ES2824026T3 - Compuestos miméticos de anticuerpos sintéticos (SyAM) dirigidos al cáncer, especialmente cáncer de próstata - Google Patents

Compuestos miméticos de anticuerpos sintéticos (SyAM) dirigidos al cáncer, especialmente cáncer de próstata Download PDF

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Abstract

Un compuesto de acuerdo con la estructura química: **(Ver fórmula)** en la que [IBT] es un resto de unión de acuerdo con la estructura química; **(Ver fórmula)** [CBT] es un resto de unión celular que se une al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) de acuerdo con la estructura química **(Ver fórmula)** en la que X1 y X2 son cada uno independientemente CH2, O, NH o S; X3 es O, CH2, NR1, S(O), S(O)2, -S(O)2O, -OS(O)2, u OS(O)2O; R1 es H, un grupo alquilo C1-C3, o un grupo -C(O)(C1-C3); k es un número entero de 0 a 20; L1 y L2 son grupos enlazadores, grupos que incluyen opcionalmente uno o más grupos conectores bifuncionales [CON]; elegir en el grupo que consiste en: - L1 y L2, cada uno independientemente, son un enlazador de acuerdo con la fórmula química: **(Ver fórmula)** en la que Ra es H o un alquilo C1-C3, preferentemente CH3, más a menudo H; m es un número entero de 1 a 12, a menudo 1, 2, 3, 4, 5 o 6; m'' es un número entero 1, 2, 3, 4, 5 o 6, a menudo 6; t es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6; y iL es 0 o 1, a menudo 1, en la que dicho enlazador, en ciertos casos, puede estar unido preferentemente a un grupo [CON] y un grupo [CBT] en un extremo, y un grupo [MULTICON] en el otro extremo; - L1 y L2, cada uno independientemente, son un enlazador de acuerdo con la estructura: **(Ver fórmula)** en la que q es un número entero de 0-12 q' es de 1 a 12, a menudo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 y iL es 0 o 1; - L1 y L2 están unidos entre sí para proporcionar enlazadores adicionales que a menudo se usan en compuestos de acuerdo con la presente invención: **(Ver fórmula)** en la que q es un número entero de 0-12, preferentemente 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6; q' es de 1 a 12, a menudo 1, 2, 3, 4, 5 o 6; iL es 0 o 1; y RL es un aminoácido o un oligopéptido, y - L1 y L2, cada uno independientemente, es un aminoácido, un dipéptido o un oligopéptido que contiene de 1 a 12, dipéptido de dilisina o glicinalisina, en el que, cuando la lisina se usa como un aminoácido en un enlazador oligopeptídico, la amina de alquileno de cadena lateral se usa para unir otros grupos enlazadores u otros componentes en la molécula; - L1 y L2, cada uno independientemente, es un grupo **(Ver fórmula)** enlazador de poliprolina o **(Ver fórmula)** enlazador de colágeno, un grupo **(Ver fórmula)** o un enlazador de polipropilenglicol o polipropileno-co-polietilenglicol que tiene entre 1 y 100 unidades de glicol; en el que Ra es H, alquilo C1-C3 o alcanol, o forma un anillo cíclico con R3 (prolina) y R3 es una cadena lateral derivada de un aminoácido; m'' es un número entero de 0 a 25; m es un número entero de 1 a 100; y n es un número entero de 1 a 100; y - L1 y L2, son cada uno independientemente un enlazador de acuerdo con la fórmula química: **(Ver fórmula)** en la que Z y Z' son cada uno independientemente un enlace, -(CH2)i-O, -(CH2)i-S, -(CH2)i-N-R **(Ver fórmula)** en las que dicho grupo -(CH2)i, si está presente en Z o Z', está unido a [MULTICON], [ABT], [CBT], o [TLR] o un grupo conector difuncional opcional [CON], si está presente; cada R es independientemente H, o un grupo alquilo C1-C3 o alcanol; cada R2 es independientemente H o un grupo alquilo C1-C3; cada Y es independientemente un enlace, O, S o N-R; cada i es independientemente de 0 a 100; D es **(Ver fórmula)** o un enlace, o D puede ser **(Ver fórmula)** o **(Ver fórmula)** o un enlazador de polipropilenglicol o polipropileno-co-polietilenglicol que tiene entre 1 y 100 unidades de glicol; con la condición de que Z, Z' y D no sean cada uno simultáneamente enlaces; j es de 1 a 100; m (en este contexto) es un número entero de 1 a 100; y n (en este contexto) es un número entero de aproximadamente 1 a 100; m' es de 1 a 100, m'' es un número entero entre 0 y 25; n' es de 1 a 100; X1 es O, S o N-R; R es como se ha descrito anteriormente; Ra es H, alquilo C1-C3 o alcanol, o forma un anillo cíclico con R3 (prolina) y R3 es una cadena lateral derivada de un aminoácido; - L1 y L2, son cada uno independientemente un enlazador basado en succinimida de acuerdo con la fórmula química: **(Ver fórmula)** . en la que cada Xs es independientemente S, O o N-RS, preferentemente S; RS es H o alquilo C1-3, preferentemente H; Sc es CH2; CH2O; o CH2CH2O; i es 0 o 1; y mS es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6; [MULTICON] es un grupo químico bifuncional o multifuncional que, cuando está presente, conecta al menos un grupo [IBT] al menos a un grupo [CBT] a través de un enlazador, siento dicho [MULTICON] un grupo conector multifuncional o molécula de acuerdo con la estructura química: **(Ver fórmula)** en la que Y4 es C-H o N; y cada X'' se deriva independientemente de un grupo electrófilo o nucleófilo, preferentemente (CH2)n''O, (CH2)n''NRCON, (CH2)n''S, (CH2)n'', (CH2)n''C=O o un grupo [CON]; el sustituyente RCON es H o un alquilo C1-C3, preferentemente H o CH3 y n'' es 0, 1, 2 o 3; en la que dicho grupo [CON], si está presente, es un resto de acuerdo con la estructura química: **(Ver fórmula)** en la que X2 es O, S, NR4, S(O), S(O)2, -S(O)2O, -OS(O)2, u OS(O)2O; X3 es NR4, O o S; y R4 es H, un grupo alquilo C1-C3 o alcanol, o un grupo -C(O)(C1-C3) o de acuerdo con la estructura química **(Ver fórmula)** m es un número entero de 0 a 12, e iL es 0 o 1 MCON es un número entero de 0 a 10; n y n' son cada uno independientemente un número entero de 1 a 15; y NL1 y NL2 son cada uno un número entero de 0 a 10, con la condición de que n >= NL1 y n' >= NL2, o una sal o enantiómero farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos miméticos de anticuerpos sintéticos (SyAM) dirigidos al cáncer, especialmente cáncer de próstata
Sector de la técnica
La presente invención se refiere a compuestos que funcionan como compuestos miméticos de anticuerpos sintéticos. Los compuestos de acuerdo con la presente invención son compuestos bifuncionales/multifuncionales que contienen al menos un resto de unión a células cancerosas que se une selectivamente al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) y un resto de unión al receptor FC que modula un receptor inmune FC, preferentemente un receptor FcyRI. Los compuestos de acuerdo con la presente invención se unen selectivamente a las células cancerosas que regulan positivamente el PSMA y, a través de esa interacción, colocan el resto de unión al receptor Fc del compuesto cerca de un receptor Fc, preferentemente un receptor FcyRI, que puede modular (preferentemente, regular positivamente) una respuesta humoral en un paciente a las células cancerosas. A través de esta acción biológica de los compuestos de acuerdo con la presente invención, las células cancerosas, incluidas las células cancerosas metastásicas, especialmente las células de cáncer de próstata pueden regularse inmunitariamente, dando como resultado la terapia favorable del cáncer en un paciente. En el presente documento se divulgan métodos para usar estos compuestos para tratar el cáncer y/o reducir la probabilidad de metástasis del cáncer.
Estado de la técnica
Una creciente cantidad de datos indica que las terapias dirigidas pueden movilizar el propio sistema inmunitario del paciente para destruir las neoplasias con menos efectos secundarios que la quimioterapia tradicional. Dado que se estima que el 41 % de los estadounidenses - casi 1 de cada 2 personas - nacidos en 2011 desarrollará cáncer en su vida, la generación de inmunoterapias contra el cáncer más eficaces es una alta prioridad. Estas terapias incluyen anticuerpos monoclonales (mAb) que dirigen las células inmunes innatas a antígenos asociados a tumor (TAA), así como "vacunas" contra el cáncer que adoptan muchas formas (incluyendo inyecciones de proteínas tumorales con adyuvantes o células dendríticas cebadas ex vivo), y se diseñan con la intención de inducir linfocitos T antitumorales de larga duración.
El documento US2011201563 (A1) divulga compuestos químicos quiméricos que se utilizan para reclutar anticuerpos contra células cancerosas, en particular, células de cáncer de próstata o células de cáncer de próstata metastatizadas. Estos compuestos comprenden un resto terminal de unión de anticuerpos (ABT) unido covalentemente a un extremo de unión celular (CBT) a través de un enlazador y, opcionalmente, una molécula conectora. El objetivo de la investigación de los presentes inventores es desarrollar compuestos novedosos capaces de estimular respuestas inmunitarias contra tumores. La introducción de anticuerpos monoclonales (mAb) ha revolucionado el campo de la inmunoterapia, particularmente, la terapia contra el cáncer. Aunque los mAb se han convertido en un pilar de los productos terapéuticos contra el cáncer, poseen graves inconvenientes.1 Los mAb están limitados por sus peligrosas reacciones secundarias inmunológicas, la falta de biodisponibilidad oral, y el alto coste de producción y administración. El desarrollo de moléculas sintéticas que imitan la función del anticuerpo puede proporcionar una solución eficaz para los problemas mencionados anteriormente.
La investigación actual está explorando el desarrollo de nuevos productos terapéuticos que aprovechen las respuestas naturales del sistema inmunitario. La optimización de la región Fc de los anticuerpos monoclonales no conjugados para aumentar su eficacia y respuesta ha sido de gran interés23. Un derivado de anticuerpos monoclonales desarrollado recientemente, los anticuerpos biespecíficos, liga dos Fab con diferente especificidad diana. Una región Fab se une a la proteína diana de interés y la otra se une a un receptor inmune de elección45, incluyendo FcyRI6, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos dirigidos a HER2 y FcyRI.6 En un enfoque alternativo, los presentes inventores, y otros, han utilizado un diseño racional para construir sistemas sintéticos capaces de realizar, o modelar, funciones inmunológicas complejas.7
Como resultado, se han producido varias moléculas de reclutamiento de anticuerpos (ARM) que pueden modular el sistema inmunitario8. Las ARM son moléculas sintéticas bifuncionales que contienen un extremo de unión a diana (TBT), que se une a proteínas de superficie patógenas con alta afinidad y especificidad, y un extremo de unión a anticuerpo (ABT) que recluta anticuerpos endógenos. Se ha demostrado que estas moléculas son capaces de provocar una respuesta inmunitaria dirigida selectivamente contra células tanto cancerosas como infectadas por virus. Este tema ha sido revisado recientemente.4
A pesar del desarrollo de las ARM, la manipulación del sistema inmunitario con moléculas completamente sintéticas se encuentra actualmente en sus inicios.9 En la presente invención, un imitador de anticuerpos de peso molecular relativamente pequeño puede realizar funciones tanto de diana como efectoras inmunes, un enfoque que es más prometedor para el tratamiento del cáncer, especialmente el cáncer de próstata. Para el desarrollo de este mimético de anticuerpos totalmente sintético, se eligió el cáncer de próstata como diana patógena, aunque el enfoque se puede utilizar en cualquier lugar donde se exprese PSMA, incluyendo prácticamente todos los cánceres, pero especialmente el cáncer de próstata y el cáncer de próstata metastásico.
La elección del cáncer de próstata como objetivo para el desarrollo de la presente invención refleja su gravedad para causar enfermedad y la muerte. El cáncer de próstata es la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer entre los hombres estadounidenses, y las estrategias actuales de tratamiento a menudo conducen a recidivas y efectos secundarios no deseados.10 Se ha predicho que uno de cada seis hombres estadounidenses desarrollará cáncer de próstata durante su vida. En la actualidad, no existen fármacos basados en anticuerpos monoclonales clínicamente aprobados que se dirijan al cáncer de próstata. Evidentemente, un enfoque inmunológico para el tratamiento del cáncer de próstata representa un enfoque con gran potencial, sin embargo, los atributos negativos de los presentes enfoques inmunológicos deben mejorarse para que este enfoque general tenga éxito. La presente invención representa un enfoque alternativo para abordar estos problemas.
La presente invención
El trabajo actual que se presenta en esta solicitud ha conducido al desarrollo inventivo de un mimético funcional completamente sintético de un anticuerpo que puede superar algunos de los inconvenientes que limitan el potencial terapéutico de los anticuerpos monoclonales. Este nuevo enfoque aprovecha las ventajas de las moléculas pequeñas tradicionales con las de los biológicos de próxima generación para abordar las limitaciones actuales. Aquí, se informa de una molécula sintética diseñada racionalmente, llamada "mimético de anticuerpo sintético dirigido al cáncer de próstata" (SyAM-P), que es capaz de redirigir las funciones inmunológicas de FcyRI hacia dianas que muestran el antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), dirigiéndose y erradicando así las células cancerosas que regulan positivamente el PSMA, incluidas las células de cáncer de próstata, incluidas las células de cáncer de próstata metastásico. Los inventores presentan aquí los primeros ejemplos de moléculas sintéticas que presentan las propiedades y funciones de un anticuerpo, lo que implica el direccionamiento selectivo de una respuesta inmunitaria contra una diana patógena, en este caso las células cancerosas, incluidas las células cancerosas metastásicas, especialmente las células de cáncer de próstata y las células de cáncer de próstata metastásico.
La presente invención se refiere a compuestos que se denominan SyAM-P. Los SyAM-P son pequeñas moléculas multifuncionales diseñadas para estimular respuestas inmunitarias antitumorales tanto innatas como adaptativas, especialmente las respuestas inmunitarias que se modulan a través de FcyRI. Los inventores han desarrollado previamente moléculas de reclutamiento de anticuerpos bifuncionales (ARM) capaces de redirigir anticuerpos endógenos a células de cáncer de próstata que expresan el antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA). La presente invención mejora las propiedades inmunoestimuladoras de las ARM uniendo moduladores de FcyRI (potentes moduladores de la respuesta humoral) al andamiaje de las ARM. Los restos de unión del compuesto precursor se dirigen a las células cancerosas que exhiben una regulación positiva de PSMA, en particular, células de cáncer de próstata, mientras que el motivo FcyRI adicional activa una respuesta humoral local para la inducción de memoria inmunológica contra el tumor. El resultado es un efecto que proporciona una actividad anticancerosa sinérgica que es sustancialmente mayor que la actividad anticancerosa de moléculas funcionales individuales que no están unidas entre sí como en la presente invención.
Descripción de las figuras
La Figura 1 muestra A) una representación del mecanismo de acción propuesto de los miméticos de anticuerpos sintéticos; B) muestra un modelo de las distancias de membrana y los requisitos de longitud durante la interacción entre un anticuerpo monoclonal contra la unión de PSMA a un receptor Fc; y C) muestra un esquema de la evolución del diseño de SyAM-P a partir de una plantilla de anticuerpo monoclonal.
La figura 2 ilustra compuestos y restos relacionados de acuerdo con la presente invención. CP33 es un motivo 1 de direccionamiento de FcyRI, SyAM-P1, primera generación que muestra un único motivo de unión de FcyRI y PSMA unidos con unidades aminocaproicas. 2, SyAm-P2, segunda generación que muestra un par de motivos dirigidos a PSMA unidos a un único motivo CP33. 3, SyAM-P3, tercera generación que muestra un par de motivos dirigidos a PSMA unidos a un único motivo CP33. El resto de biotina está presente como un asa para que los compuestos puedan aislarse o identificarse fácilmente en experimentos que se divulgan de otro modo en el presente documento. En la práctica, los compuestos terapéuticos de acuerdo con la presente invención evitan la inclusión de una molécula de biotina y los compuestos contienen un hidrógeno, un grupo alquilo o un grupo acilo en el grupo amina unido al resto de biotina representado en la figura. 3, SyAm-P3, tercera generación que muestra un par de motivos dirigidos a PSMA unidos a un par de restos/moléculas dirigidos a CP33.
La figura 3 muestra A) la unión del compuesto 1 a PSMA que expresa células RM1.PGLS de una manera dependiente de la dosis; B) unión de 1 (SyAm-P1) a células IIA1.6 que expresan FcyRI de una manera dependiente de la dosis; C) capacidad de 1 para moldear un complejo ternario entre las células IIA1.6 que expresan FcyRI y PSMA humano recombinante soluble; D) generación de explosión de superóxido contra perlas marcadas con PSMA por células U937 cebadas con IFN-y inducida por 1. Los datos de fagocitosis y explosión de superóxido son experimentos representativos realizados por triplicado en tres ocasiones distintas; E) fagocitosis usando células U937 cebadas con IFN-y como efectores y perlas marcadas con PSMA de poliestireno fluorescente inducida por 1 de una manera dependiente de la dosis y dependiente de PSMA.
La figura 4 muestra A) la comparación de la fagocitosis inducida por el compuesto 2 (SyAMP-2) y 3 (SyAMP-3) contra perlas marcadas con PSMA por células U937 cebadas con IFN-y. Se observa una respuesta dependiente de la dosis y de PSMA con un aumento en el intervalo y nivel de eficacia por el compuesto 3 en comparación con el compuesto 2 ; B) comparación de la explosión de superóxido por células U937 cebadas contra perlas marcadas con PSMA de una manera dependiente de la dosis por los compuestos 2 y 3 con un aumento en el intervalo y la cantidad de compuesto 3; C) fagocitosis de PSMA que expresa células RM1.PGLS como se induce por el compuesto 3 usando IFN-y; D) imágenes de citometría de flujo de amnis de la fagocitosis con imágenes representativas de la fagocitosis completa con imágenes representativas de la fagocitosis completa en comparación con la formación de copa fagocítica. Los canales mostrados son de campo claro, diana (teñida con colorante Fl1 DiO), nucleido (teñido con DAP1), macrófago (etapa F12 DID) e imagen combinada.
La figura 5, Tabla 1, muestra la fagocitosis de perlas de 6 pm recubiertas con PSMA por células U937 cebadas con IFN-y en presencia de 50 nM de compuesto 2. La tabla enumera el PSMA medido por pm cuadrado usando anticuerpo anti-PSMA marcado con ficoeritrina para 8,2 pmol/perla. PSMA calculado por pm cuadrado para 5,7 pmol/perla y 2,9 pmol/perla sobre la capacidad de carga en comparación con 8,2 pmol/perla. Medición de PSMA de células RM1.PGLS utilizando anticuerpo anti-PSMA de ficoeritrina. Fagocitosis de dianas realizada con células U937 cebadas y el compuesto 250 nM.
La figura 6 muestra la fagocitosis de perlas de 6 pm marcadas con PSMA por células U937 cebadas con IFN-y.
Comparación de la respuesta fagocítica inducida por diversas concentraciones del compuesto 1 o el compuesto 2.
La figura 7 muestra A) estructuras de diferentes ligandos que conectan los restos de unión de PSMA de urea que difieren en longitud e hidrofobicidad; B) muestra la fagocitosis de perlas de 6 pm marcadas con PSMA por células U937 cebadas con IFN-y. Comparación de la respuesta fagógica inducida por diversas concentraciones de SyAM que poseen un par de motivos de unión de PSMa unidos a CP33 con diversas longitudes y composiciones de enlazador.
La figura 8 muestra A) un fenómeno de prozona en el que el exceso de concentración provoca una reducción en la unión de SyAM-P del receptor Fc (incluso cuando SyAM-P con PSMA permanece intacto); B) muestra una superposición de datos ajustados al modelo complejo ternario analítico. Aumento de la eficacia y potencia consistente con un factor de aumento de 5 para dirigir la afinidad de SyAM-P1 a SyAM-P2. Aumento observado de la eficacia y la potencia consistente con un aumento de dos órdenes de magnitud de SyAM-2 a SyAM-P3. Aumento de SyAM-P3 debido a la mejora de una afinidad de unión más débil que tiene un efecto neto mayor en el modelo analítico.
La figura 9 muestra la fagocitosis de PSMA recubierta con perlas de 6 pm por células U937 cebadas con IFN-y en presencia de 50 nM de SyAM-P3. A) muestra la inhibición de la fagocitosis al aumentar las concentraciones (en nM) por IgG humana, inhibiendo la interacción de la molécula con el receptor Fc. B) muestra la inhibición de la fagocitosis al aumentar las concentraciones de 2-PMPA, inhibiendo la interacción entre la molécula y PSMA.
La figura 10 muestra A) el área bajo la curva (AUC) del ensayo de explosión de superóxido comparando /- perlas de PSMA+ diana en presencia de diversas concentraciones de SyAM-P3. Se observa poca o ninguna acumulación de superóxido en el tiempo de ensayo. B) muestra el tiempo máximo de producción de superóxido tomado (xmin) de nuevo con poca o ninguna detección de superóxido de fondo en presencia de SyAM-P3 en solitario.
La figura 11 muestra la fagocitosis de PSMA que expresa células RM1.PGLS por células U937 cebadas con IFN-Y en presencia de 6,25 nM de SyAM-P3. A) muestra la inhibición de la fagocitosis al aumentar las concentraciones (en nM) por IgG humana, inhibiendo la interacción de la molécula con el receptor Fc. B) muestra la inhibición de la fagocitosis al aumentar las concentraciones de 2-PMPA, inhibiendo la interacción entre la molécula y PSMA.
La figura 12 muestra la fagocitosis de células RM1.PGLS por células U937 cebadas con Fn-y en presencia de diversas concentraciones de compuesto 3 o ArmP8 con anticuerpo anti-DNP (133 nM). Fagocitosis restada del fondo de ninguna molécula. Las barras para el compuesto 3 evidencian fagocitosis a una concentración significativamente menor que para ArmP8.
La figura 13, Tabla 2 muestra la fagocitosis de Amnis: Los positivos dobles adjuntos se refieren a todos los eventos puntuados como ADCP en FACS tradicionales donde las dianas y los efectores se tiñen con dos colores diferentes. Todos los eventos enfocados recolectados por la citometría de flujo de imágenes de Amnis se clasificaron a continuación como "completados" (donde una diana está completamente engullida por un macrófago) o como "iniciados" (donde se había formado una copa fagocítica transparente entre el macrófago y la diana).
La figura 14 muestra varios restos de unión al receptor Fc que exhiben actividad como moduladores de FcyRI y pueden usarse como un grupo [IBT] de acuerdo con la presente invención. En la figura, cada uno de los compuestos se muestra con un enlace de unión a un hidroxilo libre (grupo OH) o amina (NH2).
La figura 15 proporciona un esquema para la síntesis química de SyAm-P1. Esta síntesis se analiza en el texto de la memoria descriptiva en la sección de síntesis química.
La figura 16 muestra el producto final SyAM-P1, sintetizado por el método presentado en la figura 15. Se observa que en aplicaciones de diagnóstico, el aminoácido lisina y la biotina unidos covalentemente al resto CP33 pueden reemplazarse fácilmente por cualquier número de aminoácidos que tienen cadenas laterales de aminoácidos no reactivas.
La figura 17 muestra la síntesis química de SyAM-P2 que contiene un grupo de biotina para aplicaciones de diagnóstico.
La figura 18 muestra la síntesis química (formación de urea) y la síntesis de enlazador para ciertas partes de SyAM-P3.
La figura 19 muestra la síntesis química de la segunda síntesis de enlazador para SyAM-P3 que contiene un grupo [MULTICON].
La figura 20 muestra la síntesis química para unir los grupos CBT al grupo [MULTICON] que contiene una azida para una modificación adicional para proporcionar SyAM-P3. Posteriormente se muestra que la azida reacciona con el compuesto acetilénico complejo que contiene dos grupos amina libres que están unidos al grupo triazol formado cuando el resto acetilénico reacciona con el resto azida para formar el intermedio complejo que se puede condensar con dos grupos CP33 para formar SyAM-P3.
La figura 21 muestra la introducción de un grupo enlazador diceto en el intermedio CP33-lisina (el grupo de ácido carboxílico de la lisina se ha protegido en los extremos con una amina para formar un grupo amida), estando el enlazador protegido en los extremos con grupos salientes de succinimida. El intermedio final, imágenes, contiene un grupo saliente de succinimida en el extremo de destilación del enlazador diceto que puede hacerse reaccionar con los dos grupos amina libres del intermedio de la figura 20 para proporcionar el producto final SyAM-P3 de la figura 22.
La figura 22 muestra el producto final SyAM-P3.
La figura 23 muestra una estrategia de enlazador alternativa para la síntesis de compuestos SyAm-P2. El esquema muestra la síntesis de SyAM-P2 usando enlazadores polipeptídicos de ácido aminohexanoico, enlazadores de polietilenglicol y enlazadores de polietilenglicol que se unen adicionalmente en enlazadores extendidos a través de un grupo amida.
La figura 24 muestra las etapas de síntesis química para SyAM-P2 utilizando enlazadores alternativos.
Objeto de la invención
Es un objeto de la invención proporcionar compuestos quiméricos bifuncionales y multifuncionales que se pueden usar para tratar prácticamente cualquier cáncer (incluido el cáncer metastásico), especialmente el cáncer de próstata y el cáncer de próstata metastásico.
Otro objeto de la invención es proporcionar compuestos que contienen un resto de unión celular que se une al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) de las células cancerosas, especialmente las células de cáncer de próstata y las células de cáncer de próstata metastásico y un resto de unión al receptor Fc que se une a los receptores Fc, en particular a los receptores FcyRI, y modula una respuesta humoral/de anticuerpos contra las células cancerosas a las que se unen los compuestos para causar la muerte de las células cancerosas y para tratar el cáncer.
Es un objeto adicional de la invención proporcionar compuestos quiméricos bifuncionales y multifuncionales que se pueden usar para proporcionar composiciones farmacéuticas, incluidas composiciones farmacéuticas que incluyen agentes bioactivos adicionales o agentes que ayudan en el tratamiento del cáncer, especialmente cáncer de próstata, incluyendo cáncer de próstata metastásico.
En la presente se divulgan métodos para tratar el cáncer, especialmente cáncer de próstata, incluido el cáncer de próstata metastásico utilizando compuestos quiméricos bifuncionales y multifuncionales de acuerdo con la presente invención que presentan una actividad anticancerosa inesperada y sinérgica.
En el presente documento se describen métodos para inhibir y/o reducir la probabilidad de metástasis de cáncer, incluyendo especialmente cáncer de próstata metastásico.
Estos y/u otros objetos de la invención pueden obtenerse fácilmente a partir de una revisión de la invención como se describe en el presente documento.
Breve descripción de la invención
En una realización, la invención proporciona compuestos bifuncionales o multifuncionales que se unen al antígeno de membrana específico de la próstata (PMSA) en células cancerosas y, por separado, a un receptor Fc, a menudo un receptor FcyRI a través del grupo [IBT]. A través de la modulación del receptor Fc (a menudo un receptor Fcy, más a menudo un receptor FcyRI), el compuesto, situado en la superficie de una célula cancerosa (a menudo una célula de cáncer de próstata y/o una célula cancerosa metastásica) estimula las células efectoras inmunes, aumentando así la señalización inmune y las respuestas fagocíticas y/o citotóxicas que actúan de manera sinérgica para ayudar a eliminar las células cancerosas del tejido, tratando así la enfermedad.
La presente invención se refiere a compuestos de acuerdo con la fórmula general:
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como se define en la reivindicación 1.
[CBT] es un resto de unión celular que se une al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) como se define en la reivindicación 1;
Li y L2 son grupos enlazadores (cuyos grupos pueden incluir uno o más grupos conectores bifuncionales [CON] como se define en la reivindicación 1; [MULTICON] es un grupo conector bifuncional o multifuncional (preferentemente, multifuncional) que, cuando está presente, conecta al menos un [IBT] al menos a un grupo [CBT] a través de un enlazador como se define en la reivindicación 1; MCON es un número entero de 0 a 10, a menudo de 1 a 10, más a menudo de 1 a 5, a menudo 0, 1 o 2;
n y n' son cada uno independientemente un número entero de 1 a 15, a menudo de 2 a 10, a menudo de 2 a 5, más a menudo 2 o 3, o 2, 3, 4, 5 o 6; NL1 y NL2 son cada uno un número entero de 0 a 10, a menudo de 1 a 10, a menudo de 2 a 5, más a menudo 2 o 3, con la condición de que n > NL1 y n' > NL2.
En otra realización, [IBT] es CP33 (véanse la figura 2 y la figura 14), que exhibe una excelente actividad como modulador de los receptores FCyRI y es particularmente eficaz para mejorar las células efectoras inmunes (por ejemplo, macrófagos y eosinófilos) para proporcionar un respuesta selectiva fagocítica y/o citotóxica, incluyendo la opsonización, de las células cancerosas, especialmente cáncer de próstata, dando como resultado la erradicación de las células cancerosas y, en consecuencia, del tejido canceroso. Además, se cree que los compuestos de acuerdo con la presente invención inducen inmunidad a largo plazo contra el tejido canceroso en el paciente, reduciendo así la probabilidad de una recidiva del cáncer en un paciente que ha visto una remisión del cáncer. Por lo tanto, los compuestos de acuerdo con la presente invención son compuestos para su uso en el tratamiento y prevención del cáncer y el cáncer metastásico, especialmente el cáncer de próstata y el cáncer de próstata metastásico. Los compuestos de acuerdo con la presente invención a menudo contendrán al menos un grupo [IBT] y al menos dos grupos [CBT], a menudo al menos dos grupos [IBT] y dos grupos [CBT] y a menudo dos o tres grupos [IBT] y dos o tres grupos [CBT].
En un aspecto adicional de la invención, una composición farmacéutica comprende una cantidad eficaz de un compuesto bifuncional/multifuncional como se ha descrito anteriormente, opcional y preferentemente en combinación con un vehículo, aditivo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En aspectos alternativos, las composiciones de combinación farmacéutica comprenden una cantidad eficaz de al menos un compuesto bifuncional/multifuncional como se describe en el presente documento, en combinación con al menos un agente adicional que se usa para tratar el cáncer, incluyendo cáncer de próstata, especialmente cáncer de próstata metastásico o una afección o efecto secundario del cáncer, especialmente cáncer de próstata (por ejemplo, dolor de huesos, hiperplasia, osteoporosis, etc., como se describe de otro modo en el presente documento).
En un aspecto adicional de la invención, los compuestos de acuerdo con la presente invención son compuestos para su uso en el tratamiento o la reducción de la probabilidad de cáncer, incluyendo cáncer metastásico en un paciente, especialmente cáncer de próstata en pacientes masculinos que lo necesitan, y para reducir la probabilidad de que un cáncer, especialmente cáncer de próstata, haga metástasis, o que un cáncer en remisión reaparecerá. El método de tratamiento del cáncer descrito en el presente documento comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un compuesto quimérico trifuncional como se describe de otro modo en el presente documento en combinación con un vehículo, aditivo o excipiente farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en combinación adicional con al menos un agente adicional que es eficaz en el tratamiento del cáncer, especialmente incluyendo cáncer de próstata, cáncer metastásico, o una o más de sus afecciones o efectos secundarios.
Un método para inhibir el cáncer de próstata para reducir o inhibir la propagación o metástasis del cáncer a otros tejidos del cuerpo del paciente, especialmente incluyendo huesos, sistema linfático (ganglios linfáticos), vejiga, conductos deferentes, riñones, hígado, pulmones y cerebro, entre otros, se divulga en el presente documento.
La presente invención también se refiere a casos en los que la destrucción de células no cancerosas que poseen PSMA puede ser de uso terapéutico, especialmente en la terapia contra el cáncer. Por ejemplo, dado que el PSMA se encuentra en la neovasculatura de muchas células cancerosas no prostáticas, pero no en la vasculatura normal, el compuesto de acuerdo con la invención podría usarse para su uso en terapia antiangiogénica para otras formas de cáncer dirigiéndose a la neovasculatura de estos cánceres e inhibiendo el crecimiento y la propagación del cáncer.
Descripción detallada de la invención
Los siguientes términos se utilizan para describir la presente invención. En los casos en los que un término no se define específicamente en el presente documento, los expertos en la técnica le dan un significado reconocido en la técnica al aplicar ese término en el contexto de su uso para describir la presente invención.
El término "compuesto", como se usa en el presente documento, salvo que se indique lo contrario, se refiere a cualquier compuesto químico específico, preferentemente los SyAM divulgados en el presente documento, e incluye tautómeros, regioisómeros, isómeros geométricos, y cuando sea aplicable, isómeros ópticos (enantiómeros) de los mismos, así como sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Dentro de su uso en el contexto, el término compuesto se refiere, en general, a un solo compuesto, pero también puede incluir otros compuestos tales como estereoisómeros, regioisómeros y/o isómeros ópticos (incluyendo mezclas racémicas), así como enantiómeros específicos o mezclas enantioméricamente enriquecidas de compuestos divulgados. El término también se refiere, en el contexto, a formas de profármacos de compuestos que han sido modificadas para facilitar la administración y el suministro de compuestos en un sitio de actividad. Se observa que al describir los presentes compuestos, se describen numerosos sustituyentes, enlazadores y moléculas conectoras y variables asociadas con los mismos, entre otros. Los expertos en la técnica entenderán que las moléculas que se describen en el presente documento son compuestos estables como se describe generalmente a continuación.
El término "paciente" o "sujeto" se usa en toda la memoria descriptiva dentro del contexto para describir un animal, en general, un mamífero, y preferentemente un ser humano, a quien se trata, incluyendo el tratamiento profiláctico (profilaxis), con las composiciones de acuerdo con la presente invención que se proporciona. Para el tratamiento de aquellas infecciones, afecciones o patologías que son específicas de un animal específico, tal como un paciente humano o un paciente de un género particular, tal como un paciente humano masculino, el término paciente se refiere a ese animal específico. Los compuestos de acuerdo con la presente invención son útiles para el tratamiento del cáncer, incluyendo especialmente el cáncer de próstata y, en particular, el cáncer de próstata metastásico.
El término "eficaz" se usa en el presente documento, salvo que se indique lo contrario, para describir una cantidad de un compuesto o composición (uno o más SyAM en solitario o en combinación) que, en el contexto, se usa para producir o efectuar un resultado deseado, si ese resultado se refiere a la inhibición del cáncer o el tratamiento de un sujeto para afecciones secundarias, patologías o manifestaciones de cáncer como se describe de otra manera en el presente documento. Este término subsume a todas las demás expresiones de cantidad eficaz o concentración eficaz (incluyendo la expresión "terapéuticamente eficaz") que se describen de otro modo en la presente solicitud.
Los términos "tratar", "tratando" y "tratamiento", etc., como se usan en el presente documento, se refieren a cualquier acción que proporcione un beneficio a un paciente con riesgo de cáncer, especialmente cáncer de próstata o metástasis de cáncer de próstata, incluyendo mejora de la afección a través de la disminución o supresión de al menos un síntoma, inhibición del crecimiento del cáncer, reducción de las células o tejidos cancerosos, prevención o retraso en la progresión de la metástasis del cáncer, prevención o retraso en la aparición de patologías o afecciones que se producen secundariamente a un cáncer o remisión o curación del cáncer, entre otros. El tratamiento, como se usa en el presente documento, abarca tanto el tratamiento profiláctico como el terapéutico. El término "profiláctico", cuando se usa, significa reducir la probabilidad de una aparición o la gravedad de una aparición dentro del contexto del tratamiento del cáncer, incluyendo la metástasis del cáncer, como se ha descrito anteriormente de otro modo.
El término "neoplasia" se refiere a la multiplicación descontrolada y progresiva de células tumorales, en condiciones que no provocarían, o provocarían, el cese de la multiplicación de células normales. La neoplasia da como resultado una "neoplasia", que se define en el presente documento como cualquier crecimiento nuevo y anormal, particularmente un nuevo crecimiento de tejido, en el que el crecimiento de las células es descontrolado y progresivo. Por lo tanto, la neoplasia incluye "cáncer", que en el presente documento se refiere a una proliferación de células tumorales que tienen el rasgo único de pérdida de controles normales, lo que da como resultado un crecimiento no regulado, falta de diferenciación, invasión tisular local, y/o metástasis.
Como se usa en el presente documento, las neoplasias incluyen, sin limitación, irregularidades morfológicas en las células en tejido de un sujeto o huésped, así como proliferación patológica de células en tejido de un sujeto, en comparación con la proliferación normal en el mismo tipo de tejido. Además, las neoplasias incluyen tumores benignos y tumores malignos (por ejemplo, tumores de colon) que son invasivos o no invasivos. Las neoplasias malignas se distinguen de las neoplasias benignas en que las primeras muestran un mayor grado de anaplasia, o pérdida de diferenciación y orientación de las células, y tienen propiedades de invasión y metástasis. Los ejemplos de neoplasias de las que se puede derivar la célula diana de la presente invención incluyen, sin limitación, carcinomas (por ejemplo, carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas, carcinomas hepatocelulares, y carcinomas de células renales), particularmente los de vejiga, intestino, mama, cuello del útero, colon, esófago, cabeza, riñón, hígado, pulmón, cuello, ovario, páncreas, próstata y estómago; leucemias; linternas benignos y malignos, particularmente, linterna de Burkitt y linterna no Hodgkin; melanomas benignos y malignos; enfermedades mieloproliferativas; sarcomas, particularmente sarcoma de Ewing, hemangiosarcoma, sarcoma de Kaposi, liposarcoma, miosarcomas, neuroepitelioma periférico, y sarcoma sinovial; tumores del sistema nervioso central (por ejemplo, gliomas, astrocitomas, oligodendrogliomas, ependimomas, gliobastomas, neuroblastomas, ganglioneuromas, gangliogliomas, meduloblastomas, tumores de células pineales, meningiomas, sarcomas meníngeos, neurofibromas, y Schwannomas); tumores de la línea germinal (por ejemplo, cáncer de intestino, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de cuello del útero, cáncer de útero, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer testicular, cáncer de tiroides, astrocitoma, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de colon, y melanoma); tipos mixtos de neoplasias, particularmente carcinosarcoma y enfermedad de Hodgkin; y tumores de origen mixto, tal como tumor de Wilms y teratocarcinomas, que pueden tratarse con uno o más compuestos de acuerdo con la presente invención. Véase, (Beers y Berkow (eds.), The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17a ed. (Whitehouse Station, N.J.: Merck Research Laboratories, 1999) 973-74, 976, 986, 988, 991.
Debido a la actividad de los presentes compuestos como compuestos antiangiogénicos, la presente invención tiene aplicabilidad general para su uso en el tratamiento de prácticamente cualquier cáncer en cualquier tejido, por lo tanto, los compuestos, las composiciones de la presente invención son generalmente aplicables al tratamiento de cáncer. Dado que la proteína diana se encuentra en la neovasculatura de la mayoría de las células cancerosas no prostáticas, los compuestos de la presente invención también pueden servir como terapia antiangiogénica para otros tipos de cáncer. Muy a menudo, los compuestos reivindicados son compuestos para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata y el cáncer de próstata metastásico, así como para reducir la probabilidad de que el cáncer de próstata no metastatice.
En ciertos aspectos particulares, el cáncer que se trata es cáncer de próstata o cáncer de próstata metastásico. Por separado, el cáncer de próstata metastásico se puede encontrar en prácticamente todos los tejidos de un paciente con cáncer en los últimos estadios de la enfermedad, típicamente el cáncer de próstata metastásico se encuentra en vesículas seminales, sistema linfático/ganglios (linfoma), en los huesos, en el tejido de la vejiga, en el tejido renal, el tejido hepático y prácticamente en cualquier tejido, incluido el cerebro (cáncer/tumor cerebral). Por lo tanto, la presente invención es generalmente aplicable y puede usarse para tratar cualquier cáncer en cualquier tejido, independientemente de la etiología.
El término "tumor" se usa para describir un crecimiento maligno o benigno o tumefacente.
El término "cáncer de próstata" se usa para describir una enfermedad en la que se desarrolla cáncer en la próstata, una glándula del sistema reproductor masculino. Se produce cuando las células de la próstata mutan y comienzan a multiplicarse incontrolablemente. Estas células pueden hacer metástasis (cáncer de próstata metastásico) desde la próstata a prácticamente cualquier otra parte del cuerpo, particularmente los huesos y los ganglios linfáticos, pero el riñón, la vejiga e incluso el cerebro, entre otros tejidos. El cáncer de próstata puede causar dolor, dificultad para orinar, problemas durante las relaciones sexuales, disfunción eréctil. Otros síntomas pueden desarrollarse potencialmente durante los estadios posteriores de la enfermedad.
Las tasas de detección de cánceres de próstata varían ampliamente en todo el mundo, y el sur y el este de Asia se detectan con menos frecuencia que en Europa, y especialmente en los Estados Unidos. El cáncer de próstata se desarrolla con mayor frecuencia en hombres mayores de cincuenta años y es uno de los tipos de cáncer más prevalentes en los hombres. Sin embargo, muchos hombres que desarrollan cáncer de próstata nunca presentan síntomas, no se someten a ninguna terapia y, finalmente, mueren por otras causas. Esto se debe a que el cáncer de próstata es, en la mayoría de los casos, de crecimiento lento, y a que la mayoría de los afectados son mayores de 60 años. Por lo tanto, a menudo mueren por causas no relacionadas con el cáncer de próstata. Muchos factores, incluidos la genética y la dieta, se han relacionado con el desarrollo del cáncer de próstata. La presencia de cáncer de próstata puede estar indicada por síntomas, examen físico, antígeno específico de la próstata (PSA), o biopsia. Existe preocupación por la precisión de la prueba de PSA y su utilidad en la detección. La sospecha de cáncer de próstata típicamente se confirma tomando una biopsia de la próstata y examinándola con un microscopio. Se pueden realizar más pruebas, tales como tomografías computarizadas y gammagrafías óseas, para determinar si el cáncer de próstata se ha diseminado.
Las opciones de tratamiento para el cáncer de próstata con intención de curar son principalmente cirugía y radioterapia. También existen otros tratamientos tales como terapia hormonal, quimioterapia, terapia con protones, criocirugía, ultrasonidos focalizados de alta intensidad (HIFU) dependiendo del escenario clínico y el resultado deseado. La presente invención puede usarse para mejorar una o más de estas terapias o para reemplazarlas.
La edad y la salud subyacente del hombre, la extensión de la metástasis, la apariencia bajo el microscopio, y la respuesta del cáncer al tratamiento inicial son importantes para determinar el resultado de la enfermedad. La decisión de tratar o no el cáncer de próstata localizado (un tumor que está contenido en la próstata) con intención curativa es una decisión del paciente entre los efectos beneficiosos y perjudiciales esperados en términos de supervivencia y calidad de vida del paciente.
Una parte importante de la evaluación del cáncer de próstata es determinar el estadio o hasta dónde se ha diseminado el cáncer. Conocer el estadio ayuda a definir el pronóstico y es útil a la hora de seleccionar terapias. El sistema más común es el sistema TNM de cuatro etapas (abreviado de Tumor/Nodos/Metástasis). Sus componentes incluyen el tamaño del tumor, el número de ganglios linfáticos afectados, y la presencia de cualquier otra metástasis.
La distinción más importante que hace cualquier sistema de estadificación es si el cáncer todavía está confinado a la próstata o si es metastásico. En el sistema TNM, los cánceres clínicos T1 y T2 se encuentran solo en la próstata, mientras que los cánceres T3 y T4 se han diseminado a otras partes y han hecho metástasis en otros tejidos. Se pueden usar varias pruebas para buscar evidencia de propagación. Estos incluyen tomografía computarizada para evaluar la diseminación dentro de la pelvis, gammagrafías óseas para buscar diseminación a los huesos, e imágenes de resonancia magnética de bobina endorrectal para evaluar de cerca la cápsula prostática y las vesículas seminales. Las gammagrafías óseas a menudo revelan un aspecto osteoblástico debido al aumento de la densidad ósea en las áreas de metástasis ósea, al contrario de lo que se encuentra en muchos otros cánceres que hacen metástasis. La tomografía computarizada (TC) y la resonancia magnética (RM) actualmente no aportan información significativa en la evaluación de posibles metástasis ganglionares en pacientes con cáncer de próstata según un metaanálisis.
El cáncer de próstata es relativamente fácil de tratar si se detecta temprano. Después de una biopsia de próstata, un patólogo examina las muestras con un microscopio. Si hay cáncer, el patólogo informa el grado del tumor. El grado indica cuánto difiere el tejido tumoral del tejido prostático normal y sugiere qué tan rápido es probable que crezca el tumor. El sistema de Gleason se utiliza para clasificar los tumores de próstata de 2 a 10, donde una puntuación de Gleason de 10 indica la mayoría de las anomalías. El patólogo asigna un número del 1 al 5 para el patrón más común observado bajo el microscopio, a continuación hace lo mismo para el segundo patrón más común. La suma de estos dos números es la puntuación de Gleason. La estadificación de Whitmore-Jewett es otro método que se utiliza a veces. La clasificación adecuada del tumor es fundamental, ya que el grado del tumor es uno de los principales factores que se utilizan para determinar la recomendación de tratamiento.
El cáncer de próstata temprano no suele causar síntomas. A menudo, se diagnostica durante la evaluación para detectar un PSA elevado observado durante una revisión de rutina. A veces, sin embargo, el cáncer de próstata causa síntomas, a menudo similares a los de enfermedades tales como la hipertrofia prostática benigna. Estos incluyen micción frecuente, aumento de la micción por la noche, dificultad para iniciar y mantener un flujo constante de orina, sangre en la orina, y dolor al orinar. El cáncer de próstata se asocia con disfunción urinaria, ya que la glándula prostática rodea la uretra prostática. Por lo tanto, los cambios dentro de la glándula afectan directamente a la función urinaria. Debido a que los conductos deferentes depositan líquido seminal en la uretra prostática y las secreciones de la propia glándula prostática se incluyen en el contenido del semen, el cáncer de próstata también puede causar problemas con la función y el rendimiento sexual, tal como dificultad para lograr la erección o eyaculación dolorosa.
El cáncer de próstata avanzado puede extenderse a otras partes del cuerpo y esto puede causar síntomas adicionales. El síntoma más común es el dolor de huesos, a menudo en las vértebras (huesos de la columna vertebral), la pelvis o las costillas. La diseminación del cáncer a otros huesos, tales como el fémur, suele ocurrir en la parte proximal del hueso. El cáncer de próstata en la columna también puede comprimir la médula espinal, causando debilidad en las piernas e incontinencia urinaria y fecal.
Se desconocen las causas específicas del cáncer de próstata. El riesgo de un hombre de desarrollar cáncer de próstata está relacionado con su edad, genética, raza, dieta, estilo de vida, medicación, y otros factores. El principal factor de riesgo es la edad. El cáncer de próstata es poco común en hombres menores de 45 años, pero se vuelve más común con la edad. La edad promedio en el momento del diagnóstico es de 70 años. Sin embargo, Sin embargo, muchos hombres nunca saben que tienen cáncer de próstata.
Los antecedentes genéticos de un hombre contribuyen a su riesgo de desarrollar cáncer de próstata. Esto se sugiere por una mayor incidencia de cáncer de próstata que se encuentra en ciertos grupos raciales, en gemelos idénticos de hombres con cáncer de próstata, y en hombres con ciertos genes. Los hombres que tienen un hermano o un padre con cáncer de próstata tienen el doble de riesgo habitual de desarrollar cáncer de próstata. Los estudios de gemelos en Escandinavia sugieren que el cuarenta por ciento del riesgo de cáncer de próstata puede explicarse por factores hereditarios. Sin embargo, ningún gen es responsable del cáncer de próstata; se han visto implicados muchos genes diferentes. Dos genes (BRCA1 y BRCA2) que son factores de riesgo importantes para el cáncer de ovario y el cáncer de mama en las mujeres también se han relacionado con el cáncer de próstata.
Las cantidades dietéticas de ciertos alimentos, vitaminas y minerales pueden contribuir al riesgo de cáncer de próstata. Los factores dietéticos que pueden aumentar el riesgo de cáncer de próstata incluyen una baja ingesta de vitamina E, el mineral selenio, el té verde y la vitamina D. Un gran estudio ha implicado a los lácteos, específicamente a la leche baja en grasa y a otros productos lácteos a los que se ha añadido palmitato de vitamina A. Esta forma de vitamina A sintética se ha vinculado con el cáncer de próstata porque reacciona con el cinc y las proteínas para formar un complejo no absorbible. El cáncer de próstata también se ha vinculado con la inclusión de la hormona somatotropina bovina en ciertos productos lácteos.
También existen algunos vínculos entre el cáncer de próstata y los medicamentos, los procedimientos médicos y las afecciones médicas. El uso diario de medicamentos antiinflamatorios tales como aspirina, ibuprofeno o naproxeno, puede disminuir el riesgo de cáncer de próstata. El uso de medicamentos para reducir el colesterol conocidos como estatinas también puede disminuir el riesgo de cáncer de próstata. La infección o inflamación de la próstata (prostatitis) puede aumentar la posibilidad de cáncer de próstata, y la infección por infecciones de transmisión sexual por clamidia, gonorrea o sífilis, parece aumentar el riesgo. La obesidad y los niveles sanguíneos elevados de testosterona pueden aumentar el riesgo de cáncer de próstata.
El cáncer de próstata se clasifica como un adenocarcinoma, o cáncer glandular, que comienza cuando las células de la glándula prostática que secretan semen normales mutan en células cancerosas. La región de la glándula prostática donde el adenocarcinoma es más común es la zona periférica. Inicialmente, pequeños grupos de células cancerosas permanecen confinados en las glándulas prostáticas de otro modo normales, una condición conocida como carcinoma in situ o neoplasia intraepitelial prostática (PIN). Aunque no hay pruebas de que la PIN sea un precursor del cáncer, está estrechamente asociada con el cáncer. Con el tiempo, estas células cancerosas comienzan a multiplicarse y diseminarse al tejido prostático circundante (el estroma) formando un tumor. Con el tiempo, el tumor puede crecer lo suficiente como para invadir órganos cercanos tales como las vesículas seminales o el recto, o las células tumorales pueden desarrollar la capacidad de viajar por el torrente sanguíneo y el sistema linfático. El cáncer de próstata se considera un tumor maligno porque es una masa de células que puede invadir otras partes del cuerpo. Esta invasión de otros órganos se llama metástasis. El cáncer de próstata suele hacer metástasis en los huesos, los ganglios linfáticos, el recto y la vejiga.
En el cáncer de próstata, las glándulas normales de la próstata normal se reemplazan por glándulas irregulares y grupos de células. Cuando un hombre tiene síntomas de cáncer de próstata, o una prueba de detección indica un mayor riesgo de cáncer, se ofrece una evaluación más invasiva. La única prueba que puede confirmar completamente el diagnóstico de cáncer de próstata es una biopsia, la extracción de pequeños trozos de próstata para un examen microscópico. Sin embargo, antes de una biopsia, se pueden usar varias herramientas diferentes para recopilar más información sobre la próstata y el tracto urinario. La cistoscopia muestra el tracto urinario desde el interior de la vejiga, utilizando un tubo de cámara delgado y flexible que se inserta por la uretra. La ultrasonografía transrectal crea una imagen de la próstata utilizando ondas sonoras a partir de una sonda en el recto.
Después de la biopsia, las muestras de tejido se examinan a continuación al microscopio para determinar si hay células cancerosas y evaluar las características microscópicas (o puntuación de Gleason) de cualquier cáncer encontrado. Además, las muestras de tejido pueden teñirse para detectar la presencia de PSA y otros marcadores tumorales con el fin de determinar el origen de las células neoplásicas que han hecho metástasis. Están en curso varios enfoques potenciales diferentes para el diagnóstico del cáncer de próstata, tal como el antígeno 2 del cáncer de próstata temprano (EPCA-2) y el análisis del prostasoma.
Además de la terapia que utiliza los compuestos de acuerdo con la presente invención, la terapia (incluida la terapia profiláctica) para el cáncer de próstata apoya funciones en la reducción del cáncer de próstata para el selenio dietético, vitamina E, licopeno, alimentos de soja, vitamina D, té verde, ácidos grasos omega 3, y fitoestrógenos. El fármaco modulador selectivo del receptor de estrógeno toremifeno se ha mostrado prometedor en los primeros ensayos. Dos medicamentos que bloquean la conversión de testosterona en dihidrotestosterona (y reducen la tendencia al crecimiento celular), finasterida y dutasterida, han demostrado ser útiles. Los fitoquímicos indol-3-carbinol y diindolilmetano, que se encuentran en las verduras crucíferas (coliflor y brócoli), tienen propiedades antiandrogénicas e inmunomoduladoras favorables. El riesgo de cáncer de próstata se reduce con una dieta vegetariana.
El tratamiento para el cáncer de próstata puede implicar vigilancia activa, cirugía (prostatectomía u orquiectomía), radioterapia, incluyendo braquiterapia (braquiterapia de próstata) y radiación con haz externo, así como terapia hormonal. Hay varias formas de terapia hormonal que incluyen las siguientes, cada una de las cuales puede combinarse con compuestos de acuerdo con la presente invención.
• Antiandrógenos tales como flutamida, bicalutamida, nilutamida y acetato de ciproterona, que bloquean directamente las acciones de la testosterona y la DHT dentro de las células del cáncer de próstata.
• Medicamentos tales como ketoconazol y aminoglutetimida, que bloquean la producción de andrógenos suprarrenales tal como DHEA. Estos medicamentos generalmente se usan solo en combinación con otros métodos que pueden bloquear el 95 % de los andrógenos producidos por los testículos. Estos métodos combinados se denominan bloqueo total de andrógenos (TAB), lo que también se puede lograr utilizando antiandrógenos.
• Moduladores de GnRH, incluidos agonistas y antagonistas. Los antagonistas de GnRH suprimen la producción de LH directamente, mientras que los agonistas de GnRH suprimen la LH a través del proceso de regulación negativa después de un efecto de estimulación inicial. Abarelix es un ejemplo de un antagonista de GnRH, mientras que los agonistas de GnRH incluyen leuprolida, goserelina, triptorelina y buserelina.
• El uso de acetato de abiraterona se puede utilizar para reducir los niveles de PSA y el tamaño de los tumores en el cáncer de próstata agresivo en estadio terminal hasta en un 70 % de los pacientes. También se puede usar sorafenib para tratar el cáncer de próstata metastásico.
Cada tratamiento descrito anteriormente tiene desventajas que limitan su uso en determinadas circunstancias. Los agonistas de GnRH eventualmente causan los mismos efectos secundarios que la orquiectomía, pero pueden causar síntomas peores al comienzo del tratamiento. Cuando se usan los agonistas de GnRH por primera vez, los aumentos repentinos de testosterona pueden provocar un aumento del dolor óseo debido al cáncer metastásico, por lo que a menudo se añaden antiandrógenos o abarelix para mitigar estos efectos secundarios. Los estrógenos no se usan comúnmente porque aumentan el riesgo de enfermedad cardiovascular y coágulos de sangre. Los antiandrógenos generalmente no causan impotencia y generalmente causan menos pérdida de masa ósea y muscular. El ketoconazol puede causar daño hepático con el uso prolongado, y la aminoglutetimida puede causar erupciones cutáneas.
Los cuidados paliativos para el cáncer de próstata en estadio avanzado se centran en prolongar la vida y aliviar los síntomas de la enfermedad metastásica. Como se señaló anteriormente, el acetato de abiraterona parece prometedor en el tratamiento del cáncer de próstata en etapa avanzada, al igual que el sorafenib. Se puede ofrecer quimioterapia para retrasar la progresión de la enfermedad y posponer los síntomas. El régimen más utilizado combina el fármaco quimioterapéutico docetaxel con un corticosteroide, tal como prednisona. Se ha demostrado que los bisfosfonatos, tal como ácido zoledrónico, retrasan las complicaciones esqueléticas tales como las fracturas o la necesidad de radioterapia en pacientes con cáncer de próstata metastásico refractario a hormonas. Puede usarse alfaradina para dirigirse a la metástasis ósea. La prueba de fase II muestra tiempos de supervivencia prolongados del paciente, reducción del dolor, y mejora de la calidad de vida.
El dolor óseo debido a una enfermedad metastásica se trata con analgésicos opioides tales como morfina y oxicodona. La radioterapia con haz externo dirigida a las metástasis óseas puede aliviar el dolor. Las inyecciones de ciertos radioisótopos, tales como estroncio-89, fósforo-32, o samario-153, también se dirigen a las metástasis óseas y pueden ayudar a aliviar el dolor.
Como alternativa a la vigilancia activa o los tratamientos definitivos, también se pueden usar terapias alternativas para la gestión del cáncer de próstata. Se ha demostrado que el PSA se reduce en hombres con cáncer de próstata aparentemente localizado mediante una dieta vegana (se permite pescado), ejercicio regular y reducción del estrés. Se ha demostrado que muchos otros agentes únicos reducen el PSA, retardan los tiempos de duplicación del PSA, o tienen efectos similares sobre marcadores secundarios en hombres con cáncer localizado en ensayos a corto plazo, tal como el zumo de granada o la genisteína, una isoflavona que se encuentra en diversas legumbres.
Las manifestaciones o afecciones secundarias o efectos del cáncer de próstata metastásico y avanzado pueden incluir anemia, supresión de la médula ósea, pérdida de peso, fracturas patológicas, compresión de la médula espinal, dolor, hematuria, obstrucción ureteral y/o de salida de la vejiga, retención urinaria, insuficiencia renal crónica, incontinencia urinaria, y síntomas relacionados con metástasis óseas o de tejidos blandos, entre otros.
Los fármacos para la próstata adicionales que pueden usarse en combinación con los compuestos de reclutamiento de anticuerpos quiméricos de acuerdo con la presente invención incluyen, por ejemplo, los fármacos/agentes para la próstata agrandada, así como eulexina, flutamida, goserelina, leuprolida, lupron, nilandron, nilutamida, zoladex, y mezclas de los mismos. Fármacos/agentes para la próstata agrandada como los anteriores, incluyen, por ejemplo, ambenilo, ambofén, amgenal, atrosept, bromanilo, bromodifenhidramina-codeína, bromotuss-codeína, cardura, clorfeniramina-hidrocodona, ciclopirox, clotrimazol-betametasona, dolsed, dutasterida, finasterida, flomax, gecilo, hexalol, lamisil, lanased, loprox, lotrisona, metanamina, meten-bella-met Bl-fen sal, met-hios-atrp-M blue-BA-f-sal, MHP-A, mibanil, prosed/DS, Ro-Sed, S-T Forte, tamsulosina, terbinafina, trac, tussionex, ty-metato, uramina, uratin, uretrón, uridón, uro-ves, urstat, usept, y mezclas de los mismos.
El término "resto terminal de unión inmunitaria", "extremo de unión inmunitaria", o [IBT], se usa para describir la porción de un compuesto quimérico de acuerdo con la presente invención que comprende una molécula que se une al receptor FcyRI en una célula efectora inmune (macrófago, neutrófilo, eosinófilo, célula dendrítica, etc.), y facilita la opsonización, fagocitosis, citotoxicidad y muerte de las células cancerosas. Un resto de unión de FcRI preferido para su uso en la presente invención es CP33, que se presenta en la figura 2 adjunta.
Los grupos [IBT] representativos para su uso en la presente invención son los que aparecen en la figura 14 adjunta. Cada uno de estos compuestos puede usarse para modular los receptores FcyRI que interactúan con las células efectoras inmunes (macrófagos, eosinófilos, neutrófilos) para inducir la aparición de fagocitosis y otra actividad de estas células efectoras contra las células cancerosas como se describe de otro modo en el presente documento. Además, estos compuestos también pueden proporcionar la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria a largo plazo a las células cancerosas en un paciente, reduciendo así la probabilidad de una recidiva después de la remisión del cáncer.
Los grupos [IBT] representativos incluyen, por ejemplo, CP33 (un IBT preferido), YU158145 (4861-0063), YU160469 (7165-0402), YU160642 (7527-0236), YU160645 (7527-0311), YU160647 (7527-0320), YU164313 (D086-0504), YU164340 (D089-0267), YU164343 (D089-0287), YU164367 (D089-0353), YU163512 (C766-0140), YU163538 (C766-0571), YU163540 (C766-0578), YU163511 (C766-0135), YU163552 (C798-0145), YU163554 (C798-0169), YU160794 (7889-2431), YU163387 (C720-0562), YU163388 (C720-0563), YU162384 (C218-0192), YU162389 (C218-0271), YU162392 (C218-0284), YU162393 (C218-0288), YU162402 (C218-0460), YU162408 (C218-0524), YU165568 (D420-6099), P680-0123 (YU170286:01), YU165561 (D420-5349), YU165531 (D420-4922), YU165550 (D420-5220), YU169577 (M050-0297), YU162636 (C291-0121), YU163100 (C611-0416), YU163102 (C611-0421), YU162257 (C200-0357), YU169182 (K891-0143), YU169197 (K891-0201), YU162415 (C218-0870), YU162417 (C218-0879), YU162413 (C218-0864), YU162414 (C218-0868) y YU162730 (C301-9341), que se modifican en un hidroxilo libre o amina libre para unirse a otros componentes de los compuestos de acuerdo con la presente invención. Cada uno de estos compuestos inmunomoduladores se presenta como una estructura química en la figura 14 con la unión indicada en un hidroxilo libre o amina libre del compuesto. La unión de cada una de estas moléculas a un enlazador y el resto de las moléculas de acuerdo con la presente invención es sobre un hidroxilo libre o una amina libre, como se representa en la figura 14 (enlace que cruza otro enlace en O o N en cada compuesto, en consecuencia). El [IBT] más utilizado en la presente invención es CP33, porque ha mostrado una mayor actividad como modulador de FcyRI. CP33 también se representa en la figura 14.
El término "resto terminal de unión celular", "extremo de unión celular", o "resto de unión celular" se utilizan para describir la porción de un compuesto quimérico de acuerdo con la presente invención que comprende al menos una molécula pequeña o resto que puede unirse específicamente al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA).
Los grupos CBT para su uso en la presente invención se exponen a continuación:
Figure imgf000012_0001
en los que X1 y X2 son cada uno independientemente CH2 , O, NH o S;
X3 es O, CH2 , NR1, S(O), S(O)2 , -S(O)2O, -OS(O)2 , u OS(O)2O;
R1 es H, un grupo alquilo C1-C3 , o un grupo -C(O)(C1-C3);
k es un número entero de 0 a 20, de 8 a 12, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
o una sal o enantiómero de los mismos.
Un grupo CBT preferido para su uso en la presente invención es el grupo
Figure imgf000012_0002
en el que k es 2, 3 o 4, preferentemente, 3. Este grupos CBT, así como los demás, tiene opcionalmente un grupo amina u otro grupo funcional en el extremo de destilación del grupo alquileno (k) de manera que k se forma a partir de, por ejemplo, un aminoácido lisina, de modo que el grupo amina u otro grupo funcional puede participar en reacciones adicionales para formar un enlazador, un triazol u otro grupo conector difuncional [CON] o un grupo multifuncional [MULTICON] como se describe de otro modo en el presente documento.
El término "enlazador" se refiere a una entidad química que conecta el resto terminal de unión celular [CBT] o el extremo de unión inmunitaria (receptor Fc) [IBT] al resto/molécula conectora difuncional [CON] y/o el resto/molécula conectora multifuncional [MULTICON]. Se observa que cada enlazador puede estar conectado a [MULTICON] a través de una molécula conectora difuncional opcional [CON} como se divulga aquí de otro modo. El enlazador no es lábil y también puede estar compuesto por uno o más grupos enlazadores para proporcionar enlazadores extendidos como se divulga de otro modo en el presente documento. Cada enlazador puede unirse directamente a un grupo [CBT] o [IBT] especialmente entre el resto [ABT] y la molécula conectora multifuncional [MULTICON] y el resto [CBT] y la molécula conectora multifuncional [MULTICON]. En ciertos casos, el grupo CBT puede estar unido directamente a un grupo conector difuncional [CON] que además está unido a un grupo enlazador y, opcionalmente, un grupo [MULTICON]. El enlazador entre las dos porciones funcionales activas de la molécula, es decir, el extremo de unión inmunitaria [IBT] y el extremo de unión celular [CBT] varía de aproximadamente 5 A a aproximadamente 50 A o más de longitud, de aproximadamente 6 A a aproximadamente 45 A de longitud, de aproximadamente 7 A a aproximadamente 40 A de longitud, de aproximadamente 8 A a aproximadamente 35 A de longitud, de aproximadamente 9 A a aproximadamente 30 A de longitud, de aproximadamente 10 A a aproximadamente 25 A de longitud, de aproximadamente 7 A a aproximadamente 20 A de longitud, de aproximadamente 5 A a aproximadamente 16 A de longitud, de aproximadamente 5 A a aproximadamente 15 A de longitud, de aproximadamente 6 A a aproximadamente 14 A de longitud, de aproximadamente 10 A a aproximadamente 20 A de longitud, de aproximadamente 11 A a aproximadamente 25 A de longitud, etc. Se usan a menudo enlazadores que se basan en aminoácidos no naturales (es decir, que tienen un grupo alquileno con entre 3 y 6, preferentemente 4 o 5 grupos metileno entre la amina y el ácido de la unidad monomérica de aminoácidos) como se describe de otro modo en el presente documento. Al tener un enlazador con una longitud como se describe de otro modo en el presente documento, el uno o más restos [IBT] y el uno o más restos [CBT] pueden situarse para aprovechar la actividad biológica de los compuestos de acuerdo con la presente invención que se unen al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) a través del grupo [CBT] y modular los receptores Fc, en particular, los receptores FcyRI en las moléculas efectoras inmunes a través del grupo [IBT] que funcionan sinérgicamente con la unidad del grupo [CBT] para mejorar la capacidad del compuesto para modular la lisis tumoral (por ejemplo, fagocitosis) por las células efectoras inmunes, y estimular y promover mejor la memoria inmunológica a la que se unen los compuestos. Esto da como resultado la muerte celular selectiva y dirigida (sinérgica) de las células cancerosas, incluidas las células cancerosas metastásicas, en particular, las células de cáncer de próstata, y las células de cáncer de próstata metastásico, en cualquier tejido en el que residan. La selección de un componente enlazador se basa en sus propiedades documentadas de biocompatibilidad, solubilidad en medios acuosos y orgánicos, y baja inmunogenicidad/antigenicidad.
Se prefieren para su uso en la presente invención los enlazadores que se basan en, o incluyen unidades de oligoaminoácidos. Se pueden preferir estos enlazadores que tienen entre 4 y 8 unidades de aminoácidos de longitud. En aspectos preferidos, cada unidad de aminoácido es una unidad de aminoácido no natural, como se describe de otro modo en el presente documento, que tiene preferentemente entre 3 y 6 grupos metileno en cada unidad monomérica de aminoácidos. Cada enlazador puede estar enlazado con la molécula conectora multifuncional [MULTICON] a través de una o más moléculas conectoras difuncionales [CON] como se describe de otro modo en el presente documento.
Aunque se pueden usar numerosos enlazadores como se describe de otro modo en el presente documento, un enlazador (no lábil) basado en enlaces de polietilenglicol (PEG), enlaces de polipropilenglicol, o polímeros de polietilenglicol-co-polipropilenglicol (por ejemplo, copolímeros de bloque en los que la porción de polietilenglicol del bloque tiene de 1 a 12 unidades de polietilenglicol de longitud y dicha porción de polipropilenglicol del bloque tiene de 1 a 12 unidades de polipropilenglicol de longitud, el número total de unidades de polietilenglicol, unidades de polipropilenglicol o unidades de copolímero de bloques de polietilenglicol-co-polipropilenglicol es de 1 a 100, de 1 a 75, de 1 a , de 1 a 15, de 1 a 12, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12, o a menudo hasta aproximadamente 100 unidades, de aproximadamente 1 a 100, de aproximadamente 1 a 75, de aproximadamente 1 a 60, de aproximadamente 1 a 50, de aproximadamente 1 a 35, de aproximadamente 1 a 25, de aproximadamente 1 a 20, de aproximadamente 1 a 15, de 1 a 10, de aproximadamente 8 a 12, de aproximadamente 1 a 8. De estos, los enlaces de polietileno (PEG) se utilizan con mayor frecuencia.
Los enlazadores alternativos preferidos pueden incluir, por ejemplo, enlazadores de poliprolina y/o enlazadores de colágeno como se representan a continuación (n es de aproximadamente 1 a 100, de aproximadamente 1 a 75, de aproximadamente 1 a 60, de aproximadamente 1 a 50, de aproximadamente 1 a 45, de aproximadamente 1 a 35, de aproximadamente 1 a 25, de aproximadamente 1 a 20, de aproximadamente 1 a 15, de 2 a 10, de aproximadamente 4 a 12, de aproximadamente 5 a 10, de aproximadamente 4 a 6, de aproximadamente 1 a 8, de aproximadamente 1 a 6, de aproximadamente 1 a 5, de aproximadamente 1 a 4, de aproximadamente 1 a 3, etc.).
Figure imgf000013_0001
enlazador de poliprolina
Figure imgf000014_0001
enlazador de colágeno.
Los enlazadores adicionales incluyen aquellos de acuerdo con las estructuras químicas:
Figure imgf000014_0002
en las que Ra es H, alquilo C1-C3 o alcanol, o forma un anillo cíclico con R3 (prolina) y R3 es una cadena lateral derivada de un aminoácido seleccionado preferentemente del grupo que consiste en alanina (metilo), arginina (propilenoguanidina), asparagina (metilenocarboxiamida), ácido aspártico (ácido etanoico), cisteína (tiol, di-tiol reducido u oxidado), glutamina (etilcarboxiamida), ácido glutámico (ácido propanoico), glicina (H), histidina (metilenoimidazol), isoleucina (1-metilpropano), leucina (2-metilpropano), lisina (butilenoamina), metionina (etilmetiltioeter), fenilalanina (bencilo), prolina (R3 forma un anillo cíclico con Ra y el grupo de nitrógeno adyacente para formar un grupo pirrolidina), hidroxiprolina, serina (metanol), treonina (etanol, 1-hidroxietano), triptófano (metilenindol), tirosina (metilenfenol) o valina (isopropilo);
m'' es un número entero entre 0 a 25, preferentemente de 1 a 10, de 1 a 8, 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
m (en este contexto) es un número entero de 1 a 100, de 1 a 75, de 1 a 60, de 1 a 55, de 1 a 50, de 1 a 45, de 1 a 40, de 2 a 35, de 3 a 30, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 1, 2, 3, 4 o 5; y
n (en este contexto) es un número entero de aproximadamente 1 a 100, de aproximadamente 1 a 75, de aproximadamente 1 a 60, de aproximadamente 1 a 50, de aproximadamente 1 a 45, de aproximadamente 1 a 35, de aproximadamente 1 a 25, de aproximadamente 1 a 20, de aproximadamente 1 a 15, de 2 a 10, de aproximadamente 4 a 12, de aproximadamente 5 a 10, de aproximadamente 4 a 6, de aproximadamente 1 a 8, de aproximadamente 1 a 6, de aproximadamente 1 a 5, de aproximadamente 1 a 4, de aproximadamente 1 a 3, etc.).
Otro enlazador de acuerdo con la presente invención comprende un enlazador de polietilenglicol que contiene de 1 a 1 de 1 a 100, de 1 a 75, de 1 a 60, de 1 a 55, de 1 a 50, de 1 a 45, de 1 a 40, de 2 a 35, de 3 a 30, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 1, 2, 3, 4 o 5 unidades de etilenglicol que pueden unirse adicionalmente a través de grupos amida (que incluyen grupos alquileno en uno o ambos lados del grupo amida que contiene de una a cinco unidades de metileno), grupos ceto (que incluyen grupos alquileno ceto que contienen de una a cinco unidades de metileno), grupos amina (que incluyen grupos alquileno amina que contienen de una a cinco unidades de metileno), grupos alquileno (que contienen de 1 a 5 unidades de metileno), aminoácidos u otros restos compatibles con grupos de polietilenglicol, incluyendo grupos conectores difuncionales [CON]), grupos [CBT], grupos [IBT], grupos [MULTICON], y otros grupos enlazadores que incluyen otros grupos de polietilenglicol (a menudo con entre 1 y 12 unidades de etilenglicol (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12). Aún otros enlazadores comprenden polipéptidos de residuos de aminoácidos (D o L). En otra realización, como se describe de otro modo en el presente documento, los polipéptidos pueden comprender aminoácidos no naturales (no naturales excepto la glicina) del enlazador no lábil, cada uno de los cuales tiene entre 1-15 o más grupos metileno que separan el grupo amino del grupo ácido, a menudo de tres a seis grupos metileno (3, 4, 5 o 6), y de 1 a 100 grupos peptídicos al proporcionar un enlazador al resto, preferentemente de 1 a 12 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12). Se observa que cada uno de los enlazadores polipeptídicos y otros enlazadores (incluidos los enlazadores lábiles) identificados en la presente solicitud se pueden unir adicionalmente entre sí o con moléculas/restos conectores [CON], moléculas/restos [MULTICON], grupos [IBT], y/o grupos [CBT] a través de grupos amida (que incluyen grupos alquileno en uno o ambos lados del grupo amida que contiene de una a cinco unidades de metileno), grupos ceto (que incluyen grupos alquileno ceto que contienen de una a cinco unidades de metileno en uno o ambos lados del grupo ceto), grupos amina (que incluyen grupos alquileno amina que contienen de una a cinco unidades de metileno en uno o ambos lados del grupo amina), grupos uretano (que incluyen grupos alquileno que contienen de una a cinco unidades metileno en uno o ambos lados de el resto uretano), grupos alquileno (que contienen de 1 a 5 unidades de metileno), aminoácidos u otros restos compatibles con la química del enlazador para unir componentes de las moléculas. Cabe señalar que en el caso de enlazadores de polietilenglicol y polipeptídicos, el uso de un grupo adicional (por ejemplo, alquilen amina u otro grupo, como se ha descrito anteriormente) o un segundo grupo enlazador puede ser útil para unir el enlazador a otro componente de la molécula. Además, más de un grupo enlazador identificado en el presente documento puede unirse para formar un grupo enlazador como se usa de otro modo en los presentes compuestos, de acuerdo con la estabilidad de las químicas del enlazador. Estos enlazadores extendidos a menudo están unidos a través de grupos conectores [CON] o como se describe de otro modo en el presente documento.
Los enlazadores preferidos adicionales incluyen aquellos de acuerdo con la estructura:
Figure imgf000015_0001
en la que Ra es H o un alquilo C1-C3 , preferentemente CH3 , más a menudo H;
m es un número entero de 1 a 12, a menudo 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
m'' es un número entero 1, 2, 3, 4, 5 o 6, a menudo 6;
t es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6; y
iL es 0 o 1, a menudo 1, en la que dicho enlazador, en ciertos casos, puede estar unido preferentemente a un grupo [CON] y un grupo [CBT] en un extremo, y un grupo [MULTICON] en el otro extremo; o
un enlazador de acuerdo con la estructura:
Figure imgf000015_0002
en la que q es un número entero de 0-12, preferentemente 1,2, 3, 4, 5 o 6; y
q' es de 1 a 12, a menudo 1,2, 3, 4, 5 o 6.
Los dos enlazadores anteriores pueden estar unidos entre sí para proporcionar enlazadores adicionales que a menudo se usan en compuestos de acuerdo con la presente invención:
Figure imgf000016_0001
en la que q es un número entero de 0-12, preferentemente 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
q' es de 1 a 12, a menudo 1,2, 3, 4, 5 o 6;
iL es 0 o 1; y
Rl es un aminoácido o un oligopéptido (término que incluye un dipéptido) como se describe de otro modo en el presente documento, incluyendo especialmente lisina, dilisina, o glicinalisina.
Otro enlazador de acuerdo con la presente invención incluye un enlazador basado en succinimida de acuerdo con la fórmula química:
Figure imgf000016_0002
en la que cada Xs es independientemente S, O o N-Rs, preferentemente S;
Rs es H o alquilo C1-3, preferentemente H;
Sc es CH2; CH2O; o CH2CH2O;
i es 0 o 1; y
mS es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Otros enlazadores que pueden usarse en la presente invención incluyen enlazadores de acuerdo con la fórmula química:
Figure imgf000016_0003
en la que Z y Z' son cada uno independientemente un enlace, -(CH2)i-O, -(CH2)i-S, -(CH2)i-N-R,
Figure imgf000016_0004
en las que dicho grupo Z o Z' está unido opcionalmente a otro grupo enlazador, un conector [CON], un grupo [MULTICON], IBT o CBT;
Cada R es H, o un grupo alquilo C1-C3 o alcanol;
Cada R2 es independientemente H o un grupo alquilo C1-C3 ;
Cada Y es independientemente un enlace, O, S o N-R;
Cada i es independientemente de 0 a 100, preferentemente de 1 a 100, de 1 a 75, de 1 a 60, de 1 a 55, de 1 a 50, de 1 a 45, de 1 a 40, de 2 a 35, de 3 a 30, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 0, 1, 2, 3, 4 o 5; D es
Figure imgf000017_0001
-(CH2)m'-;
Figure imgf000017_0002
o
un enlace, o D puede ser
Figure imgf000017_0004
0 un enlazador de polipropilenglicol o polipropileno-co-polietilenglicol que tiene entre 1 y 100 unidades de glicol (de 1 a 75, de 1 a 60, de 1 a 55, de 1 a 50, de 1 a 45, de 1 a 40, de 2 a 35, de 3 a 30, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 1, 2, 3, 4 o 52 y 50, 3 y 45);
con la condición de que Z, Z' y D no sean cada uno simultáneamente enlaces;
cada i es igual que anteriormente;
j es de 1 a 100, de 1 a 75, de 1 a 60, de 1 a 55, de 1 a 50, de 1 a 45, de 1 a 40, de 2 a 35, de 3 a 30, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 1,2, 3, 4 o 5;
m (en este contexto) es un número entero de
Figure imgf000017_0003
100, de 1 a 75, de 1 a 60, de 1 a 55, de 1 a 50, de 1 a 45, de 1 a 40, de 2 a 35, de 3 a 30, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 1,2, 3, 4 o 5; y
n (en este contexto) es un número entero de aproximadamente 1 a 100, de aproximadamente 1 a 75, de aproximadamente 1 a 60, de aproximadamente 1 a 50, de aproximadamente 1 a 45, de aproximadamente
1 a 35, de aproximadamente 1 a 25, de aproximadamente 1 a 20, de aproximadamente 1 a 15, de 2 a 10, de aproximadamente 4 a 12, de aproximadamente 5 a 10, de aproximadamente 4 a 6, de aproximadamente
1 a 8, de aproximadamente 1 a 6, de aproximadamente 1 a 5, de aproximadamente 1 a 4, de aproximadamente 1 a 3, etc.).
m' es de 1 a 100, de 1 a 75, de 1 a 60, de 1 a 55, de 1 a 50, de 1 a 45, de 1 a 40, de 2 a 35, de 3 a 30, de 1 a
15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 1, 2, 3, 4 o 5;
m'' es un número entero entre 0 a 25, preferentemente de 1 a 10, de 1 a 8, 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
n' es de 1 a 100, de 1 a 75, de 1 a 60, de 1 a 55, de 1 a 50, de 1 a 45, de 1 a 40, de 2 a 35, de 3 a 30, de 1 15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 1, 2, 3, 4 o 5;
X1 es O, S o N-R;
R es como se ha descrito anteriormente;
Ra es H, alquilo C1-C3 o alcanol, o forma un anillo cíclico con R3 (prolina); y R3 es una cadena lateral derivada de un aminoácido seleccionado preferentemente del grupo que consiste en alanina (metilo), arginina (propilenoguanidina), asparagina (metilenocarboxiamida), ácido aspártico (ácido etanoico), cisteína (tiol, ditiol reducido u oxidado), glutamina (etilcarboxiamida), ácido glutámico (ácido propanoico), glicina (H), histidina (metilenoimidazol), isoleucina (1-metilpropano), leucina (2-metilpropano), lisina (butilenoamina), metionina (etilmetiltioeter), fenilalanina (bencilo), prolina (R3 forma un anillo cíclico con Ra y el grupo de nitrógeno adyacente para formar un grupo pirrolidina), hidroxiprolina, serina (metanol), treonina (etanol, 1-hidroxietano), triptófano (metilenindol), tirosina (metilenfenol) o valina (isopropilo), en los que dicha cadena lateral de dicho aminoácido (a menudo lisina) está unida opcionalmente, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En ciertas realizaciones, el aminoácido se puede unir a través de la cadena lateral del aminoácido. En ciertas realizaciones, el aminoácido es a menudo lisina debido a su trifuncionalidad, en la que la amina de la cadena lateral se usa para unir otros enlazadores y/u otros componentes de la molécula. Se observa que un aminoácido que tiene trifuncionalidad y la cadena lateral se usa para crear el enlazador, el aminoácido (a menudo lisina) puede estar protegido en los extremos del ácido carboxílico con un grupo amina que está opcionalmente sustituido con un grupo alquilo C1-C12, preferentemente un grupo alquilo C1-C3) o en el extremo amina con un grupo acilo.
Se observa que para cada enlazador, uno o más de los grupos enlazadores, como se representan en el presente documento, pueden extenderse a través de la unión con uno o más grupos conectores difuncionales [CON], lo que se describe con más detalle a continuación en el presente documento. Por ejemplo, un enlazador de polietilenglicol (por ejemplo, de 1 a 12 unidades de etilenglicol, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12) extendido a una o más unidades de polietilenglicol (por ejemplo, cada enlazadora tiene de 1 a 12 unidades de etilenglicol, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12) a través de uno o más grupos [CON] como se describe de otro modo en el presente documento, incluyendo uno o más grupos [CON] amida, representa realizaciones adicionales de la presente invención.
Como se analiza, ciertos enlazadores preferidos para su uso en la presente invención incluyen un grupo enlazador como se muestra en los compuestos 1, 2 o 3 de la figura 2, que a menudo une un resto [CBT] a una molécula [MULTICON] de acuerdo con la estructura química:
Figure imgf000018_0001
en la que Ra es H o CH3, más a menudo H;
m es un número entero de 1 a 12, a menudo 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
m'' es un número entero 1, 2, 3, 4, 5 o 6, a menudo 6;
t es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6; y
iL es 0 o 1, a menudo 1, en la que L puede estar unido opcionalmente a un grupo [CON] y un grupo [CBT] en un extremo, y un grupo [MULTICON] en el otro extremo; o
Como se ha descrito anteriormente, como alternativa, a menudo L es un grupo enlazador complejo (como se representa en el compuesto 3 de la figura 2) que está constituido por un grupo amina que contiene óxido de etileno
Figure imgf000018_0002
en el que q es de 0 a 12, 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
q' es de 1 a 12, a menudo 1,2, 3, 4, 5 o 6,
iL es 0 o 1, en el que el grupo ceto está unido a un grupo de aminoácidos o a un oligopéptido (incluyendo un dipéptido), y el grupo amina está unido opcionalmente a través de un grupo diceto (a menudo a [IBT], más a menudo CP33),
Figure imgf000019_0001
en el que q es igual que anteriormente, y un aminoácido, a menudo lisina, o un dipéptido de aminoácidos, a menudo dilisina. En aspectos preferidos, una de las lisinas del dipéptido está unida directamente a CP33, y otro aminoácido (a menudo lisina) une el grupo amina de óxido de etileno anterior a un grupo [MULTICON] a través de un grupo [CON], más a menudo un triazol. La estructura química del enlazador complejo descrito anteriormente puede representarse por la estructura química:
Figure imgf000019_0002
en la que q es un número entero de 0-12, preferentemente 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
q' es de 1 a 12, a menudo 1,2, 3, 4, 5 o 6;
iL es 0 o 1; y
Rl es un aminoácido o un oligopéptido (término que incluye un dipéptido) como se describe de otro modo en el presente documento, incluyendo especialmente lisina, dilisina, o glicinalisina.
En ciertas realizaciones adicionales, el grupo enlazador L es un aminoácido, un dipéptido o un oligopéptido que contiene de 1 a 12, preferentemente de 1 a 6 monómeros de aminoácidos o más. En ciertas realizaciones, el oligopéptido es un dipéptido, y el dipéptido es un dipéptido de dilisina o glicinalisina. Cuando se usa lisina como un aminoácido en un enlazador oligopeptídico, la amina de alquileno de cadena lateral se usa a menudo para unir otros grupos enlazadores u otros componentes en la molécula.
El término "conector multifuncional", simbolizado por [MULTICON], se usa para describir un grupo químico o molécula que se incluye opcionalmente en compuestos quiméricos de acuerdo con la presente invención, que se forma a partir del producto de reacción de un IBT- enlazador activado con un resto CBT (que también está preferentemente activado) o un resto IBT con un enlazador-CBT activado como se describe de otro modo en el presente documento. Son posibles muchos otros enfoques sintéticos. La química sintética utilizada para sintetizar compuestos de acuerdo con la presente invención se presenta en detalle en el presente documento. El grupo conector es el resto resultante que se forma a partir de la condensación fácil de al menos tres fragmentos químicos separados que contienen grupos reactivos que pueden proporcionar grupos conectores como se describe de otro modo para producir compuestos quiméricos de acuerdo con la presente invención. Se observa que un resto o molécula conectora multifuncional [MULTICON] se distingue fácilmente de un enlazador en que el conector multifuncional es el resultado de una química específica que se usa para proporcionar compuestos quiméricos de acuerdo con la presente invención.
Los restos conectores en la presente invención incluyen al menos un resto o molécula multifuncional [MULTICON] que contiene tres o más grupos funcionales que pueden usarse para unirse covalentemente (preferentemente, a través de un enlazador) al menos a un grupo [IBT] y al menos un grupo [CBT], uniendo así cada uno de estos grupos funcionales en un solo compuesto. Los grupos conectores multifuncionales para su uso en la presente invención incluyen restos que tienen al menos tres o más grupos funcionales que pueden unirse a enlazadores a los que están unidos los grupos [IBT] y [CBT] para proporcionar compuestos que contienen al menos uno y preferentemente más de un [IBT] y [CBT] de acuerdo con la presente invención. Estos restos conectores multifuncionales también pueden unirse a otras moléculas conectoras multifuncionales con el fin de crear compuestos que contengan varios grupos [IBT] y [CBT] como se define en el presente documento.
Las moléculas conectoras multifuncionales [MULTICON] comprenden cualquier molécula o resto que contenga al menos tres grupos que puedan estar unidos a grupos [IBT] y [CBT], enlazadores y/u otros grupos conectores (incluidos grupos conectores multifuncionales y difuncionales) como se define en la reivindicación 1, y preferentemente comprenden grupos arilo o heteroarilo de cinco o seis miembros (especialmente grupos anulares de seis miembros) ilustrados por grupos arilo o heteroarilo multifuncionales, especialmente trifuncionales o tetrafuncionales, incluyendo grupos fenilo, piridilo, pirimidinilo, 1,3,5-triazinilo, 1,2,3-triazinilo, 1,2,4-triazinilo, cada uno de los cuales está sustituido con al menos 3 y hasta 6 grupos funcionales u otros grupos como se define en el presente documento. Estos grupos funcionales pueden derivarse de grupos nucleófilos o electrófilos en el precursor de la molécula conectora multifuncional (la molécula conectora multifuncional que forma el resto [MULTICON] en los compuestos finales de acuerdo con la presente mención) que se condensan en grupos enlazadores (que contienen, por ejemplo, un grupo [IBT] y un grupo [CBT] que contienen un grupo que puede unirse al resto [MULTICON]. Los grupos [MULTICON] que se utilizan en la presente invención incluyen grupos fenilo sustituido, piridilo, pirimidinilo y 1,3,5-triazinilo, 1,2,3-triazinilo, 1,2,4-triazinilo, de acuerdo con la estructura química:
Figure imgf000020_0001
o
Figure imgf000021_0001
en la que Y4 es C-H o N; y
Cada X'' se deriva independientemente de un grupo electrófilo o nucleófilo, preferentemente (CH2VO, (CH2)n''NRCON, (CH2)n''S,
(CH2)n- o (CH2)n'C=O, o cuando dicho grupo [MULTICON] es una estructura anular, X" es opcionalmente un grupo [CON], a menudo un grupo triazol, unido a la estructura anular, a menudo directamente a la estructura anular; el sustituyente RCON es H o un alquilo C1-C3 , preferentemente H o CH3 y
n'' es 0, 1, 2 o 3, y
r es un número entero de 1-12, a menudo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
El término "grupo conector difuncional" o [CON] se usa para describir un grupo difuncional que conecta dos (o más) porciones de un grupo conector para extender la longitud del grupo enlazador. En ciertas realizaciones, un grupo enlazador se hace reaccionar con o forma un grupo [CON] con otro grupo enlazador para formar un grupo enlazador extendido. El producto de reacción de estos grupos da como resultado un grupo conector identificable [CON] que se distingue del grupo enlazador como se describe de otro modo en el presente documento. Se observa además que puede haber cierta superposición entre la descripción del grupo conector difuncional y el grupo enlazador, especialmente con respecto a los grupos conectores más comunes, tales como los grupos amida, oxígeno (éter), azufre (tioéter) o enlaces amina, urea o grupos carbonato -OC(O)O- como se describe de otro modo en el presente documento. Se observa que una molécula conectora difuncional [CON] utilizada a continuación se conecta a menudo a dos partes de un grupo enlazador que une [IBT] y [CBT] a la molécula conectora multifuncional [MULTICON]. Como alternativa, un grupo [CON] puede unirse directamente a un grupo [IBT] o, más a menudo, a un grupo [CBT], así como a un grupo [MULTICON] como se describe en el presente documento.
Los grupos conectores difuncionales comunes [CON] que se usan en la presente invención, principalmente para unir un extremo de un enlazador a otro extremo de un enlazador para proporcionar un enlazador más largo, son los siguientes grupos químicos:
Figure imgf000021_0002
en los que X2 es O, S, NR4, S(O), S(O)2 , -S(O)2O, -OS(O)2 , u OS(O)2O;
X3 es O, S, NR4; y
R4 es H, un grupo alquilo C1-C3 o alcanol, o un grupo -C(O)(C1-C3).
o
Figure imgf000022_0001
grupo;
en el que CL es
Figure imgf000022_0002
m en CL es un número entero de 0 a 12, a menudo 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
e iL es 0 o 1, a menudo 1;
En ciertas realizaciones, este grupo [CON] a menudo se une a través de la amina del triazol a la estructura anular de [MULTICON].
Como se ha analizado anteriormente en el presente documento, se observa que cada uno de los grupos funcionales [ABT] y [CBT] puede unirse adicionalmente a un resto químico que une dos o más de los grupos conectores/multiconectores anteriores a un conector multifuncional más grande, proporcionando así compuestos multifuncionales complejos que comprenden más de un grupo [IBT] y [CBT] dentro del compuesto multifuncional.
El término "protección terminal" o "de protección terminal" se usa para describir un resto químico no reactivo que está unido a un grupo de ácido carboxílico libre o un grupo amina libre en un aminoácido que se usa a menudo como un enlazador en compuestos de acuerdo con la presente invención. Los grupos de protección terminal preferidos para ácidos carboxílicos en la presente invención son grupos amina que están opcionalmente sustituidos con un grupo alquilo C1-C12, preferentemente un grupo alquilo C1-C3. Al formar una amida con el ácido carboxílico activo, el ácido carboxílico se convierte en un resto estable no reactivo en los presentes compuestos. En el caso de los grupos amina, estos se protegen en los extremos preferentemente con grupos acilo o grupos uretano, preferentemente grupos acilo para formar amidas estables no reactivas.
El término "acilo" se usa para describir un grupo de acuerdo con la estructura química que a menudo contiene una cadena de alquilo C1 a C20, a menudo C2 a C20, lineal, ramificada o cíclica unida a un grupo ceto, formando así una amida no reactiva con una amina libre en los compuestos de acuerdo con la presente invención. El grupo acilo en la amina libre (a menudo de un aminoácido usado en enlazadores en compuestos de acuerdo con la presente invención, da como resultado una amida estable, no reactiva. Los grupos acilo de acuerdo con la presente invención pueden estar representados por la estructura:
O
r4c-
en la que R4 es un grupo alquilo de C1 a C20 lineal, ramificado o cíclico, alcoxialquilo, ariloxialquilo, tal como fenoximetilo, arilo, alcoxi, entre otros. Los grupos acilo preferidos son aquellos en los que R4 es un grupo alquilo de C1 a C10. Los grupos acilo de acuerdo con la presente invención también incluyen, por ejemplo, los grupos acilo obtenidos a partir de ácido benzoico y ácidos relacionados, tales como grupos de ácido benzoico sustituido, succínico, cáprico y caproico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico y oleico, entre muchos otros. Un experto en la técnica reconocerá los grupos acilo que tendrán utilidad en la presente invención, ya sea para proteger en los extremos los grupos amina reactivos para producir amidas estables no reactivas.
La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" o el término "sal" se usa en toda la memoria descriptiva para describir una forma de sal de una o más de las composiciones del presente documento que se presentan para aumentar la solubilidad del compuesto en solución salina para la administración parenteral o en los jugos gástricos del tracto gastrointestinal del paciente para potenciar la disolución y la biodisponibilidad de los compuestos. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas derivadas de bases y ácidos inorgánicos y orgánicos farmacéuticamente aceptables. Las sales adecuadas incluyen aquellas derivadas de metales alcalinos tales como potasio y sodio, metales alcalinotérreos tales como sales de calcio, magnesio y amonio, entre otros muchos ácidos conocidos en la técnica farmacéutica. Se pueden preferir las sales de sodio y potasio como sales de neutralización de ácidos carboxílicos y composiciones que contienen fosfato ácido libre de acuerdo con la presente invención. El término "sal" significará cualquier sal compatible con el uso de los compuestos según la presente invención. En caso de que los compuestos se usen en indicaciones farmacéuticas, incluido el tratamiento del cáncer de próstata, incluyendo el cáncer de próstata metastásico, el término "sal" significará una sal farmacéuticamente aceptable, coherente con el uso de los compuestos como agentes farmacéuticos.
El término "administración conjunta" significa que se administran al menos dos compuestos o composiciones a la vez al paciente, de modo que las cantidades o concentraciones eficaces de cada uno de los dos o más compuestos puedan encontrarse en el paciente en un momento dado en el tiempo. Aunque los compuestos de acuerdo con la presente invención pueden administrarse conjuntamente a un paciente al mismo tiempo, el término engloba tanto la administración de dos o más agentes al mismo tiempo como en diferentes momentos, con la condición de que las concentraciones eficaces de todos los compuestos o las composiciones administradas conjuntamente se encuentren en el sujeto en un momento dado. Los compuestos de reclutamiento de anticuerpos quiméricos de acuerdo con la presente invención se pueden administrar con uno o más agentes anticancerosos adicionales u otros agentes que se usan para tratar o mejorar los síntomas del cáncer, especialmente cáncer de próstata, incluyendo cáncer de próstata metastásico. Los agentes anticancerosos ejemplares que pueden administrarse conjuntamente en combinación con uno o más compuestos quiméricos de acuerdo con la presente invención incluyen, por ejemplo, antimetabolitos, inhibidores de topoisomerasa I y II, agentes alquilantes e inhibidores de microtúbulos (por ejemplo, taxol). Los compuestos anticancerosos específicos para su uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, aldesleucina; alemtuzumab; alitretinoína; alopurinol; altretamina; amifostina; anastrozol; trióxido de arsénico; asparaginasa; BCG vivo; cápsulas de bexaroteno; gel de bexaroteno; bleomicina; busulfán intravenoso; busulfán oral; calusterona; capecitabina; carboplatino; carmustina; carmustina con implante de Polifeprosan 20; celecoxib; clorambucilo; cisplatino; cladribina; ciclofosfamida; citarabina; citarabina liposomal; dacarbazina; dactinomicina; actinomicina D; darbepoyetina alfa; daunorrubicina liposomal; daunorrubicina, daunomicina; denileucina diftitox, dexrazoxano; docetaxel; doxorrubicina; doxorubicina liposomal; propionato de dromostanolona; solución B de Elliott; epirrubicina; epoyetina alfa estramustina; fosfato de etopósido; etopósido (VP-16); exemestano; filgrastim; floxuridina (intraarterial); fludarabina; fluorouracilo (5-FU); fulvestrant; gemtuzumab ozogamicina; acetato de goserelina; hidroxiurea; Ibritumomab Tiuxetan; idarrubicina; ifosfamida; mesilato de imatinib; Interferón alfa-2a; Interferón alfa-2b; irinotecán; letrozol; leucovorina; levamisol; lomustina (CCNU); mecloretamina (mostaza nitrogenada); acetato de megestrol; melfalán (L-PAM); mercaptopurina (6-MP); mesna; metotrexato; metoxsalen; mitomicina C; mitotano; mitoxantrona; fenpropionato de nandrolona; Nofetumomab; LOddC; Oprelvekin; oxaliplatino; paclitaxel; pamidronato; pegademasa; pegaspargasa; pegfilgrastim; pentostatina; pipobromano; plicamicina; mitramicina; porfímero sódico; procarbazina; quinacrina; rasburicasa; rituximab; sargramostim; estreptozocina; talbuvidina (LDT); talco; tamoxifeno; temozolomida; tenipósido (VM-26); testolactona; tioguanina (6-TG); tiotepa; topotecán; toremifeno; tositumomab; trastuzumab; tretinoína (ATRA); mostaza de uracilo; valrrubicina; valtorcitabina (monoval LDC); vinblastina; vinorelbina; zoledronato; y mezclas de los mismos, entre otros.
Además de los agentes anticancerosos, se pueden administrar conjuntamente varios agentes diferentes con compuestos quiméricos de acuerdo con la presente invención en el tratamiento del cáncer, especialmente cáncer de próstata, incluyendo cáncer de próstata metastásico. Estos incluyen agentes activos, minerales, vitaminas y complementos nutricionales que han demostrado cierta eficacia para inhibir el tejido del cáncer de próstata o su crecimiento, o son útiles de otro modo en el tratamiento del cáncer de próstata. Por ejemplo, uno o más de selenio dietético, vitamina E, licopeno, alimentos de soja, vitamina D, té verde, ácidos grasos omega-3 y fitoestrógenos, incluyendo beta-sitosterol, se pueden utilizar en combinación con los presentes compuestos para tratar el cáncer de próstata.
Además, los agentes activos, distintos de los agentes anticancerosos tradicionales, han mostrado cierta utilidad en el tratamiento del cáncer de próstata. El fármaco modulador selectivo del receptor de estrógeno toremifeno puede usarse en combinación con los presentes compuestos para tratar el cáncer, especialmente cáncer de próstata, incluyendo cáncer de próstata metastásico. Además, dos medicamentos que bloquean la conversión de testosterona en dihidrotestosterona, finasterida y dutasterida, también son útiles en el tratamiento del cáncer de próstata cuando se administran conjuntamente con compuestos de acuerdo con la presente invención. Los fitoquímicos indol-3-carbinol y diindolilmetano, también pueden administrarse conjuntamente con los presentes compuestos por sus efectos en el tratamiento del cáncer de próstata. Los agentes adicionales que pueden combinarse con compuestos de acuerdo con la presente invención incluyen antiandrógenos, por ejemplo, flutamida, bicalutamida, nilutamida y acetato de ciproterona, así como agentes que reducen la producción de andrógenos suprarrenales (por ejemplo, DHEA), tales como ketoconazol y aminoglutetimida. Otros agentes activos que pueden combinarse con compuestos de acuerdo con la presente invención incluyen, por ejemplo, moduladores de GnRH, incluidos agonistas y antagonistas. Los antagonistas de GnRH suprimen la producción de LH directamente, mientras que los agonistas de GnRH suprimen la LH a través del proceso de regulación negativa después de un efecto de estimulación inicial. Abarelix es un ejemplo de un antagonista de GnRH, mientras que los agonistas de GnRH incluyen leuprolida, goserelina, triptorelina y buserelina, entre otros. Estos agentes pueden combinarse con compuestos de acuerdo con la presente invención en cantidades eficaces. Además, el acetato de abiraterona también se puede combinar con uno o más compuestos de acuerdo con la presente invención en el tratamiento del cáncer de próstata, incluido especialmente el cáncer de próstata metastásico.
Otros agentes que pueden combinarse con uno o más compuestos de acuerdo con la presente invención incluyen los bisfosfonatos tales como ácido zoledrónico, que se ha demostrado que retrasan las complicaciones esqueléticas tales como fracturas que ocurren en pacientes que tienen cáncer de próstata metastásico. La alfaradina, otro agente, puede combinarse con compuestos de acuerdo con la presente invención para dirigirse a la metástasis ósea. Además, el dolor óseo debido al cáncer de próstata metastásico puede tratarse con analgésicos opioides tales como morfina y oxicodona, entre otros, que pueden combinarse con compuestos de acuerdo con la presente invención.
La presente invención se refiere a compuestos de acuerdo con la estructura química general:
Figure imgf000024_0001
en la que n y n' son cada uno independientemente un numero entero de 1 a 15, a menudo de 2 a 10, a menudo de 2 a 5, más a menudo 2 o 3;
NL1 y NL2 son cada uno un nUmero entero de 0 a 10, a menudo de 1 a 10, a menudo de 2 a 5, más a menudo 2 o 3, con la condición de que n > NL1 y n' > NL2;
MCON es un nUmero entero de 0 a 10, a menudo de 1 a 10, más a menudo de 1 a 5, a menudo 0, 1 o 2;
[IBT] es un resto de unión inmunitaria de acuerdo con la fórmula química expuesta en la figura 14 de la misma, preferentemente, [IBT] es un grupo CP33 de acuerdo con la estructura química:
Figure imgf000024_0002
[CBT] es un resto de unión celular de acuerdo con la fórmula química:
Figure imgf000024_0003
en las que X1 y X2 son cada uno independientemente CH2 , O, NH o S;
X3 es O, CH2 , NR1, S(O), S(O)2 , -S(O)2O, -OS(O)2 , u OS(O)2O;
R1 es H, un grupo alquilo C1-C3 , o un grupo -C(O)(C1-C3);
k es un nUmero entero de 0 a 20, de 8 a 12, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
L1 y L2 son cada uno independientemente un enlazador de acuerdo con la fórmula química:
Figure imgf000024_0004
en la que Ra es H o un alquilo C1-C3 , preferentemente CH3 , más a menudo H;
m es un número entero de 1 a 12, a menudo 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
m'' es un número entero 1, 2, 3, 4, 5 o 6, a menudo 6;
t es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6; y
iL es 0 o 1, a menudo 1, en la que dicho enlazador en ciertos casos, puede estar unido preferentemente a un grupo [CON] y un grupo [CBT] en un extremo, y un grupo [MULTICON] en el otro extremo; o un enlazador de acuerdo con la estructura:
Figure imgf000025_0001
en la que q es un número entero de 0-12, preferentemente 1,2, 3, 4, 5 o 6;
q' es de 1 a 12, a menudo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 y
iL es 0 o 1, preferentemente, 1.
Los dos enlazadores anteriores pueden estar unidos entre sí para proporcionar enlazadores adicionales que a menudo se usan en compuestos de acuerdo con la presente invención:
Figure imgf000025_0002
en la que q es un número entero de 0-12, preferentemente 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
q' es de 1 a 12, a menudo 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
iL es 0 o 1; y
Rl es un aminoácido o un oligopéptido (término que incluye un dipéptido) como se describe de otro modo en el presente documento, incluyendo especialmente lisina, dilisina, o glicinalisina.
En ciertas realizaciones adicionales, el grupo enlazador L es un aminoácido, un dipéptido o un oligopéptido que contiene de 1 a 12, preferentemente de 1 a 6 monómeros de aminoácidos o más. En ciertas realizaciones, el oligopéptido es un dipéptido, y el dipéptido es un dipéptido de dilisina o glicinalisina. Cuando se usa lisina como un aminoácido en un enlazador oligopeptídico, la amina de alquileno de cadena lateral se usa a menudo para unir otros grupos enlazadores u otros componentes en la molécula.
En ciertas realizaciones adicionales, el grupo enlazador L es un grupo
Figure imgf000025_0003
Figure imgf000026_0001
enlazador de colágeno, un grupo
Figure imgf000026_0002
0 un enlazador de polipropilenglicol o polipropileno-co-polietilengMcol que tiene entre 1 y 100 unidades de glicol (de 1 a 75, de 1 a 60, de 1 a 55, de 1 a 50, de 1 a 45, de 1 a 40, de 2 a 35, de 3 a 30, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 1, 2, 3, 4 o 52 y 50, 3 y 45); en los que Ra es H, alquilo C1-C3 o alcanol, o forma un anillo cíclico con R3 (prolina) y R3 es una cadena lateral derivada de un aminoácido seleccionado preferentemente del grupo que consiste en alanina (metilo), arginina (propilenoguanidina), asparagina (metilenocarboxiamida), ácido aspártico (ácido etanoico), cisteína (tiol, di-tiol reducido u oxidado), glutamina (etilcarboxiamida), ácido glutámico (ácido propanoico), glicina (H), histidina (metilenoimidazol), isoleucina (1-metilpropano), leucina (2-metilpropano), lisina (butilenoamina), metionina (etilmetiltioeter), fenilalanina (bencilo), prolina (R3 forma un anillo cíclico con Ra y el grupo de nitrógeno adyacente para formar un grupo pirrolidina), serina (metanol), treonina (etanol, 1-hidroxietano), triptófano (metilenindol), tirosina (metilenfenol) o valina (isopropilo);
m'' es un número entero de 0 a 25, preferentemente de 1 a 10, de 1 a 8, 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
m es un número entero de 1 a 100, de 1 a 75, de 1 a 60, de 1 a 55, de 1 a 50, de 1 a 45, de 1 a 40, de 2 a 35, de 3 a 30, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 1, 2, 3, 4 o 5; y
n es un número entero de 1 a 100, de 1 a 75, de 1 a 60, de 1 a 55, de 1 a 50, de 1 a 45, de 1 a 40, de 2 a 35, de 3 a 30, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 1, 2, 3, 4 o 5; o
L en un enlazador de acuerdo con la fórmula química:
Figure imgf000026_0003
en la que Z y Z' son cada uno independientemente un enlace, -(CH2)i-O, -(CH2)i-S, -(CH2)i-N-R,
Figure imgf000027_0001
en las que dicho grupo -(CH2)i, si está presente en Z o Z', está unido a [MULTICON], [ABT], [CBT], o [TLR] o un grupo conector difuncional [CON] opcional, si está presente;
Cada R es independientemente H, o un grupo alquilo C1-C3 o alcanol;
Cada R2 es independientemente H o un grupo alquilo C1-C3 ;
Cada Y es independientemente un enlace, O, S o N-R;
Cada i es independientemente de 0 a 100, de 1 a 100, de 1 a 75, de 1 a 60, de 1 a 55, de 1 a 50, de 1 a 45, de 1 a 40, de 2 a 35, de 3 a 30, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 1, 2, 3, 4 o 5;
D es
Figure imgf000027_0002
-(CH2V -;
Figure imgf000027_0003
o un enlace, o D puede ser
Figure imgf000027_0004
o un enlazador de polipropilenglicol o polipropileno-co-polietilenglicol que tiene entre 1 y 100 unidades de glicol (de 1 a 75, de 1 a 60, de 1 a 55, de 1 a 50, de 1 a 45, de 1 a 40, de 2 a 35, de 3 a 30, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 1, 2, 3, 4 o 52 y 50, 3 y 45);
con la condición de que Z, Z' y D no sean cada uno simultáneamente enlaces;
j es de 1 a 100, de 1 a 75, de 1 a 60, de 1 a 55, de 1 a 50, de 1 a 45, de 1 a 40, de 2 a 35, de 3 a 30, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 1,2, 3, 4 o 5;
m (en este contexto) es un número entero de 1 a 100, de 1 a 75, de 1 a 60, de 1 a 55, de 1 a 50, de 1 de 1 a 40, de 2 a 35, de 3 a 30, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 1,2, 3, 4 o 5; y
n (en este contexto) es un número entero de aproximadamente 1 a 100, de aproximadamente 1 a 75, de aproximadamente 1 a 60, de aproximadamente 1 a 50, de aproximadamente 1 a 45, de aproximadamente
1 a 35, de aproximadamente 1 a 25, de aproximadamente 1 a 20, de aproximadamente 1 a 15, de 2 a 10, de aproximadamente 4 a 12, de aproximadamente 5 a 10, de aproximadamente 4 a 6, de aproximadamente
1 a 8, de aproximadamente 1 a 6, de aproximadamente 1 a 5, de aproximadamente 1 a 4, de aproximadamente 1 a 3, etc.).
m' es de 1 a 100, de 1 a 75, de 1 a 60, de 1 a 55, de 1 a 50, de 1 a 45, de 1 a 40, de 2 a 35, de 3 a 30, de 1 a
15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 1, 2, 3, 4 o 5;
m'' es un número entero entre 0 a 25, preferentemente de 1 a 10, de 1 a 8, 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
n' es de 1 a 100, de 1 a 75, de 1 a 60, de 1 a 55, de 1 a 50, de 1 a 45, de 1 a 40, de 2 a 35, de 3 a 30, de 1 a
15, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, 1, 2, 3, 4 o 5;
X1 es O, S o N-R;
R es como se ha descrito anteriormente;
Ra es H, alquilo C1-C3 o alcanol, o forma un anillo cíclico con R3 (prolina) y R3 es una cadena lateral derivada de un aminoácido seleccionado preferentemente del grupo que consiste en alanina (metilo), arginina (propilenoguanidina), asparagina (metilenocarboxiamida), ácido aspártico (ácido etanoico), cisteína (tiol, di-tiol reducido u oxidado), glutamina (etilcarboxiamida), ácido glutámico (ácido propanoico), glicina (H), histidina (metilenoimidazol), isoleucina (1-metilpropano), leucina (2-metilpropano), lisina (butilenoamina), metionina (etilmetiltioeter), fenilalanina (bencilo), prolina (R3 forma un anillo cíclico con Ra y el grupo de nitrógeno adyacente para formar un grupo pirrolidina), serina (metanol), treonina (etanol, 1-hidroxietano), triptófano (metilenindol), tirosina (metilenfenol) o valina (isopropilo).
[MULTICON] es un grupo conector multifuncional o molécula de acuerdo con la estructura química:
Figure imgf000029_0001
en la que Y4 es C-H o N; y
Cada X'' se deriva independientemente de un grupo electrófilo o nucleófilo, preferentemente (CH2VO, (CH2)n''NRCON, (CH2)n"S,
(CH2V, (CH2)n-C=O o un grupo [CON];
el sustituyente RCON es H o un alquilo C1-C3 , preferentemente H o CH3 y
n'' es 0, 1, 2 o 3.
El grupo o molécula conectora difuncional [CON] opcional, si está presente, es un resto de acuerdo con la estructura química:
Figure imgf000030_0001
en la que X2 es O, S, NR4, S(O), S(O)2 , -S(O)2O, -OS(O)2 , u OS(O)2O;
X3 es NR4, O o S; y
R4 es H, un grupo C1-C3 o alcanol, o un grupo -C(O)(Ci-C3); o
una sal, solvato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo.
En aspectos preferidos de la invención, el extremo de unión inmunitaria [IBT] es CP33, indicado anteriormente. En aspectos preferidos de la invención, [CBT] es
Figure imgf000030_0002
en la que k es un número entero de 0 a 20, de 1 a 20, de 1 a 8, de 2 a 6, de 3 a 5, de 3 a 4,1, 2, 3, 4, 5 o 6.
En ciertos aspectos preferidos, el resto conector multifuncional [MULTICON] es un grupo 1,3,5-triazinilo de acuerdo con la estructura:
Figure imgf000030_0003
en la que cada X" es independientemente O, S, C=O, o NRCON,
y RCON es H o CH3 , preferentemente H.
En ciertos aspectos preferidos, el compuesto contiene un resto conector difuncional [CON] de acuerdo con la estructura:
Figure imgf000031_0001
grupo que puede unirse covalentemente en
Figure imgf000031_0002
con un grupo IBT o un grupo CBT, o como alternativa, está unido preferentemente a dos grupos enlazadores para formar un grupo enlazador extendido o directamente a un grupo [IBT] o [CBT]. En ciertos aspectos preferidos adicionales, el grupo [CON] es
En ciertas realizaciones, [CON] es a menudo un
Figure imgf000031_0003
grupo;
en el que CL es
Figure imgf000031_0004
m en CL es un numero entero de 0 a 12, a menudo 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
e iL es 0 o 1, a menudo 1;
En ciertas realizaciones, este grupo [CON] a menudo se une a través de la amina del triazol a la estructura anular de [MULTICON].
En aún otros aspectos, el grupo enlazador es un resto oligo o de polietilenglicol de la estructura:
Figure imgf000031_0005
en la que m es de 1 a 100 o como se describe de otro modo en el presente documento, preferentemente de 1 a 12, de 2 a 10, de 4 a 8, de 2 a 6, de 8 a 12, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11 o 12. Cabe apreciar aquí que los enlazadores de polipropilenglicol o polietilenglicol-co-polipropilenglicol (copolímeros de bloque en los que la porción de polietilenglicol del bloque tiene de 1 a 12 unidades de polietilenglicol de longitud y dicha porción de polipropilenglicol del bloque tiene de 1 a 12 unidades de polipropilenglicol de longitud, siendo el numero total de unidades de copolímero de bloque de 1 a 100, de 1 a 50, de 1 a 25, de 1 a 15, de 1 a 12, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12) pueden estar sustituidos por grupos PEG en los presentes compuestos. Este grupo también puede unirse a dos grupos enlazadores adicionales para proporcionar grupos enlazadores extendidos o directamente a uno o dos grupos funcionales [IBT] y/o [CBT].
Los compuestos preferidos de acuerdo con la presente invención se exponen en la figura 2 adjunta. Otros compuestos preferidos basados en estos compuestos eliminan preferentemente el resto de biotina de los compuestos en la figura 2 (que están presentes para su uso como indicador en estos compuestos ilustrados) al unir, por ejemplo, el grupo [IBT] del compuesto 1 a un aminoácido o dipéptido tal como glicina o alanina o glicina alanina para proporcionar compuestos finales, o como en los compuestos 2 y 3, protegiendo en los extremos el grupo lisina (preferentemente el grupo carboxílico con una amina para formar la amida como se describe de otro modo en el presente documento o la amina con un grupo acilo, también como se describe en el presente documento).
Las composiciones farmacéuticas que comprenden combinaciones de una cantidad eficaz de al menos un compuesto quimérico trifuncional SyAM de acuerdo con la presente invención, y uno o más de los compuestos como se describe de otro modo en el presente documento, todos en cantidades eficaces, en combinación con una cantidad farmacéuticamente eficaz de un vehículo, aditivo o excipiente, representan un aspecto adicional de la presente invención.
Las composiciones de la presente invención pueden formularse de una manera convencional usando uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables y también se pueden administrar en formulaciones de liberación controlada. Los vehículos farmacéuticamente aceptables que se pueden usar en estas composiciones farmacéuticas incluyen, pero sin limitación, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana, sustancias tamponantes tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de prolamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, copolímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y lanolina.
Las composiciones de la presente invención pueden administrarse por vía oral, parenteral, mediante pulverización por inhalación, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un depósito implantado. El término "parenteral", como se usa en el presente documento, incluye inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal o técnicas de infusión. Preferentemente, las composiciones se administran por vía oral, intraperitoneal o intravenosa.
Las formas inyectables estériles de las composiciones de la presente invención pueden ser una suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones pueden formularse de acuerdo con técnicas conocidas en la materia usando agentes de dispersión o humectación y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril puede ser también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente atóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, en forma de una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, se usan convencionalmente aceites fijos estériles en forma de un disolvente o un medio de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite suave no volátil, incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como el ácido oleico y sus derivados de glicéridos, son útiles en la preparación de inyectables, como lo son los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones oleosas también pueden contener un diluyente o dispersante alcohólico de cadena larga, tal como Ph. Helv o alcohol similar.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse por vía oral en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable, incluyendo, pero sin limitación, cápsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de los comprimidos para uso oral, los vehículos comúnmente utilizados incluyen lactosa y almidón de maíz. Típicamente, también se añadan agentes lubricantes, tal como estearato de magnesio. Para la administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz deshidratado. Cuando se necesitan suspensiones acuosas para uso oral, el principio activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también se pueden añadir ciertos agentes edulcorantes, saporíferos o colorantes.
Como alternativa, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse en forma de supositorios para administración rectal. Estos pueden prepararse mezclando el agente con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperatura ambiente, pero líquido a temperatura rectal y, por lo tanto, se derretirá en el recto para liberar el fármaco. Dichos materiales incluyen manteca de cacao, cera de abeja y polietilenglicoles.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden administrarse por vía tópica, en especial, para el tratamiento de cánceres de piel, psoriasis u otras enfermedades que se producen en o sobre la piel. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas áreas u órganos. La aplicación tópica para el tracto intestinal inferior puede lograrse en una formulación de supositorio rectal (véase lo anterior) o en una formulación de enema adecuada. También pueden usarse parches transdérmicos aceptables para la vía tópica.
Para aplicaciones tópicas, las composiciones farmacéuticas pueden formularse en una pomada adecuada que contenga el principio activo suspendido o disuelto en uno o más vehículos. Los vehículos para administración tópica de los compuestos de la presente invención incluyen, pero sin limitación, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua.
Como alternativa, las composiciones farmacéuticamente pueden formularse en una loción o crema adecuada que contenga los componentes activos suspendidos o disueltos en uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos adecuados incluyen, pero sin limitación, aceite mineral, monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, ésteres cetílicos de cera, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.
Para uso oftálmico, las composiciones farmacéuticas pueden formularse como suspensiones micronizadas en suero salino isotónico estéril con pH ajustado o, preferentemente, como soluciones en solución salina estéril isotónica de pH ajustado, tanto con un conservante como sin él, tal como cloruro de benzalconio. Como alternativa, para usos oftálmicos, las composiciones farmacéuticas pueden formularse en una pomada, tal como vaselina.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden administrarse mediante aerosol nasal o inhalación. Dichas composiciones se preparan de acuerdo con técnicas bien conocidas en la especialidad de formulación farmacéutica y pueden prepararse en forma de soluciones en suero salino, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para potenciar la biodisponibilidad, fluorocarbonos y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales.
La cantidad de compuesto en la composición farmacéutica de la presente invención que puede combinarse con los materiales portadores para producir una forma de dosificación unitaria variará dependiendo del huésped y de la enfermedad tratada, del modo particular de administración. Preferentemente, las composiciones deben formularse para que contengan entre aproximadamente 0,05 miligramos y aproximadamente 750 miligramos o más, más preferentemente de aproximadamente 1 miligramo a aproximadamente 600 miligramos, e incluso más preferentemente de aproximadamente 10 miligramos a aproximadamente 500 miligramos de principio activo, en solitario o junto con al menos un compuesto no atrayente de anticuerpos adicional que se puede usar para tratar el cáncer, el cáncer de próstata o el cáncer de próstata metastásico, o un efecto secundario o afección de los mismos.
debe entenderse también que los regímenes de dosificación y tratamiento específicos para cualquier paciente concreto dependerán de una diversidad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la velocidad de excreción, la combinación farmacológica, y el criterio del médico a cargo del tratamiento y la gravedad de la enfermedad o afección concreta que se está tratando.
Un paciente o sujeto (por ejemplo, un ser humano masculino) que padece cáncer puede tratarse administrando al paciente (sujeto) una cantidad eficaz de un compuesto de reclutamiento de anticuerpos quiméricos de acuerdo con la presente invención incluyendo sales, solvatos o polimorfos farmacéuticamente aceptables del mismo, opcionalmente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, ya sea en solitario o en combinación con otros agentes anticancerosos o farmacéuticos conocidos, preferentemente agentes que pueden ayudar en el tratamiento del cáncer de próstata, incluido el cáncer de próstata metastásico, o mejorar los efectos secundarios y las afecciones asociadas con el cáncer de próstata. Este tratamiento también se puede administrar junto con otras terapias convencionales contra el cáncer, tal como tratamiento de radiación o cirugía.
Estos compuestos pueden administrarse por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral, parenteral, intravenosa, intradérmica, subcutánea o tópica, en forma líquida, crema, gel o sólido, o en forma de aerosol.
El compuesto activo se incluye en el vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz para la indicación deseada, sin causar efectos tóxicos graves en el paciente tratado. Una dosis preferida del compuesto activo para todas las afecciones mencionadas en el presente documento está en el intervalo de aproximadamente 10 ng/kg a 300 mg/kg, preferentemente, de 0,1 a 100 mg/kg al día, más generalmente de 0,5 a aproximadamente 25 mg por kilogramo de peso corporal del receptor/paciente al día. Una dosis tópica típica variará entre el 0,01-3 % p/p en un vehículo adecuado.
El compuesto se administra convenientemente en cualquier forma de dosificación unitaria adecuada, Incluyendo, pero sin limitación, aquella que contiene menos de 1 mg, de 1 mg a 3000 mg, preferentemente de 5 a 500 mg de principio activo por forma de dosificación unitaria. Suele ser conveniente una dosis oral de aproximadamente 25-250 mg.
El principio activo se administra preferentemente para alcanzar concentraciones máximas en plasma del compuesto activo de aproximadamente 0,00001-30 mM, preferentemente aproximadamente 0,1-30 pM. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la inyección intravenosa de una solución o formulación del principio activo, opcionalmente, en solución salina, o un medio acuoso o administrado como un bolo del principio activo. La administración oral también es apropiada para generar concentraciones eficaces en plasma de agente activo.
La concentración de compuesto activo en la composición del fármaco dependerá de las tasas de absorción, distribución, inactivación y excreción del fármaco, así como otros factores conocidos por los expertos en la técnica. Cabe destacar que los valores de dosificación también variarán dependiendo de la gravedad de la afección que se vaya a aliviar. Además, hay que entender que, para cualquier sujeto concreto, las pautas posológicas específicas deben ajustarse con el paso del tiempo según las necesidades del individuo y del criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones y que los intervalos de concentración expuestos en el presente documento son solo ejemplares y no pretenden limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada. El principio activo puede administrarse de una vez o puede dividirse en una serie de dosis menores para su administración en intervalos de tiempo variables.
En general, las composiciones orales incluirán un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden atraparse en cápsulas de gelatina o compactarse formando comprimidos. Con el objetivo de administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Pueden incluirse como parte de la composición agentes aglutinantes y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles.
Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente, tal como almidón o lactosa, un agente dispersante, tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante, tal como estearato de magnesio o Sterotes; un emoliente, tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante, tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, esta puede contener, además del material del tipo anterior, un vehículo líquido, tal como un aceite graso. Además, las formas de dosificación unitarias pueden contener diversos materiales diferentes que modifiquen la forma física de la unidad de dosificación, por ejemplo, recubrimientos de azúcar, goma laca o agentes entéricos.
El compuesto activo o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo se pueden administrar como un componente de un elixir, suspensión, jarabe, oblea, goma de mascar o similares. Un jarabe puede contener, además de los compuestos activos, sacarosa como agente edulcorante y determinados conservantes, tintes y colorantes, y aromas.
El compuesto activo o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos también pueden mezclarse con otros materiales activos que no dificultan la acción deseada o con materiales que complementan la acción deseada, tales como agentes antineoplásicos, antibióticos, antifúngicos, antiinflamatorios o compuestos antivíricos. En ciertos aspectos preferidos de la invención, uno o más compuestos de reclutamiento de anticuerpos quiméricos de acuerdo con la presente invención son para su uso en administración conjunta con otro agente anticanceroso y/u otro agente bioactivo, como se describe de otro modo en el presente documento.
Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica, subcutánea o tópica pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminatetraacético; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. El preparado parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales multidosis hechos de vidrio o plástico.
En caso de que se administren por vía intravenosa, los vehículos preferidos son solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS).
En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán al compuesto contra su rápida eliminación del organismo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polímeros biocompatibles biodegradables, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para preparar dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica.
Las suspensiones liposómicas también pueden ser vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Pat. de EE.UU. N.° 4.522.811 (que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad). Por ejemplo, las formulaciones de liposomas se pueden preparar disolviendo el/los lípido/s apropiado/s (tales como estearoilfosfatidiletanolamina, estearoilfosfatidilcolina, aracadoilfosfatidilcolina y colesterol) en un disolvente inorgánico que después se evapora, dejando una película fina de lípido seco en la superficie del recipiente. Después se introduce una solución acuosa del compuesto activo en el recipiente. Se hace girar el recipiente a mano para liberar el material lipídico de los lados del recipiente y dispersar los agregados lipídicos, formándose así la suspensión liposómica.
Fundamento del diseño de compuestos
El primer objetivo en la construcción de dichos SyAM-P fue diseñar una molécula bifuncional apropiada capaz de unirse tanto al receptor FcyRI como a PSMA. Se razona que la unión de [CBT] (es decir, motivo de unión de PSMA) a IBT (es decir, motivo de unión a FcyRI) podría permitir que la molécula bifuncional (SyAM-P1) imite una molécula de reclutamiento de anticuerpos y, por lo tanto, sea capaz de moldear complejos ternarios entre el PSMA de superficie celular y FcyRI.
PSMA
El PSMA es una proteína de superficie celular que se sobreexpresa altamente en las células de cáncer de próstata, en comparación con las células normales de la próstata. Se han desarrollado varios ligandos de molécula pequeña que se unen a PSMA de forma selectiva y con alta afinidad, incluyendo 2-PMPA y glutamato ureas. Por consiguiente, se eligió [CBT] (resto de unión de PSMA) y se usa en la presente invención.
Para la activación inmune, se eligió dirigirse a un miembro activador inmune de la familia de receptores Fc, FcyRI, que se expresa en numerosas células del sistema inmunitario. En particular, FcyRI es un receptor inmune de la superficie celular responsable de iniciar respuestas proinflamatorias contra dianas opsonizadas por anticuerpos. Este receptor se une a la porción Fc de IgG y se expresa en la superficie de numerosas células inmunes, incluidos monocitos y macrófagos. La ligadura de este receptor conduce a respuestas proinflamatorias variadas, que incluyen fagocitosis y generación de especies reactivas de oxígeno. Las dianas que muestran múltiples copias de un motivo de unión a FcyRI inducen la reticulación del receptor y la posterior señalización, lo que da como resultado una respuesta proinflamatoria.11 Recientemente, se han informado péptidos capaces de unirse a receptores de la familia Fcgamma.121314 Específicamente, CP33, un péptido que puede unirse a FcyRI, se descubrió usando presentación en fagos.12 Por lo tanto, los inventores desarrollaron la porción IBT del SyAM preferentemente usando el péptido CP33 para permitir el reclutamiento selectivo y la activación posterior de células efectoras que expresan FcyRI.
Por consiguiente, los inventores sintetizaron en primer lugar la molécula SyAM-P1, utilizando síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc para conectar los dos restos (figura 2). Como consecuencia de esta síntesis química, los inventores intentaron determinar si la unión de los dos restos influiría en su capacidad para unirse a sus respectivas dianas proteicas, de manera selectiva (figura 3A, B). A continuación, los inventores evaluaron la capacidad de la primera generación de moléculas SyAM-P, identificadas como SyAM-P1, para unirse a PSMA en células RM1.PGLS (figura 3A) o FcyRI en células IIA1.6 (figura 3B). Estos experimentos se realizaron utilizando moléculas SyAM-P1 que se funcionalizaron con biotina, y la SyAM-P1 unida se detectó utilizando una estreptavidina marcada con fluorescencia, a través de citometría de flujo. SyAM-P1 demostró capacidad para unirse a sus respectivas dianas.
Los inventores evaluaron a continuación la capacidad de SyAM-P1 para inducir la formación de complejos ternarios, utilizando células que expresan PSMA soluble y FcyRI (células IIA1.6) (figura 3c). La unión de PSMA a las células se probó con un anticuerpo anti-PSMA de ficoeritrina y se analizó usando citometría de flujo. Los inventores encontraron que la formación del complejo ternario entre FcyRI expresado en la superficie de las células IIA1.6 y PSMA recombinante soluble está mediada por SyAM-P1.
Tomados en conjunto, estos datos indican claramente que SyAM-P1 puede interactuar con FcyRI y PSMA simultáneamente, formando así complejos ternarios en un medio celular. Esta formación de un complejo ternario imita la capacidad de un anticuerpo para unirse a su proteína diana y al receptor Fc. Estos resultados sirven como validación crítica para el diseño estructural general y el modelo computacional, en el que se basó. Además, la conexión de los dos restos de unión con un enlazador hidrófobo no anuló la capacidad de los componentes individuales de unirse selectivamente a sus respectivos compañeros.
SyAM-P1 fue capaz de unirse tanto a PSMA como a FcyRI de forma selectiva y, por lo tanto, la formación de un complejo ternario entre las dianas que muestran PSMA y las células efectoras cebadas debería inducir una respuesta proinflamatoria. A continuación, los inventores intentaron determinar si la molécula SyAM-P1 puede reticular FcyRI e inducir una respuesta inmunitaria por células efectoras inmunes. Para ese fin, para evaluar las respuestas proinflamatorias mediadas por moléculas SyAM, los inventores analizaron la explosión de superóxido y las respuestas fagocíticas de las células efectoras inmunes. (Figura 3D,E). Los inventores utilizaron una línea celular efectora monocítica inmortalizada (células U937) para evaluar las respuestas efectoras inmunitarias mediadas por SyAM-P1. Se cebaron células 937 con IFN-y, lo que induce una regulación positiva de FcyRI y ceba las células para las respuestas proinflamatorias (explosión de superóxido y fagocitosis). La explosión de superóxido se caracteriza por la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) que pueden producirse durante las respuestas proinflamatorias. La magnitud de esta respuesta se puede medir usando el ensayo de lucigenina. La fagocitosis es la inmersión activa de una diana opsonizada.
El ensayo de fagocitosis utilizado implicó la incubación de perlas fluorescentes F11 marcadas con PSMA con células U937 cebadas con IFN-y teñidas con Fl4, en presencia de SyAM-P1. La fagocitosis se observó mediante citometría de flujo y microscopía. Los resultados indicaron que SyAM-P1 fue capaz de inducir la explosión de superóxido (figura 3D) y la fagocitosis de perlas recubiertas con PSMa (figura 3E) de una manera dependiente de la dosis. En particular, SyAM-P1 fue capaz de inducir la explosión de superóxido a concentraciones de 100 nM y 1 pM, de una manera dependiente de la diana. En el ensayo de fagocitosis, el compuesto tenía una CE50 de 26 nM. Estas respuestas efectoras inmunitarias identificadas anteriormente se anularon cuando los ensayos se realizaron en presencia de un inhibidor de PSMA (2-PMPA) o un inhibidor de FcyRI (IgG). (datos no mostrados)
Los resultados evidenciaron que los resultados de la unión del complejo ternario se traducían en respuestas inmunitarias activas. Estas pruebas de experimentos de base para SyAM-P1 respaldaron la hipótesis de que una molécula completamente sintética podría inducir una respuesta inmunitaria dependiente de FcyRI contra dianas que muestran PSMA. Tanto las funciones de direccionamiento como efectoras de un anticuerpo podrían ser imitadas eficazmente por una molécula bifuncional completamente sintética.
Dado que SyAM-P1 fue capaz de inducir respuestas mediadas por células efectoras contra perlas recubiertas de proteína diana, los inventores evaluaron a continuación si la molécula puede provocar los efectos contra células que expresan PSMA. Para ese fin, los inventores evaluaron las respuestas inmunitarias inducidas por SyAM-P1 por células efectoras U937 cebadas contra células RM1.PGLS que expresan PSMA. Probaron los efectos inmunes mediados por U937 evaluando tanto la explosión de superóxido como la fagocitosis de las células efectoras, de forma análoga a los experimentos de perlas recubiertas de proteína. En este experimento, las células U937 cebadas con IFN-y se incubaron con células RM1.PGLS que expresaban PSMA y se trataron con diversas concentraciones de SyAM-P1. La respuesta de explosión de superóxido resultante se midió usando el ensayo de lucigenina (datos no mostrados). Además, las células U937 cebadas (teñidas con DiD, un tinte de membrana FL4) se incubaron con células diana RM1.PGLS (teñidas con DiI, un tinte de membrana FL1), en presencia de diversas concentraciones de SyAM-P1. La fagocitosis resultante, indicada por células positivas dobles FL1 y FL4, se midió usando citometría de flujo de dos colores. Como control positivo, se utilizó ARM-P8 combinado con anticuerpos anti-DNP. Si bien ARM-P8 fue capaz de inducir respuestas significativas, SyAM-P1 no pudo inducir ninguna respuesta inmunitaria contra las células diana (datos no mostrados). La respuesta positiva observada con el control Arm-P8 podría atribuirse potencialmente a la capacidad de los anticuerpos para ligar tanto FcyRI como FcyRIIA en las células efectoras inmunes, aumentando la señalización inmunitaria y las respuestas fagocíticas.
Dado que la molécula SyAM-P1 era capaz de inducir la fagocitosis mediada por células efectoras contra perlas marcadas con PSMA, pero incapaz de provocar respuestas similares contra células que expresan PSMA, se plantea la hipótesis de que esto puede ser el resultado de niveles diferenciales de moléculas de PSMA por pm2 de superficie de las dos dianas diferentes. (Figura 5). Estos resultados llevaron a los inventores a comparar el marcaje de PSMA en la superficie de las perlas con el de las células RM1.PGLS.
El nivel de opsonización de la célula diana es directamente proporcional a la respuesta inmunitaria mediada por células efectoras observada y, lo que es más importante, se debe alcanzar un umbral de opsonización antes de observar cualquier respuesta. Se evaluó la capacidad de SyAM-P1 para mediar la fagocitosis utilizando perlas cargadas con diversas cantidades de PSMA. El nivel de fagocitosis de perlas por células U937 cebadas se correlacionó directamente con el nivel de PSMA mostrado en la superficie. (Figura 5). El nivel de expresión de PSMA en la superficie de las células RM1.PGLS se midió con un anticuerpo anti-PSMA de ficoeritrina y se calculó con perlas de calibración fluorescentes de ficoeritrina. Las células RM1.PGLS muestran menos proteínas PSMA por pm que el nivel más bajo de microesferas analizado. (Figura 5). Las células RM1.PGLS mostraron aproximadamente 918 proteínas PSMA/um2, mientras que las perlas utilizadas en el ensayo mostraron aproximadamente 5577 proteínas PSMA/um2. Dada la correlación directa entre las respuestas efectoras y el nivel de opsonización, el nivel de expresión de PSMA en la superficie de las células diana fue insuficiente para inducir una respuesta mediada por SyAM-P1. Dado que el nivel de PSMA en la superficie se correlaciona directamente con la eficacia de la molécula SyAM-P1, a continuación, los inventores plantearon la hipótesis de que el aumento de la afinidad de la región TBT de la molécula, a través de la presentación bivalente, podría aumentar la cantidad de moléculas SyAM-P1 que se unen a la superficie con PSMA, en equilibrio. Los inventores razonaron que: al aumentar la concentración local del resto de unión de PSMA, aumentará la Kd aparente, lo que mejorará el intervalo de concentraciones eficaces y aumentará el nivel de molécula que se muestra en equilibrio.
De acuerdo con esa hipótesis, la molécula SyAM-P se rediseñó para incorporar una presentación bivalente de motivos dirigidos a PSMA con el fin de mejorar su eficacia (SyAM-P2) (figura 2, compuesto 2). Primero, verificaron la unión y compararon la afinidad de SyAM-P2 con perlas recubiertas de PSMA. Posteriormente, se evaluaron las respuestas inmunitarias mediadas por SyAM-P2 de células U937 cebadas contra perlas recubiertas de PSMA. (Figura 4a ). Por último, los inventores probaron los efectos de SyAM-P2 sobre su capacidad para inducir una respuesta de explosión de superóxido o una respuesta fagocítica en células U937 cebadas, contra células RM1.PGLS. (Datos no mostrados). La unión de SyAM-P1 a perlas recubiertas de PSMA (CE50 = 40 nM) fue menos eficaz que la de SyAM-P2 (CE50 = 26 nM).
SyAM-P2 fue capaz de inducir un nivel mucho más alto de fagocitosis (SI figura 2A) de perlas recubiertas de PSMA, con un rango de eficacia más amplio, en comparación con SyAM-P1. Alentados por estos resultados, los inventores procedieron a evaluar la capacidad de SyAM-P2 para mediar los efectos inmunes contra las células RM1.PGLS. Desafortunadamente, no se observó respuesta ni con el estallido de superóxido ni con la fagocitosis (datos no mostrados). Sin embargo, al aumentar la presentación de los motivos de unión, aumentó directamente el nivel de respuesta al estallido de superóxido y la fagocitosis contra perlas recubiertas de PSMA. Esto verificó la hipótesis de que el aumento de la valencia en el lado de unión de PSMA aumentará la Kd aparente (SI figura 4). El nivel de ligadura del FcyRI por SyAM-P2, en presencia de células, es todavía inadecuado para inducir una respuesta inmunitaria favorable y clínicamente relevante contra las células que expresan PSMA.
Los inventores también exploraron la longitud y la composición del enlazador en esta molécula de segunda generación, que mostró los resultados más sólidos cuando se utilizó el enlazador de ácido aminocaproico presentado en SyAM-P2 (SI figura 3). La segunda generación de moléculas SyAM aumentó la eficacia de los experimentos con perlas de PSMA, pero aún no pudo inducir una respuesta favorable contra las células RM1.PGLS. Los inventores plantearon la hipótesis de que esto se debe a una reticulación insuficiente del receptor Fc. Teniendo esto en cuenta, los inventores optimizaron SyAM-P2 para mejorar su eficacia a través de una presentación bivalente del motivo dirigido a PSMA y el motivo dirigido a FcyRI; esta molécula se denominó SyAM-P3 (figuras 1, 3).
A continuación, los inventores probaron los efectos inmunes inducidos por SyAM-P3 (es decir, explosión de superóxido y fagocitosis mediadas por U937) contra perlas recubiertas de PSMA (figura 4A y B). SyAM-P3 fue capaz de inducir una respuesta inmunitaria mucho mayor contra las perlas de PSMA, tanto en la generación de explosión de superóxido (figura 4A) como en la fagocitosis (figura 4b) en comparación con SyAM-P2; la respuesta fue mayor tanto en la potencia de fagocitosis como en el rango de eficacia. En los experimentos de control, se demostró que la explosión de superóxido dependía de la presencia tanto de la molécula como del marcaje con PSMA de la perla (SI figura 6). La fagocitosis de perlas podría competir tanto con 2-PMPA como con IgG humana (SI figura 5). Por último, Finalmente, los inventores también evaluaron la eficacia de SyAM-P3 para facilitar la fagocitosis mediada por U937 de células RM1.PGLS que expresan PSMA (figura 4C). En este caso, SyAM-P3 fue capaz de inducir eficazmente la fagocitosis mediada por U937, de una manera dependiente de la dosis, contra las células RM1.PGLS (figura 4C). Los inventores pudieron verificar visualmente la fagocitosis de las células RM1.PGLS, usando un citómetro de flujo (Amnis) con capacidades de adquisición de imágenes (figura 4D). Usando este método, los inventores visualizaron tanto las primeras etapas de la fagocitosis, donde se está formando la copa fagocítica, como las últimas etapas de las RM1.PGLS fagocitadas por completo. Esta fagocitosis podría competir tanto con 2-PMPA como con IgG humana (SI figura 7). No se observó respuesta con células SyAM-P3 y RM1.PGLS en el ensayo de explosión de superóxido.
Basándose en el modelo de complejo ternario, [ref] (SI Figura 4B) aumentando el número de motivos de ligadura de FcyRI, mejoró tanto la potencia como la eficacia de las moléculas SyAM-P para provocar respuestas inmunitarias dirigidas contra perlas recubiertas de PSMA. SyAM-P3 es eficaz para estimular la fagocitosis mediada por células efectoras inmunes de células que expresan PSMA. La respuesta con SyAM-P3 alcanzó su punto máximo a una concentración de 10 nM de la molécula, lo que es un cambio del pico de respuesta máxima observado con el uso de ARM-P8 y anticuerpos anti-DNP (SI figura 8). Este cambio en el máximo de equilibrio del complejo ternario muestra que esta molécula puede inducir una respuesta inmunitaria a una concentración de un orden de magnitud mejor que la molécula ARM-P8.
Análisis
Los compuestos divulgados en el presente informe de solicitud son únicos, en el sentido de que son las primeras moléculas totalmente sintéticas informadas capaces de imitar directamente la capacidad de un anticuerpo monoclonal para inducir una respuesta inmunitaria a través de FcyRI de una manera altamente específica. Dado que los SyAM de la presente invención son moléculas sintéticas capaces de provocar una respuesta inmunitaria al unirse directamente a las células inmunes, pueden mediar sus funciones independientemente de los anticuerpos endógenos, a diferencia de las moléculas ARM.8b, c Las moléculas SyAM de la presente invención funcionan a través de un único receptor de activación, FcyRI, que limita la reactividad cruzada con otros brazos del sistema inmunitario. La especificidad de la molécula para FcyRI evita la ligadura cruzada del FcYRIIb inhibidor, que se ha implicado en la disminución de la eficacia de los mAb in vivo. Al dirigirse selectivamente a la familia de receptores Fc, existe la posibilidad de una presentación cruzada de secuencias antigénicas y de provocar más respuestas inmunitarias adaptativas. Los SyAM abordan específicamente los aspectos desfavorables de los mAb tal como la falta de homogeneidad química, el alcance limitado de la diana patógena, la activación de la deposición del complemento que afecta las respuestas de Fc,15 y la dificultad para predecir el mecanismo de acción in vitro.
Síntesis químicas
La síntesis química de compuestos de acuerdo con la presente invención procede de forma escalonada preparando componentes básicos de diversos componentes y a continuación condensando estos componentes básicos entre sí para formar compuestos de acuerdo con la presente invención. Si bien la síntesis específica de compuestos identificados en la presente solicitud de patente procede de forma escalonada con componentes individuales, las diversas sustituciones que se usan pueden sustituirse fácilmente por otros componentes usando químicas análogas para sintetizar todos los compuestos de la presente invención. Los siguientes esquemas sintéticos son ejemplos de la química que se usa para preparar compuestos de acuerdo con la presente invención. Esta química se puede usar directamente o de forma análoga para preparar todos los compuestos de la presente invención.
SyAM-P1 (con biotina)
Este compuesto se sintetiza de acuerdo con el esquema de síntesis química que se presenta en la figura 15 para proporcionar SyAM-P1 de la figura 16. De acuerdo con el esquema presentado en la figura 15, el grupo CBT de triéster urea que contiene un grupo azida (presentado en el esquema de reacción para SyAM-P3 a continuación) se hace reaccionar con el ácido hexinoico acetilénico en ascorbato de sodio, sulfato de cobre, agua, terc-butanol a temperatura elevada en un microondas para formar el grupo triazol [CON] que está unido covalentemente a [CBT]. A continuación, el grupo de ácido carboxílico libre de ese intermedio se convierte en un derivado de cloruro de acilo, que se hace reaccionar con el derivado de lisina uretano en DIPEA para formar el intermedio CBT-lisina que contiene el resto uretano. La síntesis de péptidos en fase sólida coloca un grupo glicina en el ácido carboxílico de la lisina y el grupo amina se desprotege y se sustituye con un enlazador peptídico que comprende unidades de ácido amino hexanoico (la figura 2 muestra 5 unidades de ácido amino hexanoico). Este intermedio se hace reaccionar además con un grupo lisina unido a CP33 (si se desea la unión de biotina) o un aminoácido CP33 (alanina o glicina) para unir el grupo CP33 a la molécula del resto CBT (sin unión de biotina). Como alternativa, el grupo CP33 se puede unir a otro aminoácido, un oligopéptido, que incluye un dipéptido (tal como glicina alanina, glicina glicina o alanina alanina, entre otras muchas combinaciones) para proporcionar una molécula SyAM-P1.
SyAM-P2
La síntesis de SyAM-P2 procede de acuerdo con el esquema de reacción que se presenta en la figura 17. De acuerdo con esa síntesis, el dipéptido de glutamato-lisina bloqueado con triéster que contiene el grupo azido en la cadena lateral de lisina se hace reaccionar con polietilenglicol protegido en los extremos con amino que contiene un grupo acetilénico para formar el complejo CBT intermedio con una amina libre (s-2 de la figura 17). La amina libre se hace reaccionar con el resto [MULTICON] (s-3 de la figura 17) para condensar dos grupos CBT en el resto [MULTICON] S-3 como se indica en la etapa b. El intermedio resultante comprende dos grupos CBT, un enlazador que conecta los grupos [CON] de X-2 al grupo [MULTICON] (s-3) para proporcionar el intermedio S-4 (que puede variar en cuanto a la sustitución en el enlazador unido al grupo triazol [CON]) que se puede condensar con el intermedio 2-7 que contiene un grupo CP33 unido a un dipéptido u oligopéptido. El dipéptido u oligopéptido se puede proteger en los extremos para proporcionar un grupo no reactivo o se puede hacer reaccionar adicionalmente para proporcionar un resto de biotina para aplicaciones de diagnóstico/experimentales. S-7 en la figura 17 une CP33 a través de un tripéptido de alanina-lisina-lisina en el que la cadena lateral de la lisina distal se une al resto de biotina, pero se pueden realizar fácilmente modificaciones de S-7. Como alternativa, SyAM-P2 que evita la biotina puede simplemente tener la primera lisina protegida en los extremos con un grupo no reactivo (por ejemplo, amida) en lugar de extender el compuesto a otra lisina a la que está unido el resto de biotina. En la síntesis química de la figura 17, el grupo [IBT] (el intermedio S-7 que contiene CP33) se condensa en el éster activado del intermedio s-4 para unir el componente que contiene CP33 al grupo [MULTICON] al que están unidos los dos grupos enlazadores CBT (s-2). Esto da como resultado el producto final SyAM-P2, que puede contener un grupo biotina u otro componente indicador para el diagnóstico/análisis, o puede evitar la presencia de un componente indicador para su uso como agente terapéutico en el tratamiento del cáncer de próstata como se describe de otro modo en el presente documento.
SyAM-P3 (sin biotina)
Este es el compuesto preferido de acuerdo con la presente invención. Este compuesto tiene dos grupos CBT y dos grupos IBT que están unidos a través de un grupo 1,3,5-fenilo trifuncional central [MULTICON]. La síntesis de este compuesto comienza con la preparación del grupo CBT preferido (bajo el título de formación de urea) de acuerdo con el esquema de síntesis química que se presenta en la figura 17 de la misma. El análogo de glutamato protegido con diéster se hace reaccionar primero con trifosgeno seguido de un compuesto de lisina di-protegido (el grupo a-amino permanece desprotegido) para formar el intermedio tetraprotegido que se hidrogena (pd/C) para eliminar el grupo protector Cbz en la posición amina de cadena lateral de la lisina, que se convierte en un resto azida usando TfN3, sulfato de cobre y carbonato de potasio para formar la urea triprotegida que contiene un resto azida. Este compuesto es el sintón CBT utilizado en gran parte de la síntesis de los presentes compuestos porque la azida se puede condensar con un grupo acetilénico para formar fácilmente un grupo triazol [CON] que está unido directamente al resto [CBT] preferido en compuestos de acuerdo con la presente invención.
En la misma figura 17, el enlazador amino no natural se prepara a partir del compuesto de aminoácido diprotegido sintético eliminando el grupo Boc que protege la funcionalidad amina en un ácido fuerte en dioxano, seguido de la condensación de un aminoácido protegido con amina en el amino libre del aminoácido desprotegido con amina en clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y N,N-diisopropiletil amina (DIPEA) para proporcionar el tripéptido protegido con bencilo. A continuación, el grupo amina terminal del tripéptido resultante se protege (Fmoc) y el grupo bencilo se desprotege usando condiciones de hidrogenación para proporcionar el tripéptido enlazador protegido en el extremo N-terminal. Este es el primer enlazador.
El segundo enlazador se sintetiza condensando un grupo amina acetilénica en el grupo de ácido carboxílico libre del compuesto de lisina protegido con di-N (Fmoc) en presencia de EDC, HOBt y DIPEA. A continuación, el compuesto de lisina protegida acetilénica resultante se desprotege y se hace reaccionar con el primer enlazador protegido con amina obtenido anteriormente para formar el intermedio de lisina acetilénica sustituida con dienlazador que se desprotege (los dos grupos Fmoc se eliminan en dietilamina) y posteriormente se condensa con el análogo de benceno del ácido azido dicarboxílico. El análogo de benceno (que se convierte en el grupo [MULTICON] se hace reaccionar a continuación con el enlazador tripeptídico protegido con bencilo en EDC, HOBt, DIPEA para formar la fenil azida que contiene dos grupos enlazadores tripeptídicos. El resto de urea protegido con azido [CBT] preparado anteriormente se condensa con el compuesto de amina acetilénica para formar el grupo triazol [CON] en la posición azida que tiene un grupo metilenamina. Este intermedio se hace reaccionar con el enlazador tripeptídico protegido con amina para condensar el enlazador tripeptídico en el grupo amina libre del resto triazol. El grupo protector (Fmoc) en el extremo amina del enlazador tripeptídico se elimina con dietilamina. A continuación, este intermedio se condensa en el intermedio azidofenilo dienlazador [MULTICON] para proporcionar dos grupos enlazadores CBT que se han condensado en el intermedio azidofenilo [MULTICON]. El grupo azido en el intermedio fenilo se condensa en el resto acetilénico del segundo enlazador, preparado anteriormente para formar un grupo triazol como el tercer grupo en el resto fenilo [MULTICON]. Este intermedio contiene dos grupos enlazadores CBT en el resto fenilo [MULTICON] y un resto triazol [CON] en el resto [MULTICON]. El resto triazol [CON] también contiene los dos enlazadores de aminatrietilenglicol libres unidos a través de lisina y protegidos en los extremos con grupos amina que pueden condensarse con CP33 para producir el compuesto SyAM-p3 final.
Por consiguiente, CP33 se prepara para la condensación en los dos grupos amina libre haciendo reaccionar un intermedio de lisina di-bloqueado usado en la preparación del grupo urea CBT con el extremo de ácido carboxílico libre de CP33 para formar un intermedio CP33 en reacción con lisina que experimenta aminación para formar la amida libre con el grupo de ácido carboxílico sin reaccionar del grupo lisina. La amina libre de lisina en el intermedio CP33-lisina se hace reaccionar con el precursor del enlazador disuccinimido diceto para formar el intermedio ligado a CP33-lisina que contiene un grupo succinimida (como grupo saliente). Dos de estos intermedios ligados a CP33-lisina se condensan en el intermedio previamente preparado que contiene los dos grupos CBT que están unidos a través del grupo fenilo [MULTICON] y contienen dos grupos amina libre que se condensan fácilmente en el intermedio ligado a CP33-lisina que contiene el grupo éster activado con succinimido que forma el compuesto final SyAM-P3 como se expone en la figura 23.
En la figura 24 se describen enfoques alternativos para la síntesis de compuestos de acuerdo con la presente invención. La figura 24 muestra síntesis alternativas de SyAM-P2 que se pueden aplicar a otros compuestos de acuerdo con la presente invención, utilizando enlazadores alternativos como se expone en la figura. Todas las reacciones son sencillas y dan como resultado numerosos compuestos que puede verse que varían con respecto a los enlazadores utilizados.
Ejemplos
Información general
Síntesis: Todos los materiales de partida y reactivos se adquirieron en fuentes disponibles comercialmente y se usaron sin purificación adicional. Los desplazamientos de 1H RMN se miden usando el pico residual de disolvente como patrón interno (CDCb d 7,26, MeOD d 3,31), y se informan de la siguiente manera: desplazamiento químico, multiplicidad (s = singlete, sa = singlete ancho, d = doblete, t = triplete, dd = doblete de doblete, dt = doblete de triplete, c = cuadruplete, m = multiplete), constante de acoplamiento (Hz), integración. Los desplazamientos de 13C RMN se miden usando el pico residual de disolvente como patrón interno (CDCb d 77,20, MeOD d 49,00, o DMSO d 39,52), y se informan como desplazamientos químicos. Las bandas espectrales infrarrojas (IR) se caracterizan por ser anchas (a), fuertes (f), medias (m), y débiles (d).
Abreviaturas
AcOH = ácido acético
Acn = Acetonitrilo
Ahx = Ácido aminocaproico
AMC = 7-amino-4-metilcoumarina
Boc = ferc-butoxicarbonilo
BSA = albúmina sérica bovina
Cbz = benciloxicarbonilo
DCM = diclorometano
DIPEA = diisopropiletil amina
DMF = N,N-dimetilformamida
DMSO = dimetilsulfóxido
DPBS = solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco
EDC = 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
EDTA = ácido etilendiaminotetraacético, sal disódica
EGTA = ácido etilenglicol-bis(2-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraacético
EtOAc = acetato de etilo
Fmoc = 9-fluorenilmetiloxicarbonilo
HI-FBS = Suero fetal bovino inactivado por calor
HOBt = hidroxibenzotriazol
iPrOH = alcohol isopropílico
MeCN = acetonitrilo
MeOH = metanol
MTT = metil-tritilo
NHS = N-hidroxisuccinimida
NMP = N-metilpirrolidinona
Pbf = 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo
Pd/C = Paladio al 10 % sobre carbono
Cuant. = Conversión cuantitativa
TBS = Solución salina tamponada con Tris
Tbu = terc-butilo
TEA = trietilamina.
TFA = ácido trifluoroacético
TFAA = anhídrido trifluoroacético
THF = tetrahidrofurano
TiPS = triisopropilsilano
Trt = tritilo
Procedimiento general de síntesis de péptidos en fase sólida:
La síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) se realizó en un sintetizador de péptidos por microondas CEM Discover Liberty. La cantidad de resina, aminoácidos y reactivos utilizada en la síntesis se calculó utilizando protocolos sugeridos por el fabricante basados en la síntesis a escala de 0,1 mmol. Una vez finalizada la SPPS, la resina se recogió mediante filtración al vacío y se aclaró varias veces con CH2Cl2. Después del secado al aire libre, la resina se añadió después a un matraz que contenía una mezcla de cóctel de escisión (mezcla 92:4:4 de TFA:TIPS:H2O) y se agitó suavemente durante el tiempo especificado a continuación. Posteriormente, la resina se filtró a través de una pipeta con tapón de algodón, y el filtrado se recogió directamente en un tubo cónico de 50 ml que contenía 35 ml de Et2O frío (-78 °C), momento en el que se formó inmediatamente un precipitado de color blanco. La suspensión se volvió a enfriar a -78 °C y a continuación se centrifugó a 4400 rpm durante 5 minutos. Después de decantar el sobrenadante, el sedimento residual se recogió en MeCN al 50 %/H2O y se purificó usando HPLC de fase inversa en 6-7 porciones. Las fracciones de HPLC se combinaron y se liofilizaron para dar los péptidos correspondientes en forma de un material esponjoso de color blanco.
Síntesis
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Ácido 5-(1-((ff)-6-(terc-butoxi)-5-(3-((S)-1.5-di-terc-butoxi-1.5-dioxopentan-2-il)ureido)-6-oxohexil)-1H-1.2.3-triazol-4-il)pentanoico
Una mezcla de S.1 (98 mg, 0,191 mmol, 1,0 equiv.) y ácido heptinoico (120 mg, 0,954 mmol, 5 equiv.) se disolvió en una mezcla de H2O (1,25 ml) y f-BuOH (1,25 ml) en un tubo de reacción para microondas de 5 ml. A esta mezcla se le añadieron ascorbato de sodio 0,1 M (0,059 mmol, 0,2 equiv.) y sulfato de cobre (II) 0,1 M (0,012 mmol, 0,04 equiv.). El tubo se tapó, y se sometió a irradiación por microondas durante 10 minutos a 110 °C. Después, la reacción se concentró a presión reducida, y se sometió a cromatografía (1 x 15 cm de gel de sílice, MeOH al 20 % en CHCb, después MeOH al 20 % en CHCb TFA al 1 %) para producir s-x en forma de un aceite incoloro calc. para C31H53N5O9 (M+H) 640,7806 observado
SyAM-P1
Figure imgf000040_0002
Síntesis de péptidos en fase sólida estándar escala 0,1 mmol de Fmoc-VNS(Tbu)C(Trt)LLLPN(Trt)LLGC(Trt)GD(Tbu)D(Tbu)K(biotina)-Ahx5-Lys(MTT)-G-Resina. Mientras estaba en resina, el grupo Mtt se desprotegió usando TFA al 1 % en 5 ml de DCM mientras estaba en el evaporador rotatorio durante 5 minutos, se repitió tres veces, se lavó un sobrenadante de color amarillo. La resina de neutralizó con lavado con DIPEA 0,1 mM en d Mf . Sx (160 mg, 0,25 mmol, 2,5 equiv.) se disolvió en 3 ml de DMF y se añadió a la resina con HBTU (95 mg, 0,25 mmol, 2,5 equiv.) junto con 86 ul de DIPEA (64 mg, 5 mmol, 5 equiv.). La mezcla se sometió a irradiación de microondas durante 10 minutos a 75 °C. La resina se lavó 3 veces con DMF y el grupo Fmoc se desprotegió con piperidina al 20 % en DMF durante 20 minutos a TA. La desprotección global y la escisión del soporte sólido se realizó con una mezcla 92:4:4 de TFA:H2O:TIPS durante 90 minutos con agitación a temperatura ambiente. Posteriormente, la resina se filtró a través de una pipeta con tapón de algodón, y el filtrado se recogió directamente en un tubo cónico de 50 ml que contenía 35 ml de Et2O frío (-78 °C), momento en el que se formó inmediatamente un precipitado de color blanco. La suspensión se volvió a enfriar a -78 °C y a continuación se centrifugó a 4400 rpm durante 5 minutos. Después de decantar el sobrenadante, el sedimento residual se recogió en 25 ml de ACN al 20 %/H2O y 1 ml de DMSO y se añadieron 40 mg de carbonato de potasio y se agitaron al aire durante 48 horas para oxidarlo para dar disulfuro. Después de la oxidación, el péptido se purificó usando HPLC de fase inversa.
HRMS (ES+) calc. para C142H238N36O41S3 (M+3H) m/z 1601,91 observado (M+3H) 1601,53
Figure imgf000041_0001
2-(3-»S)-6-(4-(25-am¡no-2.5.8.11.14.17.20.23-octaoxapentacosm-1H-1.2.3-triazol-1-m-1-(terc-butoxn-1-oxohexan-2-ihureido)pentanodioato de (S)-di-terc-butilo (s-2)
Una mezcla de s-1 (152 mg, 0,295 mmol, 1,0 equiv.) y 3.6.9.12.15.18.21.24-octaoxaheptacos-26-in-1-amina (120 mg, 0,295 mmol, 1,0 equiv.) se disolvió en una mezcla de H2O (1,1 ml) y f-butanol (1,1 ml) en un tubo de reacción para microondas de 5 ml. A esta mezcla se le añadió ascorbato de sodio 0,1 M (0,6 ml, 0,2 equiv.) y sulfato de cobre (II) 0,1 M (0,12 ml, 0,04 equiv.). El tubo se tapó, y se sometió a radiación por microondas durante 2,5 minutos a 110 °C. Después, la reacción se concentró a presión reducida, y se sometió a cromatografía (1 x 15 cm de gel de sílice, MeOH al 10 % en CH2Cl2 , después MeOH al 10 % en CH2Cl2 + Et3N al 2,5 %) para producir s-2 (254 mg, 80 %) en forma de un aceite de color pardo. IR (película fina) 2869 (m), 1729 (f), 1680 (d), 1534 (m), 1456 (d), 1367 (m), 1252 (d), 1152 (f), 1113 (f) cm-1. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,71 (s, 1H), 5,32 (d, J = 8 Hz, 1H), 5,25 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,72-4,64 (dd, J = 8 Hz, XX Hz, 2H), 4,38-4,28 (m, 4H), 3,68-3,64 (m, 30 H), 2,98-2,93 (m, 2H), 2,35-2,28 (m, 2H), 2,08-2,05 (m, 1H), 1,97-1,77 (m, 4H), 1,65-1,59 (m, 1H), 1,46 (s, 9H), 1,43 (s, 18H), 1,49-1,27 (m, 2H). 13CRMN (100 MHz, CDCl3) d 172,5, 172,1, 156,9, 145,0, 123,0, 81,9, 81,9, 90,5, 70,6, 70,5, 70,5, 70,5, 70,4, 70,4, 70,4, 70,2, 69,6, 64,6, 53,1, 53,0, 49,9, 32,3, 31,7, 29,6, 28,3, 28,1, 28,1, 28,0, 21,9. HRMS (ES+) calc. para C43H80N6O15 (M+H) m/z 921,5754 Observado 921,5754.
Figure imgf000041_0002
Ácido 5-(4-(5-metox¡-5-oxopent¡l)-1H-1.2.3-tr¡azol-1-¡l)¡softál¡co (s-3)
Una mezcla de ácido azidoisoftálico (100 mg, 0,483 mmol, 1,0 equiv.) y hept-6-inoato de metilo (100 mg, 0,714 mmol, 1,45 equiv.) se disolvió en una mezcla de H2O (1,7 ml) y t-BuOH (1,7 ml) en un tubo de reacción para microondas de 5 ml. A esta mezcla se le añadieron ascorbato de sodio 0,1 M (0,059 mmol, 0,2 equiv.) y sulfato de cobre (II) 0,1 M (0,012 mmol, 0,04 equiv.). El tubo se tapó, y se sometió a irradiación por microondas durante 2,5 minutos a 110 °C. Después, la reacción se concentró a presión reducida, y se sometió a cromatografía (1 x 15 cm de gel de sílice, MeOH al 20 % en CHCb, después MeOH al 20 % en CHCb TFA al 1 %) para producir s-3 en forma de un sólido de color beige. IR (película fina) 3151 (d), 2951 (d), 1721 (f), 1604 (d), 1463 (d), 1291 (m), 1248 (m), 1071 (m) cm-1. 1H RMN (400 MHz, MeOD) d 8,70 (s, 1H), 8,66 (s, 2H), 8,51 (s, 1H), 3,66 (s, 3H), 2,83 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,41 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 1,81-1,70 (m, 4H). 13CRMN (100 MHz, DMSO-d6) d 173,3, 165,9, 148,3, 137,2, 133,5, 129,1, 123,7, 120,6, 118,0, 51,2, 33,0, 27,9, 24,7, 24,0. HRMS (ES+) calc. para C16H17N3O6 (M+H) m/z 348,1190 Observado 348,1184.
Figure imgf000042_0001
s-4
A una solución de s-3 (20 mg, 0,06 mmol, 1 equiv.) en 1 ml de CH2CI2 seco en un matraz de fondo redondo secado a la llama se le añadieron EDC (29 mg, 0,15 mmol, 2,5 equiv.) y HOBt (23 mg, 0,15 mmol, 2,5 equiv.), seguido de una solución de s-2 (122 mg, 0,133 mmol, 2,2 equiv.) en 1 ml de CH2Ch seco y piridina (15 ul, 0,181 mmol, 3 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 13 horas, después de lo cual se concentró a presión reducida a 37 °C y se sometió a cromatografía (gel de sílice, 2 x 15 cm, MeOH al 5 % en CHCb) para dar s-4 en forma de un aceite de color pardo pálido (90 mg, 73 %). IR (película fina) 2867 (d), 2405 (a), 1728 (f), 1661 (m), 1456 (f), 1367 (m), 1250 (d), 1149 (f), 1098 (f), 846 (d) cm-1. 1H RMN (500 MHz, MeOD) d 8,50 (s, 1H), 8,50 (s, 1H), 8,42 (t, J = 1,5 Hz, 1H), 7,96 (s, 2H), 6,36-6,33 (dd, J = 4, 4,5 Hz, 3H), 4,60 (s, 4H), 4,40 (t, J = 7,5 Hz, 4H), 4,22-4,11 (m, 4H), 3,70 (t, J = 5,5 Hz, 4H), 3,67-3,54 (m, 66 H), 2,83 (t, J = 7 Hz, 2H), 2,40 (t, J = 7 Hz, 2H), 2,37-2,27 (m, 4H), 2,07-2,00 (m, 2H), 1,96-1,89 (m, 4H), 1,84-1,70 (m, 8H), 1,69-1,61 (m, 2H), 1,47 (s, 19H), 1,44 (s, 21H), 1,41 (s, 17H), 1,40-1,34 (m, 4H). 13CRMN (100 MHz, MeOD) d 175,6, 173,7, 173,6, 173,4, 167,9, 159,9, 150,1, 146,0, 138,7, 138,0, 127,4, 125,0, 122,8, 121,8, 82,8, 82,6, 81,7, 71,6, 71,6, 71,5, 71,3, 70,8, 70,4, 65,0, 54,7, 54,1, 52,1, 51,1, 41,3, 34,4, 32,9, 32,5, 30,8, 29,8, 29,0, 28,4, 28,3, 26,0, 23,5. HRMS (ES+) calc. para C102H173N15O34 (M+H) 2153,2369 Observado (M+2H) m/z 1077,1271.
Figure imgf000042_0002
s-5
s-4 (90 mg, 0,042 mmol, 1 equiv.) se disolvió en MeOH (1 ml). A esta solución se le añadió LiOH 1 M en H2O (4 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 2 horas, después de lo cual se añadieron 4 equiv. de LiOH 1 M en H2O. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 2 horas más, después de lo cual se neutralizó con 6 equiv. de HCl 1 M en H2O. La reacción se concentró y se sometió a cromatografía (1 x 15 cm de gel de sílice, MeOH al 20 % en CHCb). Las fracciones que contenían el producto se concentraron, se recogieron con MeCN al 80 % en H2O y se purificaron usando HPLC (C18 de fase inversa, 5 ml/min, MeCN al 50 %-75 % en H2O durante 40 minutos). El producto se aisló y se liofilizó para dar s-5 en forma de un polvo de color blanco (10 mg, 12 %). IR (película fina) 3341 (a), 3108 (d), 2931 (m), 1729 (f), 1667 (f), 1556 (d), 1457 (d), 1151 (f) cm-1. 1H RMN (500 MHz, MeOD) d 8,73 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 8,51 (s, 3H), 8,42 (s, 1H), 7,97 (s, 2H), 4,64 (s, 1H), 4,60 (s, 4H), 4,41 (t, J = 7,2 Hz, 4H), 4,18 (dd, J = 5; 9 Hz, 2H), 4,13 (dd, J = 5; 8 Hz, 2H), 4,06 (s, 1H), 4,01 (s, 1H), 3,99-3,96 (m, 1H), 3,74-3,55 (m, 80H), 3,48-3,44 (m, 1H), 3,17-3,13 (m, 1H), 2,84 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,66 (s, 1H), 2,39-2,29 (m, 6H), 2,07-2,00 (m, 2H), 1,96-1,89 (m, 4H), 1,84-1,76 (m, 6H), 1,75-1,70 (m, 2H), 1,69-1,61 (m, 2H), 1,60-1,52 (m, 2H), 1,48-1,41 (m, 4H), 1,47 (s, 18H), 1,44 (s, 18H), 1,43 (s, 18H), 1,40-1,30 (m, 6H). 13CRMN (125 MHz, MeOD) d 177,2, 173,7, 173,7, 173,4, 168,0, 159,9, 138,8, 138,0, 127,4, 125,0, 122,7, 121,8, 82,8, 81,8, 71,5, 71,4, 71,4, 71,4, 71,3, 70,7, 70,5, 65,0, 54,7, 54,2, 41,3, 34,6, 32,9, 32,5, 30,8, 29,8, 29,0, 28,4, 28,3, 26,1, 25,5, 23,5. HRMS (ES+) calc. para C101H171N15O34 (M+H) m/z 2139,2213 Observado (M+2H) m/z 1070,1426.
cp33-Bis(Peg8-Urea)
s-5 (45 mg, 0,021 mmol, 1,0 equiv.) se disolvió en CH2C12. EDC, HOBt, y N-hidroxisuccinimida se añadieron secuencialmente, seguido de DIPEA, y la reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 6 horas, después de lo cual se observó conversión a través de LCMs . La reacción se concentró, y se añadió una mezcla de TFA al 95 %, PBS al 2,5 %, TIPS al 2,5 %. La reacción se dejó en agitación durante 30 minutos, después de lo cual se concentró. Se añadieron inmediatamente 1 ml de PBS y 1,5 ml de una solución saturada de bicarbonato sódico al matraz, seguido del péptido cp33 (16 mg, 0,007 mmol, 0,3 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 12 horas, y posteriormente se purificó por HPLC (C18 de fase inversa, 5 ml/min, MeCN al 30 %-42 % en H2O durante 66 minutos). Las fracciones que contenían el producto se recogieron y se liofilizaron para dar un polvo de color blanco (1,2 mg, 11,2 %).
Figure imgf000043_0001
2-(3-((S)-6-(4-(1-(9H-fluoren-9-¡l)-3.31-d¡oxo-2.7.10.13.16.19.22.25.28.35.38.41.44.47.50.53.56-heptadecaoxa-4.32-d¡azaheptapentacontan-57-¡l)-1H-1.2.3-tr¡azol-1-¡l)-1-(terc-butox¡)-1-oxohexan-2-¡l)ure¡do)pentanod¡oato de (S)-d¡-terc-but¡lo (s-6)
s-2 (90 mg, 0,135 mmol, 1 equiv.) se disolvió en 1 ml de CH2Cl2 seco en un matraz secado a la llama, y se añadieron secuencialmente EDCHCl (29 mg, 0,15 mmol, 1,1 equiv.) y HOBtH2O (23 mg, 0,15 mmol, 1,1 equiv.), seguido de una solución de Fmoc-N-amido-dPEG8-ácido (Quanta Biodesign Ltd. 138 mg, 0,15 mmol, 1,1 equiv.) en 1 ml de CH2Cl2 seco y DIPEA (28 ul, 0,162 mmol, 1,2 equiv.). La reacción se dejó en agitación durante 2,5 horas, después de lo cual se añadió 1 ml de MeOH. Después, la reacción se concentró a presión reducida y se sometió a cromatografía (gel de sílice, 1 x 15 cm, MeOH al 2,5 % en CHCb, después MeOH al 5 % en CHCb, después MeOH al 10 % en CHCb) para producir s-6 en forma de un aceite transparente (149 mg, 70 %). IR (película fina) 3332 (a), 2868 (m), 1727 (m), 1672 (d), 1547 (m), 1451 (d), 1367 (d), 1251 (m), 1149 (f), 1110 (f) cm-1. 1H RMN (500 MHz, CDCl3) d 7,75 (d, J = 7,5 Hz, 2H) 7,62 (s, 1H), 7,61 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,39 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,31 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 6,63 (s, 1H), 5,42 (s, 1H), 5,24 (d, J = 8 Hz, 1H), 5,15 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,67 (dd, J = 10 Hz, 25 Hz, 2H), 4,40 (d, J = 7 Hz, 2H), 4,37-4,27 (m, 4H), 4,22 (t, J = 7 Hz, 1H), 3,72 (t, J = 6 Hz, 2H), 3,68-3,55 (m, 66H), 3,54 (t, J = 5 Hz, 2H), 3,43 (dd, J = 5,5; 12 Hz, 2H), 3,39 (dd, J = 5,5; 12 Hz, 2H), 2,46 (t, J = 6 Hz, 2H), 2,37-2,24 (m, 2H) 2,10-2,03 (m, 2H), 1,95-1,76 (m, 5H), 1,64­ 1,57 (m, 1H), 1,46 (s, 9H), 1,43 (s, 18H), 1,39-1,29 (m, 2H). 13CRMN (100 MHz, CDCl3) d 172,4, 172,1, 172,1, 171,4, 156.8, 145,1, 144,0, 141,3, 127,7, 127,0, 125,1, 122,9, 120,0, 81,9, 81,9, 80,6, 70,6, 70,6, 70,6, 70,5, 70,4, 70,4, 70,3, 70,3. 70,1, 69,9, 69,6, 67,3, 66,6, 64,6, 53,1, 53,0, 49,9, 47,3, 41,0, 39,2, 37,0, 32,4, 31,7, 29,6, 28,3, 28,1,28,1,28,0, 21.8. HRMS (ES+) calc. para C77H127N7O26 (M+H) m/z 1566,8904 Observado 1566,8892.
Figure imgf000043_0002
O 1' "CO-^-Bu
f-BuO,C N Ji N i. 'CCuf-B 'u
“ H H "■
2-(3-((S)-6-(4-(53-am¡no-27-oxo-2.5.8.11.14.17.20.23.30.33.36.39.42.45.48.51-hexadecaoxa-26-azatr¡pentacont¡l)-1H-1.2.3-tr¡azol-1-¡l)-1-(terc-butox¡)-1-oxohexan-2-¡l)ure¡do)pentanod¡oato de (S)-d¡-tercbut¡lo (s-7)
s-6 (135 mg) se disolvió en 3 ml de Et2NH y 3 ml de CH2Cl2. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 3 horas, después de lo cual se concentró a presión reducida y se sometió a cromatografía (gel de sílice, 2 x 15 cm, MeOH al 2,5 % en CHCb, después MeOH al 5 % en CHCb, después MeOH al 10 % en CHCb, después MeOH al 20 % en CHCb, después MeOH al 20 % en CHCb Et3N al 2,5 %) para producir s-7 en forma de un aceite transparente (86 mg, 75 %). IR (película fina). 1H RMN (400 MHz, MeOD) d 8,01 (s, 1H), 4,64 (s, 2H), 4,42 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 4,20-4,17 (m, 1H), 4,15-4,11 (m, 1H), 3,77-3,63 (m, 72H), 3,54 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 3,37 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 3,14 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 3.00 (dd. J = 7.2; 15.2 Hz. 1H). 2,61 (t, J = 6 Hz, 1H), 2,48 (t, J = 6 Hz, 2H), 2,38-2,25 (m, 2H), 2,08-2,00 (m, 1H), 1,98-1,90 (m, 2H), 1,85-1,74 (m, 2H), 1,70-1,60 (m, 1H), 1,48 (s, 9H), 1,44 (s, 18H), 1,40-1,36 (m, 2H), 1.29 (t. J = 7.2 Hz. 2H). 13CRMN (100 MHz, MeOD) d 173,9, 173,8, 173,7, 173,5, 159,9, 146,0, 125,1, 82,8, 82,7, 81,8, 71,6, 71,5, 71,5, 71,4, 71,4, 71,3, 71,3, 71,2, 71,2, 71,1, 71,1, 70,8, 70,7, 70,6, 68,5, 68,3, 67,6, 65,0, 54,7, 54,2, 52,2, 51,1, 43,7, 40,8, 40,5, 37,5, 35,7, 32,9, 32,5, 30,9, 29,0, 28,4, 28,4, 23,5. HRMS (ES+) calc. para C62H117N7O24 (M+H) m/z 1344,8223 Observado 1344,8251.
Figure imgf000044_0001
s-8
s-3 (8 mg, 0,023 mmol, 1,0 equiv.) se disolvió en CH2CI2 (1 ml). A esta solución se le añadieron EDC-HCl (15 mg, 0,076 mmol, 3,3 equiv.), H O Bt-^O (12 mg, 0,076 mmol, 3,3 equiv.), y una solución de s-7 (102 mg, 0,076 mmol, 3,3 equiv.) en CH2Cl2 (4 ml). Se añadió piridina (5,5 mg, 5,7 pl, 0,7 mmol, 3,0 equiv.), y la reacción se dejó avanzar a temperatura ambiente durante 16 horas, después de lo cual se concentró y se purificó parcialmente (1 x 15 cm, gel de sílice, MeOH al 10 % en CHCb). Las fracciones que contenían el producto se concentraron y se recogieron inmediatamente con MeOH (1 ml). Se añadió LiOH 1 M en H2O (92 pl, 0,092 mmol, 4 equiv.) a la solución, y la reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 3 horas, después de lo cual se añadió LiOH 1 M en H2O (92 pl, 0,092 mmol, 4 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 2 horas más, después de lo cual se neutralizó con HCl 1 M en H2O (138 ml, 0,138 mmol, 6,0 equiv.). La reacción se concentró, se recogió con MeCN al 80 % en H2O, y se purificó por HPLC (fase inversa, C18, 5 ml/min, MeCN al 50 %-75 % en H2O durante 40 minutos). El producto se aisló y se liofilizó para producir s-8 en forma de un polvo de color blanco (8 mg,). IR (película fina) 2873 (m), 1729 (m), 1666 (f), 1555 (d), 1456 (d), 1368 (d), 1140 (f) 950 (w), 846 (d) cm-1. 1H RMN (500 MHz, MeOD) d 8,72 (t, J = 5,2 Hz, 1H), 8,51 (f), 3H), 8,42 (s, 1H), 7,99 (s, 2H), 7,90 (f), 3H), 4,62 (s, 4H), 4,41 (t, J = 7 Hz, 4H), 4,18 (dd, J = 5; 7,2 Hz, 2H), 4,13 (dd, J = 5; 6 Hz, 2H), 3,71-3,69 (m, 10H), 3,66-3,57 (m, 118H), 3,52 (t, J = 5,5 Hz, 4H), 3,36-3,34 (m, 8H), 2,84 (t, J = 6 Hz, 2H), 2,44 (t, J = 6,2 Hz, 4H), 2,37 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,33-2,28 (m, 4H), 2,06­ 2,00 (m, 2H), 1,96-1,90 (m, 4H), 1,83-1,77 (m, 6H), 1,75-1,68 (m, 2H), 1,67-1,63 (m, 2H), 1,46 (s, 18H), 1,44 (s, 18H), 1,43 (s, 18H), 1,39-1,34 (m, 4H). 13CRMN (125 MHz, MeOD) d 177,2, 174,0, 173,7, 173,7, 173,5, 167,9, 159,9, 150,2, 146,0, 138,8, 138,0, 127,4, 125,1, 122,8, 121,8, 82,8, 82,7, 81,8, 79,5, 71,5, 71,5, 71,5, 71,4, 71,4, 71,4, 71,3, 71,3, 71,3, 70,7, 70,6, 70,5, 68,3, 65,0, 54,7, 54,2, 51,1,41,3, 40,4, 37,5, 34,6, 32,9, 32,5, 30,8, 29,8, 29,0, 28,4, 28,3, 28,3, 26,1, 25,5, 25,3, 23,5. HRMS (ES+) calc. para C139H245N17O52 (M+H) m/z 2985,7150 Observado (M+2H) m/z 1493,3458.
s-9
s-8 (22 mg, 0,0074 mmol, 1,0 equiv.) se disolvió en 1 ml de DMF. A esta solución se le añadieron EDC (14,2 mg, 0,074 mmol, 10,0 equiv.), HOBt (11,3 mg, 0,074 mmol, 10,0 equiv.), y NHS (8,5 mg, 0,074 mmol, 10,0 equiv.) secuencialmente, seguido de DI PEA (13,0 pl, 0,074 mmol, 10,0 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 13 horas, después de lo cual la DMF se eliminó pasando una corriente estable de N2 sobre la reacción. Una mezcla de TFA al 97,5 %/TIPS al 2,5 % se añadió al matraz, y la reacción se dejó en agitación durante 1 hora, después de lo cual el TFA se eliminó a presión reducida. La mezcla de reacción en bruto se purificó por HPLC (columna Sunfire™ Prep C18 (10 x 150 mm) usando un gradiente de MeCN al 50 % a MeCN al 80 % en H2O durante 66 min a 5 ml/min) para dar s-9 en forma de un polvo de color blanco (2,5 mg), que se usó inmediatamente para la siguiente etapa.
cp33-Bis(Peg16-Urea)
s-9 (2,5 mg, 0,9 pmol, 1,0 equiv.) se disolvió en 2 ml de PBS y 1 ml de bicarbonato sódico saturado en agua. Se añadió el péptido cp33 (2,5 mg, 0,11 mmol, 1,2 equiv.), y la reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 4 horas, después de lo cual se inyectó directamente sobre la HPLC y se purificó (columna Sunfire™ Prep C18 (10 x 150 mm) usando un gradiente de MeCN al 30 % al MeCN al 42 % en H2O durante 39 min a 5 ml/min). Las fracciones que contienen el producto se aislaron y se liofilizaron para dar un polvo de color blanco (1,4 mg, 32,5 %).
Figure imgf000044_0002
6-(6-((terc-butoxicarbon¡l)am¡no)hexanam¡do)hexanoato de bencilo (s-9)
Se disolvió ácido 6-((terc-butoxicarbonil)amino)hexanoico (2,58 g, 11,15 mmol, 1,1 equiv.) en 50 ml de DCM. A la solución se le añadieron EDC-HCl (2,14 g, 11,15 mmol, 1,1 equiv.), HOBt-H2O (1,71 g, 11,15 mmol, 1,1 equiv.), y una solución de 6-aminohexanoato de bencilo (2,24 g, 10,14 mmol, 1,0 equiv.) en CH2Cl2 (50 ml). Se añadió DIPeA (2,0 ml, 11,15 mmol, 1,1 equiv.), y la solución se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 90 min, después de lo cual la reacción se lavó con ácido cítrico al 10 % (100 ml), NaHCO3 saturado (100 ml), y salmuera (100 ml). La capa orgánica se recogió, se secó con MgSO4 y se concentró para dar s-9 (3,17 g, 73 % en bruto) en forma de un polvo de color blanco, que se llevó a la siguiente etapa sin purificación adicional.
Figure imgf000045_0001
6-(6-aminohexanamido)hexanoato de bencilo (s-10)
s-9 (3,1 g) se disolvió en 15 ml de TFA y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, después de lo cual el TFA se eliminó parcialmente a presión reducida. El aceite resultante se lavó con 150 ml de éter dietílico, y el éter se decantó cuidadosamente en tubos de centrífuga de 50 ml. Los tubos de centrífuga se centrifugaron a 3,0 rcf durante 10 minutos, dando como resultado la sedimentación del producto en el fondo, y la capa etérea se eliminó cuidadosamente. Los productos se combinaron con metanol, se concentraron a presión reducida, y se destilaron azeotrópicamente con cloroformo deuterado para producir s-10 en forma de un aceite de color verde (2,27 g, 92 % en bruto), que se llevó a la siguiente etapa sin purificación.
Figure imgf000045_0002
1-(9H-fluoren-9-il)-3.10.17-trioxo-2-oxa-4.11.18-triazatetracosan-24-oato de bencilo (s-11)
Se disolvió ácido 6-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)hexanoico (2,39 g, 6,78 mmol, 1 equiv.) en CH2Cl2 (35 ml). A esta solución se le añadieron EDC-HCl (1,56 g, 8,14 mmol, 1,2 equiv.), y HOBt-H2O (1,25 g, 8,14 mmol, 1,2 equiv.). En un matraz separado, se disolvió s-10 (2,27 g, 6,78 mmol, 1 equiv.) en CH2Cl2 (40 ml), y se añadió DIPEA (3 ml, 17 mmol, 2,5 equiv.) para neutralizar los restos de TFA. Esta solución se añadió a la reacción original, y el matraz se lavó con 10 ml más de CH2Cl2 , que también se añadió a la reacción original. La mezcla de reacción se agitó durante 75 minutos a temperatura ambiente, después de lo cual se lavó con ácido cítrico al 10 % (100 ml), bicarbonato sódico saturado (100 ml), y salmuera saturada (100 ml). La capa orgánica se recogió, se secó con MgSO4, se concentró a presión reducida, y se purificó parcialmente (gel de sílice, 3 x 25 cm, MeOH al 5 % en CHCl3, después MeOH al 10 % en CHCb) para eliminar los reactivos de acoplamiento. Las fracciones que contenían el producto se recogieron y se sometieron a cromatografía una segunda vez (MeCN al 50 % en CHCb DlPEA al 2,5 %) para producir un sólido de color blanco, que se sometió a cromatografía una tercera vez (MeOH al 5 % en CHCb, después MeOH al 10 % en CHCb) para producir s-11 en forma de un sólido puro de color blanco (1,5 g, 33 %, 3 etapas). IR (película fina) 3306 (a), 2936 (m), 2861 (d), 1719 (f), 1647 (f), 1544 (f), 1450 (m), 1254 (f), 1160 (m), 741 (m) cm-1. 1H RMN (400 MHz, MeOD) d 7,80 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,64 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,39 (t, J = 8 Hz, 2H), 7,35-7,32 (m, 5H), 7,30 (t, J = 8 Hz, 2H), 5,10 (s, 2H), 4,33 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 4,21 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 3,16-3,08 (m, 6 H), 2,36 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,19-2,13 (m, 4H), 1,65-1,58 (m, 6H), 1,53-1,46 (m, 6H), 1,36-1,30 (m, 6H). 13CRMN (100 MHz, MeOD) d 176,0, 175,0, 158,9, 145,3, 142,6, 137,7, 129,5, 129,2, 128,8, 128,1, 126,2, 120,9, 67,6, 67,1,41,6, 40,2, 40,1,37,0, 37,0, 34,9, 30,6, 30,0, 27,5, 27,4, 27,4, 26,7, 25,7. HRMS (ES+) calc. para C40H51N3O6 (M+H) m/z 670,3850 Observado 670,3847.
Figure imgf000045_0003
Ácido 1-(9H-fluoren-9-ih-3.10.17-trioxo-2-oxa-4,11.18-triazatetracosan-24-oico (s-12)
Se recogió s-11 con iPrOH al 90 %/MeOH al 10 % (30 ml) y se añadió a una suspensión de Pd al 10 %/C en 10 ml de iPrOH al 90 %/MeOH al 10 %. Se usaron 40 ml de iPrOH al 90 %/MeOH al 10 % para añadir el material de partida restante, y el matraz se purgó con N2 durante 15 minutos. A continuación, se burbujeó gas H2 a través de la suspensión durante 5 minutos, y la reacción se dejó en agitación durante 2 horas en una atmósfera de H2 a temperatura ambiente, después de lo cual se filtró con celite y se sometió a cromatografía (3 x 25 cm de gel de sílice, MeOH al 10 % en CHCb) para producir s-12 en forma de un sólido de color blanco (580 mg, 45 %). IR (película fina) 3312 (a), 2935 (m), 2861 (d), 1705 (f), 1647 (f), 1546 (f), 1450 (d), 1255 (m) cm-1. 1H RMN (400 MHz, MeOD), 7,97 (s, 2H), 7,83 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,67 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,62 (t, J = 8 Hz, 2H), 7,35-7,32 (t, J = 8 Hz, 2H), 7,13 (s, 1H), 4,37 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 4,22 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 3,20-3,12 (m, 6H), 2,31 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,22-2,16 (m, 4H), 1,66-1,59 (m, 6H), 1,56­ 1,49 (m, 6H), 1,42-1,33 (m, 6H). 13CRMN (100 MHz, MeOD) d 177,6, 176,1, 158,9, 145,4, 142,6, 128,8, 128,2, 126,2, 121,0, 67,6, 41,6, 40,2, 37,0, 37,0, 30,6, 30,1, 27,6, 27,5, 27,4, 26,8, 26,7, 25,8. HRMS (ES+) calc. para C33H45N3O6 (M+H) m/z 580,3381 Observado 580,3377.
6-(6-(6-aminohexanamido)hexanamido)hexanoato de bencilo (s-13)
s-12 (1,17 g) se disolvió en una mezcla de 1:1 de Et2NH/CH2Cl2 (37 ml), y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 8 horas, después de lo cual se concentró a presión reducida y se sometió a cromatografía (3 x 25 cm de gel de sílice, MeOH al 20 % en CHCb, después MeOH al 20 % en CHCb Et3N al 2,5 %) para producir s-13 en forma de un sólido de color blanco (630 mg, 81 %). IR (película fina) 3221 (d), 3277 (d), 2941 (m), 2862 (d), 1727 (m), 1633 (f), 1542 (m), 1477 (d), 1262 (d), 1184 (d) cm-1. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,38-7,30 (m, 5H), 5,89 (s, 1H), 5,67 (s, 1H), 5,11 (s, 2H), 3,26-3,20 (m, 6H), 2,27 (t, J = 7,2, 2H), 2,19-2,14 (m, 4H), 1,69-1,62 (m, 6H), 1,55-1,48 (m, 6H), 1,40-1,32 (m, 6H). 13CRMN (100 MHz, CDCl3) d 173,5, 173,0, 172,9, 136,0, 128,4, 128,3, 128,2, 66,2, 41,7, 39,2, 39,1, 36,6, 36,5, 34,1,32,5, 29,3, 29,2, 26,4, 25,4, 25,1,24,5. HRMS (ES+) calc. para C25H41N3O4 (M+H) m/z 448,3170 Observado 448,3150.
Figure imgf000046_0001
Acido_____________________________________________________________________________ 6.6'-((6.6'-((6.6'-((5-azidoisoftaloil)bis(azanediil))bis(hexanoil))bis(azanediil))bis(hexanoil))bis(azanediil))dihexanoico (s-14)
Una mezcla de ácido azidoisoftálico (100 mg, 0,483 mmol, 1 equiv.) en 5 ml de CH2Cl2 seco se preparó en un matraz secado a la llama. A esta mezcla se le añadieron secuencialmente EDCHCl (233 mg, 1,21 mmol, 2,5 equiv.), HOBtH2O (183 mg, 1,21 mmol, 2,5 equiv.), s-13 (476 mg, 1,06 mmol, 2,2 equiv.), y piridina (0,117 ml, 1,45 mmol, 3 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas, después de lo cual se cargó directamente sobre una columna de gel de sílice y se purificó parcialmente para eliminar los agentes de acoplamiento (gel de sílice, 2 x 15 cm, MeOH al 10 % en CHCb). El material en bruto se disolvió en 5 ml de MeOH y 5 ml de THF. Se añadió una solución 1 M de LiOH en H2O (1,9 ml, 4 equiv.), y la reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 24 horas. Se añadió una solución de HCl 1 M (0,95 ml, 2 equiv.), y la reacción se concentró a presión reducida. A continuación, la mezcla en bruto se sometió a cromatografía (gel de sílice, 2 x 15 cm, MeOH al 20 % en CHCl3, después MeOH al 20 % en CHCb TFA al 1 %), y las fracciones que contenían el producto se recogieron y se concentraron a presión reducida para obtener un aceite de color pardo claro. A continuación, se añadieron 50 ml de éter dietílico al 95 %/MeOH al 5 % al aceite. A continuación, la mezcla de éter/MeOH se decantó, y el aceite se secó a presión reducida para obtener s-14 en forma de un sólido de color blanco (383 mg, 89 %, 2 etapas). IR (película fina) 3310 (a), 2937 (m), 2865 (d), 2112 (m), 1650 (f), 1553 (m), 1439 (d), 1202 (m), 1139 (m) cm-1. 1H RMN (400 MHz, MeOD) d 8,05 (s, 1H), 7,65 (s, 2H), 3,39 (t, J = 5,6 Hz, 4H), 3,15 (dd, J = 3,2; 6,6 Hz, 8H), 2,29 (t, 7,2 Hz, 4H), 2,22­ 2,15 (m, 8H), 1,68-1,58 (m, 16H), 1,51-1,47 (m, 8H), 1,42-1,32 (m, 12H). 13CRMN (100 MHz, MeOD) d 177,4, 176,0, 168,3, 138,1, 123,6, 121,5, 41,0, 40,2, 37,0, 34,8, 30,1, 30,1, 27,6, 27,5, 26,7, 25,7. HRMS (ES+) calc. para C44H71N9O10 (M+H) m/z 886,5397 Observado 886,5408.
Figure imgf000046_0002
2-(3-((S)-6-(4-(aminometil)-1H-1.2.3-triazol-1-il)-1-(terc-butoxi)-1-oxohexan-2-il)ureido)pentanodioato de (S)-diterc-butilo (s-15)
Una mezcla de s-1 (180 mg, 0,35 mmol, 1 equiv.) y propargilamina (117 ul, 1,75 mmol, 5 equiv.) se disolvió en una mezcla de H2O (1,25 ml) y f-butanol (1,25 ml) en un tubo de reacción para microondas de 5 ml. A la mezcla se le añadieron ascorbato de sodio 0,1 M (0,7 ml, 0,2 equiv.) y sulfato de cobre (II) 0,1 M (0,14 ml, 0,04 equiv.). El tubo se tapó, y se sometió a irradiación por microondas durante 2,5 minutos a 110 °C. Después, la reacción se concentró a presión reducida a 60 °C, y se sometió a cromatografía (gel de sílice, 1 x 15 cm, MeOH al 10 % en CHCl3, después MeOH al 10 % en CHCb Et3N al 2,5 %) para obtener s-15 en forma de un aceite de color verde pálido (152 mg, 77 %). IR (película fina) 2978 (m), 2933 (d), 1730 (f), 1647 (m), 1559 (m), 1456 (d), 1368 (m), 1255 (d), 1154 (f) cm-1.
1H RMN (400 MHz, MeOD) d 7,90 (s, 1H), 4,90 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 4,20-4,16 (m, 1H), 4,14-4,12 (m, 1H), 3,96 (s, 2H), 2,36-2,26 (m, 2H), 2,08-2,00 (m, 1H), 1,95-1,89 (m, 2H), 1,84-1,73 (m, 2H), 1,69-1,59 (m, 1H), 1,46 (s, 9H), 1,44 (s, 18H), 1,39-1,31 (m, 2H). 13CRMN (100 MHz, MeOD) d 173,7, 173,7, 173,5, 159,9, 147,7, 123,8, 82,8, 82,7, 81,8, 54,2, 51,1,37,1,32,9, 32,5, 30,8, 29,0, 28,4, 28,3, 23,5. HRMS (ES+) calc. para C27H48N6O7 (M+H) m/z 568,3657 Observado 568,3637.
Figure imgf000047_0001
2-(3-»S)-6-(4-(1-(9H-fluoren-9-m-3.10.17.24-tetraoxo-2-oxa-4.11.18.25-tetraazahexacosan-26-m-1H-1.2.3-triazol-1-in-1-(te/'c-butoxh-1-oxohexan-2-ihureido)pentanodioato de (S)-di-terc-butilo (s-16)
Una mezcla de ácido 6-((((9H-fluoren-9-¡l)metoxi)carboml)ammo)hexano¡co (156 mg, 0,267 m ml, 1 equiv.) se preparó en 1,5 ml de CH2Cl2 seco. A esta suspensión se le añadieron EDCHCl (56 mg, 0,294 mmol, 1,1 equiv.) y HOBtH2O (45 mg, 0,294 mmol, 1,1 equiv.). Una solución de s-16 (152 mg, 0,267 mmol, 1 equiv.) en 3 ml de CH2Cl2 seco, seguido de DIPEA (32 ul, 0,294 mmol, 1,1 equiv.), se añadió a esta suspensión. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 2 horas, después de lo cual se añadieron EDC-HCl (28 mg, 0,247 mmol, 0,5 equiv.), HOBt-H2O (23 mg, 0,247 mmol, 0,5 equiv.), y DIPEA (32 ul, 0,294 mmol, 1,1 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 2 horas más, después de lo cual la reacción se concentró a presión reducida y se sometió a cromatografía (gel de sílice, 2 x 15 cm, MeOH al 10 % en CHCb) para dar s-16 en forma de un aceite de color verde pálido viscoso (235 mg, 78 %). IR (película fina) 2933 (m), 2862 (d), 2413 (a), 1729 (f), 1630 (f), 1453 (f), 1367 (m), 1251 (d), 1153 (f), 742 (d) cm-1. 1H RMN (400 MHz, MeOD) d 7,84 (s, 1H), 7,80 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,64 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,39 (t, J = 8 Hz, 2H), 4,40 (d, J = 2 Hz, 2H), 4,37 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 4,33 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 4,21­ 4,17 (m, 2H), 4,13 (dd, J = 5,2; 8 Hz, 1H), 3,17-3,08 (m, 6H), 2,34-2,29 (m, 2H), 2,23-2,13 (m, 6H), 2,08-2,00 (m, 1H), 1,94-1,86 (m, 2H), 1,84-1,73 (m, 2H), 1,64-1,57 (m, 7H), 1,52-1,43 (m, 5H), 1,46 (s, 9H), 1,43 (s, 18H), 1,39-1,29 (m, 9H). 13CRMN (100 MHz, MeOD) d 176,0, 175,9, 173,7, 173,6, 173,4, 159,9, 158,8, 146,2, 145,3, 142,6, 128,8, 128,1, 126,2, 124,1, 120,9, 82,8, 82,6, 81,7, 67,6, 54,6, 54,1, 51,3, 41,6, 40,2, 37,0, 37,0, 36,7, 35,6, 32,9, 30,8, 30,6, 30,1, 29,0, 28,4, 28,3, 27,5, 27,4, 26,7, 26,7, 26,5, 23,4. HRMS (ES+) calc. para C60H91N9O12 (M+H) m/z 1130,6860 Observado 1130,6848.
Figure imgf000047_0002
2-(3-((S)-6-(4-((6-(6-(6-aminohexanamido)hexanamido)hexanamido)metil)-1H-1.2.3-triazol-1-il)-1-(terc-butoxi)-1-oxohexan-2-il)ureido)pentanodioato de (S)-di-terc-butilo (s-17)
s-16 (195 mg) se disolvió en 2,5 ml de Et2NH y 2,5 ml de CH2Cl2. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 26 horas, después de lo cual se concentró a presión reducida y se sometió a cromatografía (gel de sílice, 2 x 15 cm, MeOH al 20 % en CHCb, después MeOH al 20 % en CHCb Et3N al 2,5 %) para obtener s-17 en forma de un sólido de color amarillo pálido pegajoso (137 mg, 90 %). IR (película fina) 3271 (a), 2934 (m), 2864 (d), 1731 (f), 1643 (f), 1556 (f), 1457 (d), 1367 (m), 1256 (d), 1154 (f) cm-1. 1H RMN (400 MHz, MeOD) d 7,99 (s, 1H), 7,88 (s, 1H), 6,40 (dd, J = 12; 14 Hz, 1H), 4,42 (s, 2H), 4,41 (t, J = 9 Hz, 2H), 4,21-4,11 (m, 2H), 3,22-3,14 (m, 4H), 2,93 (t, J = 8 Hz, 2H), 2,35-2,30 (m, 2H), 2,25-2,16 (m, 6H), 2,08-2,01 (m, 1H), 1,95-1,90 (m, 1H), 1,83-1,74 (m, 2H), 1,71-1,58 (m, 9H), 1,55-148 (m, 4H), 1,48 (s, 9H), 1,45 (s, 18H), 1,42-1,29 (m, 10H). 13CRMN (100 MHz, MeOD) d 176,0, 175,7, 173.8, 173,7, 173,5, 159,9, 146,3, 124,2, 82,8, 82,7, 81,8, 81,7, 40,6, 40,2, 40,2, 37,0, 36,8, 36,6, 35,6, 32,9, 32,5, 30.8, 30,6, 30,2, 29,0, 28,4, 28,3, 27,6, 27,0, 26,8, 26,5, 26,4, 23,5. HRMS (ES+) calc. para C34H81N9O10 (M+H) m/z 908,6179 Observado 908,6165.
s-18
A una solución de s-14 (150 mg, 0,169 mmol, 1,0 equiv.) en CH2CI2 (1,5 ml) se le añadieron EDCHCl (81 mg, 0,423 mmol, 2,5 equiv.), HOBtH2O (65 mg, 0,423 mmol, 2,5 equiv.), seguido de una solución de s-15 (212 mg, 0,373 mmol, 2,2 equiv.) en CH2Cb (3,5 ml). Se añadió piridina (82 pl, 0,507 mmol, 3 equiv.) a la solución resultante, y la reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 20 horas, después de lo cual se concentró a presión reducida y se purificó parcialmente por cromatografía sobre gel de sílice (1 x 15 cm, gel de sílice, MeOH al 5 % en CHCl3, después MeOH al 10 % en CHCl3) para producir un aceite de color rojo oscuro (190 mg, 57 % en bruto) que se llevó a la siguiente etapa.
Figure imgf000048_0001
s-19
Se disolvió s-18 parcialmente puro (100 mg, 0,05 mmol, 1,0 equiv.) en H2O (1,25 ml) y t-BuOH (1,25 ml) en un vial para microondas de 5ml. A esta solución se le añadieron ácido 6-heptinoico (6,4 pl, 0,05 mmol, 1,0 equiv.), ascorbato de sodio 0,1 M (0,5 ml, 0,05 mmol, 1,0 equiv.), y sulfato de cobre (II) 0,1 M (0,25 ml, 0,025 mmol, 0,5 equiv.). El vial se cerró herméticamente y se sometió a irradiación por microondas durante 1 hora a 110 °C, después de lo cual la reacción se concentró y se purificó por HPLC (columna Sunfire™ Prep C18 (10 x 150 mm) usando un gradiente de MeCN al 50 % a MeCN al 80 % en H2O durante 66 min a 5 ml/min). El producto se aisló y se liofilizó para producir un polvo de color blanco (11 mg, 11 %). IR (película fina) 2938 (d), 1634 (f), 1553 (m), 1461 (m), 1369 (d), 1141 (f), 975 (d), 841 (d), 800 (d), 722 (d) cm-1. 1H RMN (400 MHz, MeOD) d 8,78 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 8,48 (s, 1H), 8,45 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 8,36 (s, 1H), 7,88 (s, 2H), 4,41-4,37 (m, 8H), 4,18 (dd, J = 5; 8,8 Hz, 2H), 4,12 (dd, J = 5,2; 8 Hz, 2H), 3,67-3,64 (m, 1H), 3,43 (t, J = 6,8 Hz, 4H), 3,14 (t, J = 6,4 Hz, 8H), 2,84 (t, J = 7 Hz, 2H), 2,37 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,34­ 2,29 (m, 4H), 2,26-2,13 (m, 12H), 2,08-1,99 (m, 2H), 1,95-1,87 (m, 4H), 1,84-1,71 (m, 6H), 1,69-1,54 (m, 20H), 1,50­ 1,42 (m, 10H), 1,46 (s, 18H), 1,44 (s, 18H), 1,43 (s, 18H), 1,38-1,26 (m, 12H). 13CRMN (100 MHz, MeOD) d 176,0, 173,7, 173,7, 173,5, 167,9, 159,9, 138,2, 122,6, 82,8, 82,7, 81,7, 54,6, 54,2, 40,2, 37,0, 32,9, 32,5, 30,1, 29,0, 28,4, 28,3, 27,6, 26,7, 23,4. HRMS (ES+) calc. para C105H173N21O24 (M+H) m/z 2113,3062 Observado (M+2H) 1057,1462.
s-20
Se disolvió s-19 parcialmente puro (35 mg, 0,018 mmol, 1,0 equiv.) en THF. A esta solución se le añadieron N-hidroxisuccinimidil éster de ácido trifluoroacético (19 mg, 0,09 mmol, 5,0 equiv.) y piridina (10 mg, 0,125 mmol, 7,0 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 1,5 horas, después de lo cual se interrumpió con 0,5 ml de PBS y se concentró a presión reducida. A la mezcla resultante se le añadieron 2 ml de TFA al 95 %/TIPS al 5 %, y la reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 1 hora, después de lo cual el TFA se eliminó a presión reducida. La mezcla de reacción se purificó por HPLC (columna Sunfire™ Prep C18 (10 x 150 mm) usando un gradiente de MeCN al 0 % a MeCN al 80 % en H2O durante 51 min a 5 ml/min), y las fracciones que contenían el producto se aislaron y se liofilizaron para dar s-20 (1,9 mg), que se usó inmediatamente en la siguiente reacción.
cp33-Bis(Ac3-Urea)
Se disolvió s-20 en 975 pl de PBS y 325 pl de bicarbonato sódico saturado en agua. Se añadió el péptido cp33 (2,4 mg, 0,0011 mmol, 1,1 equiv.), y la reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 7 horas, después de lo cual la mezcla de reacción se cargó directamente sobre la HPLC y se purificó (columna Sunfire™ Prep C18 (10 x 150 mm) usando un gradiente de MeCN al 0 % a MeCN al 80 % en H2O durante 51 min a 5 ml/min). Las fracciones que contenían el producto se recogieron y se liofilizaron para dar un polvo de color blanco (1,1 mg, 25,6 %).
Figure imgf000049_0001
s-21
Una solución de s-14 (190 mg, 0,214 mmol, 1,0 equiv.) se preparó en CH2CI2 (5 ml). Se añadieron EDCHCl (103 mg, 0,535 mmol, 2,5 equiv.) y HOBtH 2O (82 mg, 0,535 mmol, 2,5 equiv.), seguido de una solución de s-17 (428 mg, 0,472 mmol, 2,2 equiv.) en CH2Cl2 (5 ml). Se añadió piridina (52 pl, 0,642 mmol, 3,0 equiv.), y la reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 24 h, después de lo cual se concentró a presión reducida y se sometió a cromatografía (Gel de Sílice, 1 x 15 cm, MeOH al 10 % en CHCb, después MeOH al 15 % en CHCb, después MeOH al 20 % en CHCb) para dar un sólido parcialmente de color amarillo pálido (250 mg, 44 % en bruto).
Figure imgf000049_0002
s-22
s-21 (50 mg, 0,019 mmol, 1,0 equiv.) se disolvió en H2O (0,5 ml) y f-BuOH (0,5 ml) en un vial para microondas de 2 ml. A esta solución se le añadieron ácido 6-heptinoico (2,5 pl, 0,019 mmol, 1,0 equiv.), ascorbato de sodio 0,1 M (0,2 ml, 1,0 equiv.), y sulfato de cobre (II) 0,1 M (0,1 ml, 0,5 equiv.). El vial se cerró herméticamente y se sometió a irradiación por microondas durante 1 hora a 110 °C, después de lo cual la reacción se concentró y se sometió a cromatografía (1 x 15 cm, gel de sílice, MeOH al 20 % en CHCb, después MeOH al 20 % en CHCb TFA al 1 %). Las fracciones que contenían el producto se concentraron, se lavaron con éter dietílico (50 ml), y se destilaron azeotrópicamente con CDCb para dar un sólido de color verde parcialmente puro (27 mg) que se llevó a la siguiente etapa.
s-23
Se disolvió s-22 parcialmente puro (37 mg, 0,013 mmol, 1,0 equiv.) en DMF (0,5 ml). Se añadieron secuencialmente EDC (7,7 mg, 0,04 mmol, 3,0 equiv.), HOBt (6,2 mg, 0,04 mmol, 3,0 equiv.), y N-hidroxisuccinimida (4,6 mg, 0,04 mmol, 3,0 equiv.), seguido de DIPEA (7,1 pl, 0,04 mmol, 3,0 equiv.). La reacción se dejó en agitación durante 1 hora, después de lo cual se añadieron EDC (7,7 mg, 0,04 mmol, 3,0 equiv.) y DIPEA (7,1 pl, 0,04 mmol, 3,0 equiv.). La reacción se dejó en agitación durante 2 horas más, después de lo cual la DMF se eliminó pasando una corriente estable de N2 sobre la reacción. Se añadió 1 ml de una mezcla de TFA al 98 %/TIPS al 2 % al matraz, y la reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos, después de lo cual el TFA se eliminó a presión reducida. La reacción se purificó por HPLC (columna Sunfire™ Prep C18 (10 x 150 mm) usando un gradiente de MeCN al 0 % a MeCN al 80 % en H2O durante 51 min a 5 ml/min). Las fracciones que contenían el producto se recogieron y se liofilizaron para dar s-23 en forma de un polvo de color blanco (2,5 mg), que se usó inmediatamente en la siguiente etapa.
cp33-Bis(Ac6-Urea)
s-23 (2,5 mg, 0,86 pmol, 1,0 equiv.) se disolvió en 0,9 ml de PBS y 0,4 ml de una solución al 7,5 % de bicarbonato sódico en agua. Se añadió cp33 (2 mg, 0,65 pmol, 0,75 equiv.), y la reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 1 hora, después de lo cual se añadió 1 ml de DMF. La reacción se dejó en agitación durante 6 horas más a temperatura ambiente, después de lo cual la mezcla de reacción se inyectó directamente en la HPLC y se purificó (columna Sunfire™ Prep C18 (10 x 150 mm) usando un gradiente de MeCN al 10 % a MeCN al 65 % en H2 O durante 66 min a 5 ml/min). Las fracciones que contenían el producto se recogieron y se liofilizaron para dar cp33Bis(Ac6-Urea) en forma de un polvo de color blanco (0,2 mg, 4,5 %).
Figure imgf000050_0001
s-22
3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxaheptacos-26-in-1-amina (3 mg, 0,007 mmol, 1,0 equiv.) se añadió a un vial para microondas 2 ml, seguido de una solución de s-20 (20 mg, 0,007 mmol, 1,0 equiv.) en H2O (0,25 ml) y f-BuOH (0,25 ml). A esta solución se le añadieron ascorbato de sodio 0,1 M (70 pl, 0,007 mmol, 1,0 equiv.), y sulfato de cobre (II) 0,1 M (35 pl, 0,0035 mmol, 0,5 equiv.). El vial se cerró herméticamente y se sometió a irradiación por microondas durante 1 hora a 110 °C, después de lo cual la reacción se concentró para producir un aceite en bruto de color rojo. El aceite se recogió con TFA al 67 % en CH2Cl2 (3 ml) en un vial de 5 ml, y el vial se sometió a irradiación por microondas durante 2 minutos a 70 °C. La reacción se concentró, se recogió con MeCN al 50 % en H2O, y se purificó por HPLC (columna Sunfire™ Prep C18 (10 x 150 mm) usando un gradiente de MeCN al 50 % a MeCN al 80 % en H2O durante 66 min a 5 ml/min). El producto se aisló y se liofilizó para producir s-22 en forma de un polvo de color blanco (3 mg, 15 %). IR (película fina) 3296 (a), 2934 (m), 2864 (d), 1643 (f), 1556 (m), 1463 (d), 1202 (m), 1134 (m) cm-1. 1H RMN (500 MHz, MeOD) d 8,70 (s, 1H), 8,48 (d, J = 1,5 Hz, 2H), 8,38 (t, J = 1,5 Hz, 1H), 7,86 (s, 2H), 4,78 (s, 2H), 4,42 (d, J = 3,2 Hz, 4H), 4,39 (t, J = 7,2 Hz, 4H), 4,30 (dd, J = 5; 9 Hz, 2H), 4,27 (dd, J = 5; 8,5 Hz, 2H), 3,77-3,75 (m, 4H), 3,72-3,60 (m, 32H), 3,47 (t, J = 7,2 Hz, 4H), 3,15 (t, J = 7,2 Hz, 22H), 2,43-2,39 (m, 4H), 2,24-2,14 (m, 26H), 1,94-1,84 (m, 10H), 1,70-1,64 (m, 12H), 1,63-1,55 (m, 20H), 1,53-1,37 (m, 30H), 1,35-1,29, (m, 20H). HRMS (ES+) calc. para C129H218N28O36 (M+H) m/z 2737,6191 Observado 2737,6153.
Figure imgf000050_0002
(6-oxo-6-(prop-2-in-1-ilamino)hexano-1,5-diil)dicarbamato de (S)-bis((9H-fluoren-9-il)metilo) (s-23)
A una solución de Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (1 g, 1,69 mmol, 1,0 equiv.) en CH2Cl2 (30 ml) se le añadieron EDC-HCl (391 mg, 2,03 mmol, 1,2 equiv.), H O Bt-^O (311 mg, 2,03 mmol, 1,2 equiv.), seguido de propargilamina (93 mg, 0,11 ml, 1,69 mmol, 1,0 equiv.) y DIPEA (264 mg, 0,36 ml, 2,03 mmol, 1,2 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 90 minutos, después de lo cual la reacción se convirtió en un gel. El gel se rompió con una espátula y se recogió con CH2Cl2 (50 ml). La mezcla se sonicó y se filtró. El filtrado se recogió, se lavó con ácido cítrico al 10 % (50 ml), bicarbonato sódico saturado (50 ml), y salmuera (50 ml). La capa orgánica se recogió, se secó con MgSO4, y se concentró a presión reducida para dar s-23 en forma de un polvo de color blanco (330 mg, 31 % de rendimiento). IR (película fina) 3297 (f), 3068 (a), 2937 (a), 1687 (f), 1650 (f), 1539 (m), 1450 (d), 1264 (d) cm-1. 1H RMN (500 MHz, CDCl3) d 7,75 (t, J = 7,8 Hz, 4H), 7,56 (d, J = 7,4 Hz, 4H), 7,39 (c, J = 7,5 Hz, 4H), 7,30 (c, J = 7,5 Hz, 4H), 6,28 (s a, 1H), 5,44 (s a, 1H), 4,85 (s a, 1H), 4,43-4,35 (m, 4H), 4,21-4,30 (m, 3H), 4,02 (s, 2H), 3,25-3,15 (m, 2H), 2,18 (t, J = 2,4 Hz, 1H), 1,95-1,85 (m, 1H), 1,75-1,65 (m, 1H), 1,60-1,50 (m, 2H), 1,42-1,32 (m, 2H). 13CRMN (125 MHz, CDCl3) d 171,4, 156,9, 144,1, 144,0, 143,9, 143,8, 141,5, 141,4, 127,9, 127,8, 127,2, 127,2, 125,1, 125,1, 120,2, 120,1, 79,3, 72,0, 67,2, 66,8, 47,4, 40,3, 31,7, 29,6, 29,4, 22,3. HRMS (ES+) calc. para C39H37N3O5 (M+H) m/z 628,2806 Observado 628,2802.
Figure imgf000050_0003
(S)-2,6-diamino-N-(prop-2-in-1-il)hexanamida (s-24)
s-23 (300 mg) se disolvió en 10 ml de Et2NH y 10 ml de CH2Cl2. La reacción se dejó en agitación durante 24 horas, después de lo cual se concentró y se purificó por cromatografía en columna (MeOH al 25 % en CH2Cl2 , después MeOH al 25 % en CH2Cl2 + NH4OH al 2 %) para producir s-24 en forma de un sólido de color blanco (48 mg, 55 %). IR (película fina) 3278 (a), 2931 (m), 2861 (d), 1649 (f), 1554 (f), 1345 (d), 1262 (d), 920 (d) cm-1. 1H RMN (400 MHz, MeOD) d 3,96 (dd, J = 2,4, 7,2 Hz, 2H), 3,26 (t, J = 7 Hz, 1H), 2,71 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,59 (m, 1H), 1,69-1,61 (m, 1H), 1,58-1,47 (m, 3H), 1,46-1,34 (m, 2H). 13CRMN (100 MHz, MeOD) d 177,3, 80,1, 72,3, 55,9, 41,7, 36,0, 31,8, 29,3, 23,8. HRMS (ES+) calc. para C9H17N3O (M+H) m/z 184,1444 Observado 184,1441.
Figure imgf000051_0001
(11.19-d¡oxo-13-(prop-2-¡n-1-¡lcarbamo¡l)-3.6.9.21.24.27-hexaoxa-12.18-d¡azanonacosano-1.29-d¡¡l)d¡carbamato de (S)-b¡s((9H-fluoren-9-¡l)met¡lo) (s-25)
Fmoc-miniPEG3-COOH (164 mg, 0,38 mmol, 2,2 equiv.) se disolvió en CH2C12 (5 ml). A esta solución se le añadieron EDCHCl (84 mg, 0,44 mmol, 2,5 equiv.) y HOBtH2O (67 mg, 0,44 mmol, 2,5 equiv.). La solución resultante se transfirió a un matraz que contenía s-24 (32 mg, 0,174 mmol, 1,0 equiv.). Se añadió DIPEA (68 mg, 92 pl, 0,52 mmol, 3,0 equiv.), seguido de 1 ml de DMF. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 6 horas, después de lo cual se concentró y se sometió a cromatografía (MeOH al 5 % en CHCb) para producir un aceite transparente (122 mg, 70 %). IR (película fina) 3307 (a), 3063 (d), 2918 (f), 1712 (m), 1659 (m), 1535 (f), 1450 (d), 1253 (m), 1105 (m) cm-1. 1H RMN (500 MHz, CDCl3) d 7,76 (d, J = 7,5 Hz, 4H), 7,60 (d, J = 7,5 Hz, 4H), 7,39 (t, J = 7,5 Hz, 4H), 7,30 (t, J = 7,5 Hz, 4H), 6,97 (s a, 1H), 6,84 (s a, 1H), 5,74 (s a, 1H), 5,63 (s a, 1H), 4,44-4,38 (m, 5H), 4,21 (t, J = 7 Hz, 2H), 4,05-3,96 (m, 6H), 3,65-3,61 (m, 16H), 3,57-3,55 (m, 4H), 3,42-3,35 (m, 4H), 3,28-3,21 (m, 3H), 2,15 (t, J = 2 Hz, 1H), 1,93-1,87 (m, 1H), 1,72-1,66 (m, 1H), 1,56-1,50 (m, 2H), 1,39-1,34 (m, 2H). 13CRMN (125 MHz, CDCl3) d 171,2, 170,6, 170,1, 156,8, 144,2, 144,1, 141,5, 127,8, 127,8, 127,2, 125,3, 125,2, 120,1, 71,7, 71,1, 71,0, 70,6, 70,5, 70,5, 70,4, 70,4, 70,2, 70,2, 66,7, 66,7, 52,5, 47,4, 47,4, 41,1, 38,6, 31,5, 29,2, 23,1. HRMS (ES+) calc. para C55H67N5O13 (M+H) m/z 1007,4840 Observado 1007,4839.
Figure imgf000051_0002
(S)-MN'-(6-oxo-6-(prop-2-¡n-1-¡lam¡no)hexano-1.5-d¡¡l)b¡s(2-(2-(2-(2-am¡noetox¡)etox¡)etox¡)acetam¡da) (s-26)
s-25 (120 mg) se disolvió en 5 ml de CH2Cl2 y 5 ml de Et2NH. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 24 horas, después de lo cual se concentró y se sometió a cromatografía (1 x 15 cm de gel de sílice, MeOH al 25 % en CH2Cl2 , después MeOH al 25 % en CH2Cl2 + NH4OH al 2 %) para producir un aceite incoloro (42 mg, 63 %). IR (película fina) 3289 (a), 2865 (m), 1655 (f), 1532 (m), 1457 (d), 1103 (m) cm-1. 1H RMN (400 MHz, MeOD) d 4,40 (dd, J = 5,4, 8,8 Hz, 1H), 4,04 (s, 2H), 3,98-3,95 (m, 4H), 3,73-3,61 (m, 16H), 3,53 (dt, J = 2; 5,2 Hz, 4H), 3,24 (t, J = 7 Hz, 2H), 2,62 (t, J = 1,5 Hz, 1H), 1,89-1,80 (m, 1H), 1,76-1,68 (m, 1H), 1,59-1,52 (m, 2H), 1,43-1,33 (m, 2H). 13C RMN (100 MHz, MeOD), d 173,5, 172,6, 172,6, 80,5, 73,3, 73,2, 72,4, 72,0, 71,9, 71,6, 71,5, 71,4, 71,4, 71,2, 71,2, 71,2, 53,9, 42,1,42,1,39,7, 33,1,30,1, 29,5, 24,1. HRMS (ES+) calc. para C25H47N5O9 (M+H) m/z 562,3447 Observado 562,3448.
Figure imgf000051_0003
s-27
s-21 (162 mg, 0,091 mmol, 1 equiv.) y s-26 (34 mg, 0,091 mmol, 1 equiv.) se disolvieron en H2O (1,5 ml) y t-BuOH (1,5 ml) en un vial para microondas de 5 ml. A esta solución se le añadieron ascorbato de sodio 0,1 M (0,6 ml, 1 equiv.) y sulfato de cobre (II) 0,1 M (0,3 ml, 0,5 equiv.). El vial se cerró herméticamente y se sometió a irradiación por microondas durante 1 hora a 110 °C, después de lo cual la reacción se concentró a presión reducida para producir un aceite en bruto de color pardo. El aceite en bruto se recogió con TFA al 67 % en CH2Ch (3 ml) en un vial para microondas de 5 ml. El vial se cerró herméticamente y se sometió a irradiación por microondas durante 2 minutos a 70 °C, después de lo cual la reacción se concentró a presión reducida y se purificó usando HPLC (columna Sunfire™ Prep C18 (10 x 150 mm) usando un gradiente de MeCN al 50 % a MeCN al 80 % en H2O durante 66 min a 5 ml/min). El producto se aisló y se liofilizó para producir un polvo de color blanco (25 mg, 14 %, 2 etapas). IR (película fina) 3300 (a), 3093 (d), 2935 (m), 2866 (d), 1640 (f), 1552 (m), 1459 (d), 1201 (d), 1135 (d) cm-1. 1H RMN (500 MHz, MeOD) d 8,56 (s, 1H), 8,45 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 8,37 (t, J = 1,5 Hz, 2H), 7,86 (s, 2H), 5,49 (s, 2H), 4,58 (s, 2H), 4,45-4,40 (m, 6H), 4,39 (t, J = 7 Hz, 4H), 4,30 (dd, J = 5; 9 Hz, 2H), 4,26 (dd, J = 5; 9 Hz, 2H), 4,07 (s, 2H), 4,00 (s, 2H), 3,73-3,66 (m, 24H), 3,43 (t, J = 7 Hz, 4H), 3,23 (dt, J = 3,1; 7,5 Hz, 2H), 3,17-3,13 (m, 26H), 2,43-2,39 (m, 4H), 2,24-2,13 (m, 28H), 1,96-1,82 (m, 10H), 1,78-1,71 (m, 2H), 1,71-1,63 (m, 12H), 1,63-1,54 (m, 24H), 1,53-1,46 (m, 24H), 1,44-1,37 (m, 12H), 1,35-1,29 (m, 22H), 1,04 (d, J = 5,6 Hz, 2H). 13C RMN (125 MHz, MeOD) d 176,3, 176,1, 175,9, 175,8, 174,1, 172,6, 172,5, 171,1, 167,8, 161,5, 161,2, 160,1, 147,4, 138,6, 138,3, 127,9, 124,3, 122,7, 122,6, 118,4, 116,1, 71.8, 71,7, 71,4, 71,2, 71,2, 71,1,67,9, 67,9, 54,8, 54,2, 53,7, 53,5, 51,1,41,1,40,7, 40,6, 40,2, 39,6, 37,0, 36,8, 35,6, 32.9, 32,8, 31,1, 30,7, 30,1, 30,1, 28,8, 27,6, 27,5, 26,7, 26,5, 25,7, 24,1, 23,4, 17,6, 12,9. HRMS (ES+) calc. para C135H228N32O37 (M+3H) m/z 964,2387 Observado (M+3H) m/z 964,2380.
Bis(cp33)-Bis(Ac6-Urea)
s-27 (1,0 mg, 0,31 pmol, 1,0 equiv.) se disolvió en 0,15 ml de DMF. A esta solución se le añadió una solución de cp33-Ac-NHS (1,48 mg, 0,62 pmol, 2,0 equiv.) en 0,15 ml de DMF. Se añadió posteriormente DIPEA, y la reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 12 horas. La reacción se interrumpió con 1 ml de agua y se inyectó directamente en la HPLC y se purificó (columna Sunfire™ Prep C18 (10 x 150 mm) usando un gradiente de MeCN al 20 % a MeCN al 60 % en H2O durante 30 min a 5 ml/min) para dar un polvo de color blanco (0,4 mg, 19 %).
Evaluación biológica
Los siguientes tampones, soluciones, proteínas, anticuerpos, reactivos, equipos, materiales, software, etc., como se indica, se utilizaron para realizar la evaluación biológica.
Tampones y soluciones:
• FBS de IgG ultra-bajo
Invitrogen N.° 16250-086
• Medio RPMI-1640
Invitrogen N.° 11875-093
almacenado a 4 °C
• Medio libre de fenol RPMI-1640
Invitrogen N.° 11835-030
• Medio de crecimiento RPMI
Medio RPMI 1640
DE xxx
• DMEM-alto contenido de glucosa
XXXX
• Medio ADCP incoloro
Medio RPMI 1640, líquido
ATCC N.° 11835-030 sin rojo fenol complementado con HI-FBS ultra-bajo IgG al 10 % y penicilina al 1 %-estreptomicina
• Solución de DPBS
Invitrogen N.° 14190-144
• Solución de desprendimiento de EDTA
210 ml de DPBS
392 mg de sal disódica EDTA (5,0 mM)
84 mg de EGTA (1,0 mM)
a pH 7,4
filtro estéril de 0,22 pM
• Solución salina tamponada con Tris TBS-A con BSA al 1,5 %
Proteínas, anticuerpos y reactivos
• Proteína PSMA humana recombinante marcada con avi amablemente proporcionada por el Dr. Jan Konvalinka y el Dr. Ceril Barinka con referencia
• Fracción de IgG de conejo anti-dinitrofenil-KLH
Invitrogen N.° A6430
La solución adquirida se almacenó a 4 °C
• Estreptavidina-Alexa467 (Invitrogen)
• Penicilina-estreptomicina, Líquida (10.000 unidades de penicilina; 10.000 |jg de estreptomicina/ml) Invitrogen N.° 15140-163
• IFN-y humano recombinante
Cell signaling technologies
N.° 8901SC
• Solución de marcaje celular Vybrant DiD
Invitrogen N.° V-22887
1 mM en etanol
Fluoróforo FL-4
• Solución de marcaje celular Vybrant DiO
Invitrogen N.° V-22886
1 mM en DMF
Fluoróforo FL-1
• Tinte azul tripán al 0,4 %
Invitrogen N.° 15250
• Anticuerpo AT10 ab23336 lote N.° 902047
• Anticuerpo anti-PSMA conjugado con ficoeritrina
De Abcam N.° AB-77228
• Perlas de calibración de ficoeritrina
Bangs Laboratories Quantum™ R-PE MESF (N.° 827)
Equipos, materiales y software
• Placa inmunológica de fondo plano de 96 pocillos
MaxiSorp, no estéril, PS
Nunc N.° 442404
• Citómetro de flujo C6 Accuri
con el software CFlow
• Citómetro de flujo Amnis Imagestream X con el software de análisis IDEAS
• Software FlowJo
• Placas de Petri
BD Falcon N.° 351029
100 x 15 mm
• Placa de cultivo tisular
BD Falcon N.° 353003
100 x 20 mm
• Lector de microplacas multimodo Synergy 2
BioTek con software Gen 5
• Matraces T
BD Falcon N.° 353136
75 cm2 de cultivo tisular tratado
• Perlas de 6 uM marcadas con estreptavidina
Perlas de 6 uM YG fluoresebrite de Polysciences
-0,7 ug/ml de carga de biotina Lote N.° 601514
-1,4 ug/ml de carga de biotina Lote N.° 573565
Perlas no fluorescentes de 6 uM
-2,0 ug/ml de carga de biotina Lote N.° 621277
Lucigenina
Tokyo Chemicals
• Software Prism graphpad
Cultivo celular
Procedimientos generales:
• Recuento celular: Una suspensión celular (10 j l) se diluyó en azul tripán (0,4 %, 90 jl). Se cargaron 10 j l de esta mezcla en un hemocitómetro. Las células vivas se contaron visualmente con un aumento de 10X.
• Desprendimiento de EDTA: Las células adherentes se aspiraron y se lavaron con DPBS (5 ml). Al matraz se le añadió la solución de desprendimiento de EDTA (5 ml). El matraz se incubó (15 min). Las células se desprendieron completamente aclarando suavemente la solución sobre el fondo del matraz. La suspensión de células se sedimentó, se aspiró, se suspendió en medio y se dividió según se deseó en nuevos matraces.
• Las incubaciones se realizaron a 37 °C en una atmósfera humidificada complementada con el 5 % de CO2. • La granulación se realizó mediante centrifugación durante 5 minutos a 1100 rpm.
Líneas celulares:
• Todas las líneas celulares se cultivaron en una incubadora (37 °C) complementadas con CO2 al 5 %. El medio se cambió aproximadamente cada 4 días. Las células se dividieron aproximadamente 4:1. Las células no crecieron más allá de aproximadamente 30 pases.
• Las células U937 se adquirieron en la ATCC (N.° CRL-1593.2), se cultivaron en placas de Petri como una suspensión con medio RPMI-1640 complementado con HI-FBS al 10 % y penicilina-estreptomicina al 1 %.
• Células IIA1.6 amablemente proporcionadas por el Dr. Van de Winkel J.G.J. y el Dr. Leusen J.H.W, cultivadas en placas tratadas con cultivo tisular como células débilmente adherentes con medio RPMI-1640 complementado con HI-FBS al 10 % y penicilina-estreptomicina al 1 %.
• RM1.PGLS amablemente proporcionadas por el Dr. Michael Sadelain del Memorial Sloan Ketering Cancer Center cultivadas en placas tratadas con cultivo tisular como células adherentes con DMEM-alto contenido de glucosa complementado con HI-FBS al 10 % y penicilina-estreptomicina al 1 %
Figure imgf000054_0001
Ensayo de unión de perlas para la constante de unión de PSMA
Se evaluó la unión de cada derivado de SyAm a PSMA en perlas recubiertas de PSMA. Se incubaron perlas marcadas con estreptavidina 6 jm (Polysciences) con 400 jg/m l de proteína PSMA marcada con avi recombinante durante 30 minutos. Las perlas se lavaron dos veces con PBS, se bloquearon con 1 mg/ml de biotina durante 30 minutos y a continuación se lavaron dos veces con TBS-A. Se incubaron 105 perlas con una serie de dilución de SyAm que variaba entre 1 jM-100 pM. Se añadió Estreptavidina-Alexa467 (Invitrogen) a una concentración final de 3,3 jM . Las muestras se incubaron en hielo durante 30 minutos, se lavaron dos veces con DPBS, y se evaluaron con un citómetro de flujo Accuri C6. Para la unión a células RM1.PGLS se siguieron condiciones idénticas, sustituyendo las células RM1.PGLS por perlas.
Figure imgf000055_0001
Ensayo de unión de células que expresan IIA1.6 FcyRI
Se han preparado diluciones peptídicas en DMSO, normalmente partiendo de una solución madre 1 mM con una dilución adicional de 10 veces. Las células Ha1.6 transfectadas de forma estable con FcYRIA/cadena y y células Ha1.6 no transfectadas utilizadas como control negativo isogénico, se cultivaron a aproximadamente 1,5 - 2x106 células/ml de densidad, se centrifugaron y se reconstituyeron en medio RPMI 1640 sin rojo de fenol, complementado con FBS al 10 % y mezcla de Pen/Strep hasta una densidad celular de 1x106 células/ml. Una alícuota de 100 ul de células se transfirió adicionalmente a un tubo Eppendorf y se dejó enfriar en hielo durante 5-10 minutos. A continuación, se añadió a las células 1 ul de péptido disuelto en DMSO, llevando la concentración final de DMSO al 1 %. Después de 1 hora de incubación en hielo con un péptido, se añadieron a las células 5 ul de estreptavidina-Alexafluor 488 (2 mg/ml) y se dejaron incubando en hielo durante 30 - 60 minutos. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con 1 ml de medio RPMI1640 frío sin rojo fenol, complementado con FBS al 10 % y Pen/Strep y finalmente se lavaron una vez en 1 ml de tampón TBS (NaCl 150 mM y Tris 25 mM, pH 7,4). Las células se resuspendieron en tampón TBS residual (normalmente ~100 ul) y se analizaron mediante citometría de flujo con detección en el canal FL1.
Medición de PSMA
Las células RM1.PGLS se desprendieron con una solución de desprendimiento libre de enzimas con un pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo. Las células se resuspendieron a una concentración de 1x106 en PBS con BSA al 5 %. Esta solución celular se transfirió en alícuotas de 100 ul a tubos eppendorf y a los tubos apropiados se les añadieron 2 ul de anticuerpo anti-CD32a marcado con ficoeritrina. Los tubos Eppendorf se incubaron en hielo durante 30 minutos. Las muestras se centrifugaron a 1,1 RPM durante 5 minutos a 4 °C y se lavaron 2 veces con una solución de BSA al 5 % en PBS. Las células se procesaron en un citómetro de flujo Accuri C6 hasta que se alcanzaron 20k recuentos de células vivas. Las perlas de cuantificación de R-ficoeritrina de Bangs Laboratories se procesaron inmediatamente después de las muestras según las instrucciones del fabricante. La fluorescencia media geométrica del canal FL-2 se ingresó en la hoja de trabajo de calibración proporcionada por el fabricante y se calcularon los niveles de PSMA.
Cebado de células efectoras
Tres días antes de los experimentos, se pasó una placa de células U937 (aproximadamente un 60 % de confluencia) a una nueva placa de Petri (volumen total de medio de crecimiento RPMI coloreado de 10 ml). Se añadió IFN-y (20 pl, 100 pg/ml en DPBS), y las células se mantuvieron en una incubadora (37 °C, 24 h). Las células se sedimentaron después de 24 horas y se resuspendieron en 10 ml de IFN-y (20 ul, 100 ug/ml en DPBS) y se mantuvieron en una incubadora (37 °C, 24 h).
Para la producción de ROS, las células se resuspendieron en medio de crecimiento RPMI (10 ml) y se dividieron por igual en dos placas de Petri. A cada placa se le añadió medio de crecimiento RPMI de color adicional (5 ml) e IFN-y (20 pl, 100 pg/ml en DPBS), y se mantuvo en una incubadora (37 °C, 24 h)
Para la fagocitosis: Las células se transfirieron a un tubo Falcon y se añadió DiD (19 ul, concentración final = 1,9 pM). Las células se mantuvieron en una incubadora (37 °C, 30 min), se sedimentaron, se aspiraron, se resuspendieron en medio de crecimiento RPMI (10 ml), y se dividieron por igual en dos placas de Petri. A cada placa se le añadió medio de crecimiento RPMI de color adicional (5 ml) e IFN-y (20 pl, 100 pg/ml en DPBS), y se mantuvo en una incubadora (37 °C, 24 h).
Ensayo de producción de ROS
Se suspendieron U937 cebadas en medio ADCP incoloro a una concentración de 3 x 105 células U937 y se mezclaron con 105 perlas recubiertas con PSMA y diversas concentraciones de moléculas en una placa de 96 pocillos en un volumen de 90 ul. A cada pocillo se le añadieron 10 pl de una solución de lucigenina 2,5 mM (Tokyo Chemicals) para llevar el volumen total a 100 pl. La placa se centrifugó a 200 rcf durante 2 minutos (PLATE SPINNER). A continuación, se midió la quimioluminiscencia a intervalos de dos minutos mediante un lector de placas (Biotek Synergy 2) durante 60 a 90 minutos.
Ensayo de fagocitosis de perlas inducida por moléculas
• Se incubaron microesferas de 6 uM fluoresbrite YG de estreptavidina de Polysciences con una concentración 4x de PSMA marcado con avi durante 30 minutos a temperatura ambiente en DPBS (la concentración de PSMA marcado con avi depende de la capacidad de carga de biotina de las microesferas). Las perlas se lavaron con DPBS 2x y se resuspendieron en medio ADCP incoloro a 1,6 millones de perlas/ml
• Fagocitosis: Se añadieron 25 ul de una solución de perlas a 25 ul de medio ADCP con o sin moléculas a diversas concentraciones en un tubo eppendorf. A esto se le añadieron 50 ul de 4 millones/ml de células U937 cebadas, se mezclaron suavemente y a continuación se centrifugaron a 1,1 RPM durante 2 minutos. Las tapas se abrieron y se colocaron en una incubadora (37 °C, 1 h), momento en el que se cerraron los tubos eppendorf y se colocaron en hielo. Las muestras se agitaron vorticialmente y se procesaron en un citómetro de flujo Accuri C6 para un total de 50k recuentos.
• Análisis de datos: Para cada experimento se contaron 50.000 eventos. Los diagramas de dispersión frontal y lateral se seleccionaron de manera óptima para eliminar las partículas de desechos y los agregados celulares. En una gráfica de FL-2 frente a FL-4 se contaron las siguientes poblaciones:
Población
Figure imgf000056_0001
(células de doble positivo)
% de fagocitosis = -------------------------------------------------------------------x 100
(células diana restantes) (células de doble positivo)
Ensayo de fagocitosis de células
• Pase de células diana: Tres días antes de los experimentos, se pasó una placa de células diana, células RM1.PGLS a un nuevo matraz.
• Cebado de células efectoras: Tres días antes de los experimentos, se pasó una placa de células U937 (aproximadamente un 60 % de confluencia) a una nueva placa de Petri (volumen total de medio ADCP incoloro de 10 ml). Se añadió IFN-y (20 pl, 100 pg/ml en DPBS), y las células se mantuvieron en una incubadora (37 °C, 24 h). Las células se transfirieron a un tubo Falcon y se añadió DiD (19 ul, concentración final = 1,9 pM). Las células se mantuvieron en una incubadora (37 °C, 30 min), se sedimentaron, se aspiraron, se resuspendieron en medio ADCP de color (10 ml), y se dividieron por igual en dos placas de Petri. A cada placa se le añadieron medio ADCP de color adicional (5 ml) e IFN-y (20 pl, 100 pg/ml en DPBS), y las células se mantuvieron en una incubadora (37 °C, 24 h).
• Preparación de células diana: A una placa de células diana (60-80 % de células RM1.PGLS confluentes, 10 ml de volumen de medio total) se le añadió DiO (20 pl, concentración final = 2 pM). Las células se mantuvieron en una incubadora (37 °C, 30 min), se aspiraron y se lavaron con medio ADCP de color (3 x 10 ml). Se añadió medio ADCP de color (10 ml). Las células se mantuvieron en una incubadora (37 °C, 2 h), se separaron y se resuspendieron en medio ADCP incoloro a una concentración de 0,5 millones de células por ml.
• Preparación de células efectoras: Ambas placas de células U937 cebadas se transfirieron a un tubo Falcon, se sedimentaron, se aspiraron, se resuspendieron en medio ADCP incoloro (10 ml), se contaron y se diluyeron con medio ADCP incoloro para dar una concentración final de 2 millones de células por ml.
• Fagocitosis: Todas las condiciones se ejecutaron por triplicado. Para cada experimento, en un tubo Eppendorf estéril de 2 ml se añadieron medio ADCP incoloro (25 pl) que contenía varias concentraciones de SyAM-Px o ARM-P8/anticuerpo anti-DNP, células diana (25 pl = 12.500 células), y células efectoras (50 pl = 100.000 células), para dar una relación efectora-diana de 8:1. Los tubos se agitaron suavemente a mano. Las células se sedimentaron (2 min, 1100 rpm). Los tubos se abrieron, se mantuvieron en una incubadora (37 °C, 1 h), se resuspendieron con agitación brevemente con un vórtice, y se analizaron por citometría de flujo.
Figure imgf000056_0002
(células de doble positivo)
% de fagocitosis = --------------------------------------------------------------------- x 100
(células diana restantes) (células de doble positivo)
Imágenes Amnis Imagestream
El ensayo de fagocitosis se realizó como se ha descrito anteriormente. Después de una hora, las células se fijaron en formaldehído al 3 % durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron una vez en DPBS y a continuación se tiñeron con anticuerpos anti-CD14-APC y anti-CD11b-APC (Biolegend) durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron una vez en DPBS y a continuación se pasaron a través de un filtro de células de 70 |jm. Se recogieron 30.000 eventos por muestra en el citómetro de flujo Amnis Imagestream X. A continuación, se puntuaron manualmente los sucesos positivos dobles para la formación de copa fagocítica o la inmersión completa de la diana. Los datos se analizaron en el software Amnis IDEAS.
Referencias
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de acuerdo con la estructura química:
Figure imgf000058_0001
en la que [IBT] es un resto de unión de acuerdo con la estructura química;
Figure imgf000058_0002
Figure imgf000059_0001
Figure imgf000060_0001
[CBT] es un resto de unión celular que se une al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) de acuerdo con la estructura química
en la que Xi y X2 son cada uno independientemente CH2 , O, NH o S;
X3 es O, CH2 , NR1, S(O), S(O)2 , -S(O)2O, -OS(O)2 , u OS(O)2O;
R1 es H, un grupo alquilo C1-C3 , o un grupo -C(O)(C1-C3);
k es un número entero de 0 a 20;
L1 y L2 son grupos enlazadores, grupos que incluyen opcionalmente uno o más grupos conectores bifuncionales [CON]; elegir en el grupo que consiste en:
- L1 y L2 , cada uno independientemente, son un enlazador de acuerdo con la fórmula química:
Figure imgf000061_0001
en la que Ra es H o un alquilo C1-C3 , preferentemente CH3 , más a menudo H;
m es un número entero de 1 a 12, a menudo 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
m'' es un número entero 1, 2, 3, 4, 5 o 6, a menudo 6;
t es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6; y
iL es 0 o 1, a menudo 1,
en la que dicho enlazador, en ciertos casos, puede estar unido preferentemente a un grupo [CON] y un grupo [CBT] en un extremo, y un grupo [MULTICON] en el otro extremo;
- L1 y L2 , cada uno independientemente, son un enlazador de acuerdo con la estructura:
Figure imgf000061_0002
en la que q es un número entero de 0-12
q' es de 1 a 12, a menudo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 y
iL es 0 o 1;
- L1 y L2 están unidos entre sí para proporcionar enlazadores adicionales que a menudo se usan en compuestos de acuerdo con la presente invención:
Figure imgf000061_0003
en la que q es un número entero de 0-12, preferentemente 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
q' es de 1 a 12, a menudo 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
iL es 0 o 1; y
Rl es un aminoácido o un oligopéptido, y
- L1 y L2, cada uno independientemente, es un aminoácido, un dipéptido o un oligopéptido que contiene de 1 a 12, dipéptido de dilisina o glicinalisina, en el que, cuando la lisina se usa como un aminoácido en un enlazador oligopeptídico, la amina de alquileno de cadena lateral se usa para unir otros grupos enlazadores u otros componentes en la molécula;
- L1 y L2 , cada uno independientemente, es un grupo
Figure imgf000062_0001
enlazador de poliprolina o
Figure imgf000062_0002
enlazador de colágeno, un grupo
Figure imgf000062_0003
o un enlazador de polipropilenglicol o polipropileno-co-polietilenglicol que tiene entre 1 y 100 unidades de glicol;
en el que Ra es H, alquilo C1-C3 o alcanol, o forma un anillo cíclico con R3 (prolina) y R3 es una cadena lateral derivada de un aminoácido;
m'' es un número entero de 0 a 25;
m es un número entero de 1 a 100; y
n es un número entero de 1 a 100; y
- L1 y L2 , son cada uno independientemente un enlazador de acuerdo con la fórmula química:
Figure imgf000062_0004
en la que Z y Z' son cada uno independientemente un enlace, -(CH2)i-O, -(CH2)i-S, -(CH2)i-N-R
Figure imgf000063_0001
en las que dicho grupo -(CH2)i, si está presente en Z o Z', está unido a [MULTICON], [ABT], [CBT], o [TLR] o un grupo conector difuncional opcional [CON], si está presente;
cada R es independientemente H, o un grupo alquilo C1-C3 o alcanol;
cada R2 es independientemente H o un grupo alquilo C1-C3 ;
cada Y es independientemente un enlace, O, S o N-R;
cada i es independientemente de 0 a 100;
D es
Figure imgf000063_0002
-(CH2V-;
Figure imgf000063_0003
o un enlace, o D puede ser
Figure imgf000063_0004
o un enlazador de polipropilenglicol o polipropileno-co-polietilenglicol que tiene entre 1 y 100 unidades de glicol;
con la condición de que Z, Z' y D no sean cada uno simultáneamente enlaces;
j es de 1 a 100;
m (en este contexto) es un número entero de 1 a 100; y
n (en este contexto) es un número entero de aproximadamente 1 a 100;
m' es de 1 a 100,
m'' es un número entero entre 0 y 25;
n' es de 1 a 100;
X1 es O, S o N-R;
R es como se ha descrito anteriormente;
Ra es H, alquilo C1-C3 o alcanol, o forma un anillo cíclico con R3 (prolina) y R3 es una cadena lateral derivada de un aminoácido;
- L1 y L2 , son cada uno independientemente un enlazador basado en succinimida de acuerdo con la fórmula química:
Figure imgf000064_0001
en la que cada Xs es independientemente S, O o N-RS, preferentemente S;
RS es H o alquilo C1-3, preferentemente H;
Sc es CH2; CH2O; o CH2CH2O;
i es 0 o 1; y
mS es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
[MULTICON] es un grupo químico bifuncional o multifuncional que, cuando está presente, conecta al menos un grupo [IBT] al menos a un grupo [CBT] a través de un enlazador, siento dicho [MULTICON] un grupo conector multifuncional o molécula de acuerdo con la estructura química:
Figure imgf000064_0002
Figure imgf000065_0001
en la que Y4 es C-H o N; y
cada X'' se deriva independientemente de un grupo electrófilo o nucleófilo, preferentemente (CH2VO, (CH2)n''NRCON, (CH2)n"S,
(CH2V, (CH2)n''C=O o un grupo [CON];
el sustituyente RCON es H o un alquilo C1-C3 , preferentemente H o CH3 y
n'' es 0, 1, 2 o 3;
en la que dicho grupo [CON], si está presente, es un resto de acuerdo con la estructura química:
Figure imgf000066_0001
en la que X2 es O, S, NR4, S(O), S(O)2 , -S(O)2O, -OS(O)2 , u OS(O)2O;
X3 es NR4, O o S; y
R4 es H, un grupo alquilo C1-C3 o alcanol, o un grupo -C(O)(C1-C3)
o de acuerdo con la estructura química
Figure imgf000066_0002
m es un número entero de 0 a 12,
e iL es 0 o 1
MCON es un número entero de 0 a 10;
n y n' son cada uno independientemente un número entero de 1 a 15; y
NL1 y NL2 son cada uno un número entero de 0 a 10, con la condición de que n > NL1 y n' > NL2, o una sal o enantiómero farmacéuticamente aceptable de los mismos.
2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que MCON es 1, 2 o 3, n es 1, 2 o 3 y n' es 1 o 2.
3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicho grupo [IBT] es CP33.
4. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho grupo CBT es el grupo
Figure imgf000066_0003
en el que k es 2, 3 o 4, o una sal del mismo.
5. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que contiene un grupo [CON] de acuerdo con la estructura química:
Figure imgf000067_0001
en la que X2 es O, S, NR4, S(O), S(O)2 , -S(O)2O, -OS(O)2 , u OS(O)2O;
X3 es O, S, NR4; y
R4 es H, un grupo alquilo C1-C3 o alcanol, o un grupo -C(O)(C1-C3), o un grupo [CON] en el que dicho grupo [CON] es según la estructura química;
Figure imgf000067_0002
en la que CL es
Figure imgf000067_0003
m es un número entero de 0 a 12, a menudo 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6
e iL es 0 o 1, a menudo 1.
6. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que L1 y/o L2 es un
Figure imgf000067_0004
grupo
en el que Ra es H o CH3 ;
m es un número entero de 1 a 12;
m'' es un número entero de 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
t es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6; y
iL es 0 o 1.
7. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que L1 y/o L2 es
Figure imgf000068_0001
en las que Ra es H;
m'' es 1, 2, 3, 4, 5 o 6 y
m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12.
8. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que Li y/o L2 es un enlazador de polietilenglicol de entre 1 y 12 unidades de glicol de longitud, o un enlazador de polietilenglicol extendido a un segundo enlazador de polietilenglicol a través de un grupo [CON], en el que dicho enlazador de polietilenglicol tiene de 1 a 12 unidades de glicol de longitud, y dicho segundo enlazador de polietilenglicol tiene de 1 a 12 unidades de glicol de longitud.
9. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que es
Figure imgf000069_0001
en las que CP33 es
Figure imgf000069_0002
en la que dicho grupo de biotina está ausente opcionalmente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
10. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un compuesto quimérico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 junto con un vehículo, aditivo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
11. La composición de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicha composición comprende además una cantidad eficaz de un agente anticanceroso adicional.
12. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 en forma de dosificación oral, parenteral o tópica.
13. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-12 para su uso en el tratamiento del cáncer.
14. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en la que dicho cáncer es cáncer de próstata.
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