TW201707698A

TW201707698A - 亞丁基苯酞之用途

Info

Publication number: TW201707698A
Application number: TW105117580A
Authority: TW
Inventors: 林欣榮; 邱紫文; 韓鴻志; 閻思尹
Original assignee: 長弘生物科技股份有限公司
Priority date: 2015-08-19
Filing date: 2016-06-03
Publication date: 2017-03-01
Also published as: EP3338775A4; ES2789758T3; WO2017028602A1; EP3338775A1; TWI626940B; JP2017530113A; EP3338775B1

Abstract

一種使用亞丁基苯酞(butylidenephthalide，BP)於製造一製劑的用途，其中該製劑係一藥劑、一食品、或一食品添加劑，用於預防、減緩及/或抑制癌症幹細胞(cancer stem cells，CSCs)之生長、遷移(migration)、侵襲(invasion)及/或轉移(metastasis)。

Description

亞丁基苯酞之用途

本發明係關於亞丁基苯酞(butylidenephthalide，BP)之應用，包括預防、減緩及/或抑制癌症幹細胞(cancer stem cells，CSCs)，尤其是口腔癌幹細胞、鼻咽癌幹細胞、食道癌幹細胞、骨髓瘤幹細胞、皮膚癌幹細胞、黑色素瘤幹細胞、甲狀腺癌幹細胞、淋巴瘤幹細胞、血癌幹細胞、乳癌幹細胞、膀胱癌幹細胞、卵巢癌幹細胞、子宮頸癌幹細胞、前列腺癌幹細胞、胃癌幹細胞、肝癌幹細胞、肺癌幹細胞、大腸癌幹細胞、直腸癌幹細胞、胰臟癌幹細胞、膽囊癌幹細胞、腎臟癌幹細胞、神經膠母細胞瘤幹細胞、胸腺惡性腫瘤幹細胞、橫紋肌肉瘤幹細胞、腦瘤幹細胞、及髓母細胞瘤幹細胞，特別是口腔癌幹細胞、胰臟癌幹細胞、及腦瘤幹細胞(brain tumor stem cell)之生長、遷移(migration)、侵襲(invasion)及/或轉移(metastasis)。

腫瘤(tumor)在醫學上是指細胞的異常病變，此種病變是在各種致瘤因素(carcinogenic factor)作用下，使身體局部組織的細胞在基因層次上失去對其生長的正常調控，導致細胞異常增生且集結成為腫塊，因而稱為「腫瘤」。其中，「癌症」即為最常見的腫瘤形態，異常增生的「癌細胞」除了會集結成為腫塊，更會擴散、轉移至身體其他組織或器官，故又稱作惡性腫瘤(malignant tumor)。癌細胞的增生以及轉移會導致嚴重的生理功能異常且難以治癒，故近年來癌症已成為全球人類死因之首。

傳統的癌症治療方式包括外科手術治療、化學療法以及放射線療法等，然而，手術切除腫塊的方式通常無法有效根治癌症，蓋因未完全切除的癌細胞仍可持續地生長，使患者之病情又趨於惡化。因此，一般幾乎不會僅以手術切除的方式來治療癌症，而會搭配其他治療方式，例如化學療法及/或放射線療法。其中，化學療法係使用化學藥物(例如：烷基化劑(alkylating agent))對生長快速的癌細胞進行毒殺作用。然而，多數化學療法所使用之藥物亦會作用於正常細胞，對癌症患者造成嚴重的副作用，此包括嘔吐、禿髮、倦態、出血以及貧血等。至於放射線療法(例如：伽瑪刀療法)，其係利用快速分裂的癌細胞對於放射線較正常細胞敏感的原理，造成癌細胞DNA斷裂，進而殺死癌細胞。然而，以高能量的放射線摧毀癌細胞的同時亦會照射到正常細胞，此導致例如白血球減少、疲倦、失眠、疼痛、食慾不佳等副作用。此外，化學療法及放射線療法對於部分晚期患者的治療效果並不佳。

研究指出，多數的癌細胞並不具有引起腫瘤發生的能力，只有極少部分癌細胞具有致瘤性(tumorigenicity)，該等癌細胞具有幹細胞性質，也就是自我更新(self-renewal)及分化(differentiation)的能力，會不斷生長及分化成不同種類、型態的腫瘤細胞，而被稱為癌症幹細胞(cancer stem cells，CSCs)，或稱為腫瘤幹細胞。研究另證實，癌症幹細胞具有形成腫瘤、發展成癌症的潛力，特別是當轉移至身體其他組織或器官時，會發展成其他種類的癌症。此外，相較於其他癌症細胞，在例如血癌、乳癌、腦癌、卵巢癌、前列腺癌、大腸癌、直腸癌、口腔癌等不同的癌症組織中，癌症幹細胞對化學療法或放射線療法更具抵抗性，此與腫瘤的復發、侵襲、轉移、及病患的存活率有極密切的關聯。因此，若能有效的預防、減緩、或抑制癌症幹細胞之生長、遷移、侵襲、或轉移，即可提高腫瘤及癌症治療的成功率以及提升病患的存活率。

然而，目前臨床醫學上的治療方式(包括外科手術治療、化學療法以及放射線療法等)對於預防、減緩、或抑制癌症幹細胞之生長、遷移、侵襲、或轉移的成效皆相當有限。因此，持續開發可有效預防、減緩、或抑制癌症幹細胞之生長、遷移、侵襲、或轉移之方法或藥物，以降低發病率、復發率及死亡率、提升治癒率、及減少副作用，係有相當的必需性及迫切性。

本案發明人研究發現，亞丁基苯酞(butylidenephthalide，BP)可有效抑制癌症幹細胞之生長因子、幹細胞性(stemness)因子、上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)因子、及明膠酶 (gelatinase)的表現，尤其可有效抑制Sox-2、Oct4、及EZH2的表現，故可抑制癌症幹細胞之生長、遷移、侵襲、及轉移，從而可用於提供預防、減緩及/或抑制癌症幹細胞之生長、遷移、侵襲及/或轉移之藥劑、食品、或食品添加劑。

本發明之一目的，在於提供一種使用亞丁基苯酞(butylidenephthalide，BP)於製造一製劑的用途，其中該製劑係用以預防、減緩及/或抑制癌症幹細胞之生長、遷移、侵襲及/或轉移。較佳地，該製劑係一藥劑、一食品、或一食品添加劑。

本發明之另一目的，在於提供一種預防、減緩及/或抑制癌症幹細胞之生長、遷移、侵襲及/或轉移的方法，其係包含於有需要之個體中投予有效量之亞丁基苯酞(BP)。

本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。

第1圖係顯示經不同處理後之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株之相對存活率的長條圖，其中第1A圖顯示經不同濃度之亞丁基苯酞(BP)處理後的結果，第1B圖顯示經不同濃度之雙氯乙基亞硝脲(BCNU)處理後的結果；第2圖係顯示經不同濃度之亞丁基苯酞(BP)處理之正常人類口腔角質細胞(Normal Human Oral Keratinocyte，NHOK，即◇)或類頭頸癌起始細胞之口腔癌幹細胞ALDH1⁺CD44⁺-1細胞株(即，■)及ALDH1⁺CD44⁺-2細胞株(即，▲)的存活率的曲線圖；第3至5圖係顯示以西方墨點法分析經不同濃度之亞丁基苯酞(BP)處理之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株之幹細胞性(stemness)維持標誌蛋白之表現的結果，其中第3圖顯示EZH2蛋白及肌動蛋白之表現的照片圖，第4圖顯示CD133蛋白及肌動蛋白之表現的照片圖，第5圖顯示Sox-2蛋白、Oct4蛋白、及β-肌動蛋白之表現的照片圖；第6圖係顯示以西方墨點法分析經不同濃度之亞丁基苯酞(BP)處理之胰臟癌細胞MiaPaCa-2細胞株之Sox-2蛋白、CD133蛋白、CD44蛋白、及β-肌動蛋白之表現的照片圖；第7圖係顯示以西方墨點法分析經不同濃度之亞丁基苯酞(BP)處理之類頭頸癌起始細胞之口腔癌幹細胞ALDH1⁺CD44⁺-1細胞株及ALDH1⁺CD44⁺-2細胞株之Oct4蛋白、Sox-2蛋白、及GAPDH蛋白之表現的照片圖；第8圖係顯示以流式細胞儀分析經不同濃度之亞丁基苯酞(BP)處理之類頭頸癌起始細胞之口腔癌幹細胞ALDH1⁺CD44⁺-1細胞株及ALDH1⁺CD44⁺-2細胞株於存在或不存在DEAB的情況下的ALDH活性所得的結果；第9A圖係顯示以西方墨點法分析經不同濃度之亞丁基苯酞(BP)處理之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株之Axl蛋白、Gas6蛋白、及肌動蛋白表現的照片圖；第9B圖係顯示以反轉錄-聚合酶連鎖反應分析經不同濃度之亞丁基苯酞(BP)處理之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株之Axl基因及GAPDH基因表現的照片圖；第10圖係顯示以西方墨點法分析經不同濃度之亞丁基苯酞(BP)處理之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株之MMP-2蛋白及肌動蛋白表現的照片圖；第11圖係顯示以侵襲試驗系統分析經不同濃度之亞丁基苯酞(BP)處理之口腔癌幹細胞ALDH1⁺CD44⁺-1細胞株及ALDH1⁺CD44⁺-2細胞株的之侵襲能力所得的結果，其中第11A圖顯示位於侵襲試驗系統下室中之聚碳酸酯濾膜之染色結果的照片圖，第11B圖顯示量化後之相對侵襲能力的長條圖；第12圖係顯示以西方墨點法分析經不同濃度之亞丁基苯酞(BP)處理之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株之E-cadherin蛋白、TGFβ-1蛋白、Slug蛋白、及β-肌動蛋白表現的照片圖；第13圖係顯示以傷口癒合試驗測試腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株，經不同處理後之遷移能力所得的結果，其中上兩排係顯示經不同濃度之亞丁基苯酞(BP)處理後之結果的照片圖，而下兩排係顯示經不同濃度之雙氯乙基亞硝脲(BCNU)處理後之結果的照片圖；第14A圖係顯示於顯微鏡下觀察帶有pcDNA3.0-Axl 或pcDNA3.0-neo質體之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株的照片圖；第14B圖係顯示以西方墨點法分析帶有pcDNA3.0-Axl或pcDNA3.0-neo質體之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株之Axl-1蛋白及β-肌動蛋白表現的照片圖；第14C圖係顯示以傷口癒合試驗測試經不同濃度之亞丁基苯酞(BP)處理後之帶有pcDNA3.0-Axl或pcDNA3.0-neo質體之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株之遷移能力所得的結果；第15圖係以軟洋菜膠細胞群落形成方法探討經不同濃度之亞丁基苯酞(BP)處理後之口腔癌幹細胞的腫瘤起始活性所得的結果，其中第15A圖顯示ALDH1⁺CD44⁺-1細胞株及ALDH1⁺CD44⁺-2細胞株之細胞群落形成的照片圖，第15B圖顯示ALDH1⁺CD44⁺-1細胞株及ALDH1⁺CD44⁺-2細胞株之相對細胞群落形成能力的長條圖；以及第16圖係顯示以動物實驗分析亞丁基苯酞(BP)於抑制癌症幹細胞之腫瘤起始活性所得的結果，包括未經亞丁基苯酞(BP)處理之控制組小鼠(以「」顯示)、每天注射100毫克/公斤體重之亞丁基苯酞(BP)之實驗組小鼠(以「」顯示)、及每天注射200毫克/公斤體重之亞丁基苯酞(BP)之實驗組小鼠(以「」顯示)的結果，其中第16A圖顯示各組小鼠在不同時間點之平均體重(克)，第16B圖顯示各組小鼠在不同時間點之平均腫瘤體積，第16C圖顯示各組小鼠之GFP訊號強度的照片圖，第16D圖顯示將各組小鼠之GFP訊號強度量化後之結果的長條圖。

以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外，除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「有效量」或「治療有效量」，係指投予至個體時，可有效至少部分改善懷疑個體之病情的化合物數量；所謂「個體」係指哺乳動物，哺乳動物可為人類或非人動物。

本案發明人發現，對於一癌症幹細胞，亞丁基苯酞(BP)係有效於以下之至少一者：抑制癌症幹細胞之存活率、抑制癌症幹細胞生長因子(例如：EZH2蛋白)表現、抑制癌症幹細胞之幹細胞性維持之標誌(例如：CD133蛋白、Sox-2蛋白、Oct4蛋白)的表現、抑制與癌症幹細胞之增生、抗細胞凋亡、遷移、及侵襲相關之基因(例如：Axl基因)或蛋白(例如：Axl蛋白、Gas6蛋白、MMP-2蛋白)的表現、抑制與癌症幹細胞之轉移相關之蛋白(例如：E-cadherin蛋白、TGFβ-1蛋白、及Slug蛋白)的表現、以及抑制癌症幹細胞遷移至傷口的能力。於本發明部分具體實施態樣中，亞丁基苯酞(BP)係透過抑制Sox-2、Oct4、及EZH2的表現，以預防、減緩及/或抑制癌症幹細胞之生長、遷移、侵襲及/或轉移。

因此，本發明係關於使用亞丁基苯酞(BP)於製造一製劑之用途。其中，該製劑係用以預防、減緩及/或抑制癌症幹細胞之生長、遷移、侵襲及/或轉移。

本發明製劑可適用於任何合宜的癌症幹細胞，包括例如：口腔癌幹細胞、鼻咽癌幹細胞、食道癌幹細胞、骨髓瘤幹細胞、皮膚癌幹細胞、黑色素瘤幹細胞、甲狀腺癌幹細胞、淋巴瘤幹細胞、血癌幹細胞、乳癌幹細胞、膀胱癌幹細胞、卵巢癌幹細胞、子宮頸癌幹細胞、前列腺癌幹細胞、胃癌幹細胞、肝癌幹細胞、肺癌幹細胞、大腸癌幹細胞、直腸癌幹細胞、胰臟癌幹細胞、膽囊癌幹細胞、腎臟癌幹細胞、神經膠母細胞瘤幹細胞、胸腺惡性腫瘤幹細胞、橫紋肌肉瘤幹細胞、腦瘤幹細胞、及髓母細胞瘤幹細胞。於本發明部分具體實施態樣中，該製劑係用於預防、減緩及/或抑制口腔癌幹細胞、胰臟癌幹細胞及/或腦瘤幹細胞之生長、遷移、侵襲及/或轉移。

根據本發明所提供之製劑可以呈任何合宜的形式，並無特殊的限制。舉例言之，但不以此為限，該製劑可以藥劑之形式提供，亦可以呈固體或流體之食品或食品添加劑的形式提供。

當以藥劑之形式提供本發明製劑時，該藥劑係可視所欲之投藥形式而呈對應之合宜劑型。舉例言之，但不以此為限，該藥物可以口服或非經口服(例如皮下、靜脈內、肌肉、腹腔、或鼻腔)之投藥方式施用至有需要之個體上。視使用形式及用途而定，可選用合宜之載劑以提供該藥劑。

以適於口服投藥之劑型為例，本發明所提供之藥劑可含有任何不會不利影響亞丁基苯酞(BP)之所欲效益的醫藥上可接受之載劑，例如：溶劑(水、食鹽水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其類似物、及前述之組合)、油性溶劑、稀釋劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑、固體載劑(例如澱粉、皂土(bentonite))等。可利用任何合宜之方法，以適於口服投藥的劑型提供該藥劑，例如：錠劑(例如糖衣錠)、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、乳劑、及酊劑等。

至於適於皮下、靜脈內、肌肉、或腹腔注射之注射劑型或點滴劑型，則可於本發明所提供之藥劑中含有一或多種例如等張溶液、鹽類緩衝液(如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液)、增溶劑、乳化劑、5%糖溶液、以及其他載劑等成分，以靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等劑型提供該藥劑。或者，將該藥劑製備成一注射前固體，以可溶於其他溶液或懸浮液中之劑型、或可乳化之劑型提供該注射前固體，並於投予至該有需要之個體之前，將該注射前固體溶於其他溶液或懸浮液中或將其乳化，提供所欲之注射劑。此外，適於經鼻腔或經皮膚投予之外用劑型，則例如乳液、乳霜、凝膠(例如水凝膠)、膏狀物(例如分散膏、軟膏)、噴霧劑、或溶液(例如洗液、懸浮液)。

視需要地，可於本發明所提供之藥劑中另含有合宜用量之添加劑，例如可提高該藥劑於服用時的口適感及視覺感受之調味劑、調色劑、著色劑等，以及可改善該藥劑的穩定性及儲存性之緩衝劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。此外，該藥劑可視需要另含一或多種其他活性成分，或者與含該一或多種其他活性成分之藥物併用，以進一步加強該藥劑之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對亞丁基苯酞(BP)之所欲效益沒有不利的影響即可。

可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率施用本發明所提供之藥劑，端視投予個體之年齡、體重、及健康況狀(例如：所欲處理的病症以及該病症的嚴重程度)而異。舉例言之，當以口服方式施用至一個體以預防、減緩及/或抑制癌症幹細胞之生長、遷移、侵襲及/或轉移時，以亞丁基苯酞(BP)計，其用量為每天約30毫克/公斤體重至約500毫克/公斤體重，較佳為每天約40毫克/公斤體重至約120毫克/公斤體重，更佳為每天約50毫克/公斤體重至約90毫克/公斤體重，其中，該單位『毫克/公斤體重』係指每公斤體重個體所須之投藥量。惟，對於急性患者而言，其用量可視實際需要而酌增，例如增加至數倍或數十倍。

視需要地，可將本發明藥劑與以下之一者併用，以預防、減緩及/或抑制癌症幹細胞之生長、遷移、侵襲及/或轉移：外科手術治療、化學療法、放射線療法、抗體療法、免疫療法、抗血管生成療法、表現型之改變療法、及分化療法。

當根據本發明所提供之製劑以食品添加物之形式提供時，其可呈例如粉末、液體、懸浮液、顆粒等不同型態，以方便於食品製造過程中添加；而當該製劑以食品之形式提供時，則可為例如乳製品、肉類加工品、麵包類、麵食品、餅乾、口含錠、果汁類、茶類、運動飲料、營養飲料等，且可以是健康食品(例如：術後營養補充品)，但不以此為限。

可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率食用本發明所提供之健康食品，端視投予個體之年齡、體重、及健康況狀而異。亦可針對特定族群調整本發明所提供之健康食品中亞丁基苯酞(BP)的含量，較佳為調整至每日應服用的量。舉例言之，若一個體之建議攝取量為每日約50毫克亞丁基苯酞(BP)，又該健康食品每份含25毫克之亞丁基苯酞(BP)，則該個體每日可食用大約二份該健康食品。

可於本發明健康食品之外包裝標示建議使用量、特定族群(例如孕婦、糖尿病患者)的使用標準及條件、或與其他食品或醫藥共同服用的建議事項，以利使用者在無醫師、藥師或相關執事人員指導下可在家自行服用而無安全疑慮。

本發明另提供一種預防、減緩及/或抑制癌症幹細胞之生長、遷移、侵襲及/或轉移的方法，其係包含於有需要之個體中投予有效量之亞丁基苯酞(BP)。其中，有關亞丁基苯酞(BP)之施用型態與適用劑量，以及適用之癌症幹細胞的態樣等，均如上述之說明。

茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。

實施例

實施例1：亞丁基苯酞(BP)於抑制癌症幹細胞生長之效益

(1-1)

為研究亞丁基苯酞(BP)於抑制癌症幹細胞生長的效果，分別以不同濃度(0、25、50、62.5、75、100微克/毫升)之亞丁基苯酞(BP)、不同濃度(0、25、125、250、500、1000微莫耳濃度)之雙氯乙基亞硝脲(bis-chloroethylnitrosourea，BCNU；為目前臨床上用於治療惡性腦膠質瘤的化學療法藥物之一)、或不同濃度(0、100、200、400、800、1600微莫耳濃度之替莫唑胺(temozolomide，TMZ；為目前臨床上用於治療惡性腦膠質瘤的化學療法藥物之一)，對腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株或惡性腦膠質瘤DBTRG細胞株進行處理，歷時24或48小時，其後，利用細胞存活率試驗(MTT assay)分析腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株及惡性腦膠質瘤DBTRG細胞株之存活率。以處理濃度為0之組別的結果為基準，計算各實驗組的細胞相對存活率，結果示於第1A、1B圖、及表1。

由第1A、1B圖可知，不論處理24或48小時，腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株的相對存活率皆明顯隨著亞丁基苯酞(BP)或雙氯乙基亞硝脲(BCNU)的濃度提高而下降。另一方面，由表1可知，以亞丁基苯酞(BP)、雙氯乙基亞硝脲(BCNU)、或替莫唑胺(TMZ)處理腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株24小時的半抑制濃度(The half maximal inhibitory concentration，IC₅₀)分別為406微莫耳濃度(即，76.5微克/毫升)、377.6微莫耳濃度(即，80.8微克/毫升)、及大於1600微莫耳濃度(即，大於310.6微克/毫升)。前述結果顯示，亞丁基苯酞(BP)對於癌症幹細胞之生長具有抑制效果，且優於目前臨床上的化學療法藥物。

(1-2)

分別以不同濃度(0、25、50、100微克/毫升)之亞丁基苯酞(BP)，對正常人類口腔角質細胞(Normal Human Oral Keratinocyte，NHOK)或類頭頸癌起始細胞(head and neck cancer-derived tumor initiating cell-like，HNC-TIC-like)之口腔癌幹細胞ALDH1⁺CD44⁺-1細胞株及ALDH1⁺CD44⁺-2細胞株進行處理，歷時24小時，其後，利用細胞存活率試驗(MTT assay)分析正常人類口腔角質細胞、類頭頸癌起始細胞之口腔癌幹細胞ALDH1⁺CD44⁺-1及ALDH1⁺CD44⁺-2細胞株之存活率，結果示於第2圖。

由第2圖可知，正常人類口腔角質細胞的存活率並未隨著亞丁基苯酞(BP)的濃度提高而下降，而類頭頸癌起始細胞之口腔癌幹細胞ALDH1⁺CD44⁺-1及ALDH1⁺CD44⁺-2細胞株的存活率皆明顯隨著亞丁基苯酞(BP)的濃度提高而下降。前述結果再次證明，亞丁基苯酞(BP)對於癌症幹細胞之生長具有抑制效果，且對正常之細胞不具細胞毒性，不會引發因細胞毒性所導致的副作用，故可用於提供一優良之抑制癌症幹細胞生長的藥物。

實施例2：亞丁基苯酞(BP)於抑制癌症幹細胞生長因子表現的效益

已知基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)基因為癌症幹細胞之一關鍵生長因子，其係影響癌症幹細胞的生長。因此，分別以不同濃度(0、12.5、25、50、62.5、75微克/毫升)之亞丁基苯酞(BP)，對腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株進行處理，其後，萃取細胞之蛋白質，並以西方墨點法(Western Blotting)確認經亞丁基苯酞(BP)處理之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株之EZH2蛋白的表現，結果示於第3圖。

由第3圖可知，腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株之EZH2蛋白的表現明顯隨著亞丁基苯酞(BP)的濃度提高而下降。前述結果再次證明，亞丁基苯酞(BP)對於癌症幹細胞之生長具有抑制效果。

實施例3：亞丁基苯酞(BP)於抑制癌症細胞及癌症幹細胞之幹細胞性(stemness)的效益

(3-1)

已知CD44蛋白、CD133蛋白、Sox-2(sex-determining region Y protein(SRY)-related high-mobility group box 2)蛋白、及Oct4(octamerbinding transcription factor 4)蛋白皆為癌症幹細胞維持其幹細胞性(stemness)的重要標誌(marker)，參與調節癌症幹細胞之自我更新及分化。因此，分別以不同濃度(0、12.5、25、50、62.5、75微克/毫升)之亞丁基苯酞(BP)，對腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株進行處理，歷時24小時，其後，萃取細胞之蛋白質，並以西方墨點法確認經亞丁基苯酞(BP)處理之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株之CD133蛋白、Sox-2蛋白、及Oct4蛋白的表現，結果示於第4圖及第5圖。另，分別以不同濃度(0、12.5、25、50微克/毫升)之亞丁基苯酞(BP)，對胰臟癌細胞MiaPaCa-2細胞株進行處理，歷時24小時，其後，萃取細胞之蛋白質，並以西方墨點法確認經亞丁基苯酞(BP)處理之胰臟癌細胞MiaPaCa-2細胞株之Sox-2蛋白、CD133蛋白、及CD44蛋白的表現，結果示於第6圖。又，分別以不同濃度(0、25、50微克/毫升)之亞丁基苯酞(BP)，對類頭頸癌起始細胞之口腔癌幹細胞ALDH1⁺CD44⁺-1或ALDH1⁺CD44⁺-2細胞株進行處理，歷時24小時，其後，萃取細胞之蛋白質，並以西方墨點法確認經亞丁基苯酞(BP)處理之類頭頸癌起始細胞之口腔癌幹細胞ALDH1⁺CD44⁺-1及ALDH1⁺CD44⁺-2細胞株之Sox-2蛋白及Oct4蛋白的表現，結果示於第7圖。

由第4圖及第5圖可知，腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株之CD133蛋白、Sox-2蛋白、及Oct4蛋白的表現明顯隨著亞丁基苯酞(BP)的濃度提高而下降。另，由第6圖可知，胰臟癌細胞MiaPaCa-2細胞株之Sox-2蛋白、CD133蛋白、及CD44蛋白的表現亦隨著亞丁基苯酞(BP)的濃度提高而下降。又，由第7圖可知，類頭頸癌起始細胞之口腔癌幹細胞ALDH1⁺CD44⁺-1及ALDH1⁺CD44⁺-2細胞株之Sox-2蛋白及Oct4蛋白的表現皆隨著亞丁基苯酞(BP)的濃度提高而下降。前述結果顯示，亞丁基苯酞(BP)具有抑制癌症細胞及癌症幹細胞之幹細胞性的效果。

(3-2)

ALDH蛋白亦為癌症幹細胞維持其幹細胞性(stemness)的重要標誌(marker)，參與調節癌症幹細胞之自我更新及分化。因此，分別以不同濃度(0、25、50微克/毫升)之亞丁基苯酞(BP)，對類頭頸癌起始細胞之口腔癌幹細胞ALDH1⁺CD44⁺-1及ALDH1⁺CD44⁺-2細胞株進行處理，歷時24小時。其後，由各組取1×10⁵個細胞懸浮於50微升幹細胞鑑定套組(ALDEFLUOR array kit，購自加拿大溫哥華STEMCELL Technologies公司)之緩衝溶液中，並於該細胞懸浮液中加入ALDEFLUOR至最終濃度為1微莫耳濃度。接著，以7-ADD進行染色，再以流式細胞儀分析經亞丁基苯酞(BP)處理之類頭頸癌起始細胞之口腔癌幹細胞ALDH1⁺CD44⁺-1及ALDH1⁺CD44⁺-2細胞株之ALDH蛋白的活性(稱為實驗組)，結果示於第8圖。

重覆前述實驗，但於細胞懸浮液中一併加入N,N-二乙基-4-氨基苯甲醛(N,N-diethylaminobenzaldehyde，DEAB；為ALDH抑制劑)至最終濃度為150微莫耳濃度，此為控制組，結果亦示於第8圖。

由第8圖可知，於加入DEAB之控制組中，不論是否經亞丁基苯酞(BP)處理，具有ALDH蛋白活性的活細胞僅佔所有活細胞的0.1%。另一方面，於未加入DEAB之實驗組中，具有ALDH蛋白活性的活細胞數量係隨著亞丁基苯酞(BP)的濃度提高而減少。前述結果顯示亞丁基苯酞(BP)具有抑制癌症幹細胞之ALDH蛋白活性的效果，再次證明亞丁基苯酞(BP)具有抑制癌症幹細胞之幹細胞性的效果。

實施例4：亞丁基苯酞(BP)於抑制癌症幹細胞之增生、抗細胞凋亡、遷移、侵襲的效益

(4-1)

已知Axl(即，一酪胺酸激酶受體(receptor tyrosine kinase))的表現與癌症幹細胞之增生、抗細胞凋亡、遷移、侵襲的能力有關。因此，以不同濃度(0、12.5、25、50、62.5、75微克/毫升)之亞丁基苯酞(BP)，對腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株進行處理，歷時24小時，其後，萃取細胞之蛋白質及總RNA(total RNA)，並進行西方墨點法和反轉錄-聚合酶連鎖反應(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)，以確認經亞丁基苯酞(BP)處理之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株之Axl蛋白、Gas6蛋白(即，Axl之配體蛋白)、及Axl基因的表現，結果示於第9A、9B圖。

由第9A、9B圖可知，Axl蛋白、Gas6蛋白、及Axl基因的表現皆明顯隨著亞丁基苯酞(BP)的濃度提高而下降。前述結果顯示，亞丁基苯酞(BP)具有抑制癌症幹細胞之增生、抗細胞凋亡、遷移、侵襲的效益。

(4-2)

已知癌症幹細胞進行侵襲時，需先透過基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)將細胞外基質(extracellular matrix，ECM)分解。其中，明膠酶(gelatinases)的表達和腫瘤擴散的組織病理學有著高度相關性，包括Gelatinase-A(即，MMP-2)與Gelatinase-B(即，MMP-9)。因此，以不同濃度(0、12.5、25、50、62.5、75微克/毫升)之亞丁基苯酞(BP)，對腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株進行處理，歷時24小時，其後，萃取細胞之蛋白質，並進行西方墨點法確認經亞丁基苯酞(BP)處理之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株之MMP-2蛋白的表現，結果示於第10圖。

由第10圖可知，MMP-2蛋白的表現明顯隨著亞丁基苯酞(BP)的濃度提高而下降。前述結果再次證明，亞丁基苯酞(BP)具有抑制癌症幹細胞之遷移及侵襲的效果。

(4-3)

本研究進一步以穿透式侵襲試驗系統(Transwell® system，購自英國Corning公司)搭配孔徑大小為8微米之聚碳酸酯濾膜(購自英國Corning公司)探討亞丁基苯酞(BP)於抑制癌症幹細胞之遷移及侵襲的效益。首先，將基底凝膠(Matrigel^TM，購自美國BD Pharmingen公司)塗覆於該聚碳酸酯濾膜上，再將經塗覆之聚碳酸酯濾膜置於該穿透式侵襲試驗系統的下室(lower chamber)中，並於下室加入含有10%血清之培養液。另一方面，以不同濃度(0、25、50微克/毫升)之亞丁基苯酞(BP)，對類頭頸癌起始細胞之口腔癌幹細胞ALDH1⁺CD44⁺-1及ALDH1⁺CD44⁺-2細胞株進行處理，歷時24小時。其後，以1×10⁵個細胞/100微升之細胞密度，將前述經處理之口腔癌幹細胞以不含血清之培養液繼續培養於該穿透式侵襲試驗系統的上室(upper chamber)中，歷時24小時。最後，去除下室中的培養液，取出下室中的聚碳酸酯濾膜並以4%之甲醛水溶液進行固定，經結晶紫(crystal violet)染色後，於顯微鏡下以100倍之放大倍率計數五個不同視野下的細胞數目，並拍照紀錄，結果示於第11A圖。以處理濃度為0微克/毫升之組別的結果為基準，計算各實驗組細胞的相對侵襲能力，結果示於第11B圖。

由第11A圖可知，該聚碳酸酯濾膜上的細胞數目明顯隨著亞丁基苯酞(BP)的濃度提高而減少，且由第11B圖可知，該癌症幹細胞之相對侵襲能力亦隨著亞丁基苯酞(BP)的濃度提高而降低。前述結果再次證明，亞丁基苯酞(BP)具有抑制癌症幹細胞之遷移及侵襲的效果。

實施例5：亞丁基苯酞(BP)於抑制癌症幹細胞轉移之效益

(5-1)

已知癌症幹細胞發生上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)時，癌症幹細胞之E-黏附蛋白(E-cadherin)的表現會下降，使得癌症幹細胞間的聚集力降低、產生高度侵襲性與移動力、且脫離原發腫瘤，而發生轉移。因此，以不同濃度(0、12.5、25、50、62.5、75微克/毫升)之亞丁基苯酞(BP)，對腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株進行處理，歷時24小時，其後，萃取細胞之蛋白質，並以西方墨點法確認經亞丁基苯酞(BP)處理之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株之E-cadherin蛋白、TGFβ-1蛋白(具有誘發上皮細胞間質轉化的能力)、及Slug蛋白(Snail轉錄抑制蛋白家族的成員之一，具有促進癌細胞轉移的特性)的表現，結果示於第12圖。

由第12圖可知，TGFβ-1蛋白及Slug蛋白的表現皆明顯隨著亞丁基苯酞(BP)的濃度提高而下降，而E-cadherin蛋白的表現則隨著亞丁基苯酞(BP)的濃度提高而增加。前述結果顯示，亞丁基苯酞(BP)係藉由抑制TGFβ-1蛋白及Slug蛋白的表現，而調控E-cadherin蛋白的表現增加，故可用於抑制癌症幹細胞發生上皮細胞間質轉化、抑制癌症幹細胞轉移。

(5-2)

本研究進一步以傷口癒合試驗(wound healing assay)探討亞丁基苯酞(BP)於抑制癌症幹細胞轉移的效益。首先，以不同濃度(0、12.5、25、50、62.5、75微克/毫升)之亞丁基苯酞(BP)或不同濃度(0、25、50、100、200、400微莫耳濃度)之雙氯乙基亞硝脲(BCNU)，對腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株進行處理，歷時24小時。同時，於進行該處理的第0及24小時，觀察腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株遷移至傷口的情形，並拍照紀錄，結果示於第13圖。

由第13圖可知，相較於以雙氯乙基亞硝脲(BCNU)處理之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株，其遷移至傷口的細胞數目並未隨著雙氯乙基亞硝脲(BCNU)的濃度提高而減少，以亞丁基苯酞(BP)處理之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株遷移至傷口的細胞數目明顯隨著亞丁基苯酞(BP)的濃度提高而減少。前述結果顯示，亞丁基苯酞(BP)具有抑制癌症幹細胞轉移的能力。

(5-3)

為進一步探討亞丁基苯酞(BP)抑制癌症幹細胞的轉移能力，是否與Axl有相關。本研究使用Lipofectmine 2000轉染試劑，將pcDNA3.0-Axl以及pcDNA3.0-neo質體分別轉染至腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株，並以200至600微克/毫升之G418進行篩選，同時也將G418添加至未轉染之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株進行篩選，以獲得帶有pcDNA3.0-Axl或pcDNA3.0-neo質體之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株，其後以顯微鏡觀察此二細胞株，並拍照，結果示於第14A圖。接著，萃取此二細胞株之蛋白質，並以西方墨點法確認此二細胞株之Axl蛋白及β-肌動蛋白的表現，結果示於第14B圖。另，以不同濃度(0、12.5、25、50、62.5、75微克/毫升)之亞丁基苯酞(BP)，分別對帶有pcDNA3.0-Axl或pcDNA3.0-neo質體之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株進行處理，歷時24小時。同時，於進行該處理的第0及24小時，觀察帶有pcDNA3.0-Axl及pcDNA3.0-neo質體之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株遷移至傷口的情形，並拍照紀錄，結果示於第14C圖。

由第14C圖可知，相較於帶有pcDNA3.0-neo質體之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株(即，未過度表現Axl蛋白之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株)，其遷移至傷口的細胞數目明顯隨著亞丁基苯酞(BP)的濃度提高而減少，帶有pcDNA3.0-Axl質體之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株(即，過度表現Axl蛋白之腦瘤幹細胞CSCs^CD133+細胞株)遷移至傷口的細胞數目受到亞丁基苯酞(BP)抑制的現象則不明顯。綜合前述結果與實施例4的結果可知，亞丁基苯酞(BP)可透過抑制Axl表現而抑制癌症幹細胞的轉移。

實施例6：亞丁基苯酞(BP)於抑制癌症幹細胞之腫瘤起始活性(tumor initiating activity)之效益

(6-1)

本研究以軟洋菜膠細胞群落形成方法(soft agar colony formation assay)探討亞丁基苯酞(BP)於抑制癌症幹細胞之腫瘤起始活性(tumor initiating activity)的效益。首先，以不同濃度(0、25、50微克/毫升)之亞丁基苯酞(BP)，對類頭頸癌起始細胞之口腔癌幹細胞ALDH1⁺CD44⁺-1及ALDH1⁺CD44⁺-2細胞株進行處理，歷時24小時，其後，將前述經處理之細胞分別以2×10⁴之起始細胞數接種於上層洋菜膠[含有DMEM培養液(Dulbecco's Modifled Eagle's Medium)、10%(v/v)胎牛血清(Fetal Calf Serum，FCS)、以及0.3%(w/v)洋菜膠](購自Sigma-Aldrich)中。另一方面，於6孔培養盤的各孔中加入2毫升之下層洋菜膠[含有DMEM培養液、10%(v/v)FCS、以及0.6%(w/v)洋菜膠](購自Sigma-Aldrich)，待洋菜膠凝固後，分別於不同孔中加入2毫升之前述各組上層洋菜膠(含有口腔癌幹細胞)。其後，將培養盤置於37℃培養箱中進行培養，歷時4週。最後，該下層洋菜膠以0.005%之結晶紫(crystal violet)進行染色後，係置於顯微鏡下計數五個不同視野(直徑大於或等於100微米)下的細胞群落數目，並拍照紀錄，結果示於第15A圖。以處理濃度為0微克/毫升之組別的結果為基準，計算各實驗組細胞的相對細胞群落形成能力，結果示於第15B圖。

由第15A圖可知，下層洋菜膠中的細胞群落數目明顯隨著亞丁基苯酞(BP)的濃度提高而減少；由第15B圖可知，該癌症幹細胞細胞之相對細胞群落形成能力亦隨著亞丁基苯酞(BP)的濃度提高而減少。前述結果顯示，亞丁基苯酞(BP)可有效抑制癌症幹細胞之腫瘤起始活性。

(6-2)

本研究進一步以動物實驗探討亞丁基苯酞(BP)於抑制癌症幹細胞之腫瘤起始活性的效益。首先，以相同條件飼養年齡介於5至6週之BALB/c-nu/nu品系的裸小鼠(每隻之重量約18至22克，共9隻)，歷時4週。然後，將轉染有GFP之穩定構築的類頭頸癌起始細胞之口腔癌幹細胞細胞株(1×10⁴個/0.1毫升/每隻小鼠)皮下注射到小鼠的腋下。待腫瘤生長至體積達到100立方毫米後，將小鼠分成一控制組與二實驗組(共三組，每組3隻)，並對該二實驗組小鼠分別注射100毫克/公斤體重/每天及200毫克/公斤體重/每天之亞丁基苯酞(BP)，對控制組則僅注射vehicle(不含亞丁基苯酞(BP))，歷時6天。接著，於注射亞丁基苯酞(BP)或vehicle後的第10天，每隔2天測量各組小鼠的平均體重，並測量腫瘤之平均長度與平均寬度後以下式1計算腫瘤的平均體積，結果分別示於第16A、16B圖(共測量22天)。同時，以IVIS影像系統針測各組小鼠之GFP訊號(即，綠色螢光)，並拍照紀錄，結果示於第16C圖。並且以Image-Pro Plus軟體分析各組小鼠之GFP訊號強度，結果示於第16D圖。

式1：[長度×寬度²]/2(單位：立方毫米)

由第16A至16D圖可知，在小鼠的體重方面沒有明顯改變的情況下，相較於未注射亞丁基苯酞(BP)的控制組，實驗組小鼠的GFP訊號強度係明顯減少，且腫瘤體積係於注射亞丁基苯酞(BP)後，隨時間經過而減少。前述結果再次顯示，亞丁基苯酞(BP)可有效抑制癌症幹細胞之腫瘤起始活性。

由以上實驗結果可知，亞丁基苯酞(BP)可有效於抑制癌症幹細胞之存活率、抑制癌症幹細胞生長因子表現、抑制癌症幹細胞之幹細胞性維持之標誌的表現、抑制與癌症幹細胞之增生、抗細胞凋亡、遷移、及侵襲相關之基因或蛋白的表現、抑制與癌症幹細胞之轉移相關之基因或蛋白的表現、抑制與癌症幹細胞遷移至傷口的能力，尤其可有效抑制Sox-2、Oct4、及EZH2的表現，故可用以預防、減緩及/或抑制癌症幹細胞之生長、遷移、侵襲及/或轉移。

Claims

一種使用亞丁基苯酞(butylidenephthalide，BP)於製造一製劑的用途，其中該製劑係用以預防、減緩及/或抑制癌症幹細胞(cancer stem cells，CSCs)之生長、遷移(migration)、侵襲(invasion)及/或轉移(metastasis)。
如請求項1之用途，其中該製劑係抑制Sox-2、Oct4、及EZH2的表現以預防、減緩及/或抑制癌症幹細胞之生長、遷移、侵襲及/或轉移。
如請求項1之用途，其中該癌症幹細胞係以下之至少一者：口腔癌幹細胞、鼻咽癌幹細胞、食道癌幹細胞、骨髓瘤幹細胞、皮膚癌幹細胞、黑色素瘤幹細胞、甲狀腺癌幹細胞、淋巴瘤幹細胞、血癌幹細胞、乳癌幹細胞、膀胱癌幹細胞、卵巢癌幹細胞、子宮頸癌幹細胞、前列腺癌幹細胞、胃癌幹細胞、肝癌幹細胞、肺癌幹細胞、大腸癌幹細胞、直腸癌幹細胞、胰臟癌幹細胞、膽囊癌幹細胞、腎臟癌幹細胞、神經膠母細胞瘤幹細胞、胸腺惡性腫瘤幹細胞、橫紋肌肉瘤幹細胞、腦瘤幹細胞、及髓母細胞瘤幹細胞。
如請求項1之用途，其中該癌症幹細胞係口腔癌幹細胞、胰臟癌幹細胞、及/或腦瘤幹細胞。
如請求項1之用途，其中該癌症幹細胞係口腔癌幹細胞。
如請求項1之用途，其中該癌症幹細胞係胰臟癌幹細胞。
如請求項1之用途，其中該癌症幹細胞係腦瘤幹細胞。
如請求項1至7中任一項之用途，其中該製劑係一藥劑、一食品、或一食品添加劑。
如請求項8之用途，其中該製劑係一藥劑且該藥劑之用量，以亞丁基苯酞(BP)計，為每天約30毫克/公斤體重至500毫克/公斤體重。
如請求項9之用途，其中該藥劑之用量，以亞丁基苯酞(BP)計，為每天約40毫克/公斤體重至120毫克/公斤體重。