ES2789758T3

ES2789758T3 - Uso de butilideneftalida

Info

Publication number: ES2789758T3
Application number: ES16836466T
Authority: ES
Inventors: Shinn-Zong Lin; Tzyy-Wen Chiou; Horng-Jyh Harn; Ssu-Yin Yen
Original assignee: Everfront Biotech Inc
Current assignee: Everfront Biotech Inc
Priority date: 2015-08-19
Filing date: 2016-06-03
Publication date: 2020-10-26
Anticipated expiration: 2036-06-03
Also published as: EP3338775B1; EP3338775A4; TWI626940B; EP3338775A1; TW201707698A; WO2017028602A1; JP2017530113A

Abstract

Una preparación para su uso en la disminución de la tasa de incidencia y/o tasa de recurrencia de cáncer oral al prevenir, mitigar y/o inhibir el crecimiento, la migración, la invasión y/o la metástasis de las células madre de cáncer oral, que comprende una cantidad efectiva de butilideneftalida (BP).

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de butilideneftalida

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de butilideneftalida (BP), incluyendo la prevención, mitigación y/o inhibición del crecimiento, migración, invasión y/o metástasis de células madre de cáncer oral.

Antecedentes de la invención

En Medicina, un tumor se refiere a un efecto citopático anormal, que es causado por una reacción de varios factores cancerígenos que causa que las células en los tejidos locales del cuerpo pierdan la regulación normal del crecimiento a nivel genético y resulta en una proliferación celular anormal. Esas células proliferativas anormales se agruparán en una masa, lo cual se denomina "tumor". El "cáncer" es el tipo más común de tumor. Las "células cancerosas" anormales proliferadas no solo se agruparán en una masa, sino que también se diseminarán y harán metástasis en otros tejidos u órganos. Por lo tanto, el cáncer también se conoce como tumor maligno. La proliferación y metástasis de las células cancerosas causará anormalidades severas de la función fisiológica y es muy difícil de curar; por lo tanto, el cáncer es actualmente la primera causa de muerte a nivel mundial.

Los procedimientos tradicionales para tratar el cáncer incluyen cirugía, quimioterapia y radioterapia, etc. Sin embargo, el cáncer no se puede curar completamente por escisión quirúrgica de la masa porque las células cancerosas que no se cortan exactamente pueden crecer continuamente y provocar una exacerbación de la afección del paciente. Por lo tanto, la escisión quirúrgica no se usa sola en la terapia para el cáncer, y generalmente se combina con otros procedimientos terapéuticos como la quimioterapia y/o la radioterapia. En quimioterapia, se usan medicamentos químicos (como un agente alquilante) para matar las células cancerosas que tienen una alta tasa de proliferación. Sin embargo, la mayoría de los medicamentos químicos utilizados en las quimioterapias también actúan sobre las células normales, lo que produce efectos secundarios graves (como vómitos, alopecia, fatiga, sangrado, anemia, etc.) en pacientes con cáncer. La radioterapia (por ejemplo, radiocirugía con bisturí de rayos gamma) descompone el ADN de las células cancerosas con base en el principio de que las células cancerosas que se dividen rápidamente son más sensibles a la radiación que las células normales. Sin embargo, cuando la radiación de alta energía destruye las células cancerosas, las células normales también pueden irradiarse simultáneamente, lo que resulta en efectos secundarios como la pérdida de leucocitos, fatiga, insomnio, dolor y falta de apetito. Además, la quimioterapia y la radioterapia no son efectivas para una parte de los pacientes con cáncer en las últimas etapas.

La investigación ha mostrado que la mayoría de las células cancerosas no tienen la capacidad de inducir un tumor y solo unas pocas células cancerosas tienen tumorigenicidad. Esas células cancerosas con tumorigenicidad tienen características de células madre (es decir, tienen la capacidad de autorrenovación y diferenciación) y pueden crecer y diferenciarse continuamente en diferentes clases o tipos de células tumorales y, por lo tanto, se denominan "células madre cancerosas (CSC)" o "células madre tumorales". La investigación también ha mostrado que las células madre cancerosas tienen el potencial de formar un tumor y convertirse en cáncer. En particular, las células madre cancerosas se desarrollarán en otros tipos de cáncer cuando hagan metástasis en otros tejidos u órganos del cuerpo. Además, en los tejidos de ciertos tipos de cáncer como leucemia, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de recto o cáncer oral, las células madre cancerosas son más resistentes a la quimioterapia o la radioterapia que otras células. Dicha resistencia está altamente correlacionada con la recurrencia, invasión y metástasis del tumor y la tasa de supervivencia del paciente. Por lo tanto, si se puede prevenir, mitigar o inhibir eficazmente el crecimiento, la migración, la invasión y/o la metástasis de las células madre del cáncer, se puede mejorar la tasa de éxito para tratar el tumor y el cáncer y la tasa de supervivencia del paciente.

Actualmente, todos los procedimientos terapéuticos (que incluyen cirugía, quimioterapia y radioterapia, etc.) para prevenir, mitigar o inhibir el crecimiento, la migración, la invasión o la metástasis de las células madre cancerosas en la clínica son ineficientes. Por lo tanto, existe la necesidad y la urgencia de desarrollar un procedimiento o medicamento para prevenir, mitigar o inhibir el crecimiento, la migración, la invasión o la metástasis de las células madre del cáncer de manera eficaz para disminuir la tasa de incidencia, la tasa de recurrencia y la tasa de mortalidad, así como para mejorar la tasa de curación y reducir los efectos secundarios.

Los inventores de la presente invención descubrieron que la BP es eficaz para inhibir las expresiones de los factores relacionados con el crecimiento, factores de diferenciación de células madre, factores de transición epitelial-mesenquimal (EMT) y gelatinasas de células madre cancerosas, especialmente para inhibir las expresiones de Sox-2, Oct4 y EZH2, y por lo tanto, pueden inhibir el crecimiento, la migración, la invasión y la metástasis de las células madre del cáncer y se pueden usar para proporcionar un medicamento, un producto alimenticio o un aditivo alimentario para prevenir, mitigar y/o inhibir el crecimiento, migración, invasión y/o metástasis de células madre cancerosas.

Sumario de la invención

La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Por lo tanto, la invención se refiere a:

1. Una preparación para su uso en la disminución de la tasa de incidencia y/o tasa de recurrencia de cáncer oral al prevenir, mitigar y/o inhibir el crecimiento, la migración, la invasión y/o la metástasis de las células madre de cáncer oral, que comprende una cantidad efectiva de butilideneftalida (BP).

2. La preparación para uso según la reivindicación 1, que sirve para inhibir las expresiones de Sox-2 y Oct4, de este modo previniendo, mitigando y/o inhibiendo el crecimiento, la migración y/o la invasión de células madre de cáncer oral.

3. La preparación para uso según la reivindicación 1 o 2, que es un medicamento, un producto alimenticio o un aditivo alimentario.

4. La preparación para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se administra en una cantidad que varía de aproximadamente 30 mg (como BP)/kg de peso corporal a aproximadamente 500 mg (como BP)/kg de peso corporal por día.

5. La preparación para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se administra en una cantidad que varía de aproximadamente 40 mg (como BP)/kg de peso corporal a aproximadamente 120 mg (como BP)/kg de peso corporal por día.

Otros aspectos de la divulgación

Un objetivo de la presente divulgación es proporcionar un procedimiento para prevenir, mitigar y/o inhibir el crecimiento, la migración, la invasión y/o la metástasis de células madre cancerosas (CSC), que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de butilideneftalida (BP).

Específicamente, el objetivo de la presente divulgación es proporcionar un uso de butilideneftalida (BP) en la fabricación de una preparación, en el que la preparación sirve para prevenir, mitigar y/o inhibir el crecimiento, la migración, la invasión y/o la metástasis de células madre cancerosas (CSC).

Preferentemente, la preparación sirve para inhibir las expresiones de Sox-2, Oct4 y EZH2, previniendo, mitigando y/o inhibiendo el crecimiento, la migración, la invasión y/o la metástasis de células madre cancerosas (CSC). Preferentemente, la célula madre cancerosa (CSC) es al menos una de las células madre cancerosas orales, células madre cancerosas nasofaríngeas, células madre cancerosas esofágicas, células madre de mieloma, células madre cancerosas cutáneas, células madre de melanoma, células madre cancerosas tiroideas, células madre de linfoma, células madre de leucemia, células madre de cáncer de mama, células madre de cáncer de vejiga, células madre de cáncer de ovario, células madre de cáncer cervical, células madre de cáncer de próstata, células madre de cáncer de estómago, células madre de cáncer de hígado, células madre de cáncer de pulmón, células madre de cáncer de colon, células madre de cáncer rectal, células madre de cáncer de páncreas, células madre de cáncer de la vesícula biliar, células madre de cáncer renal, células madre de glioblastoma, células madre de carcinoma tímico, células madre de rabdomiosarcoma, células madre de tumor cerebral y células madre de meduloblastoma.

Preferentemente, la célula madre cancerosa (CSC) es una célula madre cancerosa oral.

Preferentemente, la célula madre cancerosa (CSC) es una célula madre cancerosa pancreática.

Preferentemente, la célula madre cancerosa (CSC) es una célula madre de tumor cerebral.

Preferentemente, la preparación es un medicamento, un producto alimenticio o un aditivo alimentario.

Preferentemente, la preparación es un medicamento y se administra en una cantidad que varía de aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal por día.

Preferentemente, la preparación se administra en una cantidad que varía de aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 120 mg/kg de peso corporal por día.

La tecnología detallada y las realizaciones preferentes implementadas para la presente invención y divulgación se describen en los siguientes párrafos que acompañan a los dibujos adjuntos para que los expertos en este campo aprecien adecuadamente las características de la invención reivindicada.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A y la Figura 1B son diagramas de barras que muestran la viabilidad relativa de las células madre de tumor cerebral CD133+ (en lo sucesivo denominadas "CSC cerebrales CD133+"), en el que la Figura 1A muestra los resultados de las CSC cerebrales CD133+ tratadas con diferentes concentraciones de butilideneftalida (BP), y la Figura 1B muestra los resultados de CSC cerebrales CD133+ tratadas con diferentes concentraciones de biscloroetilnitrosourea (BCNU);

La Figura 2 es un diagrama de curva que muestra la viabilidad relativa de los NHOK (queratinocitos orales humanos normales ♦ ) tratados con diferentes concentraciones de BP y de células madre orales similares a HNC-TIC (células iniciadoras de tumores derivados de cáncer de cabeza y cuello (es decir, línea celular ALDH1+CD44+-1 ■ o línea celular ALDH1+CD44+-2 ▲) tratadas con diferentes concentraciones de BP;

La Figura 3 a la Figura 5 muestran los resultados de la transferencia Western, mostrando las expresiones de los marcadores de mantenimiento de la diferenciación de células madre en CSC cerebrales CD133+tratadas con diferentes concentraciones de BP, en la que la Figura 3 es una fotografía que muestra las expresiones proteínicas de EZH2 y actina, la Figura 4 es una fotografía que muestra las expresiones proteínicas de CD133 y actina en CSC cerebrales CD133+ y la Figura 5 es una fotografía que muestra las expresiones proteínicas de Sox-2, Oct4 y p-actina en CSC cerebrales CD133+;

La Figura 6 es una fotografía de los resultados de la transferencia Western, que muestra las expresiones proteínicas de Sox-2, CD133, CD44 y p-actina en células MiaPaCa-2 (es decir, una línea celular de células de cáncer de páncreas) tratadas con diferentes concentraciones de BP;

La Figura 7 es una fotografía de los resultados de la transferencia Western, que muestra las expresiones proteínicas de Oct4, Sox-2 y GAPDH en células madre orales similares a HNC-TIC (es decir, línea celular ALDH1+CD44+-1 o línea celular ALDH1+CD44+-2) tratadas con diferentes concentraciones de BP;

La Figura 8 muestra los resultados del análisis de citometría de flujo, que muestra la actividad ALDH de las células madre orales similares a HNC-TIC (es decir, línea celular ALDH1+CD44+-1 o línea celular ALDH1+CD44+-2) tratadas con diferentes concentraciones de BP en presencia o ausencia de N,N-dietilaminobenzaldehído (DEAB);

La Figura 9A es una fotografía de los resultados de la transferencia Western, que muestra las expresiones proteínicas de Axl, Gas 6 y actina en CSC cerebrales CD133+ tratadas con diferentes concentraciones de BP;

La Figura 9B es una fotografía de los resultados de la reacción en cadena de la transcriptasa-polimerasa inversa (RT-PCR), que muestra las expresiones génicas de Axl y GAPDH en CSC cerebrales CD133+ tratadas con diferentes concentraciones de BP;

La Figura 10 es una fotografía de transferencia Western, que muestra las expresiones proteínicas de MMP-2 y actina en CSC cerebrales CD133+ tratadas con diferentes concentraciones de BP;

La Figura 11A y la Figura 11B muestran los resultados del sistema de ensayo de invasión Transwell, que muestra la capacidad de invasión de células madre orales similares a HNC-TIC (es decir, línea celular ALDH1+CD44+-1 o línea celular ALDH1+CD44+-2) tratadas con diferentes concentraciones de BP, en la que la Figura 11A es una fotografía que muestra los resultados de tinción de la membrana de filtro de policarbonato en la cámara inferior, y la Figura 11B es un diagrama de barras que muestra los resultados cuantificados de la capacidad de invasión relativa;

La Figura 12 es una fotografía de transferencia Western, que muestra las expresiones proteínicas de E-cadherina, TGFp-1, Slug y p-actina en CSC cerebrales CD133+ tratadas con diferentes concentraciones de BP;

La Figura 13 muestra los resultados de un ensayo de cicatrización de heridas, que muestra la capacidad de migración de CSC cerebrales CD133+, en el que la fila superior es una fotografía que muestra los resultados de CSC cerebrales CD133+ tratadas con diferentes concentraciones de BP y la fila inferior muestra los resultados de CSC cerebrales CD133+ tratadas con diferentes concentraciones de BCNU;

La Figura 14A es una fotografía tomada con el uso de un microscopio, que muestra las CSC cerebrales CD133+ que tienen plásmido pcDNA 3.0-Axl (en lo sucesivo denominadas "CSC cerebrales CD133+ pcDNA 3.0-Axl") o CSC cerebrales CD133+ que tienen pcDNA 3.0-neo plásmido (en lo sucesivo denominadas "CSC cerebrales CD133+ pcDNA 3.0-neo");

La Figura 14B es una fotografía de transferencia Western, que muestra las expresiones proteínicas de Axl-1 y pactina en las CSC cerebrales CD133+ pcDNA 3.0-Axl o las CSC cerebrales CD133+ pcDNA 3.0-neo;

La Figura 14C muestra los resultados de un ensayo de curación de heridas, que muestra la capacidad de migración de las CSC cerebrales CD133+ pcDNA 3.0-Axl tratadas con diferentes concentraciones de BP o la capacidad de migración de las CSC cerebrales CD133+ pcDNA 3.0-neo tratadas con diferentes concentraciones de BP;

La Figura 15A y la Figura 15B muestran los resultados de un ensayo de formación de colonias de agar blando, que muestra la capacidad de formación de colonias de células madre de cáncer oral tratadas con diferentes concentraciones de BP, en la que la Figura 15A es una fotografía que muestra la formación de colonias de la línea celular ALDH1+CD44+-1 y la línea celular ALDH1+CD44+-2, y la Figura 15B es un diagrama de barras que muestra la capacidad relativa de formación de colonias de la línea celular ALDH1+CD44+-1 y la línea celular ALDH1+CD44+-2;

La Figura 16A a la Figura 16D muestran los resultados de un experimento en animales, que muestra la capacidad de BP para inhibir la actividad iniciadora de tumores de células madre cancerosas, incluyendo los resultados de los ratones sin tratamiento de BP (es decir, "grupo de control",-----• -----), los ratones tratados con 100 mg/kg de BP (es decir, "grupo de 100 mg/kg",-----O-----), y los ratones tratados con 200 mg/kg de BP (es decir, "grupo de 200 mg/kg", — ▼— ), en la que la Figura 16A muestra el peso promedio (g) de cada grupo de ratones durante un período de tiempo, la Figura 16B muestra el volumen tumoral promedio (mm3) de cada grupo de ratones durante un período de tiempo, la Figura 16C es una fotografía que muestra la intensidad de GFP (es decir, fluorescencia verde) en cada grupo de ratones, y la Figura 16D es un diagrama de barras que muestra la intensidad de GFP en cada grupo de ratones.

Descripción de las realizaciones preferentes

A continuación, se describirán algunas de las realizaciones de la presente invención en detalle. Sin embargo, la presente invención se puede realizar en diversas realizaciones y no debe limitarse a las realizaciones descritas en la memoria descriptiva. Además, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria, las expresiones "un", "uno", "una", "el", "la" o similares mencionadas en la memoria descriptiva de la presente invención (especialmente en las reivindicaciones) pretenden incluir las formas singular y plural. El término "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" utilizado en la presente memoria descriptiva se refiere a la cantidad de compuesto que puede aliviar al menos parcialmente la afección que se está tratando en un sujeto sospechoso cuando se administra al sujeto que lo necesita. El término "sujeto" usado en la presente memoria descriptiva se refiere a un mamífero, incluyendo animales humanos o no humanos.

Los inventores de la presente invención encontraron que la butilideneftalida (BP) es eficaz para inhibir la viabilidad de las células madre cancerosas, inhibiendo las expresiones de factores relacionados con el crecimiento (por ejemplo, EZH2) de las células madre cancerosas, inhibiendo las expresiones de los marcadores de mantenimiento de diferenciación de células madre (p. ej., CD133, Sox-2, Oct4) de células madre cancerosas, inhibiendo las expresiones de genes (p. ej., AXL) o proteínas (Axl, Gas6, MMP-2) relacionadas con la proliferación, antiapoptosis, migración e invasión de células madre cancerosas, inhibiendo las expresiones de proteínas relacionadas con EMT (transición epitelial-mesenquimal) (p. ej., E-cadherina, TGFp-1 y Slug) de células madre cancerosas, e inhibiendo la capacidad de las células madre cancerosas para migrar hacia la herida. En algunas realizaciones de la presente invención, la BP previno, mitigó y/o inhibió el crecimiento, la migración, la invasión y/o la metástasis de las células madre cancerosas al inhibir las expresiones de Sox-2, Oct-4 y EZH2.

Por lo tanto, la presente invención se refiere al uso de BP en la fabricación de una preparación, en el que la preparación sirve para disminuir la tasa de incidencia y/o tasa de recurrencia de cáncer oral al prevenir, mitigar y/o inhibir el crecimiento, la migración, invasión y/o metástasis de células madre de cáncer oral.

La preparación de la presente divulgación se puede usar en cualquier célula madre de cáncer adecuada y los ejemplos de las células madre de cáncer incluyen, por ejemplo, células madre de cáncer oral, células madre de cáncer nasofaríngeo, células madre de cáncer de esófago, células madre de mieloma, células madre de cáncer de piel, células madre de melanoma, células madre de cáncer de tiroides, células madre de linfoma, células madre de leucemia, células madre de cáncer de mama, células madre de cáncer de vejiga, células madre de cáncer de ovario, células madre de cáncer cervical, células madre de cáncer de próstata, células madre de cáncer gástrico, células madre de cáncer de hígado, células madre de cáncer de pulmón, células madre de cáncer de colon, células madre de cáncer de recto, células madre de cáncer de páncreas, células madre de cáncer de vesícula biliar, células madre de cáncer de riñón, células madre de glioblastoma, células madre de carcinoma tímico, células madre de rabdomiosarcoma, células madre de tumor cerebral y células madre de meduloblastoma. En algunas realizaciones de la presente invención, la preparación se usa para prevenir, mitigar y/o inhibir el crecimiento, migración, invasión y/o metástasis de células madre de cáncer oral. En algunas realizaciones de la presente divulgación, la preparación se usa para prevenir, mitigar y/o inhibir el crecimiento, migración, invasión y/o metástasis de células madre de cáncer pancreático y/o células madre de tumor cerebral.

La preparación de acuerdo con la presente invención se puede proporcionar en cualquier forma adecuada sin limitaciones particulares. Por ejemplo, la preparación se puede proporcionar como medicamentos, pero no está limitada a ello. La preparación también se puede proporcionar en forma líquida o sólida como un producto alimenticio o aditivo alimentario.

Cuando la preparación de acuerdo con la presente invención se proporciona como un medicamento, el medicamento se puede preparar en cualquier forma de dosificación adecuada dependiendo de la forma de administración deseada. Por ejemplo, el medicamento puede administrarse por vía oral o parenteral (por ejemplo, vía subcutánea, intravenosa, intramuscular, peritoneal o nasal) a un sujeto que lo necesite, pero no está limitado a ello. Dependiendo de la forma y el propósito, se pueden elegir portadores/vehículos adecuados y usarlos para proporcionar el medicamento, en el que los ejemplos de los portadores adecuados incluyen excipientes, diluyentes, auxiliares, estabilizadores, retardadores absorbentes, desintegrantes, agentes hidrotrópicos, emulsionantes, antioxidantes, adhesivos, aglutinantes, fijadores, dispersantes, agentes de suspensión, lubricantes, agentes higroscópicos, etc.

Como una forma de dosificación adecuada para la administración oral, el medicamento proporcionado por la presente invención puede comprender cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o sus análogos, celulosa, almidón, bentonita de azúcar o combinaciones de los mismos) que no afectará negativamente los efectos deseados de la BP. El medicamento se puede proporcionar en cualquier forma de dosificación adecuada para la administración oral, como un comprimido (por ejemplo, una gragea), una píldora, una cápsula, un gránulo, un polvo, un extracto fluido, una solución, un jarabe, una suspensión, una emulsión y una tintura, etc.

En cuanto a una forma de inyección para administración subcutánea, intravenosa, intramuscular o peritoneal o una forma de goteo, el medicamento proporcionado por la presente invención puede comprender uno o más ingredientes tales como una solución isotónica, una solución salina tamponada con sal (p. ej., solución salina tamponada con fosfato o solución salina tamponada con citrato), un agente hidrotrópico, un emulsionante, una solución de azúcar al 5% y otros vehículos para proporcionar el medicamento como una infusión intravenosa, una infusión intravenosa emulsionada, un polvo para inyección, una suspensión para inyección o una suspensión de polvo para inyección, etc. De manera alternativa, el medicamento se puede preparar como un sólido de preinyección. El sólido de preinyección se puede proporcionar en una forma que sea soluble en otras soluciones o suspensiones, o en una forma emulsionable. Se proporciona una inyección deseada disolviendo el sólido de preinyección en una solución o suspensión o emulsionándolo antes de administrarlo a un sujeto que lo necesita. Además, los ejemplos de la forma de dosificación para su uso externo que son adecuados para la administración nasal o transdérmica incluyen una emulsión, una crema, gel (por ejemplo, hidrogel), pasta (por ejemplo, una pasta de dispersión, una pomada), un aerosol o una solución (p. ej., una loción, una suspensión).

Opcionalmente, el medicamento proporcionado por la presente invención puede comprender además una cantidad adecuada de aditivos, tales como un agente saborizante, un tóner o un agente colorante para mejorar la palatabilidad y la percepción visual del medicamento, y/o un tampón, un conservante, un preservante, un agente antibacteriano o un agente antifúngico para mejorar la estabilidad y la capacidad de almacenamiento del medicamento. Además, el medicamento puede comprender opcionalmente uno o más de otros ingredientes activos o usarse en combinación con un medicamento que comprende uno o más de otros ingredientes activos, para mejorar aún más los efectos del medicamento o aumentar la flexibilidad de aplicación y la adaptabilidad de la formulación así provisto, siempre que el(los) otro(s) ingrediente(s) activo(s) no afecten negativamente los efectos deseados de la BP.

Dependiendo de la edad, el peso corporal y las condiciones de salud (tales como la enfermedad a tratar y su gravedad) del sujeto a administrar, el medicamento proporcionado por la presente invención se puede aplicar con diversas frecuencias de administración, tales como una vez al día, varias veces al día, o una vez cada pocos días, etc. Por ejemplo, cuando el medicamento se aplica por vía oral a un sujeto para prevenir, mitigar y/o inhibir el crecimiento, la migración, la invasión y/o la metástasis de células madre cancerosas, la dosificación del medicamento es de aproximadamente 30 mg (como BP)/kg de peso corporal a aproximadamente 500 mg (como BP)/kg de peso corporal por día, preferentemente aproximadamente 40 mg (como BP)/kg de peso corporal a aproximadamente 120 mg (como BP)/kg de peso corporal por día, y más preferentemente aproximadamente 50 mg (como BP)/kg de peso corporal a aproximadamente 90 mg (como BP)/kg de peso corporal por día, en el que la unidad "mg/kg de peso corporal" se refiere a la dosis requerida por kg de peso corporal del sujeto. Sin embargo, para pacientes agudos, la dosis puede incrementarse opcionalmente hasta varios múltiplos o docenas de veces, dependiendo de los requisitos prácticos.

Opcionalmente, el medicamento de la presente invención se puede usar en combinación con cirugía, quimioterapia, radioterapia, terapia con anticuerpos, inmunoterapia, terapia antiangiogénesis, terapia de conversión y/o diferenciación de fenotipos, para prevenir, mitigar y/o inhibir el crecimiento, migración, invasión y/o metástasis de células madre cancerosas.

Cuando la preparación de acuerdo con la presente invención se proporciona como un aditivo alimentario, el aditivo alimentario puede estar en una forma que pueda añadirse convenientemente durante los procesos de fabricación de alimentos, tal como en forma de polvo, líquido, suspensión o gránulo. Cuando la preparación de acuerdo con la presente invención se proporciona como un producto alimenticio, el producto alimenticio puede ser tal como productos lácteos, carne procesada, panes, productos de pasta, galletas, trozos, jugos, tés, bebidas deportivas, bebidas nutritivas y similares, y puede ser un alimento saludable (p. ej., suplementos nutricionales después de la cirugía), pero no está limitado a ello.

Dependiendo de la edad, el peso corporal y las condiciones saludables del sujeto a administrar, los alimentos saludables proporcionados por la presente invención pueden tomarse en varias frecuencias, tales como una vez al día, varias veces al día o una vez cada pocos días., etc. La cantidad de BP en el alimento saludable proporcionado por la presente invención se puede ajustar, preferentemente a la cantidad que se debe tomar diariamente, dependiendo de la población específica. Por ejemplo, si la dosis diaria recomendada para un sujeto es de aproximadamente 50 mg y cada porción del alimento saludable contiene 25 mg de BP, el sujeto puede tomar aproximadamente dos porciones del alimento saludable por día.

Las dosis diarias recomendadas, los estándares de uso y las condiciones de uso para una población específica (por ejemplo, mujeres embarazadas y pacientes diabéticos), o las recomendaciones para un uso en combinación con otro alimento o medicamento pueden indicarse en el empaque externo del alimento saludable. de la presente invención y, por lo tanto, es favorable para que el usuario tome los alimentos saludables por sí mismo de manera segura sin las instrucciones de un médico, farmacéutico o ejecutivo relacionado.

La presente divulgación también proporciona un procedimiento para prevenir, mitigar y/o inhibir el crecimiento, migración, invasión y/o metástasis de células madre cancerosas (CSC), que comprende administrar a un sujeto que necesita una cantidad efectiva de butilideneftalida (BP). En este procedimiento, la forma aplicada y la dosificación adecuada de BP y las células madre cancerosas adecuadas están en línea con la descripción anterior sobre la preparación de la presente invención.

La presente invención se ilustrará adicionalmente en detalle con ejemplos específicos como sigue. Sin embargo, los siguientes ejemplos se proporcionan solo para ilustrar la presente invención, y el alcance de la presente invención no está limitado por ello. El alcance de la presente invención se muestra en las reivindicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1: efecto de la BP sobre la inhibición del crecim iento de células madre cancerosas

(1-1)

Para investigar el efecto de la BP sobre la inhibición del crecimiento de células madre cancerosas, se trataron CSC cerebrales CD133+ o células DBTRG de glioma maligno con diferentes concentraciones (0, 25, 50, 62,5, 75 y 100 |jg/ml) de BP, diferentes concentraciones (0, 25, 125, 250, 500 y 1000 jM ) de bis-cloroetilnitrosourea (BCNU, un medicamento de quimioterapia utilizado actualmente para tratar el glioma maligno en la clínica), o diferentes concentraciones (0, 100, 200, 400, 800 y 1600 jM ) de temozolomida (TMZ, un fármaco de quimioterapia utilizado actualmente para tratar el glioma maligno en la clínica) durante 24 o 48 horas. Posteriormente, se utilizó un ensayo de viabilidad celular, ensayo MTT, para analizar la viabilidad de las CSC cerebrales CD133+ y las células DBTRG de glioma maligno. La viabilidad de cada grupo experimental se calculó en función del resultado del grupo de control, es decir, el grupo sin ser tratado con BP, BCNU o TMZ. Los resultados se muestran en la Figura 1A y la Figura 1B para el grupo de 24 horas y el grupo de 48 horas (es decir, el tratamiento durante 24 horas y 48 horas) y en la Tabla 1 para el grupo de 24 horas.

Tabla 1

Como se muestra en la Figura 1A y la Figura 1B, tanto en el grupo de 24 horas como en el grupo de 48 horas, la viabilidad de las CSC cerebrales CD133+ disminuyó significativamente junto con el incremento en la concentración de BP o BCNU. Por otro lado, como se muestra en la Tabla 1, la mitad de la concentración inhibitoria máxima (IC⁵⁰) de BP, BCNU o TMZ para las CSC cerebrales CD133+ en el grupo de 24 horas fue de 406 jM (es decir, 76,5 jg/ml), 377,6 jM (es decir, 80,8 jg/m l) y más de 1600 jM (es decir,> 310,6 jg/ml), respectivamente. Estos resultados indican que la BP es eficaz para inhibir el crecimiento de células madre cancerosas y su efecto es superior al de los medicamentos de quimioterapia usados actualmente.

(1-2)

Las NHOK (queratinocitos orales humanos normales) y HNC-TIC (células iniciadoras de tumores derivados de cáncer de cabeza y cuello) se parecen a las células madre orales (es decir, línea celular ALDH1+CD44+-1 o línea celular ALDH1+CD44+-2) fueron tratados con diferentes concentraciones (0, 25, 50 y 100 pg/ml) de BP durante 24 horas, y luego, se utilizó un ensayo MTT para analizar las viabilidades de las células madre orales similares a NHOK y HNC-TIC (es decir, línea celular ALDH1+CD44+-1 y línea celular ALDH1+CD44+-2). Los resultados se muestran en la Figura 2.

Como se muestra en la Figura 2, la viabilidad de los NHOK no disminuyó junto con el incremento en la concentración de BP, mientras que la de las células madre orales similares a HNC-TIC (es decir, línea celular ALDH1+CD44+-1 y línea celular ALDH1+CD44+-2) disminuyeron junto con el incremento en la concentración de BP. Estos resultados indican nuevamente que BP es eficaz para inhibir el crecimiento de células madre cancerosas y no tiene citotoxicidad para las células normales. Por lo tanto, la BP no causará efectos secundarios inducidos por la citotoxicidad y, por lo tanto, se puede usar para proporcionar un medicamento de calidad para inhibir el crecimiento de células madre cancerosas.

Ejemplo 2: Efecto de la BP sobre la inhibición de las expresiones de factores relacionados con el crecim iento de células madre cancerosas

Se sabe que el gen EZH2 (mejorador del homólogo 2 de zeste) es un factor crítico relacionado con el crecimiento de células madre cancerosas, y afectará el crecimiento y las características de crecimiento de las células madre cancerosas. Las CSC cerebrales CD133+ se trataron con diferentes concentraciones (0, 12,5, 25, 50, 62,5 y 75 pg/ml) de BP, y luego, las proteínas se extrajeron de las células para realizar la transferencia Western para determinar la expresión de la proteína EZH2 en las CSC cerebrales CD133+ tratadas con BP. Los resultados se muestran en la Figura 3.

Como se muestra en la Figura 3, la expresión de la proteína EZH2 en las CSC cerebrales CD133+ disminuyó significativamente junto con el incremento en la concentración de BP. Estos resultados indican nuevamente que la BP es eficaz para inhibir el crecimiento de células madre cancerosas.

Ejemplo 3: efecto de la BP sobre la inhibición de la severidad de las células cancerosas y las células madre cancerosas

(3-1)

Se sabe que las proteínas CD44, CD133, Sox-2 (secuencia del grupo de alta movilidad relacionado con la proteína Y de la región determinante del sexo (SRY) 2) y las proteínas Oct4 (factor de transcripción de unión a octámeros 4) son marcadores de mantenimiento de la diferenciación de células madre de las de células madre cancerosas y participar en la regulación de la autorrenovación y diferenciación de células madre cancerosas. Las CSC cerebrales CD133+ se trataron con diferentes concentraciones (0, 12,5, 25, 50, 62,5 y 75 pg/ml) de BP durante 24 horas, y luego, se extrajeron proteínas de las células para llevar a cabo la transferencia Western para determinar las expresiones de Proteínas CD133, Sox-2 y Oct4 en las CSC cerebrales CD133+ tratadas con BP. Los resultados se muestran en la Figura 4 y la Figura 5. Además, la línea celular MiaPaCa-2 (es decir, una línea celular de células de cáncer de páncreas) se trató con diferentes concentraciones (0, 12,5, 25 y 50 pg/ml) de BP durante 24 horas, y luego, se extrajeron proteínas de las células para realizar la transferencia Western para determinar las expresiones de las proteínas Sox-2, CD133 y CD44 en las células MiaPaCa-2 tratadas con BP. Los resultados se muestran en la Figura 6. Sin embargo, las células madre orales similares a HNC-TIC (es decir, línea celular ALDH1+CD44+-1 o línea celular ALDH1+CD44+-2) fueron tratadas con diferentes concentraciones (0, 12,5, 25 y 50 pg/ml) de BP durante 24 horas, y luego, las proteínas se extrajeron de las células para realizar la transferencia Western para determinar las expresiones de las proteínas Sox-2 y Oct4 en las células madre orales similares a HNC-TIC tratadas con BP (es decir, línea celular ALDH1+CD44+-1 y línea celular ALDH1+CD44+-2). Los resultados se muestran en la Figura 7.

Como se muestra en la Figura 4 y la Figura 5, las expresiones de las proteínas CD133, Sox-2 y Oct4 en las CSC cerebrales CD133+ disminuyeron significativamente junto con el incremento en la concentración de BP. Como se muestra en la Figura 6, las expresiones de las proteínas Sox-2, CD133 y CD44 en las células MiaPaCa-2 disminuyeron significativamente junto con el incremento en la concentración de BP. Como se muestra en la Figura 7, las expresiones de las proteínas Sox-2 y Oct4 en las células madre orales similares a HNC-TIC (es decir, línea celular ALDH1+CD44+-1 y línea celular ALDH1+CD44+-2) disminuyó significativamente junto con el incremento en la concentración de BP. Estos resultados indican que la BP es eficaz para inhibir la diferenciación de células madre de las células cancerosas y las células madre cancerosas.

(3-2)

La proteína ALDH también es un importante marcador de mantenimiento de diferenciación de células madre de las células madre cancerosas y participa en la regulación de la autorrenovación y diferenciación de las células madre cancerosas. Las células madre orales similares a HNC-TIC (es decir, línea celular ALDH1+CD44+-1 o línea celular ALDH1+CD44+-2) fueron tratadas con diferentes concentraciones (0, 25 y 50 pg/ml) de BP durante 24 horas, y luego, 1 * 105 células obtenidas de cada grupo se suspendieron por separado en 50 pl de un kit de detección de células madre (es decir, kit de matriz ALDEFLUOR, adquirido de STEMCELL Technologies Inc., Vancouver, Canadá) y la suspensión celular de cada grupo se añadió por separado con ALDEFLUOR a una concentración final de 1 pM. Posteriormente, una muestra de cada grupo se tiñó con 7-ADD y luego se analizó mediante análisis de citometría de flujo para determinar la actividad ALDH de células madre orales similares a HNC-TIC (es decir, línea celular ALDHl+CD44+-1 y ALDH1+CD44+- 2 líneas celulares). Los resultados se muestran en la Figura 8.

Se repitió el procedimiento experimental anterior, pero la suspensión celular de cada grupo se añadió adicionalmente con N,N-dietilaminobenzaldehído (DEAb , es decir, un inhibidor de ALDH) a una concentración final de 150 pM de DEAB por separado. Los resultados también se muestran en la Figura 8.

Como se muestra en la Figura 8, en el grupo con DEAB añadido, no importa si hubo un tratamiento de BP o no, las células vivas con actividad ALDH eran solo el 0,1% del total de células vivas. Por otro lado, en el grupo sin adición de DEAB, el número de células vivas con actividad ALDH aumentó junto con el incremento en la concentración de BP. Estos resultados indican que la BP es eficaz para inhibir la actividad ALDH de las células madre cancerosas, y demuestran nuevamente que la BP es eficaz para inhibir la diferenciación de células madre de las células madre cancerosas.

Ejemplo 4: Efecto de la BP sobre la inhibición de la proliferación, antiapoptosis, m igración e invasión de células madre cancerosas

(4-1)

Se sabe que la expresión de Axl (es decir, un receptor de tirosina quinasa) está relacionada con la capacidad de las células madre cancerosas en la proliferación, antiapoptosis, migración e invasión. Las CSC cerebrales CD133+ se trataron con diferentes concentraciones (0, 12,5, 25, 50, 62,5 y 75 pg/ml) de BP durante 24 horas, y luego, las proteínas y el ARN total se extrajeron de las células para realizar la transferencia Western y revertir la reacción en cadena de la transcriptasa-polimerasa (RT-PCR) para determinar las expresiones de las proteínas Axl y Gas6 (es decir, un ligando de Axl) y la expresión del gen Axl en las CSC cerebrales CD133+ tratadas con BP. Los resultados se muestran en la Figura 9A y la Figura 9B.

Como se muestra en la Figura 9A y la Figura 9B, las expresiones de las proteínas Axl y Gas6 y la expresión del gen Axl disminuyeron significativamente junto con el incremento en la concentración de BP. Estos resultados indican que la BP es eficaz para inhibir la proliferación, la antiapoptosis, la migración y la invasión de células madre cancerosas.

(4-2)

Se sabe que al comienzo de la invasión de células madre cancerosas, la matriz extracelular (ECM) se degrada por las metaloproteinasas de matriz (MMP), en la que las expresiones de gelatinasas, tales como gelatinasa-A (es decir, MMP-2) y gelatinasa-B (es decir, MMP-9), están altamente relacionadas con la histopatología de la metástasis tumoral. Las CSC cerebrales CD133+ se trataron con diferentes concentraciones (0, 12,5, 25, 50, 62,5 y 75 pg/ml) de BP durante 24 horas, y luego, se extrajeron proteínas de las células para llevar a cabo la transferencia Western para determinar la expresión de Proteína MMP-2 en las CSC cerebrales CD133+ tratadas con BP. Los resultados se muestran en la Figura 10.

Como se muestra en la Figura 10, la expresión de la proteína MMP-2 disminuyó significativamente junto con el incremento en la concentración de BP. Estos resultados indican nuevamente que la BP es eficaz para inhibir la migración e invasión de células madre cancerosas.

(4-3)

En esta investigación, el efecto de la BP sobre la inhibición de la migración e invasión de células madre cancerosas se investigó adicionalmente mediante un sistema de ensayo de invasión Transwell (es decir, sistema Transwell®, adquirido de Corning, Reino Unido) con una membrana de filtro de policarbonato con un tamaño de poro de 8 pm (adquirida de Corning, Reino Unido). Primero, la membrana de filtro de policarbonato se recubrió con Matrigel™ (adquirido de BD Pharmingen, EE. UU.), Y luego, la membrana recubierta se colocó en la cámara inferior del sistema de ensayo de invasión Transwell. Luego, la cámara inferior se llenó con 10% de medio que contenía suero. Por otro lado, las células madre orales similares a HNC-TIC (es decir, línea celular ALDH1+CD44+-1 o línea celular ALDH1+CD44+-2) se trataron con diferentes concentraciones (0, 25 y 50 |jg/ml) de BP durante 24 horas, y luego, las células tratadas de cada grupo se cultivaron en la cámara superior que se llenó con medio sin suero, a una densidad celular de 1 x 105 células/100 j l por 24 horas. Finalmente, se retiró el medio de la cámara inferior y se extrajo la membrana de filtro de policarbonato en la cámara inferior, se fijó con formalina al 4% y se tiñó con cristal violeta. Las células cancerosas de invasión de cada grupo se contaron y fotografiaron en cinco campos visuales de la membrana con el uso de un aumento de 100 veces bajo un microscopio. Los resultados se muestran en la Figura 11A. La capacidad de invasión relativa de las células de cada grupo experimental se calculó en función del resultado del grupo tratado con 0 jg/m l de BP. Los resultados se muestran en la Figura 11B.

Como se muestra en la Figura 11A, el número de células en la membrana de filtro de policarbonato se redujo significativamente junto con el incremento en la concentración de BP. Como se muestra en la Figura 11B, la capacidad de invasión relativa de las células madre cancerosas también disminuyó junto con el incremento en la concentración de BP. Estos resultados indican nuevamente que la BP es eficaz para inhibir la migración e invasión de células madre cancerosas.

Ejemplo 5: Efecto de la BP sobre la inhibición de la metástasis de las células madre cancerosas

(5-1)

Es conocido que al comienzo de la transición epitelial-mesenquimal (EMT) de células madre cancerosas, la expresión de E-cadherina se reduciría y la fuerza de agregación entre las células madre cancerosas disminuiría, de modo que las células madre cancerosas ganaría una gran capacidad de invasión y migración y se apartaría del tumor primario y, por lo tanto, podría hacer metástasis. Las CSC cerebrales CD133+ se trataron con diferentes concentraciones (0, 12,5, 25, 50, 62,5 y 75 jg/m l) de BP durante 24 horas, y luego, se extrajeron proteínas de las células para realizar la transferencia Western para determinar las expresiones de E-cadherina, TGFp-1 (con capacidad de inducir EMT) y Slug (es decir, un miembro de los represores transcripcionales de la familia Snail con una propiedad de promover la metástasis de las células cancerosas) proteínas en las CSC cerebrales CD133+ tratadas con BP. Los resultados se muestran en la Figura 12.

Como se muestra en la Figura 12, las expresiones de las proteínas TGFp-1 y Slug disminuyeron significativamente junto con el incremento en la concentración de BP, mientras que la expresión de la proteína E-cadherina aumentó significativamente junto con el incremento en la concentración de BP. Estos resultados indican que BP regula la expresión de la proteína E-cadherina inhibiendo las expresiones de las proteínas TGFp-1 y Slug y, por lo tanto, se puede usar para inhibir la aparición de EMT de células madre cancerosas e inhibir la metástasis de las células madre cancerosas.

(5-2)

En esta investigación, se usó un ensayo de curación de heridas para investigar más a fondo el efecto de la BP sobre la inhibición de la metástasis de las células madre cancerosas. Primero, las CSC cerebrales CD133+ se trataron con diferentes concentraciones (0, 12,5, 25, 50, 62,5 y 75 jg/m l) de BP o diferentes concentraciones (0, 25, 50, 100, 200 y 400 jM ) de BCNU para 24 horas. Al mismo tiempo, el fenómeno de las CSC cerebrales CD133+ migra a la herida se observó y fotografió a las 0 y 24 horas durante el tratamiento con BP o el tratamiento con BCNU, respectivamente. Los resultados se muestran en la Figura 13.

Como se muestra en la Figura 13, el número de CSC cerebrales tratadas con BCNU CD133+ migradas a la herida no disminuyó junto con el incremento en la concentración de BCNU. En comparación con las CSC cerebrales CD133+ tratadas con BCNU, el número de CSC cerebrales CD133+ tratadas con BP que migraron a la herida disminuyó significativamente junto con el incremento en la concentración de BP. Estos resultados indican que BP es capaz de inhibir la metástasis de las células madre cancerosas.

(5-3)

En esta investigación, para investigar más a fondo si la capacidad de BP para inhibir la metástasis de las células madre cancerosas está relacionada con Axl, las CSC cerebrales CD133+ se transfectaron con el plásmido pcDNA 3.0- Axl y el plásmido pcDNA 3.0-neo respectivamente utilizando el reactivo de transfección Lipofectmine 2000. Luego, las CSC cerebrales CD133+ transfectadas y las CSC cerebrales CD133+ no transfectadas se seleccionaron por 200 a 600 jg/m l de G418 al mismo tiempo para obtener CSC cerebrales CD133+ que tienen plásmido pcDNA 3.0- Axl (en lo sucesivo denominado como "CSC cerebrales CD133+ pcDNA 3.0-Axl") o CSC cerebrales CD133+ que tienen plásmido pcDNA 3.0-neo (en lo sucesivo denominados "CSC cerebrales CD133+ pcDNA 3.0-neo"). Tanto las CSC cerebrales CD133+ pcDNA 3.0-Axl como las CSC cerebrales CD133+ pcDNA 3.0-neo se observaron y fotografiaron con el uso de un microscopio. Los resultados se muestran en la Figura 14A. Luego, se extrajeron proteínas de ambas células para llevar a cabo la transferencia Western para determinar las expresiones de la proteína Axl y la p-actina en las CSC cerebrales CD133+ tratadas con BP. Los resultados se muestran en la Figura 14B. Adicionalmente, las CSC cerebrales CD133+ pcDNA 3.0-Axl y las CSC cerebrales CD133+ pcDNA 3.0-neo se trataron con diferentes concentraciones (0, 25, 5o, 62,5, 75 y 100 |jg/ml) de BP durante 24 horas. Al mismo tiempo, se observó el fenómeno de las CSC cerebrales CD133+ pcDNA 3.0-Axl y las CSC cerebrales CD133+ pcDNA 3.0-neo que migraron a la herida a las 0 y 24 horas durante el tratamiento con BP. Los resultados se muestran en la Figura 14C.

Como se muestra en la Figura 14C, el número de CSC cerebrales CD133+ pcDNA 3.0-neo (es decir, CSC cerebrales CD133+ sin sobreexpresión de Axl) migradas a la herida disminuyó significativamente junto con el incremento en la concentración de BP. Mientras que, en comparación con las CSC cerebrales CD133+ pcDNA 3.0-neo, el fenómeno de que BP suprimía el número de CSC cerebrales CD133+ pcDNA 3.0-Axl (es decir, CSC cerebrales CD133+ con sobreexpresión de Axl) migraron a la herida no resultó muy significativo. Estos resultados y los resultados del Ejemplo 4 indican que BP puede inhibir la metástasis de las células madre cancerosas mediante la inhibición de la expresión de Axl.

Ejemplo 6: Efecto de la BP sobre la inhibición de la actividad iniciadora de tumores de células madre cancerosas

(6-1)

En esta investigación, se usó un ensayo de formación de colonias de agar blando para investigar el efecto de BP en la inhibición de la actividad iniciadora de tumores de células madre cancerosas. Primero, las células madre orales similares a HNC-TIC (es decir, línea celular ALDH1+CD44+-1 o línea celular ALDH1+CD44+-2) fueron tratadas con diferentes concentraciones (0, 25 y 50 jg/m l) de BP durante 24 horas, y luego, las células tratadas de cada grupo se sembraron por separado en el agar superior [que contiene DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco), suero de ternera fetal (FCS) al 10% (v/v) y agar al 0,3% (p/v)] (adquirido de Sigma-Aldrich) con un número de células inicial de 2 * 104. Por otro lado, se recubrió una placa de cultivo de seis pocillos con agar inferior [que contenía DMEM, FCS al 10% (v/v) y agar al 0,6% (p/v)] (adquirido de Sigma-Aldrich), 2 ml por cada pocillo. Después de que el agar inferior se solidificó, cada grupo del agar superior (que contenía células madre de cáncer oral) se añadió respectivamente al agar inferior en diferentes pocillos de la placa, 2 ml por cada pocillo. Posteriormente, la placa de cultivo se colocó en una incubadora a 37 °C durante 4 semanas. Finalmente, el agar inferior se tiñó con violeta cristal al 0,005%, se contó el número de colonias (con un diámetro >100 jm ) en cinco campos por pocillo con el uso de un microscopio, y se fotografiaron esos campos. Los resultados se muestran en la Figura 15A. La capacidad relativa de formación de colonias de las células de cada grupo experimental se calculó en función del resultado del grupo tratado con 0 jg/m l de BP. Los resultados se muestran en la Figura 15B.

Como se muestra en la Figura 15A, el número de colonias en el agar inferior disminuyó significativamente junto con el incremento en la concentración de BP. Como se muestra en la Figura 15B, la capacidad relativa de formación de colonias de las células madre cancerosas también disminuyó junto con el incremento en la concentración de BP. Estos resultados indican que BP es eficaz para inhibir la actividad iniciadora de tumores de células madre cancerosas.

(6-2)

En esta investigación, el efecto de BP sobre la inhibición de la actividad iniciadora de tumores de células madre cancerosas se investigó adicionalmente mediante experimentos con animales. Primero, se criaron ratones BALB/c nu/nu de 5-6 semanas de edad (peso 18-22 g) en la misma condición durante 4 semanas. Luego, se inyectaron células madre orales similares a HNC-TIC transfectadas de manera estable con construcciones etiquetadas con GFP (1 * 104 células/0,1 ml/ratón) por vía subcutánea en la axila de los ratones. Después de que los tumores alcanzaron 100 mm3, los ratones se agruparon en un grupo de control y dos grupos experimentales (tres grupos en total, n = 3 por grupo). Luego, un grupo experimental se inyectó diariamente con 100 mg/kg de BP durante 6 días y otro grupo experimental se inyectó diariamente con 200 mg/kg de BP durante 6 días. El grupo de control se inyectó diariamente con un vehículo (sin BP) durante 6 días. Diez días después de la inyección de BP o vehículo, la longitud y la anchura se midieron cada 2 días (22 días en total), y luego, el volumen promedio del tumor se calculó de acuerdo con la siguiente Fórmula 1. Los resultados se muestran en la Figura 16A y Figura 16B. Al mismo tiempo, la señal de GFP (es decir, fluorescencia verde) de cada grupo fue detectada y fotografiada por el sistema IVIS Imaging. Los resultados se muestran en la Figura 16C. La intensidad de GFP de cada grupo fue analizada por el software Image-Pro Plus. Los resultados se muestran en la Figura 16D.

Fórmula 1: [longitud x anchura2] / 2 (unidad: mm3)

Como se muestra en la Figura 16A a la Figura 16D, bajo la condición de que el peso corporal de los ratones no cambiara significativamente, en comparación con el grupo de control sin inyección de BP, la intensidad de GFP de los dos grupos experimentales disminuyó significativamente, y el volumen tumoral de los dos grupos experimentales disminuyó durante un período de tiempo después de la inyección de BP. Estos resultados indican nuevamente que la BP es eficaz para inhibir la actividad iniciadora de tumores de células madre cancerosas.

Como se muestra en los resultados experimentales anteriores, BP es eficaz para inhibir la viabilidad de las células madre cancerosas, inhibir las expresiones de factores relacionados con el crecimiento de las células madre cancerosas, inhibir las expresiones de los marcadores de mantenimiento de diferenciación de células madre de las células madre cancerosas, inhibir las expresiones de los genes/proteínas relacionadas con la proliferación, antiapoptosis, migración e invasión de células madre cancerosas, inhibiendo las expresiones de los genes/proteínas relacionadas con la metástasis de las células madre cancerosas e inhibiendo las capacidades de las células madre cancerosas para migrar a la herida. En particular, BP es eficaz para inhibir las expresiones de Sox-2, Oct4 y EZH2 y, por lo tanto, se puede usar para prevenir, mitigar y/o inhibir el crecimiento, la migración, la invasión y/o la metástasis de las células madre del cáncer.

Claims

REIVINDICACIONES