ES2824248T3 - Genes y genes distintivos para el diagnóstico y tratamiento de melanoma - Google Patents

Genes y genes distintivos para el diagnóstico y tratamiento de melanoma Download PDF

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Abstract

Un método para diagnosticar melanoma en un paciente que comprende: a) medir el nivel de expresión de un panel de genes que comprenden PRAME, S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, S100A10, S100A14, PI3, CCL5, CD38, CXCL10, CXCL9, IRF1, LCP2, PTPN22, y PTPRC en una muestra que se ha obtenido de un paciente; b) comparar el nivel de expresión de dicho panel de genes en la muestra del paciente a un nivel de expresión de dicho panel de genes medidos en una muestra de un individuo que no sufre de melanoma; y c) detectar una diferencia en el nivel de expresión de dicho panel de genes en el paciente, en el que una diferencia en el nivel de expresión de dicho panel de genes en el paciente indica un diagnóstico de melanoma en el paciente.

Description

DESCRIPCIÓN
Genes y genes distintivos para el diagnóstico y tratamiento de melanoma
Campo de la invención
La invención se refiere en general a una clasificación molecular de enfermedades y en particular a genes y genes distintivos para el diagnóstico de melanoma y métodos de uso de los mismos.
Antecedentes de la invención
En los Estados Unidos, se diagnosticarán más de 76,000 nuevos casos de melanoma en 2013. American Cancer Society, FACTS AND FIGURES 2013. El tratamiento del melanoma en una etapa anterior se asocia con tasas de supervivencia más altas en los pacientes. Por tanto, subsiste una gran necesidad de avances en los métodos de diagnóstico y tratamiento tempranos del melanoma. Los documentos de patente US 2012/071343, WO 2011/039734 y US 2011/070268 divulgan la asociación de marcadores de expresión con melanoma.
La publicación en la revista de Tanese et al., 2012, INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, vol. 131, no. 4, páginas 891-901 divulga la función del CXCL10 en el desarrollo del melanoma.
Breve resumen de la invención
Se divulgan paneles de biomarcadores, métodos y sistemas para determinar la expresión génica y diagnosticar y tratar el melanoma.
En un primer aspecto, la divulgación se relaciona con métodos de diagnóstico de melanoma en un paciente. En general, dichos métodos comprenden medir en una muestra obtenida del paciente la expresión de uno o más genes, o un panel de genes. Los genes pueden ser genes del ciclo celular, genes inmunitarios o genes adicionales como se define en este documento. Los genes se pueden seleccionar de la Tabla 1, la Tabla 3 o uno de los muchos paneles definidos específicamente (Paneles AI o paneles en las Tablas WW-ZZ). El método también puede comprender comparar los niveles de expresión medidos de uno o más genes con los niveles de expresión del mismo uno o más genes medidos en una muestra de referencia. La detección de una diferencia en los niveles de expresión de uno o más genes indica que el paciente tiene melanoma.
En un segundo aspecto, la divulgación se relaciona con métodos para detectar niveles anormales de expresión génica en una lesión cutánea. En general, los métodos comprenden medir en una lesión cutánea obtenida de un paciente la expresión de uno o más genes, o un panel de genes. Los genes pueden ser genes del ciclo celular, genes inmunitarios o genes adicionales como se define en este documento. Los genes se pueden seleccionar de la Tabla 1, la Tabla 3 o uno de los muchos paneles definidos específicamente (Paneles A-I o paneles en las Tablas WW-ZZ). El método también puede comprender comparar los niveles de expresión medidos de uno o más genes con los niveles de expresión del mismo uno o más genes medidos en una muestra de referencia. El método también puede comprender detectar un nivel anormal de expresión génica de al menos uno de uno o más genes.
En un tercer aspecto, la divulgación se relaciona con el tratamiento de un paciente con melanoma. En general, los métodos comprenden medir en una lesión cutánea obtenida de un paciente la expresión de uno o más genes, o un panel de genes. Los genes pueden ser genes del ciclo celular, genes inmunitarios o genes adicionales como se define en este documento. Los genes se pueden seleccionar de la Tabla 1, la Tabla 3 o uno de los muchos paneles definidos específicamente (Paneles AI o paneles en las Tablas WW-ZZ). El método también puede comprender comparar los niveles de expresión medidos de uno o más genes con los niveles de expresión del mismo uno o más genes medidos en una muestra de referencia. El método también puede comprender detectar un nivel anormal de expresión génica de al menos uno de uno o más genes, y alterar el tratamiento del paciente basándose, al menos en parte, en la diferencia.
También se divulgan sistemas, composiciones y kits para ayudar a detectar niveles anormales de expresión génica, diagnosticar melanoma o tratar melanoma.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación, se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación, que incluye las definiciones. Adicionalmente, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un sistema para realizar métodos asistidos por ordenador de diagnóstico, detección, cribado y/o tratamiento de melanoma en un paciente.
La Figura 2 muestra la distribución de las puntuaciones de CCP de las 30 muestras con una puntuación y separadas por diagnóstico clínico. Las muestras de melanoma tienen distribuciones estadísticamente diferentes cuando se comparan con las muestras de nevos.
La Figura 3 muestra las distribuciones de los 88 ensayos de amplicones individuales probados en las Rondas 1, 2 y 3 del descubrimiento de biomarcadores. El análisis se realizó en 30 muestras del Grupo 1 (círculos negros) y 53 muestras del Grupo 2 (círculos grises).
La Figura 4 muestra las distribuciones de cada amplicón individual probado en la Ronda 1 y 2 del descubrimiento de biomarcadores. Las muestras se diferencian en base a su subtipo patológico sobre el eje Y. La expresión relativa (Ct) de cada gen (en comparación con la expresión de los genes constitutivos) se grafica sobre el eje X. Cada amplicón se identifica por el nombre del gen y los últimos tres dígitos del ID del ensayo.
La Figura 5 muestra la expresión normalizada de PRAME en cada muestra, diferenciada tanto por el sitio como por el subtipo histológico. Las muestras malignas son negras, mientras que las muestras benignas son de color gris.
La Figura 6 muestra la expresión de cada uno de los 8 mejores genes inmunitarios. Cada uno de los genes tenía una relación lineal con la expresión promedio de los 8 genes inmunitarios (lo que indica que todos miden el mismo proceso biológico). Adicionalmente, todos los genes inmunitarios pueden diferenciar muestras de melanoma y nevos (de color negro y gris, respectivamente).
La Figura 7 muestra gráficos de la expresión de cada marcador (de PRAME, el promedio de los 8 genes inmunitarios y S100A9) graficados contra los otros marcadores. Los datos de cada sitio se graficaron por separado. La falta de una alta correlación entre cada biomarcador indica que es probable que cada uno mida diferentes procesos biológicos y que cada uno tenga un valor independiente.
La Figura 8 muestra la puntuación generada por el modelo de diagnóstico, utilizando la expresión de PRAME, los genes inmunitarios y S100A9. Esta puntuación se utilizó para diferenciar el melanoma maligno y los nevos benignos. La Figura 9 muestra una curva AUROC generada a partir del conjunto de datos, utilizando la puntuación producida a partir del modelo. El AUC de la curva ROC es ~0.96.
La Figura 10 muestra la distribución de puntuaciones (eje x) de todas las muestras probadas. Los datos se diferencian por diagnóstico primario. El panel superior muestra las puntuaciones de las muestras malignas. El panel inferior muestra las puntuaciones de las muestras benignas.
La Figura 11 muestra una curva AUROC generada a partir del conjunto de datos en función de la capacidad del modelo para diferenciar muestras de melanoma y nevos. El AUC de la ROC es ~0.95. Se muestran sensibilidad y especificidad. La Figura 12 muestra la distribución de puntuaciones (eje x) de todas las muestras probadas para la cohorte de validación. Los datos se diferencian por diagnóstico primario. El panel superior muestra las puntuaciones de las muestras malignas. El panel inferior muestra las puntuaciones de las muestras benignas.
La Figura 13 muestra una curva AUROC generada en base a la cohorte de validación. El AUC de la ROC es ~0.96. Se muestran sensibilidad y especificidad.
Descripción detallada de la invención
Genes y paneles
En el presente documento se divulgan biomarcadores genéticos y paneles de biomarcadores, métodos y sistemas para determinar la expresión génica y métodos para diagnosticar el melanoma. Se debe entender que todos los métodos y sistemas divulgados están destinados a ser utilizados junto con biomarcadores como se describe en el presente documento. En particular, cualquier panel divulgado se puede utilizar con cualquier método o sistema de esta divulgación. Adicionalmente, se pueden utilizar subpaneles de cualquier panel divulgado, como se describe a continuación.
Los biomarcadores genéticos y los paneles de biomarcadores son útiles, al menos en parte, por su poder predictivo para determinar si un individuo tiene melanoma. Se ha descubierto que el poder predictivo de un panel o grupo de genes a menudo deja de aumentar significativamente más allá de cierto número. Más específicamente, el número óptimo de genes en un panel, o utilizado para generar un valor de prueba, se puede encontrar siempre que se cumpla lo siguiente
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en el que P es el poder predictivo (es decir, Pn es el poder predictivo de un gen distintivo con n genes y Pn+1 es el poder predictivo de un gen distintivo con n genes más uno) y CO es alguna constante de optimización. El poder predictivo se puede definir de muchas formas conocidas por aquellos expertos en la técnica, que incluyen, pero sin limitarse a, el valor p del gen distintivo. El experto puede elegir el CO en base a sus limitaciones específicas. Por ejemplo, si el coste no es un factor crítico y se desean niveles extremadamente altos de sensibilidad y especificidad, el CO puede establecerse muy bajo de manera que solo se ignoren los aumentos triviales en el poder predictivo. Por otro lado, si el coste es decisivo y los niveles moderados de sensibilidad y especificidad son aceptables, el CO se puede establecer más alto de manera que solo aumentos significativos en el poder predictivo justifiquen el aumento del número de genes en el gen distintivo.
Adicionalmente, un experto reconocería que los paneles individuales se pueden combinar para generar paneles adicionales de acuerdo con esta divulgación, y que la combinación de dos paneles con un poder predictivo aceptable dará como resultado un panel combinado con un poder predictivo aceptable. Adicionalmente, un experto reconocería que si bien los genes individuales se describen en este documento como pertenecientes a ciertos grupos (es decir, Genes del Ciclo Celular, genes inmunitarios, etc.), todos los paneles y genes divulgados en este documento están unificados por su capacidad común para ayudar a determinar la expresión génica y tratar y diagnosticar melanoma.
Genes CCP
La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que los niveles de expresión de genes CCP en una muestra de un paciente sospechoso de tener melanoma predicen si el paciente será diagnosticado con melanoma, y además que otros genes, agregan un poder de predicción significativo cuando se combina con genes CCP (“CCG”).
“Gen del ciclo celular” y “CCG” en el presente documento se refieren a un gen cuyo nivel de expresión sigue de cerca la progresión de la célula a través del ciclo celular. Véase, por ejemplo, Whitfield et al., Mol. Biol. Cell (2002) 13: 1977­ 2000. El término “progresión del ciclo celular” o “CCP” también se utilizará en esta solicitud y en general será intercambiable con CCG (es decir, un gen CCP es un CCG; una puntuación CCP es una puntuación CCG). Más específicamente, los CCG muestran aumentos y disminuciones periódicos en la expresión que coinciden con ciertas fases del ciclo celular; por ejemplo, STK15 y PLK muestran una expresión pico en g 2/M. Id. A menudo, los CCG tienen una función clara y reconocida relacionada con el ciclo celular, por ejemplo, en la síntesis o reparación del ADN, en la condensación cromosómica, en la división celular, etc. Sin embargo, algunos CCG tienen niveles de expresión que rastrean el ciclo celular sin tener una función directa obvia en el ciclo celular, por ejemplo, UBE2S codifica una enzima conjugadora de ubiquitina, pero su expresión sigue de cerca el ciclo celular. Por tanto, un CCG de acuerdo con la presente invención no necesita tener una función reconocida en el ciclo celular. En las Tablas 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 y 9 se enumeran ejemplos de CCG. Se puede encontrar una discusión adicional de los CCG que incluye una lista extensa (aunque no exhaustiva) de los CCG, en la Solicitud Internacional No. PCT /US2010/020397 (publicación no. WO/2010/080933) (véase, por ejemplo, Tabla 1 en el documento WO/2010/080933). Solicitud Internacional No. PCT/US2010/020397 (publicación no. WO/2010/080933 (véase también la Solicitud de Estados Unidos correspondiente No. 13/177,887)) y Solicitud Internacional No. PCT/ US2011/043228 (publicación no. WO/2012/006447 (véase también la Solicitud de Estados Unidos relacionada No. 13/178,380)).
Si un gen particular es un CCG se puede determinar mediante cualquier técnica conocida en la materia, que incluye aquellas enseñadas en Whitfield et al., Mol. Biol. Cell (2002) 13: 1977-2000; Whitfield et al., Mol. Cell. Biol. (2000) 20: 4188-4198; WO/2010/080933 (). Todos los CCG en la Tabla 1 a continuación forman un panel de CCG (“Panel A”). Como se mostrará en detalle a lo largo de este documento, también se pueden utilizar CCG individuales (por ejemplo, CCG en la Tabla 1) y subconjuntos de estos genes.
Tabla 1
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De acuerdo con lo anterior, en un primer aspecto de la presente divulgación, se divulgan paneles de genes que comprenden CCG para utilizar en la determinación de la expresión génica y para diagnosticar y tratar el melanoma. En algunas realizaciones, el uso de paneles que comprenden CCG comprende determinar la expresión de los CCG en una muestra de un individuo o paciente.
La expresión génica se puede determinar a nivel de ARN (es decir, ARNm o ARN no codificante (ARNnc)) (por ejemplo, ARNmi, ARNt, ARNr, ARNnp, ARNip y ARNpi) o a nivel de proteína. La medición de la expresión génica a nivel de ARNm incluye medir los niveles de ADNc correspondientes al ARNm. Los niveles de proteínas en una muestra se pueden determinar mediante cualquier técnica conocida en la materia, por ejemplo, HPLC, espectrometría de masas o utilizando anticuerpos específicos para proteínas seleccionadas (por ejemplo, IHC, ELISA, etc.).
En una realización, se mide en la muestra la cantidad de ARN transcrito del panel de genes que incluyen genes de prueba. Adicionalmente, también se mide la cantidad de ARN de uno o más genes constitutivos en la muestra y se utiliza para normalizar o calibrar la expresión de los genes de prueba. Los términos “genes de normalización” y “genes constitutivos” se definen a continuación en el presente documento.
En cualquier realización de la invención que implica una “pluralidad de genes de prueba,” la pluralidad de genes de prueba puede incluir al menos 2, 3 o 4 genes de ciclo celular, que constituyen al menos 50%, 75% o 80% de la pluralidad de genes de prueba, y en algunas realizaciones 100% de la pluralidad de genes de prueba. En algunas realizaciones, la pluralidad de genes de prueba incluye al menos 5, 6, 7, o al menos 8 genes de ciclo celular, que constituyen al menos 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% o 90% de la pluralidad de genes de prueba, y en algunas realizaciones 100% de la pluralidad de genes de prueba. Como quedará claro a partir del contexto de este documento, un panel de genes es una pluralidad de genes. Normalmente estos genes se ensayan juntos en una o más muestras de un paciente.
En algunas otras realizaciones, la pluralidad de genes de prueba incluye al menos 8, 10, 12, 15, 20, 25 o 30 genes de ciclo celular, que constituyen al menos 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% o 90% de la pluralidad de genes de prueba, y preferiblemente 100% de la pluralidad de genes de prueba.
Como resultará evidente para un experto en la materia que conozca la presente invención y la divulgación en este documento, “muestra” significa cualquier muestra biológica que contenga una o más células de melanoma sospechosas, o uno o más ARN o proteína derivada de células de melanoma sospechosas, y obtenido de un paciente. Por ejemplo, una muestra de tejido obtenida de un lunar o nevo es una muestra útil en la presente invención. La muestra de tejido puede ser una muestra de FFPE o una muestra fresca congelada, y preferiblemente contener en gran parte las células sospechosas. Una sola célula del presunto melanoma de un paciente también es una muestra útil. Dicha célula se puede obtener directamente de la piel del paciente o purificar del fluido corporal del paciente (por ejemplo, sangre, orina). Por tanto, un fluido corporal tal como sangre, orina, esputo y saliva que contiene una o más células sospechosas de ser cancerosas, o ARN o proteínas derivados de lunar o nevo, también puede ser útil como muestra para los fines de la práctica de la presente invención.
Aquellos expertos en la técnica están familiarizados con diversas técnicas para determinar el estado de un gen o proteína en una muestra de tejido o célula, que incluyen, pero no se limitan a, análisis de micromatrices (por ejemplo, para analizar la expresión de ARNm o ARNmicro, número de copias, etc.), PCR™ cuantitativa en tiempo real (“qRT-PCR™”, por ejemplo, TaqMan™), inmunoanálisis (por ejemplo, ELISA, inmunohistoquímica), etc. El nivel de actividad de un polipéptido codificado por un gen se puede utilizar de la misma forma que el nivel de expresión del gen o polipéptido. A menudo, los niveles de actividad más altos indican niveles de expresión más altos y mientras que los niveles de actividad más bajos indican niveles de expresión más bajos. Por tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona cualquiera de los métodos discutidos anteriormente, en los que el nivel de actividad de un polipéptido codificado por c Cg se determina en lugar de o además del nivel de expresión de CCG. Aquellos expertos en la materia están familiarizados con las técnicas para medir la actividad de varias de dichas proteínas, que incluyen aquellas codificadas por los genes enumerados en la Tabla 1. Los métodos de la invención se pueden practicar independientemente de la técnica particular utilizada.
En algunas realizaciones, la expresión de uno o más genes de normalización (a menudo denominados “constitutivo” o “constitutivos”) también se obtiene para su uso en la normalización de la expresión de genes de prueba. Como se utiliza en este documento, “genes de normalización” se refiere a los genes cuya expresión se utiliza para calibrar o normalizar la expresión medida del gen de interés (por ejemplo, genes de prueba). Es importante destacar que la expresión de los genes de normalización debe ser independiente del diagnóstico de cáncer, y la expresión de los genes de normalización es muy similar entre todas las muestras. La normalización asegura una comparación precisa de la expresión de un gen de prueba entre diferentes muestras. Para este propósito, se pueden utilizar genes constitutivos conocidos en la técnica. Los genes constitutivos son bien conocidos en la técnica, con ejemplos que incluyen, pero no se limitan a, GUSB (glucuronidasa, beta), HMBS (hidroximetilbilano sintasa), SDHA (complejo succinato deshidrogenasa, subunidad A, flavoproteína), UBC (ubiquitina C), YWHAZ (proteína de activación de tirosina 3-monooxigenasa/triptófano 5-monooxigenasa, polipéptido zeta), MRFAP1, PSMA1, RPL13A, TXNL1, SLC25A3, RPS29, RPL8, PSMC1 y RPL4. Se pueden utilizar uno o más genes constitutivos. Preferiblemente, se utilizan al menos 2, 5, 10 o 15 genes constitutivos para proporcionar un conjunto de genes de normalización combinados. La cantidad de expresión génica de dichos genes de normalización se puede promediar, combinar mediante adiciones directas o mediante un algoritmo definido. Algunos ejemplos de genes constitutivos particularmente útiles para su uso en los métodos y composiciones de la invención incluyen aquellos enumerados en la Tabla 2 a continuación.
Tabla 2
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En el caso de medir los niveles de ARN para los genes, un enfoque conveniente y sensible es el ensayo PCR™ cuantitativo (qPCR) en tiempo real, después de una reacción de transcripción inversa. Normalmente, se determina un umbral de ciclo (Ct) para cada gen de prueba y cada gen de normalización, es decir, el número de ciclos en los que es detectable la fluorescencia de una reacción de qPCR por encima del fondo.
La expresión general de uno o más genes de normalización puede representarse mediante un “valor de normalización” que se puede generar al combinar la expresión de todos los genes de normalización, ponderados por igual (suma directa o promediación) o por diferentes coeficientes predefinidos. Por ejemplo, de la manera más simple, el valor de normalización de CtH puede ser el umbral de ciclo (Ct) de un solo gen de normalización, o un promedio de los valores de Ct de 2 o más, preferiblemente 10 o más, o 15 o más genes de normalización, en cuyo caso, el coeficiente predefinido es 1/N, donde N es el número total de genes de normalización utilizados. Por tanto, CtH = (CtH1 CtH2 ■■■ CtHn)/N. Como resultará evidente para aquellos expertos en la técnica, dependiendo de los genes de normalización utilizados y del peso que se desee dar a cada gen de normalización, se puede dar cualquier coeficiente (de 0/N a N/N) a los genes de normalización al ponderar la expresión de dichos genes de normalización. Es decir, CtH = xCtm yCtH2 ■ ■■ zCtHn, donde x y ■■■ z = 1.
Como se discutió anteriormente, los métodos de la invención generalmente implican determinar el nivel de expresión de un panel de CCG. Con técnicas modernas de alto rendimiento, a menudo es posible determinar el nivel de expresión de decenas, cientos o miles de genes. De hecho, es posible determinar el nivel de expresión de todo el transcriptoma (es decir, cada secuencia transcrita en el genoma). Una vez que se ha realizado dicho ensayo general, se puede analizar entonces de forma informática uno o más subconjuntos de transcripciones (es decir, paneles o, como se utiliza a menudo en este documento, pluralidades de genes de prueba). Después de medir la expresión de cientos o miles de transcripciones en una muestra, por ejemplo, se puede analizar (por ejemplo, de manera informática) la expresión de un panel o una pluralidad de genes de prueba que comprenden principalmente CCG de acuerdo con la presente invención al combinar los valores del nivel de expresión de los genes de prueba individuales para obtener un valor de prueba.
Como resultará evidente para un experto en la técnica, el valor de prueba proporcionado en la presente invención representa el nivel de expresión general de la pluralidad de genes de prueba compuestos sustancialmente por genes del ciclo celular. En una realización, para proporcionar un valor de prueba en los métodos de la invención, la expresión normalizada para un gen de prueba se puede obtener al normalizar la Ct medida para el gen de prueba frente a CtH, es decir, ACti = (Cti - CtH). Por tanto, el valor de prueba que representa la expresión general de la pluralidad de genes de prueba se puede proporcionar al combinar la expresión normalizada de todos los genes de prueba, ya sea por adición directa o promediando (es decir, ponderados por igual) o por un coeficiente predefinido diferente. Por ejemplo, el enfoque más simple es promediar la expresión normalizada de todos los genes de prueba: valor de prueba = (ACti ACt2 ■■■ ACtn)/n. Como resultará evidente para los expertos en la materia, dependiendo de los genes de prueba utilizados, también se puede dar un peso diferente a diferentes genes de prueba en la presente invención. En cada caso en el que este documento divulgue el uso de la expresión de una pluralidad de genes (por ejemplo, “determinar [en una muestra del paciente] la expresión de una pluralidad de genes de prueba” o “correlacionar el aumento de expresión de dicha pluralidad de genes de prueba con una mayor probabilidad de tener melanoma”), esto incluye, en algunas realizaciones, utilizar un valor de prueba que representa, corresponde a, derivar o calcular a partir de la expresión general de esta pluralidad de genes (por ejemplo, “determinar [en una muestra del paciente] un valor de prueba que representa la expresión de una pluralidad de genes de prueba” o “correlacionar un valor de prueba aumentado [o un valor de prueba por encima de algún valor de referencia] (que opcionalmente representa la expresión de dicha pluralidad de genes de prueba) con una probabilidad aumentada de respuesta”).
Se ha determinado que, una vez que se aprecia el fenómeno CCP reportado en este documento, la elección de CCG individuales para un panel de prueba puede ser a menudo algo arbitraria. En otras palabras, se ha encontrado que muchos CCG son muy buenos sustitutos entre sí. Por tanto, se puede utilizar cualquier CCG (o panel de CCG) en las diversas realizaciones de la invención. En otras realizaciones de la invención, se utilizan CCG optimizados. Una forma de evaluar si los CCG particulares servirán bien en los métodos y composiciones de la invención es al evaluar su correlación con la expresión media de los CCG (por ejemplo, todos los CCG conocidos, un conjunto específico de CCG, etc.). Se espera que los CCG que se correlacionan particularmente bien con la media funcionen bien en los ensayos de la invención, por ejemplo, porque reducirán el ruido en el ensayo.
Por lo tanto, en algunas realizaciones de cada uno de los varios aspectos de la invención la pluralidad de genes de prueba comprende en la parte superior 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, Í2, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o más CCG del Panel A. En algunas realizaciones de cada uno de los varios aspectos de la invención la pluralidad de genes de prueba comprende en la parte superior 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 CCG del Panel B. En algunas realizaciones la pluralidad de genes de prueba comprende al menos algún número de los CCG (por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más CCG) y esta pluralidad de los CCG comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de los genes en el Panel B. En algunas realizaciones la pluralidad de genes de prueba comprende al menos algún número de los CCG (por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más CCG) y esta pluralidad de los CCG comprende cualquier dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez de números de genes 1 y 2, 1 a 3, 1 a 4, 1 a 5, 1 a 6, 1 a 7, 1 a 8, 1 a 9, o 1 a 10 de cualquiera de los genes en el Panel B (en base al orden de la apariencia en la Tabla 1). En algunas realizaciones la pluralidad de genes de prueba comprende al menos algún número de los CCG (por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más CCG) y esta pluralidad de los CCG comprende cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, o nueve o todos los números de genes 2 y 3, 2 a 4, 2 a 5, 2 a 6, 2 a 7, 2 a 8, 2 a 9, o 2 a 10 de cualquiera de los genes en el Panel B (en base al orden de la apariencia en la Tabla 1). En algunas realizaciones la pluralidad de genes de prueba comprende al menos algún número de los CCG (por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más CCG) y esta pluralidad de los CCG comprende cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, u ocho o todos los números de genes 3 y 4, 3 a 5, 3 a 6, 3 a 7, 3 a 8, 3 a 9, o 3 a 10 de cualquiera de los genes en el Panel B (en base al orden de la apariencia en la Tabla 1). En algunas realizaciones la pluralidad de genes de prueba comprende al menos algún número de los CCG (por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más CCG) y esta pluralidad de los CCG comprende cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, o siete o todos los números de genes 4 y 5, 4 a 6, 4 a 7, 4 a 8, 4 a 9, o 4 a 10 de cualquiera de los genes en el Panel B (en base al orden de la apariencia en la Tabla 1).
En otra realización, la pluralidad de los CCG o panel de los CCG comprende cualquier conjunto de genes de la Tabla WW.
Genes inmunitarios y adicionales
Adicionalmente, se ha descubierto sorprendentemente que los paneles de genes inmunitarios son diagnósticos de melanoma. De acuerdo con lo anterior, en otro aspecto de la presente divulgación, se divulgan paneles de genes que comprenden genes inmunitarios para utilizar en la determinación de la expresión génica y para diagnosticar y tratar el melanoma. En algunas realizaciones, el uso de paneles que comprenden genes inmunitarios comprende determinar la expresión de los genes inmunitarios en una muestra de un individuo o paciente.
En el presente documento, “gen inmunitario” se refiere a un gen asociado o expresado por uno o más leucocitos. En realizaciones particulares, los genes inmunitarios comprenden genes asociados con o expresados por linfocitos. En algunas realizaciones, los genes inmunitarios comprenden genes expresados por linfocitos activados. En algunas realizaciones, los genes inmunitarios comprenden genes expresados por células T. En algunas realizaciones, los genes inmunitarios comprenden genes expresados por células T activadas. En algunas realizaciones, los genes inmunitarios comprenden los genes inmunitarios identificados en la Tabla 3, a continuación.
TABLA 3
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La expresión génica de genes inmunitarios se puede determinar como se describió anteriormente con respecto a los CCG. En una realización, se mide en la muestra la cantidad de ARN transcrito del panel de genes que incluyen genes inmunitarios. Adicionalmente, también se mide la cantidad de ARN de uno o más genes constitutivos en la muestra y se utiliza para normalizar o calibrar la expresión de los genes de prueba. Los términos “genes de normalización” y “genes constitutivos” se definieron anteriormente.
En cualquier realización de la invención que implica una “pluralidad de genes de prueba,” la pluralidad de genes de prueba puede incluir al menos 2, 3 o 4 genes inmunitarios, que constituyen al menos 50%, 75% o 80% de la pluralidad de genes inmunitarios, y en algunas realizaciones 100% de la pluralidad de genes inmunitarios. En algunas realizaciones, la pluralidad de genes inmunitarios incluye al menos 5, 6, 7, o al menos 8 genes de ciclo celular, que constituyen al menos 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% o 90% de la pluralidad de genes inmunitarios, y en algunas realizaciones 100% de la pluralidad de genes inmunitarios. Como quedará claro a partir del contexto de este documento, un panel de genes es una pluralidad de genes. Normalmente estos genes se ensayan juntos en una o más muestras de un paciente.
En algunas otras realizaciones, la pluralidad de genes inmunitarios incluye al menos 8, 10, 12, 15, 20, 25 o 30 genes inmunitarios, que constituyen al menos 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% o 90% de la pluralidad de genes inmunitarios, y preferiblemente 100% de la pluralidad de genes inmunitarios.
La muestra utilizada para determinar la expresión de genes inmunitarios puede ser cualquier muestra como se describió anteriormente para CCG.
En el caso de medir los niveles de ARN para los genes inmunitarios, se puede utilizar un ensayo PCR™ cuantitativo (qPCR) en tiempo real con valores normalizados, como se describió anteriormente.
Como se discutió anteriormente, algunas realizaciones de los métodos divulgados generalmente implican determinar el nivel de expresión de un panel que comprende genes inmunitarios. Con técnicas modernas de alto rendimiento, a menudo es posible determinar el nivel de expresión de decenas, cientos o miles de genes. De hecho, es posible determinar el nivel de expresión de todo el transcriptoma (es decir, cada secuencia transcrita en el genoma). Una vez que se ha realizado dicho ensayo general, se puede analizar entonces de forma informática uno o más subconjuntos de transcripciones (es decir, paneles o, como se utiliza a menudo en este documento, pluralidades de genes de prueba). Después de medir la expresión de cientos o miles de transcripciones en una muestra, por ejemplo, se puede analizar (por ejemplo, de forma informática) la expresión de un panel o una pluralidad de genes de prueba que comprenden principalmente genes inmunitarios de acuerdo con la presente invención al combinar los valores del nivel de expresión de los genes de prueba individual para obtener un valor de prueba.
Por lo tanto, en algunas realizaciones de cada uno de los varios aspectos de la invención la pluralidad de genes de prueba comprende cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, o 28 genes inmunitarios del Panel E. En algunas realizaciones de cada uno de los varios aspectos de la invención la pluralidad de genes de prueba comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 genes inmunitarios del Panel F. En algunas realizaciones la pluralidad de genes de prueba comprende al menos algún número de genes inmunitarios (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o more genes inmunitarios) y esta pluralidad de genes inmunitarios comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, o 28 de los genes en el Panel E, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 genes inmunitarios del Panel F.
También se ha encontrado que genes adicionales pueden ser diagnósticos para melanoma. Sin estar limitado por la teoría, se considera que estos genes adicionales son no CCG y genes no inmunitarios, y comprenden ARPC2, BCL2A1, FABP7, FN1, GDF15, HEY1, KRT15, NCOA3, NR4A1, PHACTR1, PHIP, POU5F1, PRAME, PTN, RGS1, S100A9, SELL, SPP1, WIF1, y WNT2 (Panel G). De acuerdo con lo anterior, en otro aspecto de la presente divulgación, los paneles de genes que comprenden aquellos genes adicionales se divulgan para uso en la determinación de la expresión génica, y para diagnosticar y tratar melanoma.
En una realización, el panel comprende estos genes adicionales: BCL2A1, FABP7, FN1, HEY1, KRT15, PHACTR1, PRAME, PTN, RGS1, S100A9, SELL, y SPP1 (Panel H). En otra realización, el panel que comprende genes adicionales comprende PRAME y S100A9.
En resultados adicionales, esta divulgación proporciona paneles mezclados de genes que son útiles en la determinación de la expresión génica, y para diagnosticar y tratar melanoma. Estos paneles mezclados pueden comprender genes inmunitarios y CCG, o genes inmunitarios y genes del Panel G o H, o CCG y genes del Panel G o H. En una realización, el panel mezclado comprende uno o más CCG, uno o más genes inmunitarios, y uno o más genes adicionales del Panel G. En una realización, el panel mezclado comprende Panel D. En otra realización, el panel mezclado comprende PRAME, S100A9 y los genes del panel F.
En otra realización, el panel mezclado comprende uno o más CCG, uno o más genes inmunitarios, y uno o más genes adicionales del Panel H. En una realización de a panel mezclado, el panel mezclado (Panel I) comprende los genes del Panel C y los genes del Panel D.
En una realización de a panel mezclado, el panel mezclado) comprende genes relacionados con S100A9 y/o S100A9. Los genes relacionados con S100A9 pueden incluir genes que tienen una expresión altamente correlacionada en comparación con S100A9. Estos genes relacionados con S100A9 pueden incluir genes que están agrupados estrechamente con S100A9 sobre el cromosoma 1. Estos genes relacionados con S100A9 también pueden incluir genes que tienen un control de transcripción similar como S100A9. Las proteínas relacionadas con S100A9 también pueden ser parte de la misma ruta biológica. Los genes relacionados con S100A9 también pueden codificar proteínas que interactúan con la proteína codificada por S100A9. Como un ejemplo no limitante, el panel mezclado puede comprender S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, PI3, S100A10, y S100A14 (Panel J). Como un ejemplo no limitante, el panel mezclado puede comprender S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, y PI3 (Panel L).
En una realización alternativa, el panel mezclado comprende PRAME. En otra realización, el panel mezclado comprende S100A9. En aún otra realización, el panel mezclado comprende CCL5, CD38, CXCL10, CXCL9, IRF1, LCP2, PTPN22, o PTPRC. En otras realizaciones el panel mezclado comprende S100A7, S100A8, S100A12, PI3, S100A10, y S100A14. En algunas realizaciones, el panel mezclado comprende S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, y PI3. Por lo tanto, en algunas realizaciones de cada uno de los varios aspectos de la invención el panel de genes mezclados comprende cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6, o 7 genes relacionados con S100A9 del Panel J. En otras realizaciones de cada uno de los varios aspectos de la invención el panel de genes mezclados comprende cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6, o 7 genes relacionados con S100A9 del Panel L.
Por lo tanto, en algunas realizaciones de cada uno de los varios aspectos de la invención el panel de genes mezclados comprende PRAME, al menos uno de los genes del Panel J, y al menos uno de los genes del panel F. En algunas realizaciones, el panel mezclado comprende PRAME, S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, S100A10, S100A14, PI3, CCL5, CD38, CXCL10, CXCL9, IRF1, LCP2, PTPN22, y PTPRC.
Por lo tanto, en algunas realizaciones de cada uno de los varios aspectos de la invención el panel de genes mezclados comprende PRAME, al menos uno de los genes del Panel L, y al menos uno de los genes del panel F. En algunas realizaciones, el panel mezclado comprende PRAME, S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, PI3, CCL5, CD38, CXCL10, CXCL9, IRF1, LCP2, PTPN22, y PTPRC.
Por lo tanto, en algunas realizaciones de cada uno de los varios aspectos de la invención el panel de genes mezclados comprende PRAME, S100A9, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 genes del panel F. En algunas realizaciones, el panel de genes mezclados comprende PRAME y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 genes del Panel J, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 genes del panel F. En algunas realizaciones, el panel de genes mezclados comprende PRAME, S100A9, y al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 genes del panel E. En algunas realizaciones, el panel de genes mezclados comprende PRAME, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 genes del Panel J, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 genes del Panel E.
Por lo tanto, en algunas realizaciones de cada uno de los varios aspectos de la invención el panel de genes mezclados comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 genes del Panel D, y S100A9, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 genes del panel F. En algunas realizaciones, el panel de genes mezclados comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 genes del Panel D y al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, o 7 genes del Panel J, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 genes del panel F. En algunas realizaciones, el panel de genes mezclados comprende al menos 1.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 genes del Panel D, S100A9, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 genes del panel E. En algunas realizaciones, el panel de genes mezclados comprende al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 genes del Panel D, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 genes del Panel J, y al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 genes del Panel E.
Por lo tanto, en algunas realizaciones de cada uno de los varios aspectos de la invención el panel de genes mezclados comprende al menos al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 genes del Panel G, y S100A9, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 genes del panel F. En algunas realizaciones, el panel de genes mezclados comprende al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 genes del Panel G, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 genes del Panel J, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 genes del panel F. En algunas realizaciones, el panel de genes mezclados comprende al menos 1 al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 genes del Panel G, S100A9, y al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 genes del panel E. En algunas realizaciones, el panel de genes mezclados comprende al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 genes del Panel G, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 genes del Panel J, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 genes del Panel E.
Por lo tanto, en algunas realizaciones de cada uno de los varios aspectos de la invención el panel de genes mezclados comprende al menos al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 genes del Pane1H, y S100A9, y al menos 1.2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 genes del panel F. En algunas realizaciones, el panel de genes mezclados comprende al menos al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 genes del Panel H, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 genes del Panel J, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 genes del panel F. En algunas realizaciones, el panel de genes mezclados comprende al menos 1 al menos 1 al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 genes del Pane1H, S100A9, y al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 genes del panel E. En algunas realizaciones, el panel de genes mezclados comprende al menos al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 genes del Panel H, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 genes del Panel J, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 genes del Panel E.
En una realización, el panel comprende cualquier conjunto de dos genes de la Tabla XX. En otra realización, el panel comprende cualquier conjunto de tres genes de la Tabla YY. En otra realización, el panel comprende cualquier conjunto de cuatro genes de la Tabla ZZ.
En una realización de un panel de genes constitutivos, el panel de constitutivos (Panel K) comprende uno o más genes para uso en la normalización de la expresión de genes de prueba. El panel K puede estar formado por cualquier gen cuya expresión se utilice para calibrar o normalizar la expresión medida del gen o genes de interés. El panel K puede estar compuesto por cualquier gen constitutivo o constitutivo conocido en la técnica. Ejemplos de genes constitutivos que se pueden utilizar en el Panel K incluyen CLTC, GUSB, HMBS, MMADHC, MRFAP1, PPP2CA, PSMA1, PSMC1, RPL13A, RPL37, RPL38, RPL4, RPL8, RPS29, SDHA, SLC25A3, TXNL1, UBA52, UBC, y YWHAZ. En algunas realizaciones, los genes constitutivos utilizados para normalizar la expresión de los genes de prueba pueden incluir al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 genes del Panel K.
Métodos para determinar la expresión génica
De acuerdo con lo anterior, en un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para determinar la expresión génica en una muestra de un paciente (por ejemplo, uno que se sospecha que contiene melanoma). Generalmente, el método incluye al menos las siguientes etapas: (1) obtener una muestra de un paciente (por ejemplo, uno que se sospecha que contiene melanoma); (2) determinar la expresión de un panel de genes en la muestra; y (3) proporcionar un valor de prueba (a) ponderar la expresión determinada de cada gen del panel de genes con un coeficiente predefinido, y (b) combinar la expresión ponderada de cada gen del panel de genes para proporcionar dicho valor de prueba.
La ponderación de la expresión de cada gen del panel de genes se puede realizar individualmente para cada gen, o los genes se pueden agrupar primero y su expresión normalizada promediar o combinar de otro modo antes de realizar la ponderación. En algunas realizaciones, los genes se agrupan en base a si proporcionan información independiente para separar los nevos del melanoma. En algunos ejemplos, los CCG se agrupan antes de ponderar. En otras realizaciones, los genes inmunitarios se agrupan antes de ponderar. El experto en la materia comprenderá que, en algunas realizaciones, la agrupación puede conceptualizarse como una forma de ponderar individualmente cada gen en el grupo predefinido para llegar a un valor intermedio, cuyo valor intermedio se pondera junto con otros valores de expresión génica individuales para obtener un valor final. En algunas realizaciones, se pueden realizar múltiples rondas de agrupamiento, dando como resultado múltiples valores intermedios, que a su vez pueden agruparse para obtener un valor final.
En algunas realizaciones, se determinan coeficientes de ponderación que optimizan la contribución de cada perfil de expresión al valor predictivo de cualquier valor de prueba resultante. En algunas realizaciones, los genes cuya expresión está más altamente correlacionada o anticorrelacionada con el melanoma reciben un coeficiente de ponderación mayor para maximizar el poder predictivo general de cualquier valor de prueba resultante. En algunas realizaciones, los genes cuya expresión está correlacionada o anticorrelacionada con el melanoma, pero menos correlacionada con la expresión de otros genes en el panel, reciben un coeficiente de ponderación mayor para maximizar el poder predictivo general de cualquier valor de prueba resultante. En algunas realizaciones, se pueden agrupar genes cuya expresión está significativa, moderada o altamente correlacionada.
En algunas realizaciones, se utilizan análisis de regresión para obtener coeficientes de ponderación apropiados para maximizar el poder predictivo de un valor de prueba. En algunas realizaciones, se utiliza regresión lineal para ajustar los niveles de expresión a un modelo para proporcionar valores de prueba que son diagnósticos de melanoma. En otras realizaciones, la regresión logística se utiliza para determinar coeficientes de ponderación para los niveles de expresión de genes individuales o grupos de genes en un modelo para el diagnóstico de melanoma.
En algunas realizaciones, ponderar la expresión de cada gen comprende agrupar genes inmunitarios, y luego ponderar la expresión de genes inmunitarios, PRAME y S100A9 para llegar a un valor de prueba que es diagnóstico de melanoma. En realizaciones relacionadas, hay 8 genes inmunitarios. En realizaciones relacionadas, los genes inmunitarios comprenden el Panel F. En algunas realizaciones, la ponderación para llegar a un valor de prueba es la siguiente: valor de prueba = (A x PRAME) (B x inmunitarios agrupados) (C x S100A9). En una realización relacionada, A es 0.525, B es 0.677 y C es 0.357.
En algunas realizaciones, ponderar la expresión de cada gen comprende agrupar genes inmunitarios, agrupar genes relacionados con S100A9 y luego ponderar la expresión de genes inmunitarios, PRAME y los genes relacionados con S100A9 para llegar a un valor de prueba que sea diagnóstico de melanoma. En realizaciones relacionadas, hay 8 genes inmunitarios. En realizaciones relacionadas, los genes inmunitarios comprenden el Panel F. En realizaciones relacionadas, hay 7 genes relacionados con S100A9. En realizaciones relacionadas, los genes relacionados con S100A9 comprenden el Panel J. En realizaciones relacionadas, los genes relacionados con S100A9 comprenden el Panel L. En algunas realizaciones, la ponderación para llegar a un valor de prueba es la siguiente: valor de prueba = (A x PRAME) (B x inmunitarios agrupados) (C x relacionados con S100A9 agrupados). En una realización relacionada, A es 1.149, B es 0.698 y C es 0.922.
En algunas realizaciones, ponderar la expresión de cada gen comprende agrupar genes inmunitarios, agrupar genes relacionados con S100A9 y luego ponderar la expresión de genes inmunitarios, PRAME y los genes relacionados con S100A9 y luego ajustar mediante un factor de escala lineal para llegar a un valor de prueba que es diagnóstico de melanoma. El factor de escala lineal ajusta el valor de corte de modo que el valor de corte se centre alrededor de cero. En realizaciones relacionadas, hay 8 genes inmunitarios. En realizaciones relacionadas, los genes inmunitarios comprenden el Panel F. En realizaciones relacionadas, hay 7 genes relacionados con S100A9. En realizaciones relacionadas, los genes relacionados con S100A9 comprenden el Panel J. En realizaciones relacionadas separadas, los genes relacionados con S100A9 comprenden el Panel L. En algunas realizaciones, la ponderación para llegar a un valor de prueba es la siguiente: valor de prueba = (A x PRAME) (B x inmunitarios agrupados) (C x relacionados con S100A9 agrupados) D. En una realización relacionada, A es 1.149, B es 0.698, C es 0.922 y D es -0.334.
En algunas realizaciones, un valor de prueba derivado de los niveles de expresión puede combinarse con parámetros de no expresión para llegar a un valor de prueba modificado o puntuación que es diagnóstico de melanoma. En algunas realizaciones, los factores clínicos se pueden combinar con un valor de prueba derivado de los niveles de expresión para proporcionar una puntuación que sea diagnóstica de melanoma. En realizaciones relacionadas, los datos de estadificación clínica se pueden ponderar y combinar con un valor de prueba basado en la expresión para obtener una puntuación que sea diagnóstica de melanoma.
Métodos de diagnóstico del melanoma
En el presente documento también se proporcionan métodos para diagnosticar melanoma. Generalmente, se proporciona un método para diagnosticar melanoma, que comprende a) determinar en una muestra de un individuo la expresión de un panel de genes; b) comparar la expresión del panel de genes en la muestra con la expresión del panel de genes en una o más muestras de control; y c) diagnosticar al individuo con melanoma, o concluir que es probable que el individuo tenga melanoma, basándose al menos en parte en una diferencia entre la expresión de uno o más genes del panel de genes en la muestra versus una o más muestras de control.
La etapa de comparar la expresión del panel de genes se puede realizar directamente (es decir, obtener un valor de expresión para cada gen en el panel de genes en la muestra y en una o más muestras de control, y determinar sobre gen mediante base genética si hay una diferencia significativa entre la expresión en la muestra versus uno o más controles). Alternativamente, se puede realizar implícitamente la comparación de la expresión del panel de genes en la muestra con la expresión en una o más muestras de control. En algunas realizaciones, la comparación implícita se logra al construir un modelo basado en una o más muestras de control y determinar dónde encaja la expresión del panel de genes en la muestra individual dentro del modelo. En una realización, la comparación implícita de la expresión del panel de genes en la muestra con una o más muestras de control comprende utilizar un conjunto predeterminado de coeficientes de ponderación basados en el análisis de una o más muestras de control para ponderar la expresión del panel de genes en la muestra y llegar a un valor de prueba. En una realización relacionada, el valor de prueba se compara con un valor de corte predeterminado basado en el análisis de una o más muestras de control para lograr una comparación implícita.
En algunas realizaciones, los métodos de diagnóstico comprenden adicionalmente comunicar que es probable que el individuo tenga melanoma.
Como se utiliza en el presente documento, “comunicar” una pieza particular de información significa dar a conocer dicha información a otra persona o transferir dicha información a una cosa (por ejemplo, un ordenador). En algunos métodos de la invención, se comunica el diagnóstico de un paciente o la probabilidad de tener melanoma. En algunas realizaciones, se comunica la información utilizada para llegar a dicho diagnóstico o predicción de probabilidad. Esta comunicación puede ser auditiva (por ejemplo, verbal), visual (por ejemplo, escrita), electrónica (por ejemplo, datos transferidos de un sistema informático a otro), etc. En algunas realizaciones, comunicar un diagnóstico o probabilidad de melanoma comprende generar un informe que comunica el diagnóstico o la probabilidad de melanoma. En algunas realizaciones, el informe es un informe en papel, un informe auditivo o un registro electrónico. En algunas realizaciones, el informe se muestra y/o se almacena en un dispositivo informático (por ejemplo, dispositivo de mano, ordenador de escritorio, dispositivo inteligente, sitio web, etc.). En algunas realizaciones, el diagnóstico o la probabilidad de melanoma se comunica a un médico (por ejemplo, se proporciona al médico un informe que comunica la clasificación). En algunas realizaciones, el diagnóstico o la probabilidad de melanoma se comunica a un paciente (por ejemplo, se proporciona al paciente un informe que comunica la clasificación). La comunicación de un diagnóstico o probabilidad de melanoma también se puede lograr al transferir información (por ejemplo, datos) que incorpore la clasificación a un ordenador servidor y permitiendo que un intermediario o usuario final acceda a dicha información (por ejemplo, al ver la información mostrada desde el servidor, al descargar la información en forma de uno o más archivos transferidos desde el servidor al dispositivo intermediario o del usuario final, etc.).
Siempre que una realización de la invención comprenda concluir algún hecho (por ejemplo, la probabilidad de un paciente de tener melanoma), esto puede incluir un programa informático que concluya tal hecho, normalmente después de realizar un algoritmo que aplica información sobre la expresión del panel de genes en la muestra, como se describió anteriormente.
En algunas realizaciones, el método de diagnóstico incluye (1) obtener una muestra de un paciente que se sospecha tiene melanoma; (2) determinar la expresión de un panel de genes en la muestra que incluye al menos 2, 4, 6, 8 o 10 genes de ciclo celular, o al menos 2, 4, 6 o 8 genes inmunitarios; y (3) proporcionar un valor de prueba al (a) ponderar la expresión determinada de cada una de una pluralidad de genes de prueba seleccionados del panel de genes con un coeficiente predefinido, y (b) combinar la expresión ponderada para proporcionar dicho valor de prueba, en el que al menos 20%, 50%, al menos 75% o al menos 90% de dicha pluralidad de genes de prueba son genes de ciclo celular, y en el que la alta expresión (o aumento de expresión o sobreexpresión) de la pluralidad de genes de prueba indica una mayor probabilidad de tener melanoma. En algunas realizaciones, el método comprende al menos una se las siguientes etapas: (a) correlacionar la alta expresión (o aumento de expresión o sobreexpresión) de la pluralidad de genes de prueba a una mayor probabilidad de tener melanoma; (b) concluir que el paciente tiene una mayor probabilidad de tener melanoma en base al menos en parte en la alta expresión (o aumento de expresión o sobreexpresión) de la pluralidad de genes de prueba; o (c) comunicar que el paciente tiene una mayor probabilidad de tener melanoma en base al menos en parte en alta expresión (o aumento de expresión o sobreexpresión) de la pluralidad de genes de prueba.
En algunas realizaciones, los niveles de expresión medidos en una muestra se utilizan para derivar o calcular un valor o puntuación, como se describió anteriormente. Este valor se puede derivar únicamente de los niveles de expresión u opcionalmente derivarse de una combinación de las puntuaciones del valor de expresión con otros componentes (por ejemplo, estadificación clínica, etc.) para dar un valor/puntuación potencialmente más completo. Por lo tanto, en todos los casos en los que una realización de la invención descrita en este documento implica determinar el estado de un biomarcador (por ejemplo, CCGS, genes inmunitarios o genes adicionales, como se define), las realizaciones relacionadas implican derivar o calcular un valor o puntuación del estado medido (por ejemplo, puntuación de expresión o puntuación combinada).
En algunas de tales realizaciones, se pueden combinar múltiples puntuaciones (por ejemplo, valor de prueba de expresión y parámetros clínicos, tales como estadificación clínica) en una puntuación más completa. Los puntajes de un solo componente (por ejemplo, CCG) o combinados para un paciente en particular se pueden comparar con puntajes de un solo componente o combinados para poblaciones de referencia, y las diferencias entre los puntajes de prueba y de referencia se correlacionan o son indicativas de alguna característica clínica. Por lo tanto, en algunas realizaciones la invención proporciona un método para determinar un diagnóstico de melanoma que comprende (1) obtener los niveles de expresión medidos de un panel de genes en una muestra del paciente, (2) calcular un valor de prueba a partir de estos niveles de expresión medidos, (3) comparar dicho valor de prueba con un valor de referencia calculado a partir de niveles de expresión medidos del panel de genes en una población de referencia de pacientes, y (4)(a) correlacionar un valor de prueba mayor que el valor de referencia con un diagnóstico de melanoma o (4)(b) correlacionar un valor de prueba igual a o menor que el valor de referencia con un diagnóstico benigno.
En algunas de dichas realizaciones, el valor de la prueba se calcula al promediar la expresión medida de los genes del panel (como se discute a continuación). En algunas realizaciones, el valor de la prueba se calcula al ponderar cada uno de los paneles de genes de una manera particular, como se describió anteriormente.
En algunas realizaciones la puntuación combinada incluye la puntuación CCP como se definió previamente. En algunas realizaciones, la puntuación combinada incluye una puntuación inmunitaria como se demuestra en los Ejemplos. En algunas realizaciones la puntuación inmunitaria es un promedio de la expresión de los genes en un panel de genes inmunitarios. En algunas realizaciones, la puntuación inmunitaria es un promedio de la expresión de los genes en la Tabla 30. La puntuación inmunitaria puede ser cualquier valor utilizado para representar la expresión de uno o más genes inmunitarios como se describe en este documento. En algunas realizaciones la puntuación inmunitaria es un promedio de la expresión de los genes en un panel de genes inmunitarios. En algunas realizaciones, la puntuación inmunitaria es un promedio de la expresión de los genes en el Panel D. En algunas realizaciones la puntuación inmunitaria es un promedio de la expresión de los genes en un panel de genes inmunitarios. En algunas realizaciones, la puntuación inmunitaria es un promedio de la expresión de los genes en el Panel E. En algunas realizaciones la puntuación inmunitaria es un promedio de la expresión de los genes en un panel de genes inmunitarios. En algunas realizaciones, la puntuación inmunitaria es un promedio de la expresión de los genes en el Panel F. Una puntuación combinada también puede incluir genes individuales con valor predictivo independiente y otros factores clínicos no basados en la expresión. Las puntuaciones de inmunodeficiencia y CCP pueden ser una variable numérica continua.
En algunas realizaciones, la puntuación combinada se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula:
(1) Puntuación combinada = A*(puntuación CCP) B*(puntuación inmunitaria) {C*expresión de gen X adicional) D*expresión de gen Y adicional...}
en la que X e Y representan cualquier gen de diagnóstico adicional como se describe en este documento, y la elipse indica que se pueden agregar genes adicionales extra, cada uno con su propio coeficiente.
Adicionalmente, en algunas realizaciones, la puntuación combinada se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula:
(2) Puntuación combinada = B*(puntuación inmunitaria) {C*expresión de gen X adicional) D*expresión de gen Y adic iona l.}
en la que X e Y representan cualquier gen adicional de diagnóstico como se describe en este documento, y la elipse indica que se pueden agregar genes adicionales extra, cada uno con su propio coeficiente. En una realización relacionada, el gen X adicional es PRAME y el gen Y adicional es S100A9.
Adicionalmente, en aún otras realizaciones, la puntuación combinada se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula:
(3) Puntuación combinada = B*(puntuación inmunitaria) {C*expresión de gen X adicional) D*expresión de gen Y ad ic iona l.} factor de ajuste
en la que X e Y representan cualquier gen adicional de diagnóstico como se describe en este documento, y la elipse indica que se pueden agregar genes adicionales extra, cada uno con su propio coeficiente. El factor de ajuste representa un factor escalar que se puede utilizar para ajustar la puntuación lineal. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el factor de ajuste puede ajustar la puntuación de un valor de corte particular de tal manera que el valor de corte esté centrado en cero. En una realización relacionada, el gen X adicional es PRAME y el gen Y adicional es S100A9.
Adicionalmente, en aún otras realizaciones, la puntuación combinada se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula:
(4) Puntuación combinada = B*(puntuación inmunitaria) {C*(Puntuación S100) D*expresión de gen Y ad ic iona l.} factor de ajuste
en la que Y representa cualquier gen de diagnóstico adicional como se describe en este documento, y la elipse indica que se pueden agregar genes adicionales extra, cada uno con su propio coeficiente. El factor de ajuste representa un factor escalar que se puede utilizar para ajustar la puntuación lineal. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el factor de ajuste puede ajustar la puntuación de un valor de corte particular de tal manera que el valor de corte esté centrado en cero. La puntuación S100 puede ser cualquier valor utilizado para representar la expresión de uno o más genes relacionados con S100A9 y/o S100A9 como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la puntuación S100 es un promedio de la expresión de los genes en un panel de genes relacionados con S100A9 y/o S100A9. En una realización relacionada, la puntuación S100 es un promedio de la expresión de los genes en el Panel J. En una realización relacionada, la puntuación S100 es un promedio de la expresión de los genes en el Panel L. En una realización relacionada, la puntuación S100 es un promedio de la expresión de S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, PI3, S100A10 y S100A14. En una realización relacionada, la puntuación S100 es un promedio de la expresión de S100A9, S100A7, S100A8, S100A12 y PI3. En una realización relacionada, el gen Y adicional es PRAME.
En algunas realizaciones, la fórmula (1) se utiliza en los métodos, sistemas, etc. de la invención para diagnosticar a un paciente con melanoma. En algunas realizaciones, la fórmula (2) se utiliza en los métodos, sistemas, etc. de la invención para diagnosticar a un paciente con melanoma. En algunas realizaciones, la puntuación de CCP es la media no ponderada de los valores de CT para la expresión de los genes CCP que se analizan, opcionalmente normalizada por la media no ponderada de los genes HK de modo que los valores más altos indican una expresión más alta (en algunas realizaciones una unidad es equivalente a un cambio en dos veces de expresión). En algunas realizaciones, la puntuación de CCP varía de -8 a 8 o de -1.6 a 3.7.
En algunas realizaciones A = 0.95, B = 0.61, C = 0.90 (cuando sea aplicable) y D = 1.00 (cuando sea aplicable); A = 0.57 y B = 0.39; o A = 0.58 y B = 0.41. En algunas realizaciones, A, B, C y/o D están dentro del redondeo de estos valores (por ejemplo, A está entre 0.945 y 0.954, etc.). En algunos casos, es posible que una fórmula no tenga todos los coeficientes especificados (y, por lo tanto, no incorpore las variables correspondientes). Por ejemplo, la realización mencionada inmediatamente anteriormente se puede aplicar a la fórmula (2) de modo que B en la fórmula (2) sea 0.61, C = 0.90 (cuando sea aplicable) y D = 1.00 (cuando sea aplicable). A no sería aplicable ya que este coeficiente y su variable correspondiente no se encuentran en la fórmula (2). En algunas realizaciones A está entre 0.9 y 1, 0.9 y 0.99, 0.9 y 0.95, 0.85 y 0.95, 0.86 y 0.94, 0.87 y 0.93, 0.88 y 0.92, 0.89 y 0.91, 0.85 y 0.9, 0.8 y 0.95, 0.8 y 0.9, 0.8 y 0. 85, 0.75 y 0.99, 0.75 y 0.95, 0.75 y 0.9, 0.75 y 0.85, o entre 0.75 y 0.8. En algunas realizaciones B está entre 0.40 y 1, 0.45 y 0.99, 0.45 y 0.95, 0.55 y 0.8, 0.55 y 0.7, 0.55 y 0.65, 0.59 y 0.63, o entre 0.6 y 0.62. En algunas realizaciones C está, en su caso, entre 0.9 y 1, 0.9 y 0.99, 0.9 y 0.95, 0.85 y 0.95, 0.86 y 0.94, 0.87 y 0.93, 0.88 y 0.92, 0.89 y 0.91, 0.85 y 0.9, 0.8 y 0.95, 0.8 y 0.9, 0.8 y 0.85, 0.75 y 0.99, 0.75 y 0.95, 0.75 y 0.9, 0.75 y 0.85, o entre 0.75 y 0.8. En algunas realizaciones D está, en su caso, entre 0.9 y 1, 0.9 y 0.99, 0.9 y 0.95, 0.85 y 0.95, 0.86 y 0.94, 0.87 y 0.93, 0.88 y 0.92, 0.89 y 0.91, 0.85 y 0.9, 0.8 y 0.95, 0.8 y 0.9, 0.8 y 0.85, 0.75 y 0.99, 0.75 y 0.95, 0.75 y 0.9, 0.75 y 0.85, o entre 0.75 y 0.8.
En algunas realizaciones A está entre 0.1 y 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.2 y 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.3 y 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.4 y 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.5 y 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.6 y 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.7 y 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.8 y 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.9 y 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 1 y 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 1.5 y 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 2 y 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 2.5 y 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 3 y 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 3.5 y 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 4 y 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 4.5 y 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 5 y 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 6 y 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 7 y 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 8 y 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 10 y 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 11 y 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 12 y 13, 14, 15, o 20; o entre 13 y 14, 15, o 20; o entre 14 y 15, o 20; o entre 15 y 20; B está entre 0.1 y 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0. 9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.2 y 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.3 y 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.4 y 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.5 y 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.6 y 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.7 y 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.8 y 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.9 y 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 1 y 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 1.5 y 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 2 y 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 2.5 y 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 3 y 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 3.5 y 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 4 y 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 4.5 y 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 5 y 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 6 y 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 7 y 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 8 y 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 10 y 11, 12, 13, 14, 15, o 20;
o entre 11 y 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 12 y 13, 14, 15, o 20; o entre 13 y 14, 15, o 20; o entre 14 y 15, o 20; o entre
15 y 20; C está, en su caso, entre 0.1 y 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.2 y 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.3 y 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
15, o 20; o entre 0.4 y 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.5 y 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.6 y 0.7, 0.8,
0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.7 y 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4,
4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.8 y 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, o 20; o entre 0.9 y 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 1 y 1.5, 2, 2.5,
3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 1.5 y 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, o 20; o entre 2 y 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 2.5 y 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7,
8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 3 y 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 3.
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 4 y 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 4.
8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 5 y 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 6 y 7, 8, 9, 10, 14, 15, o 20; o entre 7 y 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 8 y 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 9 y 10, 11,
12, 13, 14, 15, o 20; o entre 10 y 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 11 y 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 12 y 13, 14, 15, o
20; o entre 13 y 14, 15, o 20; o entre 14 y 15, o 20; o entre 15 y 20; y D está, en su caso, entre 0.1 y 0.2, 0.3, 0.4, 0.5,
0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.2 y 0.3, 0.4, 0.5, 0.6,
0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.3 y 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8,
0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.4 y 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2,
2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.5 y 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5,
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.6 y 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, o 20; o entre 0.7 y 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.8 y 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.9 y 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 1 y 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 1.5 y 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 2 y 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 2.5 y 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 3 y 3.5, 4, 4.5, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 3.5 y 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 4 y 4.5, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 4.5 y 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 5 y 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 6 y 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 7 y 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 8 y 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 10 y 11, 12, 13, 14, 15, o 20;
o entre 11 y 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 12 y 13, 14, 15, o 20; o entre 13 y 14, 15, o 20; o entre 14 y 15, o 20; o entre
15 y 20. En algunas realizaciones, A, B, y/o C está dentro del redondeo de cualquiera de estos valores (por ejemplo,
A está entre 0.45 y 0.54, etc.).
Como se utiliza en este documento, un paciente tiene una “mayor probabilidad” de alguna característica o resultado clínico (por ejemplo, tener melanoma) si la probabilidad de que el paciente tenga la característica o el resultado excede alguna probabilidad o valor de referencia. La probabilidad de referencia puede ser la probabilidad de la característica
o resultado en la población general de pacientes relevantes. Por ejemplo, si la probabilidad de tener melanoma en la población general es X% y se ha determinado mediante los métodos de la presente invención que un paciente en particular tiene una probabilidad del Y% de tener melanoma, y si Y> X, entonces el paciente tiene una “mayor probabilidad” de tener melanoma. Alternativamente, como se discutió anteriormente, se puede determinar un umbral o valor de referencia y se puede comparar la probabilidad de un paciente particular de tener melanoma con ese umbral o referencia.
En algunas realizaciones, el método correlaciona la puntuación específica del paciente (por ejemplo, puntuación de
CCP, puntuación combinada de CCP con variables clínicas) con una probabilidad específica (por ejemplo, 10%, 15%,
20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%) o probabilidad
de tener melanoma.
En algunas realizaciones, el método de diagnóstico incluye (1) obtener una muestra de un paciente sospechoso de tener melanoma; (2) determinar la expresión de un panel de genes en la muestra; (3) calcular los valores o puntuaciones de las pruebas; y (4) proporcionar un informe que comunique el valor o las puntuaciones de la prueba.
En algunas realizaciones, el informe es un informe en papel, un informe auditivo o un registro electrónico. En algunas realizaciones, el informe se muestra y/o se almacena en un dispositivo informático (por ejemplo, dispositivo portátil, ordenador de escritorio, dispositivo inteligente, sitio web, etc.). En algunas realizaciones, el informe se comunica a un médico (por ejemplo, se proporciona al médico un informe que comunica los valores o puntuaciones de la prueba). En algunas realizaciones, el informe se comunica a un paciente (por ejemplo, se proporciona al paciente un informe que comunica los valores o puntuaciones de la prueba). Proporcionar un informe también se puede lograr al transferir información (por ejemplo, datos) que incorporan los valores o puntuaciones de la prueba a un ordenador servidor y permitir que un intermediario o usuario final acceda a dicha información (por ejemplo, al ver la información tal como se muestra en el servidor, al descargar la información en forma de uno o más archivos transferidos desde el servidor hasta el dispositivo intermediario o del usuario final, etc.).
En otras realizaciones, el informe puede comunicar puntuaciones derivadas de diferentes fuentes y otra información relevante del paciente. Por ejemplo, el informe puede comunicar puntuaciones derivadas únicamente de los niveles de expresión. El informe también puede informar las puntuaciones calculadas mediante la fórmula (1), la fórmula (2), la fórmula (3) y/o la fórmula (4). Alternativamente, el informe puede comunicar puntuaciones derivadas de una combinación de puntuaciones de valor de expresión con otros componentes (por ejemplo, estadificación clínica, antecedentes personales/familiares, resultados de dermatopatología, etc.) para dar una puntuación potencialmente más completa. En otros casos, el informe puede comunicar múltiples puntuaciones (por ejemplo, el valor de la prueba de expresión y los parámetros clínicos, como la estadificación clínica) y/o una puntuación más completa. El informe también puede comunicar puntuaciones para genes individuales. En algunos casos, el informe puede comunicar puntuaciones junto con valores de referencia o de control. Algunos informes pueden comunicar una probabilidad específica (por ejemplo, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75 %, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%) o probabilidad de tener melanoma. Otros informes pueden comunicar la clasificación de la muestra como benigna o maligna, predicciones de riesgo de melanoma, comparaciones de riesgo de melanoma, elementos clínicamente procesables, recomendaciones para el manejo del riesgo de cáncer y/o recomendaciones de tratamiento. Sin embargo, otros informes pueden incluir antecedentes médicos personales y familiares.
Métodos de tratamiento del melanoma
En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para tratar a un paciente que comprenden obtener información sobre el estado de la expresión génica para un panel de genes (por ejemplo, Obtenido mediante el método descrito en el presente documento) y recomendar un tratamiento, prescribir un tratamiento, administrar un tratamiento, creando un plan de tratamiento o modificando un plan de tratamiento para el paciente en base del estado de expresión génica. En algunas realizaciones, el método comprende obtener el estado de expresión de CCG. En algunas realizaciones, el método comprende obtener el estado de expresión de genes inmunitarios. En algunas realizaciones, el método comprende obtener el estado de expresión de genes adicionales como se describe en este documento. Por ejemplo, la divulgación proporciona un método para tratar a un paciente que comprende:
(1) determinar el estado de al menos un CCG;
(2) determinar el estado de al menos un gen inmunitario;
(3) determinar el estado de al menos un gen adicional; y
(4) recomendar, prescribir o administrar cualquiera de
(a) un tratamiento activo (que incluye agresivo) si el paciente tiene al menos uno de aumento de expresión del CCG, aumento de expresión de gen inmunitario, o expresión de un gen adicional que difiere significativamente de la expresión en una muestra de control, o
(b) un tratamiento pasivo (o menos agresivo) si el paciente no tiene aumento de expresión del CCG, aumento de expresión de gen inmunitario, o expresión de un gen adicional que difiere significativamente de la expresión en una muestra de control.
En una realización relacionada, la invención proporciona un método para tratar un paciente que comprende:
(1) determinar el estado de al menos un gen inmunitario;
(2) determinar el estado de al menos un gen adicional; y
(3) recomendar, prescribir o administrar cualquiera de
(a) un tratamiento activo (que incluye agresivo) si el paciente tiene al menos uno de aumento de expresión de gen inmunitario, o expresión de un gen adicional que difiere significativamente de la expresión en una muestra de control, o
(b) un tratamiento pasivo (o menos agresivo) si el paciente no tiene aumento de expresión de gen inmunitario, o expresión de un gen adicional que difiere significativamente de la expresión en una muestra de control.
En una realización relacionada, la divulgación proporciona un método para tratar un paciente que comprende:
(1) determinar el estado de al menos un gen inmunitario;
(2) determinar el estado de al menos un gen adicional; y
(3) crear un plan de tratamiento que comprende cualquiera de
(a) componentes de terapia más agresivos si el paciente tiene al menos uno de aumento de expresión de gen inmunitario, o expresión de un gen adicional que difiere significativamente de la expresión en una muestra de control, o
(b) componentes de terapia menos agresivos si el paciente no tiene aumento de expresión de gen inmunitario, o expresión de un gen adicional que difiere significativamente de la expresión en una muestra de control; y
(4) implementar el plan de tratamiento.
En algunas realizaciones, las etapas de recomendación o prescripción comprenden recibir un informe que comunica el estado de expresión relevante (por ejemplo, estado de CCG). En algunas realizaciones, la etapa de creación de un plan de tratamiento comprende recibir un informe que comunica el estado de expresión relevante (por ejemplo, estado de CCG). En algunas realizaciones, este informe comunica dicho estado de una manera cualitativa (por ejemplo, expresión “alta” o “aumentada”). En algunas realizaciones, este informe comunica dicho estado indirectamente al comunicar un valor de prueba o puntuación (por ejemplo, puntuación que refleja la probabilidad de tener melanoma, etc.) que incorpora dicho estado.
El que un tratamiento sea agresivo o no dependerá generalmente del diagnóstico o la probabilidad de tener melanoma. Para las personas diagnosticadas con melanoma, o que tienen una alta probabilidad de tener melanoma, se prefiere un tratamiento agresivo. Aquellos expertos en la técnica están familiarizados con otros tratamientos agresivos y menos agresivos para cada tipo de cáncer. Por otro lado, si un individuo tiene una probabilidad baja de tener melanoma, se podría prescribir una terapia menos agresiva. Por lo tanto, para un individuo que tiene un riesgo bajo de tener melanoma, un proveedor médico podría recomendar un régimen de “espera vigilante”.
Aquellos expertos en la técnica conocen una variedad de tratamientos y/o terapias para el melanoma. Esta variedad de terapias para el melanoma puede variar en su agresividad. En general, a medida que aumenta la agresividad de la terapia del melanoma, aumenta la eficacia del tratamiento, pero también aumentan los efectos adversos para el paciente. Los expertos pueden comprender que la agresividad de la terapia del melanoma que se utiliza para tratar al paciente debe equilibrarse para tener en cuenta tanto la eficacia del tratamiento como los efectos adversos que probablemente experimentará el paciente. Por lo tanto, el experto buscará maximizar la eficacia del tratamiento mientras minimiza los efectos adversos del tratamiento al seleccionar un nivel apropiado de agresividad adaptado al paciente individual. El nivel apropiado de tratamiento se puede seleccionar basándose, al menos en parte, en el informe que comunica el estado de expresión relevante.
En algunas realizaciones, un experto puede incorporar el informe que comunica el estado de expresión relevante en la selección de la agresividad del tratamiento. Un informe que comunica una puntuación que indica una alta probabilidad de melanoma indicaría un tratamiento más agresivo, mientras que un informe que comunica una puntuación que indica una menor probabilidad de melanoma indicaría un tratamiento menos agresivo. En algunas realizaciones, un tratamiento menos agresivo puede comprender la eliminación del melanoma sospechoso durante una biopsia. En algunas realizaciones, un tratamiento más agresivo puede incluir la extirpación del melanoma sospechoso, así como la eliminación de un pequeño borde de piel normal y una capa de tejido debajo tanto del melanoma sospechoso como del borde pequeño de piel. En otras realizaciones, un tratamiento más agresivo puede comprender una nueva escisión del sitio de la biopsia para eliminar tejido adicional que bordea la muestra de biopsia extraída. En aún otras realizaciones, un tratamiento más agresivo puede comprender la reexcisión de tejido adicional que rodea el sitio de la biopsia.
En otras realizaciones, un tratamiento incluso más agresivo puede incluir cirugía para extirpar cualquier ganglio linfático afectado o una disección de ganglio linfático (linfadenoectomía). En otras realizaciones, un tratamiento aún más agresivo puede incluir cirugía para extirpar cualquier ganglio linfático afectado o una disección de ganglio linfático (linfadenoectomía) seguida de terapia adyuvante con interferón. En otras realizaciones, un tratamiento incluso más agresivo puede incluir cirugía para extirpar cualquier ganglio linfático afectado, así como tratamientos adicionales tales como quimioterapia y/o terapia de radiación. En otras realizaciones, un tratamiento aún más agresivo puede incluir cirugía para extirpar cualquier tejido u órgano afectado. En realizaciones alternativas, tratamientos incluso más agresivos pueden incluir quimioterapia. Algunos métodos de administración de quimioterapia incluyen tratamientos orales e intravenosos. Algunos métodos de administración de quimioterapia incluyen la perfusión aislada de las extremidades de fármacos de quimioterapia. En otras realizaciones, tratamientos incluso más agresivos pueden incluir terapia de radiación. En aún otras realizaciones, tratamientos incluso más agresivos pueden incluir terapia biológica. Algunas terapias biológicas pueden incluir interferón y/o interleucina-2. Algunas terapias biológicas pueden incluir terapias basadas en anticuerpos tal como ipilimumab (Yervoy). En otras realizaciones, una terapia incluso más agresiva puede incluir inmunoterapia. Algunas inmunoterapias pueden incluir interferón-alfa, anti-CTLA-4, vacunas, vacuna Bacille Calmette-Guerin, interleucina 2 y/o terapia con células T. Algunas inmunoterapias también se pueden combinar con quimioterapia y/o terapia de radiación. En realizaciones alternativas, incluso terapias más agresivas pueden incluir terapia dirigida. Algunas terapias dirigidas pueden incluir fármacos tales como vemurafenib (Zelboraf) que se utilizan para tratar el melanoma avanzado. Otras terapias dirigidas incluyen inhibidores de BRAF y/o inhibidores de KIT.
En algunas realizaciones, la selección del tratamiento específico puede basarse en parte en el estado de expresión relativo de los genes probados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el perfil de expresión de los genes individuales dentro del panel sería indicativo de la selección del tipo y/o clase de terapia. Un cierto perfil de expresión de los genes individuales dentro del panel puede ser indicativo de melanoma que se puede tratar eficazmente solo con cirugía. Por otro lado, otro perfil de expresión puede ser indicativo de melanoma que se puede tratar eficazmente con cirugía combinada con terapia de radiación. En otros casos, otro perfil de expresión puede ser indicativo de melanoma que se puede tratar eficazmente con cirugía combinada con quimioterapia. En aún otros casos, el perfil de expresión puede ser indicativo de un melanoma que se puede tratar eficazmente solo con una monitorización cuidadosa y un seguimiento regular. En realizaciones alternativas, el perfil de expresión podría ser indicativo de melanoma que se puede tratar eficazmente con dosis más altas de terapia administradas a intervalos más cortos, mientras que otros perfiles de expresión podrían ser indicativos de dosis más bajas de terapia administradas a intervalos más largos. En algunas realizaciones, el perfil de expresión puede indicar ciertas combinaciones, dosis y/o frecuencias de terapias.
En otras realizaciones, un experto puede utilizar al menos en parte el informe que comunica el estado de expresión relevante para guiar la selección de los fármacos para el melanoma apropiados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el perfil de expresión de los genes individuales dentro del panel puede ser indicativo de la selección de fármacos de melanoma particulares. En algunas realizaciones, los fármacos para el melanoma se pueden seleccionar de entre aldesleucina, dabrafenib, dacarbazina, DTIC-Dome (Dacarbazina), Intrón A (Interferón alfa-2b recombinante), ipilimumab, mekinist (Trametinib), Peginterferón alfa-2b, PEG-intrón (Peginterferón alfa-2b), Proleukina (Aldesleukina), Interferón Alfa-2b recombinante, Sylatron (Peginterferón Alfa-2b), Tafinlar (Dabrafenib), Trametinib, Vemurafenib, Yervoy (Ipilimumab) y/o Zelboraf (Vemurafenib). En otras realizaciones, los fármacos para el melanoma se pueden seleccionar de la vacuna Bacille Calmette-Guerin (BCG), interleucina-2, imiquimod, citocinas, dacarbazina (DTIC), temozolomida (Temodar), inhibidor de la proteína quinasa activada por mitógenos (MEK) (trametinib) y/o fármacos bloqueadores beta-adrenérgicos.
En aún otras realizaciones, el experto puede crear o modificar un plan de tratamiento para el paciente individual basándose, al menos en parte, en el informe que comunica el estado de expresión relevante. En algunas realizaciones, la selección de diferentes componentes de la terapia que comprenden el plan de tratamiento puede basarse al menos en parte en el informe que comunica el estado de expresión relevante (o valores de prueba o puntuaciones). Por ejemplo, en algunos casos, el informe indicará una baja probabilidad de melanoma y el plan de tratamiento puede incluir componentes de terapia menos agresivos. Los componentes de la terapia menos agresivos pueden incluir la extirpación del melanoma sospechoso y la monitorización de seguimiento del paciente. En otros casos, el informe puede indicar una alta probabilidad de melanoma y el plan de tratamiento puede incluir componentes de terapia más agresivos. Los componentes de un plan de tratamiento más agresivo pueden incluir la extirpación del melanoma sospechoso y el tejido circundante, la reexcisión del sitio de la biopsia para eliminar tejido circundante adicional, quimioterapia, terapia de radiación y/o terapia biológica. En realizaciones alternativas, el informe que comunica el estado de expresión relevante se puede utilizar en parte para seleccionar los diferentes elementos dentro de cada componente del plan de tratamiento. Como ejemplo no limitante, el informe se puede utilizar para seleccionar fármacos individuales para el melanoma que comprenden el componente de quimioterapia del plan de tratamiento. En otros ejemplos no limitantes, el informe se puede utilizar para seleccionar los tipos de radiación, las cantidades de radiación y/o el régimen de dosificación del componente de radiación del plan de tratamiento. En algunas realizaciones, el plan de tratamiento puede comprender adicionalmente la medición continua del estado de expresión relevante para determinar la eficacia del plan de tratamiento. En otras realizaciones, esta medición continua de la eficacia del tratamiento se puede utilizar para modificar el plan de tratamiento.
Sistemas de diagnóstico y tratamiento del melanoma
Los resultados de cualquier análisis de acuerdo con la invención a menudo se comunicarán a médicos, asesores genéticos y/o pacientes (u otras partes interesadas, como investigadores) en una forma transmisible que se pueda comunicar o transmitir a cualquiera de las partes anteriores. Dicha forma puede variar y puede ser tangible o intangible. Los resultados se pueden incorporar en declaraciones descriptivas, diagramas, fotografías, gráficos, imágenes o cualquier otra forma visual. Por ejemplo, se pueden utilizar gráficos que muestran el nivel de expresión o actividad o información de variación de secuencia para varios genes para explicar los resultados. Los diagramas que muestran dicha información para genes diana adicionales también son útiles para indicar algunos resultados de las pruebas. Las declaraciones y las formas visuales se pueden registrar en un medio tangible, como papeles, medios legibles por ordenador tales como disquetes, discos compactos, etc., o en un medio intangible, por ejemplo, un medio electrónico en forma de correo electrónico o sitio web en Internet o intranet. Adicionalmente, los resultados también se pueden grabar en forma de sonido y transmitirse a través de cualquier medio adecuado, por ejemplo, líneas de cable analógicas o digitales, cables de fibra óptica, etc., a través de teléfono, fax, teléfono móvil inalámbrico, teléfono de Internet y similares.
Por tanto, la información y los datos sobre el resultado de una prueba pueden producirse en cualquier parte del mundo y transmitirse a una ubicación diferente. Como ejemplo ilustrativo, cuando un ensayo de nivel de expresión, nivel de actividad o secuenciación (o genotipado) se realiza fuera de los Estados Unidos, la información y los datos sobre el resultado de una prueba se pueden generar, emitir en una forma transmisible como se describió anteriormente, y luego importar a los Estados Unidos. De acuerdo con lo anterior, la presente invención también abarca un método para producir una forma transmisible de información en al menos uno de (a) nivel de expresión o (b) nivel de actividad para al menos una muestra de paciente. El método comprende las etapas de (1) determinar al menos uno de (a) o (b) anteriores de acuerdo con los métodos de la presente invención; y (2) incorporar el resultado de la etapa de determinación en una forma transmisible. La forma transmisible es el producto de dicho método.
Las técnicas para analizar dicha expresión, actividad y/o datos de secuencia (de hecho, cualquier dato obtenido de acuerdo con la invención) a menudo se implementarán utilizando hardware, software o una combinación de los mismos en uno o más sistemas informáticos u otros sistemas de procesamiento capaces de efectuar dicho análisis.
Por tanto, la presente invención proporciona adicionalmente un sistema para determinar la expresión génica en una muestra de tumor, que comprende: (1) un analizador de muestras para determinar los niveles de expresión de un panel de genes en una muestra de paciente, en el que el analizador de muestras contiene la muestra del paciente, o moléculas de ADNc de ARNm expresado del panel de genes derivados de la muestra; (2) un primer programa informático para (a) recibir datos de expresión génica del panel de genes, (b) ponderar la expresión determinada de cada uno de los genes de prueba, y (c) combinar la expresión ponderada para proporcionar un valor de prueba; y opcionalmente (3) un segundo programa informático para comparar el valor de prueba con uno o más valores de referencia, cada uno asociado con un grado predeterminado de riesgo de melanoma.
En otra realización, se mide en la muestra la cantidad de ARN transcrito del panel de genes que incluyen genes de prueba. Adicionalmente, también se mide la cantidad de ARN de uno o más genes constitutivos en la muestra y se utiliza para normalizar o calibrar la expresión de los genes de prueba, como se describió anteriormente.
El analizador de muestras puede ser cualquier instrumento útil para determinar la expresión génica, incluyendo, por ejemplo, una máquina de secuenciación, una máquina de PCR en tiempo real y un instrumento de micromatriz.
La función de análisis basada en ordenador se puede implementar en cualquier idioma y/o navegadores adecuados. Por ejemplo, se puede implementar con lenguaje C y preferiblemente utilizando lenguajes de programación de alto nivel orientados a objetos tal como Visual Basic, SmallTalk, C++ y similares. La aplicación se puede escribir para adaptarse a entornos tales como el entorno de Microsoft Windows™, que incluye Windows™ 98, Windows™ 2000, Windows™ NT y similares. Adicionalmente, la aplicación también se puede escribir para el entorno Macintosh™, SUN™, UNIX o LINUX. Adicionalmente, las etapas funcionales también se pueden implementar utilizando un lenguaje de programación universal o independiente de la plataforma. Ejemplos de dichos lenguajes de programación multiplataforma incluyen, pero no se limitan a, lenguaje de marcado de hipertexto (HTML), JAVA™, JavaScript™, lenguaje de programación Flash, interfaz de puerta de enlace común/lenguaje de consulta estructurado (CGI/SQL), lenguaje de informes de extracción práctica (PERL), AppleScript™ y otros lenguajes de secuencia de comandos del sistema, lenguaje de programación/lenguaje de consulta estructurado (PL/SQL) y similares. Se pueden utilizar navegadores compatibles con Java™ o JavaScript™, como HotJava™, Microsoft™ Explorer™ o Netscape™. Cuando se utilizan páginas web de contenido activo, pueden incluir subprogramas Java™ o controles ActiveX™ u otras tecnologías de contenido activo.
La función de análisis también se puede incorporar en productos de programas informáticos y utilizarse en los sistemas descritos anteriormente u otros sistemas basados en Internet o informáticos. De acuerdo con lo anterior, otro aspecto de la presente invención se refiere a un producto de programa informático que comprende un medio utilizable por ordenador que tiene códigos de programa legibles por ordenador o instrucciones incorporadas en el mismo para permitir que un procesador lleve a cabo análisis de estado genético. Estas instrucciones de programa informático se pueden cargar sobre un ordenador u otro aparato programable para producir una máquina, de modo que las instrucciones que se ejecutan en el ordenador u otro aparato programable crean medios para implementar las funciones o pasos descritos anteriormente. Estas instrucciones del programa de ordenador también se pueden almacenar en una memoria o medio legible por ordenador que puede dirigir un ordenador u otro aparato programable para que funcione de una manera particular, de modo que las instrucciones almacenadas en la memoria o medio legible por ordenador produzcan un artículo de fabricación que incluye instrucciones que implementan el análisis. Las instrucciones del programa de ordenador también se pueden cargar sobre un ordenador u otro aparato programable para hacer que se realicen una serie de etapas operativas en el ordenador u otro aparato programable para producir un proceso implementado por el ordenador de tal manera que las instrucciones que se ejecutan en el ordenador u otro aparato programable proporcionen etapas para implementar las funciones o etapas descritas anteriormente.
Por tanto, un aspecto de la presente invención proporciona un sistema para determinar si un paciente tiene una mayor probabilidad de tener melanoma. En términos generales, el sistema comprende (1) un programa informático para recibir, almacenar y/o recuperar los datos del estado genético de un paciente (por ejemplo, nivel de expresión, nivel de actividad, variantes) y opcionalmente datos de parámetros clínicos (por ejemplo, estadificación clínica); (2) programa informático para consultar estos datos del paciente; (3) programa de ordenador para concluir si existe una mayor probabilidad de tener melanoma basado en estos datos del paciente; y opcionalmente (4) programa de ordenador para generar/mostrar esta conclusión. En algunas realizaciones, este programa informático para generar la conclusión puede comprender un programa informático para informar a un profesional de la salud de la conclusión.
La práctica de la presente invención también puede emplear métodos, software y sistemas biológicos convencionales. Los productos de software de ordenador de la invención incluyen normalmente medios legibles por ordenador que tienen instrucciones ejecutables por ordenador para realizar las etapas lógicas del método de la invención. Los medios legibles por ordenador adecuados incluyen disquete, CD-ROM/DVD/DVD-ROM, unidad de disco duro, memoria flash, ROM/rAm , cintas magnéticas, etc. Se describen métodos básicos de biología computacional en, por ejemplo, Setubal et al., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg et al. (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998); Rashidi and Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, London, 2000); y Ouelette and Bzevanis, Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley and Sons, Inc., 2nd ed., 2001); véase también, Patente de Estados Unidos No. 6,420,108.
La presente invención también puede hacer uso de diversos productos de programas informáticos y software para una variedad de propósitos, tales como diseño de sondas, gestión de datos, análisis y operación de instrumentos. Véase Patentes de Estados Unidos Nos. 5,593,839; 5,795,716; 5,733,729; 5,974,164; 6,066,454; 6,090,555; 6,185,561; 6,188,783; 6,223,127; 6,229,911 y 6,308,170. Adicionalmente, la presente invención puede tener realizaciones que incluyan métodos para proporcionar información genética a través de redes tales como Internet como se muestra en Ser. de Estados Unidos Nos. 10/197,621 (Publicación de Estados Unidos No. 20030097222); 10/063,559 (Publicación de Estados Unidos No. 20020183936), 10/065,856 (Publicación de Estados Unidos No. 20030100995); 10/065,868 (Publicación de Estados Unidos No. 20030120432); 10/423,403 (Publicación de Estados Unidos No. 20040049354).
Las técnicas para analizar dicha expresión, actividad y/o datos de secuencia (de hecho, cualquier dato obtenido de acuerdo con la invención) a menudo se implementarán utilizando hardware, software o una combinación de los mismos en uno o más sistemas informáticos u otros sistemas de procesamiento capaces de efectuar dicho análisis.
Por tanto, un aspecto de la presente invención proporciona sistemas relacionados con los métodos anteriores de la invención. En una realización, la invención proporciona un sistema para determinar la expresión génica en una muestra, que comprende:
(1) un analizador de muestra para determinar los niveles de expresión en una muestra de un panel de genes, en el que el analizador de muestra contiene la muestra, ARN de la muestra y expresado a partir del panel de genes, o ADN sintetizado de dicho ARN;
(2) un primer programa informático para
(a) recibir datos de expresión génica sobre uno o más genes de prueba seleccionados del panel de genes, (b) ponderar la expresión determinada de cada uno del uno o más genes de prueba con un coeficiente predefinido, y (c) combinar la expresión ponderada para proporcionar un valor de prueba; y opcionalmente
(3) un segundo programa informático para comparar el valor de prueba con uno o más valores de referencia, cada uno asociado con un grado predeterminado de riesgo de tener melanoma.
En otra realización la invención proporciona un sistema para determinar expresión génica en una muestra, que comprende: (1) un analizador de muestra para determinar los niveles de expresión de un panel de genes en una muestra, en el que el analizador de muestra contiene la muestra que es un nevo o lunar sospechoso de tener melanoma, ARN de la muestra y expresado a partir del panel de genes, o ADN sintetizado de dicho ARN; (2) un primer programa informático para (a) recibir datos de expresión génica sobre uno o más genes de prueba seleccionados del panel de genes, (b) ponderar la expresión determinada de cada uno de los genes de prueba con un coeficiente predefinido, y (c) combinar la expresión ponderada para proporcionar un valor de prueba, en el que los genes de prueba comprenden genes inmunitarios y genes adicionales; y opcionalmente (3) un segundo programa informático para comparar el valor de prueba son uno o más valores de referencia, cada uno asociado con un grado predeterminado de riesgo de tener melanoma. En algunas realizaciones, el sistema comprende adicionalmente un módulo de visualización que muestra la comparación entre el valor de prueba y uno o más valores de referencia, o muestra un resultado de la etapa de comparación, o muestra el diagnóstico del paciente y/o el grado de riesgo de tener melanoma.
En una realización preferida, se mide en la muestra la cantidad de ARN transcrito del panel de genes que incluye genes de prueba (y/o ADN transcrito inversamente a partir de ellos). Adicionalmente, también se mide la cantidad de ARN de uno o más genes constitutivos en la muestra (y/o ADN transcrito inversamente a partir de la misma) y se utiliza para normalizar o calibrar la expresión de los genes de prueba, como se describió anteriormente.
El analizador de muestras puede ser cualquier instrumento útil para determinar la expresión génica, que incluye, por ejemplo, una máquina de secuenciación (por ejemplo, Illumina HiSeq™, Ion Torrent PGM, secuenciador ABI SOLiD™, PacBio RS, Helicos Heliscope™, etc.), una máquina de PCR en tiempo real (por ejemplo, ABI 7900, Fluidigm BioMark™, etc.), un instrumento de micromatrices, etc.
La Figura 1 ilustra un sistema 100 para realizar métodos asistidos por ordenador de diagnóstico, detección, cribado y/o tratamiento de melanoma en un paciente.
El sistema 100 comprende un módulo 10 de interfaz paciente/proveedor médico que comprende un proveedor 11 médico y un paciente 12. El proveedor 11 médico comprende un médico y/u otro personal médico que atiende al paciente 12. El proveedor médico recopila un historial médico completo del paciente 12, que incluye, pero no se limita a, síntomas, antecedentes médicos y/o historial familiar. El proveedor 11 médico también realiza un examen físico del paciente 12 y obtiene una muestra del paciente 12.
El sistema 100 comprende adicionalmente un dispositivo 20 de procesamiento de datos que comprende un módulo 21 analizador de muestras. La muestra del paciente se transporta desde el módulo 10 de interfaz paciente/proveedor médico hasta el dispositivo 20 analizador de muestras. El módulo 21 analizador de muestras determina los niveles de expresión génica de un panel de biomarcadores en la muestra del paciente. El panel de biomarcadores puede comprender biomarcadores útiles para determinar la presencia de melanoma en el paciente 12. El panel de biomarcadores puede comprender adicionalmente genes constitutivos útiles para normalizar los niveles del panel de biomarcadores. El módulo 21 analizador de muestras puede comprender cualquier instrumento útil para determinar los niveles de expresión génica, que incluyen, por ejemplo, una máquina de secuenciación (por ejemplo, Illumina HiSeq™, Ion Torrent PGM, secuenciador ABI SOLiD™, PacBio RS, Helicos Heliscope™, etc.), una máquina de PCR en tiempo real (por ejemplo, ABI 7900, Fluidigm BioMark™, etc.), un instrumento de micromatrices, etc.
El sistema 100 comprende adicionalmente un dispositivo 30 de procesamiento de datos que comprende un módulo 31 de base de datos de historial médico. El módulo 31 de base de datos de historial médico puede comprender un historial médico completo del paciente 12 que incluye información de historial familiar que comprende el número de miembros de la familia de un paciente diagnosticado con cáncer, que incluye melanoma. La información del historial familiar también puede comprender el grado de relación con un paciente de cada miembro de la familia diagnosticado con cáncer, que incluye melanoma. El módulo 31 de base de datos de historial médico puede estar en comunicación con el módulo 10 de interfaz de paciente/proveedor médico. El módulo 31 de base de datos de historial médico puede estar configurado para recibir el historial médico del paciente desde el módulo 10 de interfaz de paciente/proveedor médico ya sea como un registro físico o como una transmisión electrónica.
El sistema 100 comprende adicionalmente un dispositivo 40 de procesamiento de datos que comprende un módulo 41 de base de datos de información del paciente. El módulo 41 de base de datos de información del paciente comprende información del paciente que comprende niveles de expresión génica de un panel de biomarcadores del paciente 12. El módulo 41 de base de datos de información del paciente puede estar en comunicación con el módulo 41 analizador de muestras. El módulo 41 de base de datos de información del paciente puede estar configurado para recibir los niveles de expresión génica del paciente desde el módulo 21 analizador de muestras ya sea como un registro físico o como una transmisión electrónica.
El sistema 100 comprende adicionalmente un dispositivo 50 de procesamiento de datos y un dispositivo 60 de procesamiento de datos. El dispositivo 50 de procesamiento de datos comprende un módulo 51 de puntuación. El dispositivo 60 de procesamiento de datos comprende un módulo 61 de base de datos de información de biomarcadores. El módulo 61 de base de datos de información de biomarcadores comprende información de biomarcadores que comprende información de nivel de umbral para cada biomarcador de un panel de biomarcadores, en el que el panel de biomarcadores comprende biomarcadores positivos, biomarcadores negativos o ambos, en el que un nivel estadísticamente significativamente superior a un nivel de umbral para cada biomarcador positivo particular es indicativo de melanoma en un paciente y un nivel estadísticamente significativo por debajo de un nivel umbral para cada biomarcador negativo particular es indicativo de la presencia de melanoma en un paciente.
El módulo 51 de puntuación puede estar en comunicación con el módulo 61 de base de datos de información de biomarcadores y el módulo 41 de base de datos de información del paciente. El módulo 51 de puntuación puede estar configurado para comparar la información de biomarcadores y la información del paciente para generar una puntuación que represente la comparación entre la información del biomarcador y la información del paciente. El módulo 51 de puntuación se puede configurar adicionalmente para normalizar, promediar y aplicar ponderación de subgrupos de biomarcadores durante la generación de la puntuación. El módulo 51 de puntuación se puede configurar adicionalmente para sumar y/o restar algebraicamente subgrupos de biomarcadores durante la generación de la puntuación.
El dispositivo 50 de procesamiento de datos puede comprender adicionalmente un módulo 52 de evaluación en comunicación con el módulo 51 de puntuación. El módulo 22 de evaluación puede estar además en comunicación con el módulo 61 de base de datos de información de biomarcadores. El módulo 52 de evaluación puede adicionalmente estar en comunicación con el módulo 31 de base de datos de historial médico. El módulo 52 de evaluación se puede configurar para determinar una probabilidad de presencia de melanoma en el paciente en base a la puntuación del paciente en comparación con puntuaciones de grupos de pacientes diagnosticados con melanoma y puntuaciones de grupos de pacientes que no fueron diagnosticados con melanoma. El módulo 52 de evaluación se puede configurar adicionalmente para determinar una probabilidad de presencia de melanoma en el paciente basándose en la puntuación del paciente y la información del paciente. El dispositivo 50 de procesamiento de datos puede comprender adicionalmente un módulo 53 de diagnóstico en comunicación con el módulo 52 de evaluación. El módulo 53 de diagnóstico se puede configurar para determinar procedimientos de diagnóstico adicionales sugeridos en base a la probabilidad de melanoma de un paciente. El dispositivo 50 de procesamiento de datos puede comprender adicionalmente un módulo 54 de generación de informes. El módulo 54 de generación de informes puede comprender cualquier dispositivo que agregue los datos y el proceso del dispositivo 50 de procesamiento de datos en un informe. El informe producido por el módulo 54 de generación de informes puede comprender la puntuación. El informe puede comprender adicionalmente la probabilidad de la presencia de melanoma. El informe puede comprender adicionalmente procedimientos de diagnóstico adicionales sugeridos. El informe puede incluir adicionalmente tratamientos sugeridos.
El sistema 100 comprende adicionalmente un dispositivo 70 de procesamiento de datos. El dispositivo 70 de procesamiento de datos comprende un medio 71 de comunicación. El medio 71 de comunicación está en comunicación con el módulo 54 de generación de informes y el módulo 10 de interfaz de paciente/proveedor médico. El medio 71 de comunicación está configurado para transmitir el informe generado por el módulo 54 de generación de informes al módulo 10 de interfaz de paciente/proveedor médico. El informe se puede transmitir adicionalmente por medios electrónicos al módulo 10 de interfaz de paciente/proveedor médico. Los medios 71 de comunicación también pueden transmitir el informe imprimiendo en un medio tangible tales como papel y transmitir el informe al módulo 10 de interfaz de paciente/proveedor médico. Al recibir el informe transmitido, el proveedor 11 médico puede tratar al paciente 12 de acuerdo con la información del informe. El proveedor 11 médico puede diagnosticar además al paciente 12 basándose en el informe. El proveedor 11 médico puede adicionalmente crear o modificar un plan de tratamiento para el paciente 12 basándose en el informe. El proveedor 11 médico puede adicionalmente seguir la prueba diagnóstica adicional sugerida del informe y/o seguir los tratamientos sugeridos en el informe.
De acuerdo con lo anterior, los diversos componentes, módulos, sistemas y/o características divulgados en este documento se pueden incorporar como módulos dentro de un sistema. Dicho sistema se puede implementar en software, firmware, hardware y/o infraestructura física. Aunque no siempre se menciona explícitamente en este documento, un módulo puede identificarse (nombrarse) en base a la función que realiza. Por ejemplo, un módulo que está configurado para calcular algo puede comprender hardware, software o firmware específico y se le denomina correctamente “módulo de cálculo”.
Las realizaciones también se pueden proporcionar como un producto de programa informático que incluye un medio legible por máquina no transitorio que tiene almacenadas en el mismo instrucciones que se pueden utilizar para programar, o ejecutarse en, un ordenador (u otro dispositivo electrónico) para realizar los procesos descritos en este documento. El medio legible por máquina puede incluir, pero no se limita a, discos duros, disquetes, discos ópticos, CD-ROM, DVD-ROM, ROM, RAM, Ep ROM, EEPROM, tarjetas magnéticas u ópticas, dispositivos de memoria de estado sólido, u otros tipos de medios/medios legibles por máquina adecuados para almacenar instrucciones electrónicas. Más aún, un producto de programa informático se puede correr, ejecutar, descargar y/o utilizar de otro modo local o remotamente a través de una red.
Se debe entender que las referencias a “un dispositivo de procesamiento de datos” pueden referirse al mismo dispositivo o uno o más dispositivos diferentes. Por ejemplo, ciertas etapas de los métodos asistidos por ordenador se pueden realizar en un dispositivo controlado por un proveedor de servicios de diagnóstico y otras etapas se pueden realizar en un dispositivo controlado por un médico. Asimismo, los dispositivos 10, 20, 30, 40, 50, 60 y 70 de procesamiento de datos pueden ser un solo dispositivo o, por ejemplo, el dispositivo 50 de procesamiento de datos puede ser múltiples dispositivos de procesamiento de datos.
En determinadas realizaciones, el método implementado por ordenador se puede configurar para identificar que un paciente tiene o no tiene cáncer de páncreas. Por ejemplo, el método implementado por ordenador se puede configurar para informar a un médico que un paciente en particular tiene cáncer de páncreas. Alternativa o adicionalmente, el método implementado por ordenador se puede configurar para sugerir realmente un curso de tratamiento particular en base a las respuestas a/resultados para varias consultas.
Ejemplos
Ejemplo 1
En este ejemplo, determinamos si los genes de progresión del ciclo celular pueden diferenciar entre melanoma maligno y nevos no malignos. Específicamente, este ejemplo evalúa si el melanoma se puede diferenciar de los nevos benignos, así como de los nevos displásicos. Materiales y métodos
Muestras: 31 muestras de piel FFPE, con portaobjetos de 3 x 10 mm para cada muestra, y un portaobjetos de 4 mm para revisión de H&E entre las edades de 10-11 años se obtuvieron de una institución académica. Las muestras consistieron en 11 nevos benignos, 10 nevos displásicos y 10 muestras de melanoma. La Tabla 4 enumera las muestras y los detalles clínicos correspondientes.
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Procesamiento de muestras, generación de puntuación de CCP y análisis: se tiñeron portaobjetos de 4 mm para hacer portaobjetos de H&E y se revisaron por un patólogo que rodeó la lesión con un círculo (el nevo o el melanoma). Utilizando el portaobjetos de H&E, las lesiones se disecaron y se retiraron de cada uno de los tres portaobjetos de 10 |jM. Se agruparon las tres lesiones disecadas de un solo paciente.
Se extrajo ARN de muestras y se determinaron los niveles de expresión de ARN utilizando técnicas de qPCR estándar. De las 31 muestras, 30 se analizaron con éxito y generaron una puntuación de CCP (véase los datos en la Tabla 4).
Las puntuaciones de CCP de las muestras de melanoma se compararon con los otros dos grupos, nevos benignos y nevos displásicos, así como con nevos displásicos solos, utilizando la prueba t de Student, para determinar si las puntuaciones de CCP de los grupos eran diferentes de una manera estadísticamente significativa.
Resultados
Observamos que las muestras de melanoma tenían puntuaciones de CCP diferentes a las de ambos subgrupos de nevos combinados, de una manera muy significativa desde el punto de vista estadístico (valor de p, 1.4 x 10-6, véase Figura 2). Cuando se utilizan estos datos en un modelo de diagnóstico, las muestras de melanoma se pueden identificar con un AUC de 0.97. En promedio, las puntuaciones de CCP del melanoma fueron 1.08 más altas que las puntuaciones de CCP de los nevos. Consulte la Tabla 4 para obtener una lista de todos los datos. La Figura 2 muestra la distribución de las puntuaciones de CCP de las 30 muestras con una puntuación, separadas por el diagnóstico clínico.
También observamos que las muestras de melanoma tenían diferentes puntuaciones de CCP en comparación con solo los nevos displásicos, de una manera estadísticamente significativa (valor de p, 3.9 x 10-5, véase Figura 2). Cuando se utilizan estos datos en un modelo de diagnóstico, se pueden identificar las muestras de melanoma, en comparación con solo los nevos displásicos, con un AUC de 0.97. En promedio, las puntuaciones de CCP del melanoma fueron 0.94 más altas que las puntuaciones de CCP de los nevos.
Finalmente, observamos que los nevos benignos no eran estadísticamente diferentes a los nevos displásicos (valor p, 0.17), lo que indica que cuando los nevos se vuelven displásicos no se replican a un ritmo más rápido, y solo después de la transición a un melanoma hacen que las células comiencen a replicarse más rápido. Los datos indican que las muestras de melanoma se replican a una tasa dos veces mayor que la de los nevos.
Discusión
Estos datos muestran que la medición de las puntuaciones de CCP puede diferenciar entre melanoma maligno y nevos no malignos. Más específicamente, estos datos muestran que una puntuación CCP puede diferenciar entre melanoma y nevos displásicos. Si bien la diferencia promedio entre los dos grupos es moderada (~1 unidad CCP), la precisión de las mediciones permite una buena separación de los dos conjuntos de datos.
Ejemplo 2
En este ejemplo, determinamos si ciertos genes CCP diferenciaban nevos y melanomas de manera más eficaz (Tabla 6). De hecho, observamos que había ciertos genes de CCP que tenían valores de AUC mucho mejores que otros, a pesar de que todos menos uno tenían un AUC> 0.8, que todavía era bastante impresionante. Decidimos seguir adelante y seleccionamos diez genes CCP cuyas puntuaciones AUC eran > 0.95 (véase Tabla 6). Diez genes CCP fueron suficientes para producir una puntuación CCP sólida y fiable.
Tabla 6.
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Ejemplo 3
Este ejemplo evalúa una variedad de biomarcadores potenciales para determinar si su expresión alterada puede diferenciar entre melanoma maligno y nevos no malignos.
Materiales y métodos
Muestras: El descubrimiento de biomarcadores se realizó utilizando dos conjuntos de datos independientes. El primer conjunto de datos consistió en 31 muestras (Grupo 1). Véase la Tabla 7 para obtener una lista de estas muestras y sus detalles clínicos. El segundo conjunto de datos consistió en 53 muestras (Grupo 2). Véase la Tabla 8 para obtener una lista de estas muestras y sus detalles clínicos.
Tabla 7. Muestras Grupo 1.
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Tabla 8. Muestras de grupo 2
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Extracción de ARN: Las 31 muestras del grupo 1 se anonimizaron con un qPCRID y un portaobjetos de H&E de 4 mm fue revisado por un patólogo, quien rodeó con un círculo la lesión de interés (ya sea el nevo o el melanoma). A continuación, las lesiones se macrodiseccionaron y se retiraron de tres portaobjetos de 10 pM. Las tres lesiones disecadas de un solo paciente se agruparon en un solo tubo. Se extrajo ARN de las muestras, se determinaron los niveles de expresión de ARN utilizando técnicas de qPCR estándar y se generó una puntuación de CCP estándar.
A continuación, se utilizó ARN de 30 de las muestras en las dos primeras rondas de descubrimiento de biomarcadores. El ARN se determinó mediante ADN y se cuantificó. El ARN con concentraciones> 40 ng/uL se normalizó a 40 ng/uL.
Las 53 muestras del grupo 2 se anonimizaron con un qPCR ID, y portaobjetos de H&E fue revisado por un patólogo, quien rodeó con un círculo la lesión de interés. Luego, las lesiones se macro-disecaron de cinco portaobjetos de 4 mm. Las cinco lesiones disecadas de un solo paciente se agruparon en un solo tubo. El ARN de cada tubo se extrajo utilizando técnicas estándar de extracción de ARN. El ARN se determinó mediante ADN y se cuantificó. Todas las muestras de ARN con concentraciones> 40 ng/uL se normalizaron a 40 ng/uL.
Medición de la expresión génica: la expresión de ARN se midió utilizando técnicas de qPCR estándar. Se determinaron los valores de Ct y la expresión de cada gen se normalizó a la expresión de los genes constitutivos.
Los biomarcadores se evaluaron en tres rondas de prueba. Solo las muestras del grupo 1 se analizaron en las rondas 1 y 2 de prueba. Las muestras de los grupos 1 y 2 se analizaron en la ronda 3 de prueba. Los datos de cada ronda de pruebas se analizaron por separado y se agregaron. Los genes constitutivos probados para la normalización en las tres rondas incluyeron MRfAp 1, PSMA1, RPL13A y TXNL1. Adicionalmente, los genes constitutivos SLC25A3, RPS29, RPL8, PSMC1 y RPL4 se incluyeron en la primera ronda de pruebas.
Resultados
La Tabla 9 enumera todos los amplicones utilizados en el descubrimiento de biomarcadores y enumera los valores p para rondas separadas de análisis y análisis agregado como se indica en la columna de prueba de la ronda. Los valores P son valores P de la Suma de Rangos de Wilcoxon, y los valores p y el AUC indican la diferenciación de todos los subtipos de melanomas de todos los subtipos de nevos.
Tabla 9. Todos los amplicones utilizados durante el descubrimiento del biomarcador
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La Figura 3 muestra la distribución de todos los amplicones probados en las tres rondas de descubrimiento de biomarcadores. Las muestras se diferencian en función del diagnóstico en el eje Y. La expresión relativa (Ct) de cada gen (en comparación con la expresión de los genes constitutivos) se representa gráficamente en el eje X
La Figura 4 muestra las distribuciones de cada amplicón individual probado en las rondas uno y dos del descubrimiento de biomarcadores. Las muestras se diferencian según su subtipo patológico en el eje Y. La expresión relativa (Ct) de cada gen (en comparación con la expresión de los genes constitutivos) se representa gráficamente en el eje X. Cada amplicón está identificado por el gen y los últimos tres dígitos del ID del ensayo
Discusión
Estos datos indican claramente que la expresión de genes biomarcadores específicos se puede utilizar para diferenciar el melanoma maligno de los nevos no malignos. No obstante, se necesita un conjunto de datos más grande para determinar con mayor confianza qué tan efectivo es cada biomarcador individual para diferenciar el melanoma, así como para determinar qué tan grandemente se debería ponderar cada biomarcador en un modelo de diagnóstico. La Tabla 10 enumera el ensayo/amplicón de mejor rendimiento de cada uno de los biomarcadores determinado por su AUC, valor P y falta de datos perdidos. Los valores P son valores P de la Suma de Rangos de Wilcoxon. Los valores de P y el AUC indican la diferenciación de todos los subtipos de melanomas de todos los subtipos de nevos.
Tabla 10
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Ejemplo 4
Se calcularon los valores P para distinguir el melanoma de los nevos para todas las combinaciones de dos, tres y cuatro genes del Panel I con datos de las mismas muestras utilizadas anteriormente. Se utilizó la regresión logística de Firth para asignar los mejores pesos a cada uno de los genes en cada combinación. Los valores p se calcularon utilizando una prueba de relación de probabilidad que compara un modelo que contiene todos los genes en cada combinación con un modelo reducido que no contiene variables predictoras. El número de muestras con datos para todos los genes en cada combinación y si la combinación contiene genes CCP, otros genes o una mezcla de c Cp y otros genes se incluyen en los resultados.
Adicionalmente, se calcularon los valores p para la expresión de CCP promedio de todas las combinaciones de uno a cuatro de los genes de CCP en el panel C como continuación a la siguiente etapa para uso en un conjunto de entrenamiento potencial. Se calculó el promedio de cada combinación de genes CCP y se realizó una prueba t para probar una diferencia en la expresión promedio entre melanomas y nevos.
La Tabla WW contiene los resultados para las combinaciones de entre uno y 4 promedios de genes CCP. La Tabla XX contiene los resultados para todas las combinaciones de dos genes. La Tabla YY contiene los resultados de las 500 combinaciones principales de tres genes. La Tabla ZZ contiene los resultados de las 500 mejores combinaciones de cuatro genes.
Tabla WW
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Tabla XX
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Tabla YY
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Tabla ZZ
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Ejemplo 5
En este ejemplo, determinamos un modelo para diferenciar muestras de melanoma de muestras de nevo en base a una puntuación calculada.
Métodos
Se adquirieron aproximadamente 600 lesiones cutáneas de dos sitios separados (codificados como “Munich” y “Provitro”), con números relativamente iguales en ambos lugares. Cada sitio proporcionó muestras tanto malignas como benignas, con todos los subtipos histológicos principales representados. Se confirmó el diagnóstico de cada caso utilizando un segundo dermatopatólogo que desconocía el diagnóstico del primer dermatopatólogo. Si había discordancia, un tercer dermatopatólogo adjudicaba el diagnóstico.
A continuación, un portaobjetos teñido con H&E de cada caso fue revisado por un patólogo y se identificó la lesión de interés para cada caso. El tejido correspondiente se macrodiseccionó de 5 portaobjetos sin teñir (4 mm de grosor) y se combinó en un solo tubo. A continuación, se extrajo el ARN del tejido, se sintetizó ADN a partir del ARN utilizando ADNasa I y ADNc. Luego amplificamos previamente todos los genes de interés, incluidos 7 genes de normalización constitutivos) en una reacción múltiplex. Finalmente, se utilizó PCR cuantitativa para medir la expresión de cada gen. Los valores de expresión se calcularon al determinar el CT (Crossing Threshold) de cada gen. Cada muestra se ejecutó por triplicado al dividir cada muestra en 3 alícuotas después de la síntesis de ADNc.
A continuación, se promediaron y normalizaron las tres medidas de cada gen mediante la expresión promediada de los siete genes constitutivos. Se estudió cada gen para determinar si su expresión podía diferenciar entre muestras de melanoma maligno y nevos benignos; si los genes eran efectivos en esto, se analizaban adicionalmente para ver qué genes tenían datos correlativos (una indicación de que estos genes miden la misma ruta biológica). Los genes con datos correlacionados se agruparon en conjuntos, y la expresión promedio del conjunto se utilizó para diferenciar el melanoma y los nevos.
Resultados
Se adquirieron ~600 muestras de dos sitios alemanes (etiquetados como Munich y Provitro [Berlín]). Cada sitio contribuyó con números aproximadamente iguales de muestras malignas y benignas, con todos los subtipos histológicos principales representados en las muestras de cada sitio. Primero identificamos la lesión de interés en cada muestra y luego extrajimos el ARN de cada muestra y medimos el nivel de expresión de ARN de los genes distintivos potenciales y 7 genes de normalización constitutivos (Tabla 11).
Tabla 11- Lista de potenciales genes distintivos probados y genes constitutivos utilizados para normalización.
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Constitutivo
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A continuación, se analizó la capacidad de cada gen para determinar si su expresión era eficaz para diferenciar las muestras de melanoma maligno y nevos benignos. Determinamos que PRAME era un biomarcador muy eficaz (Figura 5). Adicionalmente, también encontramos que una gran cantidad de genes inmunitarios también eran capaces de diferenciar fuertemente el melanoma y los nevos. Investigamos adicionalmente 8 de estos genes inmunitarios y encontramos que sus datos estaban altamente correlacionados, ya que la expresión de cada gen inmunitario individual tenía una relación lineal con el promedio de los 8 genes inmunitarios (Figura 6). Esto puede indicar que se miden el mismo proceso biológico y, por lo tanto, se agruparon en un conjunto “inmunitario”. Se calculó la expresión promedio de los 8 genes inmunitarios y luego se utilizó al analizar el conjunto de datos. Finalmente, también notamos que el gen del ciclo celular S100A9 también fue capaz de diferenciar muchas muestras de melanoma y nevos.
A continuación, creamos un modelo de diagnóstico combinado, utilizando estos tres conjuntos de biomarcadores (PRAME, los genes inmunitarios y S100A9). Cuando se graficó la expresión de cada biomarcador frente al otro, no vimos una correlación alta, lo que indica que es probable que cada biomarcador mida un proceso biológico diferente y tenga un valor independiente (véase Figura 7). Analizamos los datos a través de un modelo de regresión logística para determinar mejor cómo se podría ponderar cada biomarcador en el modelo, para maximizar la capacidad del modelo para diferenciar el melanoma y los nevos. El modelo más eficaz se encontró con las siguientes ponderaciones para la expresión de cada conjunto de biomarcadores: (0.525 x PRAME) (0.677 x inmunológico) (0.357 x S100A9). Luego, el modelo toma los datos de cada paciente y genera una puntuación, que se puede utilizar para diferenciar el melanoma y los nevos (véase Figura 8). Este conjunto de datos actual se utilizó luego para generar una curva ROC (véase Figura 9), que tenía un AUC de ~0.96.
Ejemplo 6
En este ejemplo, determinamos un modelo de diagnóstico para diferenciar entre melanoma maligno y nevos no malignos y luego refinamos aún más el modelo de diagnóstico.
Métodos
Se adquirieron y prepararon muestras de pacientes como se describió anteriormente en el Ejemplo 5. Asimismo, la extracción de ARN, la preparación y la cuantificación de la expresión génica también se llevaron a cabo de la misma manera que se describió anteriormente en el Ejemplo 5. La misma lista de genes distintivos potenciales y se ensayaron los mismos genes constitutivos que en el Ejemplo 5 (Tabla 11). Como en el Ejemplo 5, la expresión medida de cada gen se promedió y se normalizó mediante la expresión promediada de los siete genes constitutivos. Cada gen se analizó para determinar si su expresión podía diferenciar entre muestras de melanoma maligno y muestras de nevos benignos. Los genes que eran eficaces para diferenciar entre muestras de melanoma maligno y muestras de nevos benignos se analizaron adicionalmente para determinar qué genes tenían datos correlativos. Los datos correlacionados indicaron que los genes midieron la misma ruta biológica. Los genes con datos correlacionados se agruparon en conjuntos, y la expresión media del conjunto se utilizó para diferenciar el melanoma y los nevos.
Resultados
Construcción del modelo de diagnóstico
Como se describe en el Ejemplo 5, se analizó cada gen para determinar si su expresión era eficaz para diferenciar las muestras de melanoma maligno de las muestras de nevos benignos. En este análisis, utilizamos la selección directa para elegir predictores para inclusión en un modelo de diagnóstico que diferenciaría las muestras de melanoma y nevos. Como en el Ejemplo 5, seleccionamos PRAME, S100A9 y una puntuación de componente inmunitario como predictores para diferenciar las muestras de melanoma maligno de las muestras de nevos benignos. La puntuación del componente inmunitario estaba compuesta por ocho genes inmunitarios (CXCL9, CCL5, CXCL10, IRF1, PTPN22, PTPRC, LCP2 y CD38) que tenían datos altamente correlacionados (Figura 6). Estos ocho genes inmunitarios se agruparon y sus valores se promediaron para crear una puntuación del componente inmunitario. Como en el Ejemplo 5, también determinamos que estos tres predictores (PRAME, S100A9 o el componente inmunitario) tenían patrones de expresión solo moderadamente correlacionados entre sí (Figura 7), lo que indica que cada predictor proporciona en gran medida información independiente al distinguir muestras de melanoma y nevos.
A continuación, creamos un modelo de diagnóstico combinado utilizando PRAME, S100A9 y la puntuación del componente inmunitario. El modelo de diagnóstico combinado que creamos fue un modelo lineal basado en los datos de expresión génica de los tres predictores (PRAME, S100A9 y el componente inmunitario). Al generar el modelo lineal, utilizamos regresión logística generalizada para calcular las mejores ponderaciones para cada uno de los tres predictores que diferenciarían de manera más efectiva las muestras de melanoma y nevos en este conjunto de datos. Las mejores ponderaciones calculadas fueron las siguientes: 1.149 para PRAME, 0.922 para S100A9 y 0.698 para la puntuación del componente inmunitario. Utilizando estas mejores ponderaciones, los datos de expresión génica para los tres predictores luego se utilizaron para generar una puntuación que se podría utilizar para ayudar a diferenciar entre muestras de nevos benignos y muestras de melanoma. Los datos de expresión génica para cada predictor se multiplicaron por la mejor ponderación respectiva y luego se combinaron los tres valores ponderados. Este valor combinado, como se muestra en este documento, representó una puntuación que se podría utilizar para ayudar a diferenciar entre muestras de nevos benignos y muestras de melanoma:
Puntuación = (PRAME x 1.149) (S100A9 x 0.922) Componente inmunitario x 0.698)
A continuación, generamos y graficamos las puntuaciones de las 544 muestras (Figura 10). En los puntajes graficados observamos una distribución bimodal. Casi todas las muestras con una puntuación superior a cero eran melanoma (barras de color gris oscuro), mientras que casi todas las muestras de nevos (barras de color gris claro) tenían una puntuación menor que cero. Con estos datos, se generó una curva ROC que tenía un AUC de ~0.95 y un valor p asociado de 2.0 x 10-63 (Figura 11). A partir de esta curva ROC, seleccionamos un punto de corte para diferenciar entre muestras de melanoma y muestras de nevos. Al seleccionar el punto de corte, buscamos maximizar la sensibilidad del modelo, manteniendo la mayor especificidad posible. Seleccionamos un punto de corte con una sensibilidad de 0.89 y una especificidad de 0.93. A continuación, ajustamos el cálculo de la puntuación para que el punto de corte seleccionado tuviera un valor de cero. Por tanto, el cálculo de la puntuación ajustada fue:
Puntuación (PRAME x 1.149) (S100A9 x Componente 0.334 ajustada 0.922) inmunitario x 0.698)
Refinación del modelo de diagnóstico
Para mejorar la robustez y precisión del ensayo, queríamos determinar medidas adicionales para los predictores PRAME y S100A9. Probamos amplicones adicionales correspondientes a PRAME y S100A9. Intentamos determinar si otros amplicones producían una señal fiable y correlacionada para estos genes. Probamos cuatro amplicones PRAME adicionales.
También probamos amplicones que correspondían a otros seis genes que determinamos que tendrían una expresión altamente correlacionada con S100A9: S100A7, S100A8, S100A10, S100A12, S100A14 y PI3.
Determinamos que un amplicón PRAME tenía bajas tasas de falla y tenía valores altamente correlacionados con el amplicón PRAME utilizado previamente en el modelo. Promediamos su medida con la otra medida PRAME para proporcionar un componente PRAME.
Elegimos otros cuatro genes potenciales que produjeron datos con bajas tasas de falla y estaban altamente correlacionados con el amplicón S100A9 seleccionado en el conjunto de entrenamiento. Estos cuatro genes, S100A7, S100A8, S100A12 y PI3 se promediaron con S100A9 para producir un solo componente relacionado con S100, o puntuación S100.
Por tanto, pudimos crear un gen distintivo refinado para los tres predictores, PRAME, el componente relacionado con S100 y el componente inmunitario. El gen distintivo refinado incluyó mediciones adicionales para los predictores relacionados con PRAME y S100 determinados anteriormente. El gen distintivo refinado incluyó un total de 15 amplicones que midieron 14 genes distintivos que comprenden dos mediciones del gen PRAME, una medición de cada uno de los genes relacionados con S100 S100A9, S100A7, S100A8, S100A12 y PI3, y mediciones de ocho genes inmunitarios altamente correlacionados (CXCL9, CCL5, CXCL10, IRF1, PTPN22, PTPRC, LCP2 Y CD38) (Tabla 12). Junto con estos 15 amplicones de gen distintivo, también incluimos amplicones correspondientes a nueve genes constitutivos diferentes para la normalización, para un total de 24 amplicones en nuestro gen distintivo refinado (Tabla 12).
Tabla 12- Genes constitutivos y distintivos que comprenden el distintivo refinado.
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Por último, realizamos un estudio de concordancia para verificar que los cambios en la reacción de PCR múltiplex no alterarían los datos generados a partir de los 10 amplicones de gen distintivo retenidos del gen distintivo inicial. El ensayo qPCR se basa en el hecho de que todos los genes medidos se amplifican previamente en una única reacción de PCR múltiplex. Dado que el gen distintivo refinado difería del gen distintivo inicial, era importante asegurarse de que el conjunto de amplicones diferente del gen distintivo refinado no alteraran la reacción de PCR múltiplex y, de acuerdo con lo anterior, alteraran los datos generados a partir de los 10 amplicones retenidos del conjunto de genes distintivos iniciales. Por lo tanto, volvimos a probar la expresión de ARN en 74 muestras de ARN del conjunto de entrenamiento inicial utilizando el gen distintivo refinado. Las puntuaciones de las muestras de ARN reevaluadas demostraron una correlación extremadamente alta (coeficiente de correlación de 0.99) en comparación con las puntuaciones generadas a partir del conjunto de entrenamiento. Por tanto, el gen distintivo refinado no alteró los datos generados a partir de ninguno de los amplicones del gen distintivo refinado.
De acuerdo con lo anterior, el gen distintivo refinado produjo un cálculo de puntuación ajustado y refinado de:
Puntuación Componente
ajustada, (componente PRAME (Componente
x 1.149) S100 x 0.922) inmunitario x 0.334 refinada 0.698)
Ejemplo 7
En este ejemplo validamos clínicamente un modelo de diagnóstico para diferenciar entre melanoma maligno y nevos no malignos.
Métodos
Se generó una cohorte de validación al adquirir más de 400 lesiones cutáneas de cuatro sitios separados: Cleveland Clinic, Moffit Cancer Center, Northwestern University y el University of Utah (Tabla 13).
T l 1 - F n m r r l h r v li i n líni .
Figure imgf000070_0002
Solo se incluyeron muestras que produjeron resultados analizables.
Cada sitio proporcionó muestras tanto malignas como benignas, con todos los subtipos histológicos principales representados. Se confirmó el diagnóstico de cada caso utilizando un segundo dermatopatólogo que desconocía el diagnóstico del primer dermatopatólogo. Si había discordancia en los diagnósticos, un tercer dermatopatólogo adjudicaba el diagnóstico. Los subtipos de melanoma incluyeron melanoma de extensión superficial, melanoma nodular, melanoma lentigo maligno, melanoma desmoplásico y subtipos clasificados como no especificados de otra manera (Tabla 14).
T l 14 - Inf rm i n líni r m r ^ m l n m iliz n l v li i n líni .
Figure imgf000070_0001
Los subtipos de nevos incluyeron nevos azules, nevos compuestos, nevos de unión, nevos dérmicos, nevos de penetración profunda, nevos displásicos y subtipos clasificados como no especificados de otra manera (Tabla 15).
Tabla 15 - Información clínica de las muestras de nevos utilizadas en la validación clínica.
Figure imgf000071_0001
Las muestras de los pacientes se prepararon como se describió anteriormente en el Ejemplo 5. La extracción de ARN, la preparación de ARN y la cuantificación de la expresión génica también se llevaron a cabo como se describió anteriormente en el Ejemplo 5. La misma lista de genes distintivos potenciales y los mismos genes constitutivos fueron ensayados como en el Ejemplo 5 (Tabla 11). Asimismo, como en el Ejemplo 5, la expresión medida de cada gen se promedió y se normalizó mediante la expresión promediada de los siete genes constitutivos. Luego, se generó una puntuación ajustada y refinada para cada muestra de paciente utilizando el cálculo de la puntuación ajustada y refinada de:
Puntuación Componente
ajustada, (componente PRAME (Componente x 0.334 refinada x 1.149) S100 x 0.922) inmunitario
0.698)
Resultados
Se graficaron las puntuaciones ajustadas y refinadas para cada muestra de paciente (Figura 12). Las puntuaciones ajustadas y refinadas graficadas dieron como resultado una distribución bimodal similar a la que se ve en la Figura 10 del Ejemplo 6. Casi todas las muestras de melanoma tenían puntuaciones superiores a cero (Figura 12, panel superior) y casi todas las muestras de nevos tenían puntuaciones inferiores a cero (Figura 12, panel inferior). Estos datos se utilizaron luego para generar una curva ROC de validación que tenía un AUC de ~0.96 con una sensibilidad de 0.9 y una especificidad de 0.91 (Figura 13). El valor p asociado con la curva ROC de validación fue de 3.7 x 10-63. A continuación, se comparó la curva ROC de validación con la curva ROC generada en el Ejemplo 6 (Figura 11) para determinar si había sido validado el modelo de diagnóstico. La curva ROC de validación tenía un AUC de ~0.96, una sensibilidad de 0.9 y una especificidad de 0.91 en comparación con la curva ROC del Ejemplo 6 que tenía un AUC de ~0.95, una sensibilidad de 0.89 y una especificidad de 0.93. La estrecha concordancia de la curva ROC de validación y la curva ROC del Ejemplo 6 indicó que la cohorte de validación validó el modelo de diagnóstico del Ejemplo 6.
A continuación, se analizó el rendimiento del modelo de diagnóstico dentro de los subtipos histológicos individuales para aquellos subtipos con 30 o más muestras (Tabla 16).
Tabla 16. Ensa o de desem eño dentro de los subti os individuales en la validación clínica.
Figure imgf000071_0002
Hubo dos subtipos benignos, compuesto y dérmico, con más de 30 muestras. La puntuación de los subtipos dérmicos y compuestos dio como resultado especificidades del 94% y 98%, respectivamente, con una especificidad general del 91% para todos los nevos. Hubo tres subtipos malignos, melanoma de extensión superficial, melanoma nodular y melanoma lentigo maligno con más de 30 muestras. La puntuación de melanoma de extensión superficial, melanoma nodular y melanoma lentigo maligno resultó en sensibilidades del 86%, 97% y 90%, respectivamente, con una sensibilidad general del 90% para todos los melanomas

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para diagnosticar melanoma en un paciente que comprende:
a) medir el nivel de expresión de un panel de genes que comprenden PRAME, S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, S100A10, S100A14, PI3, CCL5, CD38, CXCL10, CXCL9, IRF1, LCP2, PTPN22, y PTPRC en una muestra que se ha obtenido de un paciente;
b) comparar el nivel de expresión de dicho panel de genes en la muestra del paciente a un nivel de expresión de dicho panel de genes medidos en una muestra de un individuo que no sufre de melanoma; y
c) detectar una diferencia en el nivel de expresión de dicho panel de genes en el paciente, en el que una diferencia en el nivel de expresión de dicho panel de genes en el paciente indica un diagnóstico de melanoma en el paciente.
2. El método de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente comparar los niveles de expresión del panel de genes al normalizar con un panel de genes constitutivos.
3. El método de la reivindicación 2, en el que el panel de genes constitutivos comprende CLTC, MRFAP1, PPP2CA, PSMA1, RPL13A, RPL8, RPS29, SLC25A3, o t X n L1, o combinaciones de los mismos.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que detectar una diferencia comprende adicionalmente calcular una puntuación basada en la suma de los niveles de expresión de cada gen dentro del panel de genes, en el que la puntuación es indicativa de una diferencia en niveles de expresión del panel de genes del paciente.
5. El método de la reivindicación 4, en el que calcular la puntuación comprende adicionalmente ponderar los valores de los niveles de expresión de cada gen con el panel de genes y/o sustituir un nivel de expresión individual de un gen con un nivel de expresión promedio de un grupo de genes relacionados.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se registra la detección de una diferencia en los niveles de expresión en un informe.
7. El método de la reivindicación 6, en el que el informe se comunica al proveedor médico del paciente.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se registra el diagnóstico de melanoma en un informe.
9. El método de la reivindicación 8, en el que el informe se comunica al proveedor médico del paciente.
10. Un método implementado por ordenador que comprende:
calcular una puntuación como se define en la reivindicación 4 o 5
animar la ejecución de un módulo de código configurado para mostrar una puntuación que representa una comparación entre niveles de expresión génica de un panel de biomarcadores en un paciente y niveles de expresión génica en grupos de control con melanoma y en grupos de control sin melanoma;
iniciar la ejecución del módulo de código; y
presentar una representación gráfica visual de la puntuación;
en el que la puntuación representa la probabilidad de que el paciente tenga melanoma.
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