sistema multicomponente confiere la conjugación de anticuerpos variados debido a la capacidad de ajuste químico. El sistema tiene sonda de obtención de imágenes simultánea a través del agente de infrarrojos cercano - Cianina.
El impacto global de la tecnología de captura de células NSMP se concibe más allá del posible beneficio de CTC en el diagnóstico precoz de enfermedades que se detectan por algunas tecnologías de captura de células.
El nanosistema multicomponente proporcionado aquí también puede encontrar aplicación en la detección de otras enfermedades conjugando biomarcadores específicos y componentes bioactivos. Por ejemplo, esta plataforma de tecnología se puede extender para la detección de otras enfermedades, específicamente enfermedades cardiovasculares e infecciosas, fijando anticuerpos específicos al nanosistema polimérico. Más específicamente, el cribado de infarto agudo de miocardio detectando los niveles de troponina T en sangre usando sistemas magnéticos anti-troponina específicos o la separación inmunomagnética de organismos patógenos de matrices medioambientales.
Definiciones
Las células o anticuerpos como se proporciona en esta memoria descriptiva son cualquier célula o anticuerpo que se dirija específicamente a células cancerosas. Estos pueden ser anticuerpos de interacción con biomoléculas que ya se conocen, por ejemplo, los publicados en cualquier parte, o anticuerpos o proteínas novedosos.
Los alótropos de carbono como se proporcionan aquí incluyen nanotubos de carbono de una sola pared o de pared múltiple (CNT), grafeno o nanocuernos. Estarán en formas oxidadas o no oxidadas o funcionalizados con otros grupos reactivos.
Los dendrímeros o polímeros de cuarta generación PAMAM (G4) son poligliceroles, poliaminas o polímeros hiperramificados reactivos y modificados que se acoplan a COOH, NH2, OH u otros grupos reactivos.
Estos dendrímeros o polímeros hiperramificados proporcionan la fijación simultánea de múltiples grupos funcionales. La glutatión (GSH), como se proporciona aquí, sirve de conector reactivo multifuncional. Se pueden usar en la presente invención otros conectores reactivos que incluyen ácido cítrico, moléculas pequeñas con funcionalidad tiol, cadenas reactivas alifáticas y otros aminoácidos reactivos.
Ejemplos:
Caracterización de NSMP
Se investigó la estructura de nanopartículas de Fe3O4 por TEM como se muestra en la Figura 1. Se estima que el tamaño promedio de las partículas de Fe3O4 en la matriz es ~ 17 nm. La distribución de tamaño de las nanopartículas de Fe3O4 se da en la Figura 1.
Se caracterizó la química superficial de los nanoconjugados por reflectancia total atenuada (ATR-IR). Como se muestra en la Figura 2 (A,B), el espectro de AIR-001, AIR-002, AIR-003, AIR-005, y AIR-007, AIR-012 mostró nuevos picos en comparación con el nanosistema precedente debido a la nueva conjugación de componentes. Así, la caracterización de IR demostró ser una conjugación satisfactoria de todos los componentes.
Alta dispersabilidad
AIR-72 mostró una excelente dispersabilidad en comparación con nanopartículas de Fe3O4. La suspensión de AIR-072 mostró un color marrón claro uniforme debido a AIR-072 dispersado incluso después de 3 min de confirmar su mayor capacidad de dispersión (Figura 3). Sin embargo, en caso de nanopartículas de Fe3O4, la mayoría de las partículas sedimentaron después de 3 min. La dispersabilidad más alta de AIR-072 resultó de la presencia de dendrímeros hidrófilos PAMAM G4 y PNIPAM.
Propiedades ópticas de NSMP
Se confirmó la conjugación de Cy5 en AIR-007 por mediciones de fluorescencia. Se da la comparación del espectro de fluorescencia (Aex= 600 nm) de NSMP con el de Cy5 libre en la Figura 4. El NSMP presentó el pico típico de emisión de Cy5 como se muestra en la Figura 4. La fluorescencia máxima de Cy5 mostró un desplazamiento hacia el rojo tras la conjugación con AIR-007 debido a cambios en la conformación. Esto confirma además la conjugación de Cy5 con AIR-007. Se evaluó la cantidad de Cy5 conjugada con NSMP usando espectrofotometría de uV-visible. Se encontró que se conjugaban aproximadamente 60 |jg de Cy5 por g de AIR-007.
Conjugación de Tf con NSMP
Se cuantificó la fijación de Tf sobre NSMP por el procedimiento de Bradford. Se representó la curva de calibración usando el patrón de proteína BSA (50 jg/ml) en agua milliQ. Para estimar la cantidad de conjugación de Tf, se tomó la disolución antes y después de la reacción de conjugación de Tf para AIR-056 en placa de 96 pocillos para el análisis. Se añadieron a cada pocillo 300 j l de 5X reactivo del ensayo de proteínas diluidas Bio-rad y se incubó durante 5 minutos. Se midió la absorbancia a 570 nm en un lector de microplacas. Se encontró que la cantidad de Tf
conjugada era 74,7 mg por gramo de NSMP.
Captura de células mediada por el nanosistema NSMP conjugado con Tf
Se evaluaron los nanosistemas NSMP - AIR-012, AIR-010 (con y sin Tf), AIR-055, AIR-056 (con y sin Tf) para la rápida captura de células cancerosas incubando con la línea celular de carcinoma colorrecta1HCT116 TfR+ durante 3 min. Además, también se estudiaron los componentes usados para sintetizar los nanosistemas NSMP para evaluar la captura de células no específicas. Se observó que la capacidad de captura de células de AIR-012 con Tf era superior a la de los otros conjugados y componentes (Figura 5). La eficacia de captura de células de NSMP fue ~ 100 %. Se encontró que la capacidad de captura de células cancerosas era AIR-012 > AIR-056 > AIR-055 > AIR-005 >> CNT > Fe3O4 (Figura 6).
Captura de células mediada por el nanosistema NSMP conjugado con EpCam
Se evaluó la eficiencia de captura de células cancerosas de NSMP con el anticuerpo contra EpCam. Por tanto, se evaluaron los nanosistemas NSMP AIR-060 y AIR-011 (con y sin EpCam) incubando con células HCT116 durante 3 min. Los presentes inventores observaron que la capacidad de captura de células de AIR-060 con EpCam era superior a la del conjugado sin EpCam (Figura 7). La eficacia de captura de células de NSMP fue ~ 99 % (Figura 8).
Eficiencia de captura de células mediada por el nanosistema NSMP conjugado con EpCam a partir de suspensión de CTC enriquecida
Se evaluó la eficiencia de captura de células cancerosas cuando se mezclaron con CMSPh de NSMP con el anticuerpo contra EpCam. Se prepararon muestras de CTC enriqueciendo CMSPh con células HCT116 marcadas con sonda fluorescente doble, las células HCT116 en la relación específica (1:1000). Por tanto, se evaluaron los nanosistemas de NSMP AIR-060 y AIR-039 (con y sin EpCam) incubando suspensión de CTC artificial durante 3 min. Se observó que la capacidad de captura de células de AIR-060 con EpCam era superior a la del conjugado sin EpCam. La eficacia de captura de células cancerosa de NSMP con EpCam fue ~ 80% (Figura 9).
Captura de células cancerosas mediada por el nanosistema NSMP conjugado con EpCam
Se evaluaron los nanosistemas NSMP AIR-072 y AIR-071 (con y sin EpCam) incubando con un número muy bajo de células HCT116 (10 células) durante 3 min. Se observó que AIR-072 con EpCam tuvo excelente capacidad en el direccionamiento y aislamiento de células HCT116 (Figura 10).
Eficiencia de captura de células mediada por el nanosistema NSMP conjugado con EpCam a partir de suspensión artificial de CTC de concentración clínicamente relevante
Se evaluó la eficiencia de captura de células cancerosas de NSMP en muestras de CTC en las concentraciones clínicamente relevantes (aproximadamente una CTC por cada 105 glóbulos sanguíneos). Se prepararon muestras de CTC enriqueciendo CMSPh con células HCT116 marcadas con GFP en la relación específica (1:105). Se evaluaron los nanosistemas NSMP AIR-072 y AIR-071 (con y sin EpCam) incubando durante 3 min en suspensión de CTC. Se observó que la capacidad de captura de células de AIR-072 con EpCam era superior a la del conjugado sin EpCam. La eficacia de captura de células de NSMP fue ~ 95 para las células HCT116 marcadas con sonda fluorescente doble y 100 % para las células HCT116 teñidas con Da Pi (Figura 11).
Captura de CTC usando sujetos con cáncer (Tabla 1 y Figura 12)
Se desarrollaron el nanosistema NSMP AIR-EpCAM y grafeno-EpCAM para aislar CTC de muestras de sangre completa de pacientes con cáncer. Se obtuvieron muestras de sangre de sujetos con cáncer clínico y se eliminaron los RBC mediante tratamiento con tampón de lisis de RBC. La muestra restante se mezcló con el nanosistema NSMP EpCAM o grafeno EpCAM y se aisló con captura magnética. Se fijaron las células capturadas y no capturadas adicionales con formaldehído y se tiñeron con citoqueratina (CK)-18-FITC y CD45-PE para detectar específicamente células cancerosas y glóbulos sanguíneos (leucocitos), respectivamente (Figura 12).
Tabla 1. Indica el número de CTC capturadas en sujetos con cáncer rectal, de colon, de pulmón y de mama.
Claims (6)
1. Un nanosistema multicomponente biofuncional que comprende:
(i) un anticuerpo específico o no específico de CTC que se dirige a células cancerosas, preferentemente un anticuerpo anti-transferrina (Tf) o anti-EpCam, o una biomolécula que se dirige a células cancerosas;
(ii) nanopartículas de óxido de hierro (Fe3O4);
(iii) sonda de infrarrojos cercano de NHS de cianina5 (Cy5);
(v) alótropos de carbono para la interacción con las células cancerosas;
(vi) poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAM);
(vii) dendrímeros o polímeros de cuarta generación (G4) seleccionados del grupo que consiste en poligliceroles, poliaminas y polímeros hiperramificados; y
(viii) glutatión (GSH) para direccionamiento celular, aislamiento y obtención de imágenes de células cancerosas circulantes.
2. El nanosistema multicomponente biofuncional de la reivindicación 1, en donde dicho alótropo de carbono se selecciona del grupo que consiste en nanotubos de carbono de una sola pared o de pared múltiple, grafeno y nanocuernos.
3. El nanosistema multicomponente biofuncional de la reivindicación 1, en donde dichos dendrímeros o polímeros de cuarta generación (G4) se acoplan a COOH, NH2, OH u otros grupos reactivos.
4. Un proceso de síntesis de un nanosistema multicomponente biofuncional que comprende las etapas de:
a) sintetizar nanopartículas magnéticas de Fe3O4 precipitando simultáneamente iones Fe2+ y Fe3+ por disolución de amoniaco y tratar en condiciones hidrotérmicas;
b) anclaje de glutatión con Fe3O4;
c) síntesis de conjugado de Fe3O4-GSH-dendrímero PAMAM G4;
d) síntesis de conjugado de Fe3O4-GSH-PAMAM G4-CNT o grafeno;
e) síntesis de conjugado de Fe3O4-GSH-PAMAM G4-CNT o grafeno-Cy5-PNIPAM;
f) síntesis de conjugado de Fe3O4-GSH-PAMAM G4-CNT o grafeno-Cy5-PNIPAM-Tf; y
g) síntesis de conjugado de Fe3O4-GSH-PAMAM G4-CNT o grafeno-Cy5-PNIPAM-anti EpCam.
5. Uso del nanosistema multicomponente biofuncional de las reivindicaciones 1 a 3 o el producto del proceso según la reivindicación 4 en el diagnóstico in vitro/ex vivo del cáncer.
6. Un kit que comprende un nanosistema multicomponente biofuncional que comprende un anticuerpo específico o no específico de CTC que se dirige a células cancerosas, preferentemente un anticuerpo anti-transferrina (Tf) o anti-EpCam, nanopartículas de óxido de hierro (Fe3O4), sonda de infrarrojos cercano de NHS de cianina5 (Cy5), alótropos de carbono, poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAM), dendrímeros o polímeros de cuarta generación (G4) tales como poligliceroles/poliiminas y glutatión (GSH).
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