ES2786226T3 - Un módulo de válvula de purga molecular bioquímico sintético que mantiene el equilibrio de cofactores - Google Patents

Abstract

Una ruta metabólica recombinante, artificial o diseñada mediante ingeniería genética en un sistema exento de células o un microorganismo que comprende una pluralidad de etapas enzimáticas que convierten un sustrato en un producto, en la que la ruta incluye una producción desequilibrada y la utilización de un primer cofactor, comprendiendo dicha ruta: una primera enzima dependiente de cofactores que puede convertir un primer sustrato en un segundo sustrato, dicha enzima da lugar a la producción desequilibrada y a la utilización de un primer cofactor; una segunda enzima dependiente de cofactores que también puede convertir el primer sustrato en el segundo sustrato, en la que la segunda enzima dependiente de cofactores es un mutante de la primera enzima dependiente de cofactores que se ha modificado para tener su preferencia de cofactores alterada hacia un segundo cofactor; y una enzima que recicla el primer cofactor, en la que el primer cofactor comprende NAD+/NADH y el segundo cofactor comprende NADP+/NADPH, y en la que la ruta comprende una NADH deshidrogenasa, una NADPH deshidrogenasa que es una NADH deshidrogenasa mutante que utiliza NADP+ en vez de NAD+, y una NADH oxidasa.

Description

DESCRIPCIÓN

Un módulo de válvula de purga molecular bioquímico sintético que mantiene el equilibrio de cofactores

Campo técnico

La divulgación proporciona rutas diseñadas mediante ingeniería genética para la producción química usando un sistema de purga molecular que equilibra los cofactores.

Antecedentes

El mayor beneficio ambiental potencial de la ingeniería metabólica sería la producción de productos químicos de bajo valor/alto volumen, tales como biocombustibles. Sin embargo, los altos rendimientos requeridos para la viabilidad económica de los productos químicos de bajo valor son particularmente difíciles de lograr en microbios debido a la miríada de rutas bioquímicas en competición, necesarias para la viabilidad celular.

Korman et al., divulgan un sistema bioquímico sintético para la producción in vitro de isopreno a partir de intermedios de la glucolisis (Protein Science, vol. 23, n.° 5, 12 de marzo de 2014, páginas 576-585). Satoh et al., divulgan la síntesis de poli(3-hidroxibutirato) catalizada por enzimas a partir de acetato con recirculación de CoA y regeneración de NADPH in vitro (Journal of Bioscience and Bioengineering, vol 95, n.°4, 1 de enero de 2003, páginas 335-341). Heux et al., divulgan la ingeniería de cofactores en Saccharomyces cerevisiae: expression of a H2O-forming NADH oxidase and impact on redox metabolism (Metabolic Engineering, vol. 8, n.°4, 1 de julio de 2006, páginas 303-314).

Sumario

La presente invención proporciona una ruta metabólica recombinante, artificial o diseñada mediante ingeniería genética que comprende una pluralidad de etapas enzimáticas que convierten un sustrato en un producto, en la que la ruta incluye una producción desequilibrada y la utilización de un cofactor de la ruta que comprende: una primera enzima dependiente de cofactores que puede convertir un primer sustrato en un segundo sustrato, dicha enzima da lugar a la producción desequilibrada y a la utilización de un primer cofactor; una segunda enzima dependiente de cofactores que también puede convertir el primer sustrato en el segundo sustrato, en la que la segunda enzima dependiente de cofactores es un mutante de la primera enzima dependiente de cofactores que se ha modificado para tener su preferencia de cofactores alterada hacia un segundo cofactor; y una enzima que recicla el primer cofactor, en la que el primer cofactor comprende NAD+/NADH y el segundo cofactor comprende NADP+/NADPH, y en la que la ruta comprende una NADH deshidrogenasa, una NADPH deshidrogenasa que es una NADH deshidrogenasa mutante que utiliza NADP+ en vez de NAD+, y una NADH oxidasa.

En una realización de lo anterior, la NADH deshidrogenasa es un complejo de una NADH piruvato deshidrogenasa. En una realización adicional, el complejo de la NADH piruvato deshidrogenasa comprende una subunidad a de la piruvato deshidrogenasa, una subunidad b de la piruvato deshidrogenasa, una dihidrolipoamida acetiltransferasa, y una dihidrolipoamida deshidrogenasa. En una realización adicional más, la subunidad a de la piruvato deshidrogenasa comprende una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID nO:1, en la que la subunidad b de la piruvato deshidrogenasa comprende una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO:2, en la que la dihidrolipoamida acetiltransferasa es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO:3, y en la que la dihidrolipoamida deshidrogenasa es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO:5, en la que el complejo convierte el piruvato en acetil-CoA. En una realización adicional más, la NADPH deshidrogenasa es un complejo de una NADPH piruvato deshidrogenasa mutante que utiliza NADP+. En una realización adicional, el complejo de la NADPH piruvato deshidrogenasa comprende una subunidad a de la piruvato deshidrogenasa, una subunidad b de la piruvato deshidrogenasa, una dihidrolipoamida acetiltransferasa, y una dihidrolipoamida deshidrogenasa mutante que utiliza preferentemente NADP+. En otra realización, la subunidad a de la piruvato deshidrogenasa comprende una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID ⁿO:1, en la que la subunidad b de la piruvato deshidrogenasa comprende una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO:2, en la que la dihidrolipoamida acetiltransferasa es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO:3, y en la que la dihidrolipoamida deshidrogenasa es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO:7 y utiliza preferentemente NADP+, en la que el complejo convierte el piruvato en acetil-CoA. En otras realizaciones adicionales, la NADH oxidasa es una NoxE o una homóloga de la misma. En una realización adicional, la NADH oxidasa comprende una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID ⁿO:10. En otra realización de cualquiera de las anteriores, la ruta es un sistema exento de células. En otra realización adicional, la ruta recombinante, artificial o diseñada mediante ingeniería genética produce PHB. En otra realización más, la ruta recombinante, artificial o diseñada mediante ingeniería genética produce isopreno.

La presente descripción proporciona un sistema enzimático que comprende una ruta metabólica que incluye una pluralidad de enzimas para convertir un sustrato en un producto, teniendo la ruta metabólica una utilización desequilibrada de cofactores reductores/oxidantes, en la que el sistema enzimático comprende una válvula de purga metabólica que comprende una NADH piruvato deshidrogenasa, y una NADPH piruvato deshidrogenasa y una NADH/NADPH oxidasa.

Se describe también en el presente documento un microorganismo recombinante que comprende una NADH piruvato deshidrogenasa heteróloga, una NADPH piruvato deshidrogenasa y una NADH y/o NADPh oxidasa.

La descripción proporciona también un polipéptido recombinante que comprende una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 5 y que comprende las mutaciones E206V, G207R, A208K, y S213R. En una realización, el polipéptido comprende la secuencia de SEQ ID NO:7.

La descripción proporciona también un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 5 y que comprende las mutaciones E206V, G207R, A208K, y S213R. En un ejemplo adicional, el polinucleótido codifica un polipéptido de la SEQ ID NO: 7. En un ejemplo adicional, el polinucleótido comprende una secuencia que es un 70-90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO:6 y codifica un polipéptido de la SEQ ID NO:7.

La descripción proporciona también una ruta recombinante, artificial o diseñada mediante ingeniería genética que convierte un sustrato en un producto deseado, en la que la ruta incluye una producción desequilibrada y la utilización de un cofactor de la ruta que comprende una primera etapa metabólica que produce un primer cofactor reducido y una segunda etapa metabólica que oxida el primer cofactor reducido, en la que la ruta comprende la ruta de una válvula de purga que recircula un segundo cofactor reducido. En un ejemplo, el primer cofactor reducido comprende NADPH y el segundo cofactor reducido comprende NADH. En un ejemplo adicional, la ruta de la válvula de purga comprende una NADH deshidrogenasa y una NADH oxidasa. En un ejemplo más adicional, la NADH deshidrogenasa es una NADH piruvato deshidrogenasa. En otro ejemplo, el primer cofactor reducido comprende NADH y el segundo cofactor reducido comprende NADPH. En otro ejemplo más, la ruta de la válvula de purga comprende una NADPH deshidrogenasa y una NADPH oxidasa. En un ejemplo adicional, la NADPH deshidrogenasa es una NADPH piruvato deshidrogenasa. En otro ejemplo de cualquiera de los anteriores la ruta produce isopreno a partir de piruvato. En otro ejemplo más de cualquiera de los anteriores la ruta produce PHB. Los detalles de una o más realizaciones de la invención se muestran en los dibujos acompañantes y en la descripción a continuación. Otras características, objetos y ventajas serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos adjuntos, que se incorporan y constituyen una parte de esta memoria descriptiva, ilustran una o más realizaciones de la divulgación y, junto con la descripción detallada, sirven para explicar los principios y las implementaciones de la invención.

La Figura 1A-C muestra un sistema de una válvula de purga bioquímica sintética para la producción de PHB. (A ) La ruta metabólica in vitro para la conversión del piruvato a PHB. La ruta comprende 6 reacciones separadas: reacción 1 (PDHnadh), reacción 2 (PDHnadph), reacción 3 (NoxE), reacción 4 (PhaA), reacción 5 (PhaB), reacción 6 (PhaC). La válvula de purga está destacada en la ruta recuadrada. (B) Cómo se diseña la válvula de purga para que funcione. A bajo NADPH (alto NADP+), ^{p d h nadph} domina la reacción, generando Acetil-CoA y ⁿA^d PH a partir de piruvato y NADP+. La válvula de purga está eficazmente "cerrada". En condiciones de alta concentración de NADPH (baja concentración de NADP+), se realiza una privación de la enzima ^{p d h nadph} por el cofactor oxidado, suprimiendo la ruta de la Acetil-CoA. En esta situación, se hace cargo el sistema PDHNADPH/NoxE, produciendo Acetil-CoA; la válvula de purga está "abierta". (C) Un esquema de ingeniería química ilustrativo del sistema de la válvula de purga usando en la producción de PHB a partir de piruvato, que implica un bucle de recirculación de cofactores.

La Figura 2 muestra el diseño de la enzima ^{p d h} nadph. Las estructuras de la subunidad E3 de G. stearothermophilus natural (E3, traza de la estructura principal) se muestran superpuestas sobre la estructura de la glutatión reductasa de E. coli (GTX-NADPH, traza de la estructura principal en gris). El sustrato NADPH de la glutatión transferasa se muestra con una representación de palos, mostrando la colocación del resto fosfato que necesita acomodarse. Se muestran los restos cambiados para aceptar el fosfato (E206V, G207R, A208K, y S213R).

La Figura 3 muestra la producción de PHB usando un sistema optimizado. En esta reacción, la producción de PHB se controla por un aumento de A600 producido mediante precipitación de los gránulos de PHB. No se observa aumento en la ausencia de la polimerasa PHB, PhaC. Se confirmó la producción de PHB mediante un ensayo de cromatografía de gases. La A340 controla el nivel de NADPH ya que no se deja que NADH se acumule debido a la presencia de NoxE. El sistema de la válvula de purga mantiene un alto nivel de NADPH a lo largo de la reacción.

La Figura 4 muestra un curso temporal de la reacción de optimización del piruvato a PHB utilizando relaciones subóptimas de p d h nadph y PDHNA H Las trazas de A340, controlan los niveles de NADPH que se encuentran en tres fases distintas. Una reducción inicial rápida de NADPH por el p d h nadph va seguida por una oxidación lenta del NADPH por PhaB a medida que aumentan los niveles intermedios. A medida que la reacción procede, la válvula de purga se cierra y los niveles de NADPH aumentan de nuevo. La evolución del sistema coincide con el aumento en A600 que representa la precipitación de los gránulos de PHB de la solución.

La Figura 5A-B muestra que el sistema de la válvula de purga es robusto. (A ) El gráfico muestra un rendimiento relativo de PHB tras el inicio con diferentes cantidades de cada uno de los cofactores. Los rendimiento relativos representan la relación de la A600 final para la reacción, con respecto a la A600 final para la reacción optimizada. Todas las reacciones muestran un rendimiento relativamente robusto en comparación con el control negativo que carece de la enzima phaC final (barra naranja). Las barras de error reflejan la desviación estándar de las tres reacciones independientes. (B) Tabla de los números reflejados en el gráfico en la parte A.

La Figura 6A-B muestra el empleo de la válvula de purga para la producción de isopreno. (A ) La ruta metabólica in vitro para la conversión del piruvato a isopreno. La válvula de purga destacada en el recuadro comprende las mismas enzimas/reacciones que en la Fig. 1A. En la ruta del mevalonato, se usan 3 Acetil-CoA para preparar HMG-CoA (enzimas 6 y 7). HMG-CoA se reduce por HMGR (enzima 8) con 2 NADPH para dar mevalonato. A continuación se usan 3 ATP para convertir el mevalonato en pirofosfato de isopentenilo seguido por la producción de isopreno (enzimas 9-12). (B) El gráfico muestra la dependencia de la producción de isopreno de la válvula de purga. No se usó válvula de purga en la primera reacción (PDHNADH, NADPH, NoxE). Se añadió simplemente NADPH y se recirculó NADH usando NoxE. El experimento final (PDHNADH, p d h nadph, NoxE) muestra los resultados que emplea el sistema de válvula de purga. Dejar fuera cualquier componente del sistema de la válvula de purga dio como resultado drásticas disminuciones en la producción de isopreno. Cada reacción se llevó a cabo por duplicado.

La Figura 7 muestra la estabilidad de las enzimas GsPDH. Las enzimas se incubaron a una temperatura dada durante 1 hora y a continuación se evaluaron inmediatamente para la actividad.

La Figura 8 muestra la estabilidad del sistema PHB a temperatura ambiente. Se mezclaron todos los componentes del sistema optimizado, dejando fuera el piruvato y a continuación el sistema se incubó a temperatura ambiente. La reacción se inició en varios momentos mediante la adición del piruvato y se controló la extensión de la reacción mediante la DO600. El gráfico muestra el porcentaje de extensión de la reacción conseguido para cada tiempo de preincubación.

Descripción detallada

Tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "y", y "el/la" incluyen las referencias plurales salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a "un polinucleótido" incluye una pluralidad de dichos polinucleótidos y la referencia a "la enzima" incluye la referencia a una o más enzimas, y así sucesivamente.

A no ser que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente una persona normalmente experta en la materia a la cual pertenece esta divulgación. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica de los métodos y composiciones divulgados, se describen en el presente documento métodos, dispositivos y materiales ilustrativos.

Además, el uso de "o" significa "y/o" a no ser que se indique otra cosa. De forma similar, "comprenden", "comprende", "que comprende" "incluye", "incluye", y "que incluye", son indistintos y no se pretende que sean limitantes.

Debe entenderse además que, cuando las descripciones de diversas realizaciones utilizan el término "que comprende", los expertos en la materia entenderán que, en algunos casos específicos, una realización puede describirse alternativamente utilizando el lenguaje "consiste esencialmente en" o "consiste en".

Cualquier publicación descrita anteriormente y a través del texto se proporciona únicamente para su publicación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que los inventores no tienen derecho a anteponer dichas publicaciones en virtud de la divulgación anterior.

Como se usa en el presente documento, una "actividad" de una enzima es una medida de su capacidad para catalizar una reacción que da como resultado un metabolito, es decir, para "funcionar", y puede expresarse como la velocidad a la que se produce el metabolito de la reacción. Por ejemplo, la actividad enzimática se puede representar como la cantidad de metabolito producido por unidad de tiempo o por unidad de enzima (por ejemplo, concentración o peso), o en términos de afinidad o constantes de disociación.

El término "ruta biosintética", denominado también "ruta metabólica", se refiere a un conjunto de reacciones bioquímicas anabólicas o catabólicas para convertir (transmutar) una especie química en otras. Los productos génicos pertenecen a la misma "ruta metabólica" si ellos, en paralelo o en serie, actúan sobre el mismo sustrato, producen el mismo producto, o actúan o producen un intermedio metabólico (es decir, metabolito) entre el mismo sustrato y el producto final del metabolito. La divulgación proporciona rutas biosintéticas in vitro que comprenden una válvula de purga metabólica y también proporcionan un microorganismo recombinante que tiene una ruta diseñada mediante ingeniería metabólica que comprende una válvula de purga metabólica para la producción de un producto o intermedio deseado.

Como se usa en el presente documento, un "cofactor" se refiere generalmente a un compuesto o metabolito químico que es necesario para la actividad biológica de una proteína. Estas proteínas son comúnmente enzimas, y los cofactores ayudan en las transformaciones bioquímicas. Los cofactores incluyen, aunque no de forma limitativa, uno o más iones inorgánicos, o un complejo orgánico o una molécula metaloorgánica denominada algunas veces coenzima; la mayoría de las cuales se derivan de vitaminas y de los nutrientes orgánicos requeridos en pequeñas cantidades. Algunas enzimas o complejos de enzimas requieren algunos cofactores. Por ejemplo, el complejo multienzimático de la piruvato deshidrogenasa en la unión de la glucolisis y el ciclo del ácido cítrico requieren cinco cofactores orgánicos y un ion metálico: débilmente unidos al pirofosfato de tiamina (TPP), la lipoamida unida covalentemente y el flavina adenina dinucleótido (FAD), y los cosustratos nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) y la coenzima A (CoA), y un ion metálico (Mg2+). Los cofactores orgánicos son a menudo vitaminas o se preparan a partir de vitaminas. Pueden contener el nucleótido adenosina monofosfato (AMP) como parte de sus estructuras, tales como ATP, coenzima A, FAD, y NAD+.

Una "enzima" significa cualquier sustancia, compuesta normalmente completamente o en última instancia por aminoácidos que forman una proteína o polipéptido que cataliza o promueve, más o menos específicamente, una o más reacciones químicas o bioquímicas.

El término "expresión" con respecto a un gen o polinucleótido se refiere a la transcripción del gen o el polinucleótido y, según sea apropiado, la traducción del transcrito de ARNm resultante en una proteína o polipéptido. Así, como será evidente según el contexto, la expresión de una proteína o polipéptido da como resultado la transcripción y la traducción del marco de lectura abierto.

Un "metabolito" se refiere a cualquier sustancia producida por el metabolismo o una sustancia necesaria o que participa en un proceso metabólico concreto que proporciona un metabolito, una sustancia química, alcohol o cetona deseados. Un metabolito puede ser un compuesto orgánico que es un material de partida (por ejemplo, un carbohidrato, un fosfato azucarado, piruvato, etc.), un intermedio en (por ejemplo, acetil-CoA), o un producto final (por ejemplo, isopreno o PHB) del metabolismo. Los metabolitos se pueden usar para construir más moléculas complejas, o se pueden descomponer en unas más simples. Se pueden sintetizar metabolitos intermedios a partir de otros metabolitos, usados quizá para preparar sustancias más complejas, o descomponer en compuestos más simples, a menudo con la liberación de energía química.

Como se usa en el presente documento, la expresión "diseñado mediante ingeniería metabólica" o "diseño mediante ingeniería metabólica" implica un diseño de ruta racional y un ensamblaje de genes biosintéticos, de genes asociados con operones, y elementos de control de dichos polinucleótidos, para la producción de un metabolito deseado, tal como acetil-CoA, alcoholes superiores u otras sustancias químicas, en un microorganismo o in vitro. "Diseñado mediante ingeniería metabólica" puede incluir además la optimización del flujo metabólico mediante la regulación y la optimización de la transcripción, traducción, estabilidad de la proteína y funcionalidad de la proteína usando el diseño mediante ingeniería genética y una condición de cultivo adecuada que incluye reducción, perturbación, o desactivación genética de, una ruta metabólica competidora que compite con un intermedio que lleva a una ruta deseada. Un gen biosintético puede ser heterólogo para el microorganismo hospedador, tanto por ser extraño para el hospedador como por haberse modificado mediante mutagénesis, recombinación y/o asociación con una secuencia de control de la expresión heteróloga en una célula hospedadora endógena. En una realización, donde el polinucleótido es xenogénico para el organismo hospedador, el polinucleótido puede estar optimizado para el codón.

Una "válvula de purga metabólica" se refiere a una ruta metabólica diseñada mediante ingeniería genética que 'purga' los metabolitos y cofactores en exceso resultantes de la recirculación del metabolito o cofactor para su uso en una ruta metabólica primaria.

Los términos "polinucleótido", "ácido nucleico" o "ácido nucleico recombinante" se refieren a polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (ADN), y, en su caso, ácido ribonucleico (ARN).

Una "proteína" o "polipéptido", términos que se usan indistintamente en el presente documento, comprende una o más cadenas de bloques componentes químicos denominados aminoácidos que están unidos entre sí por enlaces químicos llamados enlaces peptídicos. Una proteína o polipéptido puede funcionar como una enzima.

Las expresiones "microorganismo recombinante" y célula hospedadora recombinante" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a microorganismos que se han modificado genéticamente para expresar o expresar en exceso polinucleótidos endógenos, o para expresar secuencias no endógenas, tales como las incluidas en un vector. El polinucleótido codifica generalmente una enzima diana implicada en una ruta metabólica para producir un metabolito deseado como se describe en el presente documento, pero puede incluir también factores de proteínas necesarios para la regulación o la actividad o la transcripción. Por consiguiente, los microorganismos recombinantes descritos en el presente documento se han diseñado mediante ingeniería genética para expresar o expresar en exceso enzimas diana que no se han expresado o expresado en exceso previamente por un microorganismo parenteral. Se entiende que las expresiones "microorganismo recombinante" y "célula hospedadora recombinante" no se refieren solo al microorganismo recombinante concreto sino a la progenie o a la progenie potencial de dicho microorganismo.

El término "sustrato" o "sustrato adecuado" se refiere a cualquier sustancia o compuesto que se convierte o se entiende que se convierte en otro compuesto mediante la acción de una enzima. El término incluye no solo un compuesto individual, sino también combinaciones de los compuestos, tales como soluciones, mezclas y otros materiales que contienen al menos un sustrato, o sus derivados. Además, el término "sustrato" abarca no solo compuestos que proporcionan una fuente de carbono adecuada para usar como material de partida, sino también metabolitos intermedios y metabolitos de productos finales usados en una ruta como se describe en el presente documento. Además, un sustrato puede ser un cofactor oxidado o reducido o un factor que está fosforilado o desfosforilado.

Se han empleado el diseño mediante ingeniería metabólica y la biología sintética para la producción de sustancias químicas de alto valor pero que no han tenido tanto éxito como se esperaba en satisfacer las rigurosas restricciones económicas de la fabricación a gran escala de productos químicos. Los sistemas microbianos están a menudo limitados por una variedad de desafíos técnicos que dificultan alcanzar un coste competitivo, incluyendo malos rendimientos debidos a rutas competitivas; baja productividad producida por tasas de crecimiento lentas o dificultades en la optimización de la ruta; crecimiento microbiano contaminante; toxicidad del producto; y aislamiento del producto caro.

Una estrategia que está comenzando a captar la atención es llevar a cabo transformaciones bioquímicas complejas utilizando mezclas de enzimas en un recipiente de reacción o sistema de flujo más bien que en una célula. Construir rutas únicas y dedicadas in vitro puede eliminar reacciones secundarias que se producen en la célula, de tal manera que son posibles rendimientos de casi el 100 % y tiempos de reacción rápidos. Los sistemas bioquímicos in vitro permiten también un control más preciso sobre la optimización y los problemas de toxicidad del producto se pueden diagnosticar y mitigar más fácilmente. Además, la extracción del producto puede ser más fácil.

Tradicionalmente, se ha relegado la construcción de la ruta in vitro a su uso como de investigación o en aplicaciones que requieren solo 1-3 enzimas para la producción de compuestos quirales y otras sustancias químicas de alto valor. Mejoras en la expresión de las proteínas y el acceso a enzimas estables han posibilitado sistemas más complejos. Se han notificado sistemas de biotransformación in vitro en los últimos años que implican sistemas de aproximadamente treinta enzimas. Uno de los primeros estudios modernos en este campo fue una ruta artificial que producía hidrógeno a partir de almidón. El concepto se adelantó recientemente con un sistema creativo que generaba hidrógeno a partir de celobiosa con rendimientos próximos al 100%. En otro esfuerzo, se expresaron heterólogamente enzimas de la glucolisis hipertermófilas, que se purificaron térmicamente y se ensamblaron para convertir la glucosa en n-butanol con un rendimiento del 82 %. En otro estudio, se construyó una ruta de Entner-Doudoroff no fosforilativa elegantemente simplificada a partir de archaea hipertermófilas para producir etanol e isobutanol con rendimientos ~55 %. Estos estudios pioneros ilustran la flexibilidad de la bioquímica sintética y el potencial para altos rendimientos.

El mantenimiento de un correcto equilibrio de cofactores es una parte esencial de la generación de flujo y proporciona una fuerza de impulsión adecuada a través de una ruta enzimática. In vivo, la especificidad enzimática por los cofactores NADH y NADPH se usa normalmente para controlar el flujo de carbono a través de las rutas catabólica y anabólica respectivamente. Los organismos normalmente detectan el estado de reducción de estos cofactores y utilizan esta información para regular positiva o negativamente las rutas catabólicas y anabólicas para hacer frente a los cambios ambientales. Los sistemas in vitro, sin embargo, no tienen la miríada de rutas periféricas que facilitan este control. Además, las especificidades anabólicas y catabólicas naturales de NADH y NADPH complican las biotransformaciones in vitro. Los sistemas bioquímicos sintéticos a menudo se han ocupado de estos problemas mediante consideraciones cuidadosas de la estequiometría de cofactores en el diseño de la ruta, mediante el uso de metabolitos propiciatorios caros, enzimas rediseñadas genéticamente de forma que se necesite solo un único tipo de cofactor, añadir cofactores en exceso, o añadir constantemente intermedios a la mezcla de reacción para sostener el proceso.

Aunque los métodos, composiciones y sistemas descritos en el presente documento se describen con referencia a determinados productos metabólicos, los métodos, composiciones y sistemas son aplicables a una amplia gama de rutas bioquímicas recombinantes en donde es importante la recirculación de cofactores. En una ruta diseñada mediante ingeniería genética ilustrativa, la divulgación describe la producción de polihidroxibutiratos (PHB) y polihidroxialcanoatos (PHA). En otra realización ilustrativa, la divulgación describe la producción de isopreno. Ambas realizaciones utilizan un sistema de válvula de purga molecular de la divulgación para mantener el equilibrio de cofactores adecuado.

Los PHB y otros PHA son sustancias termoplásticas biodegradables. Los PHA pueden tener características similares a muchos polímeros derivados de sustancias petroquímicas populares, pero son no tóxicos y biodegradables, por tanto, estas composiciones están atrayendo atención creciente como una posible alternativa verde a polímeros basados en el petróleo en una amplia gama de aplicaciones. El polímero PHA mejor caracterizado y más abundante es polihidroxibutirato (PHB) que se produce naturalmente a partir de Acetil-CoA como un mecanismo de almacenamiento de carbono y energía en muchos organismos. En la actualidad, la producción industrial de PHB se lleva a cabo en procesos de cultivos discontinuos in vivo con privación de nutrientes. Este proceso consume normalmente mucho tiempo, requiere grandes volúmenes de fermentación, y requiere métodos caros para la extracción del PHB. Intentos previos para producir bioplástico in vitro han requerido la adición de sustratos propiciatorios y un exceso molar de cofactores para convertir el acetato en PHB.

El isopreno es una plataforma química para una amplia variedad de productos, pero se emplea principalmente en la producción de caucho sintético. La ruta isoprenoide proporciona también precursores para aproximadamente 25.000 biomoléculas conocidas incluyendo fármacos tales como taxol y biocombustibles potenciales. Se han realizado numerosos esfuerzos para producir isopreno en microorganismos y el menor rendimiento notificado es del 28 % de glucosa. Korman et al. (Protein Sci., 23(5):576-85, mayo de 2014), mostró que el sistema bioquímico sintético podría producir isopreno con un rendimiento >95 % a partir de piruvato siempre que se añadieran cofactores de alta energía. Los ejemplos de isoprenoides que se pueden producir mediante los métodos, composiciones y sistemas de la divulgación se seleccionan entre el grupo que consiste de un hemiterpeno, monoterpeno, diterpeno, triterpeno, tetraterpeno, sesquiterpeno, y politerpeno. Por ejemplo, se puede seleccionar el isoprenoide a partir del grupo que consiste en abietadieno, amorfadieno, careno, a-farneseno, p-farneseno, farnesol, geraniol, geranilgeraniol, isopreno, linalool, limoneno, mirceno, nerolidol, ocimeno, pachulol, p-pineno, sabineno, Y-terpineno, terpinoleno, y valenceno.

La divulgación describe un sistema de válvula de purga para equilibrar cofactores en rutas in vitro para la producción química y en sistemas in vivo. Por ejemplo, la divulgación describe una ruta para convertir el piruvato en PHB que mantiene sostenible el equilibrio de cofactores reductores, sin el requerimiento de una correspondencia estequiométrica perfecta de generación de cofactores y la utilización para el uso del carbono. Además, la divulgación describe el uso del sistema de válvula de purga molecular en otras rutas. Por ejemplo, la divulgación demuestra el sistema de válvula de purga que se puede usar como la base para la producción de otros productos derivados de Acetil-CoA aplicando esto a la producción de isopreno a partir de piruvato mediante la ruta del mevalonato. Así, los módulos reguladores descritos en el presente documento pueden liberarnos de tener que equilibrar perfectamente la utilización del equilibrio de cofactores cuando se diseñan sistemas bioquímicos sintéticos.

La divulgación proporciona un nódulo de control robusto para equilibrar la producción y el consumo de cofactores tales como NADPH y NADH de una manera autorregulante y autoequilibrante. Esta ruta in vitro mantiene el equilibrio de cofactores sin requerir adherencia a la estequiometría en la generación y utilización de cofactores que aseguran el flujo de carbono. Debido en parte a que el sistema puede sostener altos niveles de NADPH, impulsando la transformación hasta casi su finalización, convirtiendo por ejemplo, el piruvato a cualquiera de PHB o isopreno en casi un 100 % del rendimiento teórico. Además, los altos rendimientos en el sistema son robustos hasta variaciones de 10 veces en los niveles de cofactores.

En última instancia, los métodos y composiciones de la divulgación pueden expandirse para incorporar la conversión de sustratos de coste bajo tales como glucosa u otros azúcares en piruvato, que implicarían la ruta de la glucolisis o partes de la ruta de la glucolisis. Por tanto, se ha demostrado anteriormente un sistema bioquímico sintético que emplea la glucolisis. Construyendo compuestos más complejos a partir de Acetil-CoA tales como ácidos grasos, policétidos, y otros isoprenoides que incorporan el uso y la recirculación del ATP. En dichos casos, desarrollar sistemas reguladores similares a la válvula de purga empleada aquí, liberará al diseño del sistema bioquímico sintético de tener que consumir cofactores de alta energía durante la fase anabólica en perfecto equilibrio estequiométrico. Así, la estrategia puede ayudar a diversificar las dianas químicas de la bioquímica sintética.

La biotransformación del piruvato en PHB, ilustra un problema básico de desequilibrio de cofactores que se encuentra en los sistemas bioquímicos. En particular, la conversión del piruvato en Acetil-CoA por la piruvato deshidrogenasa (PDH) da como resultado una molécula de NADH. Sin embargo, la ruta de las tres enzimas (phaA, B, y C) a PHB a partir de Acetil-CoA utiliza solo una mitad de una molécula de NADPH por Acetil-CoA. Así, la ruta convencional produce un exceso de equivalentes reductores. Además, los equivalentes reductores son del tipo fuerte (NADH más bien que NADPH). La divulgación ilustra el sistema de válvula de purga en una ruta para la regulación del NAD y del NADP y sus equivalentes reducidos, como se muestra en la FIG. 1A, que puede generar el cofactor correcto y regular su producción.

En el diseño, se desarrolló una "válvula de purga bioquímica sintética que desacopla eficazmente la producción estequiométrica del NAD(P)H a partir del Acetil-CoA (Fig. 1). A este fin se utilizó una mezcla de un PDH natural que utiliza NAD+ (PDHnadh), un Pd H mutante que utiliza NADP+ (PDHnad h), y una NADH generadora de agua (NoxE) que oxida específicamente NADH, pero no NADPH. Al emplear este nodo metabólico, Se generó NADPH para la producción de PHB a partir de piruvato, pero también disipa los equivalentes reductores en exceso de una manera autorreguladora. Tal como se ilustra en la Fig. 1B, en condiciones de una baja concentración de NADPH, una alta concentración de NADP+, el ^{p d h nadph} mutante puede funcionar para generar Acetil-CoA y restaurar los niveles de NADPH. En condiciones de una alta concentración de NADPH, una baja concentración de NADP+, la actividad del PDH^nadph se cortará automáticamente y el PDHNADH natural se usará preferentemente para producir Acetil-CoA y NADH. En esta condición de alta concentración de NAPDH, no se necesitan equivalentes reductores. Debido a que los equivalentes reductores se producen en la forma de NADH y no de NADPH, se eliminan por una oxidasa, NoxE. La presencia de NoxE asegura que el NADH nunca se acumula y el PDHNA H puede funcionar ya para generar carbono para la ruta PHB en la forma de Acetil-CoA. El sistema Pd Hnadh/ PDHnadPh/ NoxE actúa de la misma forma que una válvula de purga que se abre en condiciones de una alta concentración de NADPH para aliviar la "presión" de los equivalentes reductores en exceso (es decir, la acumulación de NADH) y permite mantener el flujo de carbono. En la Fig. 1C se muestra un esquema de diseño de ingeniería del sistema de la válvula de purga.

Por ejemplo, la divulgación demuestra que para construir un sistema in vitro, se adquirieron las enzimas comercialmente o purificadas, se ensayaron para la actividad, y se mezclaron juntas en un tampón de reacción seleccionado adecuadamente. El sistema comprende un conjunto de un núcleo de enzimas para el sistema de la "válvula de purga" y un conjunto secundario de enzimas para la síntesis de una sustancia química deseada o biocombustible. El sistema de la válvula de purga del núcleo puede utilizarse en combinación con cualquier sistema in vitro que convierta un conjunto de metabolitos (por ejemplo, una primera fuente de carbono) en un segundo metabolito (por ejemplo, un producto químico deseado), en el que la ruta metabólica secundaria (por ejemplo, la ruta del producto) utiliza y/o produce metabolitos de cofactores en exceso (por ejemplo, produce equivalentes reductores en exceso). En dichos casos, se puede utilizar un sistema de válvula de purga para equilibrar los cofactores. Por ejemplo, en el caso de PHB e isopreno, estos equivalentes reductores se pueden utilizar y optimizar. En una realización, la ruta metabólica produce un exceso de un equivalente reductor que es necesario para la producción del producto deseado. Por ejemplo, en el Esquema 1, a continuación, una primera etapa metabólica produce equivalentes reductores y una segunda etapa metabólica utiliza los equivalentes reductores, sin embargo, la segunda etapa utiliza solo una fracción de los equivalentes reductores producidos en la primera etapa. Así, en un sistema cerrado, el factor limitante serán los equivalentes reductores.

Esquema 1

Tras la utilización del NADP+ disponible en el esquema 1, por ejemplo, el sistema se detendría y no fabricaría más metabolitos ("B" o "X"). Sin embargo, en el sistema de la válvula de purga de la divulgación, una ruta secundaria que puede oxidar los equivalentes reductores llegaría a ser activa y permitiría la producción de A a B, permitiendo por tanto a la vez el uso del NADPH en las etapas B a X. Una vez que está presente suficiente NADP+, a continuación, la ruta metabólica de A a B utilizaría el NADP+.

En una realización, la válvula de purga para su uso en un sistema in vitro comprende: una combinación de una enzima NADH- deshidrogenasa y una NADPH-deshidrogenasa y una NADH o NADPH-oxidasa. En una realización, el sistema de la válvula de purga comprende un complejo de una NADH-piruvato deshidrogenasa, un complejo de una NADPH-piruvato deshidrogenasa y una NADH-oxidasa. debe señalarse que se pueden usar otras parejas de deshidrogenasas.

El sistema de la válvula de purga de la anterior realización puede utilizarse en combinación con cualquier ruta metabólica que produzca NADH o NADPH y utilice una fracción de lo que se produjo en la producción de un producto deseado. Por ejemplo, se puede usar el sistema de purga en una ruta que convierta en piruvato en acetil-CoA para producir NADH o NADPH y que utiliza NADH o NADPH para producir adicionalmente un metabolito deseado. Las rutas ilustrativas incluyen las rutas del PHB y el isopreno descritas a continuación.

La divulgación proporciona rutas que se pueden desarrollar in vitro de numerosos modos. Por ejemplo, Las enzimas deseadas se pueden clonar/diseñarse mediante ingeniería genética en un microorganismo o célula, expresarse y a continuación purificarse a partir del cultivo. En otro ejemplo, las enzimas pueden expresarse, las células alterarse y usarse una preparación alterada en las rutas de la divulgación. En otra realización, las enzimas pueden purificarse y anclarse a un sustrato en un sistema (por ejemplo, en un sistema microfluídico) para su uso en la ruta metabólica. En otra realización más, se pueden clonar las enzimas termófilas que tienen la actividad deseada, expresarse, y las células o las preparaciones de las anteriores calentarse a una temperatura en la que las enzimas deseadas permanecen activas mientras que las enzimas indeseadas se desnaturalizan. En otra realización más, las enzimas pueden adquirirse comercialmente y mezclarse según sea adecuado. En todas las realizaciones anteriores, el sistema se combinaría con los sustratos y cofactores necesarios (por ejemplo, NAD-, NADP-, FAD-, AMP, ADP, ATP y similares).

Por consiguiente, la divulgación proporciona microorganismos "diseñados" o "modificados" mediante ingeniería genética que se producen mediante la introducción de material genético en el microorganismo hospedador o precursor de elección modificando o alterando por tanto la fisiología y la bioquímica celular del microorganismo. Mediante la introducción del material genético el microorganismo precursor adquiere nuevas propiedades, por ejemplo, la capacidad de producir cantidades nuevas, o mayores de, un metabolito intracelular. El material genético introducido en el microorganismo precursor contiene gen(es), o partes de gen(es), que codifican una o más de las enzimas implicadas en una ruta biosintética e incluyen gen(es) o partes de gen(es), que codifican una o más de las enzimas implicadas en la válvula de purga metabólica, la(s) ruta(s) útiles para la producción de un metabolito deseado (por ejemplo, acetil-fosfato y/o acetil-CoA), y pueden incluir también elementos adicionales para la expresión y/o regulación de la expresión de estos genes, por ejemplo, secuencias promotoras.

Un microorganismo diseñado o modificado mediante ingeniería genética puede incluir también de manera alternativa o adicionalmente la introducción de un material genético en un microorganismo hospedador o precursor, la alteración, deleción o inactivación génica de un gen o polinucleótido para alterar la fisiología celular y la bioquímica del microorganismo. Mediante la reducción, alteración o inactivación génica de un gen o polinucleótido, el microorganismo adquiere propiedades nuevas o mejoradas (por ejemplo, la capacidad de producir cantidades nuevas o mayores de un metabolito intracelular, mejorar el flujo de un metabolito por la vía deseada, y/o reducir la producción de subproductos indeseables). Por ejemplo, puede ser deseable diseñar mediante ingeniería genética un organismo para expresar un conjunto deseado de enzimas en una ruta metabólica eliminando a la vez las enzimas de las rutas competitivas. Este diseño mediante ingeniería genética puede ser aplicable in vitro (donde tras la alteración o la purificación, no están presentes las enzimas indeseables) o in vivo.

Una proteína "nativa" o "natural", enzima, polinucleótido, gen, o célula, significa una proteína, enzima, polinucleótido, gen, o célula de origen natural.

Un "microorganismo precursor" se refiere a una célula utilizada para generar un microorganismo recombinante. La expresión "microorganismo precursor" describe, en una realización, una célula que se produce en la naturaleza, es decir, una célula natural que no se ha modificado genéticamente. La expresión "microorganismo precursor" describe además una célula que sirve como "precursora" para el diseño mediante ingeniería genética adicional. En esta última realización, la célula puede haberse diseñado mediante ingeniería genética, pero sirve como fuente para un diseño mediante ingeniería genética adicional.

Por ejemplo, un microorganismo natural puede modificarse genéticamente para expresar o expresar en exceso una primera diana enzimática tal como una NADH-piruvato deshidrogenasa. Este microorganismo puede actuar como microorganismo precursor en la generación de un microorganismo modificado para expresar o expresar en exceso una segunda diana enzimática por ejemplo, una NADH-oxidasa. Como se usa en el presente documento, "expresa" o "expresa en exceso" se refiere a la expresión fenotípica de un producto génico deseado. En una realización, un gen que se produce naturalmente en el organismo puede diseñarse mediante ingeniería genética de tal manera que se una a un promotor heterólogo o dominio regulador, en el que el dominio regulador da lugar a la expresión del gen, modificando por tanto su expresión normal relativa al organismo natural. Como alternativa, el organismo puede diseñarse mediante ingeniería genética para eliminar o reducir una función represora en el gen, modificando por tanto su expresión. En otra realización más, un casete que comprende la secuencia génica unida operativamente a un elemento de control/regulador de la expresión deseado se diseña mediante ingeniería genética en el microorganismo.

Por consiguiente, un microorganismo precursor funciona como una célula de referencia para los eventos sucesivos de modificación genética. Cada evento de modificación puede llevarse a cabo introduciendo una o más moléculas de ácidos nucleicos en la célula de referencia. La introducción facilita la expresión o la expresión en exceso de una o más enzimas diana o la reducción o eliminación de una o más enzimas diana. Se entiende que el término "facilita" abarca la activación de los polinucleótidos endógenos que codifican una enzima diana mediante la modificación genética de por ejemplo, una secuencia promotora en un microorganismo precursor. Se entiende además que el término "facilita" abarca la introducción de polinucleótidos exógenos que codifican una enzima diana en un microorganismo precursor.

Los polinucleótidos que codifican enzimas útiles para generar metabolitos que incluyen homólogos, variantes, fragmentos, proteínas de fusión relacionadas o equivalentes funcionales de las mismas, se usan en moléculas de ácidos nucleicos recombinantes que dirigen la expresión de dichos polipéptidos en células hospedadoras adecuadas, tales como células bacterianas o células de levaduras.

El listado de secuencias adjuntas a la presente proporciona secuencias de polinucleótidos ilustrativas que codifican polipéptidos útiles en los métodos descritos en el presente documento. Se entiende que la adición de secuencias que no alteran la actividad codificada de una molécula de ácido nucleico, tal como la adición de una secuencia no funcional o no codificante (por ejemplo, etiquetas de poliHIS), es una variación conservativa del ácido nucleico básico.

Se entiende que un polinucleótido descrito anteriormente incluye "genes" y que las moléculas de ácidos nucleicos descritas anteriormente incluyen "vectores" o "plásmidos". Por consiguiente, el término "gen", denominado también un "gen estructural" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido concreto que comprende una secuencia de aminoácidos, que comprende toda o parte de una o más proteínas o enzimas, y puede incluir secuencias de ADN reguladoras (no transcritas), tales como una región promotora o elementos de control de la expresión, que determinan, por ejemplo, las condiciones en las que se expresa el gen. La región transcrita del gen puede incluir regiones sin traducir, incluyendo intrones, la región 5' sin traducir (UTR), y 3'-UTR, así como la secuencia de codificación.

Los expertos en la materia reconocerán que, debido a la naturaleza degenerada del código genético, se pueden usar una variedad de codones que difieren en sus secuencias de nucleótidos para codificar un aminoácido dado. Un polinucleótido o una secuencia génica concreta que codifica una enzima biosintética o polipéptido descrito anteriormente se mencionan en el presente documento meramente para ilustrar una realización de la divulgación, y la divulgación incluye polinucleótidos de cualquier secuencia que codifican un polipéptido que comprende la misma secuencia de aminoácidos de los polipéptidos y proteínas de las enzimas utilizadas en los métodos de la divulgación. De manera similar, un polipéptido puede tolerar normalmente una o más sustituciones, deleciones, e inserciones de aminoácidos en su secuencia de aminoácidos sin pérdida o pérdida significativa de una actividad deseada. La divulgación incluye dichos polipéptidos con secuencias de aminoácidos alternativas, y las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de ADN que se muestran en el presente documento meramente ilustran las realizaciones ilustrativas de la divulgación.

La divulgación proporciona polinucleótidos en la forma de vectores o plásmidos de expresión de ADN recombinante, como se describe con más detalle en otra parte del presente documento, que codifican una o más enzimas diana. En general, dichos vectores pueden tanto replicarse en el citoplasma del microorganismo hospedador como integrarse en el ADN cromosómico del microorganismo hospedador. En cualquier caso, el vector puede ser un vector estable (es decir, el vector sigue estando presente en muchas divisiones celulares, incluso si existe solo presión selectiva) o un vector transitorio (es decir, el vector es perdido gradualmente por los microorganismos hospedadores con números crecientes de divisiones celulares). La divulgación proporciona moléculas de ADN en forma aislada (es decir, no puras, pero existiendo en una preparación en una abundancia y/o concentración que no se encuentra en la naturaleza) y purificadas (es decir, sustancialmente exentas de materiales contaminantes o sustancialmente exentas de materiales que con el ADN correspondiente se encontrarían en la naturaleza).

Un polinucleótido de la divulgación puede amplificarse utilizando ADNc, ARNm o, como alternativa, ADN genómico, como un molde, y cebadores de oligonucleótidos adecuados de acuerdo con las técnicas de amplificación de la PCR convencionales t aquellos procedimientos descritos en la sección de Ejemplos siguiente. El ácido nucleico así amplificado puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por análisis de secuencia de ADN. Es más, los oligonucleótidos correspondientes a secuencias de nucleótidos pueden prepararse mediante técnicas sintéticas estándar, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automatizado.

Se entiende también que una molécula de polinucleótido aislada que codifica un polipéptido homólogo a las enzimas descritas en el presente documento puede crearse introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido concreto, de tal manera que una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos se introducen en la proteína codificada. Se pueden introducir mutaciones en el polinucleótido mediante técnicas convencionales, tales como mutagénesis dirigida a sitio y mutagénesis mediada por la PCR. En contraste con aquellas posiciones donde puede ser deseable realizar una sustitución de aminoácidos no conservativa, en algunas posiciones es preferible realizar sustituciones de aminoácidos conservativas.

Como se entenderá por aquellos expertos en la materia, puede ser ventajoso modificar una secuencia de codificación para mejorar su expresión en un huésped particular. El código genético es redundante con 64 codones posibles, perro la mayoría de organismos utilizan normalmente un subconjunto de estos codones. Los codones que se utilizan con mayor frecuencia en una especie se llaman codones óptimos y los que no se utilizan muy a menudo se clasifican como codones raros o de bajo uso. Los codones se pueden sustituir para reflejar el uso de codones preferido del huésped, un proceso a veces llamado "optimización de codones" o "control del sesgo de codones de especies".

Se pueden preparar secuencias de codificación optimizadas que contienen codones preferidos por un huésped procariota o eucariota concreto (véase también Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:477-508), por ejemplo, para aumentar la velocidad de traducción o para producir transcritos de ARN recombinante que tengan propiedades deseables, tales como una vida media más larga, en comparación con los transcritos producidos a partir de una secuencia no optimizada. Los codones de terminación de la traducción también pueden modificarse para reflejar las preferencias del huésped. Por ejemplo, los codones de terminación típicos para S. cerevisiae y mamíferos son UAA y UGA, respectivamente. El codón de terminación típico para plantas monocotiledóneas es UGA, mientras que los insectos y E. coli utilizan comúnmente UAA como el codón de terminación (Dalphin et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24: 216-218). Se proporciona la metodología para optimizar una secuencia de nucleótidos para la expresión en una planta, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.° 6.015.891, y las referencias citadas en la anterior.

"Transformación" se refiere al proceso por el cual se introduce un vector en una célula hospedadora. La transformación (o transducción, o transfección), puede conseguirse mediante uno cualquiera de numerosos medios que incluyen la electroporación, microinyección, biolística (o administración mediada por bombardeo de partículas), o transformación mediada por agrobacterium.

Un "vector" se refiere generalmente a un polinucleótido que se puede propagar y transferir entre organismos, células, o componentes celulares. Los vectores incluyen virus, bacteriófagos, provirus, plásmidos, fagémidos, transposones, y cromosomas artificiales tales como YAC (cromosomas artificiales de levaduras), BAC (cromosomas artificiales bacterianos), y PLAC (cromosomas artificiales de plantas, y similares, que son "episomas", es decir, que se replican autónomamente o se pueden integrar en un cromosoma de una célula hospedadora. Un vector puede ser también un polinucleótido de ARN puro, un polinucleótido de ADN puro, un polinucleótido compuesto de a Dn y ARN en la misma hebra, una polilisina conjugada con ADN o ARN, un péptido conjugado a ADN o ARN, un liposoma conjugado a ADN o similar, que no son episómicos en la naturaleza, o pueden ser un organismo que comprende una o más de las anteriores construcciones de polinucleótidos tales como un agrobacterium o una bacteria.

Los diversos componentes de un vector de expresión pueden variar ampliamente, dependiendo del uso previsto del vector y de la(s) células(s) hospedadora(s) en las que se pretende replicar el vector o impulsar la expresión. Los componentes del vector de expresión adecuados para la expresión de los genes y el mantenimiento de los vectores en E. coli, levaduras, Streptomyces, y otras células usadas comúnmente son ampliamente conocidos y están comercialmente disponibles. Por ejemplo, los promotores adecuados para la inclusión en los vectores de expresión de la divulgación incluyen aquellos que funcionan en microorganismos hospedadores eucariotas o procariotas. Los promotores pueden comprender secuencias reguladoras que permiten la regulación de la expresión relativa al crecimiento del microorganismo hospedador o que producen la expresión de un gen para ser activado o desactivado en respuesta a un estímulo químico o físico. Para E. coli y determinadas células hospedadoras bacterianas diferentes, se pueden usar promotores derivados de genes para enzimas biosintéticas, enzimas que confieren resistencia a antibióticos, y proteínas de fagos, e incluyen, por ejemplo, la galactosa, lactosa (lac), maltosa, triptófano (trp), beta-lactamasa (bla), bacteriófago lambda PL, y promotores de T5. Además, se pueden usar también promotores sintéticos, tales como el promotor tac (patente de EE.UU n.° 4.551.433). Para los vectores de expresión de E. coli, es útil incluir un origen de replicación de E. coli, tal como de pUC, p1P, p1, y pBR.

Así, los vectores de expresión recombinantes contienen al menos un sistema de expresión, que, a su vez, está compuesto de al menos una porción de secuencias que codifican un gen unidas operativamente a un promotor y opcionalmente secuencias de terminación que funcionan para efectuar la expresión de la secuencia de codificación en células hospedadoras compatibles. Las células hospedadoras se modifican mediante transformación con los vectores de expresión de ADN recombinante de la divulgación para contener las secuencias del sistema de expresión tanto como elementos extracromosómicos como integradas en el cromosoma.

Además, y como se ha mencionado anteriormente, los homólogos de las enzimas útiles para generar metabolitos están abarcados por los microorganismos y métodos proporcionados en el presente documento. El término "homólogos" utilizado con respecto a una enzima o gen original de una primera familia o especie se refiere a enzimas o genes distintos de una segunda familia o especie que se determinan por sus análisis funcionales, estructurales o genómicos para ser una enzima o gen de la segunda familia o especie que corresponde a la enzima o gen original de la primera familia o especie. Más a menudo, los homólogos tendrán similitudes funcionales, estructurales o genómicas. Se conocen técnicas por las cuales los homólogos de una enzima o gen pueden clonarse fácilmente utilizando sondas genéticas y la PCR. Se puede confirmar la identidad de las secuencias clonadas como homólogas usando ensayos funcionales y/o mediante cartografiado genómico de los genes.

Una proteína tiene "homología" o es "homóloga" a una segunda proteína si la secuencia del ácido nucleico que codifica la proteína tiene una secuencia similar con la secuencia del ácido nucleico que codifica la segunda proteína. Como alternativa, una proteína tiene homología con una segunda proteína si las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos "similares". (Por tanto, la expresión "proteínas homólogas" se define para significar que las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos similares).

Como se usa en el presente documento, dos proteínas (o una región de las proteínas) son sustancialmente homogéneas cuando las secuencias de aminoácidos tienen al menos aproximadamente un 30 %, 40 %, 50 % 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99% de identidad. Para determinar el porcentaje de identidad de las dos secuencias de aminoácidos, o de las dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean a fines comparativos óptimos (por ejemplo, huecos que se pueden introducir en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos para la alineación óptima y las secuencias no homólogas se pueden descartar a fines comparativos). En una realización, la longitud de una secuencia de referencia alineada para fines comparativos es al menos del 30 %, normalmente al menos del 40 %, más normalmente al menos del 50 %, incluso más normalmente al menos del 60 %, e incluso más normalmente al menos del 70 %, 80 %, 90 %, 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. Se comparan entonces los restos de aminoácidos o los nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esta posición (como se usa en el presente documento, "identidad" de aminoácido o de ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácido o de ácido nucleico). el porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartido por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que necesita introducirse para la alineación óptima de las dos secuencias.

Cuando "homólogo" se usa en referencia a proteínas o péptidos, se reconoce que las posiciones de los restos que no son idénticos difieren a menudo en sustituciones de aminoácidos conservativa. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la que un resto de aminoácido está sustituido por otro resto de aminoácido que tiene una cadena secundaria (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambia sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos donde dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de la secuencia o el grado de homología puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Pearson et al., 1994).

En algunos casos, se pueden usar "isozimas" que realizan la misma conversión/reacción funcional, Pero que son de esta manera disimilares en la estructura que se determina normalmente para no ser "homóloga".

Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que el resto de aminoácido se reemplaza con un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Alanina (A), Valina (V), y 6) Fenilalanina (f ), Tirosina (Y), Triptófano (W).

La homología de secuencias para polipéptidos, que se puede denominar como porcentaje de identidad de la secuencia, se mide normalmente usando un software de análisis de secuencias. Véase, por ejemplo, el Paquete del Software de Análisis de Secuencias del Genetics Computer Group (GCG), University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wis. 53705. El software de análisis de proteínas empareja secuencias similares utilizando la medida de la homología asignada a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como "Gap" y "Bestfit" que se puede usar con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencias o la identidad de secuencias entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína natural y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1.

Un algoritmo típico usado que compara la secuencia de una molécula con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST (Altschul, 1990; Gish, 1993; Madden, 1996; Altschul, 1997; Zhang, 1997), especialmente blastp o tblastn (Altschul, 1997). Los parámetros típicos de BLASTp son: Valor esperado: 10 (por defecto); Filtro: seg (por defecto); Coste de apertura de hueco: 11 (por defecto); Coste de extensión de hueco: 1 (por defecto); alineaciones máximas: 100 (por defecto); Tamaño de palabra: 11 (por defecto); n.° de descripciones: 100 (por defecto); Matriz de penalización: BLOWSUM62.

Cuando se busca una base de datos que contiene secuencias de un gran número de diferentes organismos, es típico comparar secuencias de aminoácidos. Se puede medir la búsqueda en la base de datos usando secuencias de aminoácidos mediante algoritmos diferentes del blastp conocido en la técnica. Por ejemplo, se pueden comparar las secuencias de polipéptidos usando FASTA, un programa de GCG Versión 6.1. FASTA proporciona alineaciones y un porcentaje de identidad de la secuencia de las regiones entre las secuencias de búsqueda y respuesta (Pearson, 1990). Por ejemplo, se puede determinar el porcentaje de identidad de la secuencia entre las secuencias de aminoácidos usando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 2 y la matriz de puntuación PAM250), como se proporciona en GCG Versión 6.1.

En determinadas realizaciones, una ruta metabólica convierte una fuente de carbono en un intermedio o producto final deseado. Por ejemplo, una fuente de carbono se puede convertir en piruvato, que se puede metabolizar a acetil-CoA a PHB o isopreno. Las fuentes de carbono adecuadas pueden ser azúcares. Por ejemplo, una fuente de carbono puede ser un azúcar derivado de la biomasa. Un "azúcar derivado de la biomasa" incluye, aunque no de forma limitativa, moléculas tales como glucosa, sacarosa, manosa, xilosa, y arabinosa. La expresión azúcar derivado de biomasa abarca sustratos de carbono adecuados de 1 a 7 carbonos usados ordinariamente por microorganismos, tales como azúcares de 3-7 carbonos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, glucosa, lactosa, sorbosa, fructosa, idosa, galactosa y manosa todos tanto en forma D como en forma L, o una combinación de 3-7 azúcares de carbono, tales como glucosa y fructosa, y/o 6 azúcares de carbono ácidos que incluyen, aunque no de forma limitativa, ácido 2-ceto-L-gulónico, ácido idónico (IA), ácido glucónico (GA), 6-fosfogluconato, ácido 2-ceto-D-glucónico (2 KDG), ácido 5-ceto-D-glucónico, 2-cetogluconatofosfato, ácido 2,5-diceto-L-gulónico, ácido 2,3-L-dicetogulónico, ácido deshidroascórbico, ácido eritórbico (EA) y ácido D-manónico.

Las materias primas y residuos celulósicos y lignocelulósicos, tales como residuos agrícolas, madera, residuos forestales, fangos procedentes de la fabricación del papel, y residuos sólidos municipales e industriales, proporcionan una materia prima renovable potencialmente grande para la producción de sustancias químicas, plásticos, combustibles y piensos. Las materias primas y residuos celulósicos y lignocelulósicos, compuestos por polímeros de carbohidratos que comprenden celulosa, hemicelulosa, y lignina puede tratarse generalmente mediante una variedad de medios químicos, mecánicos y enzimáticos para liberar los azúcares de hexosa y pentosa principalmente. Estos azúcares pueden a continuación "alimentarse" en una ruta para producir piruvato como se describe adicionalmente en el presente documento.

La divulgación proporciona los números de registro de diversos genes, homólogos y variantes útiles en la generación de los microorganismos recombinantes descritos en el presente documento. Debe entenderse que los homólogos y las variantes descritos en el presente documento son ilustrativos y no limitantes. los homólogos adicionales, variantes y secuencias están disponibles para los expertos en la técnica que utilizan diversas bases de datos que incluyen, por ejemplo, el National Center for Biotechnology Information (NCBI) cuyo acceso está disponible en la World-Wide-Web.

Son conocidas en la técnica las condiciones de cultivo adecuadas para el crecimiento y el mantenimiento de un microorganismo recombinante proporcionado en el presente documento.

Se entiende que puede diseñarse mediante ingeniería genética una gama de microorganismos para expresar una o más enzimas de la divulgación. Se entiende que los diversos organismos pueden actuar como "fuentes" para el material genético que codifica las enzimas diana adecuadas para su uso en un microorganismo recombinante proporcionado en el presente documento.

El término "microorganismo" incluye especies microbianas procariotas y eucariotas procedentes de los Dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, incluyendo el último levaduras y hongos filamentosos, protozoos, algas, o Protistas superiores. Los términos "células microbianas" y "microbios" se usan de manera indistinta con el término microorganismo.

El término "procariotas" es reconocido en la técnica y se refiere a células que no contienen núcleo u otros orgánulos celulares. Los procariotas se clasifican generalmente en uno de dos dominios, las Bacteria y las Archaea. La diferencia definitiva entre organismos de los dominios Archaea y Bacteria se basan en diferencias fundamentales en la secuencia de la base nucleotídica en el ARN ribosómico de 16s .

El término "Archaea" se refiere a una clasificación de organismos de la división Mendosicutes, que se encuentran normalmente en entornos inusuales y se distinguen del resto de los procariotas por varios criterios, incluyendo el número de proteínas ribosómicas y la ausencia de ácido murámico en las paredes celulares. En función del análisis del ssrARN, las Archaea consisten es dos grupos filogenéticamente distintos: Crenarchaeota y Euryarchaeota. En función de su fisiología, las Archaea pueden organizarse en tres tipos: metanógenas (procariotas que producen metano); halófilas extremas (procariotas que viven a concentraciones muy altas de sal ([NaCl]); e (hiper) termófilas extremas (procariotas que viven a temperaturas muy altas). A pesar de las características unificantes de las archaeas que las distinguen de las Bacterias (es decir, sin mureína en la pared celular, lípidos de membrana unidos a ésteres, etc.), estos procariotas presentan atributos estructurales o bioquímicos únicos que las adaptan a sus hábitats concretos. Las Crenarchaeota consisten principalmente en procariotas hipertermófilas dependientes de azufre y las Euryarchaeota contienen las metanógenas y halófilas extremas.

"Bacteria", o "eubacteria", se refiere a un dominio de organismos procariotas. Las bacterias incluyen al menos 11 grupos distintos del siguiente modo: (1) bacterias Gram-positivas (gram+), de las cuales existen dos subdivisiones principales: (1) grupo con un alto contenido de G+C (Actinomycetes, Mycobacteria, Micrococcus, diferentes ) (2) grupo con un bajo contenido de G+C (Bacillus, Clostridia, Lactobacillus, Staphylococci, Streptococci, Mycoplasmas); (2) Proteobacteria, por ejemplo, Bacterias Gram-negativas púrpura fotosintéticas no fotosintéticas (incluye la mayoría de bacterias Gram-negativas "comunes"); (3) Cyanobacteria, por ejemplo, fotótrofas oxigénicas; (4) Espiroquetas y especies relacionadas; (5) Planctomyces; (6) Bacteroides, Flavobacteria; (7) Chlamydia; (8) Bacterias sulfuradas verdes; (9) Bacterias no sulfuradas verdes (también, fotótrofas anaerobias); (10) Micrococci radiorresistentes y relacionados; y (11) Thermotoga y Thermosipho thermophiles.

Las "bacterias Gram negativas" incluyen cocos, bacilos no entéricos y bacilos entéricos. Los géneros de bacterias Gram negativas incluyen, por ejemplo, Neisseria, Spirillum, Pasteurella, Brucella, Yersinia, Francisella, Haemophilus, Bordetella, Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Proteus, Vibrio, Pseudomonas, Bacteroides, Acetobacter, Aerobacter, Agrobacterium, Azotobacter, Spirilla, Serratia, Vibrio, Rhizobium, Chlamydia, Rickettsia, Treponema, y Fusobacterium.

Las "bacterias Gram positivas" incluyen cocos, bacilos no esporulantes, y bacilos esporulantes. Los géneros de bacterias Gram positivas incluyen, por ejemplo, Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Lactobacillus, Listeria, Mycobacterium, Myxococcus, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus, y Streptomyces. Por consiguiente, la divulgación proporciona una ruta diseñada mediante ingeniería genética in vitro o in vivo que comprende una NADPH-deshidrogenasa (por ejemplo, una NADPH-PDH o un homólogo de la misma), una NADH-deshidrogenasa (por ejemplo, una NADPH-PDH o un homólogo de la misma), y una NADH-oxidasa (por ejemplo., una NOX o un homólogo de la misma).

Como se ha tratado anteriormente, textos generales que describen técnicas de biología molecular útiles en el presente documento, incluyendo el uso de vectores, promotores y muchos otros temas relevantes, incluyen a Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology Volumen 152, (Academic Press, Inc., San Diego, Calif.) ("Berger"); Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 2a ed., Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (suplementado hasta 1999) ("Ausubel").

Ejemplos de protocolos suficientes para dirigir a personas expertas a través de procedimientos de amplificación in vitro, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación de la Qp-replicasa y otras técnicas mediadas por la ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA), por ejemplo, para la producción de los ácidos nucleicos homólogos de la divulgación se encuentran en Berger, Sambrook y Ausubel, así como en Mullis et al. (1987) patente de Estados Unidos n.° 4.683.202; Innis et al., eds.

1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press Inc. San Diego, Calif.) ("Innis"); Arnheim y Levinson (1 de octubre de 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94; Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 87: 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem 35: 1826; Landegren et al. (1988) Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu y Wallace (1989) Gene 4:560; Barringer et al. (1990) Gene 89:117; y Sooknanan y Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564.

Los procedimientos mejorados para la clonación de ácidos nucleicos amplificados in vitro se describen en Wallace et al., patente de EE.UU n.° 5.426.039.

Los procedimientos mejorados para amplificar ácidos nucleicos grandes mediante PCR se resumen en Cheng et al. (1994) Nature 369: 684-685 y en las referencias citadas en el mismo, donde se generan amplicones de PCR de hasta 40 kb. Un experto apreciará que esencialmente cualquier ARN puede convertirse en un ADN de bicatenario adecuado para la digestión de restricción, expansión de PCR y secuenciación utilizando transcriptasa inversa y una polimerasa. Véase, por ejemplo, Ausubel, Sambrook y Berger, todos citados anteriormente.

La invención se ilustra en los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que sean limitantes.

Ejemplos

Materiales. Se usó medio LB de Miller o agar-LB de Miller (BD Difco) para el crecimiento de las cepas bacterianas en medio líquido o sólido. E. coli BL21Gold(DE3) [B, F-, ompT, hsdSB, (rB-,me-), dcm+, Tetr, galÁ, (DE3) endA Hte] (Agilent) se usó como hospedador tanto para la clonación como para la expresión de las proteínas recombinantes usando vectores pET. E. coli TOP10(DE3) [F-mcrA A (mrr-hsdRMS-mcrBC) 980lacZAM15 AlacX74 nupG recA1 araD139 A (ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 A'] se usó para la expresión de proteínas recombinantes a partir del vector pBAD/p15A. Los plásmidos pET28a(+) y pET22b(+) se adquirieron de Novagen. Se usó HotStart Taq Mastermix (Denville) para la amplificación génica del ADN genómico o plásmido. ADN polimerasaPhusion (Finnizymes), DNA ligasa Taq (MCLab), y Exonucleasa T5 (Epicenter) se adquirieron por separado y se usaron para preparar la mezcla maestra de ensamblaje (AMM) usada para la clonación. ATP, ácido (±)-a-lipoico, piruvato, Coenzima A, y NAD+ fueron de Sigma.

Construcción del plásmido. Se construyeron los plásmidos de expresión para las enzimas PHB a partir de la estructura principal del plásmido pET28a usando los sitios de corte Nde1 y Sac1 para producir construcciones con 6X etiquetas tag en el extremo N para la purificación. Los genes que codifican la acetil CoA acetiltransferasa (phaA; YP_725941) y la acetoacetil-CoA reductasa (phaB; YP_725942) se amplificaron y clonaron a partir del ADN genómico de R. eutropha. El gen que codifica la polihidroxibutirato sintasa (phaC; HE_610111) se sintetizó y optimizó por codones para su expresión en un hospedador de E. coli antes de subclonarse en el vector de expresión pET28a. Para la ruta del isopreno, las construcciones fueron las mismas que las descritas en la referencia (Korman, T. P., Sahachartsiri, B., Li, D., Vinokur, J. M., Eisenberg, D. y Bowie, J. U. (2014), "A synthetic biochemistry system for the in vitro production of isoprene from glycolysis intermediates". Protein Science. doi: 10.1002/pro.2436).

Se usaron células E. coli BL21-Gold como la cepa hospedadora para la expresión de las enzimas. Todas las enzimas se expresaron en medio de Luria-Bertani (LB) suplementado con 50 pg/ml de kanamicina y se indujeron con isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido 0,2 mM añadido al cultivo al final del crecimiento en fase logarítmica. Las phaA, phaB, MVK, PMVK, e IspS se indujeron a 37 °C durante la noche y phaB, THL/HMGR, HMGS, e IDI se indujeron a 18 °C durante la noche. La phaC se indujo a 25 °C durante 5 horas antes de la recogida.

Purificación de la enzima. Las células de 0,5 l de cultivo se recogieron mediante centrifugación y se resuspendieron en Tris 150 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM. Se lisaron las células en hielo con sonicación y se retiraron los residuos celulares mediante centrifugación a 12.000 x g a 4 °C. El sobrenadante se mezcló a continuación con 5 ml de níquel-ácido nitrilotriacético (NTA) agarosa, y después de 30 minutos, la suspensión de agarosa se cargó sobre una columna de gravedad y se lavó con cinco volúmenes de columna de Tris 100 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, imidazol 15 mM. A continuación se eluyó la enzima con imidazol 250 mM, Tris 100 mM, pH 7,5. La enzima resultante se dializó en Tris 50 mM pH 7,5 NaCl 50 mM y se almacenó a 4 °C.

Vectores de expresión para las subunidades E1ap, E2, y E3, de PDH, y LplA de E. coli. Los dominios E1, E2, y E3 se amplificaron por separado a partir del ADN genómico de G. stearothermophilus (ATCC) usando cebadores que contenían 15-20 pb complementarias del gen y 15-20 pb complementarias del sitio de clonación múltiple en el vector donde se colocaría el gen. Los genes que codifican E1a y E1p se amplificaron juntos a partir del ADN genómico de G. stearothermophilus y se clonaron en pET28a(+) que se había digerido con Ncol y Xhol. Esto creó una construcción sin etiqueta para la expresión de E1 bajo el control del promotor T7 donde la traducción de E1a utiliza el RBS procedente del vector pET28 mientras que E1p utiliza el RBS endógeno de G. stearothermophilus. Los dominios E2 y E3 se amplificaron por separado y se clonaron en pET22b(+) digerido con Ndel y Xhol o pET28a(+) digerido con Ncol y Xhol respectivamente para crear las construcciones E2 y E3 sin etiqueta. La lipoato proteína ligasa de E. coli, LplA, se amplificó a partir del ADN genómico de E. coli K12 y se ensambló en pBAD/p15A digerido con Xhol y EcoRI para crear 6xHis-LplA.

Expresión en exceso y purificación de las subunidades PDH de G. stearothermophilus y LpIA de E. coli. Todas las cepas de E. coli se hicieron crecer a 37 °C en medio LB suplementado con un antibiótico adecuado (100 pg/ml de ampicilina, 50 pg/ml de kanamicina, o 34 pg/ml de cloranfenicol). Para todas las construcciones, se usaron 5 ml del cultivo iniciador nocturno para inocular 1 l de medio LB. Cuando la DO600 alcanzó 0,6, se añadieron IPTG 0,3 mM (vectores pET) o arabinosa al 0,02 % (pBAD/p15A) para inducir la expresión de la proteína. Después de 16 horas, se recogieron las células, se resuspendieron (4 ml/g de células húmedas) en Tris-Cl 50 mM pH 7,5 NaCl 0,1 M (Tampón A), se lisaron mediante sonicación, y se retiraron los residuos celulares mediante centrifugación a 30.000xg durante 20 min.

25 ml del lisado de E. coli que contenía 6xHis-LplA se cargaron en 3 ml de una resina Ni-NTA (Qiagen), se lavaron con 25 ml de Tampón A que contenía imidazol 10 mM, y se eluyeron con 5 ml de Tampón A que contenía imidazol 250 mM. A continuación se almacenó 6xHis-LplA puro a 4 °C hasta su uso.

Los dominios individuales de PDH de G. stearothermophilus se purificaron parcialmente a partir de lisados de E. coli con calor antes de la modificación y la reconstitución del complejo PDH. Los lisados que contenían E1ap, E2, o E3 se incubaron a 65 °C durante 35 minutos para desnaturalizar térmicamente las proteínas de E. coli seguido por centrifugación a 30.000xg durante 20 min para aglomerar las proteínas precipitadas. Casi todos los dominios PDH permanecen en el sobrenadante. A continuación, el dominio E2 se lipó en el extracto calentado mediante la adición de ácido (±)-a-lipoico 1 mM, ATP 2 mM, MgCh 3 mM y 50 pg de 6xHis-LplA purificado. A continuación se dejó continuar la reacción de lipoación con una mezcla suave durante la noche a 25 °C, proporcionando E2 lipoado (E2lip). Tras la lipoación, E1ap, E2lip, y E3 se mezclaron en una relación molar 3:1:3 y se incubaron durante al menos 1 hora a 25 °C para formar el complejo GsPDH activo. A continuación se aisló el complejo GsPDH mediante ultracentrifugación (Beckman) durante 4 horas a 95.000xg. El aglomerado amarillo resultante se resuspendió en Tris-Cl 20 mM, pH 7,5 en 1/50 del volumen de partida y se evaluó su actividad. El análisis de SDS-PAGE confirmó la presencia de los 4 dominios e indicó que la preparación era >90 % pura. El complejo reconstituido se almacenó a 4 °C hasta su uso.

Actividad y optimización enzimática. Se evaluó NoxE controlando la oxidación del NAD(P)H a 340 nm. Se llevó a cabo el ensayo en Tris-HCl 100 mM pH 7,5 MgCh 5 mM, KCl 5 mM, y NAD(P)H 0,2 mM.

Se evaluaron PDH WT y mutante controlando la reducción de NAD(P)+ a 340 nm. Se llevó a cabo el ensayo en Tris 50 mM pH 7,5 MgCh 5 mM, piruvato 5 mM, CoA 1 mM, y 0,5 mM de NAD(P)+.

Se evaluó PhaC controlando la absorbancia de la hidrólisis del enlace tioéster del sustrato 3HBCoA a 235 nm. Se llevó a cabo el ensayo en Tris 100 mM pH 7,5, MgCh 5 mM y 3HBCoA 0,15 mM.

Se midieron las actividades de la ruta del isopreno como se ha notificado anteriormente (Korman et al.). En la Tabla A se muestra la cantidad de cada enzima en la ruta reconstituida del isopreno descrita a continuación.

Tabla A. Lista de las enzimas y actividades utilizadas en la producción de PHB o isopreno a partir de piruvato.

Enzima Unidades/mg mg añadidos Unidades añadidas

1 GsPDHNAD 0,082±0,007 0,002/0,0013 0,00016/0,00011 1 ' GsPDHNADP 0,12 ± 0,008 0,076/0,0095 0,009/0,001

2 NoxE 0,35 ±0,036 0,020/0,00625 0,007/0,0022

3 PhaA 76,2 ± 4,4 0,023 1,75

4 PhaB 6,1 ± 0,6 0,014 0,085

5 PhaC 142,7 0,032 4,57

6 E/THL-HMGR 0,06 ± 0,002a 0,003 0,00018

7 EfHMGSb 0,6 ±0,01 0,041 0,025

8 EflHMGR 0,06 ± 0,002a 0,023 0,0014

9 ScMVK 47,0 ± 0,9 0,008 0,38

10 SsPMVK 0,8 ±0,02 0,029 0,023

11 ScMDC 4,0 ± 0,07 0,038 0,152

12 EclDI 0,035c 0,083 0,003

13 PalspS 0,156d 0,088 0,014

a) Evaluado en dirección directa (síntesis) mediante acoplamiento con MvaS y controlando el consumo de NADPH

Condiciones de reacción y análisis final de PHB. La reacción autosostenida optimizada para la biotransformación del piruvato a PHB estaba compuesta por Tris 250 mM pH 7,5, MgCl 5 mM, KCl 5 mM, CoA 0,5 mM, NAD+0,1 mM, NADP+0,5 mM, piruvato 50 mM, 2 pg de PDHnadh, 76 pg de p d h Nadph, 23 pg de phaA, 14 pg de phaB, y 32 pg de phaC en un volumen de reacción final de 200 pl. Se iniciaron las reacciones con la adición de piruvato, que se dejó fuera de la mezcla inicial. Se llevaron a cabo todas las reacciones de PHB a temperatura ambiente. Para el ensayo del comportamiento autorregulador de la válvula de purga, algunas concentraciones enzimáticas fueron subóptimas: 5 pg de phaA, 2,5 pg phaB, y 1,9 pg de phaC.

Para ensayar las PHB, las reacciones se liofilizaron y se incubaron con 1 ml de cloroformo, 0,45 ml de metanol, y 0,05 ml de H2SO4 para hidrolizar el polímero y generar metil 3-hidroxibutirato. Se extrajeron las reacciones con 0,5 ml de agua y se aplicó 1 pl de la capa de cloroformo a una columna HP-Innowax de 0,25 micrómetros usando un cromatógrafo de gases HP 5890 de la Serie II. El método GC usó una temperatura de inyección que se mantuvo a 35 °C durante 5 minutos antes de que se aumentara a 275 °C durante 40 minutos. Se compararon las intensidades máximas con un patrón auténtico para evaluar las concentraciones.

Condiciones de reacción y análisis del isopreno. Se llevó a cabo la producción in vitro de isopreno como se ha descrito anteriormente (Korman et al.) con los siguientes cambios. Se configuraron reacciones de 200 pl en viales de gas de 2 ml precintados que contenían enzimas, piruvato 3 mM, ATP 15 mM, CoA 0,6 mM, NAD+0,2 mM, NADP+0,4 mM (o NADPH 5 mM), MgCh 10 mM, KCl 20 mM, pirofosfato de tiamina 0,1 mM en tris-Cl 100 mM pH 8,5 y se incubaron a 32 °C durante 18 horas. Se controló la producción de isopreno mediante muestreo directo de 100 pl del espacio superior usando una jeringa hermética 100 pl. Se analizó el espacio superior mediante GC-FID (HP5980II) equipado con una columna GS-GasPro (0,32 mm x 30 m, Agilent). Se cuantificó la cantidad de isopreno producida mediante comparación con una curva patrón de varias concentraciones de isopreno muestreadas de la misma manera.

Para implementar el módulo de la válvula de purga, fue necesario una PDH que utilizaba un NADP+. Se ha diseñado mediante ingeniería genética un PDH mutante de E. coli para que tuviera especificidad por NADP+ introduciendo mutaciones en la enzima E3 (EcE3). El PDH de E. coli era, sin embargo, inestable. Se diseñó mediante ingeniería genética una PDH mutante de G. stearothermophilus termófilo que acepta preferentemente NADP+ con estabilidad enzimática aumentada.

De manera similar al diseño de la PDH mutante de E. coli, se diseñó la PDH mutante de G. stearothermophilus (SEQ ID NO:7) superponiendo la estructura conocida de la subunidad E3 del G. stearothermophilus (GsE3) con la estructura conocida de la glutatión reductasa de E. coli relacionada, que utiliza NADP+. La superposición estructural permitió el posicionamiento del resto fosfato adicional en el sitio activo del GsE3, basándose en cómo se había colocado en la glutatión reductasa (véase la Fig. 2). Las sustituciones de la cadena lateral fueron entonces las diseñadas para GsE3 que podían permitir la aceptación del fosfato. Se identificó la directriz de un diseño satisfactorio anterior de la enzima EcE3 que comparte un 47 % de identidad de la secuencia con la GsE3. Las mutaciones introducidas en EcE3 fueron E206V, G207R, A208K, G209H y S213R (numeración de GsE3). Tras examinar los cambios en el contexto de la estructura de GsE3, se introdujeron todos, salvo G209H, ya que parecía que la nueva cadena lateral His podría producir choques estéricos con los restos K224 y N237 cercanos.

Las propiedades cinéticas de las enzimas diseñadas mediante ingeniería genética y las enzimas naturales desvelan que las mutaciones alteran la especificidad como se deseaba.

Los parámetros cinéticos se relacionan en la Tabla B. Para la enzima (GsPDHNADH) de G. stearothermophilus natural kcat es 11,2 veces mayor con NAD+ que NADP+ y kcat/Km es 1150 veces mayor. para el mutante (GsP-DhNADP ) diseñado mediante ingeniería genética, kcat es 7,3 veces mayor con NADP+ que NAD+ y kcat/Km es 21 veces mayor. Así, los inventores fueron capaces dar la vuelta a la especificidad de la enzima PDH.

T l B Li l r i líi l nzim l l l r

Las enzimas GsPDHNADH y GsPDHnadph (designadas de ahora en adelante PDHnadh y PDHnadph) fueron mucho más estables que sus homólogas de E. coli. Como se muestra en la Figura 7, las enzimas de G stearothermophilus retuvieron ~50 % de actividad tras una hora de incubación a 67 °C mientras que las enzimas PDH de E. coli PDH se inactivaron completamente a 50 °C.

Un segundo aspecto del diseño de la válvula de purga es el uso de una NADH oxidasa con una especificidad alta por el cofactor. Se seleccionó NoxE de L. lactis ya que esta es una NADH oxidasa formadora de agua por lo que no genera ningún producto tóxico tal como peróxido de hidrógeno. Tal como se muestra en la Tabla B, la Kcat de NoxE es 248,8 veces mayor con NADH que nAd PH y la kcat/Km es 9900 veces mayor.

En la Tabla C se relacionan las enzimas seleccionadas para los diversos experimentos. En las etapas iniciales solo se usaron el complejo PDHnadh natural y NoxE para generar Acetil-CoA y NADPH se suministró exógenamente. Tras optimizar las relaciones enzimáticas en este sistema, se añadió la p d h Nadph mutante para ensayar la generación de NADPH in situ. Por último, se optimizó la cantidad de p d h nadph, manteniendo las otras enzimas fijas.

Enzima Nombre ^Nú

_re ^m

_g ^e

_is ^r

_t ^o

_ro ^de Plásmido Etiqueta Organismo Válvula de purga

1 PDHnadh Complejo de la piruvato G.

1' PDHnadph deshidrogenasa stearothermophilus 1a E1a ^{Subunidad a de la piruvato} P21873 (SEQ ID

_{deshidrogenasa NO:1)} pET28 ninguna G.

stearothermophilus 1b E1b ^{Subunidad b de la piruvato} P21874 (SEQ ID

_{deshidrogenasa NO:2)} pET28 ninguna G.

stearothermophilus 1c E2 ^{Dihidrolipoamida} CAA37630 (SEQ

_{Acetiltransferasa ID NO:3)} pET22 ninguna G.

stearothermophilus ^gNADH

1d Dihidrolipoamida P11959 (SEQ ID

Deshidrogenasa pET28 ninguna G.

_NO:5) stearothermophilus ^gNADPH

1'd Dihidrolipoamida P11959 (SEQ ID

deshidrogenasa mutante _NO:7) pET29 ninguna G.

stearothermophilus 1e LplA Lipoato Proteína Ligasa ^{NP 418}

_N ⁸

_O ⁰

_: ³

₈ ⁽

₎ ^SEQ pBAD/p15A N-His E _ID . coli 2 NoxE ^{NADH oxidasa (formadora de} YP 007507681

_{SEQ ID NO:10)} pET22 C-His L. lacti _{H20) (} s Ruta de PHB

3 PhaA Acetil-CoA acetiltransferasa ^{GJUJ-1435 (SEQ} pET28 N-His R. eut _{ID NO: 11)} ropha 4 PhaB 3-hidroxibutiril-CoA reductasa ^{GJUJ-1436 (SEQ}

_{ID NO:12)} pET28 N-His R. eutropha 5 PhaC Polihidroxibutirato sintasa ^{G8BLJ2 (SEQ ID}

_{NO: 13)} pET28 N-His C. necator sp. S-6 (continuación)

Enzima Nombre Número de

_registro Plásmido Etiqueta Organismo Ruta del isopreno

6 THL/HMGR ^{Fusión de Tiolasa/HMG-CoA} WP 002357755

_{Reductasa (SEQ ID NO:14)} pET28 N-His E. faecalis 7 HMGS ^{HMG-CoA Sintasa A110G} WP 010785222

_{Mutante (SEQ ID NO:15)} pET28 N-His E. faecalis 8 HMGR HMG-CoA Reductasa ^{WP 002357755}

_{(SEQ ID NO:16)} pET28 N-His E. faecalis 9 MVK mevalonato quinasa ^{BAA24409 (SEQ}

_{ID NO: 17)} pET28 N-His S. cerevisiae 10 PMVK fosfomevalonato quinasa ^{NP 344303 (SEQ}

_{ID NO:18)} pET28 N-His S. solfataricus 11 MDC difosfomevalonato decarboxilasa ^{NP 014441 (SEQ}

_{ID NO: 19)} pET28 N-His S. cerevisiae 12 Idi isopentenil difosfato isomerasa ^{NP 417365 (SEQ}

_{ID NO:20)} pET22 C-His E. coli 13 IspS Isopreno Sintasa ^Q50L36

_: ⁽

₂ ^S

₁ ^E

_{NO )} ^{Q ID} pET28 N-His P. alba Las SEQ ID NOS que se muestran anteriormente proporcionan las secuencias polipeptídicas.

Las secuencias de codificación están fácilmente disponibles para un experto en la materia.

En la Fig. 3 se muestra el progreso del piruvato optimizado a la reacción de PHB junto con un control de la ausencia de la última enzima, phaC. Ambas reacciones tenían una relación ^{p d h nadph}:P^d H^nadh de 40:1. En esta relación, los niveles de NADPH aumentan rápidamente (A340) y se mantienen a lo largo del transcurso de tiempo (NoxE oxida rápidamente a NADH de tal manera que los cambios en A340 reflejan solo cambios en los niveles de NADPH). Al mismo tiempo, se producen los gránulos de PHB como se controla mediante A60036.

Se evaluó la producción de PHB usando un método de cromatografía de gases y se encontró que la reacción optimizada producía 2,45 ± 0,5 mg/ml de PHB a partir de piruvato 50 mM que representa la conversión casi completa (94 ± 20 %) del piruvato a plástico. En el sistema optimizado, se usaron inicialmente 0,5 mM de NADP+, conseguir de esta manera un rendimiento del 94 % requiere aproximadamente 90 renovaciones del cofactor NADP+, indicando un alto nivel de sostenibilidad del sistema.

Se evaluó la estabilidad del sistema completo mezclando los componentes e iniciando a continuación la reacción con diversas demoras de tiempo. En la Fig. 8 se muestra la disminución en la extensión de la reacción. La extensión de la reacción sigue siendo de ~50 % después de dos días.

El comportamiento regulador de la válvula de purga es mejor observarlo a concentraciones subóptimas de la enzima y relaciones de y relaciones de ^{p d h nadph} a ^p D^{h n}A^dh que ralentizan el tiempo de respuesta. En el ensayo optimizado (relación molar 40:1 de p d h nadph:PDHnadh), se observó un rápido aumento en los niveles de NADPH, que se mantuvo en todo momento. En los sistemas no óptimos que se muestran en la Fig. 4, la válvula de purga no puede responder tan rápidamente a la bajada de las concentraciones de NADPH de tal manera que se observaron variaciones en los niveles de NADPH a medida que se desarrolla es sistema. Los inventores observaron también un rápido aumento inicial en los niveles de NADPH, pero a medida que se acumulan los intermedios, el consumo comienza a superar la producción de NADPH. En última instancia, el sistema se compensa generando mayores niveles de NADPH.

Para ensayar si el sistema era robusto a los cambios en los niveles de cofactores, se variaron las concentraciones de cofactores iniciales en las reacciones y se midieron los rendimientos de PHB. Se construyó cada reacción con las combinaciones de NAD+, NADH, NADP+ o NADPH a cualquiera de 0,1 mM o 1 mM y se controló la producción de PHB mediante la DO final a 600 nm. Se compararon todas las condiciones de reacción con la reacción optimizada que produjo la conversión casi completa del piruvato en PHB y estuvieron comprendidas en una variación aleatoria. Este resultado indica que la válvula de purga puede compensar fácilmente los cambios en las concentraciones de cofactores y los estados de reducción.

Para ensayar la versatilidad de la válvula de purga molecular y si se puede aplicar como plataforma general para la producción de una gama diversa de compuestos derivados de Acetil-CoA, se usó la válvula de purga de PDH para producir isopreno mediante la ruta del mevalonato dependiente de Acetil-CoA. Korman et al. describieron anteriormente la producción in vitro de isopreno a partir de piruvato, que requirió el uso de NADPH añadido exógenamente. De manera similar a la ruta de PHB, la ruta del mevalonato tiene una estequiometría del carbono y de cofactores inherentemente diferente. En particular, la ruta del mevalonato requiere 3 Acetil-CoA y 2 NADPH para

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Una ruta metabólica recombinante, artificial o diseñada mediante ingeniería genética en un sistema exento de células o un microorganismo que comprende una pluralidad de etapas enzimáticas que convierten un sustrato en un producto, en la que la ruta incluye una producción desequilibrada y la utilización de un primer cofactor, comprendiendo dicha ruta:

una primera enzima dependiente de cofactores que puede convertir un primer sustrato en un segundo sustrato, dicha enzima da lugar a la producción desequilibrada y a la utilización de un primer cofactor;

una segunda enzima dependiente de cofactores que también puede convertir el primer sustrato en el segundo sustrato, en la que la segunda enzima dependiente de cofactores es un mutante de la primera enzima dependiente de cofactores que se ha modificado para tener su preferencia de cofactores alterada hacia un segundo cofactor; y

una enzima que recicla el primer cofactor,

en la que el primer cofactor comprende NAD+/NADH y el segundo cofactor comprende NADP+/NADPH, y en la que la ruta comprende una NADH deshidrogenasa, una NADPH deshidrogenasa que es una NADH deshidrogenasa mutante que utiliza NADP+ en vez de NAD+, y una NADH oxidasa.

2. La ruta recombinante, artificial o diseñada mediante ingeniería genética de la reivindicación 1, en la que la NADH deshidrogenasa es un complejo de una NADH piruvato deshidrogenasa.

3. La ruta recombinante, artificial o diseñada mediante ingeniería genética de la reivindicación 2, en la que el complejo de la NADH piruvato deshidrogenasa comprende una subunidad a de la piruvato deshidrogenasa, una subunidad b de la piruvato deshidrogenasa, una dihidrolipoamida acetiltransferasa, y una dihidrolipoamida deshidrogenasa.

4. La ruta recombinante, artificial o diseñada mediante ingeniería genética de la reivindicación 3, en la que la subunidad a de la piruvato deshidrogenasa comprende una secuencia que es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO:1, en la que la subunidad b de la piruvato deshidrogenasa comprende una secuencia que es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO:2, en la que la dihidrolipoamida acetiltransferasa comprende una secuencia que es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 3, en la que la dihidrolipoamida deshidrogenasa comprende una secuencia que es al menos un 90 %, idéntica a la SEQ ID NO: 5, en la que el complejo convierte el piruvato en acetil-CoA, o en la que la dihidrolipoamida deshidrogenasa comprende una secuencia que es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO:5 y que comprende las mutaciones E206V, G207R, A208K, y S213R.

5. La ruta recombinante, artificial o diseñada mediante ingeniería genética de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la NADPH deshidrogenasa es un complejo de una NADPH piruvato deshidrogenasa mutante que utiliza NADP+.

6. La ruta recombinante, artificial o diseñada mediante ingeniería genética de la reivindicación 5, en la que el complejo de la piruvato deshidrogenasa mutante comprende una subunidad a de la piruvato deshidrogenasa, una subunidad b de la piruvato deshidrogenasa, una dihidrolipoamida acetiltransferasa, y una dihidrolipoamida deshidrogenasa mutante que utiliza preferentemente NADP+.

7. La ruta recombinante, artificial o diseñada mediante ingeniería genética de la reivindicación 6, en la que la subunidad a de la piruvato deshidrogenasa comprende una secuencia que es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO:1, en la que la subunidad b de la piruvato deshidrogenasa comprende una secuencia que es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO:2, en la que la dihidrolipoamida acetiltransferasa comprende una secuencia que es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO:3, y en la que la dihidrolipoamida deshidrogenasa comprende una secuencia que es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO:7 y utiliza preferentemente NADP+, en la que el complejo convierte el piruvato en acetil-CoA.

8. La ruta recombinante, artificial o diseñada mediante ingeniería genética de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la NADH oxidasa es una NoxE u homóloga de la misma y en la que la NADH oxidasa comprende una secuencia que es al menos un 50 % idéntica a la SEQ ID NO: 10.

9. La ruta recombinante, artificial o diseñada mediante ingeniería genética de una cualquiera de las anteriores reivindicaciones en la que la ruta recombinante, artificial o diseñada mediante ingeniería genética produce PHB, isopreno o un compuesto isoprenoide.